KR19990022471A - 국소용 아시클로비르 유도체 - Google Patents

국소용 아시클로비르 유도체 Download PDF

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Abstract

아시클로비르 모노포스페이트, 아시클로비르 디포스페이트 및 아시클로비르 트리포스페이트와 같이 헤르페스 바이러스의 자연적인 균주 뿐만 아니라, 내성 균주, 특히 타이미딘 키나제 음성 균주에 대하여 증가된 활성을 나타내는 항헤르페스 뉴클레오사이드 동족체 포스페이트 에스테르를 포함하는 헤르페스 바이러스 감염에 사용되는 국소용 조성물. 항헤르페스 뉴클레오사이드 동족체 포스페이트 에스테르는 포스포르아미데이트 및 포스포티오레이트 뿐만 아니라 C 및 S 가교원자를 포함하는 폴리포스페이트를 포함한다.

Description

국소용 아시클로비르 유도체
아시클로비르 (ACV)는 독특한 불완전한 (아시클릭) 당 부분을 함유하는 구아노신의 항바이러스성 뉴클레오사이드 동족체이다. 뉴클레오사이드 동족체는 세포에서의 DNA 복제 과정을 중단시켜, 항바이러스 및 항신생물질 제제로서 유용하다. ACV는 특히 타입 I 및 타입 II의 헤르페스 심플렉스 바이러스 감염의 치료에 효과적이다. ACV가 HSV 타이미딘 키나제에 의하여 선택적으로 인산화되지만, 숙주 타이미딘 키나제에 의하여는 인산화되지 않기 때문에 세포내에서의 ACV의 항헤르페스 바이러스 활성은 낮은 독성을 갖는다. 결과적으로, HSV로 감염된 세포만이 ACV 모노포스페이트 (ACV-MP)를 형성한다. 그 후 ACV-MP는 세포내 효소에 의하여 바이러스 복제를 방해하는 활성 제제인 ACV 트리포스페이트로 동화적으로 전환된다 [파이페 등, J. Biol. Chem. 253:8721-8727 (1978); 푸르만, 등, J. Virol. 32:72-77 (1979)].
아시클로비르의 항헤르페스 바이러스 활성은 조직 배양 세포에서 헤르페스 바이러스 심플렉스 바이러스의 복제를 억제하는 것으로 나타났으며 [오브리언 등, Antimicrob. Agents and Chemother. 34:1178-1182 (1990)]; HSV에 의하여 감염된 환자에게 ACV를 경구 투여한 임상 실험에서도 나타났다 [화이트레이, Immunobiol. and Prpphylaxis of Human Herpesvirus Infections, 로페즈 등 Plenum Press, NY 1990; 및 스트라우스, Sexually Transmitted Diseases 16(2):107-113(1989)].
국소 아시클로비르 치료를 받은 환자가 그 증상이 다소 완화됨에도 불구하고, 점막 및 경피 HSV 감염에 대한 치료로 아시클로비르가 선택되면, 치료는 느리고 불완전하다 [스푸루안스, 등 J. Infect Dis. 146:85-90 (1982); 및 스프루안스 등, Antimicrob. Agents Chemother. 25: 553-555 (1984)].
헤르페스 바이러스 감염된 배양 세포에 대하여 인터페론과 함께 ACV를 사용하는 조합된 치료 [오브리언 등, Antimicrob. Agents and Chemother., 34(6):1178- 1182 (1990)], 또는 무흉선증 생쥐에서 헤르페스성 건선에 대한 국소 치료로서 ACV와 함께 HSV 불활성화제인 A111OU와 함께 사용하는 것 [로베 등, Antiviral. Research 15:87-100 (1991)]은 ACV 단독으로 사용한 경우를 능가하는 상승된 항헤르페스 바이러스 I 활성을 나타낸다.
아시클로비르는 또 다른 바이러스성 질환인 바리셀라 (수두)의 치료에 대한 임상 실험에서 질적인 성공을 거두며 사용되었다 [화이트레이 등, Immunobiology and Prophylaxis of Human Herpesvirus Infections, 로페즈, Plenum Press, New York (1990) pp. 243-253]. 또한, 성공은 하지 않았지만 재생불량성 빈혈 [고메즈-알마거 등, Amer. J. of Hematology 29:172-173 (1988)] 및 십이지장궤양 [룬 등, Gut 31:151-152 (1990)]과 같은 바이러스성 병인으로 가정된 다른 질환을 치료하는데 실험적으로 사용되어 왔다.
아시클로비르 포스페이트는 야생형의 HSV 또는 HSV-1 감염된 배양세포에서 생체외적인 실험적인 분리체에 대하여 효과적인 것으로 나타났지만, 동일한 조건하에서 타이미딘 키나제 결핍된 HSV 돌연변이체에는 거의 또는 전혀 영향이 없는 것으로 나타났다 (도 1 및 도 2의 자료 참조).
HIV (AIDS) 감염 또는 이식 거부를 방지하기 위하여 면역 억제 의약을 투여한 이식 수용자와 같은 면역 억제된 환자에게 있어서, 헤르페스의 출현을 방지하기 위하여 ACV가 장기간 제공된다. 이러한 치료법은 HSV 타이미딘 키나제 (90 % 빈도) 뿐만 아니라 DNA 폴리머라제 (10 % 빈도)에서의 돌연변이를 야기하는, 즉 달리말하면 ACV-내성 바이러스성 균주를 초래하는 선택적 외인을 제공한다. 이러한 아시클로비르 내성 헤르페스 바이러스 균쥬에 대한 효과적인 국소 치료법은 없다.
본 발명에 따라, 헤르페스 바이러스 감염에 기인한 점막 및 경피 헤르페스성 병변의 치료에서 효과적인 아시클로비르 포스페이트 에스테르 및 다른 항헤르페스 항바이러스 뉴클레오사이드 동족체 포스페이트 에스테르가 제공된다. 이들 제제는 놀랍게도 배양 세포에서 타이미딘 키나제 결핍 헤르페스 바이러스에 대하여 비교적 불활성이지만 이들 돌연변이체 바이러스 감염에 기인한 병변에 대해 항바이러스성 활성을 나타낸다. 또한, 본 발명은 국소용으로 적합한 제약 담체에 아시클로비르 모노포스페이트, 아시클로비르 디포스페이트, 아시클로비르 트리포스페이트, 아시클로비르 모노포스페이트 글리세롤, 아시클로비르 디포스페이트 글리세롤, 아시클로비르 모노포스페이트 모르폴리데이트, 아시클로비르 디포스페이트 모르폴리데이트, 아시클로비르 모노포스페이트 이소프로필리덴 글리세롤, 아시클로비르 디포스페이트 이소프로필리덴 글리세롤, 아시클로비르 포스포메틸렌디포스포네이트 또는 이들의 혼합물일 수 있는 아시클로비르 유도체의 유효한 항바이러스 농도를 포함하는 제약 제형을 제공할 수 있다.
바이러스성 타이미딘 키나제에 의한 인산화에 따른 다른 항헤르페스 심플렉스 뉴클레오사이드는 감염된 환자의 피부에 적합한 국소 제형의 포스페이트 에스테르로서 투여될 때 강화된 활성을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 관점에 따라, 본 발명의 임의의 아시클로비르 포스페이트 유도체 또는 그들의 혼합물을 포함하는 제형을 인간 및 다른 포유 동물을 포함하는 바이러스 감염된 동물의 점막 또는 경피 병변에 투여하는 것을 포함하는 바이러스 감염의 국소 치료 방법을 제공한다. 본 방법의 바람직한 구현예에서, 동물은 헤르페스 바이러스에 의하여 감염된다. 특히 바람직한 구현예에서, 동물은 아시클로비르에 대하여 내성인 헤르페스 바이러스 균주에 감염된다. 아시클로비르 내성 헤르페스 바이러스 균주는 항바이러스 제제에 대한 내성이 타이미딘 키나제 유전자의 변경 또는 결합에 기인한 것인 바이러스 균주일 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점에 따라, 점막 또는 경피 바이러스 감염의 치료용 의약의 제조에 적어도 하나의 항-헤르페스 뉴클레오사이드 동족체 포스페이트가 사용된다. 바람직한 구현예로 뉴클레오사이드 포스페이트는 수용성 염이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 바이러스 감염은 헤르페스 심플렉스 바이러스, 타입 1 또는 타입 2이다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 항헤르페스 뉴클레오사이드 동족체 포스페이트 에스테르가 제약상 허용되는 담체와 함께 점막 또는 경피 바이러스 감염의 치료용 의약의 제조에 사용된다. 바람직한 관점에서, 제약상 허용되는 담체는 수성의 크림 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
또한 아시클로비르 포스포르아미데이트 및 황 및 메틸렌 가교 기를 포함하는 포스포티오레이트와 같은 항헤르페스 뉴클레오사이드 포스페이트 에스테르가 제공된다.
도 1은 Wi38 섬유아세포에서 헤르페스 심플렉스 바이러스 복제에 대한 아시클로비르 및 아시클로비르 모노포스페이트의 비교 효과를 설명한다.
도 2는 생체외에서 HSV-DM21 TK 돌연변이체의 복제에 대한 아시클로비르 및 아시클로비르 모노포스페이트의 비교 효과를 설명한다.
도 3은 HRS/J 생쥐에서 TK-결핍 형의 아시클로비르 내성 HSV-1 감염에 대한 국소적인 아시클로비르 및 아시클로비르 포스페이트 에스테르의 비교 효과를 설명한다.
도 4는 HRS/J 생쥐에서 TK-변경 형의 아시클로비르 내성 HSV-1 감염에 대한 국소적인 아시클로비르 및 아시클로비르 포스페이트 에스테르의 비교 효과를 설명한다.
도 5는 HRS/J 생쥐에서 야생형의 아시클로비르 내성 HSV-1의 감염에 대한 국소적인 아시클로비르 및 아시클로비르 모노포스페이트의 비교 효과를 설명한다.
도 6은 HRS/J 생쥐에서 TK-변경 형의 아시클로비르 내성 HSV-1의 감염에 대한 국소적인 아시클로비르 및 아시클로비르 모노포스페이트의 비교 효과를 설명한다.
본 발명은 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV) 감염, 특히 HSV의 ACV-내성 돌연변이체에 대하여 우수한 국소 활성을 나타내는 아시클로비르 포스페이트 유도체를 제공한다.
아시클로비르는 9-위치에서 치환기를 갖고, 일반명이 유래된 아시클릭 당 기를 갖는 푸린 염기인 구아닌의 동족체이다. 아시클로비르의 화학명은 9-(2-히드록시에톡시메틸)-구아닌으로 하기 구조를 갖는다:
본 발명의 아시클로비르 포스페이트 유도체는 아시클릭 당기의 말단 O-위치에 하기와 같은 치환체 R을 갖는다:
여기서, 치환체 R은 다음과 같다:
관련된 트리포스페이트 유도체는 부가적인 포스페이트 기를 포함하는 해당 구조를 갖는다.
본 발명에 따라, 아시클로비르 모노포스페이트 (ACV-MP), 아시클로비르 디포스페이트 (ACV-DP), 아시클로비르 트리포스페이트 (ACV-TP), 아시클로비르 모노포스페이트 글리세롤 (ACV-MP-G), 아시클로비르 디포스페이트 글리세롤 (ACV-DP-G), 아시클로비르 모노포스페이트 모르폴리데이트 (ACV-MP-모르폴린), 아시클로비르 디포스페이트 모르폴리데이트 (ACV-DP-모르폴린), 아시클로비르 포스포메틸렌디포스포네이트 (ACV-PMDP), 아시클로비르 모노포스페이트 이소프로필리덴 글리세롤 (ACV-MP-이소P-G), 아시클로비르 디포스페이트 이소프로필리덴 글리세롤 (ACV-DP-이소P-G)가 단독으로 또는 배합되어 적절한 제약 제형으로 제조되어 HSV-감염된 개체의 경피 병변에 투여된다. 설명된 ACV-MP, ACV-DP, ACV-TP, ACV-DP-G, ACV-PMDP, 아시클로비르의 모르폴린 유도체, 및 아시클로비르 이소프로필리덴 글리세롤 유도체 화합물은 지용성이 아니며, 수용성 포스페이트 에스테르이며, 따라서 바람직하게는 수성 기재 국소 제형으로 제공된다.
놀랍게도, 다른 뉴클레오사이드의 모노포스페이트 및 폴리포스페이트 유도체를 기대하였지만, 아시클로비르의 포스페이트 에스테르가 강화된 국소 항-HSV 활성을 나타낸다는 것을 발견하였다. 또한, 뉴클레오사이드 동족체의 모노포스페이트, 디포스페이트 및 트리포스페이트 및 포스포메틸렌디포스포네이트 유도체의 염이 용이하게 제조될 수 있고, 이러한 염이 수성 매질, 예를 들면 크림, 겔 또는 다른 수분산액 에서 강화된 용해도를 나타낸다는 것을 발견하였다. 더욱이, 이들 염은 폴리에틸렌 글리콜 매질에서 가용성이어서 독특한 점막 또는 경피 분산액을 제공한다.
본 발명의 방법에 유용한 뉴클레오타이드 동족체의 다른 폴리포스페이트 에스테르는 메틸렌- 및 티오연결된 폴리포스페이트 뉴클레오사이드 동족체 뿐만 아니라, 모노- 및 폴리포스포아미데이트 및 모노- 및 폴리포스포티오레이트 뉴클레오사이드 동족체를 포함한다.
유사하게, 항헤르페스 심플렉스 뉴클레오사이드의 모노포스페이트, 디포스페이트 및 다른 포스페이트 에스테르는 상기 지적한 것처럼 강화된 국소 활성을 나타낸다. 하기 헤르페스 항바이러스 뉴클레오사이드는 포스페이트 에스테르로서 강화된 활성을 나타낸다.
1-베타-D-아라비노푸라노실-E-5-(2-브로모비닐)우라실;
2'-플루오로카르보시클릭-2'-데옥시구아노신;
6'-플루오로카르보시클릭-2'-데옥시구아노신;
1-(베타-D-아라비노푸라노실-5(E)-(2-요오도비닐)우라실;
(1r-1α, 2β, 3α)-2-아미노-9-(2,3-비스(히드록시메틸)시클로부틸)-6H-푸린-6-온;
9H-푸린-2-아민, 9-((2-(1-메틸에톡시)-1-((1-메틸에톡시)메틸)에톡시)메틸-(9Cl);
트리플루오로타이미딘;
9-[(1,3-디히드록시-2-프로폭시)메틸]구아닌;
5-에틸-2'-데옥시우리딘;
E-5-(2-브로모비닐)-2'-데옥시우리딘;
5-(2-클로로에틸)-2'-데옥시우리딘;
1-(2-데옥시-2-플루오로-베타-D-아라비노푸라노실)-5-요오도사이토신 (FIAC);
1-(2-데옥시-2-플루오로-베타-D-아라비노푸라노실)-5-요오도우리딘 (FIAU);
부시클로비르;
6-데옥시아시클로비르;
9-(4-히드록시-3-히드록시메틸부트-1-일)구아닌;
E-5-(2-요오도비닐)-2'-데옥시우리딘;
5-비닐-1-베타-D-아라비노푸라노실우라실 (V-araU);
1-베타-D-아라비노푸라노실타이민 (ara-T);
2'-노르-2'-데옥시구아노신 (2'NDG);
9-(4-히드록시-3-히드록시메틸부트-1-일)구아닌 (펜시클로비르, BRL 3912);
1-(베타-D-아라비노푸라노실아데닌 (ara-A; 비다라빈).
모노포스페이트, 디포스페이트 및 트리포스페이트 에스테르는 하기 식
[여기서, N은 항헤르페스 심플렉스 바이러스 뉴클레오사이드 동족체이고; Z는 O, S, 또는 NH이고, n은 1 또는 2 이다]; 또는 하기 식
[여기서, N은 항헤르페스 심플렉스 바이러스 뉴클레오사이드 동족체이고; Z는 O, S, 또는 NH이고; X는 O, CH2또는 S이고; n은 1 또는 2 이다]을 갖는다.
따라서, 포스포에스테르는 포스페이트, 포스포티오레이트 또는 포스포르아미데이트일 수 있고, 디에스테르 및 트리에스테르는 산소 이외의 가교 원자를 가질 수 있는 예를 들면 2,3-μ-티오트리포스페이트 에스테르 또는 2,3-μ-메틸렌디포스포네이트일 수 있다.
기대와 달리, 이들 뉴클레오사이드 동족체 포스페이트는 HSV-감염된 피부 세포의 세포막을 통과할 수 있고, HSV DNA 폴리머라제를 억제함으로써 바이러스 복제 속도를 저하시킬 수 있다. 본 발명의 모노- 및 디포스페이트 뉴클레오사이드는 세포의 동화작용성 인산화에 의하여 트리포스페이트로 전환되지만, 트리포스페이트 동족체는 세포내 DNA 폴리머라제를 억제할 필요 없이 직접 HSV DNA 폴리머라제를 억제한다. 본 발명은 또한 감염된 피부 세포에서 HSV 증식을 효과적으로 감소시키기 위하여 국소 투여될 수 있는 농도의 뉴클레오사이드 동족체 모노-, 디- 및 트리포스페이트의 제약 제형을 제공한다. 적합한 국소 제형으로 피부에 투여될 때, DNA 사슬 종결 디데옥시뉴클레오사이드 포스페이트는 유사하게 HSV 복제를 감소시킨다. 이들에는 현재 계류중인 미국 특허출원 번호 제07/373,088호에 기재되어 있는 것과 같은 아시클로비르, 간시클로비르, 펜시클로비르, BVaraU, 디데옥시사이티딘, 디데옥시타이미딘, 디데옥시구아노신, 디데옥시아데노신, 디데옥시이노신, 3-아지도디데옥시타이미딘, 디데옥시히드로디데옥시타이미딘 (d4T), 및 다른 디데옥시뉴클레오사이드 동족체가 포함된다.
이러한 화합물의 염은 용이하게 제조할 수 있으며, 이러한 염은 수성 매질, 예를 들면 크림, 겔 또는 다른 수성의 분산액에 강화된 용해도를 나타낸다. 통상, 이들 화합물의 유용한 염에는 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 또는 수소 염이 포함된다. 본 분야의 숙련자에게 공지된 임의의 생리적으로 허용되는 양이온이 사용될 수 있다. 더욱이, 이러한 염은 선호되는 점막 또는 경피의 분산액으로 제공되는 폴리에틸렌 글리콜 크림 및 로션에 유용하고 효과적이다.
이들 화합물의 여러 포스페이트 에스테르가 기본적으로 아시클로비르에 대하여 하기 기재된 것처럼 제조될 수 있다.
아시클로비르 포스페이트 에스테르의 합성:
본 발명은 아시클로비르 모노- 및 디- 포스페이트, 아시클로비르 모노포스페이트 모르폴리데이트, 아시클로비르 모노- 및 디포스페이트 글리세롤, 및 아시클로비르 모노- 및 디포스페이트 1,2-이소프로필리덴 글리세롤의 합성 방법을 제공한다.
아시클로비르 모노포스페이트는 요시까와 등 (Bull. Chem. Soc. Japan 42:3505-35-8, 1969)의 방법을 토오르켄 및 토팔의 방법 (Carcinogenesis 4:1591-1597, 1983)으로 변형한 방법, 및 실시예 1에 예시된 방법에 따라 아시클로비르로부터 제조할 수 있다. 아시클로비르 디포스페이트는 트리부틸암모늄 포스페이트 또는 트리부틸암모늄 파이로포스페이트를 포스페이트 공여자로 사용하여 오트 등의 방법 (Anal. Biochem. 21:469-472, 1967)에 의하여 다른 뉴클레오사이드 동족체의 방법으로 제조될 수 있다.
아시클로비르 디포스페이트 글리세롤의 제조 방법은 실시예 2 내지 4에 제시된다. 일반적으로, 뉴클레오사이드 포스페이트 글리세롤은 포스파티딜 뉴클레오사이드의 제조 방법과 유사한 방법으로 제조된다. 실시예 3에 기재된 방법에서, 아시클로비르 포스페이트는 이탈기, 예를 들면 실시예 2에 있어서의 모르폴린을 첨가하여 활성화되고, N,N'-디시클로헥실카르보디이미도 (DCC)의 존재하에 글리세롤-3-포스페이트 디시클로헥실암모늄 염과 함께 축합된다. 이외에 실시예 4에 기재된 것 처럼, 이소프로필리덴 부분에 의하여 보호된 반응성 히드록실기를 갖는 글리세롤 포스페이트가 모르폴리데이트를 첨가하여 활성화되고, 실시예 2에 기재된 조건하에서 아시클로비르 모노포스페이트와 함께 축합된다.
여러 아실 사슬을 함유하는 아시클로비르-디포스페이트-디글리세라이드 (ACV-DP-DG)는 종래에는 적절한 디아실포스파티드산 모르폴리데이트 (PA-모르폴리데이트) 및 아시클로비르 모노포스페이트 (ACV-MP)의 축합 반응에 의하여 제조되었다. 수행될 수 있는 방법은 아그라노프 및 수오미의 문헌 (Biochem. Prep. 10:47-51 (1963))에 설명되어 있다. 이외에, 발명의 명칭이 리포뉴클레오사이드 합성인 미국 특허 출원번호 제07/706,873호 및 홍 등의 영국 특허출원 제2,168,350호에 설명된 것처럼 뉴클레오사이드 모노포스페이트의 모르폴리데이트를 제조하고, 포스파티드산과 축합한다.
상기 화학 방법은 본 발명의 화합물의 제조 방법의 일반적인 적용이 설명되어 있다. 상황에 따라, 개시된 범주내에 포함된 각각의 화합물에 설명된 것처럼 반응이 적용될 수 없다. 본 분야의 숙련자는 이러한 화합물을 용이하게 인식할 수 있다. 그러한 모든 경우에, 본 분야의 숙련자에게 공지된 종래 방법의 변형, 예를 들면 간섭기의 적절한 보호, 다른 종래 시약으로의 변경, 또는 반응 조건의 일반적인 변형에 의하여 성공적으로 수행될 수 있다. 이외에, 본원에 개시된 다른 반응 또는 다른 종래의 반응이 본 발명의 해당 화합물의 제조에 적용될 수 있다. 이 모든 제조 방법에서, 모든 출발 물질은 공지된 것이거나 공지된 출발 물질로부터 용이하게 제조될 수 있다. 다른 지시가 없는 한, 모든 부 및 백분율은 중량비이다.
뉴클레오사이드 모노포스페이트, 디포스페이트 및 트리포스페이트 및 뉴클레오사이드 포스페이트 동족체의 합성
뉴클레오사이드를 인 옥시클로라이드와 반응시켜 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 합성하는 방법은 현재 계류중인 미국 특허 출원 번호 제07/373,088호 및 동 제08/060,258호 및 앞서 설명된 문헌 [요시까와 등, Bull. Chem. Soc. Japan 42:3505-3508, 1969; 토르켄 및 타팔, Carcinogenesis 4:1591-1597, 1983]에 기재되어 있다. 뉴클레오사이드 디포스페이트는 오트 등의 문헌 (Anal. Biochem. 21:469-472, 1967)의 방법에 따라 제조된다.
뉴클레오사이드 트리포스페이트는 실라 및 롤링의 문헌 (Nucl. Acids Res. 20:55-61, 1992)에 따라 제조되거나, 또는 모프아트 및 크호라나의 방법 (J. Am. Chem. Soc. 83:663, 1991)에 의하여 뉴클레오사이드 모노포스페이트로부터 제조되거나, 또는 호오드 및 오트의 방법 (J. Am. Chem. Soc. 87:1785-1788, 1963)에 따라 제조된다. 하기 실시예에 뉴클레오사이드의 포스페이트 에스테르 및 뉴클레오사이드 동족체의 제조를 위하여 유용한 합성 방법이 상세하게 제시된다.
뉴클레오사이드 포스포로티오에이트, 뉴클레오사이드 포스포르아미데이트, 뉴클레오사이드 포스포네이트 및 뉴클레오사이드 포스포로플루오리데이트를 포함하는 다른 뉴클레오사이드 포스페이트 동족체가 본 분야의 숙련자에게 공지되어 있으며, 예를 들면 호친슨의 문헌 (The synthesis, reactions and properties of nucleoside mono-, di-, tri- and tetraphosphate and nucleotide with changes in the phosphoryl residue. In Chemistry of Nucleotides and Nucleosides, L. Townsend, ed. 1991 pp. 81-146 및 그의 참고문헌)에 요약되어 있는 방법에 의하여 합성될 수 있다. 통상의 합성법을 다음에 요약하였다.
(1) 뉴클레오사이드 포스포로티오에이트는 하나 이상의 포스포릴 산소원자가 황에 의하여 치환된 뉴클레오타이드의 동족체이다. 초기의 합성 방법은 보호된 뉴클레오사이드 및 트리스(1-이미다졸릴)포스판 황을 반응시키는 것이었으나, 최근에 와서는 트리스(1-이미다조일)포스판 황대신에 티오포스포릴-클로라이드 (PSCl3)로 대체되었다. 뉴클레오사이드 포스포르아닐리데이트가 수산화나트륨 및 이황화탄소를 처리함으로써 포스포로티오에이트로 전환될 수 있다. 뉴클레오사이드 5'-포스포로티오에이트가 뉴클레오사이드 5'-포스파이트의 직접적인 황화 반응으로부터 초래될 수 있다. 푸린 뉴클레오사이드 2'(3')-포스포로티오에이트는 그 2',3'-Ο-디-n-부틸스타닐렌 유도체를 티오포스포릴 클로라이드를 반응시키고, 염기성 가수분해하여 합성될 수 있다.
(2) 뉴클레오사이드 포스포르아미데이트는 하나 이상의 포스포릴 산소원자가 온화한 산성 조건에서 조차 뉴클레오사이드 포스포로티오에이트의 P-S 결합보다 더욱 불안정한 P-N 결합을 만드는 질소원자에 의하여 대체된 동족체이다. 이러한 화합물의 합성에는 아미노뉴클레오사이드의 인산화 및 인산의 트리에스테르로 뉴클레오사이드 아지드를 처리하는 것이 포함된다. 친유성 뉴클레오사이드 포스포르아미데이트는 세포에 의하여 용이하게 가수분해되어 생물학적으로 활성인 화합물로 취해질 수 있기 때문에 특히 유용한 항-HSV 화합물일 수 있다.
(3) 뉴클레오사이드 포스포네이트는 포스포릴 산소가 안정한 P-C 결합을 만드는 탄소에 의하여 대체되고, 인 원자가 산소 대신에 전자 공여 알킬기로 대체될 때 P-OH기의 산가가 감소된 화합물이다. 뉴클레오사이드 포스포네이트는 본 분야의 숙련자에 의하여 아르브소브 또는 미카엘리스-벡커 반응을 사용하여 뉴클레오사이드 할로겐화물로부터 용이하게 제조된다. 뉴클레오사이드 5'-포스포네이트는 본 분야의 공지된 방법을 사용하여 2',3'-보호된 5'-요오도-5'-데옥시뉴클레오사이드로부터 합성될 수 있다. 5'-산소가 메틸렌 기로 대체된 등비성 뉴클레오사이드 5'-포스포네이트는 적절히 보호된 뉴클레오사이드 5'-알데하이드를 디페닐 트리페닐포스포르아닐리덴메틸포스포네이트를 커플링하여 α,β-불포화된 포스포네이트 디에스테르를 생성하고, 이를 환원하고, 포스포릴 잔기에서 탈보호하여 포스포네이트를 생성함으로써 합성된다. 등비성 뉴클레오사이드 3'-포스포네이트는 푸린 또는 피리미딘의 중금속 염과 커플된 포스포닐화된 리보오스-1 클로라이드로부터 출발하여 합성된다. 포스포네이트는 일반적으로 그 포스페이트 반대이온에 비하여 덜 극성이어서 국소적으로 투여될 때, 세포에 더욱 용이하게 흡수될 수 있기 때문에 항-HSV 제제로 유용하다.
(4) 뉴클레오사이드 포스포로플루오리데이트는 모노뉴클레오타이드의 동족체이다. 뉴클레오사이드 5'-포스페이트를 2,4-디니트로플루오로벤젠으로 처리하면 뉴클레오타이드의 2,4-디니트로페닐에스테르를 통하여 뉴클레오사이드 5'-포스포로플루오리데이트가 제조된다.
(5) 다른 뉴클레오사이드 폴리포스페이트 동족체에는 산소 이외의 원자가 뉴클레오사이드의 디- 및 트리- 포스페이트에서 α,β-인원자 사이에서 치환되거나, 또는 뉴클레오사이드 트리포스페이트에서 β,γ-인원자 사이에서 치환된 것을 포함한다 (타운센드의 In Chemistry of Nucleotide and Nucleoside, 1991에서 호친슨의 119면 표 III에 기재된 것 포함). 일반적으로, α,β-동족체는 DCC를 사용하여 2',3'-Ο-보호된 뉴클레오사이드를 파이로포스페이트 동족체로 축합반응시키거나, 또는 친핵성 대체반응 (토실 뉴클레오사이드의 당 잔기의 5'-위치로부터 톨루엔 술포닐 (토실)잔기를 메틸렌 비스포스포네이트 이온으로 대체하는 반응)으로부터 제조된다.
ACV-MP, ACV-DP, ACV-TP, ACV-MP 글리세롤, ACV-DP 글리세롤, ACV-MP-이소프로필리덴 글리세롤, ACV-DP 이소프로필리덴 글리세롤 및 ACV-P -메틸렌디포스포네이트를 포함하는 본 발명의 아시클로비르 유도체가 아시클로비르-내성 HSV-1 감염의 헤르페스성 병변의 국소 치료에 특히 효과적이라는 것을 발견하였다. 실시예 7은 HSV의 야생형 분리체 및 실험실 세포주로 감염된 배양 세포가 아시클로비르 및 아시클로비르 모노포스페이트를 사용한 치료에서 동일한 성공을 나타냄을 보여준다 (실시예 7; 도 1). Wi38 섬유아세포에서의 바이러스 감염의 경우, 아시클로비르 및 아시클로비르 모노포스페이트가 모두 약 1 내지 2 μM의 동일한 IC50을 갖는다. 그러나, 동일하게 배양된 세포 시스템이 아시클로비르를 아시클로비르 모노포스페이트로로 전환시키는 타이미딘 키나제가 결핍된 아시클로비르-내성 균주인 HSV-DM.21의 균주로 감염되었을 때, 아시클로비르 및 아시클로비르 모노포스페이트가 바이러스 플라크를 감소시키는 데 효과적이지 못하다 (실시예 7; 도 2).
아시클로비르-내성 경피성 HSV-1 감염에 관한 아시클로비르 포스페이트 에스테르의 효과는 상기 언급된 생체외 배양 세포의 데이터에서 놀랄만하다. 수성 크림으로 아시클로비르 포스페이트 에스테르는 아시클로비르-내성 HSV-1 감염된 생쥐의 헤르페스성 병변의 수를 감소시키는 데 있어서 원래의 아시클로비르보다 실질적으로 더욱 효과적이다 (실시예 9; 도 3 및 4).
따라서, 이러한 결과로 볼 때, 아시클로비르 및 아시클로비르 포스페이트의 생체외 도입은 생체내에서 국소적으로 투여된 로션과는 상이한 양상의 작용을 진행한다고 생각된다.
뉴클레오사이드 동족체 포스페이트의 국소 제형
상기 설명한 것처럼, 본 발명의 뉴클레오사이드 동족체 유도체는 유용하고 편리한 피부학적 용도로서 본 분야의 공지된 여러 제형으로 도입되어 국소용으로 제조될 수 있다. 뉴클레오사이드 동족체 유도체는 수용성이고, 따라서 수용액, 유중수 에멀션, 또는 수성의 크림이 매우 바람직한 제형이다. 아시클로비르 및 다른 뉴클레오사이드 모노포스페이트의 수용성은 나트륨, 칼륨, 암모늄 또는 수소와 같은 염의 제형으로서 강화될 수 있다. 특히 바람직한 제형으로, 활성 성분은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 비히클로서 제조될 수 있다. 이외에, 활성 성분은 희석제 또는 담체로서 전분 또는 활석과 같은 불용성 분말을 사용하여 건조 분말 제형으로 국소적으로 투여될 수 있다.
비히클은 침투를 강화하거나, 활성 기간을 연장하거나, 또는 투여 부위에 대한 조건에 부응하기 위하여 선택될 수 있기 때문에, 몇가지 국소 제형에 있어 중요한 성분이다. 예를 들면, 손바닥 또는 발바닥과 같은 신체의 굳은 부분에 투여하기 위한 제형은 디메틸술폭시드 프로필렌 글리콜 또는 아존 (상표명)과 같은 침투 강화제를 포함할 수 있고, 가랑이, 팔꿈치 안쪽, 또는 손가락 또는 발가락 사이와 같은 내부 부위 투여용으로 분말 제형이 선택될 수 있다. 이 제형은 또한 여러 유기 중합체 또는 본 분야의 공지된 다른 조성물을 함유하여 활성 항바이러스 아시클로비르 유도체의 방출을 지연시킬 수 있다.
여러 적절한 국소 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서에서 발견될 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042 (Chapter 87: Blaug, Seymour). 이들 제형은 예를 들면, 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 액제, 무수 흡수 기재, 유중수 또는 수중유 에멀션, 에멀션 카르보왁스 (여러 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고형의 겔 및 카르보왁스를 포함하는 반고형 혼합물을 포함한다.
본 발명의 국소 제형에서 활성 성분의 농도는 약 0.01 gm% 내지 100 gm%, 바람직하게는 약 0.1 내지 50 gm%, 가장 바람직하게는 약 1 gm% 내지 약 15 gm%일 수 있다. 이 제형은 당업자에게 공지된 상기 언급된 처방서에 기재된 것처럼 또한 피부의 침투 및 치료를 돕는 유효한 농도의 다른 제제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 활성 포스페이트 에스테르를 함유하는 국소 제형의 효과는 본 분야의 숙련자에게 공지된 종래의 실험 절차를 사용하여 평가할 수 있다. 예를 들면, 특히 신속한 실험 절차는 엘리스 등의 문헌 (Antimicrobial Agents and Chemotheraphy 33:304-310, 1989)에 기재된 것처럼 쥐과의 오로파셜 모델 (orofacial model)이다. 이러한 실험 시스템에서, 코에 상처를 내고 접종한 생쥐의 HSV의 병원성이 면역화된 숙주에서 경피 HSV 감염의 치사 주기의 합리적인 모델일 수 있는 것으로 나타났다.
영향받은 피부의 헤르페스 병변에 제형을 반복하여 투여할 수 있다. 예를 들면, 일일 1회, 2회 또는 수회 처리가 치료가 달성될 때까지 수일 동안 연장될 수 있다. 독성 및 자극의 출현 위험은 최소한이다.
실시예 1
아시클로비르 뉴클레오사이드 동족체의 인산화
아시클로비르 뉴클레오사이드 유도체는 하기 방법을 통하여 제조되었다. 기본적으로 요시까와 등의 문헌 (Tetrahedron Letters 50:5065-5068 (1967)); 및 요시까와 등의 문헌 (Bull. Chem. Soc., Japan 42:3205-3208 (1967))에 기재된 것처럼 비보호된 아시클로비르를 트리메틸 포스페이트 ((CH3O)3PO) 중의 POCl3과 반응시켰다. 300-400 ml의 트리메틸 포스페이트 중의 2 M POCl3의 냉각 (0 ℃) 용액에 아시클로비르 (1 M)을 교반하면서 적가하고, 반응 온도를 0 내지 5 ℃로 유지하였다. 반응 진행을 모노 Q HR 5/5 음이온 교환 칼럼 (파마시아, 업사라, 스웨덴)을 사용하는 HPLC로 모니터 하였다. 통상, 5㎕의 반응 혼합물을 수산화나트륨 수용액으로 중화 (최종 pH 7.0)하여 칼럼에 주입하였다.
용리는 다음과 같이 수행하였다: 물로 세척, 0.1 M 탄산암모늄, NH4HCO3으로 아시클로비르 모노포스페이트를 용리하고, 0.1 내지 0.6 M의 NH4HCO3직선 구배로 몇가지 고급 인산화된 산물을 용리하였다. 본 방법으로 측정하였을 때 반응은 대부분 45 내지 75 분내에 완료되었고, 반응 산물을 가수분해하고 2 배의 수산화나트륨 수용액으로 중화하여 최종적으로 pH를 7로 하였다.
생성 화합물의 정제는 반응 혼합물의 분석을 위하여 상기 설명한 것처럼 수행하였다. 이 방법으로 0.8 몰의 아시클로비르 모노포스페이트를 제조하고, 동일한 용리 조건을 사용하여 Q 세파로스 급속 유속 칼럼으로 정제하였다.
동결건조를 반복한 후에 수율은 80 내지 96 % 사이였다.
전개 시스템으로 1-프로판올/25% NH3/H2O (20:20:3, 부피비)을 사용한 TLC 분석의 결과, 단일 자외선 Pi 양성 스팟을 나타내었다.
실시예 2
아시클로비르 모노포스포모르폴리데이트의 제조
아시클로비르 모노포스페이트 (5 mmol) 및 모르폴린 (20 mmol)을 t-부탄올 (50 ml)에 현탁하고, 온화한 환류하에 가열하면서 t-부탄올 (50 mmol)에 용해된 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC, 20 mmol)을 1 시간에 걸쳐 적가하였다. 이 혼합물을 12 내지 36 시간 동안 환류하에 교반하고, 증발시켜 건조하였다. 잔류물을 에테르로 분쇄하고, 동일한 용매를 사용하여 기울여 따르기로 세척하였다. 산물을 메탄올-에테르 혼합물로 재결정하여 정제하였다.
실시예 3
아시클로비르 모노포스포모르폴리데이트로부터 sn-글리세로-3-디포스포-아시클로비르의 제조
실시예 2에서 제조된 아시클로비르 모노포스포모르폴리데이트 (2 mmol)를 무수 피리딘 (20 ml)에 용해하고, 진공하 증발시켜 건조하였다. 피리딘 중에 잔류물을 용해시키고 증발시키는 공정을 3회 더 반복하여 화합물로부터 미량의 물을 제거하였다. 글리세롤-3-포스페이트 디-모노시클로헥실암모늄 염 (3 mmol)을 건조된 잔류물에 첨가하고, 이 혼합물을 20 ml의 피리딘에 용해하고, 60 ℃로 12 내지 36 시간 동안 불활성 분위기하에서 교반하였다. 용매를 진공하 증발시키고, 잔류물을 에테르로 분쇄하고, 그 결과생성된 고형물을 중탄산암모늄의 직선 밀도 구배 (10 mmol 내지 300 mmol, 각각 500 ml)를 사용하는 DEAE-세파덱스 칼럼 (2.5cm×30cm) 상의 이온 교환 크로마토그래피로 정제하였다. 순수한 산물을 포함하는 분획 (TLC 및 분석 HPLC로 확인)을 모아 동결건조하여 표제 화합물을 제공하였다.
실시예 4
1,2-이소프로필리덴-sn-글리세로-3-모노포스포모르폴리데이트로부터 sn-글리세로-3-디포스포-아시클로비르의 제조
A. 1,2-이소프로필리덴-sn-글리세롤-3-포스페이트의 제조
인 옥시클로라이드 (25 mmol)을 30 분에 걸쳐 1,2-이소프로필리덴-글리세롤 (20 mmol) (시그마, 세인트 루이스, 미조리) 및 트리에틸아민 (100 mmol)의 혼합물에 첨가하고, 0 ℃로 냉각하였다. 0 ℃에서 10 내지 90 분 동안 혼합물을 교반한 후에, 물 (1 ml)을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 이 혼합물을 클로로포름 (500 ml)에 용해하고, 물 (3×100 ml)로 세척하였다. 물 세척 용액을 모아 클로로포름 (50 ml)로 다시 추출하고, 동결건조하였다. 이 산물을 임의의 부가적인 정제없이 후속 반응에 바로 사용하였다.
B. 1,2-이소프로필리덴-sn-글리세로-3-모노포스포모르폴리데이트의 제조
실시예 2의 아시클로비르 포스포모르폴리데이트의 제조에 설명된 방법에 따라 (A)에서 제조된 1,2-이소프로필리덴-sn-글리세로-3-포스페이트를 모르폴린과 축합하여 1,2-이소프로필리덴-sn-글리세로-3-모노포스포모르폴리데이트를 제조하였다.
실시예 2에서 기재된 조건하에서 중간 화합물, 1,2-이소프로필리덴-sn-글리세로-3-모노포스포모르폴리데이트와 아시클로비르 모노포스페이트의 반응으로 1,2-이소프로필리덴-sn-글리세로-3-모노포스포모르폴리데이트를 수득하였다.
1,2-이소프로필리덴-sn-글리세로-3-디포스포-아시클로비르 (1 mmol)을 50 내지 90 %의 수성의 아세트산에 용해하고, 실온에서 4 내지 12 시간 동안 교반하여, 조 글리세로-3-디포스포-아시클로비르 산물을 상기 설명한 것처럼 정제하였다.
실시예 5
sn-글리세로-3-포스포-아시클로비르의 제조
1,2-이소프로필리덴-sn-글리세로-3-포스페이트, 1 mM (실시예 4B에서 제조된) 및 아시클로비르 (1 mM)을 무수 피리딘 (10 ml) 및 DCC (4 mmol)에 현탁하였다. 용해된 피리딘 (4 ml)을 첨가하고, 이 혼합물을 25 내지 60 ℃에서 12 내지 72 시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고, 잔류물에 에테르로 분쇄하였다. 조 산물을 실시예 3에서 설명한 것처럼 이온 교환 크로마토그래피로 정제하였다. 수성의 아세트산을 처리하여 생성물로부터 이소프로필리덴-보호기를 제거하여 표제 화합물을 생성하였다.
이외에, 표제 화합물은 2,4,6-트리이소프로필벤젠술포닐 클로라이드 (TPS-Cl)를 축합제로 사용하여 제조하였다.
실시예 6
아시클로비르 디포스페이트 디팔미토일글리세롤의 염기성 가수분해에 의한 아시클로비르 포스페이트 에스테르 혼합물의 제조
아시클로비르-디포스페이트-디팔미토일글리세롤 (1 mmol)을 클로로포름에 용해하고, 메탄올 중의 수산화나트륨 (2.1 mmol)을 첨가하였다. 20 내지 90 분 동안 반응을 수행하고, 그 진행을 TLC를 사용하여 모니터하였다. 반응이 종료하면, Dowex-50 X-2 (H+)를 반응 혼합물에 첨가하여 pH를 7로 조정하였다. 여과법으로 수지를 분리하고, 여과물을 동결건조하고, 조 생성물을 실시예 1에 기재된 것처럼 정제하였다.
실시예 7
모노뉴클레오사이드로부터 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 제조
데옥시리보뉴클레오타이드, 디데옥시리보뉴클레오타이드 및 동족체의 5'-트리포스페이트의 제조는 하기 개요의 일련의 반응이 관련된다.
뉴클레오타이드 동족체 모노포스페이트 합성은 현재 계류중인 1993년 5월 12일 출원된 미국 특허출원 제08/060,258호 및 실시예 1에서 설명되었다. 추가의 방법은 다음과 같다.
뉴클레오타이드 (I) 및 과량의 1,1'-카르보닐디이미다졸 (II)를 실온에서 1 시간 동안 반응시켜 이미다졸리데이트 (III)을 반응시켰다. 미반응된 1,1'-카르보닐디이미다졸을 메탄올로 분해하고, 과량의 무기 파이로포스페이트 (IV)를 첨가하였다. 이로부터 반응 물질로부터 연속적으로 무기 파이로포스페이트의 형성이 제거된다. 인산화 반응은 무기 파이로포스페이트 (IV)의 첨가 후 약 24 시간 후에 종료되며, 그 후 뉴클레오사이드 트리포스페이트 산물 (V)를 DEAE-셀룰로오스상에서 음이온 교환 크로마토그래피로 정제하고, 산물을 나트륨 염과 같은 염으로 전환시켰다. 뉴클레오타이드 (I) 및 이미다졸리데이트 (III)은 함께 반응하여 대칭적인 파이로포스페이트 부산물을 형성할 수 있기 때문에, DEAE-셀룰로오스 상의 음이온 교환 크로마토그래피는 필요한 산물 (V)가 불필요한 부산물보다 낮은 전하를 갖는 저 pH에서 수행하여 두 화합물을 분리한다.
합성에 사용된 한 제제는 트리부틸암모늄 파이로포스페이트로 하기 절차에 따라 제조한다. 테트라나트륨 파이로포스페이트 데카하이드레이트 (446 mg, 1 mmol)의 용액을 Dowex 50W-X4 (피리디늄) 수지 (17 ml)의 칼럼을 통과시켜 수득된 피리디늄 파이로포스페이트 수용액에 트리부틸아민 (0.24 ml, 1 mmol)을 첨가한다. 이 용액을 진공하에서 농축하고, 무수 피리딘을 첨가하고 연속적으로 증발시키고 이어서 N,N-디메틸포름아미드 (DMF) 잔류물 10 ml의 두 할당량을 첨가하고, 증발시켜 건조하였다.
뉴클레오사이드 트리포스페이트의 합성은 하기 방법으로 달성되었다. 1 ml의 DMF 중의 무수 트리부틸암모늄 염으로서 모노뉴클레오타이드 (0.1 mmol)의 용액 또는 현탁액에 1 ml의 DMF 중의 1,1'-카르보닐디이미다졸 (80 mg, 0.5 mmol)을 첨가하였다. 이 배합물을 30 분 동안 혼합하고, 실온에서 4 내지 12 시간 동안 건조기에 유지한 후에, 33 ㎕ (0.8 mmol)의 메탄올로 처리하고, 30 분 동안 실온에서 반응시켰다. 5 ml의 DMF 중의 트리부틸암모늄 파이로포스페이트 (0.5 mmol)를 첨가하고, 격렬히 혼합하고, 그 후 혼합물을 24 시간 동안 실온에서 건조기에 유지하여 이미다졸륨 파이로포스페이트를 침전시켰다. 이 침전물을 4 회의 1 ml 할당량의 DMF로 세척하고, 원심분리하고 다시 DMF에 재현탁하여 80 - 100 %의 순도를 얻었다. 상층액으로 동 부피의 메탄올로 처리하고 진공하 증발하여 건조하였다. 잔류물을 중탄산 트리에틸암모늄의 직선 구배 (pH 5 내지 7.5의 약 0 내지 0.4 M의 3 L 구배)를 갖는 DEAE 셀룰로오스 칼럼 (2×20 cm) 상에서 크로마토그래피하고, 분획을 모으고, 분광 광도계로 분석하여 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 함유하는 분획을 확인하였다. 적절한 분획을 진공하에서 증발시키고, 트리에틸암모늄 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 약 0.05 M의 농도가 되도록 메탄올에 용해시키고, 5 배 부피의 나트륨 퍼클로레이트 (15 당량)의 아세톤 용액을 첨가하여 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 나트륨 염의 침전물을 형성하였다. 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 다른 염이 적절한 침전 반응에 의하여 제조될 수 있다는 것이 본 분야의 숙련자에게 이해될 수 있다. 침전된 염은 원심분리에 의하여 모아지고 1 ml의 아세톤으로 4회 세척하고, 오산화인 상에서 진공하에 건조하였다.
다음 실시예에 제시된 것을 포함하여 부가적인 절차가 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 합성에 이용가능하다.
실시예 8
2,2,2-트리브로모메틸 포스포로모르폴리노클로리데이트를 사용하여 뉴클레오사이드 모노-, 디-, 및 트리-포스페이트의 합성
기본적으로 붐 등의 문헌 [Tetrahedron Lett. 32:2779-2782, 1975]의 방법을 사용하여 리보뉴클레오사이드의 모노-, 디- 및 트리포스페이트 및 이들의 유도체를 단일 중간체로부터 제조하였다. 일반적으로, 이 반응에는 일가의 시약 (2,2,2-트리브로모메틸 포스포로모르폴리노클로리데이트)을 리보뉴클레오사이드 (또는 그의 유도체)와 반응시켜 리보뉴클레오사이드에 2,2,2-트리브로모에틸 보호기가 부착된 포스포트리에스테르 유도체 (즉, 리보뉴클레오사이드 5'-포스포모르폴리데이트 또는 리보뉴클레오사이드 5'-포스포모르폴리데이트 유도체를 제조하기 위하여)를 제조하는 반응을 포함한다. 보호기는 산성의 해보호 및 중화 반응의 Cu/Zn 커플링 반응에 의하여 제거되어, 해보호 단계에서 사용된 산 및 중화반응에서 사용된 암모늄염에 따라 모노-, 디- 및 트리포스페이트가 생성된다. 즉, 모노포스페이트 리보뉴클레오사이드를 수득하기 위하여, HCl 및 암모니아가 사용되며; 디포스페이트 리보뉴클레오사이드를 수득하기 위하여 인산의 모노(트리-n-부틸암모늄)염이 사용되고; 트리포스페이트 리보뉴클레오사이드를 수득하기 위하여 비스(트리-n-부틸암모늄)파이로포스페이트가 사용된다.
일반적인 반응은 하기와 같이 나타낼 수 있다.
1 가의 시약 (1) 2,2,2-트리브로모메틸 포스포로모르폴리노클로리데이트는 2,2,2-트리브로모메틸 포스포로디클로리데이트 및 모르폴린을 무수 에테르 중에서 반응시켜 제조되고, 본 분야의 공지된 방법으로 시클로헥산/n-펜탄을 사용하여 이로부터 반응 산물이 분리되고 재결정된다. 결정성 2,2,2-트리브로모에틸 포스포로모르폴리노클로리데이트는 79 ℃의 융점을 갖는다.
1 가의 시약 (2 mmol)을 1 밀리몰의 뉴클레오사이드 또는 그의 유도체와 무수 피리딘 중에서 20 ℃로 48 시간 동안 혼합하고, 이 반응 혼합물을 크로마토그래피 (헌트 및 라이비, Chem. Ind. 1868, 1967)로 분획하여 무색의 뉴클레오타이드 (III) 고형물을 수득하였다. 무수 DMF 중에서 뉴클레오타이드를 Cu/Zn으로 20 ℃로 10 분동안 처리하고, 여과하여 과량의 Cu/Zn을 제거하여 뉴클레오사이드 포스포로모르폴리데이트를 생성하였다.
뉴클레오사이드 포스포로모르폴리데이트를 상이한 산 및 암모니아 원으로 처리하여 모노-, 디- 또는 트리포스페이트를 생성하였다. 모노포스페이트의 경우, 포스포로모르폴리데이트를 0.01 N HCl, pH 2로 20 ℃에서 2 시간 동안 처리하고 그 후 수성의 암모니아 (pH 9)로 중화하고 세파덱스 G-25 칼럼 상에서 정제하였다.
유사하게, 2 ml의 무수 DMF 중의 포스포로모르폴리데이트 (0.1 밀리몰)을 2 ml의 무수 DMF 중의 0.5 밀리몰의 비스(트리-n-부틸암모늄)파이로포스페이트와 수분을 배제한 조건에서 20 ℃로 3 시간 동안 반응시켜, 뉴클레오사이드 5'-트리포스페이트를 수득하였다. 반응 산물을 진공하에서 농축하고, Dowex 50 (암모늄 형)으로 처리하고, DEAE 셀룰로오스 칼럼 (2×25 cm) 상에서 0.0 내지 0.3 M Et3NH2CO3용액의 3 리터의 직선 구배를 사용하여 정제하였다.
뉴클레오사이드 5'-디포스페이트는 수분을 배제한 조건에서 20 ℃로 3 시간 동안 4 ml의 무수 피리딘 중에서 포스포로모르폴리데이트 (0.1 밀리몰)을 0.6 밀리몰의 모노(트리-n-부틸암모늄)포스페이트와 반응시켜 수득하고, 반응산물을 유사하게 농축하고 정제하였다. 이외에, 포스포트리에스테르 유도체 (III)은 모노(트리-n-부틸암모늄)포스페이트를 함유하는 피리딘 용액중의 Zn 분진으로 처리하여 해당되는 뉴클레오사이드 디포스테이트로 직접 전환될 수 있다. 즉, 1 밀리몰의 시약 III을 수분을 배제한 조건에서 20 ℃로 48시간 동안 0.1 g의 미세분할된 Zn 및 12 밀리몰의 모노(트리-n-부틸암모늄)포스페이트를 함유하는 15 ml의 무수 피리딘의 교반 용액에 첨가한다. 그 후, 반응 혼합물을 원심분리하여 Zn을 침전시키고, 상층액을 DEAE 셀룰로오스 상에서 정제하기에 앞서 15 ml의 물과 3회 공증발시켰다.
실시예 9
아시클로비르 트리포스페이트의 합성
(1) 아시클로비르-5'-트리포스페이트, 트리에틸암모늄 염, 합성. 아시클로비르 (25 mg, 0.1 mmol)을 트리메틸 포스페이트 (250 ㎕, 1.07 밀리몰)에 용해하고, POCl3(18.5 ㎕, 0.2 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물을 1.5 시간 동안 0 ℃에서 교반하고, 1 ml의 무수 DMF 중의 0.5 M 비스(트리-n-부틸암모늄)파이로포스페이트 및 1 ml의 트리-n-부틸아민의 혼합물을 1 분동안 격렬히 교반하면서 첨가하고; 이 용액을 1 M의 수성의 Et3NH2CO3용액, pH 7로 중화하고, 감압하에서 증발시켜 건조하였다. 잔류물을 Et3NH2CO3용액, pH 7 (11 H2O/11 0.7 M TBK) 용액의 직선 구배를 사용하는 DEAE 세파덱스 칼럼 (2.6×30 cm) 상에서 정제하여, 258 nm의 자외선 (H2O) λ최대를 갖는 무색의 고형물을 수득하였다.
실시예 10
아시클로비르 포스포메틸렌디포스포네이트의 합성
합성은 기본적으로 미엘스 등의 방법 1 (J. Am. Chem. Soc. 85:3292-3295, 1963)에 설명되어 있다. 뉴클레오사이드 5'-포스포르아미데이트를 메틸렌디포스폰산과 반응시켜 뉴클레오사이드 폴리포스페이트의 포스폰산 동족체를 제조하였다. 이외에, 미엘스의 방법 2 (상기 문헌)를 사용하여 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 축합제로서 디시클로헥실카르보디이미드 (DCC)를 사용하여 메틸렌디포스폰산과 반응시켰다.
방법 1에 따라, 요오드화메틸렌과 과량의 트리에틸 포스파이트를 반응시켜 제조된 그의 테트라에틸 에스테르를 농축된 HCl 중에서 가수분해하여 메틸렌디포스폰산을 수득하였다. 1,3-디시클로헥실구아니디늄 아시클로비르 5'-포스포르아미데이트 (3.6 밀리몰) 및 메틸렌디포스폰산 (10.8 밀리몰)을 54 ml의 새롭게 증류된 ο-클로로페놀로 처리하고; 이 혼합물을 빙냉하고, 36 ml의 무수 피리딘을 첨가하였다. 이 결과의 용액을 실온에서 때때로 진탕하면서 48 시간 동안 방치하고, 빙냉하면서 300 ml의 물을 첨가하였다. 이 용액을 에테르로 6 회 추출하였다 (총 부피 850 ml). 1 N HCl로 수용액의 pH를 2로 조정하고, 30 g의 산으로 세척한 챠콜 (Norit A)을 처리하고, 30 분 동안 교반하고; 그 후 여과법으로 챠콜을 모으고, 물 (전체 5 L의 부피)로 완전히 세척하였다. 아시클로비르 유도체를 50 % 수 에탄올 - 5% 농축 수산화암모늄 (총 3 리터)으로 용리하고, 용리물을 모아 35 ℃에서 증발시켜 400 ml의 부피로 농축하였다. 농축된 용리물을 2.7 cm×31 cm의 도웩스-2 칼럼 (클로라이드; 8% 가교결합)에 적용하고, 2 리터의 0.003 N HCl (혼합 용기에서) 및 2 리터의 0.003 N HCl + 0.45 N LiCl (수용기에서)의 혼합으로부터 생긴 직선 구배로 용출하고; 10 ml의 분획을 모으고, 아시클로비르 메틸렌디포스포네이트를 함유하는 분획을 본 분야에 공지된 방법을 사용하여 종이 크로마토그래피 또는 자외선 흡광도로 확인하였다. 아시클로비르 메틸렌디포스포네이트 함유 분획을 1 N LiOH로 중화하고, 30 ℃에서의 증발법으로 농축하고, 농축된 용액을 250 ml의 아세톤-10 % 메탄올로 처리하여 고형물을 침전시키고, 이를 원심분리로 분리하고, 세척물에 염화물이 감지되지 않을 때까지 아세톤-10 % 메탄올 혼합물로 세척하였다. LiOH로 pH 8로 조정된 100 ml의 물에 용해하고, 상기 설명한 혼합 챔버에서의 1.5 리터의 0.003 N HCl 및 수용기에서의 1.5 리터의 0.003 N HCl + 0.45 N LiCl의 혼합으로부터 생긴 구배를 사용하여 상기 설명한 것처럼 도웩스-2 칼럼을 통하여 이 용액을 크로마토그래피하고, 용출물을 상기 설명한 것처럼 처리하고, 침전물을 6 ml의 물에 용해시키고, 40 ml의 메탄올로 침전시켜 아시클로비르 메틸렌디포스포네이트의 Li-염을 더 정제하였다. 최종 침전물을 15 ml의 물에 용해하고, 동결 건조하여 테트라리튬 아시클로비르 메틸렌디포스포노에이트를 제조하였다.
방법 2를 사용하여, 메틸렌디포스폰산 (11.4 밀리몰) 및 아시클로비르 모노포스페이트 (2.6 mmol)을 피리딘 (30 ml) 및 물 (4 ml)에 용해하여 두 상의 혼합물을 제조하고, 격렬히 교반하면서 세 할당량 (반응 출발시에 29 밀리몰, 4 시간 후에 48 밀리몰, 및 12 시간 후에 19 밀리몰)으로 DCC를 실온에서 첨가하였다. 24 시간 후, 반응이 종료되고 침전된 디시클로헥실우레아를 여거하고, 물로 세척하였다. 여과물 및 세척물을 물로 총 부피가 150 ml이 되도록 조정하고, 에테르 (총 300 ml)로 5회 추출하였다. 이 용액을 pH 8로 조정하고, 2.5 cm×17.5cm 칼럼의 도웩스-1 칼럼 (포맷; 2% 가교 결합)상에서 크로마토그래피하고, 칼럼을 1.5 리터의 물로 세척하여 피리딘을 제거하였다. 칼럼으로 부터의 용리는 500 ml의 물을 함유하는 혼합 챔버에 4 N 포름산 (500 ml), 4 N 포름산 + 0.1 M 암모늄 포르메이트 (500 ml), 및 4 N 포름산 + 0.2 M 암모늄 포르메이트 (1500 ml)의 용액을 연속적으로 첨가하여 생성된 구배를 사용하여 수행하고, 15 ml 분획을 모았다. 2CdATM을 함유하는 분획 (대략 115 내지 134번째 시험관)을 본 분야의 공지된 방법에 따라 자외선 흡광도를 사용하여 확인하였다. 2CdATMDP를 함유하는 분획을 모아 약 200 ml의 부피로 동결건조하고, 7 g의 산 세척한 챠콜 (Norit A)을 처리하여 15 분 동안 교반하고, 여과법으로 챠콜을 모으고 물로 세척하였다 (총 800 ml). 이 산물을 50 % 수성 에탄올-5 % 농축 수산화암모늄 (총 600 ml)으로 용출하고, 이 용출물을 20 ℃에서 증발하여 200 ml의 부피로 농축하고, 여과하여 미량의 챠콜을 제거하고, 동결건조하여 분말화하였다. 이 분말을 4 ml의 물에 용해하고, 이 용액에 과량의 1 M 아세트산바륨으로 처리하고, 그 결과의 침전물을 원심분리법으로 모아, 물로 세척하고 0 ℃에서 0.1 N HBr중에 용해하였다. 이 용액을 1 N NaOH를 사용하여 pH 6.5로 조정하고, 그 결과의 침전물을 원심분리법으로 모으고, 2 ml의 물, 에탄올 및 에테르 각각으로 연속적으로 세척하였다. 시료를 P2O4상에서 12 시간 동안 실온으로 건조하여 디바륨 2CdATMDP 수화물을 수득하였다. 본 발명의 다른 뉴클레오사이드 동족체 포스포메틸렌디포스포노에이트를 유사하게 제조하였다.
실시예 11
HSV의 아시클로비르-내성 TK 돌연변이체 (DM.21)에서의 아시클로비르 모노포스페이트의 항바이러스 효과의 부재
헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV)의 야생형 균주 또는 HSV (DM.21)의 돌연변이 균주 각각으로 감염된 Wi-섬유아세포의 별도의 배양액을 각각 아시클로비르 또는 아시클로비르 모노포스페이트로 처리하였다. DM.21 돌연변이체는 ACV를 ACV-MP로 전환시켜 아시클로비르에 내성을 있게하는 타이미딘 키나제 효소가 없다. HSV-1에 대한 결과를 도 1에 나타내고 HSV-DM.21에 대한 결과는 도 2에 나타내었다. IC50은 바이러스 플라크 형성율을 50 %로 억제하는 항바이러스 제제의 농도이다.
헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV-1)의 야생형 분리체 및 실험실 균주에서 아시클로비르 및 아시클로비르 모노포스페이트는 0.1 μM의 IC50(도 1)을 갖는다. 비교하였을 때, 이러한 분석에서 아시클로비르 및 아시클로비르 모노포스페이트는 모두 돌연변이체 HSV에 대하여 100 μM 과량의 IC50을 갖는다.
생체외의 이러한 결과를 기준으로 할 때, 아시클로비르 모노포스페이트가 HSV의 타이미딘 키나제 결핍 또는 다른 돌연변이 균주로 감염된 동물에 국소적으로 투여될 때 유의한 활성을 나타낼 것으로 기대할 수 없다.
실시예 12
HSV의 아시클로비르-내성 균주로 감염된 생쥐에서의 아시클로비르 포스페이트의 항바이러스 효과
HRS/J 형 생쥐를 엘리스의 문헌 [Antimicrobial Agents and Chemotherapy 33(3): 304-310 (1989)]에서 설명된 난절 방법으로 경피적으로 감염시켰다. 요약하면, 10 마리의 생쥐 군을 가벼운 에테르 마취하에 25-게이지 바늘을 사용하여 코를 난절하고, 희석된 바이러스가 침적된 면-팁 적용기를 사용하여 10초간 문질러서 접종하였다. 감염에 사용된 바이러스는 엘리스 등의 문헌을 참고로 할 때 TK-결핍 균주 (TKD)이다. 감염 3시간 후에, 상기 인용된 엘리스의 문헌에 따라 수성 크림 (AC) 형태의 아시클로비르 또는 아시클로비르 포스페이트로 4일 동안 일일 3회로 동물을 국소 치료하였다.
이 결과는 도 3에 제시된다. 5 gm%의 아시클로비르를 함유하는 제형이 활성이었다. 대조적으로, 80%의 아시클로비르 모노포스페이트와 함께 20 %의 다른 아시클로비르 포스페이트 에스테르 (아시클로비르 데포스페이트 및 아시클로비르 디포스페이트 글리세롤)의 혼합물 5 gm%를 포함하는 제형이 단지 몇마리에서만 헤르페스 병변을 발생하는, 우수한 활성을 나타내었다. 모든 병변이 모든 군에서 8일 내에 치료되었다.
더 병원성 균주인 TK-변경된 HSV-1 바이러스 (TKA, 엘리스, 상기 문헌)를 사용하여 5일 동안 계속해서 처리하여 상기 설명한 절차를 반복하였다. TKD바이러스와 달리, TKA는 미처리된 생쥐에서 치명적이다. 5 gm%-아시클로비르를 사용한 처리는 14일 내에 대부분의 동물을 생존시키고 실질적으로 개선시켜 병변 점수를 알맞게 감소시켰다. 그러나 동일한 농도의 포스페이트 에스테르의 경우, 병변 점수는 크게 개선되었고, 도 4에 나타낸 것처럼 모든 병변은 9일 후에 해소되었으며, 모든 동물은 생존하였다.
실시예 13
아시클로비르-내성 야생형 HSV-1로 감염된 생쥐에서의 아시클로비르 모노포스페이트의 항바이러스 효과
아시클로비르-민감성의 야생형 HSV-1 및 아시클로비르 유도체로서 단지 아시클로비르 모노포스페이트 (ACV-MP)를 갖는 제형을 사용하여 실시예 12의 절차를 반복하였다. 하나는 수성의 크림에 ACV-MP가 14.5 밀리몰/100 ml로 존재하고, 다른 하나는 수성의 크림에 22.2 밀리몰/100 ml로 존재하도록 두 크림 (그러나, 포스페이트기의 첨가에 의하여 모노포스페이트에 존재하는 아시클로비르의 몰수는 순수한 아시클로비르에 비하여 모두 5 gm%로 감소하였다)을 제형하였다.
감염 24 시간 후에 처리를 시작하여 4일 동안 1일 4회 계속하였다. 10 마리의 미처리된 생쥐는 5일 째에 단계 4의 병변을 발생하였고 14일 째에 모두 죽었다 (도 5). 아시클로비르 모노포스페이트 처리된 동물은 병변이 발생하지 않았고, 10 마리의 동물 중 10마리의 동물이 모두 생존하였다 (도 5). 아시클로비르 처리된 군에서, 여러 동물은 7 내지 9일 째에 경증의 병변이 발생하여 해소되었고, 10 마리중 9마리의 동물이 생존하였다 (도 5).
이러한 연구로, 저 투여량 (14.5 밀리몰/100 ml)의 ACV-MP가 야생형의 HSV-1 감염에서의 병변을 방지하는 데 있어서의 아시클로비르 (22.2 밀리몰/100 ml) 보다 더욱 효과적이라는 것을 보여준다.
실시예 14
아시클로비르-내성 HSV-1로 감염된 생쥐에서의 아시클로비르 모노포스페이트의 항바이러스 효과
아시클로비르 유도체로서 단지 아시클로비르 모노포스페이트 (ACV-MP)를 갖는 제형을 사용하여 실시예 12의 절차를 반복하였다. 감염 3 시간 후에 처리를 시작하였고, 감염일에 2회 처리하고, 그 후 4일 동안 매일 3회 처리하였다. 도 6을 참고로할 때 14.5 밀리몰/100 ml의 ACV-MP는 아시클로비르-내성 (TK-변경된) HSV-1로 감염된 동물에서 병변 점수를 감소시키는 데 있어서, 22.2 밀리몰/100 ml의 아시클로비르 보다 분명히 더욱 효과적이다.
대조군 및 아시클로비르-처리된 군에서, 10 마리중 8마리가 14일 실험에서 생존하였고, 아시클로비르 모노포스페이트 처리로 10 마리중 10 마리 모두가 생존하였다.
실시예 15
아시클로비르-내성 HSV-2로 감염된 기니아 피그에서의 아시클로비르 모노포스페이트의 항바이러스 효과
1차 생식기의 치료에 있어서 수성 크림 (AC)에서의 아시클로비르 모노포스페이트 (ACV-MP)가 폴리에틸렌 글리콜 (ACV-PEG)에서의 5 % 아시클로비르 보다 더욱 효과적인지를 측정하기 위하여 시험하였다. 특히, 우리는 ACV-내성 HSV-2에 의하여 야기되는 기니아 피그의 생식기 헤르페스 감염에 대하여 조사하였다. 부가적으로, 두 부형제 시스템, 즉 수성 크림 (AC) 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)에서 아시클로비르 치료를 비교하였다. 피부 및 질부 자극을 평가하기 위하여 위약-대조하고, 감염되지 않은 동물에 ACV 제형을 처리하였다.
젖땐 기니아 피그에 HSV-2를 질부내 접종하면 생식관에서 바이러스가 먼저 복제되고, 이어서 외부 소포 병변의 발생을 특징으로 하는 1차 생식기 감염을 초래한다. 바이러스 양은 질관에서 1 내지 3일 째에 피크를 나타내고, 7-10일에 점차 감소한다. 외부 생식 병변은 4일 째에 최초로 발생하였고, 심각한 피크 병변은 6 내지 8일 째에 발생하였으며, 이 병변은 일반적으로 15 내지 18일에 치료되었다.
변경된 타이미딘 키나제를 가지고, 생체외 조건에서 ACV 처리에 대한 내성을 갖는 HSV-2 균주 12247을 동물에 접종하였다. 먼저 중량 250 내지 300 g의 암컷의 허틀리 기니아 피크 (챨스 리버, 킹스톤, 뉴욕)의 질부를 닦아 질부 분비물을 제거하였다. 1 시간 후에, 이 동물의 질부내에 2.4×104플라크 형성 단위 (pfu)를 접종하였다. 접종은 바이러스 침적된 스웹을 질관에 삽입하고, 대략 6회 회전하여 달성하였다.
10 마리의 기니아 피그 군을 질내 및 외부 생식 피부 모두에 0.1 ml (처리당 동물당 총 0.2 ml)의 각각의 제형으로 치료하였다. 바이러스 접종 24시간 후 시작하여 7일 동안 매일 3회 치료하였다. 세 마리의 미감염된 동물을 동일한 스케쥴로 각각의 제형으로 처리하여 국소 독성 및 자극을 평가하였다.
질관에서의 HSV-2 복제에 대한 여러 치료의 효과를 결정하기 위하여, HSV-2 접종후 1, 3, 5, 7, 및 10일에 1차 접종 동안 수득된 질 분비물의 스웹을 수득하였다. 스웹을 2.0 ml의 매질을 함유하는 시험관에 두고, 볼텍스하고, HSV를 정량하기 까지 -70 ℃에서 동결하였다. 모든 시료가 모아지면 이들을 해동하고 연속적으로 희석하고, 마이크로타이터 CPE 분석법으로 토끼 신장 세포를 사용하여 HSV-2의 양을 측정하였다.
또한, 치료의 효능을 측정하기 위하여 외부 생식 병변의 발생과 심각도를 측정하였다. 병변의 심각도는 0 내지 5 점수로 등급화하였다. 병변의 존재 또는 부재 및 심각도는 바이러스 접종후 19일 동안 기록하였다. 감염율, 피크 병변 점수, 피크 바이러스 양, PBS 위약 처리된 및 PEG 의약 처리된 또는 AC 위약 처리된 및 AC 의약 처리된 동물 사이의 바이러스 양-일 곡선하의 면적, 및 병변 점수-곡선 면적을 만-화이트니 유 (Mann-Whitny U) 등급 합계 실험을 사용하여 비교하였다. p-값은 0.05 이하의 유의도를 나타내었다.
질부 바이러스 복제에 대한 ACV 제형의 국소 치료 효과를 표 I에 나타내었다. 단지 ACV-MP (5 % ACV-MP-PEG 또는 5 % ACV-MP-AC)로 처리한 것만이 곡선 (AUC) 하의 바이러스 양-일 면적 및 평균 피크 바이러스 양을 감소시켰다.
아시클로비르 내성 HSV-2를 질부내 접종된 기니아 피그의 질부 바이러스 양에 대한 아시클로비르 모노포스페이트의 치료 효과
처리A #바이러스 양성/#접종된 바이러스 양-일 곡선하 면적 p-값 평균 피크 바이러스 양 p-값
위약-PBS 10/10 31.6 - 5.0 -
위약-AC 10/10 34.6 NSB 5.1 NS
ACV-PEG 10/10 33.4 NS 5.2 NS
ACV-AC 10/10 27.9 NS 4.6 NS
ACV-MP-PEG 6/10 3.4 0.001 2.0 0.001
ACV-MP-AC 9/10 14.5 0.001 3.7 0.05
A. 국소 및 질부내 처리는 바이러스 접종 24 시간 후 시작하였고, 7일 동안 매일 3회 계속하였다. 몰 기준으로 한 아시클로비르 함량은 순수한 아시클로비르 (22.2 밀리몰/100 ml)을 사용하여 수행한 것에 비하여 아시클로비르 모노포스페이트 (14.5 밀리몰/100 ml)을 사용한 실험에서 더 낮았다.
B. NS는 적절한 위약 처리된 군에 비교하였을 때, 통계학적인 유의도가 없음을 나타낸다.
병변 발생에 대한 ACV 제형을 사용한 국소 치료 효과를 표 II에 나타내었다. ACV 및 ACV-MP 제형 모두는 적절한 위약 처리된 군에 비교하였을 때 병변 점수-일 AUC를 유의하게 변경시켰다. 그러나, 5 % ACV-MP-PEG를 사용한 치료만이 평균 피크 병변 점수를 유의하게 감소시켰다.
기니아 피그에서의 아시클로비르 내성 생식기 HSV-2 감염에서의 외부 병변 발생에 대한 아시클로비르 모노포스페이트를 사용한 치료 효과
처리A 병변 점수-일 곡선하 면적 p-값 평균 피크 병변 점수 p-값
위약-PBS 28.3 - 3.0 -
위약-AC 34.2 NSB 3.5 NS
ACV-PEG 9.5 0.001 1.8 NS
ACV-AC 19.3 0.01 2.5 NS
ACV-MP-PEG 1.7 0.001 0.7 0.001
ACV-MP-AC 23.4 0.05 2.3 NS
A. 국소 및 질부내 처리는 바이러스 접종 24 시간 후 시작하였고, 7일 동안 매일 3회 계속하였다. 몰 기준으로 한 아시클로비르 함량은 순수한 아시클로비르 (22.2 밀리몰/100 ml)을 사용하여 수행한 것에 비하여 아시클로비르 모노포스페이트 (14.5 밀리몰/100 ml)을 사용한 실험에서 더 낮았다.
B. NS는 적절한 위약 처리된 군에 비교하였을 때, 통계학적인 유의도가 없음을 나타낸다.
ACV-내성 HSV-2 생식기 헤르페스 감염의 기니아 피그 모델에서 단지 ACV-MP만이 유의하게 질부 바이러스 복제를 감소시켰다. 또한, ACV-MP-PEG처리된 군이 가장 낮은 바이러스 양-일 및 평균 피크 양 값을 가졌다. ACV-MP 및 ACV가 모두 병변 발생을 변경시켰지만, PEG의 의약이 AC의 경우 보다 더욱 낮은 점수를 가졌다. 이외에 ACV-MP-PEG를 수용한 동물이 가장 낮은 병변 점수-일 및 평균 피크 병변 점수를 가졌다.
더욱이, 연구 전체에 걸쳐 미감염된 ACV 제형-처리된 동물에서 생식 부위의 어떠한 자극 또는 어떠한 다른 독성의 신호도 없었다.
이러한 결과는 HSV-2 생식기 헤르페스를 치료하는 데 있어서의 아시클로비르 모노포스페이트의 강한 활성을 나타낸다. 더욱이, 폴리에틸렌 글리콜 분산된 아시클로비르 모노포스페이트가 병변을 치료하는 데 가장 좋은 효과를 나타내는 것에 주목할만 하다.
실시예 16
아시클로비르 디포스페이트의 활성
아시클로비르 유도체로서 단지 아시클로비르 디포스페이트 (ACV-DP)를 갖는 제형을 사용하여 실시예 12의 절차를 반복하였다. ACV 단독의 경우보다 더욱 우수한 효과를 관찰하였다.
실시예 17
아시클로비르 모노포스페이트 글리세롤의 활성
아시클로비르 유도체로서 단지 아시클로비르 모노포스페이트 글리세롤 (ACV-MP-G)를 갖는 제형을 사용하여 실시예 12의 절차를 반복하였다. ACV 단독의 경우보다 더욱 우수한 효과를 관찰하였다.
실시예 18
아시클로비르 디포스페이트 글리세롤의 활성
아시클로비르 유도체로서 단지 아시클로비르 디포스페이트 (ACV-DP-글리세롤)를 갖는 제형을 사용하여 실시예 12의 절차를 반복하였다. ACV 단독의 경우보다 더욱 우수한 효과를 관찰하였다.
실시예 19
아시클로비르 모노포스페이트 모르폴리데이트의 활성
아시클로비르 유도체로서 단지 아시클로비르 모노포스페이트 모르폴리데이트 (ACV-MP-모르폴리데이트)를 갖는 제형을 사용하여 실시예 12의 절차를 반복하였다. ACV 단독의 경우보다 더욱 우수한 효과를 관찰하였다.
실시예 20
아시클로비르 모노포스페이트 이소프로필리덴 글리세롤의 활성
아시클로비르 유도체로서 단지 아시클로비르 모노포스페이트 이소프로필리덴 글리세롤 (ACV-MP-이소P-G)를 갖는 제형을 사용하여 실시예 12의 절차를 반복하였다. ACV 단독의 경우보다 더욱 우수한 효과를 관찰하였다.
실시예 21
아시클로비르 디포스페이트 이소프로필리덴 글리세롤의 활성
아시클로비르 유도체로서 단지 아시클로비르 디포스페이트 이소프로필리덴 글리세롤 (ACV-DP-이소P-G)를 갖는 제형을 사용하여 실시예 12의 절차를 반복하였다. ACV 단독의 경우보다 더욱 우수한 효과를 관찰하였다.
실시예 22
아시클로비르 포스포메틸렌디포스포네이트 및 아시클로비르트리포스페이트의 활성
아시클로비르 유도체로서 각각 단지 ACV-포스포메틸렌디포스포네이트 및 아시클로비르트리포스페이트를 갖는 제형을 사용하여 실시예 12의 절차를 반복하였다. ACV 단독의 경우보다 더욱 우수한 효과를 관찰하였다.
실시예 23
아시클로비르 모노포스페이트 및 염의 용해도
아시클로비르 모노포스페이트의 다양한 염에 대하여 용해도를 하기와 같이 실험하였다.
자성 교반 막대를 갖는 3 개의 10 ml 비이커 각각에 2 ml의 증류수를 두었다. 각각의 개별적인 플라스크에 칼륨, 나트륨, 나트륨/암모늄, 및 H+ (유리산)으로부터 선택된 아시클로비르 모노포스페이트 염을 포화 용액이 수득될 때 까지 첨가하였다. 각각의 포화된 염 용액을 비중 여과하였다. 아시클로비르 모노포스페이트 나트륨/암모늄 및 유리 산염 용액을 와트만 번호 4 여과지를 통하여 여과하여 투명한 용액을 얻었다. 칼륨 및 나트륨 염 용액은 와트만 번호 1 여과지를 사용하여 여과하여 각각의 다소 불투명한 용액을 얻었다.
각각의 포화된 염 용액 1 ml을 파이펫을 사용하여 미리 중량을 측정한 둥근 바닥 플라스크에 옮기고, 이 용액을 건조하였다. 모든 액체가 증발된 후에 둥근 바닥 플라스크의 무게를 다시 칭량하여, 밀리리터 당 존재하는 아시클로비르 모노포스페이트 염의 mg을 쉽게 측정하였다.
하기 표에 아시클로비르에 대하여 설명한 것처럼 제조된 여러 염의 용해도를 기재하였다.
염 아시클로비르에 비교한 용해도
H+ 21 X
K+ 85 X
Na+/NH4 + 100 X
Na+ 108 X
표 III에 나타낸 결과에서 아시클로비르 모노포스페이트의 염 형성을 통하여 용해도가 급격히 증가함을 알 수 있다. 다른 뉴클레오사이드 모노포스페이트가 유사하게 강화된 용해도를 나타낼 것으로 기대된다. 이러한 방식으로, 강화된 염의 용해도 때문에 다량의 아시클로비르 모노포스페이트를 함유하는 국소 조성물을 제형하는 것이 가능하다.

Claims (23)

  1. 항바이러스성 뉴클레오사이드 동족체 포스포로티오에이트, 뉴클레오사이드 동족체 포스포아미데이트 및 뉴클레오사이드 동족체 포스포플루오리데이트로 이루어지는 군으로부터 선택된 항바이러스성 뉴클레오사이드 동족체 포스페이트 에스테르.
  2. 1,2-μ-메틸렌-뉴클레오사이드 동족체 디포스페이트;
    2,3-μ-메틸렌-뉴클레오사이드 동족체 트리포스페이트;
    1,2-μ-티오-뉴클레오사이드 동족체 디포스페이트; 및
    2,3-μ-티오-뉴클레오사이드 동족체 트리포스페이트로 이루어지는 군으로부터 선택된 항바이러스성 뉴클레오사이드 동족체 포스페이트 에스테르.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항바이러스성 뉴클레오사이드 동족체가 아시클로비르, 9-(2-히드록시에톡시메틸)구아닌인 화합물.
  4. 국소용의 제약상 허용되는 담체 중에 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 항헤르페스 뉴클레오사이드 동족체 포스페이트 에스테르 또는 제약상 허용되는 그의 염, 또는 이들의 혼합물의 항바이러스 유효량을 포함하는 제약 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 뉴클레오사이드 동족체 포스페이트 에스테르가 뉴클레오사이드 동족체 포스포로티오에이트, 뉴클레오사이드 동족체 포스포아미데이트, 및 뉴클레오사이드 동족체 포스포플루오리데이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 뉴클레오사이드 동족체 포스페이트 에스테르가
    1,2-μ-메틸렌-뉴클레오사이드 동족체 디포스페이트;
    2,3-μ-메틸렌-뉴클레오사이드 동족체 트리포스페이트;
    1,2-μ-티오-뉴클레오사이드 동족체 디포스페이트; 및
    2,3-μ-티오-뉴클레오사이드 동족체 트리포스페이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제약 조성물.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오사이드 동족체가 아시클로비르인 조성물.
  8. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오사이드 동족체 포스페이트 에스테르가 아시클로비르 모노포스페이트인 조성물.
  9. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오사이드 동족체 포스페이트 에스테르가 아시클로비르 디포스페이트인 조성물.
  10. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오사이드 동족체 포스페이트 에스테르가 아시클로비르 트리포스페이트인 조성물.
  11. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항헤르페스 뉴클레오사이드 동족체가 하기 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조성물.
    1-베타-D-아라비노푸라노실-E-5-(2-브로모비닐)우라실;
    2'-플루오로카르보시클릭-2'-데옥시구아노신;
    6'-플루오로카르보시클릭-2'-데옥시구아노신;
    1-(베타-D-아라비노푸라노실)-5(E)-(2-요오도비닐)우라실;
    (1r-1α, 2β, 3α)-2-아미노-9-(2,3-비스(히드록시메틸)시클로부틸)-6H-푸린-6-온;
    9H-푸린-2-아민, 9-((2-(1-메틸에톡시)-1-((1-메틸에톡시)메틸)에톡시)메틸)-(9Cl);
    트리플루오로타이미딘;
    9-[(1,3-디히드록시-2-프로폭시)메틸]구아닌;
    5-에틸-2'-데옥시우리딘;
    E-5-(2-브로모비닐)-2'-데옥시우리딘;
    5-(2-클로로에틸)-2'-데옥시우리딘;
    1-(2-데옥시-2-플루오로-베타-D-아라비노푸라노실)-5-요오도사이토신 (FIAC);
    1-(2-데옥시-2-플루오로-베타-D-아라비노푸라노실)-5-요오도우리딘 (FIAU);
    부시클로비르;
    6-데옥시아시클로비르;
    9-(4-히드록시-3-히드록시메틸부트-1-일)구아닌;
    E-5-(2-요오도비닐)-2'-데옥시우리딘;
    5-비닐-1-베타-D-아라비노푸라노실우라실;
    1-베타-D-아라비노푸라노실타이민;
    2'-노르-2'-데옥시구아노신;
    9-(4-히드록시-3-히드록시메틸부트-1-일)구아닌;
    1-(베타-D-아라비노푸라노실아데닌.
  12. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오사이드 동족체 포스페이트 에스테르가 제약상 허용되는 염의 형태인 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 염이 나트륨, 칼륨, 암모늄 및 수소 염으로 이루어지는 군으로부터 선택된 조성물.
  14. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제약상 담체가 수성의 크림 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어지는 군으로부터 선택된 조성물.
  15. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항바이러스성 뉴클레오사이드 동족체의 유효량을 포함하는 조성물의 유효량을 감염된 병변에 투여하는 것을 포함하는 헤르페스 바이러스 감염된 동물의 경피성 또는 점막성 병변의 국소 치료 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 뉴클레오사이드 동족체 포스페이트 에스테르가 아시클로비르 모노포스페이트인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 뉴클레오사이드 동족체 포스페이트 에스테르가 아시클로비르 디포스페이트인 방법.
  18. 제15항에 있어서, 상기 뉴클레오사이드 동족체 포스페이트 에스테르가 아시클로비르 트리포스페이트인 방법.
  19. 국소용으로 적합한 제약상 담체 중의 항헤르페스 바이러스 뉴클레오사이드 동족체 포스페이트 에스테르, 제약상 허용되는 항헤르페스 바이러스 뉴클레오사이드 동족체 포스페이트 에스테르 염, 또는 이들의 혼합물의 유효량을 동물의 헤르페스 바이러스 감염된 경피 또는 점막 조직에 투여하는 것을 포함하는, 타이미딘 키나제를 코딩하는 바이러스 유전자의 변경 또는 결함에 기인하여 하나 이상의 항바이러스성 화합물에 내성을 갖는 헤르페스 바이러스에 의한 헤르페스 바이러스 감염증의 치료 방법.
  20. 제15항에 있어서, 상기 동물이 인간인 방법.
  21. 제15항에 있어서, 상기 감염이 아시클로비르 내성인 헤르페스 바이러스 균주에 기인한 것인 방법.
  22. 제15항에 있어서, 상기 바이러스의 아시클로비르 내성이 타이미딘 키나제를 코딩하는 바이러스 유전자의 변경 또는 결함에 기인하는 것인 방법.
  23. 항바이러스 유효량의 아시클로비르 트리포스페이트를 함유하는 조성물을 동물의 감염된 경피 또는 점막 병변에 국소적으로 투여하는 것을 포함하는 동물에서의 헤르페스 바이러스 감염의 치료 방법.
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