KR19980082350A - 뿌리혹선충 방제용 파스테리아 페네트랜스(Pasteuria penetrans) CJ-1 세균 및 이를 대량 증식하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 뿌리혹선충의 생물적 방제를 위하여 뿌리혹선충의 국내토착 천적세균인 파스테리아 페네트랜스(Pasteuria penetrans) CJ-1 세균 및 이를 대량 증식하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 시설 재배하는 각종 채소류 및 화훼류에서 피해가 큰 뿌리혹선충의 생물적 방제를 통해 농약사용을 절감하므로써 농약사용에 의한 인축독성, 수질, 토양 등 환경오염 문제를 경감시키고 저농약 안전농산물 생산을 가능하게 하기 위해서 뿌리혹선충의 천적세균 중 국내토착 천적세균인 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균을 내생포자의 형태로 토양으로부터 분리한 후, 이를 대량 증식하는 방법에 관한 것이다.

Description

뿌리혹선충 방제용 파스테리아 페네트랜스(Pasteuria penetrans) CJ-1 세균 및 이를 대량 증식하는 방법

본 발명은 뿌리혹선충의 생물적 방제를 위하여 파스테리아 페네트랜스(Pasteuria penetrans) CJ-1 세균 및 이를 대량 증식하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 시설 재배하는 각종 채소류 및 화훼류에서 피해가 큰 뿌리혹선충의 생물적 방제를 통해 농약사용을 절감하므로써 농약사용에 의한 인축독성, 수질, 토양 등 환경오염 문제를 경감시키고 저농약 안전농산물 생산을 가능하게 하기 위해서 뿌리혹선충의 국내토착 천적세균인 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균을 내생포자의 형태로 토양으로부터 분리하고, 이를 대량 증식하는 방법에 관한 것이다.

뿌리혹선충은 시설재배 채소류 및 화훼류에서 가장 피해가 큰 해충의 하나로서, 전국의 시설재배단지에서 발견되며 특히 참외, 오이, 고추, 수박 등 과채류 생산에서 가장 방제가 어렵고 피해가 큰 해충이다. 따라서, 현재 뿌리혹선충의 방제를 위해서 약제처리, 저항성 품종의 이용, 토양의 장기간 담수, 토양의 태양열 소독, 객토 및 환토 등의 방법이 이용되고 있다. 그러나 약제를 사용할 경우에는 1ha당 50만원 정도의 방제비용이 소요되고 약효도 지속적이지 못하므로 해마다 사용해야 하는 문제점과 인축 및 환경에 대한 독성 문제가 따른다. 또한, 저항성 품종을 이용하는 경우에는 불과 몇 개의 작물에 제한되어 실용성이 낮고, 토양의 담수, 태양열 소독, 객토 및 환토 등의 방법은 지역 및 작물에 따라 적용이 어렵거나 비용이 많이 드는 단점이 있다.

한편, 최근 국민소득 향상으로 소비자들의 무공해, 안전농산물에 대한 관심이 높아지고 수요가 늘어나고 있으며 농약사용에 의한 잔류독성, 환경오염에 대한 경각심이 높아지고 있어 농약사용을 최소화하여 무공해 안전농산물을 생산할 수 있는 기술개발이 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 과채류등에 가장 큰 피해를 주는 뿌리혹선충의 방제에 있어 상기한 문제점을 해결하기 위해서 연구를 거듭한 바, 뿌리혹선충의 국내토착 천적세균으로서 뿌리혹선충의 생물학적 방제에 이용되는 세균인 파스테리아 페네트랜스(Pasteuria penetrans) CJ-1 세균을 내생포자의 형태로 토양으로부터 분리한 후, 이를 대량 증식할 수 있음에 착안하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 뿌리혹선충의 국내토착 천적세균인 파스테리아 페네트랜스(Pasteuria penetrans) CJ-1 세균을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균을 대량 증식하는 방법을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 이루기 위해서, 본 발명에 따른 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균은 토양시료를 채집하는 단계; 상기 토양시료로부터 분석체-원심분리 부유법(combined sieve-centrifugal flotation)을 사용하여 뿌리혹선충의 유충을 분리하는 단계; 해부현미경을 사용하여 상기 유충들 중 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균의 포자가 부착된 유충을 분리해내어 토마토 뿌리에 접종하는 단계; 상기 포자가 부착된 유충을 접종한 토마토 뿌리를 온실에서 약 4주간 재배한 후, 해부하여 뿌리혹선충의 암컷 성충을 분리하는 단계 및 상기 뿌리혹선충의 암컷 성충을 세포마쇄기(Tissue grinder)로 마쇄하여 암컷체내의 세균포자를 분리하는 단계로 이루어진 방법으로 분리됨을 특징으로 한다.

또한, 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균을 대량증식하는 방법은 상기한 방법으로 분리한 내생포자의 형태의 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균의 현탁액을 제조하는 단계; 뿌리혹선충 유충에 파스테리아 페네트랜스 세균의 내생포자를 부착하는 단계; 포자가 부착된 유충을 오이 뿌리에 접종한 후, 온실에서 재배하는 단계 및 오이 뿌리를 세척한 후 건조하여 마쇄시키는 단계를 포함함을 특징으로 한다.

상기한 본 발명의 목적, 그 외의 목적, 특징 및 장점은 하기 발명의 상세한 설명에 의해 당업자에게 명백하게 드러날 것이다.

이하 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명에 의해 대량 증식된 파스테리아 페네트랜스(Pasteuria penetrans) CJ-1 세균은 그램 음성이며, 격막이 있는 균사를 만든다. 그리고, 균사에서 생기는 영양번식체는 콜리플라워 형태이며, 균사의 끝에 내생포자(Endospore)가 만들어진다. 내생포자는 지름이 4.7 ± 0.41㎛, 높이가 2.0 ± 0.22㎛이며 중앙핵의 지름은 2.3 ± 0.30㎛의 크기를 갖는 볼록한 반구형으로 뿌리혹선충에 대해 활성을 가지므로 생물학적 방제에 이용될 수 있다. 특히, 본 발명에 의해 증식된 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균은 뿌리혹선충에만 기생하는 절대활물 기생세균으로 기주범위가 한정되어 있으므로 생태계내의 어떠한 동식물과 인축에 대해서 독성이 없으므로 공해유발 및 환경오염의 위험이 전혀 없고, 생물적으로 매우 안정된 구조를 가지므로 건조, 과습, 고온 및 저온에 강하여 성질의 변화가 없으며 장기보존 및 장거리 수송이 가능하다. 또한, 뿌리혹선충이 감염된 토양이나 화분에 적정 밀도수준으로 혼화처리하면 토양에 잔류하다가 뿌리혹선충의 유충이 이동할 때 뿌리혹선충의 표면에 부착하여 선충이 식물 뿌리내로 침입할 때 따라 들어가 선충체내로 침입이 이루어지며 선충이 생장함에 따라 같이 생장하여 30℃에서 약 4주가 지나면 완전히 성숙, 내생포자가 되면서 선충은 사멸하게 되고 뿌리내에 잔류한 포자는 토양내에 혼합되어 다음 작기에 식물체 뿌리로 침입하는 선충에 부착되어 생육 및 번식을 계속하게 된다.

이하, 본 발명의 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균의 분리 및 대량 증식방법에 대해 구체적으로 설명한다.

1. 파스테리아 페네트랜스(Pasteuria penetrans) CJ-1 세균의 분리 및 내생포자 현탁액의 제조

본 발명은 우선 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균의 대량 증식을 위하여 뿌리혹선충의 국내토착 천적세균인 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균을 토양으로부터 분리하는데, 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균은 내생포자의 형태로 분리된다. 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균의 분리방법은 토양시료를 채집하는 단계; 분석체-원심분리기 부유법(combined sieve-centrifugal flotation)을 사용하여 채집한 토양으로부터 뿌리혹선충의 유충을 분리하는 단계; 해부 현미경을 사용하여 유충들 중 파스테리아 페네트랜스 세균의 포자가 부착된 유충을 분리해내어 토마토 뿌리에 접종하는 단계; 토마토를 온실에서 약 4주간 재배한 후, 뿌리를 해부하여 뿌리혹선충의 암컷 성충을 분리하는 단계; 뿌리혹선충의 암컷 성충을 세포마쇄기(Tissue grinder)로 마쇄하여 암컷체내의 세균포자를 분리하는 단계로 이루어 진다.

본 발명자들은 상기한 방법으로 제주도 북제주군 애월읍 고성리의 콩재배지에서 채집한 토양으로부터 직경이 2∼8㎛이고, 형태가 둥글고 중심핵이 뚜렷한 내생포자를 분리하고, 이를 파스테리아 페네트랜스 CJ-1으로 명명하여 1997년 4월 18일자로 한국종균협회(KFCC)에 기탁하였고, 수탁번호 KFCC-10969를 부여받았다.

상기 분리방법에서 뿌리혹선충의 유충을 분리하는데 사용되는 방법인 분석체-원심분리기 부유법(combined sieve-centrifugal flotation)은 10% 사이토라제(cytolase) 효소액을 이용하여 식물체의 뿌리 조직을 와해시켜 유충이 노출되도록 한 후, 노출된 유충들을 200메쉬의 분석체 위에서 물로 씻어 거르고, 이를 비중이 1.18인 설탕물과 혼합한 다음 3000rpm에서 약 3분간 원심분리하여 뿌리혹선충의 유충체가 모인 상등액을 얻는 방법이다.

본 발명의 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균(KFCC-10969)의 대량 증식을 위해서는 상기한 방법으로 분리된 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균의 내생포자에 물을 첨가하여 현탁액으로 제조하여 사용한다.

2. 파스테리아 페네트랜스(Pasteuria penetrans) CJ-1 세균(KFCC-10969)의 대량 증식방법

파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균의 대량 증식방법은 상기 1에서 제조된 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균의 내생포자 현탁액을 사용하여 뿌리혹선충 유충에 포자를 부착하는 단계; 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균의 포자가 부착된 유충을 오이 뿌리에 접종한 후, 온실에서 재배하는 단계 및 오이 뿌리를 세척하고 건조한 후, 마쇄시키는 단계를 포함하는데, 각 단계를 상세하게 설명하면 다음과 같다.

(1) 뿌리혹선충 유충에 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균(KFCC-10969)의 포자를 부착하는 단계

뿌리혹선충 유충에 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균의 포자를 부착하기 위해서는 우선, 건전한 토마토에 뿌리혹선충을 접종하여 증식시킨 후, 뿌리혹선충의 알을 채집하여 약 25∼30℃ 인큐베이터 내에서 유충이 부화되도록 하였다. 부화된 유충중 2일된 유충을 모아 뿌리혹선충의 유충수 : 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균의 내생포자수가 1 : 20이 되도록 상기 1에서 제조한 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균의 내생포자 현탁액과 혼합하였다. 이때, 선충의 수에 비하여 포자수가 너무 많거나 적게되면 세균포자가 각 유충체에 부착되는 수가 너무 많거나 적어지게 되는데, 부착된 세균포자가 너무 적으면 세균의 증식효율이 떨어지고, 너무 많으면 유충의 활동력이 낮아지게 되어 결국 기주식물체내로의 침입효율이 낮아지므로, 증식효율 또한 낮아질 수 있다. 따라서, 유충수 : 내생포자수가 1 : 20이 되도록 내생포자 현탁액과 혼합하는 것이 가장 바람직하다. 상기에서와 같이 혼합된 용액을 원심분리기에서 3,000rpm으로 5분간 원심분리하여 유충 표면에 10개/1마리 수준으로 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균의 내생포자가 부착되도록 하였다.

(2) 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균(KFCC-10969)의 포자가 부착된 유충을 오이 뿌리에 접종한 후, 온실에서 재배하는 단계

파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균의 포자가 부착된 유충에 살균수를 첨가하여 약 1,000 마리/1㎖로 희석한 후, 파종후 약 4주된 오이의 근권부에 1차 접종한 후 3일 후 다시 2차 접종하는 방법으로 약 10,000 마리/주 수준으로 접종하여 온실에서 약 4주간 자라도록하였다.

이때, 세균의 증식효율과 세균포자 형성율을 기주식물별로 비교한 하기 표 1과 표 2에서와 같이 오이에서 가장 증식효율과 세균포자 형성율이 좋으므로, 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균의 포자를 오이에 접종하는 것이 바람직하다.

[표1]

기주식물별 세균의 증식효율

(단위 : 개/주)
기주식물	뿌리혹선충수	난낭수
줄기호박 1	1.3	1.0
″ 2	16.0	11.3
열매호박 1	5.9	5.1
″ 2	0.3	0.0
오이	27.7	10.7
무	0.5	0.4
토마토	7.2	2.6
오크라	3.6	2.4

[표 2

기주식물별 세균포자 형성율 비교

기주식물	조사된 뿌리혹선충 암컷수	내생포자 형성 암컷수	내생포자 수/암컷
오이	20	3	53,333
호박	10	10	380,000
오크라	20	7	72,807
토마토	17	10	220,000

또한, 접종방법에 있어서도, 하기 표 3에서 알 수 있는 바와 같이 동시접종하는 것보다 3일간격으로 2회 분할 접종하는 것이 증식효율이 높으므로, 2회 분할하여 접종하는 것이 바람직하다.

[표 3]

처리(마리/주)	뿌리혹선충수	난낭수
분할접종(250＋250)	58.7	47.6
동시접종(500)	9.6	7.4

상기한 방법으로 오이에 접종된 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균은 일반적으로 뿌리혹선충이 약 25∼30℃ 정도의 환경하에서 약 4주간이면 생활이 완료되고, 이 시기에 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균의 내생포자가 형성되므로 온실에서 약 4주간 증식시키는 것이 바람직하다. 한편, 식물체를 기르는 온도에 따라 증식기간은 조절되어야 한다.

(3) 오이 뿌리를 세척하고 건조한 후, 마쇄시키는 단계

파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균(KFCC-10969)의 내생포자가 증식된 오이 뿌리를 물로 세척하여 깨끗이 한 후, 건조기내에서 48시간 건조시키고, 마쇄기로 분쇄한 후, 원하는 제형으로 만들어 사용한다.

상기한 방법으로 대량 증식된 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균의 내생포자는 매우 안정하므로 제형에 있어서 특별히 한정되지는 않지만, 예를 들면 분말, 액상제제, 혼합상토로 제형화될 수 있는데, 증식된 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균의 내생포자 밀도는 증식시기나 수확량에 따라 달라지므로 각 제형화 시기마다 내생포자의 수를 히메사이토메터(haemacytometer)로 먼저 계수한 후, 일정량의 물, 무균상토등의 증량물질을 첨가하여 제형화하는 것이 바람직하다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 의해 대량 증식된 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균(KFCC-10969)은 종래의 뿌리혹선충 방제용 농약을 대체하여 뿌리혹선충을 생물적으로 방제함으로서 뿌리혹선충 방제용 농약사용으로 소요되는 비용이 절감되며, 농약의 인축에 대한 피해를 줄일 수 있고, 수질, 토양 등 환경오염을 감소시키고 무공해, 안전농산물 생산에 기여할 수 있다. 또한, 제형화된 내생 포자를 1회 토양에 처리한 후 다른 요인이 없는 한 다시 처리하지 않더라도 지속적인 방제효과가 있으므로 추가적인 농약사용이 불필요한 장점이 있다.

Claims (5)

1. 뿌리혹선충 방제용 파스테리아 페네트랜스(Pasteuria penetrans) CJ-1 세균(KFCC-10969)
2. 제 1항에 기재된 뿌리혹선충 방제용 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균(KFCC-10969)을 대량 증식하는 방법으로서,

   (1) 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균의 내생포자 현탁액을 제조하는 단계;

   (2) 뿌리혹선충 유충에 상기 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균의 내생포자 를 부착하는 단계;

   (3) 상기 포자가 부착된 뿌리혹선충의 유충을 오이뿌리에 접종에 접종한 후, 온실에서 재배하는 단계; 및

   (4) 오이 뿌리를 세척하고 건조한 후, 마쇄시키는 단계

   를 포함함을 특징으로 하는 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균(KFCC-10969)을 대량 증식하는 방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 제 2단계는 뿌리혹선충의 유충수 : 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균의 내생포자수가 약 1 : 20이 되도록 제 1단계에 제조한 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균의 내생포자 현탁액과 혼합한 후, 원심분리기에서 약 3,000rpm으로 약 5분간 원심분리하여 유충 표면에 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균의 내생포자가 부착되는 것임을 특징으로 하는 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균(KFCC-10969)을 대량 증식하는 방법.
4. 제 1항에 있어서, 상기 제 3단계는 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균의 내생포자가 부착된 뿌리혹선충의 유충을 3일간격으로 연속 2회 오이에 접종함을 특징으로 하는 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균(KFCC-10969)을 대량 증식하는 방법.
5. 제 1항에 있어서, 대량 증식된 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균을 분말, 액상제제, 혼합상토로 제형화됨을 특징으로 하는 파스테리아 페네트랜스 CJ-1 세균(KFCC-10969)을 대량 증식하는 방법.