KR19990014835A - 근육 영양 인자 - Google Patents
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Abstract
척추 동물에서 근육 성장 또는 분화를 촉진시키기 위한 조성물 및 방법을 개시한다. 그러한 조성물은 인터류킨-15의 근육 영양량을 포함하고 퇴행성 위축, 쇠약, 다양한 노화 관련 질병, 당 비내성을 포함하는 당뇨의 이차 영향, 및 근육 이양증, 횡문근육종 및 출혈성 심장 질환을 포함하는 다양한 질병의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물 및 방법이 가축의 고기 및 우유 생산의 효능을 증가시키는 농업적 용도를 발견한다.
Description
척추 동물에서 근섬유내의 핵은 DNA 합성 또는 유사 분열을 할 수 없으므로, 근섬유 수 또는 근섬유 핵 수의 증가는 근아세포 (myoblast)로 알려진 골격근 전구 세포의 증식 및 그에 이은 분화에 기인한다. 성인에서, 근아세포는 근육의 부상시, 세포 주기를 재진입하여 수회의 증식을 이행하고 그에 이어 분화할 수 있는 유사 분열 무활동 상태인 예비 전구체 파퓰레이션으로 잔류하고 세포 주기로부터 영구적으로 퇴진한다. 분화시, 분화된 근아세포 (근세포 (myocytes))는 서로 또는 근섬유와의 융합 능력을 필요로 하고, 또한 근육 특이성 근원섬유 및 수축 단백질로된 큰 집합 (예, 근육 미오신 및 악틴, 트로포닌, 트오포미오신 등)의 등위 발현을 시작한다.
근육 조직은 상이한 영양 인자에 의해 조절되는 몇 개의 상이한 메카니즘에 의해 성장할 수 있다. 근육 조직은 근섬유의 질량 또는 크기를 거대화 또는 증가시키는 과영양, 또는 근섬유의 수 또는 근육 핵의 수를 증가시키는 과형성, 또는 이들 이들 두 개 방법의 조합에 의해 성장할 수 있다. 골격근 조직상에 작용하는 성장 인자는 두 개의 큰 부류로 나뉠 수 있다. 근아세포의 증식을 촉진시키는 인자는 일반적으로 근아세포의 분화를 억제하고 근육 제어 전사 인자 (MRF; muscle regulatory transcription factor)의 발현 및 작용을 억제한다. 역으로 말해서, 근아세포의 분화를 자극하는 인자는 일반적으로 MRF의 발현을 촉진시키고 근육에 과영양을 유발할 수 있다. 근육 영양 인자로서 통상적으로 고려되는 대부분의 약제는 근육의 과영양을 촉진시키기 위해 작용한다. 그러한 과영양 인자는 예를 들어 성장 호르몬 (GH) 또는 인슐린 유사 성장 인자-I (IGF-I)를 포함한다. 근육 과영양은 생체내 또는 시험관내에서 근섬유의 직경을 측정하거나 근육 특이성 근원섬유 및 수축성 단백질의 성장을 측정함으로써 산정될 수 있다.
임상적으로, 그러한 골격근 조직 질량의 감소 또는 근육 위축은 보다 노령인 개체에서의 약함이 중요한 유인 (誘因)이다. 인간 남성에서, 근육 질량은 50에서 80세 사이에서 1/3이 감소한다. 보다 노령에서, 독립적인 생활을 위한 능력의 잠재적인 손실 및 연쇄적인 물리적 능력 감소를 야기하는 추가의 퇴행성 위축을 초래할 수 있다. 더욱이, 물리적 노화 과정은 마른 체중의 현저한 감소 및 중추 비만의 증가를 포함하는, 신체 조성에 지대한 영향을 끼친다. 전체적인 비만 및 지방 분포에서의 변화는 고혈압, 당 비내성 및 당뇨병, 지방이상증, 및 동맥경화증과 같은 공통적인 연령 관계 질병에서 중요한 인자인 것으로 나타난다. 또한, 근육 질량, 및 그에 이은 강도 및 지구력에서 연령과 관련된 감소가 기능 손실, 의존성 및 불능에 대한 중요한 결정 요소가 될 수 있다. 또한 근육 약화는 노령화될수록 감퇴될 소인과 그 결과인 질병율 및 사망률에 주된 인자이다. 미국에서 감퇴로부터의 합병증은 65세 이상의 노인 중에서 사인을 야기하는 6번째에 해당한다.
근골격 약화에 대해 성장 호르몬 또는 IGF-I과 같은 영양 인자를 이용한 치료는 염 잔류, 부종, 혈압 상승, 인슐린 내성, 과혈당증, 저혈당증, 여성형유방, 완골 턴널 증후군 및 퇴행성 근통증/관절통을 포함하는 현저하게 해로운 부작용과 연관될 수 있다. 그러한 부작용은 많은 조직 및 대사 과정에서 이들 인자의 과다발현의 결과인 것으로 보인다. 유사하게 몇몇 연구에서 근육의 강도 또는 골밀도를 증가시키는 것으로 나타나는 에스트로겐 또는 안드로겐을 사용한 치료는 동시에 발암의 위험을 증가시킬 수 있다. 따라서, 근육 과영양, 및 궁극적으로 근육 질량을 촉진시키는 보다 구체적인 작용을 가지는 근육 영양 인자에 대한 필요성이 존재한다. 골격근 질량의 손실을 감소시키거나 역전환시키는 수단은 보다 노령인 개인에 대해 독립 능력을 증가시키고 이에 따른 생활의 질의 향상 및 건강 보호 비용의 감소를 일으킬 것이다. 근아세포의 증식을 촉진시키지 않는 인자가 특히 가치 있을 것이다.
발명의 요약
본 발명은 근육 영양 인자, 및 포유 동물에서 근육 성장 또는 분화를 촉진시키는 그의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 근육 성장, 분화 또는 과영양을 촉진시키는 인터류킨-15 (IL-15)의 용도에 관한 것이다. 근육 성장에 대한 그러한 자극은 위축, 또는 쇠약, 특히 골격근 위축 및 심근 위축을 치료하기에 유용하다. 또한, 근육 조직이 손상을 입거나, 비정상이거나 위축된 특정 질병, 예를 들어 일반적인 노화, 퇴행성 위축, 쇠약 또는 악액증 및 고혈압, 당 비내성 및 당뇨, 지방이상증 및 동맥경화증과 같은 노화 및 근육 질량의 손실과 관련된 다양한 이차 질병은 본 발명을 사용하여 치료될 수 있다. 또한, IL-15가 근아세포 분화를 야기할 수 있으므로 한 IL-15는 횡문근육종의 치료에 사용될 수 있다. 또한 본 발명은 출혈성 심장 장애와 같은, 특정 심부전증의 치료에 관한 것이다. 또한 근육 발육 이상과 같은 근육병의 치료도 본 발명의 한 양태이다.
일반적으로, 본 발명의 방법은 척추 동물에게 필요한 근육 성장 또는 분화를 촉진시키기 위한 IL-15의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 IL-15 단독 또는 예를 들어 스테로이드, 성장 호르몬 또는 IGF-I와 같은 1종 이상의 다른 근육 영양 인자와의 조합을 근육 영양량으로 포함하는 조성물을 추가로 포함한다. 또한 IL-15의 근육 영양량 및 스테로이드, 성장 호르몬 또는 IGF-I와 같은 다른 인자의 근육 영양량을 공급하는 치료 방법은 본 발명에 의해 제공된다. 목축과 관련해서, 본 발명은 목축에서 고기 생산 효능을 증가시키기 위해 척추 동물에서 골격근 성장을 야기하는 조성물 및 방법을 제공한다.
본 발명은 근육 성장 방법에 관한 것으로, 구체적으로 인터류킨-15의 유효량을 투여함으로써 포유 동물에서 근육 성장 또는 분화를 촉진시키는 방법에 관한 것이다.
도 1은 근아세포 증식에서 IL-15의 영향을 나타낸다. 증식은 생쥐 C2 근아세포 (도 1A)를 사용하거나 소 미오겐의 일차 배양물을 사용하여 DNA에3[H]-티미딘을 혼입함으로써 분석하였다. 데이터의 포인트는 IL-15의 각 농도에 대한 두 개의 배양 접시 ± SEM의 평균값을 나타낸다. 에러 바가 나타나지 않는 경우, SEM은 심볼 크기보다 더 작다. 나타낸 데이터는 C2 근아세포에 대해 5회 및 소 일차 배양물에 대해 2회 수행된 실험의 전형이다.
도 2는 웨스턴 블랏의 밀도적 양측정에 의해 계산된, 분화된 소 근육 일차 배양물에 의한 축적된 근육 특이성 미오신 중쇄 (MHC) 상의 IL-15 및 IGF-I의 효과를 설명한다. 유사분열 억제제인, 아피디콜린으로 처리한 잘 융합된 소 미오겐 배양물에 아래와 같이 72시간 동안 IL-15 또는 IGF-I를 투여하였다.Con: 처리하지 않음;IL-15: IL-15를 10 ng/ml로 투여;IGF-I (10): IGF-I를 10 ng/ml로 투여;IGF-I (100): IGF-I를 100 ng/ml로 투여; 및IGF-I + IL-15: IL-15를 10 ng/ml 및 IGF-I를 100 ng/ml로 투여. 처음 4개의 바는 3번의 독립적인 실험에 대한 평균 ± SEM을 나타내고 다섯 번째 바는 2번의 독립적인 실험에 대한 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 3은 IL-15 MHC 발현에 대한 투여량 반응 효과를 나타낸다. 도 3A 및 도 3B에 나타낸 데이터는 각 세포 유형에 대한 두번의 독립적인 실험의 평균 ± SEM을 나타내는 각 지점과, 각각 웨스턴 블랏의 밀도적 양측정에 의해 계산된, C2 근아세포 및 소 미오겐의 일차 배양물에서 대조군 MHC 발현에 대한 퍼센테이지이다. 모두 4일간 IL-15에 노출시킨 후 결정하였다.
도 4는 미오겐의 분화 속도에 대한 IL-15의 영향을 설명한다. 분화된 근세포 핵은 항-MHC 면역세포화학 분석을 사용하여 C2 근세포 배양 (도 4A) 및 소 미오겐의 일차 배양 (도 4B)에서 저혈청 배지로 바꾼 후 24시간 간격으로 양을 측정하였다. 데이터는 평균 ± SEM (n=12)를 나타낸다. 매 시점마다 대조군 및 10 ng/ml의 IL-15로 처리된 배양물 사이의 차이는 스투던츠 t-시험 (Student's t-test)을 사용하여 비교하였다. 두 조의 배양물에서, 2일자 값 ± IL-15는 p≤0.05로 통계상 차이가 있었다. 모든 다른 쌍은 통계상 차이가 없었다.
인터류킨-15 (IL-15)는 IL-2 의존성 세포주, 즉 CTLL-2의 증식을 도울 수 있는 공지의 T-세포 성장 인자이다. IL-15는 그랍스테인 (Grabstein) 등에 의해, 본 발명에 참고 문헌으로 채택된 문헌 [Science,264: 965 (1994)]에서 114개의 아미노산을 가진 완성된 단백질로서 최초 보고되었다. 사람 IL-15의 cDNA는 서열 1에서 나타내었고, 사람 IL-15의 아미노산 서열은 서열 2에서 나타내었다. 본 명세서에서 사용된 용어 IL-15는 서열 2의 천연 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 가지는 폴리펩티드, 및 완만하거나 아주 절박한 조건하에서 서열 1의 핵산 서열과 결합하는 핵산에 의해 지정되는 천연 폴리펩티드의 돌연변이 단백질, 동족체 또는 하부 단위를 의미하고, 이들 각각은 CTLL-2 세포의 증식을 촉진시킬 것이다 [Gillis and Smith,Nature 268:154 (1977); ATCC TIB 214]. CTLL-2 증식 분석에서, 재조합적으로 발현된 전구체로 트랜스펙트된 세포의 상층액 및 IL-15의 완성된 형태의 인프레임 (inframe) 융합은 CTLL-2 세포 증식을 야기할 수 있다. 또한 본 명세서에서 사용된 용어 IL-15는 예를 들어 사람, 원숭이, 소, 돼지, 말 및 쥐를 포함하는 다양한 포유 동물 종으로부터 유도된 IL-15를 의미한다. 본 명세서에 인용된 경우, IL-15 뮤테인 또는 변이체는 천연 포유 동물 IL-15의 서열에 실질적으로 동일한 폴리펩티드이지만 아미노산 결손, 삽입 또는 치환으로 인해 천연 포유 동물 IL-15 폴리펩티드와 상이한 아미노산 서열을 가진다. 변이체는 주어진 아미노산 잔기가 유사한 물리화학적 특성을 가지는 잔기에 의해 대체되었음을 의미하는, 보존적으로 치환된 서열을 포함할 수 있다. 보존적인 치환의 예는 하나의 지방족 잔기를 Ile, Val, Leu, 또는 Ala와 같은 것들로 서로 치환하거나 Lys 및 Arg; Glu 및 Asp; 또는 Gln 및 Asn 사이와 같은, 하나의 극성 잔기를 서로 치환하는 것을 포함한다. 그 외에 그러한 보존적인 치환, 예를 들어 유사한 소수성을 가지는 전체 영역의 치환은 공지되어 있다. 또한 천연적으로 발생하는 IL-15 변이체도 본 발명에 포함된다. 그러한 변이체의 예는 IL-15 결합성을 지니는 IL-15 단백질에 대한 교호 (alternate) mRNA 스플라이싱 (splicing) 또는 단백질 분해성 절단으로부터 초래된 단백질이다. mRNA에 대한 교호 스플라이싱은 끝이 잘린 단백질을 생성할 수 있지만, 생물학적으로 활성인 IL-15 단백질이다. IL-15 단백질로부터 하나 이상의 말단 아미노산을 단백질 분해성 제거 (일반적으로 1 내지 5개의 말단 아미노산)함으로써, 단백질 분해에 기인하는 변이체는 예를 들어 상이한 유형의 숙주 세포에서 발현된 N- 또는 C-말단에서의 차이점을 포함한다.
사람 IL-15는 그랍스테인 등에 의한 문헌 [Science,264: 965 (1994)]에 기재된 절차에 따라 얻을 수 있거나, 서열 1에 제공된 DNA 서열 정보를 기초로 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)과 같은 통상적인 절차에 의해 얻을 수 있다. 사람 IL-15 cDNA는 1993년 2월 19일에 미국 메릴랜드주 록빌에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection (ATCC))에 기탁되었고, 기탁 번호 69245호를 부여 받았다. 본 기탁은 I41-hIL-15로 명명되었다. 기탁은 부다페스트 조약 (Budapest Treaty)의 명명법에 따라 이루어졌다.
본 명세서에서 사용된 근아세포 배양물은 주기적인 골격근 전구체를 함유하는 배양물에 관한 것이고, 다핵 근섬유를 형성하기 위해 분화 및 융합을 이행하는 근아세포 배양물로부터 유도된 근섬유 배양물과 구별되어 인식된다. 미오겐 배양물은 두 종류 모두의 배양물에 관한 일반명칭이다. 근세포란 용어는 아직 융합되지 않은, 분화된 후기 유사분열의 근육 세포를 일컫고, 따라서 일반적으로 대부분의 조건에서 일시적인 세포 유형을 나타낸다.
근육-영양이란 용어는 근육 수축성 단백질의 축적에 앞서 그러한 근섬유의 질량 또는 크기에 비례하여 근섬유의 질량 또는 크기의 증가를 초래하는, 근육 수축성 단백질에 의한 축적을 의미한다. IL-15, 스테로이드, IGF-I 또는 성장호르몬과 같은 영양 인자에 관해 본 명세서에서 사용된 용어 근육-영양량은 영양 인자를 투여하기 전의 근섬유의 질량 또는 크기에 비해 질량 또는 크기면에서 근섬유의 증가를 야기하기에 충분한 IL-15, 스테로이드, IGF-I 또는 성장호르몬의 양을 의미한다.
미오신 중쇄 (myosin heavy chain) 또는 MHC는 근육 특이성 미오신 중쇄, 근섬유에 의해 발현된 근육 특이성 수축 단백질이다. MHC 단백질은 근섬유에 의해 생성된 총 근원섬유 단백질의 주부분을 나타내고, 그러므로 이는 근원섬유 단백질의 성장에 대한 우수한 척도이다. 분화된 근세포 및 근섬유에 의한 MHC 단백질의 축적은 골격 미오겐 분화 및 근육 과영양의 징후이다. 예를 들어 문헌 [Bader et al.,J. Cell Biol.95:763-770 (1982) 및 Chi et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,72:4999-5003 (1975)]에서 알 수 있다.
스테로이드란 용어는 에스트로겐 또는 안드로겐, 또는 그의 유도체와 같은 아나볼릭 (anabolic) 스테로이드 호르몬을 일컫는다.
근육 특이성 중쇄 단백질이 말단 근육 분화의 표식이기 때문에, MHC 합성을 검출하기 위한 양적인 방법은 근육 과영양을 확인하기 위한 중요한 수단이다. MHC 합성을 검출하기 위해, 문헌 [Bader et al.,J. Cell Biol.,95:763 (1982)]에 기재된 MF-20과 같은 모노클론 항체를 이용하는, 문헌 [Quinn et al.,J. Cell Physiol.,159:387 (1994)]에 기재된 것과 같은 통상적인 웨스턴 블랏 기술이 사용될 수 있다. 모노클론 항체 MF-20은 MHC에 대해 결합 친화성을 가지고 미국 아이오와주 아이오와시에 소재한 디벨로프멘탈 스터디즈 하이브리도마 뱅크 (Developmental Studies Hybridoma Bank)로부터 공식적으로 이용할 수 있다. 별법으로, MHC에 대해 특이적인 어떤 모노클론 항체는 MHC 검출을 위한 웨스턴 블랏 분석에서의 용도를 발견하게 될 것이다. 사실, 실질적으로 정제된 MHC, 또는 예를 들어 액틴 또는 트로포닌과 같은 다른 근육 특이성 단백질 중 어떤 것은 그러한 웨스턴 블랏 분석에 유용될 수 있는 그런 근육 특이성 단백질에 대한 신규 모노클론 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 웨스턴 블랏 기술 및 시약은 당업계에 공지되어 있다.
MHC 합성 및 이에 따른 근육 과영양을 검출하기 위한 웨스턴 블랏 분석을 사용하는 것에 별법으로, 분화된 근세포 및 근섬유는 문헌 [Quinn et al.,J. Cell Physiol.,159:387 (1994)]에 기재된 것과 같은 근육 특이성 MHC의 면역 형광 검출법을 사용하여 검출될 수 있다. 일반적으로, 배양물은 혈청이 없는 배양물 배지로 헹구고 고정시키고, 다시 배양물 배지로 헹군 다음 낮은 비율로 혈청을 함유하는 완충된 염 용액으로 차단시켰다. 그 다음 배양물은 MHC에 대한 모노클론 항체, 예를 들어 MF-20을 함유하는 완충된 염 용액으로 배양물될 수 있고 헹굴 수 있으며 예를 들어 플루오로크롬, 항-마우스 IgG와 같이 라벨링된 상태로 배양물될 수 있다. 배양의 마지막에, 브롬화에티듐과 같은 핵 염색제가 첨가될 수 있다. 배양물을 헹구고, 글리세롤에 담아서 에피플루오레슨스 현미경을 사용하여 관찰하였다. 현미경 필드 당 근세포 핵 (MHC-양성 세포내의 핵)의 수를 결정할 수 있다.
위에 덧붙여서, 또한 본 발명은 필요로하는 척추동물에게 IL-15 단백질의 근육 영양량을 투여하는 것을 포함한다. IL-15의 투여는 단독 또는 스테로이드, 성장호르몬 또는 IGF-I와 같은 부가적인 근육 영양 인자의 유효량과 동시에 또는 연이은 조합으로 수행될 수 있다. 또한 본 발명은 적합한 희석제 또는 담체에 IL-15의 근육 영양량을 포함하는, 조성물의 사용 방법을 제공한다. 본 발명의 IL-15는 제약 조성물을 제조하기 위해 사용된 공지의 방법에 따라 제제화될 수 있다. IL-15는 단독 활성 물질로서 혼합물로 조합되거나 제약상 적합한 희석제 (예, 트리스-HCl, 아세테이트, 포스페이트), 보존제 (예, 티메로살, 벤질 알콜, 파라벤), 유화제, 용해제, 보조제 및(또는) 담체와 같은 다른 공지의 활성물질과의 혼합물로 조합될 수 있다. 적합한 담체 및 그들의 제제는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed. 1980, Mack Publishing Co.]에 기재되어 있다. 또한 그러한 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 메탈 이온 등과 착화합물로된 IL-15를 함유하거나, 폴리아세트산, 폴리글리콜산, 히드로겔 등과 같은 중합체 화합물로 혼입되거나, 리포좀, 미세현탁액, 교질입자, 유니라멜라 또는 멀티라멜라 소포체, 알긴산 비드, 적혈구 고스트 또는 스페로블라스트 (Spheroblast)로 혼입된 IL-15를 함유할 수 있다. 그러한 조성물은 IL-15의 물리적 상태, 용해도, 안정도, 생체내 방출 속도, 및 생체내 제거 속도에 영향을 끼칠 것이다. 또한 IL-15 분자는 조직 특이성 접합체, 리간드 또는 항원에 대한 항체와 접합될 수 있거나, 조직 특이성 접합체의 리간드와 결합될 수 있다.
또한, IL-15 조성물은 흡입 또는 직접적인 유전자 전이에 의해 국부적으로, 경구용으로, 비경구용으로, 직장용으로 투여될 수 있다. 비경구용이란 용어는 피하주사, 정맥내, 근육내, 지망막하내 주사, 또는 주입 기술을 포함한다. 직접적인 유전자 전이란 용어는 참고 문헌으로 본 명세서에 채택된, 문헌 [Wolff et al.,Science,247:1465 (1990)]에서 알 수 있는 것과 같이, IL-15 유전자를 함유하는 발현 벡터 또는 플라스미드를 직접 표적 조직으로 투여함을 의미한다. 그러한 조성물은 통상 단독이거나 어떤 다른 활성 물질의 유효량과의 조합으로 IL-15의 유효량을 함유할 것이다. 투여량 및 조성물에 함유된 원하는 약물 농도는 원하는 용도, 환자의 체중 및 연령, 및 투여 방법을 포함하는 많은 인자에 의해 다양하게 의존될 수 있다. 예비 투여량은 동물 시험에 따라 결정될 수 있고, 사람 투여를 위한 적정 투여량의 개산 (槪算)은 부당한 실험이 아닌 당업계에 수용될 수 있는 사용예에 따라 수행될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해, 출혈성 심장병, 횡문근육종, 퇴행성 위축, 쇠약 또는 악액증, 당뇨병, 일반적인 노화와 같은 특정 질환의 치료, 및 고혈압, 당뇨병, 및 동맥경화성 심장 혈관 질병과 같은 노화된 동물의 근질량 감소와 연관된 특정 질환의 치료가 가능하다. 더욱이, 또한 그러한 치료는 위에 열거된 질환과 연관된 이차 부작용을 경감시킬 수 있다. 또한, 근육 변성과 같은, 근육병의 치료도 본 발명에 포함된다. 근육 변성은 진행성 근육 약화, 파괴 및 근섬유의 재생, 및 종국에 있어서 섬유성 및 지방 연관 조직에 의한 근섬유의 대체로 특징될 수 있다. 근육 변성으로부터 고통받는 환자의 근섬유내에 대사 저장 물질의 축적은 일어나지 않는다. 본 발명에 따른 치료는 질병의 일부 증상을 경감시킬 수 있고 환자의 생활의 질을 향상시킬 수 있다.
더욱이, 본 발명은 또한 육류 생산의 효과를 증가시키는데 사용될 수 있다. 구체적으로, 전체적인 골격근량을 증가시키기 위해, IL-15의 근육 영양량을 동물에게 먹이거나 주사할 수 있다. 또한 다른 영양 인자와 IL-15의 조합도 본 발명에 포함된다. IL-15의 투여로 근육량이 증가할 수 있는 전형적인 동물은 소, 돼지, 양, 닭 및 연어와 같은 가축을 포함한다.
위에 덧붙여서, 아래의 실시예는 구체적인 양태를 설명하기 위해 제공되었고 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다.
실시예 1
C2 근아세포의 증식 및 소 미오겐의 일차 배양물에 있어서 IL-15의 영향
본 실시예는 C2 근아세포의 증식 및 소 미오겐의 일차 배양물에 있어서 IL-15의 영향을 설명한다. 그랍스테인 등에 의해 기재된 것과 같은 방법으로 시미안 (simian) IL-15를 제조하였다. 성인 쥐의 골격근으로부터 유도된 세포 계열인 C2 근아세포를 문헌 [Yaffe et al.,Nature,270:725 (1977)]에 기재된 방법에 따라 단리하였다. 10% 소 태아 혈청 (FCS; 미국 유타주 로간시에 소재한 하이클론 (Hyclone)사로부터 구입)을 함유하는 이글스 최소필수배지 (MEM; 미국 미주리주 세인트루이스시에 소재한 시그마 (Sigma)사로부터 구입)에서 C2 근아세포를 유지시켰다. MEM 내의 10% FCS가 1.5 ml인 35 mm 접시 당 50,000 세포로 C2 근아세포를 접종하였다. 24시간 후, 배지는 MEM 내의 0.5% FCS가 1.5 ml로 변하였고, 재조합 시미안 IL-15를 다양한 농도로 첨가하였다. 이들 조건하에서의 배양물은 추가로 44시간 동안 계속되었고, 이어서 4시간 동안 0.75 uCi의 [3H]-티미딘 (6.7 Ci/mmol; 미국 델라웨어주 윌밍턴시에 소재하는 뉴 잉글랜드 뉴클리어 (New England Nuclear)사로부터 구입)을 투여하였다. C2 세포 DNA에 [3H]-티미딘 방사선 표지의 혼입량은 문헌 [Chen et al.,J. Cell Physiol.,160:563 (1994)]에 기재된 것과 같이 트리클로로아세트산 (TCA) 침전을 사용하여 측정하였다. 즉, 배양물을 헹궈내고, DNA를 4℃에서 밤새 1 ml의 차가운 5% TCA로 침전시킨 다음, 차가운 5% TCA로 헹구었다. 0.5 M NaOH 1 ml로 DNA를 용해시키고, 에콜룸 (Ecolume; 캐나다 어빙시에 소재하는 ICN사로부터 구입) 10 ml를 함유하는 신틸레이션 바이알에 옮기고, 100 ㎕의 빙초산으로 중화시키고, 팩커드 (Packard) 1900 CA 트리-카브 (Tri-Carb) 액체 신틸레이션 분석기를 사용하여 DNA로 표지의 혼입량을 측정하였다.
참고 문헌으로 본 명세서에 채택된, 문헌 [Quinn et al.,Devel. Biol.,140:8 (1990)]에 기재된 것과 같이 저온 보존된 90일된 소 태아의 넓적 다리 근육의 트립신 소화물로부터 소 태아 미오겐의 일차 배양물을 준비하였다. MEM 내에 10% FCS가 1.5 ml인 35 mm 접시 당 100,000 세포로 미오겐 세포를 접종하였다. 세포가 배양물 접시에 부착하도록 48시간 동안 둔 다음, 배지를 MEM내에 2% FCS 1.5 ml로 바꾸고, 다양한 농도의 재조합 시미안 IL-15를 첨가하였다. 증식 또는 MHC 발현에 대한 분석은 [3H]-티미딘 혼입을 사용하여, 24시간 간격으로 저혈청 배지로 변화시키는, 위에 기재된 것과 같은 방법으로 수행하였고 4일간 분석을 계속하였다. 배지 (MEM에 2% FCS 1.5 ml) 및 IL-15를 48시간 후에 다시 채웠다.
도 1A 및 1B에서 보는 것처럼, [3H]-티미딘 혼입 분석은 시험된 모든 농도의 IL-15에서, 잔류하는 DNA로 표지의 혼입이 실질적으로 변하지 않았음을 나타내었다. 따라서, IL-15는 시험된 어떤 농도에서도 C2 근아세포 또는 소 미오겐의 일차 배양물의 증식에 아무런 영향을 가지지 않았다.
실시예 2
IGF-I의 유무시 분화된 소 근섬유에 있어서 IL-15의 영향
본 실시예는 단독이거나 IGF-I과의 조합으로, 분화된 소 근섬유에 대한 IL-15의 영향을 설명한다. 소 미오겐의 일차 배양물은 실시예 1에서 설명된 것과 같이 접종하였다. 배지는 48시간 후 MEM에서 2% FCS로 변하였고, 세포가 분화되고 융합되도록 하였다. 3일 후 저혈청 배지로 전환한 다음, 유사분열 억제제인 아피디콜린 (Sigma; Gosset et al.,J. Cell Biol., 106:2127 (1988)) 5 ㎍/ml를 IL-15 또는 사람 재조합 IGF-I (미국 뉴욕주 레이크 플라시드시에 소재하는 UBI사로부터 구입)와 함께 또는 이들 없이 첨가하였다. 배지 및 성장 인자 (IL-15 또는 IGF-I)를 48시간 이후에 다시 채우고, 배양물은 아피디콜린 및 IL-15 또는 IGF-I를 투여한 다음 72시간에 MHC에 대한 웨스턴 블랏 분석이나 면역 세포 화학 분석으로 결정하였다. 따라서, 분화된 근세포/근섬유는 72시간 동안 IL-15 또는 IGF-I로 처리하였다.
아피디콜린은 [3H]-티미딘의 혼입을 완전히 억제하엿다. 또한, 배양물에 대한 역상 현미경 평가는 아피디콜린 처리가 융합된 근관으로 우세하게 구성되는 배양물을 허용하는, 주기적인 세포의 사멸로 결과됨을 나타내었다. 도 2에서 보는 것처럼, 10 ng/ml의 IL-15로 처리된 배양물은 대조군에 비해 약 두배의 MHC를 함유하였다. 또한, IL-15는 MHC 발현을 촉진시키는데 10 내지 100 ng/ml의 IGF-I 만큼 효과적이었다. 10 ng/ml의 IL-15 및 100 ng/ml의 IGF-I의 조합은 첨가제이고 IL-15 또는 IGF-I 단독인 경우의 대조군에 비해 MHC의 발현이 거의 다섯배 이상 증가시킬 정도로 보다 더 효과적이었다. 포화되는 농도에서 이용하는 IGF-I의 작용에 대해 IL-15의 작용은 부가적이므로, 이들 발견은 IL-15가 IGF-I의 자기분비 발현을 증가시키는 근세포를 포함함으로써 작용하지 않는다는 것을 암시하고 또한 IL-15가 분화된 근섬유상에 직접 작용할 수 있음을 설명한다.
실시예 3
C2 근아세포의 분화 및 MHC 발현 및 소 미오겐의 일차 배양물에 있어서 IL-15의 영향
C2 근세포 및 소 미오겐의 일차 배양물은 아피도콜린을 사용하지 않은 것을 제외하고, 실시예 2에서 설명된 것과 같이 접종하였다. 위에서 설명된 것과 같이 웨스턴 블랏으로 MHC의 양을 측정하고, 위에서 설명된 것과 같이 면역 세포 화학 분석을 수행하였다. 도 3 및 4에서 보는 것처럼, 다양한 농도의 재조합 시미안 IL-15는 MHC의 발현을 촉진시켰다. MHC 발현은 생쥐 C2 근아세포 배양물에서 약 다섯배 증가하였고 (도 3), 약 10 ng/ml의 IL-15를 이용한 경우 소 태아 미오겐의 일차 배양물에서 약 2.5배 증가하였다. MHC 발현에 대한 본 자극이 미오겐 분화 속도를 증가시키는데 기인함을 결정하기 위해, 통상적인 항-MHC 면역 세포 화학을 사용하여 근세포 핵의 출현에 대한 시간 과정을 결정하였다. 도 3 및 4에서 보는 것처럼, 2일째에 10 ng/ml의 IL-15로 처리한 C2 근아세포 및 소 미오겐의 일차 배양물에서 검출된, 최종적으로 분화된 근세포 핵의 수는 그들 각각의 대조군과 현저하게 상이하였다. 이 효과는 새롭게 분화하는 근세포에서의 미오신 발현에 대한 면역 세포 화학적 검출 가능성이 약간 증가하는데 기인할 수 있다. 그러나, 관찰된 차이점은 각각 C2 근아세포 및 소 미오겐의 일차 배양물에서 웨스턴 블랏을 사용하여 관찰된 MHC 발현에서 약 5배 및 2.5배 증가에 대한 이유를 밝힐 수는 없다. 데이터는 IL-15가 미오겐성 분화를 촉진시킬 수 있음을 나타내는 반면에, 데이터는 IL-15가 분화된 근세포에서 MHC 발현 또는 축적을 촉진시키기 위해 주로 작용함을 나타낸다.
또한, 데이터를 나타내지는 않았으나, IL-15로 처리한 C2 근아세포 배양물에서 근관은 대조군 배양물에서의 근관에 비해 훨씬 더 큰 것으로 나타났다. 이 관찰은 IL-15가 단순한 MHC 축적이 아닌 전체적인 근섬유 과영양을 촉진시킴을 나타낸다. 이들 결과는 IL-15가 근아세포 증식 속도에는 아무 영향이 없으나, 분화된 근세포에서 근육 특이성 MHC 축적을 촉진시키는 작용을 한다는 것을 나타낸다.
〈서열표〉
(1) 일반적 정보 :
(i) 출원인: 임뮤넥스 코포레이션
(ii) 발명의 명칭: 근육 영양 인자
(iii) 서열수: 2
(iv) 통신 주소:
(A) 수신인: 임뮤넥스 코포레이션
(B) 거리: 유니버시티 스트리트 51
(C) 도시: 시애틀
(D) 주: 워싱턴
(E) 국가: USA
(F) 우편번호: 98101
(v) 컴퓨터 판독 형태
(A) 매체 유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: 애플 매킨토시
(C) 작동 시스템: 시스템 7, 워드 6.0
(D) 소프트웨어: 패턴트인 릴리스 #1.0, 버전 #1.25
(vi) 현재 출원 데이터:
(A) 출원 번호: 미부여
(B) 출원일: 1996. 5. 7.
(C) 분류:
(viii) 대리인 정보:
(A) 성명: 말라스카, 스티븐 엘.
(B) 등록 번호: 32,655
(C) 일련 번호: 2833-WO
(ix) 통신 정보:
(A) 전화: 206-587-0430
(2) 서열 1에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 489 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(ix) 양상:
(A) 이름: CDS
(B) 위치: 1..489
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 2에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 162 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(xi) 서열 설명:
Claims (22)
- 인터류킨-15 (IL-15)의 근육 영양량 및 생리학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 스테로이드, 성장 호르몬 및 인슐린 유사 성장 인자 (IGF-I)로 구성된 군으로부터 선택된 인자의 근육 영양량을 더 포함하는 조성물.
- 제2항에 있어서, 인자가 성장 호르몬인 조성물.
- 제2항에 있어서, 인자가 IGF-I인 조성물.
- 제1항에 따른 조성물의 투여를 포함하는, 척추동물에서 근육 성장 촉진 방법.
- 제5항에 있어서, 조성물이 스테로이드, 성장 호르몬 및 인슐린 유사 성장 인자 (IGF-I)로 구성된 군으로부터 선택된 인자의 근육 영양량을 더 포함하는, 근육 성장 촉진 방법.
- 제5항에 있어서, 척추 동물이 사람인 방법.
- 제5항에 있어서, 척추 동물이 닭, 양, 소, 돼지 및 어류로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
- 제1항에 따른 조성물의 투여를 포함하는, 척추 동물에서 출혈성 심장 질환의 치료 방법.
- 제9항에 있어서, 조성물이 스테로이드, 성장 호르몬 및 인슐린 유사 성장 인자 (IGF-I)로 구성된 군으로부터 선택된 인자의 근육 영양량을 더 포함하는, 출혈성 심장 질환의 치료 방법.
- 제1항에 따른 조성물의 투여를 포함하는, 척추 동물에서 퇴행성 위축의 치료 방법.
- 제11항에 있어서, 조성물이 스테로이드, 성장 호르몬 및 인슐린 유사 성장 인자 (IGF-I)로 구성된 군으로부터 선택된 인자의 근육 영양량을 더 포함하는, 퇴행성 위축의 치료 방법.
- 제1항에 따른 조성물을 포유 동물에 투여하는 것을 포함하는 척추 동물에서 근육 쇠약의 치료 방법.
- 제13항에 있어서, 조성물이 스테로이드, 성장 호르몬 및 인슐린 유사 성장 인자 (IGF-I)로 구성된 군으로부터 선택된 인자의 근육 영양량을 더 포함하는, 근육 쇠약의 치료 방법.
- 제1항에 따른 조성물의 투여를 포함하는, 척추 동물에서 당뇨병과 연관된 당 비내성의 치료 방법.
- 제15항에 있어서, 조성물이 스테로이드, 성장 호르몬 및 인슐린 유사 성장 인자 (IGF-I)로 구성된 군으로부터 선택된 인자의 근육 영양량을 더 포함하는, 당뇨병과 연관된 당 비내성의 치료 방법.
- 제1항에 따른 조성물의 투여를 포함하는, 척추 동물에서 당뇨병과 연관된 변성의 치료 방법.
- 제17항에 있어서, 조성물이 스테로이드, 성장 호르몬 및 인슐린 유사 성장 인자 (IGF-I)로 구성된 군으로부터 선택된 인자의 근육 영양량을 더 포함하는, 당뇨병과 연관된 변성의 치료 방법.
- 제1항에 따른 조성물의 투여를 포함하는, 척추 동물에서 횡문근육종의 치료 방법.
- 제20항에 있어서, 조성물이 스테로이드, 성장 호르몬 및 인슐린 유사 성장 인자 (IGF-I)로 구성된 군으로부터 선택된 인자의 근육 영양량을 더 포함하는, 횡문근육종의 치료 방법.
- 제1항에 따른 조성물의 투여를 포함하는, 척추 동물에서 근육 이양증의 치료 방법.
- 제22항에 있어서, 조성물이 스테로이드, 성장 호르몬 및 인슐린 유사 성장 인자 (IGF-I)로 구성된 군으로부터 선택된 인자의 근육 영양량을 더 포함하는, 근육 이양증의 치료 방법.
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