KR19990009887A - 인간 면역결핍 바이러스-1의 표면 단백질 지파41에 대한 단일클론 항체, 이를 생산하는 융합세포주 및 그의 제조 방법 - Google Patents

인간 면역결핍 바이러스-1의 표면 단백질 지파41에 대한 단일클론 항체, 이를 생산하는 융합세포주 및 그의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV-1)의 표면 단백질 gp41 에 대한 단일클론 항체, 이를 생산하는 융합세포주 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 HIV-1 에서 항원성이 높은 부위인 gp41 단백질의 아미노산 번호 584-618 서열을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체에 관한 것으로서, 상기 단일클론 항체는 혈액 내의 HIV-1 항원 또는 항체를 검색하여 바이러스에 의한 면역결핍 질환을 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

인간 면역결핍 바이러스-1 의 표면 단백질 지피41에 대한 단일클론 항체, 이를 생산하는 융합세포주 및 그의 제조방법.
본 발명은 인간 면역결핍 바이러스 (Human Immunodeficiency Virus ; 이하 HIV-1 이라고 약칭함)의 표면 단백질 gp41 에 대한 단일클론 항체, 이를 생산하는 융합세포주 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 본 발명은 HIV-1 에서 항원성이 높은 부위인 표면 단백질 gp41 의 아미노산 번호 584-618 서열을 특이적으로 인식하는 마우스 단일클론 항체에 관한 것으로서, 상기 단일클론 항체는 혈액 내의 HIV-1 항원 또는 항체의 농도 등을 검색하여 바이러스에 의한 면역결핍 질환을 진단하고 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
사람 면역결핍 바이러스 1 형 (HIV-1)은 렌티바이러스 (lentivirus)에 속하는 레트로바이러스의 일종인데, 최근 HIV-1 이 후천성 면역결핍증 (Aquired Immunedeficiency Syndrome, AIDS)을 유발하는 주요한 병원체로 알려져 그에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다.
구체적으로 HIV-1 이 생체에 감염되는 경우, 바이러스의 표면 단백질인 gp120 단백질이 생체 면역계에 존재하는 T 세포에 있는 CD4 에 부착하고 이는 다시 표면 단백질 gp41 과 융합하는 과정 등을 거쳐 바이러스 입자인 핵산-단백질 복합체가 세포내로 들어간다고 보고되어 있다 (E. Freed, et al.,P. N. A. S.,87: 4650, 1990). 이와 같이 핵산-단백질 복합체가 일단 세포질 내로 들어가면, 바이러스의 역전사 효소 (reverse transcriptase) 및 리보핵산 분해효소 H (RNase H)가 작용하여 바이러스 RNA 가 DNA 로 전환되고 이는 다시 세포핵 내로 들어가게 된다. 세포핵 내로 들어간 상기 DNA 는 바이러스의 삽입효소 (integrase)에 의해 숙주세포의 염색체 중에 무작위적으로 삽입된 다음 세포 내의 전사인자의 작용으로 HIV-1 유전자가 발현되는 과정을 거쳐 감염된 세포에서 새로운 바이러스 입자를 생산하게 된다.
인간 면역결핍 바이러스 (HIV-1)가 생체에 감염된 초기에는 바이러스 혈증 (Viremia)이 일어나 림프조직을 포함한 몸 전체에 바이러스가 퍼지게 되는데, 이 때 CD4 가 있는 T 세포의 수가 감소하면서 바이러스가 혈액 내에 상당한 양으로 존재하는 것이 확인된다. 이어서 감염된지 4 내지 6주가 경과하면 CD4 가 있는 T 세포의 수가 원래대로 돌아오면서 감염 잠복기에 들어가게 되는데, 이 때 여러 가지 면역 반응이 유발된다. 상기 잠복 기간 동안 혈액 내에 존재하는 바이러스의 양과 감염된 세포수는 매우 적게 나타나지만 림프절에서는 계속 HIV-1 이 증식하는 것으로 알려져 있다 (G. Pantalo, et al.,Nature,362: 355, 1993). 상기 과정을 거쳐 수년 내지 10년이 더 경과하면 혈액 내에 CD4 가 있는 T 세포가 1 ml 당 200개 이하로 떨어지면서 바이러스가 왕성하게 증식하고, 궁극적으로 HIV-1 에 감염된 환자는 사망하게 된다.
인간 면역결핍 바이러스에 의한 후천성 면역결핍증을 진단하기 위하여 효소면역측정법으로 HIV 항체 또는 항원을 검색하는 방법이 많이 이용되는데, 실제로 상기 질환의 진단에 있어서 HIV-1 의 gp41 단백질, gp36 단백질 및 이들로부터 유래한 펩타이드들이 항원으로 이용되었다 (Kenealy, W. et al.,AIDS Res. Hum. Retroviruses,3: 95-105, 1987; Petrov, R. V. et al.,Biomed. Sci.,1: 239-244, 1990; Khaitov, R. M. et al.,Biomed. Sci.,1: 553-564, 1990). 상기에서 재조합 단백질 항원들은 정제 과정이 복잡하여 가격이 비싸고, 펩타이드 항원은 비용은 저렴하나 코팅 효율과 항원성이 낮은 단점이 있었다 (Geerlings, H. J. et al.,J. Immuno. Methods,106: 239-244, 1988).
이외에도 후천성 면역결핍증을 보다 효율적으로 진단하기 위하여 HIV-1 단백질에 대한 폴리클론 항체 또는 단일클론 항체를 사용하면 혈액 내의 항원을 검색할 수 있고 경쟁 반응 등에 의하여 항체의 농도도 결정할 수 있어 매우 유리하다. 그러나 실제로 상기 항체를 생산하는 과정에서 특정 펩타이드 자체만을 동물에 가하여 면역화시키는 경우 펩타이드의 분자량이 작으므로 항체가 생성되는 것이 어렵다. 또한, 펩타이드를 운반체 단백질에 접합시켜 (conjugation) 얻은 펩타이드-운반체 단백질을 동물에 면역화시키는 경우 펩타이드 뿐만 아니라 운반체 단백질에 대하여도 항체가 생성되는 단점이 있다. 상기의 단점을 극복하기 위하여 면역화에 사용되는 펩타이드를 다가지 항원 펩타이드 (multiple antigenic peptide, MAP) 형태로 합성하면 바이러스 항체을 검색하는 강력한 코팅 항원으로 사용될 뿐만 아니라 백신 등을 개발하는데 사용되는 효과적인 항원이 될 수 있다.
실제로 본 발명자들은 인체 내에서 자연적으로 만들어지는 HIV-1 항체에 대하여 반응성이 높은 부위인 HIV-1 표면 단백질 gp41 의 아미노산 번호 584-618 서열의 35개 아미노산으로 이루어진 직쇄상 펩타이드가 2개 달린 MAP (multiple antigenic peptide; 이하 MAP-1 이라 약칭함) 형태로 설계하여 제조하고 이를 간접 효소면역측정법의 코팅 항원으로 사용하여 HIV-1 항체를 진단할 수 있음을 보고한 바 있었다 (대한민국 특허출원 제 97-18527호).
이에 본 발명자들은 HIV-1 감염을 효과적으로 진단하는 항체를 얻기 위하여, HIV-1 표면 단백질 gp41 중 아미노산 번호 584-618 서열을 포함하는 상기 MAP-1 합성 펩타이드를 마우스에 면역화시켜 기존의 방법으로 융합세포주를 제조하고 이로부터 상기 아미노산 서열에 높은 특이성을 보이는 마우스 단일클론 항체를 분리하여 그의 항원 특이성 등을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV-1)의 표면 단백질 gp41 에 결합하는 마우스 단일클론 항체, 이를 생산하는 융합세포주 및 그의 제조방법을 제공함에 그 목적이 있다.
도1a 는 인간 면역결핍 바이러스-1 (HIV-1) 표면 단백질 gp41 중 아미노산 번호 584-618 서열을 MAP (multiple antigenic peptide) 형태로 합성한 구조를 나타낸 것이고,
도 1b 는 HIV-1 표면 단백질 gp41 중 아미노산 번호 584-618 서열을 포함하는 상기 MAP 합성 펩타이드 (MAP-1)를 33% 트리신-SDS 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동으로 확인한 것이고,
레인 1 : 분자량 마커; 레인 2 : MAP-1 합성 펩타이드
도 2 는 HIV-1 표면 단백질 gp41에 대한 단일클론 항체 및 이를 생산하는 융합세포주의 제조 과정을 도시화한 것이고,
도 3 은 본 발명의 융합세포주가 생산하는 단일클론 항체를 이용하여 면역글로불린 이소타입을 결정한 것이고,
도 4a 는 본 발명의 단일클론 항체가 HIV-1 표면 단백질 gp41을 특이적으로 인식하는 능력을 효소면역측정법으로 측정하여 나타낸 것이고,
● : MAP-1 합성 펩타이드를 코팅 항원으로 사용한 경우;
■ : HIV-1 p24 단백질 중 아미노산 번호 164-184 서열을 포함하는 MAP 합성 펩타이드를 코팅 항원으로 사용한 경우
도4b 는 본 발명의 단일클론 항체가 HIV-1 표면 단백질 gp41을 특이적으로 인식하는 능력을 효소면역측정법으로 측정하여 나타낸 것이고,
● : 상기 단일클론 항체를 1차 항체로 사용한 경우;
■ : 항-MHC 클래스 I 단일클론 항체를 1차 항체로 사용한 경우
도 5는 본 발명의 단일클론 항체의 항원 특이성을 웨스턴 블럿으로 검증하여 나타낸 것이다.
레인 1 : HIV-1 gp160 단백질; 레인 2 : 알콜 분해효소
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HIV-1 표면 단백질 gp41 중 아미노산 번호 584-618 서열을 포함하는 다가지 항원 펩타이드 (MAP-1)를 마우스에 면역시키는 과정으로 융합세포주를 제조하고, 이로부터 상기 서열을 특이적으로 인식하는 마우스 단일클론 항체 (수탁번호 : KCTC 0332 BP)를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV-1)의 표면 단백질 gp41 를 특이적으로 인식하는 단일클론 항체를 생산하는 융합세포주를 제조하기 위하여, 우선 HIV-1 표면 단백질 gp41 중 아미노산 번호 584-618 서열의 35개 아미노산으로 이루어진 직쇄상 펩타이드 [이하 gp41(584-618) 이라고 약칭함] 2개를 포함하는 MAP-1 합성 펩타이드를 설계하여 제조한다 (대한민국 특허출원 제 97-18527호; 도 1 참조)
상기 MAP-1 합성 펩타이드를 이용하여 마우스를 면역화시키고 이로부터 추출한 비장세포와 마이엘로마 세포를 기존의 방법으로 융합시킨 다음 MAP-1 합성 펩타이드 및 HIV-1 표면 단백질 등에 특이성을 보이는 세포 클론을 효소면역측정법으로 선별한다.
상기의 과정으로 선별된 본 발명의 마우스 융합세포주를 KI-41 으로 명명하고 이를 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1997년 5월 17일에 기탁하였다 (수탁번호 : KCTC 0332 BP)
본 발명은 상기 마우스 융합세포주가 생산하는 단일클론 항체의 이소타입이 IgG1 임을 이소타입 키트를 이용하여 결정한다 (도 3 참조).
본 발명은 MAP-1 합성 펩타이드에 대한 상기 단일클론 항체가 HIV-1 gp41(584-618)를 선별적으로 인식하는 항원 특이성이 있는가를 확인하기 위하여, MAP-1 합성 펩타이드 및 음성 대조군인 HIV-1 p24(164-184) MAP 합성 펩타이드에 대한 반응성을 효소면역측정법으로 조사하였다.
그 결과, 상기 단일클론 항체는 HIV-1 gp41(584-618) MAP-1 합성 펩타이드에 대하여 선별적으로 높은 항원 인식능력을 나타냄을 확인하였다 (도 4 참조).
또한 본 발명은 상기 단일클론 항체가 자연 상태로 존재하는 HIV-1 단백질도 선별적으로 인식하는 항원 특이성이 있는가를 확인하기 위하여, HIV-1 gp41(584 -618) 펩타이드 부위를 포함하는 HIV-1 gp160 단백질을 이용한 웨스턴 블럿을 수행하였다.
그 결과, 본 발명의 단일클론 항체는 알콜 분해효소와는 전혀 반응하지 않는 반면 HIV-1 gp41(584-618) 펩타이드를 포함하는 HIV-1 gp160 단백질과는 특이적으로 반응함을 확인하였다 (도 5 참조).
따라서 본 발명의 단일클론항체는 HIV-1 gp160 단백질을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체로도 사용될 수 있다.
본 발명의 마우스 융합세포주가 생산하는 단일클론 항체는 사람의 혈액 내에 존재하는 HIV-1 의 표면 단백질 항원을 검색하는데 사용될 수 있을 뿐만 아니라 이를 AIDS 환자의 혈청에 존재하는 HIV-1 표면 단백질 gp41 에 대한 항체와 경쟁적으로 반응시키면 환자 혈청 내의 상기 항체의 농도를 결정할 수 있다.
따라서, 본 발명의 단일클론 항체는 다양한 반응 시약을 포함하는 HIV-1 항원 또는 항체 진단키트 등을 개발하는데 이용될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 MAP-1 의 제조
HIV-1 항체에 대하여 반응성이 높은 부위인 HIV-1 의 표면 단백질 gp41 의 아미노산 번호 584-618 의 35개 아미노산으로 이루어진 2개의 펩타이드를 가지는 MAP-1 을 합성하기 위하여, 본 발명자들이 개발한 보트형 반응기 (대한민국 특허공고 제 95-14842 호)에서 Fmoc 보호기를 이용한 메리필드 고상법을 수행하였다 (Merrifield, R. B.,J. Am. Chem. Soc.,85: 2149-2154, 1963; Merrifield, R. B.,Science,232: 341-347, 1983) (도 1a 참조).
우선, Fmoc - 알라닌 - 수지를 피페리딘 (piperidine)을 이용하여 Fmoc 보호기를 제거하고 DCC/HOBt 를 이용하여 Fmoc - 라이신(Fmoc)을 연결시켰다. 이 상태에서 Fmoc 보호기를 피페리딘으로 제거하여 2개 아민기를 노출시킨 다음 HIV-1 의 gp41(584-618)의 아미노산을 카복시 말단부터 순차적으로 DCC/HOBt 로 연결하여 가지가 2개 달린 조 (crude) MAP-1 을 제조하였다. 상기 과정을 거친 합성 펩타이드들에 3% 트리이소프로필실란 (triisopropylsilane)이 첨가된 시약 K (트리플루오르아세트산 / 티오아니솔 / 페놀 / 에탄디티올 / 물 = 85 / 5 / 5 / 2.5 / 5, v/v)를 처리하여 본 발명의 MAP-1 함성 펩타이드를 정제하였다. 다음 MAP-1 합성 펩타이드를 역상 C18컬럼을 이용한 HPLC 로 다시 분리·정제하여 그의 분자량을 트리신-SDS 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동으로 확인하였다 (도 1b 참조)
실시예 2 마우스의 면역화
실시예 1 에서 제조한 MAP-1 합성 펩타이드로 마우스를 면역화시키기 위하여, 8주된 실험용 BALB/c 마우스를 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 (KRIBB) 실험동물 사육실에서 분양받았다. 상기 MAP-1 합성 펩타이드 100μg 을 완전 프로인트 면역보조제 (Complete Freund's adjuvant)와 혼합하여 유상화한 다음 마우스의 복강에 주사하였다. 다음 동일한 과정을 반복하여 2주 간격으로 같은 양의 MAP-1 합성 펩타이드를 면역보조제와 혼합하여 복강에 2회 주사하였다. 각 주사일로부터 2주 뒤에 마우스의 안 정맥으로부터 50 - 100μl 의 혈액을 채혈한 다음 MAP-1 합성 펩타이드를 코팅한 웰 플레이트에 항-마우스 IgG 항체를 반응시키는 간접 효소면역측정법 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 수행하였다. 그 결과 마우스의 혈청 내에 MAP-1 합성 펩타이드에 대한 특이 항체의 역가가 상승하고 있슴을 확인하였다.
실시예 3 HIV-1 gp41(584-618) 펩타이드를 특이적으로 인식하는 단일클론 항체를 생산하는 마우스 융합세포주의 제조
HIV-1 gp41(584-618) 펩타이드를 특이적으로 인식하는 단일클론 항체를 생산하는 마우스 융합세포주를 제조하기 위하여, 세포 융합 3일전에 MAP-1 합성 펩타이드 100μg 을 인산 완충용액 (phosphate buffered saline)에 녹인 다음 생쥐의 꼬리 정맥에 주사하였다 (도 2참조). 면역원을 주사한 마우스에서 추출한 비장세포와 마이엘로마 세포 SP2/0 를 융합하고 이를 분리 배지인 HAT 배지로 옮겨 96-웰 플레이트에서 배양하였다. 세포 콜로니가 형성된 다음 각 웰로부터 배양액 50μl 를 채취하여 MAP-1 합성 펩타이드를 코팅 항원으로 한 효소면역측정법을 수행하였다. 다음 상기에서 나타난 양성 클론으로부터 단일클론을 분리하기 위하여 제한 희석 (limiting dilution)을 수행하였다.
실시예 4 융합세포주를 탐색하는 간접 효소면역측정법
실시예 3 에서 융합한 세포 중에서 MAP-1 합성 펩타이드에 대하여 특이성을 가진 항체를 생산하는 융합세포주를 검색하기 위하여, 간접 효소면역측정법을 수행하였다. 구체적으로 MAP-1 합성 펩타이드 및 음성 대조 펩타이드인 HIV-1 p24 의 아미노산 번호 164-182 서열 [gp24 (164-182)]을 포함하는 MAP (Lee, M. K., Shin, S. Y., Kim, S. Y. and Hahm, K. S.,Korean J. BRM.,6: 249-258, 1996)을 코팅용액 (0.1N 탄산암모늄 완충용액, pH 9.5)에 잘 혼합하여 96-웰 엘리자 플레이트에 각 웰당 200ng 농도로 상기 펩타이드가 포함되도록 1시간 동안 37℃ 에서 코팅 처리하였다. 이어서 비특이 반응을 방지하기 위하여 각 웰에 2.7% 카제인을 포함하는 트리스 완충용액을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 세척액 (0.05% 트윈 20 을 포함하는 트리스 완충용액)으로 3번 반복하여 세척하였다. 다음 각 융합세포주들의 배양액 100μl씩 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 더 반응시킨 다음 세척액으로 반복하여 3번 세척하였다. 다음 마우스 IgG 에 특이한 서양 고추냉이 퍼옥시다제 (horseradish peroxidase) 결합 염소 유래 항체를 가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시키고 세척액으로 반복하여 3번 세척한 다음 인산염-구연산 완충용액에 0.4mg/ml 의 o-페닐렌디아민디하이드로클로라이드 (o-phenylenediaminedihydro- chloride, OPD) 및 0.4μl/ml 과산화수소수가 포함된 기질용액으로 발색반응시켜 492nm 에서 흡광도를 측정하였다 (도 4 참조).
상기의 과정에서 선별된 본 발명의 MAP-1 합성 펩타이드에 대한 단일클론 항체를 생산하는 마우스 융합세포주를 KI-41 으로 명명하고 이를 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1997년 5월 17일에 기탁하였다 (수탁번호 : KCTC 0332 BP)
실시예 5 단일클론항체의 이소타입 결정
본 발명의 MAP-1 합성 펩타이드에 대한 단일클론 항체의 이소타입을 결정하기 위하여, 이소타입 키트 (ISO-1, 시그마사, 미국)를 구입하여 사용하였다. MAP-1 합성 펩타이드에 대한 단일클론 항체를 생산하는 융합세포주인 KI-41 을 RPMI-1640 의 배양액 내에서 적절한 세포 농도로 증식시킨 다음 그 배양액을 2ml 취하여 이소타입 키트의 스트립 (strip)과 분석 튜브에서 30분 동안 반응시켰다. 다음 상기 배양액을 제거하여 세척액인 PBS-T-BSA 완충용액 (인산완충용액 / 0.05% 트윈 / 1% 소혈청 알부민)으로 세척하고 바이오틴화된 (biotinylation) 항-마우스 면역글로불린을 PBS-T-BSA 완충용액에 1 : 50 비율로 희석하여 분석 튜브에 가한 다음 30분 동안 반응시켰다. 다음 상기 PBS-T-BSA 완충용액으로 반복하여 3회 세척하고 난 다음 PBS-T-PBS 완충용액에 1 : 50 정도로 희석된 아비딘-퍼옥시다제를 첨가하여 15분 동안 반응시키고 이를 다시 PBS-T-BSA 완충용액으로 세척하였다. 최종적으로 4ml 의 3차 증류수에 기질 용액 (2.5M 초산 완충용액, pH 5.0) 2방울, 기질 크로모젠 (chromogen, N,N-디메틸포름아마이드에 3-아미노-9-에틸-카보졸이 녹아있는 상태) 1방울 및 2% 과산화수소수 (H2O2) 1방울을 섞은 기질 용액을 분석 튜브에 첨가하여 1분 동안 반응시켰다. 이소타입의 신호가 나타나면 0.1M 수산화나트륨을 가하여 반응을 정지시키고 스트립을 3차 증류수로 세척하였다. 이상과 같은 방법으로 MAP-1 합성 펩타이드에 대한 본 발명의 단일클론 항체의 이소타입은 IgG1 임이 밝혀졌다 (도 3 참조).
실시예 6 단일클론 항체의 항원 특이성 조사
MAP-1 합성 펩타이드에 대한 본 발명의 단일클론 항체가 HIV-1 gp41(584-618)를 선별적으로 인식하는 항원 특이성이 있는가를 확인하기 위하여, MAP-1 합성 펩타이드 및 음성 대조군인 HIV-1 p24(164-184) MAP 합성 펩타이드에 대한 반응성을 조사하였다. 이들 펩타이드들을 96-웰 엘리자 플레이트에 각 웰 당 500ng, 250ng, 125ng, 62.5ng, 31.3ng, 15.6ng, 7.8ng, 3.9ng 양으로 희석하여 코팅되도록 가하고, 이를 2.7% 카제인을 포함하는 트리스 완충용액으로 블로킹시킨 다음 상기 융합세포주의 배양액 100μl 씩 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시키고 실시예 3 과 동일한 방법으로 단일클론 항체의 HIV-1 gp41(584-618) MAP-1 합성 펩타이드에 대한 항원 인지능력을 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 KI-41 융합세포주가 생산하는 단일클론 항체는 음성 대조군인 HIV-1 p24(164-182) MAP 합성 펩타이드는 전혀 인식하지 않고 HIV-1 gp41(584-618) MAP-1 합성 펩타이드에 대하여 선별적으로 높은 항원 인식능력을 나타내었다 (도 4a 참조).
또한, 음성 대조군으로 1차 항체로 항-MHC 클래스 I 단일클론 항체 (Brodsky, F. M. and Parham, P. L.,J. Immuno.,128: 129-135, 1982)를 생산하는 융합세포주 (W6/32)의 배양액을 사용한 경우 그 어느 코팅 항원도 인식되지 않아 효소면역 반응이 특이적으로 수행되었음을 증명하였다 (도 4b 참조).
실시예 7 단일클론 항체의 항원 특이성 조사
본 발명의 융합세포주가 생산하는 단일클론 항체의 항원 특이성이 합성 펩타이드 형태의 항원 뿐만 아니라 자연 상태로 존재하는 HIV-1 단백질을 인식할 수 있음을 검증하기 위하여 웨스턴 블럿을 수행하였다. HIV-1 gp41(584-618) 펩타이드 부위를 포함하는 HIV-1 gp160 단백질 2.5μg 및 음성 대조군인 알콜 분해효소 ( alcohol dehydrogenase) 2.5μg 을 10% 폴리아크릴아마이드 젤에 전기영동하고 이를 니트로셀룰로스 막에 이동시킨 다음 2.7% 카제인을 포함하는 트리스 완충용액으로 실온에서 1시간 동안 담구어 블로킹시켰다. 이를 다시 세척액 (0.05% 트윈20 을 포함하는 트리스 완충용액)으로 세척한 다음 세포 배양액을 가하여 실온에서 1시간 동안 반응시키고 다시 세척액으로 씻어 내었다. 다음 항-마우스 IgG 퍼옥시다제 결합 염소 유래 항체 (시그마사, 미국)가 1 : 5000 비율로 희석된 0.3% 카제인을 포함한 트리스 완충용액을 가하여 실온에서 30분 동안 반응시키고 이를 세척액으로 3번 반복하여 세척한 다음 4-클로로-1-나프톨 및 과산화수소수를 포함한 트리스 완충용액에 담구어서 발색 반응을 수행하였다. 다음 상기 반응은 니트로셀룰로스 막을 3차 증류수로 씻어냄으로 종결시켰다.
그 결과도 5에 나타난 바와 같이, 알콜 분해효소는 본 발명의 단일클론 항체에 의하여 전혀 인식되지 않는 반면 HIV-1 gp41(584-618) 펩타이드를 포함하는 HIV-1 gp160 단백질은 상기 단일클론 항체에 특이적으로 결합하였음을 확인하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 마우스 융합세포주가 생산하는 단일클론 항체는 HIV-1 표면 단백질 gp41 을 인식하는 높은 특이성을 지닌다. 따라서상기 단일클론 항체는 사람의 혈액 내에 존재하는 HIV-1 표면 단백질 항원을 검색하고, 이를 AIDS 환자의 혈청에 존재하는 HIV-1 표면 단백질에 대한 항체와 경쟁적으로 반응시켜 환자 혈청 내의 상기 항체의 농도를 결정하는데 사용될 수 있다. 상기 단일클론 항체 및 다양한 반응 시약을 포함하는 HIV-1 항원 및 항체 진단키트 등을 개발하면 면역결핍 질환 등을 효과적으로 진단하는데 유용하게 이용할 수 있다.

Claims (6)

  1. 인간 면역결핍 바이러스 (HIV-1)의 표면 단백질 gp41 을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체.
  2. 제 1항에 있어서, 표면 단백질 gp 41 의 아미노산 번호 584-618 서열을 특이적으로 인식하는 마우스 단일클론 항체.
  3. 제 1 항 또는 제 2항에 있어서, 표면 단백질 gp41 부위를 포함하는 HIV-1 gp160 단백질을 특이적으로 인식하는 마우스 단일클론 항체.
  4. 제 1항의 단일클론 항체를 생산하는 융합세포주 KI 41 (수탁번호 : KCTC 0332 BP).
  5. HIV-1 의 표면 단백질 gp41 의 아미노산 번호 584-618 서열을 포함하는 다가지 항원 펩타이드 (MAP-1)로 마우스를 면역화시킨 다음 그 생쥐의 비장세포를 마이엘로마 세포와 융합하고 이로부터 제 1항의 단일클론 항체를 생산하는 융합세포주를 선별하는 제 4항의 융합세포주의 제조방법.
  6. 제 1항의 단일클론 항체를 HIV-1 의 표면 단백질 항원 또는 항체를 검색하여 HIV-1 감염을 진단하는데 사용하는 용도.
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