KR19990010720A

KR19990010720A - 효모용 인간 알파인터페론 유전자의 발현벡터, 이를 이용하여 형질전환된 효모 및 이를 이용한 인간 알파인터페론의 제조방법

Info

Publication number: KR19990010720A
Application number: KR1019970033590A
Authority: KR
Inventors: 노문종; 정관혜; 이정상
Original assignee: 구광시; 주식회사 코오롱
Priority date: 1997-07-18
Filing date: 1997-07-18
Publication date: 1999-02-18

Abstract

유전자 재조합 기술을 이용하여 효모를 숙주로 이용하여 인간 알파인터페론(inteferon-α)을 대량 생산하는데 사용되는 효모용 인간 알파인터페론 발현벡터를 제조하고, 이를 이용하여 형질전환된 효모를 제조하였으며, 이 형질전환된 효모를 이용하여 인간 알파인터페론을 제조한다.

Description

효모용 인간 알파인터페론 유전자의 발현벡터, 이를 이용하여 형질전환된 효모 및 이를 이용한 인간 알파인터페론의 제조방법

[산업상 이용 분야]

본 발명은 인간 알파인터페론 발현벡터에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 유전자 재조합 기술을 이용하여 효모(yeast)를 숙주로 이용하여 인간 알파인터페론을 대량생산하는데 사용되어지는 효모용 인간 알파인터페론 유전자의 발현벡터, 이를 이용하여 제조할 수 있는 형질전환된 효모 및 이를 이용한 인간 알파인터페론의 제조방법에 관한 것이다.

[종래 기술]

인터페론은 생체내에서 임파구나 섬유아세포 등 여러 가지 세포가 생산하는 생리활성 단백질로서, 인터페론에는 알파(α), 베타(β), 감마(γ)의 주요한 서브타입(subtype)이 있으며, 알파인터페론과 베타인터페론은 아미노산이 166개, 감마인터페론은 143개가 각각 결합한 단백질이다.

이 중에서 알파인터페론은 인간의 체내에서 만들어지는 사이토카인(cytokine)의 일종으로 면역작용을 조절하고, 바이러스의 증식을 저해하는 기능을 가지는 단백질이다.

알파인터페론은 주로 B 림파구세포(B lymphocyte), 눌 임파구세포(null 1ymphocyte) 및 거식세포(macrophage)에서 생성된다. 알파인터페론은 항바이러스기능, 항암기능, 자연살세포(natural killer cel1: NK cell)의 활성화및 골수세포의 억제기능에 서로 상승작용을 갖고 있는 것으로 알려져 있다(Klimpelet al., J.Immunol., 129, 76-79, 1982).

또한 여러 가지 바이러스성 질병에 효과적으로 작용하며, 여러 가지 암에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

이러한 알파인터페론은 대장균 세포에 의해 대량생산되거나, 효모의 세포내에서 생산하고 있다. 종래의 발현 벡터에서 사용된 프로모터의 경우 영양분에 의해 발현이 유도되는 프로모터를 사용하였으며, 세포내에서 생산하는 방식이었다. 종래에 사용된 탄수화물 유도 프로모터의 경우 배지의 가격이 비싸기 때문에 생산단가가 높고, 발현의 조절이 어려웠으며 세포내에서 생산하기 때문에 다른 단백질이 다량 존재함으로 인하여 순수한 알파인터페론을 정제하기 위한 추후 정제가 복잡하다는 단점이 있다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 유전자의 발현을 용이하게 유도하며 생산 단가를 낮추면서 순수한 알파인터페론을 정제하기가 용이한 인간 알파인터페론 발현벡터를 제공하기 위한 것이다.

도1은 효모발현 벡터의 조절부위를 도식화한 도면.

도2는 인간 알파인터페론 유전자가 함유된 재조합 효모에서 알파인터페론 단백질이 대량 발현된 것을 확인한 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 결과를 나타낸 사진.

[과제를 해결하기 위한 수단]

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 킬레이틴(chelatin) 1 유전자의 프로모터와 상기 프로모터의 3' 방향으로 접합된 단백질 분비 신호와 상기 단백질 분비 신호의 3' 방향으로 접합된 인간 알파인터페론을 포함하는 효모용 인간 알파인터페론 발현벡터를 제공한다.

상기한 효모용 인간 알파인터페론 발현벡터는 하기의 서열표 1과 같은 서열을 갖는다.

서열표 1은 본 발명의 일 실시예에 의한 효모용 발현 벡터의 프로모터인 cup1과 인간 알파인터페론 유전자의 5'말단 부위의 일부 염기서열을 나타낸 것이다.

[서열표 1]

또한 본 발명에 있어서, 하기의 서열표 2의 시발체, 하기의 서열표 3의 시발체 및 효모의 크로모좀 DNA를 주형으로 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하고 상기 중합효소 연쇄반응 생성물을 제한효소 EcoRI과 HindⅢ로 절단하여 약 310 염기쌍의 효모에서의 단백질 분비신호 DNA 절편을 분리하고 하기의 서열표 4의 시발체, 하기의 서열표 5의 시발체 및 인간의 전체 DNA를 주형으로 사용하여 중합반응을 수행하고 상기 중합효소 연쇄효소 연쇄반응 생성물을 제한효소 HindIII와 NheI으로 절단하여 약 510 염기쌍의 인간 알파인터페론 DNA 절편을 분리하고 효모 Saccharomyces cerevisiae.의 킬레이틴 1 프로모터를 가지는 효모용 발현벡터를EcoRI 과 NheI으로 절단하여 벡터 절편을 얻고 상기 벡터 절편에 단백질 분비신호DNA 절편과 인간 알파인터페론 DNA 절편을 동시에 접합시켜 효모용 인간 알파인터페론 발현벡터의 제조방법을 제공한다.

[서열표 2]

5'-CCGAATTCATACACAATATAAACG-3'

[서열표 3]

5'-GCAACCAATGCCAAGCTTCAGC-3'

[서열표 4]

5'-CCTCCAAGCTTGTGATTTGCCTCAAACCCACAGCCTGG-3'

[서열표 5]

5'-CCTCCAAGCTTGCTAGCTTATTCCTTACTTCTTAAAC -3'

본 발명에 있어서, 1997년 5월 12일에 생명공학연구소 유전자은행에 기탁번호 KCTC 8798P호로 기탁된 형질전환된 효모 Saccharomyces cerevisiae를 제공한다.

그리고 본 발명은 형질전환된 효모Saccharomyces cerevisiae를 최소배지에 도말하고 상기 최소배지로부터 코로니를 얻는 공정을 포함하는 인간 알파인터페론 제조방법을 제공한다.

한편, 진핵세포에서 단백질의 합성은 유전정보를 가지는 크로모좀의 DNA를주형으로 하여 전령 리보핵산(messenger RNA: mRNA)을 합성하는 전사(transcription) 과정과 이 mRNA를 주형으로 하여 단백질을 합성하는 번역(translation) 과정을 거쳐 이루어진다.

전사의 시작과 조절은 리보핵산 중합효소Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ)와 몇 가지 전사인자에 의해 이루어진다. 리보핵산 중합효소 Ⅱ는 주형 DNA중에 프로모터(promoter)라고 알려진 부위를 인지하고, 이 부위에 결합하여 전사를 시작하게 된다(Siliciano, P.G. et al., Cell,37, 969-978,1984; Struhl, K. et al., Proc. Nat1. Acad. Sci. 79, 7385-7389, 1984).

효모 Saccharomyces cerevisiae의 킬레이틴 1(CUP1) 유전자는 금속 양이온에 의해 조절되는 효소로서, 이 효소는 배양배지 내에 구리 이온(CuSO₄)과 같은 금속의 양이온이 첨가되면 약 100-1000배 정도로 발현이 증가된다. 위와 같은 사실에 근거하여 본 발명에서는 CUP1 유전자의 프로모터 부위 (프로모터 cup1)를 이용하여, 인간 알파인터페론 유전자와 효모의 단백질 분비 신호를 프로모터 cup1에 접합시켜 제조한 알파인터페론 유전자의 발현벡터 (이하 pPcup-M-I라 칭함)를 제공한다. 본 발명은 배지 중으로 분비하는 분비형 벡터를 사용하여 배지중의 단백질 중에서 알파인터페론이 차지하는 분율이 증가시켜 정제가 용이하게 한 것이다.

pPcup-M-I의 제조 과정을 좀 더 상세히 설명하면 다음과 같다. 먼저 프로모터 cup1을 가지는 효모용 발현벡터를 EcoRI과 NheI으로 절단하여 벡터 절편을 얻고, 여기에 단백질 분비신호와 사람의 알파인터페론 유전자가 접합된 DNA절편을 접합하여 효모에서 사람의 알파인터페론을 생산하게 하는 발현벡터 pPcup-M-I를 제조한다. 또한 이에 의해 형질전환된 효모세포를 배양하여 그 배양액을 15% SDS-폴리아크릴아마이드 젤에서 전기영동하여 사람의 알파인터페론이 만들어지는 것을 확인하였다. 본 발명의 발현벡터인 pPcup-M-I는 1997년 5월 12일에 생명공학연구소 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures: KCTC)에 기탁번호 KCTC 8798P호로 기탁하였다.

본 발명의 범위는 상기 기탁된 플라스미드뿐 아니라 이 플라스미드의 도 1의 서열과 같은 특정적 부위에 기능을 현저하게 변화시키지 않는 한 도 1의 염기서열을 치환, 부가 및 삭제 등의 변화를 가해 제조한 발현벡터와 이에 의해 형질전환된 효모 및 이를 이용한 사람의 알파인터페론의 제조방법에까지 미친다.

[실시예]

본 발명은 하기 실시예에 의해 상세히 설명되고 있다. 각각의 제조 단계에 관하여 Sambrook et al.에 의하여 제안된 방법(Molecular C1oning, Cold Spring Harbor, 1989)을 참조할 수 있다.

다음은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 비교예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예들은 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

[발현벡터의 제조]

1) 시발체의 합성과 중합효소 연쇄반응

효모의 단백질 분비신호와 사람의 알파인터페론 유전자를 클로닝하기 위하여 다음과 같이 시발체를 합성하였다.

효모에서의 단백질 분비신호를 클로닝하기 위해 하기의 서열표 2의 시발체 MF와 서열표 3의 시발체 MR을 사용하고 효모의 크로모좀 DNA를 주형으로 사용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)을 수행하였다. 여기서 얻어진 PCR 산물을 제한효소 EcoRI과 HindⅢ로 절단하여 약310 염기쌍의 DNA 절편(이하 절편 M이라 칭함)을 분리하였다.

[서열표 2]

5'-CCGAATTCATACACAATATAAACG-3 '

[서열표 3]

5'-GCAACCAATGCCAAGCTTCAGC-3'

또한 사람의 알파인터페론을 클로닝하기 위해서 하기의 서열표 4의 시발체IF와 서열표 5의 IR을 사용하고 사람의 전체 DNA를 주형으로 사용하여 PCR을 수행하였다.

[서열표 4]

5'-CCTCCAAGCTTGTGATTTGCCTCAAACCCACAGCCTGG-3'

[서열표 5]

5'-CCTCCAAGCTTGCTAGCTTATTCCTTACTTCTTAAAC-3'

여기서 얻어진 PCR 산물을 제한효소 HindⅢ와 Nhe I 으로 절단하여 약 510 염기쌍의 DNA절편(이하 절편 IFN이라 칭함)을 분리하였다.

2) 발현벡터의 제조

프로모터 cup1이 함유된 발현벡터 pPcup을 제한효소 EcoRI과 NheI으로 절단한 후 큰 DNA 절편을 얻었다. 이 큰 DNA 절편에 절편 M과 절편 IFN을 동시에 접합시켜 발현벡터 pPcup-M-I를 얻었다. 접합된 발현벡터중 사람의 알파인터페론을 생산하기 위한 조절부위는 도 1에 나타내었다.

[실시예 2]

효모의 형질전환과 사람의 알파인터페론 유전자의 발현상기 재조합 발현벡터 pPcup-M-I를 1ithium acetate를 이용하는 방법으로 효모에 형질전환시켰다(Johnston, J.R. 'Molecular genetics of Yeast ' pp. 121-134,1994). 형질전환된 효모는 최소배지(SD plate: 2% glucose, 0.67% yeast nitrogenbase without amino acids, 2% bacto-agar)에 도말하여 코로니로 얻었다. 얻어진형질전환된 효모는 5㎖의 YPD배지(1% yeast extract, 2% glucose, 1%bacto-pepton)에서 배양하여 사람의 알파인터페론을 생산하는지의 여부를 확인하였다.

발현의 여부는 배양액을 원심분리하여 세포를 제거한 후, 상등액 1mℓ에 100%트리클로로아세트산(trichloroacetic acid)을 0.1mℓ 첨가하여 얼음에 1시간 두었다가 14000rpm에서 30분간 원심분리하여 단백질을 회수하고 이 단백질을 0.02㎖의 0.1N 소듐하이드록사이드(NaOH) 용액에 녹여 15% SDS 폴리아크릴아마이드 젤 전기 영동시킨 후, 코마지 브릴리언트(Coomasie brilliant) R250으로 염색하여 확인하였다. 이 결과를 도 2에 나타내었다. 제1열은 표준 단백질 분자량들(66000, 45000, 36000, 29000, 24000, 20000, 14200, 6500kDa)이고, 제2열에서 제5열까지는 각각 형질전환된 효모의 배지 상등액을 농축한 것이며, 제6열은 형질전환되지 않는 숙주 효모의 배양 상등액을 농축한 것이다.

본 발명에 의한 효모용 발현벡터는 CUP1 유전자의 프로모터를 사용하여 인간 알파인터페론을 배지 중으로 분비하여 생산하게 함으로써 외부 유전자의 발현을 원하는 시기에 쉽게 유도할 수 있고, 배지 중으로 분비하여 생산함으로써 정제가 용이하다.

Claims

Saccharomyces cerevisiae의 킬레이틴 1 유전자의 프로모터와; 상기 프로모터의 3'방향으로 접합된 단백질 분비 신호와; 상기 단백질 분비 신호의 3'방향으로 접합된 인간 알파인터페론을; 포함하는 효모용 인간 알파인터페론 발현벡터.
제1항에 있어서, 상기 효모용 인간 알파인터페론 발현벡터는 하기의 서열표 1과 같은 서열을 갖는 효모용 인간 알파인터페론 발현벡터.

[서열표 1]
하기의 서열표 2의 시발체, 하기의 서열표 3의 시발체 및 효모의 크로모좀 DNA를 주형으로 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하고; 상기 중합효소 연쇄반응 생성물을 제한효소 EcoRI과 HindIII로 절단하여 약 310 염기쌍의 효모에서의 단백질 분비신호 DNA 절편을 분리하고; 하기의 서열표 4의 시발체, 하기의 서열표 5의 시발체 및 인간의 전체 DNA를 주형으로 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하고; 상기 중합효소 연쇄반응 생성물을 제한효소 HindIII와 NheI으로 절단하여 약 510 염기쌍의 인간 알파인터페론 DNA 절편을 분리하고; 효모 Saccharomyces cerevisiae의 킬레이틴 1 프로모터를 가지는 효모용 발현벡터를 EcoRI과 NheI으로 절단하여 벡터 절편을 얻고; 상기 벡터 절편에 단백질 분비신호 DNA 절편과 인간 알파인터페론 DNA 절편을 동시에 접합시켜 효모용 인간 알파인터페론 발현벡터의 제조방법.

[서열표 2]

5'-CCGAATTCATACACAATATAAACG-3'

[서열표 3]

5'-GCAACCAATGCCAAGCTTCAGC-3'

[서열표 4]

5'-CCTCCAAGCTTGTGATTTGCCTCAAACCCACAGCCTGG-3'

[서열표 5]

5'-CCTCCAAGCTTGCTAGCTTATTCCTTACTTCTTAAAC-3'
1997년 5월 12일에 생명공학연구소 유전자은행에 기탁번호 KCTC 8798P호로 기탁된 형질전환된 효모 Saccharomyces cerevisiae.
제4항의 형질전환된 효모 Saccharomyces cerevisiae를 최소배지에 도말하고; 상기 최소배지로부터 코로니를 얻는; 공정을 포함하는 인간 알파인터페론 제조방법.