KR102977458B1 - Cd7 표적의 인간화 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Cd7 표적의 인간화 항체 및 이의 용도

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Abstract

본 발명은 CD7 표적의 인간화 항체, 및 이를 포함하는 다중특이성 항체, 키메라 항원 수용체, 항체 접합체, 약학 조성물 및 키트, 및 CD7 발현 관련 질병의 진단/치료/예방에서 이의 용도를 제공한다.

Description

CD7 표적의 인간화 항체 및 이의 용도
본 발명은 면역치료 분야에 속한다. 보다 상세하게는, 본 발명은 CD7 표적의 인간화 항체, 및 질병 예방 및/또는 치료 및/또는 진단에서 이의 용도에 관한 것이다.
CD7은 분자량이 약 40kDa인 세포 표면 당단백질로 면역글로불린 상과에 속한다. CD7은 대부분의 T 세포, NK 세포, 골수 세포, T 세포 급성 림프구성 백혈병/림프종, 급성 골수성 백혈병 및 만성 골수성 백혈병에서 발현된다. CD7 분자는 그 리간드 K12/SECTM1과의 결합을 통해 T 세포 활성화 동안 보조자극 신호로 작용하는 것으로 보고되었다. 또한, 마우스 T 전구세포에서 CD7 분자의 파괴는 여전히 정상적인 T 세포 발달 및 생체항상성을 초래하는 것으로 보고되었으며, 이는 CD7이 T 세포의 발달 및 기능에 핵심적인 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으며, 이는 T 세포 급성 림프구성 백혈병(T-ALL) 치료에 매우 적합한 치료 표적이 된다. 실제로, CD7은 백혈병 및 림프종의 치료를 위한 세포독성 분자의 표적으로서 광범위하게 연구되어 왔다.
본 발명의 목적은 CD7 표적의 인간화 항체, 및 질병 예방 및/또는 치료 및/또는 진단에서 이의 용도를 제공하는 데에 있다.
제1 양상에 있어서, 본 발명은 CD7 인간화 항체를 제공하며, 여기에는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역이 포함되고, 여기에서 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 CDR-L1, SEQ ID NO: 2로 표시되는 CDR-L2, SEQ ID NO: 3으로 표시되는 CDR-L3을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4로 표시되는 CDR-H1, SEQ ID NO: 5로 표시되는 CDR-H2, SEQ ID NO:6으로 표시되는 CDR-H3을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 8, 11, 14 및 17로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 상동성을 가지며, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9, 12, 15 및 18로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 상동성을 갖는다.
일 실시방식에 있어서, 상기 CD7 인간화 항체는 SEQ ID NO: 8, 11, 14 및 17로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 9, 12, 15 및 18로부터 선택되는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시방식에 있어서, 상기 CD7 인간화 항체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 10, 13, 16 및 19로부터 선택된다.
본 발명은 상기 CD7 인간화 항체를 암호화하는 핵산 분자를 더 제공한다. 따라서, 일 실시방식에 있어서, 상기 CD7 인간화 항체를 암호화하는 핵산 분자는 SEQ ID NO: 20 내지 23으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 서열 상동성을 가지며, 이의 암호화된 CD7 인간화 항체는 CD7 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 바람직하게는, 상기 CD7 인간화 항체를 암호화하는 핵산 분자는 SEQ ID NO: 20 내지 23으로부터 선택된다.
다른 일 양상에 있어서, 본 발명은 다중특이성 항체(바람직하게는 이중특이성 항체 또는 삼중특이성 항체)를 제공하며, 여기에는 상술한 CD7 인간화 항체 및 다른 항원과 특이적으로 결합하는 하나 이상의 제2 항체 또는 이의 항원 결합 부위가 포함된다.
일 실시방식에 있어서, 제2 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 임의 항체 또는 항체 단편 형태를 구비할 수 있으며, 예를 들어 전장 항체, Fab, Fab', (Fab')2, Fv, scFv, scFv-scFv, 미니바디(minibody), 디아바디(diabody) 또는 sdAb가 있다.
본 발명은 상기 CD7 인간화 항체 또는 다중특이성 항체를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터, 및 상기 CD7 인간화 항체 또는 다중특이성 항체를 발현하는 숙주 세포를 더 제공한다.
다른 일 양상에 있어서, 본 발명은 키메라 항원 수용체를 더 제공하며, 여기에는 본 발명에 따른 CD7 인간화 항체, 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인이 포함된다. 바람직하게는, 상기 키메라 항원 수용체는 하나 이상의 보조자극 도메인을 더 포함한다. 보다 바람직하게는, 키메라 항원 수용체는 본원에 따른 CD7 인간화 항체 또는 상기 CD7 인간화 항체를 포함하는 다중특이성 항체, CD8α 막횡단 도메인, CD28 또는 4-1BB 보조자극 도메인, 및 CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
본 발명은 상기에 정의된 바와 같은 CD7 표적의 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산 분자 및 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 더 제공한다.
본 발명은 상기에 정의된 바와 같은 CD7 표적의 키메라 항원 수용체를 포함하는 세포를 더 제공하며, 바람직하게는 T 세포, NK 세포, NKT 세포, 대식세포, 수지상 세포와 같은 면역 세포를 제공한다.
다른 일 양상에 있어서, 본 발명은 항체 접합체를 더 제공하며, 여기에는 본 발명에 정의된 CD7 인간화 항체 및 제2 기능성 구조가 포함된다. 여기에서 상기 제2 기능성 구조는 Fc, 방사성 동위원소 및 반감기를 연장하는 구조 부분, 검출 가능한 마커 및 약물로부터 선택된다.
일 실시방식에 있어서, 반감기를 연장하는 구조 부분은 알부민의 결합 구조, 트랜스페린의 결합 구조, 폴리에틸렌 글리콜 분자, 재조합 폴리에틸렌 글리콜 분자, 인간 혈청 알부민, 인간 혈청 알부민의 단편 및 인간 혈청 알부민을 결합하는 폴리펩티드(항체 포함)로부터 선택된다. 일 실시방식에 있어서, 검출 가능한 마커는 형광단, 화학발광 화합물, 생물발광 화합물, 효소, 항생제 내성 유전자 및 조영제로부터 선택된다. 일 실시방식에 있어서, 상기 약물은 세포 독소 및 면역 조절제로부터 선택된다.
다른 일 양상에 있어서, 본 발명은 검출 키트를 더 제공하며, 여기에는 본 발명에 따른 인간화 항체, 다중특이성 항체, 항체 접합체 또는 키메라 항원 수용체가 포함된다.
다른 일 양상에 있어서, 본 발명은 약학 조성물을 더 제공하며, 여기에는 본 발명에 따른 인간화 항체, 키메라 항원 수용체, 다중특이성 항체 또는 항체 접합체, 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제가 포함된다.
다른 일 양상에 있어서, 본 발명은 CD7 발현 관련 질환을 치료 및/또는 예방 및/또는 진단하는 방법을 더 제공하며, 여기에는 피험자에게 상술한 바와 같은 인간화 항체, 키메라 항원 수용체, 다중특이성 항체, 항체 접합체 또는 약학 조성물을 투여하는 단계가 포함된다.
발명의 상세 내용
달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 과학 및 기술 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
CD7 인간화 항체
본 명세서에서 용어 "항체"는 당업자가 이해하는 가장 광범위한 함의를 가지며, 여기에는 단일 클론 항체(온전한 항체 포함), 다중 클론 항체, 다가 항체, 다중특이성 항체(예를 들어 이중특이성 항체), 및 기대하는 생물학적 활성을 나타낼 수 있는 하나 이상의 CDR 서열을 갖는 항체 단편 또는 합성 폴리펩티드가 포함된다. 본 발명에 따른 항체는 임의 유형(예를 들어 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 등) 또는 아형(예를 들어 IgG1, IgG2, IgG2a, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 등)일 수 있다.
통상적으로, 온전한 항체에는 이황화 결합에 의해 함께 연결된 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄가 포함되며, 각각의 경쇄는 이황화 결합에 의해 각각의 중쇄에 연결되며, "Y"형 구조를 나타낸다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역을 포함하며, 여기에서 중쇄 가변 영역은 3개의 상보성 결정 영역(CDR): CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하고, 중쇄 불변 영역은 3개의 불변 도메인: CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역을 포함하며, 여기에서 경쇄 가변 영역은 3개의 CDR: CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을, 경쇄 불변 영역은 1개의 불변 도메인 CL을 포함한다. 중쇄/경쇄 가변 영역에서, CDR은 더욱 보존된 프레임워크 영역(FR)에 의해 분리된다. 중쇄/경쇄의 가변 영역은 항원과의 인식 및 결합을 담당하는 반면, 불변 영역은 항체가 숙주 조직이나 인자와 결합하도록 매개할 수 있으며, 여기에는 면역계의 다양한 세포(예를 들어 이펙터 세포)와 고전적인 보체계의 첫 번째 구성 요소가 포함된다.
주어진 CDR 또는 FR에 대한 정확한 아미노산 서열 경계는 당업계에 잘 알려진 여러 넘버링 방식을 사용하여 쉽게 결정할 수 있다. 이러한 방식에는, Kabat et al.(1991), "Sequences ofProteins of Immunological Interest," 제5판 Public Health Service, NationalInstitutes of Health, Bethesda, Maryland("Kabat" 넘버링 방식); Al-Lazikani et al.(1997)JMB273, 927-948("Chothia" 넘버링 방식); MacCallum et al., J.Mol.Biol.262:732-745(1996), "Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding sitetopography." J.Mol.Biol.262, 732-745"("Contact" 넘버링 방식); Lefranc MP et al. "IMGTunique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains andIg superfamily V-like domains.", Dev Comp Immunol, 2003년 1월; 27(1):55-77("IMGT" 넘버링 방식); Honegger A 및 Plckthun A, "Yet another numbering scheme forimmunoglobulin variable domains:an automatic modeling and analysis tool." JMol Biol, 2001년 6월 8일; 309(3):657-70("Aho" 넘버링 방식); 및 Martin et al., "Modelingantibody hypervariable loops:a combined algorithm," PNAS, 1989, 86(23):9268-9272("AbM" 넘버링 방식)가 포함된다.
주어진 CDR 또는 FR의 경계는 식별에 사용되는 방식에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, Kabat 방식은 구조적 비교를 기반으로 하는 반면, Chothia 방식은 구조적 정보를 기반으로 한다. Kabat 및 Chothia 방식의 넘버링은 모두 가장 일반적인 항체 영역 서열 길이를 기반으로 하는데, 여기에서 자모를 삽입함으로써 삽입(예를 들어 "30a")을 제공하며 일부 항체에서 결실이 나타난다. 이 두 방식은 특정 삽입 및 결실("삽입 결실(indel)")을 상이한 위치에 배치하여, 상이한 넘버링을 생성한다. Contact 방식은 복잡한 결정 구조의 분석을 기반으로 하며, 여러 측면에서 Chothia 넘버링 방식과 유사하다. AbM 방식은 Kabat 및 Chothia 정의 간의 절충안이며, Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에서 사용하는 방식을 기반으로 한다.
따라서, 달리 명시되지 않는 한, 주어진 항체 또는 이의 영역(예를 들어, 이의 가변 영역)의 "CDR"은 임의의 상기 방식 또는 다른 공지된 방식에 의해 정의된 CDR을 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 특정한 CDR(예를 들어, CDR3)에 주어진 아미노산 서열이 포함된다고 명시된 경우, 이러한 CDR은 임의 상기 방식 또는 기타 공지된 방식에 정의된 상응하는 CDR(예를 들어 CDR3)의 서열을 더 가질 수 있다. 마찬가지로, 달리 명시되지 않는 한, 주어진 항체 또는 이의 영역(예를 들어, 이의 가변 영역)의 "FR"은 임의의 상기 방식 또는 다른 공지된 방식에 의해 정의된 FR을 포함하는 것으로 이해된다.
본 명세서에 사용된 용어 "인간화" 항체는 모든 또는 기본적으로 모든 CDR 아미노산 잔기가 비인간 CDR로부터 유래되고 모든 또는 기본적으로 모든 FR 아미노산 잔기가 인간 FR로부터 유래되는 항체를 지칭한다. 비인간 항체의 "인간화 형태"는 상기 비인간 항체의 변이체를 지칭하며, 이는 인간화를 거쳐 통상적으로 인간에 대한 면역원성을 낮추는 동시에 모체 비인간 항체의 특이성 및 친화성을 유지한다. 일부 실시방식에 있어서, 인간화 항체의 일부 FR 잔기는 비인간 항체(예를 들어, CDR 잔기 유래 항체) 유래의 상응하는 잔기에 의해 치환되어, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화성을 회복 또는 개선한다.
인간화 항체 및 이의 제조 방법은 당업자에게 공지된 것이며, 예를 들어, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633(2008)을 참조한다. 인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 "최적 피팅" 방법을 사용하여 선택한 프레임워크 영역; 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 서브 그룹의 인간 항체의 공유 서열로부터 유래된 프레임워크 영역; 인간 성숙(체세포 돌연변이) 프레임워크 영역 또는 인간 생식계열 프레임워크 영역; 및 FR 라이브러리 스크리닝으로 획득한 프레임워크 영역을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용된 용어 "항체 단편" 또는 "항원 결합 부위"는 온전한 항체의 일부분만을 포함하는데, 일반적으로 온전한 항체의 항원 결합 부위를 포함하므로 항원을 결합하는 능력을 보유한다. 본 발명의 항체 단편의 예시에는 Fab, Fab', F(ab')2, Fd 단편, Fd', Fv 단편, scFv, 이황화 결합 Fv(sdFv), 항체의 중쇄 가변 영역(VH) 또는 경쇄 가변 영역(VL), 선형 항체, 2개의 항원 결합 부위를 갖는 "디아바디", 단일 도메인 항체, 나노바디, 상기 항원의 천연 리간드 또는 이의 기능성 단편 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 따라서, 본 발명의 "항체"는 상기에서 정의된 바와 같은 항체 단편을 포함한다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명의 CD7 인간화 항체는 scFv이다. "단일쇄 항체" 또는 "scFv"는 본원에서 혼용될 수 있으며, 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)이 링커에 의해 연결된 항체를 지칭한다. 링커의 최적 길이 및/또는 아미노산 조성이 선택될 수 있다. 링커의 길이는 scFv의 가변 도메인 폴딩 및 상호작용에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 사실상 비교적 짧은 링커(예를 들어 5-10개 아미노산 사이)를 사용하면 사슬 내 폴딩을 방지할 수 있다. 링커의 크기 및 조성의 선택에 대해서는, 예를 들어 Hollinger et al., 1993Proc Natl Acad.Sci. U.S.A. 90:6444-6448; 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0100543, 2005/0175606, 2007/0014794; 및 PCT 공개 번호 WO2006/020258 및 WO2007/024715를 참조하며, 이는 전체 내용이 참조로 본원에 포함되었다. scFv는 임의의 순서로 연결된 VH 및 VL, 예를 들어 VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH를 포함할 수 있다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명은 CD7 인간화 항체를 제공하며, 여기에는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역이 포함되고, 여기에서 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 CDR-L1, SEQ ID NO: 2로 표시되는 CDR-L2, SEQ ID NO: 3으로 표시되는 CDR-L3을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4로 표시되는 CDR-H1, SEQ ID NO: 5로 표시되는 CDR-H2, SEQ ID NO:6으로 표시되는 CDR-H3을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 8, 11, 14 및 17로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 서열 상동성을 가지며, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9, 12, 15 및 18로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 서열 상동성을 갖는다.
일 실시방식에 있어서, 상기 CD7 인간화 항체는 SEQ ID NO: 8, 11, 14 및 17로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 9, 12, 15 및 18로부터 선택되는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시방식에 있어서, 상기 CD7 인간화 항체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 10, 13, 16 및 19로 표시된다.
본원에서 사용되는 용어 "서열 상동성"은 2개의(뉴클레오티드 또는 아미노산) 서열이 비교에서 동일한 위치에 동일한 잔기를 갖는 정도를 의미하며, 통상적으로 백분율로 표시된다. 바람직하게는, 상동성은 비교되는 서열의 전체 길이 상에서 결정된다. 따라서 완전히 동일한 서열의 2개 카피는 100% 상동성을 갖는다. 당업자는 일부 알고리즘을 사용하여 서열 상동성을 결정할 수 있음을 알고 있으며, 예를 들어 Blast(Altschul 등(1997)Nucleic Acids Res.25: 3389-3402), Blast2(Altschul 등(1990)J.Mol.Biol.215: 403-410), Smith-Waterman(Smith 등(1981) J.Mol.Biol.147: 195-197) 및 ClustalW가 있다.
일 양상에 있어서, 본 발명은 상술한 바와 같은 CD7 인간화 항체를 포함하는 다중특이성 항체(바람직하게는 이중특이성 항체 또는 삼중특이성 항체)를 더 제공하며, 여기에는 다른 항원과 특이적으로 결합하는 하나 이상의 제2 항체가 더 포함된다.
본 명세서에 사용된 용어 "다중특이성"은 항원 결합 단백질이 다중에피토프 특이성을 갖는 것을 의미한다(즉, 하나의 생체분자 상의 2개, 3개 또는 그 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있거나 2개, 3개 또는 그 이상의 상이한 생체분자 상의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있음). 본 명세서에 사용된 용어 "이중특이성"은 항원 결합 단백질이 2가지의 상이한 항원 결합 특이성을 갖는 것을 나타낸다.
일 실시방식에 있어서, 제2 항체는 임의 항체 또는 항체 단편 형태를 구비할 수 있으며, 예를 들어 전장 항체, Fab, Fab', (Fab')2, Fv, scFv, scFv-scFv, 미니바디(minibody), 디아바디(diabody) 또는 sdAb가 있다.
따라서, 일 실시방식에 있어서, 상기 제2 항체 표적은, BCMA, CD4, CD5, CD8, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD52, CD54, CD74, CD80, CD126, CD138, B7, MUC-1, Ia, HM1.24, HLA-DR, 테나신, 혈관생성인자, VEGF, PIGF, ED-B 피브로넥틴, 종양유전자, 종양유전자 생성물, CD66a-d, 괴사 항원, Ii, IL-2, T101, TAC, IL-6, ROR1, TRAIL-R1(DR4), TRAIL-R2(DR5), tEGFR, Her2, L1-CAM, 메소텔린, CEA, B형 간염 표면 항원, 항엽산 수용체, CD24, CD30, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, ErbB3, ErbB4, ErbB 이량체, EGFR vIII, FBP, FCRL5, FCRH5, 태아 아세틸콜린 수용체, GD2, GD3, G 단백질 결합 수용체 유형 C 계열 5D(GPRC5D), HMW-MAA, IL-22R-α, IL-13R-α2, kdr, κ 경쇄, Lewis Y, L1-세포 부착 분자(L1-CAM), 흑색종 관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, 흑색종 우선 발현 항원(PRAME), 서바이빈, EGP2, EGP40, TAG72, B7-H6, IL-13 수용체 a2(IL-13Ra2), CA9, CD171, G250/CAIX, HLA-A1, HLA-A2, NY-ESO-1, PSCA, 엽산 수용체-a, CD44v6, CD44v7/8, avb6 인테그린, 8H9, NCAM, VEGF 수용체, 5T4, 태아 AchR, NKG2D 리간드, 이중 항원, 범용 태그 관련 항원, 암-고환 항원, MUC1, MUC16, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 암태아 항원, VEGF-R2, 암배아 항원(CEA), 전립선 특이성 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린 B2, CD123, c-Met, GD-2, O-아세틸화 GD2(OGD2), CE7, Wilms 종양 1(WT-1), 사이클린, 사이클린 A2, CCL-1, hTERT, MDM2, CYP1B, WT1, 액티빈, AFP, p53, 사이클린(D1), CS-1, BAFF-R, TACI, CD56, TIM-3, CD123, L1-세포 부착 분자, MAGE-A1, MAGEA3, 사이클린(예를 들어 사이클린 A1(CCNA1)) 및/또는 병원체 특이적 항원, 바이오틴화 분자, HIV, HCV, HBV 및/또는 기타 병원체에 의해 발현되는 분자; 및/또는 네오에피토프 또는 네오항원의 항원으로부터 선택된다.
핵산, 벡터, 숙주 세포
다른 일 양상에 있어서, 본 발명은 본 발명의 CD7 인간화 항체 또는 다중특이성 항체를 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명의 핵산은 RNA, DNA 또는 cDNA일 수 있다. 본 발명의 일 실시방식에 있어서, 본 발명의 핵산은 기본적으로 분리된 핵산이다.
일 실시방식에 있어서, 상기 CD7 인간화 항체를 암호화하는 핵산 분자는 SEQ ID NO: 20 내지 23으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 서열 상동성을 가지며, 이의 암호화된 CD7 인간화 항체는 CD7 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 바람직하게는, 상기 CD7 인간화 항체를 암호화하는 핵산 분자는 SEQ ID NO: 20 내지 23으로 표시된다.
본 발명의 핵산은 벡터 형태일 수도 있으며, 벡터에 존재하고/하거나 벡터의 일부분일 수 있다. 해당 벡터는 예를 들어 플라스미드, 코스미드 또는 YAC이다. 벡터는 특히 발현 벡터일 수 있으며, 즉 CD7 인간화 항체가 생체외 및/또는 생체내에서(즉, 적합한 숙주 세포, 숙주 유기체 및/또는 발현 시스템에서) 발현되는 벡터를 제공할 수 있다. 해당 발현 벡터는 통상적으로 적어도 하나의 본 발명의 핵산 분자를 포함하며, 이는 하나 이상의 적합한 발현 제어 요소(예를 들어 프로모터, 인핸서, 터미네이터 등)에 작동가능하게 연결될 수 있다. 상기 조절 요소 및 이의 서열을 선택하여 특정 숙주에서의 발현을 용이하게 하는 것은 당업자가 잘 알고 있는 것이다. 본 발명의 CD7 인간화 항체의 발현에 유용하거나 필요한 조절 요소 및 기타 요소의 구체적인 예시에는 프로모터, 인핸서, 터미네이터, 인테그레이터, 선별 마커, 리더 서열, 리포터 유전자가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
다른 일 양상에 있어서, 본 발명은 본 발명의 CD7 인간화 항체, 다중특이성 항체를 발현하고/하거나 본 발명의 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 더 제공한다. 본 발명의 바람직한 숙주 세포는 박테리아 세포, 진균 세포 또는 포유동물 세포이다.
적합한 박테리아 세포는 그람 음성 박테리아 균주(예를 들어 대장균(Escherichia coli) 균주, 프로테우스속(Proteus) 균주 및 슈도모나스속(Pseudomonas) 균주) 및 그람 양성 박테리아 균주(예를 들어 바실루스속(Bacillus) 균주, 스테렙토미세스속(Streptomyces) 균주, 포도상구균속(Staphylococcus) 균주 및 락토코쿠스속(Lactococcus) 균주)의 세포를 포함한다.
적합한 진균 세포는 트리코데르마속(Trichoderma), 뉴로스포라속(Neurospora) 및 아스페르길루스속(Aspergillus) 종의 세포; 또는 사카로마이세스속(Saccharomyces)(예를 들어, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)), 시조사카로미세스속(Schizosaccharomyces)(예를 들어 쉬조사카로마이세스 폼베속(Schizosaccharomyces pombe)), 피치아속(Pichia)(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichiapastoris) 및 피치아 메탄올리카(Pichia methanolica)) 및 한세눌라속(Hansenula) 종의 세포를 포함한다.
적합한 포유동물 세포는 예를 들어 HEK293 세포, CHO 세포, BHK 세포, HeLa 세포, COS 세포 등을 포함한다.
그러나, 본 발명은 양서류 세포, 곤충 세포, 식물 세포 및 당업계에서 이종 단백질을 발현하기 위한 임의 기타 세포도 사용할 수 있다.
키메라 항원 수용체
다른 일 양상에 있어서, 본 발명은 상술한 바와 같은 CD7 인간화 항체를 포함하는 재조합 수용체를 더 제공하며, 예를 들어 재조합 TCR 수용체 또는 키메라 항원 수용체가 있다. 바람직하게는, 본 발명은 상술한 바와 같은 CD7 인간화 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체를 더 제공한다.
본원에서 사용되는 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 인공적으로 구축된 하이브리드 폴리펩티드를 의미한다. 상기 하이브리드 폴리펩티드는 일반적으로 리간드 결합 도메인(예를 들어 항체의 항원 결합 부분), 막횡단 도메인, 보조자극 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 각 도메인 사이는 링커에 의해 연결된다. CAR은 항체의 항원 결합 특성을 이용하여 비MHC 제한 방식으로 T 세포 및 기타 면역 세포의 특이성과 반응성을 선택한 표적으로 재지정할 수 있다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명은 키메라 항원 수용체를 제공하며, 여기에는 상술한 바와 같은 CD7 인간화 항체 또는 상기 CD7 인간화 항체를 함유한 다중특이성 항체, 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인이 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "막횡단 도메인"은 면역 세포(예를 들어, 림프구, NK 세포 또는 NKT 세포)의 표면에서 키메라 항원 수용체를 발현시킬 수 있고, 표적 세포에 대한 면역 세포의 세포 반응을 안내할 수 있는 폴리펩티드 구조를 의미한다. 막횡단 도메인은 천연 또는 합성일 수 있으며, 임의 막결합 또는 막횡단 단백질로부터 유래될 수 있다. 키메라 항원 수용체와 표적 항원이 결합하면, 막횡단 도메인은 신호전달을 수행할 수 있다. 특히 본 발명에 적용되는 막횡단 도메인은 예를 들어 TCRα 사슬, TCRβ 사슬, TCRγ 사슬, TCRδ 사슬, CD3ζ 서브유닛, CD3ε 서브유닛, CD3γ 서브유닛, CD3δ 서브유닛, CD45, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 및 이의 기능적 단편으로부터 유래될 수 있다. 또는 막횡단 도메인은 합성된 것일 수 있으며, 주로 류신과 발린 같은 소수성 잔기를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 막횡단 도메인은 CD8α 사슬 또는 CD28로부터 유래된다. 이는 SEQ ID NO: 24 또는 26으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 서열 상동성을 갖거나, 이의 암호화 서열은 SEQ ID NO: 25 또는 27로 표시되는 핵산 분자와 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100% 서열 상동성을 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 효과기 기능 신호를 전달하고 세포가 주어진 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 일부를 의미한다. 일 실시방식에 있어서, 본 발명의 키메라 항원 수용체에 포함된 세포내 신호전달 도메인은 T 세포 수용체 및 보조 수용체의 세포내 영역 서열일 수 있으며, 이는 항원 수용체 결합 후 함께 작용하여 신호전달뿐만 아니라, 이러한 서열의 모든 파생물 또는 변이체 및 동일하거나 유사한 기능을 갖는 모든 합성 서열을 개시한다. 세포내 신호전달 도메인은 많은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motifs, ITAM)를 포함할 수 있다. 본 발명의 세포내 신호전달 도메인의 비제한적 예시에는 FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d 등의 세포내 영역이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 바람직한 실시방식에 있어서, 본 발명의 CAR의 신호전달 도메인은 CD3ζ 세포내 영역을 포함할 수 있으며, 이는 SEQ ID NO: 32 또는 34로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%의 서열 상동성을 갖거나, 이의 암호화 서열은 SEQ ID NO: 33 또는 35로 표시되는 핵산 분자와 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%의 서열 상동성을 갖는다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 항체와 막횡단 도메인 사이에 위치한 힌지 영역을 더 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "힌지 영역"은 일반적으로 막횡단 도메인을 항체에 연결하도록 작용하는 임의의 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 구체적으로, 힌지 영역은 항체에 더 큰 유연성과 접근성을 제공하는 역할을 한다. 힌지 영역은 최대 300개의 아미노산, 바람직하게는 10 내지 100개의 아미노산, 가장 바람직하게는 25 내지 50개의 아미노산을 포함할 수 있다. 힌지 영역은 CD8, CD4 또는 CD28의 세포외 영역으로부터 전체적으로 또는 부분적으로, 또는 항체 불변 영역으로부터 전체적으로 또는 부분적으로와 같이 천연 분자로부터 전체적으로 또는 부분적으로 유래될 수 있다. 또는 힌지 영역은 자연 발생 힌지 서열에 대응하는 합성 서열이거나, 완전히 합성된 힌지 서열일 수 있다. 바람직한 실시방식에 있어서, 상기 힌지 영역은 CD8α, CD28, FcγRIIIα 수용체, IgG4 또는 IgG1의 힌지 영역 부분을 포함하고, 보다 바람직하게는 CD8α, CD28 또는 IgG4 힌지이며, 이는 SEQ ID NO: 40, 42 또는 44로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%의 서열 상동성을 갖거나, 이의 암호화 서열은 SEQ ID NO: 41, 43 또는 45로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%의 서열 상동성을 갖는다.
일 실시방식에 있어서, 키메라 항원 수용체는 하나 이상의 보조자극 도메인을 더 포함할 수 있다. 보조자극 도메인은 상기 보조자극 분자로부터의 세포내 기능적 신호전달 도메인일 수 있고, 여기에는 상기 보조자극 분자의 전체 세포내 부분 또는 이의 기능적 단편이 포함된다. "보조자극 분자"는 T 세포 상에서 보조자극 리간드에 특이적으로 결합함으로써, T 세포의 보조자극 반응(예를 들어, 증식)을 매개하는 동족 결합 배우체를 의미한다. 보조자극 분자에는 MHC 클래스 1 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 보조자극 도메인의 비제한적 예시에는 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD8, CD18(LFA-1), CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD270(HVEM), CD272(BTLA), CD276(B7-H3), CD278(ICOS), CD357(GITR), DAP10, LAT, NKG2C, SLP76, PD-1, LIGHT, TRIM 및 ZAP70의 단백질로부터 선택된 하나 이상의 보조자극 신호전달 도메인이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 CAR의 보조자극 도메인은 4-1BB, CD28 또는 4-1BB+CD28로부터 유래된다. 일 실시방식에 있어서, 4-1BB 보조자극 도메인과 SEQ ID NO: 30으로 표시되는 아미노산 서열은 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 상동성을 갖거나, 이의 암호화 서열은 SEQ ID NO: 31로 표시되는 핵산 분자와 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 상동성을 갖는다. 일 실시방식에 있어서, CD28 보조자극 도메인과 SEQ ID NO: 28로 표시되는 아미노산 서열은 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 상동성을 갖거나, 이의 암호화 서열은 SEQ ID NO: 29로 표시되는 핵산 분자와 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 상동성을 갖는다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명의 CAR은 T 세포와 같은 세포에서 발현될 때 신생 단백질이 소포체에 이어서 세포 표면에 지시되도록 신호 펩티드를 포함할 수 있다. 신호 펩티드의 코어는 단일 α-나선을 형성하는 경향이 있는 긴 길이의 소수성 아미노산 영역을 포함할 수 있다. 신호 펩티드의 말단에는 통상적으로 신호 펩티다제에 의해 인식되고 절단되는 아미노산 영역이 있다. 신호 펩티다제는 전좌 동안 또는 완료 후 절단되어 유리 신호 펩티드 및 성숙 단백질을 생성할 수 있다. 그 후, 유리 신호 펩티드는 특정 프로테아제에 의해 소화된다. 본 발명에서 사용될 수 있는 신호 펩티드는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 B2M, CD8α, IgG1, GM-CSFRα 등에서 유래된 신호 펩티드이다. 일 실시방식에 있어서, 본 발명의 신호 펩티드는 B2M 또는 CD8α로부터 유래되며, 이는 SEQ ID NO: 36 또는 38로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%의 서열 상동성을 갖거나, 이의 암호화 서열은 SEQ ID NO: 37 또는 39로 표시되는 핵산 분자와 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%의 서열 상동성을 갖는다.
일 실시방식에 있어서, 상기 CAR은 본원에 따른 CD7 인간화 항체를 포함하거나 상기 CD7 인간화 항체를 포함하는 다중특이성 항체, CD8α 막횡단 도메인, CD28 또는 4-1BB 보조자극 도메인, 및 CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 상기 실시방식에 있어서, 상기 CAR은 B2M, CD8α, IgG1 또는 GM-CSFRα 유래의 신호 펩티드를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 상기에 정의된 바와 같은 CD7 표적의 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산 분자 및 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 더 제공한다.
본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 (외인성) 유전 물질을 숙주 세포로 전달하기 위한 비히클로 사용되는 핵산 분자이며, 상기 핵산 분자는 예를 들어 숙주 세포에서 복제 및/또는 발현될 수 있다. 벡터는 일반적으로 표적화 벡터 및 발현 벡터를 포함한다. "표적화 벡터"는 분리된 핵산을 예를 들어, 특정 표적화 부위의 서열을 사용하여 상동 재조합 또는 하이브리드 재조합효소에 의해 세포 내부로 전달하는 매체이다. "발현 벡터"는 본 발명의 키메라 항원 수용체 폴리펩티드를 암호화하는 것과 같은 이종 핵산 서열의 전사 및 적합한 숙주 세포에서의 이들의 mRNA 번역에 사용되는 벡터이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 벡터는 당업계에 공지되어 있고 다수가 상업적으로 입수가능하다. 일 실시방식에 있어서, 본 발명의 벡터는 플라스미드, 바이러스(예를 들어 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 백시니아바이러스, 라우스육종바이러스(RSV), 폴리오마바이러스 및 아데노 관련 바이러스(AAV) 등), 파지, 파지미드, 코스미드 및 인공 염색체(BAC 및 YAC 포함)를 포함한다. 벡터 자체는 통상적으로 핵산 분자이며, 통상적으로 삽입물(트랜스진)을 포함하는 DNA 서열과 벡터의 "백본" 역할을 하는 비교적 큰 서열이다. 조작된 벡터는 통상적으로 숙주 세포의 자율 복제 기점(폴리뉴클레오티드의 안정적인 발현이 필요한 경우), 선별 마커 및 제한 효소 절단 부위(예를 들어 다중 클론 부위, MCS 등)도 포함한다. 벡터는 프로모터, 폴리A 꼬리(polyA), 3' UTR, 인핸서, 터미네이터, 인슐레이터, 오퍼레이터, 선별 마커, 리포터 유전자, 표적화 서열 및/또는 단백질 정제 태그 등 요소를 더 포함한다. 구체적인 일 실시방식에 있어서, 상기 벡터는 체외 전사된 벡터이다.
조작된 면역 세포
일 양상에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따른 CAR을 발현하는 조작된 면역 세포를 더 제공한다.
본원에서 사용되는 용어 "면역 세포"는 하나 이상의 이펙터 기능(예를 들어, 세포독성 세포 사멸 활성, 사이토카인 분비, ADCC 및/또는 CDC 유도)을 갖는 면역계의 임의의 세포를 지칭한다. 예를 들어, 면역 세포는 T 세포, 대식 세포, 수지상 세포, 단핵구, NK 세포 및/또는 NKT 세포일 수 있다. 일 실시방식에 있어서, 면역 세포는 성체줄기세포, 배아줄기세포, 제대혈줄기세포, 전구세포, 골수줄기세포, 유도만능줄기세포, 전능줄기세포 또는 조혈줄기세포 등과 같은 줄기세포에서 유래한다. 바람직하게는, 면역 세포는 T 세포이다. T 세포는 1차 T 세포와 같이 체외 배양된 T 세포, 또는 Jurkat, SupT1 등과 같이 체외 배양된 T 세포주의 T 세포, 또는 피험자로부터 획득한 T 세포와 같은 임의의 T 세포일 수 있다. 피험자의 예시에는 인간, 개, 고양이, 마우스, 래트 및 이들의 트랜스진 물종 포함한다. T 세포는 말초혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직 및 종양을 비롯한 다양한 출처에서 얻을 수 있다. T 세포는 농축되거나 정제될 수도 있다. T 세포는 임의 발육 단계에 있는 CD4+/CD8+ T 세포, CD4+ 헬퍼 T 세포(예를 들어, Th1 및 Th2 세포), CD8+ T 세포(예를 들어, 세포독성 T 세포), 종양 침윤 세포, 기억 T 세포, 나이브 T 세포, γδ-T 세포, αβ-T 세포 등을 포함하나 이에 한정되지 않을 수 있다. 바람직한 일 실시방식에 있어서, 면역 세포는 인간 T 세포이다. Ficoll 분리와 같은 당업자에게 공지된 다양한 기술을 사용하여 피험자의 혈액으로부터 T 세포를 얻을 수 있다.
당업계에 공지된 통상의 방법(예를 들어, 형질도입, 형질감염, 형질전환 등)을 채택하여 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 면역 세포에 도입할 수 있다. "형질감염"은 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드(벡터 포함)를 표적 세포에 도입하는 과정이다. 한 가지 예시는 RNA 형질감염, 즉 RNA(예를 들어 체외 전사된 RNA, ivtRNA)를 숙주 세포에 도입하는 과정이다. 해당 용어는 주로 진핵 세포의 비바이러스 방법에 사용된다. "형질도입"이라는 용어는 통상적으로 바이러스 매개의 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드의 전달을 설명하는 데 사용된다. 동물 세포의 형질감염은 통상적으로 세포막에 일시적인 기공 또는 "구멍"을 열어 물질 섭취를 허용하는 것이다. 인산칼슘 사용, 전기천공법, 세포 압출 또는 양이온성 지질을 물질과 혼합하여 세포막과 융합하고 이들의 운반물을 내부의 리포좀에 침착시켜 형질감염을 수행할 수 있다. 진핵 숙주 세포를 형질감염시키기 위한 예시적인 기술에는 지질 소포-매개 섭취, 열 충격-매개 섭취, 인산칼슘-매개 형질감염(인산칼슘/DNA 공침전), 미세주입 및 전기천공법이 포함된다. 용어 "형질전환"은 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드(벡터 포함)의 박테리아뿐만 아니라 비동물 진핵 세포(식물 세포 포함)로의 비-바이러스 전달을 설명하는 데 사용된다. 따라서 형질전환은 박테리아 또는 비동물성 진핵 세포의 유전적 변형이며, 이는 주변 환경으로부터 세포막에 의한 직접적인 섭취와 외인성 유전 물질(핵산 분자)의 후속 통합에 의해 생성된다. 형질전환은 수동 수단으로 수행할 수 있다. 형질전환이 일어나기 위해서는 세포나 박테리아가 수용능 상태에 있어야 한다. 원핵 형질전환의 경우, 기술에는 열충격 매개 섭취, 완전한 세포와 세균 원형질체의 융합, 미세주입 및 전기천공법이 포함될 수 있다. 핵산 또는 벡터가 면역 세포에 도입된 후, 당업자는 통상적인 기술에 의해 수득된 면역 세포를 증폭 및 활성화할 수 있다.
일 실시방식에 있어서, 이식편대숙주병의 위험을 줄이기 위해, 상기 조작된 면역 세포는 적어도 하나의 CD52, GR, dCK, TCR/CD3 유전자(예를 들어 TRAC, TRBC, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ), MHC 관련 유전자(HLA-A, HLA-B, HLA-C, B2M, HLA-DPA, HLA-DQ, HLA-DRA, TAP1, TAP2, LMP2, LMP7, RFX5, RFXAP, RFXANK, CIITA) 및 면역 체크포인트 유전자, 예를 들어 PD1, LAG3, TIM3, CTLA4, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, HAVCR2, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2 및 GUCY1B3으로부터 선택되는 유전자의 발현이 억제 또는 침묵되는 것을 더 포함한다. 바람직하게는, 상기 조작된 면역 세포는 적어도 하나의 TRAC, TRBC, HLA-A, HLA-B, HLA-C, B2M, RFX5, RFXAP, RFXANK, CIITA, PD1, LAG3, TIM3, CTLA4로부터 선택되는 유전자의 발현이 억제되거나 침묵되는 것을 더 포함하며, 보다 바람직하게는 TRAC, TRBC, HLA-A, HLA-B, HLA-C, B2M, RFX5, RFXAP, RFXANK, CIITA이다.
유전자 발현을 억제하거나 유전자를 침묵시키는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 안티센스 RNA, RNA 디코이, RNA 앱타머, siRNA, shRNA/miRNA, 트랜스-우성-음성 단백질(TNP), 키메라/항체 접합체, 케모카인 리간드, 항감염성 세포 단백질, 세포내 항체(sFv), 뉴클레오시드 유사체(NRTI), 비-뉴클레오시드 유사체(NNRTI), 인테그라제 억제제(올리고뉴클레오티드, 디뉴클레오티드 및 화학제) 및 프로테아제 억제제를 사용하여 유전자 발현을 억제한다. 또한 예를 들어 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, TALE 뉴클레아제 또는 CRISPR 시스템 중의 Cas 효소에 의해 매개된 DNA 단편화를 통해 유전자를 침묵시킬 수도 있다.
일 실시방식에 있어서, 다양한 면역 세포를 제공하며, 각종 면역 세포는 하나 이상의 키메라 항원 수용체를 발현하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시방식에 있어서, 하나의 면역 세포를 CD7에 결합하고/하거나 표적화하는 키메라 항원 수용체(예를 들어, 본 발명에 따른 CD7 인간화 항체를 포함하는 CAR)를 발현하도록 조작하고, 다른 하나의 면역 세포를 기타 항원에 결합하고/하거나 표적화하는 키메라 항원 수용체를 발현하도록 조작한다. 일 실시방식에 있어서, 면역 세포는 다중특이성 키메라 항원 수용체를 발현할 수도 있으며, 이는 CD7을 포함한 하나 이상의 항원을 표적화한다. 예를 들어, 이러한 다중특이성 키메라 항원 수용체는 CD7 표적의 다중특이성 항체를 포함하거나, 본 발명에 따른 CD7 인간화 항체 및 기타 항원을 표적화하는 항체를 동시에 포함할 수 있다. 이러한 실시방식에 있어서, 상기 다양한 조작된 면역 세포는 함께 또는 개별적으로 투여될 수 있다. 일 실시방식에 있어서, 상기 다양한 면역 세포는 동일한 조성물 또는 상이한 조성물에 있을 수 있다. 세포의 예시적 조성물에는 본 출원의 이하에 설명된 조성물이 포함된다.
항체 접합체
일 양상에 있어서, 본 발명은 항체 접합체를 제공하며, 여기에는 본 발명에 정의된 CD7 인간화 항체 및 제2 기능성 구조가 포함된다. 여기에서 상기 제2 기능성 구조는 Fc, 방사성 동위원소 및 반감기를 연장하는 구조 부분, 검출 가능한 마커 및 약물로부터 선택된다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명은 항체 접합체를 제공하며, 여기에는 본 발명에 정의된 CD7 인간화 항체 및 Fc가 포함된다. 본 명세서에 사용된 용어 "Fc"는 면역글로불린 중쇄의 C 말단 영역을 정의하는 데 사용되며, 여기에는 천연 Fc 및 변이체 Fc가 포함된다. "천연 Fc"는 온전한 항체의 분해에 의해 생성된, 단량체 또는 다량체 여부에 상관없는 비항원 결합 단편을 포함하는 분자 또는 서열을 지칭한다. 천연 Fc가 생산되는 면역글로불린의 공급원은 바람직하게는 인간이다. 천연 Fc 단편은 공유 결합(예를 들어 이황화 결합) 및 비공유 결합에 의해 이량체 또는 다량체 형태로 연결될 수 있는 단량체 폴리펩티드로 구성된다. 유형(예를 들어 IgG, IgA, IgE, IgD, IgM) 또는 아형(예: IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgGA2)에 따라, 천연 Fc 분자 단량체 서브유닛 사이에 1-4개의 분자간 이황화 결합을 갖는다. 천연 Fc의 예시는 IgG의 파파인 분해에 의해 생성된 이황화 결합을 통해 연결된 이량체이다(Ellison et al.(1982), Nucleic Acids Res. 10:4071-9 참조). 본 명세서에 사용된 용어 "천연 Fc"는 일반적으로 단량체, 이량체 및 다량체 형태를 의미한다. "변이체 Fc"는 본원에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 "아미노산 변형"에 의해 "천연" 또는 "야생형" Fc의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 지칭하며, "Fc 변이체"로 칭하기도 한다. 따라서, "Fc"는 단일 사슬 Fc(scFc), 즉 폴리펩티드 링커에 의해 연결된 2개의 Fc 단량체로 구성된 단일 사슬 Fc를 포함하며, 이는 기능적 이합체 Fc 영역으로 자연적으로 폴딩될 수 있다. 일 실시방식에 있어서, 상기 Fc는 바람직하게는 인간 면역글로불린의 Fc이며, 보다 바람직하게는 인간 IgG1의 Fc이다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명은 항체 접합체를 제공하며, 여기에는 본 발명에 정의된 CD7 인간화 항체 및 방사성 동위원소가 포함된다. 본 발명에 사용되는 방사성 동위원소의 예시에는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 99mTc, 123I, 18F 및 68Ga가 포함되나 이에 한정되지 않는다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명은 항체 접합체를 제공하며, 여기에는 본 발명에 정의된 CD7 인간화 항체 및 반감기를 연장하는 구조 부분이 포함되고, 상기 반감기를 연장하는 구조 부분은 알부민의 결합 구조, 트랜스페린의 결합 구조, 폴리에틸렌 글리콜 분자, 재조합 폴리에틸렌 글리콜 분자, 인간 혈청 알부민, 인간 혈청 알부민의 단편 및 인간 혈청 알부민을 결합하는 폴리펩티드(항체 포함)로부터 선택된다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명은 항체 접합체를 제공하며, 여기에는 본 발명에 정의된 CD7 인간화 항체 및 검출 가능한 마커가 포함된다. 용어 "검출 가능한 마커"는 본원에서 신호 검출이 가능한 화합물을 지칭한다. 예를 들어, 검출 가능한 마커는 MRI 조영제, 신티그래피 조영제, X선 영상 조영제, 초음파 조영제, 광학 영상 조영제일 수 있다. 검출 가능한 마커의 예시에는 형광단(예를 들어 플루오레세인, Alexa 또는 시아닌), 화학 발광 화합물(예를 들어 루미놀), 생물 발광 화합물(예를 들어 루시페라아제 또는 알칼리 포스파타제), 효소(예를 들어 겨자무과산화효소, 포도당-6-포스파타제, β-갈락토시다제), 항생제(예를 들어 카나마이신, 암피실린, 클로람페니콜, 테트라사이클린 등) 내성 유전자 및 조영제(예를 들어 나노입자 또는 가돌리늄)이 포함된다. 당업자는 사용하는 검출 시스템에 따라 적합한 검출 가능한 마커를 선택할 수 있다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명은 항체 접합체를 제공하며, 여기에는 본 발명에 정의된 CD7 인간화 항체 및 상기 CD7 인간화 항체와 접합되는 약물을 포함하는데, 예를 들어 세포 독소 또는 면역 조절제(즉, 항체 약물 접합체)가 있다. 통상적으로 약물은 공유 결합을 통해 항체와 연결되며, 통상적으로 링커에 의존한다. 일 실시방식에 있어서, 상기 약물은 세포 독소이다. 다른 일 실시방식에 있어서, 상기 약물은 면역 조절제이다. 세포 독소의 예시에는 메토트렉세이트, 아미노프테린, 6-메르캅토푸린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실, 다카르바진, 질소 머스타드, 티오테파, 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU), 로무스틴(CCNU), 1-메틸니트로소우레아, 시클로포스파미드, 질소 머스타드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조신, 미토마이신, 시스-디클로로디아민 백금(II)(DDP), 시스플라틴, 카르보플라틴, 조루비신, 독소루비신, 데토루비신, 카미노마이신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 악티노마이신 D, 블레오마이신, 칼리케아미신, 미트로마이신, 안트라마이신(AMC), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 파클리탁셀, 리신, 슈도모나스 외독소, 젬시타빈, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 에토포사이드, 테니포사이드, 콜히친, 디하이드록시안트라세디온, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 퓨로마이신, 프로카바진, 하이드록시우레아, 아스파라기나제, 코르티코스테로이드, 미토탄(O,P'-(DDD)), 인터페론, 및 이들의 조합이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 면역 조절제의 예시에는 간시클로비르, 에타너셉트, 타크로리무스, 시롤리무스, 사이클로스포린, 사이클로스포린, 라파마이신, 사이클로포스파미드, 아자티오프린, 마이코페놀레이트 모페틸, 메토트렉세이트 레티노이드, 글루코코르티코이드 및 유사체, 사이토카인, 줄기 세포 성장 인자, 림프독소, 종양 괴사 인자(TNF), 조혈 인자, 인터루킨(예를 들어 IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18 및 IL-21), 콜로니 자극 인자(예를 들어 G-CSF 및 (GM-CSF), 인터페론(예를 들어 인터페론-α, 인터페론-β 및 인터페론-γ), "S1 인자"로 명명된 줄기 세포 성장 인자, 에리트로포이에틴 및 트롬보포이에틴, 또는 이들의 조합이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
키트와 약학 조성물
다른 일 양상에 있어서, 본 발명은 검출 키트를 더 제공하며, 여기에는 본 발명에 따른 인간화 항체, 다중특이성 항체, 항체 접합체 또는 키메라 항원 수용체가 포함된다.
다른 일 양상에 있어서, 본 발명은 약학 조성물을 더 제공하며, 여기에는 본 발명에 따른 인간화 항체, 키메라 항원 수용체, 다중특이성 항체 또는 항체 접합체, 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제가 포함된다.
본 명세서에 사용된 용어 "약학적으로 허용 가능한 부형제"는 피험자 및 활성 성분과 약리학적 및/또는 생리학적으로 적합(즉, 원하지 않는 국소적 또는 전신적 효과를 일으키지 않고 원하는 치료 효과를 이끌어낼 수 있음)한 담체 및/또는 부형제를 의미하며, 이는 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995 참조). 약학적으로 허용 가능한 부형제의 예시에는 충전제, 결합제, 붕해제, 코팅제, 흡착제, 접착방지제, 유동보조제, 산화방지제, 향미제, 착색제, 감미제, 용매, 공용매, 완충제, 킬레이트제, 계면활성제, 희석제, 습윤제, 방부제, 유화제, 코팅제, 등장화제, 흡수 지연제, 안정화제 및 장력 조절제가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 적합한 부형제의 선택은 본 발명의 원하는 약학 조성물의 제조를 위해 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명의 약학 조성물에 사용하기 위한 예시적인 부형제는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스 및 물을 포함한다. 통상적으로, 적합한 부형제의 선택은 특히 사용되는 활성제, 치료할 질병 및 약학 조성물의 원하는 제형에 따라 달라진다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 다양한 투여 경로에 적합하다. 통상적으로, 투여는 비경구적으로 수행된다. 비경구 전달 방법은 국소, 동맥내, 근육내, 피하, 골수내, 척수강내, 심실내, 정맥내, 복강내, 자궁내, 질내, 설하 또는 비강내 투여를 포함한다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 다양한 형태, 예컨대 고체, 액체, 기체 또는 동결건조 형태로 제조될 수도 있으며, 특히 연고, 크림, 경피 패치, 겔, 분말, 정제, 용액, 기체 에어로졸 형태, 과립, 환제, 현탁액, 에멀젼, 캡슐, 시럽, 엘릭시르, 추출물, 팅크 또는 액체 추출물의 형태, 또는 원하는 투여 방법에 사용하기 위해 특별히 적합한 형태일 수 있다. 약제의 제조를 위한 본 발명에 공지된 공정은 예를 들어 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정 제조, 밀링, 유화, 캡슐화, 포매 또는 동결건조 공정을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 것과 같은 면역 세포를 포함하는 약학 조성물은 통상적으로 용액 형태로 제공되며, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 완충액을 포함한다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 치료될 질환의 치료 및/또는 예방에 적합한 하나 이상의 다른 약제와 조합하여 투여될 수 있다. 조합에 적합한 약제의 바람직한 예시에는 시스플라틴, 메이탄신 유도체, 라첼마이신(rachelmycin), 칼리케아미신(calicheamicin), 도세탁셀, 에토포사이드, 겜시타빈, 이포스파미드, 이리노테칸, 멜팔란, 미톡산트론, 소르피머 나트륨 포르피린 II(sorfimer sodiumphotofrin II), 테모졸로미드, 토포테칸, 트리메트레이트 글루쿠로네이트(trimetreate glucuronate), 아우리스타틴 E(auristatin E), 빈크리스틴 및 독소루비신과 같은 항암 약물; 리신, 디프테리아 독소, 슈도모나스 박테리아 외독소 A, DNase 및 RNase와 같은 펩티드 세포 독소; 요오드 131, 레늄 186, 인듐 111, 이리듐 90, 비스무트 210 및 213, 악티늄 225 및 아스타틴 213과 같은 방사성 핵종; 항체-지정 효소 전구 약물 등의 전구 약물; 혈소판 인자 4, 흑색종 성장 촉진 단백질 등과 같은 면역자극제; 항-CD3 항체 또는 이의 단편, 보체 활성제, 이종 단백질 도메인, 동종 단백질 도메인, 바이러스/박테리아 단백질 도메인 및 바이러스/박테리아 펩티드와 같은 항체 또는 이의 단편이 포함된다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 화학 요법, 방사선 요법과 같이 다른 하나 이상의 치료 방법과 조합 사용될 수 있다.
치료/예방/진단 용도
다른 일 양상에 있어서, 본 발명은 CD7 발현 관련 질환을 치료 및/또는 예방 및/또는 진단하는 방법을 더 제공하며, 여기에는 피험자에게 상술한 바와 같은 인간화 항체, 키메라 항원 수용체, 다중특이성 항체, 항체 접합체 또는 약학 조성물을 투여하는 단계가 포함된다.
일 실시방식에 있어서, CD7 발현과 관련된 질병에는 비고형 종양(예를 들어 백혈병 및 림프종과 같은 혈액학적 종양) 및 고형 종양이 포함된다. 혈액학적 종양은 혈액 또는 골수의 암이며, 여기에는 급성 백혈병(예를 들어 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 및 골수모세포성, 전골수성, 골수단구성, 단핵구성 및 적백혈병), 만성 백혈병(예를 들어 만성 골수성(과립구성) 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병), 진성 적혈구증가증, 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종(무통 및 고등급 형태), 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 골수이형성 증후군, 털세포 백혈병, 버킷 림프종, 미만성 대세포 림프종, 맨틀 세포 림프종, T-림프구성 백혈병/림프종(T-ALL/LBL), 조기 친T-림프구성 백혈병(ETP-ALL), 결절외 NK/T 세포 림프종, 소림프구성 림프종(SLL) 및 척수 발달 불량이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 고형 종양은 통상적으로 양성 또는 악성일 수 있는 낭종이나 체액 영역을 포함하지 않는 비정상적인 조직 덩어리이다. 상이한 유형의 고형 종양은 이를 형성하는 세포 유형에 따라 명명된다(예를 들어 육종, 암종 및 림프종). 고형 종양의 예시에는 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 중피종, 췌장암, 난소암, 복막암, 대망암 및 장간막암, 인두암, 전립선암, 직장암, 신장암, 피부암, 소장암, 흑색종, 신장암, 후두암, 연조직암, 위암, 고환암, 대장암, 식도암, 자궁경부암, 폐포 횡문근육종, 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 항문암, 안구암, 간내 담관암, 관절암, 목암, 담낭암, 흉막암, 비강암, 중이암, 구강암, 외음부암, 갑상선암 및 요관암이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
일 실시방식에 있어서, CD7 발현과 관련된 질병은 바람직하게는 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), T-림프구성 림프종(T-LBL), 조기 친T-림프구성 백혈병(ETP-ALL) 및 결절외 NK/T 세포 림프종으로부터 선택된다.
이하 첨부된 도면 및 실시예를 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다. 당업자는 본 발명의 도면 및 실시예가 단지 예시를 위한 것이며 본 발명을 제한하지 않음을 이해해야 한다는 점에 유의해야 한다. 모순되지 않는 경우, 본원의 실시예와 실시예의 특징은 서로 조합될 수 있다.
도 1은 CD7 인간화 항체를 포함하는 CAR-T 세포의 scFv 발현 수준을 도시하였다.
도 2는 표적 세포에 대한 CD7 인간화 항체를 포함하는 CAR-T 세포의 사멸 효과를 도시하였다.
도 3은 CD7 인간화 항체를 포함하는 CAR-T 세포와 표적 세포와 공동 배양된 사이토카인 방출 수준을 도시하였다.
실시예 1. CD7 인간화 항체 제조
마우스 유래 CD7 scFv(클론 m189)를 기반으로 인간화 항체를 제조하였다. 클론 m189는 SEQ ID NO: 1로 표시되는 CDR-L1, SEQ ID NO: 2로 표시되는 CDR-L2, SEQ ID NO: 3으로 표시되는 CDR-L3, SEQ ID NO: 4로 표시되는 CDR-H1, SEQ ID NO: 5로 표시되는 CDR-H2, SEQ ID NO: 6으로 표시되는 CDR-H3, 및 SEQ ID NO: 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 인간화 항체의 구체적인 제조 방법은 다음과 같다. 먼저 Ig BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)와 IMGT(면역 유전자 데이터베이스 IMGT: http://www.imgt.org)를 통해 서열 유사성 검색을 각각 수행하고, 검색 결과에서 경쇄 및 중쇄와 모두 서열 유사성이 비교적 높은 항체를 선택하여 인간화 항체 주형으로 사용하였다. 그 후, 마우스 유래 CD7 scFv의 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR을 서열 유사성이 비교적 높은 인간화 항체 주형의 프레임워크에 이식한 후, 복귀 돌연변이를 수행하여, 인간화 항체의 친화도 및 특이성을 확보하였다. 최종적으로 획득한 CD7 인간화 단일 사슬 항체(scFv)의 아미노산 서열은 하기 표 1과 같다.
표 1. 인간화 CD7scFv의 서열
실시예 2. CD7 인간화 항체를 포함하는 CAR-T 세포 제조
다음 단백질을 암호화하는 서열을 합성하고, 이를 pLVX 벡터(Public Protein/Plasmid Library(PPL), Cat. No.: PPL00157-4a): CD8α 신호 펩티드(SEQ ID NO: 38), CD7 인간화 scFv(SEQ ID NO: 10, 13, 16, 19로부터 선택), CD8α 힌지 영역(SEQ ID NO: 40), CD8α 막횡단 영역(SEQ ID NO: 24), 4-1BB 세포내 영역(SEQ ID NO: 30), CD3ζ 세포내 신호전달 도메인(SEQ ID NO: 32)에 클로닝하였으며, 표적 서열의 정확한 삽입을 시퀀싱을 통해 확인하였다. 여기에서, hCAR7-1CAR에 포함된 항-CD7 scFv의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 10으로 표시되고, hCAR7-2CAR에 포함된 항-CD7 scFv의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 13으로 표시되고, hCAR7-3CAR에 포함된 항-CD7 scFv의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 16으로 표시되고, hCAR7-4CAR에 포함된 항-CD7 scFv의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 19로 표시된다.
멸균 튜브에 3ml Opti-MEM(Gibco, Cat. No. 31985-070)을 첨가하여 상기 플라스미드를 희석한 다음, 플라스미드: 바이러스 패키징 벡터: 바이러스 엔벨로프 벡터=4:2:1의 비율에 따라 psPAX2(Addgene, Cat. No. 12260) 및 엔벨로프 벡터 pMD2.G(Addgene, Cat. No. 12259)를 첨가한다. 그 후, 120ul X-treme GENE HP DNA 형질감염 시약(Roche, Cat. No. 06366236001)을 추가하고 즉시 혼합하며 실온에서 15분 동안 배양한 후, 플라스미드/벡터/형질감염 시약 혼합물을 293T 세포의 배양 플라스크에 점적한다. 24시간 및 48시간에 바이러스를 수집하고 이를 합친 후, 초속 원심분리(25000g, 4℃, 2.5시간)로 농축된 렌티바이러스를 수득하였다.
CD7은 T 세포에서도 발현되기 때문에, CAR-T 세포 간의 상호 사멸을 피하기 위해, 발명자는 CRISP/Cas9 시스템을 통해 T 세포의 CD7을 녹아웃시켰다. 배양 1d 후, DynaBeads CD3/CD28 CTSTM(Gibco, Cat. No. 40203D)로 T 세포를 활성화하고 37℃ 및 5% CO2 하에서 1일 동안 계속 배양하였다. 그 후, 농축된 렌티바이러스를 첨가하고, 연속 배양 3일 후에, 상이한 CD7 인간화 scFv를 발현하는 CAR T 세포를 수득하였다. 변형되지 않은 야생형 T 세포는 음성 대조군(NT)으로 사용하였다.
Biotin-SP(long spacer) AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG, F(ab')2 Fragment Specific(min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot)(jackson immunoresearch, Cat. No. 115-065-072)을 1차 항체로 사용하고, APC Streptavidin(BD Pharmingen, Cat. No. 554067) 또는 PE Streptavidin(BD Pharmingen, Cat. No. 554061)을 2차 항체로 사용하여, 유세포 분석기로 hCAR7-1 T 세포, hCAR7-2 T 세포, hCAR7-3 T 세포 및 hCAR7-4에서 scFv의 발현 수준을 검출하였으며, 그 결과는 도 1에 도시된 바와 같다.
본 발명에서 제조한 CAR T 세포 중의 CD7 인간화 scFv는 모두 효과적으로 발현할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 3: CAR T 세포의 표적 세포에 대한 사멸 효과 및 사이토카인 방출
3.1 CAR-T 세포의 표적 세포에 대한 사멸 효과
T 세포가 표적 세포를 사멸시키면, 표적 세포의 수가 감소할 수 있다. T 세포 및 루시페라아제를 발현할 수 있는 표적 세포를 공동 배양한 후, 표적 세포의 수가 감소하는 동시에, 분비된 루시페라아제의 분비도 감소할 수 있다. 루시페라아제는 플루오레세인을 산화성 플루오레세인으로 전환되도록 촉매할 수 있으며, 이 산화 과정에서 생물발광이 생성될 수 있고, 이러한 발광의 강도는 표적 세포에서 발현되는 루시페라아제의 수준에 따라 달라진다. 따라서, 검출된 형광 강도는 T 세포의 표적 세포에 대한 사멸 능력을 반영할 수 있다.
표적 세포에 대한 CAR-T 세포의 사멸 능력을 검출하기 위해, 먼저 플루오레세인 유전자를 가진 Jurkat 표적 세포를 1×104/웰로 96-웰 플레이트에 플레이팅한 후, 1:1, 0.5:1 및 0.25:1의 효과 표적비(즉, 이펙터 T 세포와 표적 세포의 비율)로 CAR T 세포와 NT 세포를 96-웰 플레이트에 플레이팅하여 공동 배양을 수행하였으며, 16 내지 18시간 후 마이크로플레이트 리더로 형광값을 측정하였다. 계산 공식 (표적 세포 형광 평균값-샘플 형광 평균값)/표적 세포 형광 평균값 ×100%에 따라, 사멸 효율을 계산하여 획득하였으며, 그 결과는 도 2에 도시된 바와 같다.
NT와 비교하여 본 발명의 CAR T 세포는 표적 세포를 특이적으로 사멸시킬 수 있음을 알 수 있다.
3.2 CAR-T 세포의 사이토카인 방출
T 세포가 표적 세포를 사멸시키면, 표적 세포의 수가 감소하는 동시에 사이토카인이 방출될 수도 있다. 하기 단계에 따라, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용하여 본 발명의 CAR T 세포가 표적 세포를 사멸시켰을 때 사이토카인 IFNγ의 방출 수준을 측정하였다.
(1) 세포 공동 배양 상청액 수집
96-웰 플레이트에 표적 세포를 1x105/웰로 플레이팅한 후, 1:1의 비율로 CAR T 및 NT 세포(음성 대조군)를 표적 세포와 공동 배양하였으며, 18 내지 24시간 후 세포를 공동 배양하여 상청액을 수집하였다.
(2) 상청액에서 IFNγ 분비량의 ELISA 검출
포획 항체 Purified anti-human IFN-γAntibody(Biolegend, Cat. No. 506502)를 사용하여 96-웰 플레이트를 코팅하여 4℃에서 밤새 배양한 후, 항체 용액을 제거하고, 250μL의 2% BSA(sigma, Cat. No. V900933-1kg)를 함유한 PBST(0.1% Tween을 함유한 1XPBS) 용액을 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 그 후 플레이트를 250μL PBST(0.1% Tween이 포함된 1XPBS)로 3회 세척하였다. 50 μL의 세포 공동 배양 상청액 또는 표준품을 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 250μL의 PBST(0.1% Tween을 함유하는 1XPBS)로 플레이트를 3회 세척하였다. 그 후 각 웰에 50μL 검출 항체 Anti-Interferon gamma 항체[MD-1](Biotin)(abcam, Cat. No. ab25017)를 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 250μL의 PBST(0.1% Tween을 포함하는 1XPBS)로 플레이트를 3회 세척하였다. 다시 HRP Streptavidin(Biolegend, Cat. No. 405210)을 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 배양한 후, 상청액을 버리고, 250μL의 PBST(0.1% Tween을 함유하는 1XPBS)를 첨가하며, 5회 세척하였다. 각 웰에 50μL의 TMB 기질 용액을 첨가하였다. 반응을 실온의 어두운 곳에서 30분 동안 발생시킨 후, 각 웰에 50μL 1mol/L H2SO4를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 반응이 정지하고 30분 이내에, 마이크로플레이트 리더를 사용해 450nm 지점의 흡광도를 검출하고, 표준 곡선(표준품의 판독값과 농도에 따라 제도)에 따라 사이토카인의 함량을 계산하였으며, 그 결과는 도 3에 도시된 바와 같다.
본 발명의 CAR T 세포의 사이토카인 방출이 대조군 NT 세포보다 현저히 높은 것을 알 수 있다.
상기 내용은 본 발명의 바람직한 실시예일 뿐이며, 본 발명을 한정하려는 것이 아님을 유의해야 하며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명은 다양한 수정 및 변경이 가능하다. 당업자는 본 발명의 사상 및 원리 내에서 이루어진 모든 수정, 등가 대체, 개선 등이 본 발명의 보호 범위 내에 포함된다는 것을 이해한다.
SEQUENCE LISTING <110> Bioheng Therapeutics Limited <120> CD7-TARGETING HUMANIZED ANTIBODY AND USE THEREOF <130> BHPCT16 <150> CN2020112086691 <151> 2020-11-03 <150> PCT/CN2021/127570 <151> 2021-10-29 <160> 45 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 <400> 1 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L2 <400> 2 Ser Ala Ser Gln Ser Ile Ser 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 <400> 3 Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr Thr 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 <400> 4 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H2 <400> 5 Asn Pro Ser Asn Gly Arg 1 5 <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H3 <400> 6 Gly Gly Val Tyr Tyr Asp Leu Tyr Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 249 <212> PRT <213> 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Artificial Sequence <220> <223> h189-2 scFv <400> 13 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Ser Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser 100 105 110 Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val 115 120 125 Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val 130 135 140 Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met 145 150 155 160 His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp 165 170 175 Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly 180 185 190 Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser 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Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Lys Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Val Tyr Tyr Asp Leu Tyr Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 249 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> h189-3 scFv <400> 16 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Ser Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser 100 105 110 Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val 115 120 125 Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val 130 135 140 Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met 145 150 155 160 His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Lys 165 170 175 Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly 180 185 190 Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu 195 200 205 Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 210 215 220 Gly Gly Val Tyr Tyr Asp Leu Tyr Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly 225 230 235 240 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 <210> 17 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> h189-4 VL <400> 17 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 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taaccatgac gagagacacg 600 agtattagca cggcatatat ggagttgtct cgactgagga gcgacgacac ggccgtgtac 660 tattgcgcgc gaggtggggt gtactatgac ctgtattatt acgcattgga ctattggggg 720 cagggaacac tcgtcactgt ttccagc 747 <210> 21 <211> 747 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> h189-2 scFv <400> 21 gatgtcgtta tgacgcaaag cccagccttt ctctccgtaa cgcctggcga aaaagttacg 60 atcacctgcc gggcatctca aagtatcagt aacaatttgc attggtatca acagaaaccc 120 gaccaagccc caaaactcct tatcaagagc gctagtcaga gtatctccgg cgtcccttct 180 cgattctctg gctcaggtag tggaactgat ttcaccttca ctatatctag tttggaagct 240 gaagacgcgg ccacttacta ctgtcagcag tcaaatagtt ggccctacac cttcggtcaa 300 gggacaaaag tcgagatcaa acgaggctca acctctggta gcgggaagcc tggatctgga 360 gaaggcagca caaagggaca ggtgcagttg gtccaatctg gggcggaggt taagaagcct 420 ggggcttctg ttaaagtgag ttgtaaggca tcaggttata ctttcacatc ctactacatg 480 cactgggttc ggcaggctcc gggccaggga cttgaatgga tggggtggat taatccaagc 540 aatggccgca ctaactatgc tcagaagttc caaggaaggg tcacaatgac tagagacact 600 tccatatcaa ccgcgtatat ggaactttca cgacttcgca gcgacgatac tgcggtctat 660 tattgtgcgc gagggggagt ttattatgac ctttactact acgcgcttga ttattgggga 720 cagggtaccc ttgttaccgt ttccagc 747 <210> 22 <211> 747 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> h189-3 scFv <400> 22 gatgtcgtta tgacgcaaag cccagccttt ctctccgtaa cgcctggcga aaaagttacg 60 atcacctgcc gggcatctca aagtatcagt aacaatttgc attggtatca acagaaaccc 120 gaccaagccc caaaactcct tatcaagagc gctagtcaga gtatctccgg cgtcccttct 180 cgattctctg gctcaggtag tggaactgat ttcaccttca ctatatctag tttggaagct 240 gaagacgcgg ccatgtactt ctgtcagcag tcaaatagtt ggccctacac cttcggtcaa 300 gggacaaaag tcgagatcaa acgaggctca acctctggta gcgggaagcc tggatctgga 360 gaaggcagca caaagggaca ggtgcagttg gtccaatctg gggcggaggt taagaagcct 420 ggggcttctg ttaaagtgag ttgtaaggca tcaggttata ctttcacatc ctactggatg 480 cactgggttc ggcaggctcc gggccaggga cttgaatgga tggggaaaat taatccaagc 540 aatggccgca ctaactatgc tcagaagttc caaggaaggg tcacaatgac tagagacact 600 tccatatcaa ccgcgtatat ggaactttca cgacttcgca gcgacgatac tgcggtctat 660 tattgtgcgc gagggggagt ttattatgac ctttactact acgcgcttga ttattgggga 720 cagggtaccc ttgttaccgt ttccagc 747 <210> 23 <211> 747 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> h189-4 scFv <400> 23 gaaatcgtgt tgacacagag ccctgcaacc ctttcacttt ccccaggcga acgcgcgacc 60 ctgtcatgcc gcgctagtca aagtatatca aataacctcc actggtatca gcaaaagcct 120 ggtcaggccc cacgcttgtt gatcaaatct gcctctcaaa gcatcagtgg tattcccgct 180 agattctctg gtagcgggcc tgggaccgat ttcactttga ctatctcatc tttggaaccg 240 gaggatttcg ctgtctactt ttgccaacag agtaattcat ggccttatac gttcggacag 300 ggaacgaagg tagagattaa aagaggctct acaagcggtt ccggtaagcc gggctctggg 360 gaaggttcaa cgaaagggca agtacagctc gtacagtccg gggcagaagt taagaagccg 420 ggggcatccg tcaaagtatc atgtaaagcg agtggttata cgttcacaag ctactggatg 480 cattgggtac gccaagcccc aggccaagga ttggaatgga tgggtaagat taacccgagc 540 aatggaagga caaattacgc tcaaaagttc cagggacggg tcacaatgac gcgcgatacg 600 agcattagca cagcctacat ggagctttcc cgccttaggt cagatgacac tgctgtgtat 660 tattgcgcca gaggtggagt gtattacgac ctctattatt acgccctcga ctattgggga 720 cagggtactc ttgttactgt gagtagc 747 <210> 24 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8alpha transmembrane domain <400> 24 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys 20 25 <210> 25 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8alpha transmembrane domain <400> 25 atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60 accctttact gcaaa 75 <210> 26 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28 transmembrane domain <400> 26 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val 20 25 <210> 27 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28 transmembrane domain <400> 27 ttttgggtcc tcgtcgtagt tggaggggta cttgcctgtt atagcctcct ggttaccgta 60 gcatttatta tattctgggt g 81 <210> 28 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28 costimulatory domain <400> 28 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 29 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28 costimulatory domain <400> 29 aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60 gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120 tcc 123 <210> 30 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-1BB costimulatory domain <400> 30 Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg 1 5 10 15 Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro 20 25 30 Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu 35 40 <210> 31 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-1BB costimulatory domain <400> 31 cggggcagaa agaaactcct gtatatattc aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact 60 actcaagagg aagatggctg tagctgccga tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa 120 <210> 32 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3zeta signaling domain <400> 32 Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln 1 5 10 15 Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu 20 25 30 Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly 35 40 45 Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 50 55 60 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 65 70 75 80 Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 85 90 95 Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro 100 105 110 Arg <210> 33 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3zeta signaling domain <400> 33 ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 60 ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 120 ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180 aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240 cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300 acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 339 <210> 34 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3zeta signaling domain <400> 34 Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln 1 5 10 15 Gly Gln Asn Gln Leu Phe Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu 20 25 30 Phe Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly 35 40 45 Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu 50 55 60 Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly 65 70 75 80 Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Phe Gln Gly Leu Ser 85 90 95 Thr Ala Thr Lys Asp Thr Phe Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro 100 105 110 Pro Arg <210> 35 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3zeta signaling domain <400> 35 ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 60 ctctttaacg agctcaatct aggacgaaga gaggagttcg atgttttgga caagagacgt 120 ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg cagagaagga agaaccctca ggaaggcctg 180 tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 240 gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc cttttccagg gtctcagtac agccaccaag 300 gacacctttg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gc 342 <210> 36 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M signal peptide <400> 36 Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser 1 5 10 15 Gly Leu Glu Ala 20 <210> 37 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M signal peptide <400> 37 atgtcccgct ctgttgcttt ggctgtgctg gcccttttgt cccttagcgg actggaggcc 60 <210> 38 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8alpha signal peptide <400> 38 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 39 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8alpha signal peptide <400> 39 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccg 63 <210> 40 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8alpha hinge region <400> 40 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 35 40 45 <210> 41 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8alpha hinge region <400> 41 accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60 tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120 gacttcgcct gtgat 135 <210> 42 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28 hinge region <400> 42 Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn 1 5 10 15 Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu 20 25 30 Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro 35 <210> 43 <211> 117 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28 hinge region <400> 43 attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60 catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagccc 117 <210> 44 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 hinge region <400> 44 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 45 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 hinge region <400> 45 gaaagcaaat acgggccgcc gtgtccaccc tgtccg 36

Claims (19)

  1. CD7 표적의 인간화 항체에 있어서,
    여기에는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역이 포함되고, 여기에서 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 CDR-L1, SEQ ID NO: 2로 표시되는 CDR-L2, SEQ ID NO: 3으로 표시되는 CDR-L3을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4로 표시되는 CDR-H1, SEQ ID NO: 5로 표시되는 CDR-H2, SEQ ID NO:6으로 표시되는 CDR-H3을 포함하고, 상기 CD7 표적의 인간화 항체는 SEQ ID NO: 8, 11, 14 및 17로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 9, 12, 15 및 18로부터 선택되는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 CD7 표적의 인간화 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 CD7 표적의 인간화 항체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 10, 13, 16 및 19로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 인간화 항체.
  3. 핵산 분자에 있어서,
    제1항에 따른 인간화 항체를 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 20 내지 23으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 서열 상동성을 가지며, 이의 암호화된 CD7 표적의 인간화 항체는 CD7 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  5. 다중특이성 항체에 있어서,
    제1항의 인간화 항체 및 다른 항원과 특이적으로 결합하는 하나 이상의 제2 항체 또는 이의 항원 결합 부위가 포함되는 것을 특징으로 하는 다중특이성 항체.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 제2 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 전장 항체, Fab, Fab', (Fab)2, Fv, scFv, scFv-scFv, 미니바디(minibody), 디아바디(diabody) 또는 sdAb로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 다중특이성 항체.
  7. 벡터에 있어서,
    제1항에 따른 인간화 항체 또는 제5항에 따른 다중특이성 항체를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  8. 분리된 숙주 세포에 있어서,
    제1항에 따른 인간화 항체 또는 제5항에 따른 다중특이성 항체를 발현하는 것을 특징으로 하는 분리된 숙주 세포.
  9. 키메라 항원 수용체에 있어서,
    제1항에 따른 인간화 항체 또는 제5항에 따른 다중특이성 항체, 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체.
  10. 제9항에 있어서,
    CD28 또는 4-1BB로부터 선택된 보조자극 도메인을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체.
  11. 제10항에 있어서,
    CD8α 막횡단 도메인, CD28 또는 4-1BB 보조자극 도메인, 및 CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체.
  12. 분리된 조작된 면역 세포에 있어서,
    제9항에 따른 키메라 항원 수용체를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 조작된 면역 세포.
  13. 제12항에 있어서,
    T 세포, NK 세포, NKT 세포, 대식세포, 수지상 세포로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 조작된 면역 세포.
  14. 항체 접합체에 있어서,
    제1항에 따른 인간화 항체 또는 제5항에 따른 다중특이성 항체, 및 제2 기능성 구조를 포함하고, 여기에서 상기 제2 기능성 구조는 Fc, 방사성 동위원소 및 반감기를 연장하는 구조 부분, 검출 가능한 마커 및 약물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 접합체.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 반감기를 연장하는 구조 부분은 알부민의 결합 구조, 트랜스페린의 결합 구조, 폴리에틸렌 글리콜 분자, 재조합 폴리에틸렌 글리콜 분자, 인간 혈청 알부민, 인간 혈청 알부민의 단편 및 인간 혈청 알부민을 결합하는 폴리펩티드로부터 선택되고; 상기 검출 가능한 마커는 형광단, 화학발광 화합물, 생물발광 화합물, 효소, 항생제 내성 유전자 및 조영제로부터 선택되고; 상기 약물은 세포 독소 및 면역 조절제로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 접합체.
  16. CD7 발현과 관련된 비고형 종양 및 고형 종양의 검출 키트에 있어서,제1항에 따른 인간화 항체 또는 제5항에 따른 다중특이성 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 검출 키트.
  17. CD7 발현과 관련된 비고형 종양 및 고형 종양의 치료 및/또는 예방 및/또는 진단을 위한 약학 조성물에 있어서, 제1항에 따른 인간화 항체 또는 제5항에 따른 다중특이성 항체, 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  18. 삭제
  19. 삭제
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