KR102881115B1 - 코엘렌테라진 유사체 - Google Patents

코엘렌테라진 유사체

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KR102881115B1
KR102881115B1 KR1020217008428A KR20217008428A KR102881115B1 KR 102881115 B1 KR102881115 B1 KR 102881115B1 KR 1020217008428 A KR1020217008428 A KR 1020217008428A KR 20217008428 A KR20217008428 A KR 20217008428A KR 102881115 B1 KR102881115 B1 KR 102881115B1
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마리 피. 홀
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Abstract

코엘렌테라진 유사체, 유사체를 제조하는 방법, 유사체를 포함하는 키트 및 루시퍼레이스-기반 검정에서 발광을 검출하기 위해 화합물을 사용하는 방법이 기재되어 있다. 화합물은 하기 일반 구조 (I) 및 (II)를 가지되, G는 1, 2 또는 3개의 RD기로 치환된 퓨란-2-일, 6- 내지 12-원 아릴 또는 퓨란-2-일 이외의 5- 내지 12-원 헤테로아릴이고, 아릴 및 헤테로아릴은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 RE기로 선택적으로 치환된다.

Description

코엘렌테라진 유사체
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2018년 8월 23일자로 출원된 미국 가출원 제62/721,708호에 대한 우선권을 주장하며, 그 전체 내용은 참조에 의해 본 명세서에 완전히 원용되어 있다.
기술분야
본 개시내용은 코엘렌테라진 유사체(coelenterazine analogue), 코엘렌테라진 유사체를 제조하는 방법 및 루시퍼레이스-기반 검정에서 코엘렌테라진 유사체를 사용하는 방법에 관한 것이다.
생물발광 검정(Bioluminescent assay)은 세포 생리학, 특히 유전자 발현과 연관된 과정의 연구에서 광범위하게 사용된다. 특히, 루시퍼레이스 리포터 효소(luciferase reporter enzyme)는 이 분야에서 상당히 가치가 있는 도구이며, 현재까지 생물발광검정에 유용할 수 있는 작고 환경적으로 민감하지 않은 루시퍼레이스를 얻기 위한 강력한 단백질 공학이 있었다. 전-세포 바이오센서 측정, 고-처리량 스크리닝을 통한 약물 발견 및 생체내 이미징(in vivo imaging)을 가능하게 하는 효율적인 루시퍼레이스 리포터가 다수 존재하며, 이는 또한 살아있는 세포에서의 단백질-단백질 상호작용, 아폽토시스 및 세포 생존능력의 연구를 가능한게 한다. 코엘렌테라진(coelenterazine) 및 코엘렌테라진 유사체를 기질로서 사용하는 루시퍼레이스는 전 세포 적용에 있어서 그것의 밝기와 수용성으로 인해 가장 널리 사용되는 시스템 중 하나이다.
많은 공지된 코엘렌테라진 유사체는 결함이 있으며, 이는 루시퍼레이스 기질로서의 유효성과 루시퍼레이스-기반 검정에서의 유용성을 제한한다. 이러한 결함은 세포 독성, 광민감성, 열역학적 불안정성, 낮은 수 용해도 및 낮은 세포 투과성을 포함한다. 따라서, 개선된 특성을 갖는 코엘렌테라진 유사체 및 이 유사체를 합성하는 방법이 필요하다.
일 양태에서, 하기 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 호변이성질체 또는 염이 개시된다:
식 중,
X는 C1-10알킬, 할로겐, CN, 나이트로, C1-10할로알킬, C1-4할로알킬렌-OC1-4알킬, C2-10알켄일, C2-10알킨일, -C(O)ORx1, -CONRx1Rx2, -OC(O)NRx1Rx2, -NRx3C(O)ORx1, -ORx1, -C1-10알킬렌-ORx1, -OC(O)Rx1, -NRx1Rx2, -C1-10알킬렌-NRx1Rx2; -NRx3C(O)Rx1, -NRx3C(O)NRx1Rx2, -SO2Rx1, -SO2NRx1Rx2, -NRx3SO2Rx1, -SO2ORx1, -OSO2Rx1, -OSO3Rx1, -OP(O)(OH)ORx1, -OSi(C1-10알킬)3, -ORx0, -OGE 또는 -NRx1GE이고;
m은 0, 1, 2, 3 또는 4이며;
R1은, 각 경우에, 독립적으로 할로겐, CN, 나이트로, C1-10알킬, C1-10할로알킬, -ORA1, -NRB1RC1, -OGE 또는 -NRB1GE이되;
선택적으로 2개의 인접한 R1기, 또는 X 및 인접한 R1기는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 5- 내지 7-원 사이클로알킬, 5- 내지 7-원 사이클로알켄일, 페닐, 5- 내지 6-원 헤테로아릴 또는 5- 내지 7-원 헤테로사이클릴로부터 선택되는 융합된 고리를 형성하며, 선택적 융합된 고리는 할로겐, CN, 나이트로, C1-10알킬, C1-10할로알킬, -ORA1 및 -NRB1RC1으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 4개의 치환기로 선택적으로 치환되고;
GE는, 각 경우에, 독립적으로 효소 기질을 포함하되, 효소에 의한 생물전환은 GE를 H로 전환하며;
n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
R2는, 각 경우에, 독립적으로 할로겐, CN, 나이트로, C1-10알킬, C1-10할로알킬, -ORA2 또는 -NRB2RC2이되; 2개의 인접한 R2기는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 선택적으로 5- 내지 7-원 사이클로알킬, 5- 내지 7-원 사이클로알켄일, 페닐, 5- 내지 6-원 헤테로아릴 또는 5- 내지 7-원 헤테로사이클릴로부터 선택되는 융합된 고리를 형성하며, 선택적 융합된 고리는 할로겐, CN, 나이트로, C1-10알킬, C1-10할로알킬, -ORA2 및 -NRB2RC2로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 4개의 치환기로 선택적으로 치환되며;
RA1 및 RA2는, 각 경우에, 독립적으로 H, C1-10알킬, C1-10할로알킬, C3-12사이클로알킬, -C(O)C1-10알킬, -C(O)C3-12 사이클로알킬 또는 -C(O)C1-3알킬렌-C3-12사이클로알킬이되, 각각의 사이클로알킬은 할로겐, C1-4알킬 및 C1-4할로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 4개의 치환기로 선택적으로 치환되고;
RB1, RB2, RC1 및 RC2는, 각 경우에, 독립적으로 H, C1-10알킬, C1-10할로알킬, C3-12사이클로알킬, -C(O)C1-10알킬, -C(O)C3-12 사이클로알킬, -C(O)C1-3알킬렌-C3-12사이클로알킬, -SO2C1-10알킬, -SO2C3-12 사이클로알킬 또는 -SO2C1-3알킬렌-C3-12사이클로알킬이되, 각각의 사이클로알킬은 할로겐, C1-4알킬 및 C1-4할로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 4개의 치환기로 선택적으로 치환되며;
대안적으로, RB1 및 RC1 및/또는 RB2 및 RC2는 이들 각각이 부착되는 질소 원자와 함께 C1-4알킬, C1-4할로알킬, 옥소, -OH 및 -OC1-4알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 4개의 치환기로 선택적으로 치환되는, 4- 내지 8-원 포화 또는 부분적으로 불포화된 헤테로고리형 고리를 형성하고;
G는 1, 2 또는 3개의 RD기, 6- 내지 12-원 아릴 또는 퓨란-2-일 이외의 5- 내지 12-원 헤테로아릴로 치환된 퓨란-2-일이되, 아릴 및 헤테로아릴은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 RE기로 선택적으로 치환되며;
RD 및 RE는, 각 경우에, 독립적으로 할로겐, C1-10알킬, C1-10할로알킬 또는 -L-RW이고;
L은 결합, C1-10알킬렌 또는 -OC1-10알킬렌-이며;
RW는 -CN, -NO2, -ORx4, -NRx4Rx5, -C(O)ORx4, -OC(O)Rx4, -NRx6C(O)Rx2, -C(O)NRx4Rx5, -NRx6C(O)ORx4, -OC(O)NRx4Rx5, -SO2Rx4, -SO2NRx4Rx5, -NRx6SO2Rx4, -OSO2Rx4, -SO2ORx4, -OSO3Rx4, -OP(O)(OH)ORx4 또는 -NRx6C(O)NRx4Rx5이고;
Rx1, Rx2, Rx3, Rx4, Rx5 및 Rx6은, 각 경우에, 독립적으로 H, C1-10알킬, C1-10할로알킬, C3-12사이클로알킬 또는 -C1-3알킬렌-C3-12사이클로알킬이되, 각각의 사이클로알킬은 할로겐, C1-4알킬 및 C1-4할로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 4개의 치환기로 선택적으로 치환되며;
대안적으로, Rx1 및 Rx2 및/또는 Rx4 및 Rx5는 이들 각각이 부착되는 질소 원자와 함께 C1-4알킬, C1-4할로알킬, 옥소, -OH 및 -OC1-4알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 4개의 치환기로 선택적으로 치환되는, 4- 내지 8-원 포화 또는 부분적으로 불포화된 헤테로고리형 고리를 형성하고;
Rx0은 당 모이어티(sugar moiety)이며; 그리고
단, 화합물은 하기의 화합물이 아니다:
8-벤질-2-(4-하이드록시벤질)-6-(3-하이드록시페닐)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온;
6-(4-((8-벤질-6-(3-하이드록시페닐)-3-옥소-3,7-다이하이드로이미다조[1,2-a]피라진-2-일)메틸)-2-클로로페녹시)헥세인-1-설폰산; 또는
6-(4-((8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-3-옥소-3,7-다이하이드로이미다조[1,2-a]피라진-2-일)메틸)-2-클로로페녹시)헥세인-1-설폰산.
다른 양태에서, 하기 화학식 (II)의 화합물, 또는 이의 호변이성질체 또는 염이 개시된다:
식 중,
Y는 C1-10알킬, 할로겐, CN, 나이트로, C1-10할로알킬, C1-4할로알킬렌-OC1-4알킬, C2-10알켄일, C2-10알킨일, -C(O)ORy1, -CONRy1Ry2, -OC(O)NRy1Ry2, -NRy3C(O)ORy1, -ORy1, -C1-10알킬렌-ORy1, -OC(O)Ry1, -NRy1Ry2, -C1-10알킬렌-NRy1Ry2; -NRy3C(O)Ry1, -NRy3C(O)NRy1Ry2, -SO2Ry1, -SO2NRy1Ry2, -NRy3SO2Ry1, -SO2ORy1, -OSO2Ry1, -OSO3Ry1, -OP(O)(OH)ORy1, -OSi(C1-10알킬)3, -ORy0, -OGE 또는 -NRy1GE이고;
p는 0, 1, 2, 3 또는 4이며;
q는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
R3은, 각 경우에, 독립적으로 할로겐, CN, 나이트로, C1-10알킬, C1-10할로알킬, -ORA3, -NRB3RC3, -OGE 또는 -NRB3GE이되;
선택적으로 2개의 인접한 R3기, 또는 Y 및 인접한 R3기는, 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 5- 내지 7-원 사이클로알킬, 5- 내지 7-원 사이클로알켄일, 페닐, 5- 내지 6-원 헤테로아릴 또는 5- 내지 7-원 헤테로사이클릴로부터 선택되는 융합된 고리를 형성하며, 선택적 융합된 고리는 할로겐, CN, 나이트로, C1-10알킬, C1-10할로알킬, -ORA3 및 -NRB3RC3으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 4개의 치환기로 선택적으로 치환되며;
GE, 각 경우에, 독립적으로 효소 기질을 포함하되, 효소에 의한 생물전환은 GE를 H로 전환하고;
R4는, 각 경우에, 독립적으로 할로겐, CN, 나이트로, C1-10알킬, C1-10할로알킬, -ORA4 또는 -NRB4RC4이되; 2개의 인접한 R4기는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 선택적으로 5- 내지 7-원 사이클로알킬, 5- 내지 7-원 사이클로알켄일, 페닐, 5- 내지 6-원 헤테로아릴 또는 5- 내지 7-원 헤테로사이클릴로부터 선택되는 융합된 고리를 형성하고, 선택적 융합된 고리는 할로겐, CN, 나이트로, C1-10알킬, C1-10할로알킬, -ORA4 및 -NRB4RC4로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 4개의 치환기로 선택적으로 치환되며;
RA3 및 RA4는, 각 경우에, 독립적으로 H, C1-10알킬, C1-10할로알킬, C3-12사이클로알킬, -C(O)C1-10알킬, -C(O)C3-12사이클로알킬 또는 -C(O)C1-3알킬렌-C3-12사이클로알킬이되, 각각의 사이클로알킬은 할로겐, C1-4알킬 및 C1-4할로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 4개의 치환기로 선택적으로 치환되고;
RB3, RB4, RC3 및 RC4는, 각 경우에, 독립적으로 H, C1-10알킬, C1-10할로알킬, C3-12사이클로알킬, -C(O)C1-10알킬, -C(O)C3-12사이클로알킬, -C(O)C1-3알킬렌-C3-12사이클로알킬, -SO2C1-10알킬, -SO2C3-12사이클로알킬 또는 -SO2C1-3알킬렌-C3-12사이클로알킬이되, 각각의 사이클로알킬은 할로겐, C1-4알킬 및 C1-4할로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 4개의 치환기로 선택적으로 치환되며;
대안적으로, RB3 및 RC3 및/또는 RB4 및 RC4는 이들 각각이 부착되는 질소 원자와 함께 C1-4알킬, C1-4할로알킬, 옥소, -OH 및 -OC1-4알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 4개의 치환기로 선택적으로 치환되는, 4- 내지 8-원 포화 또는 부분적으로 불포화된 헤테로고리형 고리를 형성하고;
Ry1, Ry2 및 Ry3은, 각 경우에, 독립적으로 H, C1-10알킬, C1-10할로알킬, C3-12사이클로알킬 또는 -C1-3알킬렌-C3-12사이클로알킬이되, 각각의 사이클로알킬은 할로겐, C1-4알킬 및 C1-4할로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 4개의 치환기로 선택적으로 치환되며;
대안적으로, Ry1 및 Ry2는 이들 각각이 부착되는 질소 원자와 함께 C1-4알킬, C1-4할로알킬, 옥소, -OH 및 -OC1-4알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 4개의 치환기로 선택적으로 치환되는, 4- 내지 8-원 포화 또는 부분적으로 불포화된 헤테로고리형 고리를 형성하고; 그리고
Ry0은 당 모이어티이며,
단, 화합물은 하기의 화합물이 아니다:
8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸)-6-(3-메톡시페닐)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온;
8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸)-6-(3-하이드록시페닐)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온;
6-(3-아미노페닐)-8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온;
8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸)-6-(나프탈렌-1-일)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온;
8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸)-6-(나프탈렌-2-일)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온;
6-(안트라센-9-일)-8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온;
8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸)-6-(페난트렌-9-일)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온;
8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸)-6-(퀴놀린-6-일)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온;
tert-뷰틸 3-(8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸)-3-옥소-3,7-다이하이드로이미다조[1,2-a]피라진-6-일)벤조에이트; 또는
3-(8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸)-3-옥소-3,7-다이하이드로이미다조[1,2-a]피라진-6-일)벤조산.
또한, 화합물을 제조하는 방법, 화합물을 포함하는 키트 및 루시퍼레이스-기반 검정에서 루시퍼레이스 기질로서 화합물을 사용하는 방법이 개시된다.
도 1은 여과 전(상청액) 및 여과 후(여과액)의 에탄올/프로필렌 글리콜/하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린/PEG 400/물(10:10:10:35:35) 중 8.7mM JW-1040의 UV 흡수 스펙트럼을 보여준다.
도 2는 여과 전(상청액) 및 여과 후(여과액)의 에탄올/프로필렌 글리콜/하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린/PEG 400/물(10:10:10:35:35) 중 8.7mM 퓨리마진의 UV 흡수 스펙트럼을 보여준다.
코엘렌테라진 유사체가 본 명세서에 개시된다. 코엘렌테라진 유사체는 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 화합물일 수 있으며, 다양한 해양 생물에서 발견되는 루시퍼레이스 및 발광단백질, 예컨대 자포동물(cnidarian)(예를 들어, 레닐라(Renilla) 루시퍼레이스), 해파리(예를 들어, 아이쿠오레아(Aequorea) 해파리로부터의 에쿼린(aequorin)) 및 십각류 루시퍼레이스(예를 들어, 오플로포루스 그라실리로스트리스(Oplophorus gracilirostris)의 루시퍼레이스 복합체)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 발광(luminescence)을 생성하기 위해 코엘렌테라진("코엘렌테라진-이용 효소(coelenterazine-utilizing enzyme)")을 이용하는 단백질에 유용한 기질일 수 있다.
일부 실시형태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (II)의 화합물은 퓨리마진과 비교하여 개선된 수 용해도(aqueous solubility)를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (II)의 화합물은 6-페닐기의 파라 위치에서 유사한 치환을 갖는 코엘렌테라진 화합물과 비교하여 개선된 생물발광 신호 역학(kinetic)을 나타낸다. 따라서, 화학식 (I) 및 화학식 (II)의 화합물은 생체내 발광 이미징 응용뿐만 아니라 생물발광을 이용하는 다른 응용에도 유용할 수 있다.
1. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상충되는 경우 정의를 포함한 현재 문서가 우선한다. 바람직한 방법 및 물질이 아래에 설명되지만, 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌은 그 전문이 참조에 의해 원용된다. 본 명세서에 개시된 물질, 방법 및 예는 단지 예시일 뿐 제한하고자 하는 의도가 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "포함하다(comprise(s))", "포함하다(include(s))", "갖는", "갖다", "할 수 있다", "함유하다(contain(s))" 및 이들의 변형은 추가적인 행위 또는 구조의 가능성을 배제하지 않는 개방형 접속 구(open-ended transitional phrase), 용어 또는 단어로 의도된다. 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 달리 명시하지 않는 한 복수의 참조를 포함한다. 본 개시내용은 또한 명시적으로 제시되었는지 여부에 관계없이, 본 명세서에 제시된 실시형태 또는 요소를 "포함하는", "로 이루어지는" 및 "로 본질적으로 구성되는" 다른 실시형태를 상정한다.
수량과 관련하여 사용되는 수식어 "약"은 언급된 값을 포함하고 문맥에 의해 지시된 의미를 갖는다(예를 들어, 적어도 특정 수량의 측정과 관련된 오류의 정도를 포함함). 수식어 "약"은 또한 두 끝점의 절대값에 의해 정의된 범위를 개시하는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, "약 2에서 약 4까지"라는 표현은 "2에서 4까지"의 범위를 개시한다. 용어 "약"은 표시된 숫자의 플러스 또는 마이너스 10%를 지칭할 수 있다. 예를 들어, "약 10%"는 9% 내지 11%의 범위를 나타낼 수 있고, "약 1"은 0.9 내지 1.1을 의미할 수 있다. "약"의 다른 의미는 반올림과 같이 문맥에서 명백할 수 있으므로, 예를 들어 "약 1"은 또한 0.5 내지 1.4를 의미할 수 있다.
특정 작용기 및 화학적 용어의 정의는 아래에서 더 상세하게 기재된다. 본 개시내용의 목적을 위해, 화학 원소는 원소 주기율표(CAS 버전, Handbook of Chemistry and Physics, 제75판, 속 표지)에 따라 식별되며, 특정 작용기는 일반적으로 본 명세서에 기재되는 바와 같이 정의된다. 또한, 유기 화학의 일반적인 원리뿐만 아니라 특정 작용 모이어티 및 반응성은 문헌[Organic Chemistry, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito, 1999; Smith and March March's Advanced Organic Chemistry, 5th Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2001; Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., New York, 1989; Carruthers, Some Modern Methods of Organic Synthesis, 3rd Edition, Cambridge University Press, Cambridge, 1987]에 기재되어 있으며; 이들 각각의 전체 내용은 참조에 의해 원용되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "알킬"은 직쇄 또는 분지형의 포화 탄화수소 사슬을 의미한다. 용어 "저급 알킬" 또는 "C1-6알킬"은 1 내지 6개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지형의 사슬 탄화수소를 의미한다. 용어 "C1-4알킬"은 1 내지 4개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지형의 사슬 포화 탄화수소를 의미한다. 알킬의 대표적인 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소-프로필, n-뷰틸, sec-뷰틸, 아이소-뷰틸, tert-뷰틸, n-펜틸, 아이소펜틸, 네오펜틸, n-헥실, 3-메틸헥실, 2,2-다이메틸펜틸, 2,3-다이메틸펜틸, n-헵틸, n-옥틸, n-노닐 및 n-데실을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "알켄일"은 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 직쇄 또는 분지형의 탄화수소 사슬을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "알킨일"은 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 포함하는 탄화수소 사슬을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "알킬렌"은 예를 들어, 1 내지 6개의 탄소 원자의 직쇄 또는 분지형의 포화 사슬 탄화수소로부터 유래되는 2가의 기를 지칭한다. 알킬렌의 대표적인 예는 -CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2- 및 -CH2CH2CH2CH2CH2-를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "아릴"은 페닐, 또는 모 분자 모이어티(parent molecular moiety)에 부착되고 사이클로알킬기(예를 들어, 인단일), 페닐기(즉, 나프틸) 또는 비방향족 헤테로사이클(예를 들어, 벤조[d][1,3]다이옥솔-5-일)에 융합된 페닐을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "사이클로알킬"은 0개의 헤테로원자와 0개의 이중 결합을 포함하는 탄소고리형 고리 시스템을 지칭한다. 사이클로알킬의 대표적인 예는 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 사이클로옥틸, 사이클로노닐, 사이클로데실, 아다만틸 및 바이사이클로[1.1.1]펜탄일을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "사이클로알켄일"은 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하고, 바람직하게는 고리당 5 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 비방향족 단일고리형 또는 다중고리형 전-탄소(all-carbon) 고리 시스템을 의미한다. 예시적 단일고리형 사이클로알켄일 고리는 사이클로펜텐일, 사이클로헥센일 또는 사이클로헵텐일을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "할로겐" 또는 "할로"는 Cl, Br, I 또는 F를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "할로알킬"은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 수소 원자가 할로겐으로 대체된 본 명세서에 정의된 바와 같은 알킬기를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "헤테로아릴"은 방향족 단일고리형 헤테로원자-함유 고리(단일고리형 헤테로아릴) 시스템 또는 적어도 하나의 단일고리형 헤테로아릴(이중고리형 헤테로아릴)을 포함하는 이중고리형 고리 시스템을 지칭한다. 단일고리형 헤테로아릴은 N, O 및 S로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 적어도 하나의 헤테로원자(예를 들어, O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택되는 1, 2, 3 또는 4개의 헤테로원자)를 포함하는 5 또는 6원 고리이다. 5원 방향족 단일고리형 고리는 2개의 이중 결합을 갖고, 6원 방향족 단일고리형 고리는 3개의 이중 결합을 갖는다. 이중고리형 헤테로아릴은 단일고리형 방향족의, 포화 또는 부분적으로 포화된 탄소고리형 고리, 단일고리형 헤테로아릴 또는 단일고리형 헤테로사이클에 융합된 단일고리형 헤테로아릴 고리를 갖는 8- 내지 12-원 고리 시스템이다. 이중고리형 헤테로아릴은 방향족 고리 원자에서 모 분자 모이어티에 부착된다. 헤테로아릴의 대표적인 예는 인돌일(예를 들어, 인돌-1-일, 인돌-2-일, 인돌-4-일), 피리딘일(피리딘-2-일, 피리딘-3-일, 피리딘-4-일을 포함), 피리미딘일, 피라진일, 피리다진일, 피라졸일(예를 들어, 피라졸-4-일), 피롤일, 벤조피라졸일, 1,2,3-트라이아졸일(예를 들어, 트라이아졸-4-일), 1,3,4-티아다이아졸일, 1,2,4-티아다이아졸일, 1,3,4-옥사다이아졸일, 1,2,4-옥사다이아졸일, 이미다졸일, 티아졸일(예를 들어, 티아졸-4-일), 아이소티아졸일, 티엔일, 벤즈이미다졸일(예를 들어, 벤즈이미다졸-5-일), 벤조티아졸일, 벤족사졸일, 벤족사다이아졸일, 벤조티엔일, 벤조퓨란일, 아이소벤조퓨란일, 퓨란일, 옥사졸일, 이속사졸일, 퓨린일, 아이소인돌일, 퀴녹살린일, 인다졸일(예를 들어, 인다졸-4-일, 인다졸-5-일), 퀴나졸린일, 1,2,4-트라이아진일, 1,3,5-트라이아진일, 아이소퀴놀린일, 퀴놀린일, 6,7-다이하이드로-1,3-벤조티아졸일, 이미다조[1,2-a]피리딘일(예를 들어, 이미다조[1,2-a]피리딘-6-일), 나프티리딘일, 피리도이미다졸일, 티아졸로[5,4-b]피리딘-2-일, 티아졸로[5,4-d]피리미딘-2-일을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "헤테로사이클" 또는 "헤테로고리형"은 단일고리형 헤테로사이클, 이중고리형 헤테로사이클 또는 삼중고리형 헤테로사이클을 의미한다. 단일고리형 헤테로사이클은 O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 적어도 하나의 헤테로원자를 포함하는 3-, 4-, 5-, 6-, 7- 또는 8-원 고리이다. 3- 또는 4-원 고리는 0 또는 1개의 이중 결합과, O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개의 헤테로원자를 포함한다. 5-원 고리는 0 또는 1개의 이중 결합과, O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 헤테로원자를 포함한다. 6-원 고리는 0, 1 또는 2개의 이중 결합과, O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 헤테로원자를 포함한다. 7- 및 8-원 고리는 0, 1, 2 또는 3개의 이중 결합과, O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 헤테로원자를 포함한다. 단일고리형 헤테로사이클의 대표적인 예는 아제티딘일, 아제판일, 아지리딘일, 다이아제판일, 1,3-다이옥산일, 1,3-다이옥솔란일, 1,3-다이티오란일, 1,3-다이티안일, 이미다졸린일, 이미다졸리딘일, 아이소티아졸린일, 아이소티아졸리딘일, 이속사졸린일, 이속사졸리딘일, 모폴린일, 2-옥소-3-피페리딘일, 2-옥소아제판-3-일, 옥사다디아졸린일, 옥사다디아졸리딘일, 옥사졸린일, 옥사졸리딘일, 옥세탄일, 옥세판일, 옥소카닐, 피페라진일, 피페리딘일, 피란일, 피라졸린일, 피라졸리딘일, 피롤린일, 피롤리딘일, 테트라하이드로퓨란일, 테트라하이드로피란일, 테트라하이드로피리딘일, 테트라하이드로티엔일, 티아다이아졸린일, 티아다이아졸리딘일, 1,2-티아지난일, 1,3-티아지난일, 티아졸린일, 티아졸리딘일, 티오모폴린일, 1,1-다이옥시도티오모폴린일(티오모폴린 설폰), 티오피란일 및 트라이티안일을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이중고리형 헤테로사이클은 페닐기에 융합된 단일고리형 헤테로사이클, 또는 단일고리형 사이클로알킬에 융합된 단일고리형 헤테로사이클, 또는 단일고리형 사이클로알켄일에 융합된 단일고리형 헤테로사이클, 또는 단일고리형 헤테로사이클에 융합된 단일고리형 헤테로사이클, 또는 단일고리형 헤테로아릴에 융합된 단일고리형 헤테로사이클, 또는 스피로 헤테로사이클기, 또는 고리의 2개의 비-인접한 원자가 1, 2, 3 또는 4개의 탄소 원자의 알킬렌 브리지 또는 2, 3 또는 4개의 탄소 원자의 알켄일렌 브리지에 의해 연결된 브리지된 단일고리형 헤테로사이클 고리 시스템이다. 이중고리형 헤테로사이클은 비방향족 고리 원자(예를 들어, 2-옥사스피로[3.3]헵탄-6-일, 인돌린-1-일, 헥사하이드로사이클로펜타[b]피롤-1(2H)-일)에서 모 분자 모이어티에 부착된다. 이중고리형 헤테로사이클의 대표적인 예는 벤조피란일, 벤조티오피란일, 크로만일, 2,3-다이하이드로벤조퓨란일, 2,3-다이하이드로벤조티엔일, 2,3-다이하이드로아이소퀴놀린, 2-아자스피로[3.3]헵탄-2-일, 2-옥사-6-아자스피로[3.3]헵탄-6-일, 아자바이사이클로[2.2.1]헵틸(2-아자바이사이클로[2.2.1]헵트-2-일을 포함), 아자바이사이클로[3.1.0]헥산일(3-아자바이사이클로[3.1.0]헥산-3-일을 포함), 2,3-다이하이드로-1H-인돌일, 아이소인돌린일, 옥타하이드로사이클로펜타[c]피롤일, 옥타하이드로피롤로피리딘일 및 테트라하이드로아이소퀴놀린일을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 삼중고리형 헤테로사이클은 페닐기에 융합된 이중고리형 헤테로사이클, 또는 단일고리형 사이클로알킬에 융합된 이중고리형 헤테로사이클, 또는 단일고리형 사이클로알켄일에 융합된 이중고리형 헤테로사이클, 또는 단일고리형 헤테로사이클에 융합된 이중고리형 헤테로사이클, 또는 이중고리형 고리의 2개의 비-인접한 원자가 1, 2, 3 또는 4개의 탄소 원자의 알킬렌 브리지 또는 2, 3 또는 4개의 탄소 원자의 알켄일렌 브리지에 의해 연결된 이중고리형 헤테로사이클로 예시된다. 삼중고리형 헤테로사이클의 예는 옥타하이드로-2,5-에폭시펜탈렌, 헥사하이드로-2H-2,5-메타노사이클로펜타[b]퓨란, 헥사하이드로-1H-1,4-메타노사이클로펜타[c]퓨란, 아자-아다만테인(1-아자트라이사이클로[3.3.1.13,7]데케인) 및 옥사-아다만테인(2-옥사트라이사이클로[3.3.1.13,7]데케인)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 단일고리형, 이중고리형 및 삼중고리형 헤테로사이클은 비방향족 고리 원자에서 모 분자 모이어티에 연결된다.
"알킬", "사이클로알킬", "알킬렌" 등과 같은 용어는 특정 예의 기(예를 들어, "C1-4알킬", "C3-6사이클로알킬", "C1-4알킬렌")에 존재하는 원자의 수를 나타내는 명칭이 선행될 수 있다. 이러한 명칭은 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같이 사용된다. 예를 들어, "C" 뒤에 첨자가 있는 숫자는 뒤의 기에 존재하는 탄소 원자의 수를 나타낸다. 따라서, "C3알킬"은 3개의 탄소 원자를 갖는 알킬기(즉, n-프로필, 아이소프로필)이다. "C1-4"에서와 같이 범위가 주어진 경우, 기의 구성원은 언급된 범위에 포함되는 임의의 수의 탄소 원자를 가질 수 있다. 예를 들어, "C1-4알킬은 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖지만 배열된(즉, 직쇄 사슬 또는 분지형) 알킬기이다.
본 명세서에서 사용되는 "동물"은 포유동물, 양서류, 새, 어류, 곤충, 파충류 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 임의의 척추동물을 지칭한다. 포유동물은 인간, 비인간 영장류(예를 들어, 고릴라, 원숭이, 개코원숭이 및 침팬지 등), 개, 고양이, 염소, 말, 돼지, 소, 양 등 및 실험용 동물(예를 들어, 래트, 기니피그, 마우스, 저빌, 햄스터 등)을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 동물은 인간 또는 비인간일 수 있다. 적합한 동물은 수컷과 암컷 둘 다와, 배아(예를 들어, 자궁내(in utero) 또는 난내(in ovo)), 유아, 유소년, 청소년, 성년 및 노년의 동물을 포함하는 임의의 연령의 동물을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "융합 단백질" 및 "융합 폴리펩타이드"는 아미노산의 단일 연속 사슬(사슬은 자연에서 발생하지 않음)의 일부로서 형광 단백질과 같은 관심 있는 이종 단백질과 조합된 적어도 하나의 생물발광 단백질을 포함하는 융합을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "작동 가능하게 연결된"은 유전자의 발현이 공간적으로 연결된 프로모터의 제어하에 있음을 의미한다. 프로모터는 제어하에 유전자의 5'(상류) 또는 3'(하류)에 위치할 수 있다. 프로모터와 유전자 사이의 거리는 그 프로모터와 프로모터가 유래되는 유전자에서 제어하는 유전자 사이의 거리와 대략 동일할 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 이 거리의 변화는 프로모터 기능의 손실없이 수용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "이식유전자(transgene)"는 하나의 유기체로부터 단리 및/또는 조작되고, 다른 유기체로 도입되는 유전자 서열을 함유하는 유전자 또는 유전 물질을 지칭한다. 이식유전자는 형질전환된 서열(transgenic sequence), 또는 천연의 또는 야생형 DNA 서열을 함유할 수 있다. 이러한 비-천연형 DNA의 세그먼트는 형질전환된 유기체에서 RNA 또는 단백질을 생산하는 능력을 보유할 수 있다. 예를 들어, 이식유전자는 융합 단백질, 예컨대 루시퍼레이스를 포함하는 융합 단백질을 암호화할 수 있다. 형질전환된 서열은 부분적으로 또는 전체적으로 종-이종(heterologous)일 수 있으며, 즉 형질전환된 서열 또는 이의 일부는 도입되는 세포와 상이한 종으로부터 유래될 수 있다.
"형질전환된 동물(transgenic animal)"은 유전자 조작된 동물 또는 유전자 조작된 동물의 자손을 지칭한다. 형질전환된 동물은 보통 바이러스, 식물 또는 다른 동물과 같은 적어도 하나의 관련없는 유기체로부터의 유전 물질을 함유한다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "형질전환(transformation)", "형질감염(transfection)" 및 "형질도입(transduction)"은 이종 핵산 분자, 예컨대 유전 물질의 세포로의 도입을 지칭한다. 이러한 세포로의 도입은 안정하거나 일시적일 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 숙주 세포 또는 숙주 유기체는 이종 핵산 분자, 예컨대 유전 물질로 안정적으로 형질전환된다. 다른 실시형태에서, 숙주 세포 또는 숙주 유기체는 이종 핵산 분자, 예컨대 유전 물질로 일시적으로 형질전환된다. 폴리뉴클레오타이드의 맥락에서 "일시적 형질전환"은 폴리뉴클레오타이드가 세포로 도입되며, 세포의 게놈으로 통합되지 않음을 의미한다. 세포로 도입된 폴리뉴클레오타이드의 맥락에서 "안정적으로 도입"함으로써 또는 "안정적으로 도입되는" 것에 의해 도입된 폴리뉴클레오타이드가 세포의 게놈으로 안정적으로 통합되고, 따라서 세포가 폴리뉴클레오타이드로 안정적으로 형질전환되는 것으로 의도된다. 본 명세서에서 사용되는 "안정적인 형질전환" 또는 "안정적으로 형질전환된"은 핵산 분자가 세포로 도입되고 세포의 게놈으로 통합되는 것을 의미한다. 이와 같이, 통합된 핵산 분자는 이의 후대에 의해, 보다 구체적으로 여러 연속 세대의 후대에 의해 유전될 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 "게놈"은 핵, 플라스미드 및 색소체 게놈을 포함할 수 있으며, 따라서 예를 들어 엽록체 또는 미토콘드리아 게놈으로의 핵산 작제물의 통합을 포함한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 안정적인 형질전환은 염색체외에서(extrachromasomally) 유지되는 이식유전자, 예를 들어 미니염색체 또는 플라스미드를 지칭할 수 있다. 일부 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열, 작제물, 발현 카세트는 일시적으로 발현될 수 있고/거나 이들은 숙주 유기체의 게놈으로 안정적으로 통합될 수 있다.
본 명세서에 개시되는 화합물의 경우, 이들의 기 및 치환기는, 선택 및 치환이 예를 들어, 재배열, 고리화, 제거 등에 의해서와 같은 변형을 자발적으로 겪지 않는 안정한 화합물을 생성하는 원자 및 치환기의 허용 원자가에 따라 선택될 수 있다.
본 명세서에서 숫자 범위의 인용의 경우, 동일한 정밀도를 갖는 그 사이에 각각의 개재되는 숫자가 명시적으로 상정된다. 예를 들어, 6 내지 9의 범위의 경우 6과 9 외에 숫자 7과 8이 상정되며, 범위 6.0 내지 7.0의 경우 숫자 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 및 7.0이 명시적으로 상정된다.
2. 화합물
본 발명의 첫번째 양태는 화학식 (I)의 화합물을 제공하되, R1, R2, X, G, m 및 n은 본 명세서에 정의된 바와 같다. 본 명세서에서 제공되는 화학식 (I)의 실시형태는 Rx1, Rx2, RD, 등과 같은 하위-변수를 포함하여 이들 변수가 본 명세서에 기재된 바와 같이, 변수 R1, R2, X, G, m 및 n의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, G는 1, 2 또는 3개의 RD기로 치환된 퓨란-2-일이되, RD는 본 명세서에 정의된 바와 같다. 일부 실시형태에서, 퓨란-2-일은 단일의 RD기(예를 들어, , , )로 치환된다. 추가의 실시형태에서, RD는 C1-4알킬(예를 들어, CH3) 또는 C1-4할로알킬(예를 들어, CF3)이다.
일부 실시형태에서, G는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 RE기로 선택적으로 치환된 6- 내지 12-원 아릴이되, RE는 본 명세서에 정의된 바와 같다. 추가의 실시형태에서, 6- 내지 12-원 아릴은 페닐이다. 다른 실시형태에서, 6- 내지 12-원 아릴은 1 내지 2개의 산소 원자를 포함하는 5- 내지 7-원 헤테로고리형 고리(예를 들어, 벤조다이옥솔)에 융합된 페닐이다. 추가의 실시형태에서, 아릴(예를 들어, 페닐)은 1 내지 3개의 RE, 예컨대 할로겐, C1-4알킬, -OC1-4알킬 및 -C1-10알킬렌-OC1-4알킬(예를 들어, , , , )로 선택적으로 치환된다. 추가의 실시형태에서, 페닐은 할로겐, -ORx4, C1-10알킬렌-ORx4 및 -OC1-10알킬렌-SO2ORx4(예를 들어, -OC6알킬렌-SO3H)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 3개의 RE기로 선택적으로 치환된다.
다른 실시형태에서, G는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 RE기로 선택적으로 치환된, 퓨란-2-일 이외의 5- 내지 12-원 헤테로아릴이다. 추가의 실시형태에서, 헤테로아릴은 티엔일, 이미다졸일, 피리딘일 또는 티아졸일, 예를 들어 각각 1, 2 또는 3개의 RE기로 선택적으로 치환된 , , 또는 이다.
추가의 실시형태에서, G는 , , , , , , , 및 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, X는 ORx1 또는 NRx1Rx2이되, Rx1 및 Rx2는 본 명세서에 정의된 바와 같다. 추가의 실시형태에서, X는 ORx1이다. 다른 추가의 실시형태에서, X는 NRx1Rx2이다. 이러한 실시형태에서, 이는 여전히 추가의 실시형태이되, Rx1 및 Rx2는 수소이다. 다른 실시형태에서, X는 -OSi(C1-10알킬)3(예를 들어, -OSi(t-Bu)(Me)2)이다.
일부 실시형태에서, R1은, 각 경우에, 할로겐, CN, 나이트로, C1-10알킬, C1-10할로알킬, -ORA1 또는 -NRB1RC1이되, RA1, RB1 및 RC1은 본 명세서에 정의된 바와 같다. 추가의 실시형태에서, R1은 할로겐, CN, 나이트로, C1-4알킬(예를 들어, 메틸, 에틸), C1-4할로알킬(예를 들어, CF3), -ORA1 또는 -NRB1RC1이되, RA1, RB1 및 RC1은 독립적으로, 각 경우에, H, C1-4알킬(예를 들어, 메틸, 에틸), C1-4할로알킬(예를 들어, CF3) 또는 C3-6사이클로알킬(예를 들어, 사이클로프로필)이다.
일부 실시형태에서, R2는, 각 경우에, 독립적으로 할로겐, CN, 나이트로, C1-10알킬, C1-10할로알킬, -ORA2 또는 -NRB2RC2이되, RA2, RB2 및 RC2는 본 명세서에 정의된 바와 같다. 추가의 실시형태에서, R2는 할로겐, CN, 나이트로, C1-4알킬(예를 들어, 메틸, 에틸), C1-4할로알킬(예를 들어, CF3), -ORA2 또는 -NRB2RC2이되, RA2, RB2 및 RC2는 독립적으로, 각 경우에, H, C1-4알킬(예를 들어, 메틸, 에틸), C1-4할로알킬(예를 들어, CF3) 또는 C3-6사이클로알킬(예를 들어, 사이클로프로필)이다.
화학식 (I)의 실시형태에서, m은 0이며, R2, X, G 및 n은 본 명세서에 정의된 바와 같은 실시형태가 본 명세서에 기재된다. 화학식 (I)의 실시형태에서, n은 0이며, R1, X, G 및 m은 본 명세서에 정의된 바와 같은 실시형태가 본 명세서에 기재된다. 예를 들어, 화학식 (I)의 일부 실시형태에서, m은 0이고, n은 0이며, X 및 G는 본 명세서에 정의된 바와 같다.
예시적 조합에서, m은 0이고, n은 0이며, X는 OH 또는 NH2이고, G는 본 명세서에 정의된 바와 같다. 추가의 예시적 조합에서, G는 단일의 RD기로 치환된 퓨란-2-일; 각각 1 내지 3개의 RE기로 선택적으로 치환된 , , 또는 ; 또는 1 내지 3개의 RE기로 선택적으로 치환된 아릴이되, 아릴은 페닐 또는 1 내지 2개의 산소 원자를 포함하는 5- 내지 7-원 헤테로고리형 고리(예를 들어, 벤조다이옥솔)에 융합된 페닐이다. RD 및 RE 치환기의 수 및 동일성은 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같다.
화학식 (I)의 실시형태에서, m은 1이고, R1은 할로겐이며, R2, X, G 및 n은 본 명세서에 정의된 바와 같은 실시형태가 본 명세서에 기재된다. 예를 들어, 화학식 (I)의 일부 실시형태에서, m은 1이고, n은 0이며, X 및 G는 본 명세서에 정의된 바와 같다. 예시적 실시형태에서, m은 1이고, R1은 플루오린이며, n은 0이고, X는 OH 또는 NH2이며, G는 본 명세서에 정의된 바와 같다.
화학식 (I)의 대표적인 화합물은 하기를 포함한다:
본 발명의 다른 양태는 화학식 (II)의 화합물을 제공하되, R3, R4, Y, p 및 q는 본 명세서에 정의된 바와 같다. 본 명세서에 제공된 화학식 (II)의 실시형태는 Ry1, Ry2, RA3 등과 같은 하위-변수를 포함하여 이들 변수가 본 명세서에 기재되어 있는 바와 같이, 변수 R3, R4, Y, p 및 q의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 선택적으로 2개의 인접한 R3기, 또는 Y와 인접한 R3기는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 5- 내지 7-원 사이클로알킬, 5- 내지 7-원 사이클로알켄일 또는 5- 내지 7-원 헤테로사이클릴로부터 선택되는 융합된 고리를 형성하며, 선택적 융합된 고리는 할로겐, CN, 나이트로, C1-10알킬, C1-10할로알킬, -ORA3 및 -NRB3RC3으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 4개의 치환기로 선택적으로 치환된다.
일부 실시형태에서, p+q는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9이다. 일부 실시형태에서, p+q는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9이다. 일부 실시형태에서, p는 1, 2, 3 또는 4이다. 일부 실시형태에서, q는 1, 2, 3, 4 또는 5이다. 일부 실시형태에서, p는 0이다. 일부 실시형태에서, q는 0이다. 일부 실시형태에서, p+q는 0, 1 또는 2이다. 일부 실시형태에서, p+q는 1 또는 2이다. 일부 실시형태에서, p+q는 1이다. 일부 실시형태에서, p+q는 2이다. 일부 실시형태에서, p+q는 3이다.
일부 실시형태에서, Y는 나이트로 ORy1 또는 NRy1Ry2이되, Ry1 및 Ry2는 본 명세서에 정의된 바와 같다. 일부 실시형태에서, Y는 ORy1 또는 NRy1Ry2이되, Ry1 및 Ry2는 본 명세서에 정의된 바와 같다. 추가의 실시형태에서, Y는 나이트로이다. 추가의 실시형태에서, Y는 ORy1이다. 다른 추가의 실시형태에서, Y는 NRy1Ry2이다. 이러한 실시형태에서, 이는 여전히 추가의 실시형태이되, Ry1 및 Ry2는 수소이다.
일부 실시형태에서, R3은, 각 경우에, 할로겐, CN, 나이트로, C1-10알킬, C1-10할로알킬, -ORA3 또는 -NRB3RC3이되, RA3, RB3 및 RC3은 본 명세서에 정의된 바와 같다. 추가의 실시형태에서, R3은 할로겐, CN, 나이트로, C1-4알킬(예를 들어, 메틸, 에틸), C1-4할로알킬(예를 들어, CF3), -ORA3 또는 -NRB3RC3이되, RA3, RB3 및 RC3은 독립적으로, 각 경우에, H, C1-4알킬(예를 들어, 메틸, 에틸), C1-4할로알킬(예를 들어, CF3) 또는 C3-6사이클로알킬(예를 들어, 사이클로프로필)이다. 일부 실시형태에서, p는 1이고, R3은 할로겐 또는 C1-4알킬(예를 들어, 메틸)이다. 일부 실시형태에서, p는 1이고, R3은 할로겐이다. 예시적 실시형태에서, p는 1이고, R3은 플루오린 또는 클로린이다. 다른 예시적 실시형태에서, p는 1이고, R3은 플루오린이다. 다른 예시적 실시형태에서, p는 1이고, R3은 클로린이다. 추가의 예시적 실시형태에서, p는 1이고, R3은 C1-4알킬이다. 다른 예시적 실시형태에서, p는 1이고, R3은 메틸이다.
일부 실시형태에서, R4는, 각 경우에, 독립적으로 할로겐, CN, 나이트로, C1-10알킬, C1-10할로알킬, -ORA4 또는 -NRB4RC4이되, RA4, RB4 및 RC4는 본 명세서에 정의된 바와 같다. 추가의 실시형태에서, R4는 할로겐, CN, 나이트로, C1-4알킬(예를 들어, 메틸, 에틸), C1-4할로알킬(예를 들어, CF3), -ORA4 또는 -NRB4RC4이되, RA4, RB4 및 RC4는 독립적으로, 각 경우에, H, C1-4알킬(예를 들어, 메틸, 에틸), C1-4할로알킬(예를 들어, CF3) 또는 C3-6사이클로알킬(예를 들어, 사이클로프로필)이다. 일부 실시형태에서, q는 1 또는 2이고, 각각의 R4는 독립적으로 할로겐 또는 C1-4알킬이다. 일부 실시형태에서, q는 1이고, R4는 C1-4알킬이다.
일부 실시형태에서, R4는, 각 경우에, 할로겐이다. 일부 실시형태에서, R4는 플루오린이다. 예시적 실시형태에서, q는 1 또는 2이고, R4는 플루오린이다. 일부 실시형태에서, q는 1이고, R4는 플루오린이다. 다른 실시형태에서, q는 2이고, 각각의 R4는 플루오린이다.
화학식 (II)의 실시형태에서, p는 1, 2, 3 또는 4이고, R3, R4, Y 및 q는 본 명세서에 정의된 바와 같은 실시형태가 본 명세서에 기재된다. 추가의 실시형태에서, p는 1 또는 2이고, R3, R4, Y 및 q는 본 명세서에 정의된 바와 같다. 여전히 추가의 실시형태에서, p는 1이고, R3, R4, Y 및 q는 본 명세서에 정의된 바와 같다.
화학식 (II)의 실시형태에서, q는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고, R3, R4, Y 및 p는 본 명세서에 정의된 바와 같은 실시형태가 본 명세서에 기재된다. 화학식 (II)의 실시형태에서, q는 1, 2, 3, 4 또는 5이고, R3, R4, Y 및 p는 본 명세서에 정의된 바와 같은 실시형태가 본 명세서에 기재된다. 추가의 실시형태에서, q는 1 또는 2이고, R3, R4, Y 및 p는 본 명세서에 정의된 바와 같다. 여전히 추가의 실시형태에서, q는 0이고, R3, Y 및 p는 본 명세서에 정의된 바와 같다. 여전히 추가의 실시형태에서, q는 1이고, R3, R4, Y 및 p는 본 명세서에 정의된 바와 같다.
화학식 (II)의 일부 실시형태에서, p는 1이고, q는 1이며, R3, R4 및 Y는 본 명세서에 정의된 바와 같다. 화학식 (II)의 일부 실시형태에서, p는 1이고, q는 2이며, R3, R4 및 Y는 본 명세서에 정의된 바와 같다. 화학식 (II)의 일부 실시형태에서, p는 1이고, q는 0이며, R3, R4 및 Y는 본 명세서에 정의된 바와 같다.
예시적 조합에서, p는 0 또는 1이고, q는 0 또는 1이며, Y는 나이트로, OH 또는 NH2이고, R3 및 R4는 독립적으로 할로겐, CN, 나이트로, C1-4알킬(예를 들어, 메틸, 에틸), C1-4할로알킬(예를 들어, CF3), -ORA4 또는 -NRB4RC4이되, RA4, RB4 및 RC4는 독립적으로, 각 경우에, H, C1-4알킬(예를 들어, 메틸, 에틸), C1-4할로알킬(예를 들어, CF3) 또는 C3-6사이클로알킬(예를 들어, 사이클로프로필)이다.
예시적 조합에서, p는 0 또는 1이고, q는 1이며, Y는 OH 또는 NH2이고, R3 및 R4는 독립적으로 할로겐, CN, 나이트로, C1-4알킬(예를 들어, 메틸, 에틸), C1-4할로알킬(예를 들어, CF3), -ORA4 또는 -NRB4RC4이되, RA4, RB4 및 RC4는 독립적으로, 각 경우에, H, C1-4알킬(예를 들어, 메틸, 에틸), C1-4할로알킬(예를 들어, CF3) 또는 C3-6사이클로알킬(예를 들어, 사이클로프로필)이다.
예시적 조합에서, p는 1이고, q는 1 또는 2이며, Y는 OH 또는 NH2이고, R3 및 R4는 할로겐이다.
화학식 (II)의 대표적인 화합물은 하기를 포함한다:
다른 실시형태에서, 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 화합물은 may be for 루시퍼레이스에 대한 전-기질(pro-substrate), 즉 루시퍼레이스와 결합될 때 직접 발광을 지지하지는 않지만, 예를 들어 제2 효소를 사용한 생물전환에 의해 루시퍼레이스 기질로 전환될 수 있는 화합물일 수 있다. 전-기질은 -OGE, -NRx1GE, -NRy1GE, -NRB1GE 또는 -NRB3GE로 치환된 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 화합물을 포함한다.
GE는 효소 기질을 포함하되, 효소에 의한 효소 기질의 생물전환은 GE를 H로 전환한다. 일부 실시형태에서, GE는 GE1-L1-이고; GE1은 효소 기질이며, L1은 GE1을 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 화합물의 나머지 부분(즉, 모 분자 모이어티)에 연결하는 링커이다.
일부 실시형태에서, L1은 결합 또는 중성 주변 조건하에서 안정한 원자의 배열로 구성된 2가의 기이며, 원자는 탄소, 수소, 질소, 산소, 황, 인 및 실리콘으로부터 선택된다. 2가의 기는 단일 결합(예를 들어, CH2-CH2, CH2-O), 이중 결합(예를 들어, C=O) 또는 삼중 결합(예를 들어, C≡C)을 포함할 수 있으며, 고리 구조(예를 들어, 사이클로알킬)를 함유 또는 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 2가의 기는 -C1-10알킬렌-, -C2-10알킬렌-O-, C3-8사이클로알킬렌, -C(O)-, -O-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -NH-, -N(C1-4알킬)-, -N(COC1-4알킬)-, 아미노산 모이어티, 보호된 아미노산 모이어티 및 페닐렌 중 하나 이상의 배열이되, C3-8사이클로알킬렌 및 페닐렌은 선택적으로 C1-4알킬, C1-4할로알킬, C1-4알콕시, 할로, 사이아노 또는 하이드록시로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 4개의 치환기로 독립적으로 치환된다. 일부 실시형태에서, L1은 C1-C10알킬렌(예를 들어, C2-C3알킬렌)이다.
링커 L1은 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 WO2006/130551, WO2014/159044, US2007/0015790 또는 US2014/0304842에 기재된 바와 같은 전-기질과 효소 기질 사이의 링커일 수 있다. 예를 들어, L1은 반응식 1에 나타나 있는 바와 같은 트라이메틸 록(trimethyl lock), 퀴논 메타이드, 다이펩타이딜, 파라-아미노 벤질옥시카보닐 또는 알킬렌다이아미노카보닐 링커와 같은 흔적없는 링커(traceless linker)일 수 있다. GE1의 효소적 생물전환은 벤조티아졸 루시페린 유사체를 방출하기 위해 자발적으로 자가-희생(self-immolate)할 수 있는 링커를 방출하도록 GE1이 부착된 헤테로원자에 대한 결합의 절단을 초래한다. 일부 흔적없는 링커(예를 들어, 알킬렌 링커)는 WO2006/130551에 기재되어 있는 바와 같이 β-제거에 의해 자발적으로 제거될 수 있다.
반응식 1
효소 기질 GE1의 대표적인 예는 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 WO2006/130551 또는 US2007/0015790에 기재되어 있는 바와 같은 프로테이스, 사이토크롬(CYP) P450 리덕테이스, 모노아미네옥시데이스(monoamineoxidase: MAO), 플라빈 모노옥시게네이스(flavin monooxygenase: FMO), 글루타티온 S 트랜스퍼레이스(glutathione S transferase: GST), 데알킬레이스(예를 들어, 데메틸레이스), 데아세틸레이스, 데포밀레이스, 설파테이스, 포스파테이스(예를 들어, 알칼리성 포스파테이스(alkaline phosphatase: AP)), 베타-락타메이스 및 알코올 데하이드로게네이스에 대한 기질을 포함한다.
대표적인 프로테이스 기질은 펩타이드 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 문헌[Cosby et al. in Cell Notes (2007) 18, pp. 9-11]에 의해 기재된 바와 같은 Z-DEVD-, Z-LETD-, GP-, Suc-LLVY-, Z-LRR-, Z-nLPnLD-, Z-QEVY-, VP-, Z-VDVAD-, Z-VEID-, Z-ATAD-, Z-IEPD-, Z-IETD-, Z-TSAVLQ- 및 Z-VNSTLQ-를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이러한 프로테이스 기질의 경우에, 효소 기질은 X 또는 Y에서 O 또는 N에 직접 부착되어 직접 절단되기 때문에 L1은 결합이다.
흔적없는 링커를 갖는 GE의 대표적인 예는 반응식 2에 나타나 있다.
반응식 2
화합물명은 CHEMDRAW® ULTRA의 일부로서 Struct=Name 명명 알고리즘을 사용하여 할당된다.
화합물은 비대칭 또는 카이랄 중심이 존재하는 입체이성질체로 존재할 수 있다. 입체이성질체는 카이랄 탄소 원자 주변의 치환기의 배열에 따라 "R" 또는 "S"이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "R" 및 "S"는 문헌[IUPAC 1974 Recommendations for Section E, Fundamental Stereochemistry, in Pure Appl. Chem., 1976, 45: 13-30]에서 정의된 바와 같은 배열이다. 본 개시내용은 다양한 입체이성질체 및 이들의 혼합물을 상정하며, 이들은 특히 본 발명의 범위 내에 포함된다. 입체이성질체는 거울상이성질체와 부분입체이성질체 및 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체의 혼합물을 포함한다. 화합물의 개별 입체이성질체는 비대칭 또는 키랄 중심을 함유하는 상업적으로 입수 가능한 출발 물질로부터 합성적으로 제조될 수 있거나, 또는 라세미 혼합물의 제조에 이어 당업자에게 잘 알려진 분리 방법에 의해 제조될 수 있다. 이들 분리 방법은 (1) 거울상이성질체의 혼합물을 카이랄 보조제에 부착하고, 생성된 부분입체이성질체의 혼합물을 재결정화 또는 크로마토그래피에 의해 분리하고, 문헌[Furniss, Hannaford, Smith, and Tatchell, "Vogel's Textbook of Practical Organic Chemistry", 5th edition (1989), Longman Scientific & Technical, Essex CM20 2JE, England]에 기재된 바와 같은 보조제로부터 선택적으로 순수한 생성물을 선택적 유리시키는 것, 또는 (2) 카이랄 크로마토그래피 칼럼에서 광학 거울상이성질체의 혼합물을 직접 분리하는 것, 또는 (3) 분별 재결정화 방법으로 예시된다.
화합물은 호변이성질체 형태뿐만 아니라 기하이성질체를 가질 수 있으며, 이들은 또한 본 발명의 한 양태를 구성한다는 것을 이해해야 한다. 본 발명의 화합물 또는 이의 호변이성질체 또는 염은 화합물, 화합물의 염, 화합물의 호변이성질체 및 화합물의 염의 호변이성질체를 포함한다.
본 개시내용은 또한 동위원소-표지된 화합물을 포함하지만, 이들은 하나 이상의 원자가 일반적으로 자연에서 발견되는 원자 질량(atomic mass) 또는 질량수(mass number)와 다른 원자 질량 또는 질량수를 갖는 원자로 대체된다는 사실에 대해서 화학식 (I)에 언급된 것과 동일하다. 본 발명의 화합물에 포함하기에 적합한 동위원소의 예는 각각 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 18O, 17O, 31P, 32P, 35S, 18F 및 36Cl과 같지만 이들로 제한되지 않는 수소, 탄소, 질소, 산소, 인, 황, 플루오린 및 클로린이다. 중수소(deuterium), 즉 2H와 같은 더 무거운 동위원소로의 치환은 더 큰 대사 안정성, 예를 들어 증가된 생체내 반감기 또는 감소된 투여량 요건으로 인한 소정의 치료 이점을 제공할 수 있으며, 따라서 일부 상황에서 바람직할 수 있다. 화합물은 의료 이미징 및 수용체의 분포를 결정하기 위한 양전자-방출 단층 촬영(positron-emitting tomography: PET) 연구를 위한 양전자-방출 동위원소를 포함할 수 있다. 화학식 (I)의 화합물에 포함될 수 있는 적합한 양전자-방출 동위원소는 11C, 13N, 15O 및 18F이다. 동위원소-표지된 화학식 (I)의 화합물은 일반적으로 당업자에게 공지된 종래의 기법에 의해 또는 비-동위원소 표지된 시약 대신 적절한 동위원소-표지된 시약을 사용하여 첨부된 실시예에 기재된 것과 유사한 과정에 의해 제조될 수 있다.
본 명세서에 개시된 화합물은 염의 형태일 수 있다. 합리적인 이익/위험비에 상응하는 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 등이 없이 인간 및 하등 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 염의 선택은 타당한 의학적 판단 범위 내에 있다. 약제학적으로 허용 가능한 염은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, S. M. Berge 등은 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 문헌[J Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19]에서 상세하게 약제학적으로 허용 가능한 염을 설명하고 있다. 본 발명의 화합물의 허용 가능한 염은 적합한 무기산과 유기산 및 염기로부터 유래되는 것들을 포함한다. 허용 가능한, 무독성의 산 부가염의 예는 무기산, 예컨대 하이드로클로르산, 하이드로브롬산, 인산, 황산 및 퍼클로르산 또는 유기산, 예컨대 아세트산, 옥살산, 말레산, 타타르산, 시트르산, 석신산 또는 말론산으로 또는 이온 교환과 같은 당업계에서 사용되는 다른 방법을 사용하여 형성된 아미노기의 염이다. 다른 허용 가능한 염은 아디페이트, 알지네이트, 아스코르베이트, 아스파테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 바이설페이트, 보레이트, 뷰티레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 시트레이트, 사이클로펜테인프로피오네이트, 다이글루코네이트, 도데실설페이트, 에테인설포네이트, 포메이트, 퓨마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 글루코네이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 하이드로아이오다이드, 2-하이드록시-에테인설포네이트, 락토바이오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말리에이트, 말로네이트, 메테인설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 나이코티네이트, 나이트레이트, 올리에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 석시네이트, 설페이트, 타타레이트, 티오사이아네이트, p-톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 발러레이트 염 등을 포함한다. 염 부가염은 카복실기와 리튬, 포타슘, 칼슘, 마그네슘 또는 알루미늄과 같은 금속 양이온 또는 유기 1차, 2차 또는 3차 아민의 수산화물, 탄산염 또는 중탄산염과 같은 적합한 염기와의 반응에 의해 개시된 화합물의 최종 단리 및 정제 동안 제조될 수 있다. 메틸아민, 다이메틸아민, 트라이메틸아민, 트라이에틸아민, 다이에틸아민, 에틸아민, 트라이뷰틸아민, 피리딘, N,N-다이메틸아닐린, N-메틸피페리딘, N-메틸모폴린, 다이사이클로헥실아민, 프로카인, 다이벤질아민, N,N-다이벤질페네틸아민, 1-에펜아민 및 N,N'-다이벤질에틸렌다이아민, 에틸렌다이아민, 에탄올아민, 다이에탄올아민, 피페리딘, 피페라진 등으로부터 유래된 것들과 같은 4차 아민염이 제조될 수 있다.
A. 화합물의 특성
화학식 (I) 및 화학식 (II)의 화합물은 발광을 생성하기 위한 루시퍼레이스의 기질일 수 있다. 화합물은 개선된 수 용해도, 개선된 안정성, 개선된 세포 투과성, 증가된 세포와의 생체적합성, 감소된 자가발광 및/또는 감소된 독성을 가질 수 있다.
"발광"은 적절한 조건하에, 예를 들어 코엘렌테라진 유사체와 같은 적합한 기질의 존재하에 루시퍼레이스의 광 출력(light output)을 지칭한다. 광 출력은 발광 반응의 시작시에 광 출력(이는 때때로 "T=0" 발광 또는 "플래시"라고도 지칭됨)의 즉각적 또는 거의-즉각적인 측정으로 측정될 수 있으며, 이는 코엘렌테라진 기질의 추가시에 개시될 수 있다. 다양한 실시형태에서 발광 반응은 용액에서 수행된다. 다른 실시형태에서, 발광 반응은 고체 지지체에서 수행된다. 용액은 예를 들어, 원핵 또는 진핵 발현 시스템의 세포로부터의 용해물(lysate)을 함유할 수 있다. 다른 실시형태에서, 발현은 무세포(cell-free) 시스템에서 발생하거나 또는 루시퍼레이스 단백질이 세포외 매질로 분비되며, 후자의 경우에는 용해물을 생성할 필요가 없다. 일부 실시형태에서, 반응은 발광성 단백질을 함유하는 반응 챔버(예를 들어, 96-웰 플레이트와 같은 다중웰 플레이트의 웰)로 적절한 물질, 예를 들어 코엘렌테라진 유사체, 완충액 등을 주입함으로써 시작된다. 여전히 다른 실시형태에서, 루시퍼레이스 및/또는 코엘렌테라진 유사체(예를 들어, 화학식 (I) 및 화학식 (II)의 화합물)는 숙주로 도입되며, 및 발광의 측정은 전체 유기체 또는 세포, 조직, 외식편(explant) 또는 이들의 추출물을 포함할 수 있는 숙주 또는 이들의 일부에서 이루어진다. 반응 챔버는 예를 들어, 발광계(luminometer) 또는 광전자 증배관(photomultiplier)을 사용하여 광 출력을 측정할 수 있는 판독 장치에 위치될 수 있다. 광 출력 또는 발광은 또한 시간 경과에 따라, 예를 들어 동일한 반응 챔버에서 초, 분, 시간 등의 기간 동안 측정될 수 있다. 광 출력 또는 발광은 시간 경과에 따른 평균, 신호 감쇠의 반감기, 시간 경과에 따른 신호의 합(sum) 또는 피크 출력으로 보고될 수 있다. 발광은 상대 광 단위(Relative Light Unit: RLU)로 측정될 수 있다.
화학식 (I) 및 화학식 (II)의 화합물은 코엘렌테라진 또는 퓨리마진과 같은 공지의 코엘렌테라진 유사체와 비교하여, 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 10 이상, 20 이상, 30 이상, 40 이상, 50 이상 또는 100 이상의 RLU를 가질 수 있다.
화학식 (I) 및 화학식 (II)의 화합물은 450 내지 700 나노미터, 460 내지 600 나노미터, 470 내지 600 나노미터, 480 내지 600 나노미터, 490 내지 600 나노미터, 500 내지 600 나노미터, 510 내지 600 나노미터, 520 내지 600 나노미터, 530 내지 600 나노미터, 540 내지 600 나노미터, 550 내지 600 나노미터, 560 내지 600 나노미터, 570 내지 600 나노미터, 580 내지 600 나노미터, 590 내지 600 나노미터, 470 내지 590 나노미터, 480 내지 580 나노미터, 490 내지 570 나노미터, 500 내지 560 나노미터 또는 510 내지 550 나노미터의 λmax를 가질 수 있다. 화학식 (I) 및 화학식 (II)의 화합물은 450 나노미터 이상, 460 나노미터 이상, 470 나노미터 이상, 480 나노미터 이상, 490 나노미터 이상, 500 나노미터 이상, 510 나노미터 이상, 520 나노미터 이상, 530 나노미터 이상, 540 나노미터 이상, 550 나노미터 이상, 560 나노미터 이상, 570 나노미터 이상, 580 나노미터 이상, 590 나노미터 이상, 600 나노미터 이상, 610 나노미터 이상, 620 나노미터 이상, 630 나노미터 이상, 640 나노미터 이상, 650 나노미터 이상, 660 나노미터 이상, 670 나노미터 이상, 680 나노미터 이상, 690 나노미터 이상 또는 700 나노미터 이상의 λmax를 가질 수 있다.
"생체적합성"은 코엘렌테라진 유사체(예를 들어, 화학식 (I)의 화합물)에 대한 세포(예를 들어, 원핵 또는 진핵)의 내성(tolerance)을 지칭한다. 코엘렌테라진 유사체의 생체적합성은 숙주 세포에서 유발하는 스트레스와 관련이 있다.
코엘렌테라진 유사체(예를 들어, 화학식 (I)의 화합물)의 향상된 생체적합성은 세포 생존능력 및/또는 세포의 성장 속도를 측정함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 코엘렌테라진 유사체의 향상된 생체적합성은 코엘렌테라진 유사체가 세포에 얼마나 적합한지 및/또는 독성이 있는지 결정하기 위해 천연의 또는 공지의 코엘렌테라진과 비교하여 코엘렌테라진 유사체에 노출된 세포의 루시퍼레이스 발현의 부재하에 세포 생존능력을 측정함으로써 결정될 수 있다.
특히, 향상된 생체적합성은 세포 생존능력 분석(예를 들어, CellTiter-Glo® 발광성 세포 생존능력 검정을 사용하여), 아폽토시스 검정(예를 들어, Caspase-Glo® 기술을 사용하여) 또는 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 세포 생존능력 또는 아폽토시스에 대한 개시된 화합물의 효과는 세포 생존능력 또는 아폽토시스에 대한 천연의 또는 공지의 코엘렌테라진 유사체의 효과와 비교될 수 있다.
향상된 생체적합성은 또한 세포 정장 또는 유전자 발현에 대한 코엘렌테라진 유사체의 효과(예를 들어, 화학식 (I)의 화합물)를 측정함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 화합물의 향상된 생체적합성은 일정 기간 후 세포 수를 측정함으로써, 또는 천연의 또는 공지의 코엘렌테라진에 노출되거나 콜렌타라진이 없는 세포와 비교하여 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 화합물에 노출된 세포의 샘플에서 스트레스 반응 유전자의 발현을 결정함으로써 결정될 수 있다. 세포 성장 또는 유전자 발현에 대한 개시된 화합물의 효과는 천연의 또는 공지의 코엘렌테라진과 비교될 수 있다.
B. 합성 방법
화학식 (I) 및 화학식 (II)의 화합물은 합성 과정에 의해 또는 대사 과정에 의해 제조될 수 있다. 대사 과정에 의한 화합물의 제조는 인간 또는 동물의 신체(생체내)에서 발생하는 과정 또는 시험관내에서 발생하는 과정을 포함한다.
화학식 (I) 및 화학식 (II)의 화합물이되, 기는 반응식 1 내지 3에 나타낸 바와 같이 합성될 수 있다. 적합한 합성 방법은 또한 예를 들어, 그 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되어 있는 2016년 2월 15일자로 출원된, 문헌[Shakhmin et al.,"COELENTERAZINE ANALOGUES"]에 대한 미국 특허 제62/295,363호(변호사 문서 번호 016026-9574)에 개시된 것들을 포함할 수 있다.
다음의 반응식의 설명에 사용된 약어는 다음과 같다: 아세토나이트릴에 대해 ACN; 카보닐다이이미다졸에 대해 CDI; 다이클로로메테인에 대해 DCM; 다이메틸폼아마이드에 대해 DMF; 당량에 대해 eq; 에탄올에 대해 EtOH; 시간에 대해 h 또는 hr; 호너-워즈워스-에몬스(Horner-Wadsworth-Emmons)에 대해 HWE; 메탄올에 대해 MeOH; 분에 대해 min.; 실온에 대해 RT/rt/r.t.; tert-뷰틸다이메틸실릴에 대해 TBDMS; 1,1,3,3-테트라메틸구아니딘에 대해 TMG; 트라이플루오로아세트산에 대해 TFA; 테트라하이드로퓨란에 대해 THF; 1,1,3,3-테트라메틸구아니딘에 대해 TMG.
반응식 3
반응식 3은 화학식 (I)의 코엘렌테라진을 함유하는 페놀에 대한 일반적인 합성 경로를 보여준다.
반응식 4
반응식 4는 화학식 (I)의 치환된 퓨란-함유 화합물의 일반적인 합성을 보여준다.
반응식 5
반응식 5는 화학식 (II)의 퓨란-함유 화합물의 일반적인 합성을 보여준다.
일반 절차
일반 절차 A(카벤 삽입): 클로로벤젠 중 2-아미노-피라진(1 당량)의 용액에 메틸(또는 tert-뷰틸) 2-다이아조-2-(다이에톡시포스포릴)아세테이트(2 내지 3 당량) 및 로듐 아세테이트 이량체(5 몰%)를 첨가하였다. 혼합물을 배기된 플라스크에서 100℃로 24시간 내지 48시간 동안 가열하였다. 반응물을 냉각시키고, 에틸 아세테이트로 희석하고, 셀라이트를 첨가하고, 농축시키고 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하였다.
일반 절차 B(HWE 반응): 메탄올 중 알데하이드(1 당량) 및 메틸(또는 tert-뷰틸) 포스포네이트 에스터 유도체(1 당량)의 용액에 1,1,3,3-테트라메틸구아니딘(3 당량)을 첨가하였다. 용액을 실온에서 0.5 내지 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 다이클로로메테인과 약 0.1M HCl로 희석하고, 수성 층을 다이클로로메테인으로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 농축시키고 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하였다.
일반 절차 C(스즈키 커플링): 브로마이드(1 당량)의 용액에 보로네이트(1.2 내지 1.5 당량)를 첨가하였다. 용액을 질소로 퍼지하면서, [1,1'-비스(다이페닐포스피노)페로센]다이클로로팔라듐(II)(0.1 당량) 및 1M 세슘 카보네이트 수용액(3 당량)을 첨가하였다. 반응물을 60℃ 내지 85℃에서 2 내지 18시간 동안 교반하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트와 물로 희석하고, 수성 층을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 농축시키고 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하였다.
일반 절차 D(TFA 탈보호): 다이클로로메테인(10㎖) 중 코엘렌테라진 유사체의 용액에 트라이플루오로아세트산(1㎖)을 첨가하였다. 용액을 실온에서 2 내지 6시간 동안 교반하였다. 혼합물을 톨루엔으로 희석하고, 농축시키고, 톨루엔에 재현탁시키고 농축시켰다. 이를 2회 반복하여 미정제 생성물을 수득하였다.
일반 절차 E(CDI 고리화): 다이클로로메테인 중 카복실레이트(1 당량)의 용액에 카보닐다이이미다졸(2 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 0.5 내지 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 다이클로로메테인과 약 0.1M HCl로 희석하고, 수성 층을 다이클로로메테인으로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고 농축시켜 미정제 생성물을 수득하였다.
일반 절차 F(환원): 다이클로로메테인 및 메탄올(1:1) 중 데하이드로-코엘렌테라진(1 당량)의 현탁액을 얼음 수조로 냉각시켰다. 소듐 보로하이드라이드(5 당량)를 첨가하고, 혼합물을 0.5 내지 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 다이클로로메테인과 약 0.1M HCl로 희석하고, 수성 층을 다이클로로메테인으로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 농축시키고 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하였다.
일반 절차 G(HCl 탈보호): 메탄올(10㎖) 중 코엘렌테라진 유사체의 용액에 수성 HCl(6M, 1㎖)을 첨가하였다. 용액을 실온에서 2 내지 6시간 동안 교반하였다. 혼합물을 다이클로로메테인과 물로 희석하고, 수성 층을 다이클로로메테인으로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 농축시키고 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하였다.
일반 절차 H(나이트로 환원): 에탄올 중 나이트로 코엘렌테라진의 용액에 촉매 탄소 상 팔라듐(10%)을 첨가하였다. 용액을 질소로 퍼지하였다. 수소(1atm)를 첨가하고, 현탁액을 실온에서 2 내지 8시간 동안 교반하였다. 용액을 질소로 퍼지하고, 셀라이트를 통해 여과하였다. 여과액을 수집하고, 셀라이트를 첨가하고, 농축시키고 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하였다.
각각의 개별 단계에 대한 최적의 반응 조건 및 반응 시간은 사용된 특정 반응물 및 사용된 반응물에 존재하는 치환기에 따라 달라질 수 있다. 특정 절차가 실시예 부문에 제공된다. 반응물은 종래의 방식으로, 예를 들어 잔류물로부터 용매를 제거하고 결정화, 증류, 추출, 분쇄 및 크로마토그래피와 같지만 이들로 제한되지 않는 당업계에 일반적으로 알려진 방법에 따라 더 정제됨으로써 워크업될 수 있다. 달리 기재되지 않는 한, 출발 물질 및 시약은 상업적으로 입수 가능하거나 또는 화학 문헌에 기재된 방법을 사용하여 상업적으로 입수 가능한 물질로부터 당업자에 의해 제조될 수 있다. 상업적으로 입수 가능하지 않은 경우, 출발 물질은 표준 유기 화학 기법, 공지된 구조적으로 유사한 화합물의 합성과 유사한 기법, 또는 위에 기재된 반응식 또는 합성 실시예 부문에 기재된 절차와 유사한 기법으로부터 선택되는 절차에 의해 제조될 수 있다.
반응 조건, 시약 및 합성 경로의 순서의 적절한 조작, 반응 조건과 양립할 수 없는 임의의 화학 작용기의 보호 및 방법의 반응 순서의 적절한 지점에서의 탈 보호를 포함하는 일상적인 실험 방법은 본 발명의 범위에 포함된다.
적합한 보호기 및 이러한 적합한 보호기를 사용하여 상이한 치환기를 보호 및 탈보호하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며; 이의 예는 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 문헌[PGM Wuts and TW Greene, in Greene's book titled Protective Groups in Organic Synthesis (4th ed.), John Wiley & Sons, NY (2006)]에서 찾을 수 있다. 본 발명의 화합물의 합성은 위에 기재된 합성 반응식 및 특정 실시예에 기재된 것과 유사한 방법에 의해 달성될 수 있다.
개시된 화합물의 광학적으로 활성인 형태가 필요한 경우, 이는 광학적으로 활성인 출발 물질(예를 들어, 적합한 반응 단계의 비대칭 유도에 의해 제조됨)을 사용하여 본 명세서에 기재된 절차 중 하나를 수행함으로써 또는 표준 절차(예컨대, 크로마토그래피 분리, 재결정화 또는 효소적 분리)를 사용하는 화합물 또는 중간체의 입체이성질체의 혼합물의 분리에 의해 수득될 수 있다.
유사하게는, 화합물의 순수한 기하이성질체가 필요한 경우, 이는 출발 물질로서 순수한 기하이성질체를 사용하여 위의 절차 중 하나를 수행함으로써 또는 크로마토그래피 분리와 같은 표준 절차를 사용하여 화합물 또는 중간체의 기하이성질체의 혼합물의 분리에 의해 수득될 수 있다.
기재된 합성 반응식 및 특정 실시예는 예시적인 것이며, 첨부된 청구범위에 정의된 바와 같이 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다는 것이 이해될 수 있다. 합성 방법 및 특정 실시예의 모든 대안, 수정 및 등가물은 청구범위의 범위 내에 포함된다.
3. 사용 방법 및 키트
본 개시내용의 화합물은 루시퍼레이스 기질, 예를 들어 코엘렌테라진 유사체가 사용된 임의의 방식으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 이들은 샘플, 예를 들어 효소, 효소적 반응을 위한 보조인자, 효소 기질, 효소 저해제, 효소 활성자 또는 OH 라디칼, 또는 하나 이상의 상태, 예를 들어 산화환원 상태에서 하나 이상의 분자를 검출하기 위해 코엘렌테라진의 유사체를 사용하는 생물발광 방법에서 사용될 수 있다. 샘플은 동물(예를 들어, 척추 동물), 식물, 균류, 생리학적 유체(예를 들어, 혈액, 혈장, 소변, 점액성 분비물), 세포, 세포 용해물, 세포 상청액 또는 세포의 정제된 분획(예를 들어, 세포내(subcellular) 분획)을 포함할 수 있다. 이러한 분자의 존재, 양, 분광 분포, 방출 역학 또는 특정 활성이 검출 또는 정량될 수 있다. 분자는 다상(multiphasic) 용액(예를 들어, 에멀션 또는 현탁액) 또는 고체 지지체(예를 들어, 입자, 모세혈관 또는 검정 용기)를 포함하는 용액에서 검출 또는 정량화될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 화합물은 관심 있는 분자의 정량화를 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 코엘렌테라진 유사체(예를 들어, 천연의 또는 공지의 코엘렌테라진 또는 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 화합물)는 특정 생화학적 활성, 예를 들어 아폽토시스 또는 약물 대사의 프로브로서 사용될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 화합물은 오플로포러스-유래 루시퍼레이스 및/또는 오플로포러스-루시퍼레이스 유래 생물발광 복합체의 저해제와 함께 사용될 수 있다. 오플로포러스-유래 루시퍼레이스 및/또는 오플로포러스-루시퍼레이스 유래 생물발광 복합체의 예시적 저해제는 예를 들어, 국제 특허 공개 WO2016/210294와 WO2018/125992 및 2018년 6월 1일자로 출원된 미국 특허 제62/679,205호와 2018년 5월 1일자로 출원된 미국 특허 제62/665,346호에 개시되어 있으며, 이들 모두 그 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되어 있다.
소정의 실시형태에서, 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 화합물은 살아있는 세포, 예를 들어 생체내에서 발광을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 루시퍼레이스는 세포(리포터 또는 다른 방법으로) 및 코엘렌테라진 유사체(예를 들어, 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 화합물)로 처리된 세포에서 발현될 수 있으며, 이는 배양물에서 세포를 투과하고, 루시퍼레이스와 반응하여 발광을 생성할 것이다. 세포 투과성에 더하여, 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 화합물은 세포 생존능력의 측면에서 천연의 코엘렌테라진과 유사한 생체적합성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 배지에서 천연의 코엘렌테라진의 안정성을 증가시키는 것으로 알려진 화학적 변형을 포함유 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 화합물이 합성될 수 있으며, 보다 강력한, 생세포 루시퍼레이스-기반 리포터 검정에 사용될 수 있다. 여전히 다른 실시형태에서, 루시퍼레이스 및 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 화합물을 함유하는 샘플(세포, 조직, 동물 등을 포함)은 다양한 현미경 및 이미징 기법, 예를 들어 생체내 이미징을 사용하여 검정될 수 있다. 여전히 다른 실시형태에서, 분비성 루시퍼레이스는 생세포 리포터 시스템의 일부로서 세포에서 발현된다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 화합물은 키트의 일부로 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 키트는 사용자가 본 명세서에 개시된 것과 같은 검정을 수행할 수 있도록 하는 적합한 시약 및 설명서와 함께 하나 이상 루시퍼레이스(폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 둘 다의 형태로) 및 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 코엘렌테라진 유사체를 포함할 수 있다. 키트는 또한 본 명세서에 개시된 것과 같은 하나 이상 완충액을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키트는 위에 기재된 바와 같은 오플로포러스-유래 루시퍼레이스 및/또는 오플로포러스-루시퍼레이스 유래 생물발광 복합체의 저해제를 더 포함할 수 있다.
완충액은 시트르산 또는 시트레이트 완충액, MES, 1,4-피페라진다이에테인설폰산 또는 HEPES; 무기 포스페이트(예를 들어, 파이로포스페이트 또는 포타슘 포스페이트의 형태로); EDTA, CDTA 또는 1,2-다이아미노사이클로헥세인테트라아세트산과 같은 킬레이터; 소듐 플루오라이드, 마그네슘 설페이트와 같은 염; TERGITOL®(예를 들어, 비-이온성 노닐페놀 에톡실레이트), 도데실트라이메틸암모늄 브로마이드(DTAB) 또는 THESIT®(하이드록시폴리에톡시도데케인)와 같은 계면활성제 또는 세제; INDUSTROL® DF204(유기 소포제) 또는 MAZU® DF(실리콘 소포제)와 같은 소포제; 젤라틴, PRIONEX® 10%(젤라틴, 타입 A) 또는 알부민(예를 들어, BSA, HSA) 또는 글리세롤과 같은 단백질 안정화제; 아데노신 트라이포스페이트(adenosine triphosphate: ATP) 또는 아데노신 모노포스페이트(adenosine monophosphate: AMP)를 포함한다. 다른 성분은 폴리에틸렌 글리콜, 폴리바이닐 피리딘, 크라운 에터 또는 사이클로덱스트린을 포함할 수 있다.
A. 생체내 이미징
본 개시내용의 화합물은 생체내 및 생체외 생물발광 이미징과 같은 살아있는 세포의 이미징을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 화합물은 생물발광 영상 조직 절편 또는 살아있는 동물의 세포를 위해 루시퍼레이스를 이용하는 코엘렌테라진과 함께 사용될 수 있다. 생체내 생물발광 영상은 세포 또는 조직으로부터 방출된 빛의 검출을 기반으로 하는 다목적이며 민감한 도구이다. 생물발광은 비-침습적 방식으로 종양 세포, 세균 및 바이러스 감염, 유전자 발현 및 치료 반응을 추적하는데 사용되었다. 생물발광 이미징은 동일한 동물의 질환 경과의 종적 모니터링을 제공하며, 이는 질환의 진행 동안 여러 시점에서 다수의 동물을 분석하는 것보다 바람직한 대안이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 화합물은 다양한 동물 모델에서 세포 이동, 종양 진행, 유전자 발현 및 바이러스 감염과 같은 생물학적 과정을 모니터링하기 위해 생체내에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 화합물은 형질전환 동물, 예컨대 형질전환 마우스의 이미징을 위해 사용될 수 있다. 세포 또는 조직을 포함하는 형질전환 동물은 인간의 세포 기능 및 질환의 모델을 나타낼 수 있다. 따라서, 이러한 동물은 세포 기능 및 관련 이벤트의 메커니즘을 연구하고, 제품(예를 들어, 항체, 소분자 등)을 생성 및 테스트하고, 및 암과 자가면역 병태를 포함하는 관련 인간 질환을 치료 및 진단하는데 유용하다. 일부 실시형태에서, 형질전환 동물은 인간에게 투여하기 위한 특정 작용제의 안전성의 지표를 더 제공할 수 있다. 작용제의 효과는 특정 작용제 및 본 개시내용의 화합물을 특정 세포 또는 전신에 투여하고, 특정 효과를 찾기 위해 생물발광 이미징을 수행함으로써 연구될 수 있다. 동물-기반 및 세포-기반 모델과 본 개시내용의 화합물은 질환을 치료하는데 효과적일 수 있는 약물, 제약, 요법 및 중재를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 화합물은 융합 단백질, 예컨대 루시퍼레이스를 포함하는 융합 단백질을 발현하도록 형질전환된 세포 또는 동물의 생물발광 이미징을 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 형질전환 동물 또는 세포는 루시퍼레이스를 포함하는 융합 단백질을 발현할 수 있다. 일부 실시형태에서, 루시퍼레이스는 코엘렌테라진-이용 루시퍼레이스, 예컨대 오플로포러스 또는 오플로포러스-유래 루시퍼레이스, 레닐라 루시퍼레이스, 가우시아 루시퍼레이스, 예컨대 가우시아 프린셉스(Gaussia princeps) 루시퍼레이스, 메트리디아 루시퍼레이스, 예컨대 메트리디아 론가(Metridia longa) 및 메트리디아 파시피카(Metridia pacifica) 루시퍼레이스, 바르굴라 루시퍼레이스, 예컨대 바르굴라 힐겐도르피(Vargula hilgendorfii) 루시퍼레이스, 플레우로맘마 시피아스(Pleuromamma xiphias) 루시퍼레이스 및 이들의 변이체, 재조합체 및 돌연변이체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 억제성 프로모터 또는 조절성 프로모터일 수 있다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 또한 조직 특이적 프로모터일 수 있다.
일부 실시형태에서, 생물발광 단백질과 관심 있는 이종 단백질, 예컨대 형광 단백질의 융합 단백질은 펩타이드 결합에 의해 서로 직접 연결될 수 있거나, 또는 개재(intervening) 아미노산 서열에 의해 분리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드는 또한 생물발광 단백질과 관심 있는 이종 단백질, 예컨대 형광 단백질에 외인성인 서열을 함유할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 표적화 또는 국재화 서열, 태그 서열, 다른 형광 단백질 또는 생물발광 단백질 또는 다른 발색단의 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적화 서열은 융합 단백질의 특정 조직, 세포-유형(예를 들어, 근육, 심장 또는 신경 세포), 세포 구획물(예를 들어, 미토콘드리아 또는 다른 세포 기관, 핵, 세포질 또는 원형질 막) 또는 단백질로의 국재화를 지시할 수 있다. 또한, 융합은 다중 형광 또는 생물발광 단백질 또는 이의 변이체 및/또는 다른 선택된 단백질로부터의 서열을 함유할 수 있다.　일부 실시형태에서, 루시퍼레이스는 HALOTAG® 단백질 또는 형광 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein: GFP), 적색 형광 단백질(red fluorescent protein: RFP) 또는 주황색-적색 형광 단백질에 융합된다.
형질전환 동물의 세포와 같은 세포내에서 생성된 생물발광은 당업계에 잘 알려진 다양한 수단에 의해 이미지화되거나 검출될 수 있다. 예를 들어, 형질전환 동물의 의도된 부위에 국재화된 융합 단백질 및 본 개시내용의 화합물은 다양한 방식으로 이미지화될 수 있다. 국재화를 달성하기 위한 시간의 합리적인 추정은 당업자에 의해 이루어질 수 있다. 더욱이, 시간의 함수로서 국재화의 상태에 이어 융합 단백질 및 본 개시내용의 화합물로부터 생성된 생물발광이 이미징될 수 있다. 영상화 또는 대상체로부터의 광자 방출 측정은 최대 수십 분까지 지속될 수 있기 때문에, 형질전환 동물은 이미징 과정 중에 고정될 수 있다.
생체내 이미징은 육안 또는 임의의 종류의 카메라(스틸 또는 비디오)를 사용하여 수행될 수 있다. 생물발광의 이미징은 예를 들어, 극히 낮은 수준의 빛(전형적으로, 단일 광자 이벤트)을 검출할 수 있는 광검출기의 사용과 이미지가 구성될 때까지 광자 방출을 통합하는 것을 포함한다. 이러한 민감한 광검출기의 예는 이벤트가 카메라에 의해 검출되기 전에 단일 광자 이벤트를 강화하는 장치와 검출 시스템에 내재된 백그라운드 노이즈를 통해 단일 광자를 검출할 수 있는 카메라(예를 들어, 액체 질소로 냉각됨)를 포함한다. 사용되는 "광검출 장치"는 포유동물 내부에서 나오는 희미한 빛을 합당한 시간 내에 이미징할 수 있으며, 그러한 장치로부터의 신호를 사용하여 이미지를 구성할 수 있을 만큼 충분히 높은 감도를 가져야 한다.
생물발광 신호는 고감도의, 강화된 전하 결합 소자(intensified charge coupled device: CCD) 카메라로 검출될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 생물발광 신호를 검출하기에 충분히 민감하고 형광 신호 또한 검출하기에 충분히 넓은 동적 범위를 갖는 강화된 CCD 카메라가 이미징에 사용된다. 적합한 카메라는 당업계에 공지되어 있으며, LivingImage™ 소프트웨어(캘리퍼 라이프 사이언시스(Caliper Life Sciences))를 사용하여 제어되는 Olympus LV200 생물발광 이미징 시스템, 통합 이미징 시스템(IVIS™ 이미징 시스템, 캘리퍼 라이프 사이언시스) 또는 맞춤형 2-광자 형광 라이프타임 이미징 현미경(문헌[Yasuda Curr Opin Neurobiol. 2006;16:551-561])을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 카메라는 마취, 마우스와 같은 동물용 플랫폼 및 내부 조명을 제공하는 내광성 컨테이너(light-proof container)에 장착된다.
생체내 이미징은 문헌[참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 Contag, C., U.S. Pat. No. 5,650,135, Jul. 22, 1997; Contag, P., et al,　Nature Medicine　4(2):245-247, 1998; Contag, C., et al,　OSA TOPS on Biomedical Optical Spectroscopy and Diagnostics　3:220-224, 1996; Contag, C. H.,　Photochemistry and Photobiology　66(4):523-531, 1997; Contag, C. H., al,　Molecular Microbiology　18(4):593-603, 1995]에 기재된 바와 같은 비-침습적 전체 동물 이미징일 수 있다. 내부 장기로부터 방출되는 빛을 검출하는 민감도는 루시퍼레이스 발현의 수준, 신체 내 표지된 세포의 깊이(광자가 조직을 통과해야 하는 거리) 및 검출 시스템의 민감도를 포함하는 여러 요인에 따라 달라진다.
"광자 증폭 장치"는 검출 스크린에 도달하기 전에 광자를 증폭한다. 이러한 종류는 마이크로채널 강화기(microchannel intensifier)와 같은 강화기가 있는 CCD 카메라를 포함한다. 마이크로채널 강화기는 전형적으로 카메라의 검출 스크린에 수직이며 함께 확장되는 금속 어레이의 채널을 포함한다. 마이크로채널 어레이는 이미지화될 샘플, 대상체 또는 동물과 카메라 사이에 배치된다. 어레이의 채널에 들어가는 대부분의 광자는 빠져나가기 전에 채널의 측면에 접촉한다. 어레이에 인가된 전압은 각각의 광자 충돌로부터 많은 전자를 방출한다. 이러한 충돌로 인한 전자는 "샷건(shotgun)" 패턴으로 원점(origin) 채널을 벗어나 카메라에 의해 검출된다.
이미지 처리장치는 예를 들어, 모니터에 표시되거나 비디오 프린터에 인쇄될 수 있는 이미지를 구성하기 위해 광자를 계산하는 광검출기 장치에 의해 생성된 신호를 처리한다. 이러한 이미지 처리장치는 전형적으로 위에 기재된 민감한 광자-계수 카메라를 포함하는 시스템의 일부로서 판매되므로, 동일한 공급원으로부터 입수 가능하다. 이미지 처리장치는 일반적으로 IBM-호환 PC 또는 애플 매킨토시(애플 컴퓨터(Apple Computer), 캘리포니아주 쿠퍼티노)와 같은 개인용 컴퓨터에 연결되며, 이는 구입한 이미징 시스템의 일부로 포함되거나 포함되지 않을 수 있다. 이미지가 디지털 파일의 형식이면, 다양한 이미지 처리 프로그램(예컨대, "ADOBE PHOTOSHOP", 어도비 시스템즈(Adobe Systems), 캘리포니아주 마운틴뷰)을 사용하여 조작되고 인쇄될 수 있다.
동물 또는 대상체 전체가 반드시 광검출 장치의 검출 필드에 있을 필요는 없음을 이해할 수 있을 것이다. 예를 들어, 대상체의 특정 영역을 표적으로 하는 융합 단백질을 측정하는 경우, 원하는 정보를 얻기 위해 그 영역으로부터의 빛과 충분한 주변의 "어두운" 구역만이 측정될 필요가 있다.
광자 방출 이미지가 생성되면, 전형적으로 대상체의 "정상"의 반사된 광 이미지에 중첩되어 방출된 광자의 공급원에 대한 참조(reference) 프레임을 제공한다(즉, 대상체에 대하여 융합 단백질을 국재화). 반사된 광 이미지에 광자 방출 이미지를 중첩하여 형성된 "복합(composite)" 이미지는 그 후 대상체에서 표적의 위치 및/또는 양을 결정하기 위해 분석된다.
B. 생물발광 공명 에너지 전달(BRET)
개시된 화합물은 리간드-단백질 및/또는 단백질-단백질 상호작용을 검출하기 위한 임의의 방법에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 화합물은 생체내 또는 시험관내 생물발광 공명 에너지 전달(bioluminescence resonance energy transfer: BRET) 시스템에 사용될 수 있다. BRET에 대하여, 생물발광 공여체에서 형광 수여체로의 에너지 전달은 빛 방출의 스펙트럼 분포의 이동을 초래한다. 이러한 에너지 전달은 파트너의 상호작용과 해리와 같은 시험관내 또는 생체내 단백질-단백질 또는 리간드-단백질 상호작용의 실시간 모니터링을 가능하게 할 수 있다. NanoBRET™ 시스템과 같은 BRET 시스템의 예는 예를 들어, 미국 특허 제10,024,862호, 미국 공개 제2014/0194307호, 미국 특허 제10,067,149호 및 미국 공개 제2014/0194325호에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, BRET 분석에 사용되는 발광 효소는 2개의 분자가 서로 결합할 수 있는지 또는 세포에서 공동-국재화될 수 있는지를 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 발광 효소는 제1 융합 단백질을 생성하기 위해 관심 있는 분자 또는 단백질과 결합되는 생물발광 공여체 분자로서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 발광 효소는 항체, 단백질, 수용체, 약물, 약물 담체, 펩타이드, 당, 지방산, 나노입자 또는 다른 바이오 분자와 접합될 수 있다. 다양한 실시형태에서, 제1 융합 단백질은 발광 효소 및 관심 있는 단백질을 함유한다. 다양한 실시형태에서, 발광 효소를 함유하는 제1 융합 단백질은 세포 용해물, 온전한 세포 및 살아있는 동물을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 시스템에서 단백질/단백질 상호작용을 검출하기 위해 BRET 분석에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, BRET 분석은 또한 위에 기재된 바와 같은 오플로포러스-유래 루시퍼레이스 및/또는 오플로포러스-루시퍼레이스 유래 생물발광 복합체의 저해제를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 형광 수여체는 형광단, 예컨대 형광 단백질, 형광 분자, 형광 표지 또는 형광 추적물질일 수 있다. 일부 실시형태에서, 형광 추적물질은 형광단에 태그된 소분자일 수 있다. 일부 실시형태에서, 형광 수여체는 항체, 단백질, 수용체, 약물, 약물 담체, 펩타이드, 당, 지방산, 나노입자 또는 다른 바이오분자에 접합된 형광 수여체를 포함하는 제2 융합 단백질일 수 있다.
다양한 실시형태에서, HALOTAG®는 형광 수여체 분자로서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, HALOTAG®는 관심 있는 제2 단백질 또는 발광 효소에 융합될 수 있다. 예를 들어, 발광 효소는 HALOTAG®에 융합되고, HALOTAG® TMR 리간드와 같은 형광 HALOTAG® 리간드로 표지된 세포 또는 동물에서 발현될 수 있다. 다른 예에서, 발광 효소는 형광 단백질에 융합되고, 세포 또는 동물에서 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, BRET는 몇 가지 비-제한적 예로 GFP, RFP 주황색-적색 형광 단백질을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 형광 단백질 또는 플루오레세인, 로다민 그린, 오레곤 그린 또는 Alex488을 포함하는 형광 표지와 결합된 발광 효소를 사용하여 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 개시된 화합물은 실시간으로 온전한 세포에서 약물:표적 상호작용과 같은 선택된 표적 단백질에서 화합물 결합을 측정하기 위해, NANOBRET™ 표적 결합(Target Engagement: TE) 검정과 같은 표적 결합 검정에 사용될 수 있다. 예를 들어, NANOBRET™ TE 검정은 다음의 4개의 성분을 포함할 수 있다: bright NANOLUC® 루시퍼레이스에 융합된 발현된 세포 표적 단백질; 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 세포-투과성 형광 추적물질; NANOLUC ® 루시퍼레이스에 대한 기질로 사용되는 개시된 화합물 중 하나 이상; 및 NANOLUC® 루시퍼레이스에 대한 세포-불투과성 저해제. 검정은 발광 에너지를 NANOLUC® 루시퍼레이스에서 표적 단백질-NANOLUC® 융합에 결합된 형광 추적물질로 전달함으로써 달성되는 생물발광 공명 에너지 전달(BRET)을 사용한다. 이러한 에너지 전달은 화합물 결합 친화도뿐만 아니라 화합물-표적 체류 시간을 직접 측정할 수 있게 한다.
일부 실시형태에서, 세포에 적용되고 특이적으로 세포내 표적 단백질-NANOLUC® 융합에 결합할 수 있는 화합물은 BRET의 감소를 초래할 것이다. 일부 실시형태에서, 세포내 표적 결합의 정확한 평가를 보장하기 위해, NANOLUC® 저해제는 건강한 살아있는 세포 내에서 발현된 NANOLUC® 루시퍼레이스에 악영향을 미치지 않으면서 취급 중에 손상된 세포로부터 발생할 수 있는 임의의 세포외 NANOLUC® 신호를 경감시키기 위해 사용될 수 있다.
BRET 시스템은 광학 현미경, 디지털 현미경, 발광계, 전하 결합 소자(CCD) 이미지 센서, 상보적 금속-산화물 반도체(complementary metal-oxide-semiconductor: CMOS) 이미지 센서 또는 디지털 카메라아 같지만 이들로 제한되지 않는, 생물발광 융합 단백질로부터 방출된 빛을 검출하기 위한 광검출기 또는 이미징 장치를 더 포함할 수 있다.
C. 제형 및 투여
전체 동물 연구를 위해, 개시된 이미징 프로브는 바람직하게는 비경구 투여 용으로 제형화된다. 비경구 제형은 당업계에 공지된 기법을 사용하여 수성 조성물로서 제조될 수 있다. 전형적으로, 이러한 조성물은 용액 또는 현탁액; 재구성 매질의 첨가시 용액 또는 현탁액을 제조하기에 적합한 고체 형태; 에멀션, 예컨대 유중수(water-in-oil: w/o) 에멀션, 수중유(oil-in-water: o/w) 에멀션 및 이들의 마이크로에멀션, 리포솜 또는 에멀솜(emulsome)으로 제조된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "비경구"는 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 피하 및 관절내 주사 및 주입을 포함하는 투여 방식을 지칭한다.
담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 1종 이상의 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜), 오일, 예컨대 식물성 오일(예를 들어, 땅콩유, 옥수수유, 참깨유 등) 및 이들의 조합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다.
유리 산 또는 염기 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로서 활성 화합물의 용액 및 분산액은 계면활성제, 분산제, 유화제, pH 조정제 및 이들의 조합을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 적합하게 혼합된 물 또는 다른 용매 또는 분산 매질로 제조될 수 있다.
적합한 계면활성제는 음이온성, 양이온성, 양쪽성 또는 비이온성 표면 활성제일 수 있다. 적합한 음이온성 계면활성제는 카복실레이트, 설포네이트 및 설페이트 이온을 함유하는 것들을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 음이온성 계면활성제의 예는 소듐, 포타슘, 긴 사슬 알킬 설포네이트의 암모늄 및 알킬 아릴 설포네이트, 예컨대 소듐 도데실벤젠 설포네이트; 다이알킬 소듐 설포석시네이트, 예컨대 소듐 도데실벤젠 설포네이트; 다이알킬 소듐 설포석시네이트, 예컨대 소듐 비스-(2-에틸티옥실)설포석시네이트; 및 알킬 설페이트, 예컨데 소듐 라우릴 설페이트를 포함한다. 양이온성 계면활성제는 4차 암모늄 화합물, 예컨대 벤잘코늄 클로라이드, 벤젠토늄 클로라이드, 세트라이모늄 브로마이드, 스테아릴 다이메틸벤질 암모늄 클로라이드, 폴리옥시에틸렌 및 코코넛 아민을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 비이온성 계면활성제의 예는 에틸렌 글리콜 모노스테아레이트, 프로필렌 글리콜 미리스테이트, 글리세릴 모노스테아레이트, 글리세릴 스테아레이트, 폴리글리세릴-4-올리에이트, 소르비탄 아크릴레이트, 수크로스 아크릴레이트, PEG-150 라우레이트, PEG-400 모노라우레이트, 폴리옥시에틸렌 모노라우레이트, 폴리소르베이트, 폴리옥시에틸렌 옥틸페닐에터, PEG-1000 세틸 에터, 폴리옥시에틸렌 트라이데실 에터, 폴리프로필렌 글리콜 뷰틸 에터, Poloxamer® 401, 스테아로일 모노아이소프로판올아마이드 및 폴리옥시에틸렌 수소화 탈로우 아마이드를 포함한다. 양쪽성 계면활성제의 예는 소듐 N-도데실-β-알라닌, 소듐 N-라우릴-β-이미노다이프로피오네이트, 미리스토암포아세테이트, 라우릴 베타인 및 라우릴 설포베타인을 포함한다.
제형은 미생물의 성장을 방지하기 위해 방부제를 함유할 수 있다. 적합한 방부제는 파라벤, 클로로뷰탄올, 페놀, 소르브산 및 티메로살을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 제형은 또한 활성제(들)의 분해를 방지하기 위해 항산화제를 함유할 수 있다.
제형은 전형적으로 재구성시 비경구 투여를 위해 pH 3 내지 8로 완충된다. 적합한 완충액은 포스페이트 완충액, 아세테이트 완충액 및 시트레이트 완충액을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
수용성 중합체가 종종 비경구 투여용 제형에 사용된다. 적합한 수용성 중합체는 폴리바이닐피롤리돈, 덱스트란, 카복시메틸셀룰로스 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
멸균 주사 용액은 필요에 따라 위에 나열된 부형제 중 하나 이상과 함께 적절한 용매 또는 분산 매질에 필요한 양의 활성 화합물을 혼입시킨 다음 여과 멸균시킴으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분을 기본 분산 매질과 위에 나열된 다른 필수 성분을 포함하는 멸균 비히클에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 이의 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분의 분말과 임의의 추가적인 원하는 성분을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조 기법이다. 분말은 입자가 사실상 다공성이므로 입자의 용해를 증가시킬 수 있는 방식으로 제조될 수 있다. 다공성 입자의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
4. 실시예
실시예 1. 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-2-(3-(메톡시메틸)벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-0372)
단계 1. 3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)피라진-2-아민(JRW-0218)
다이옥세인(5㎖) 중 3-벤질-5-브로모피라진-2-아민(300㎎, 1.14 m㏖)의 용액에 (3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)보론산(430㎎, 1.70 m㏖)을 첨가하였다. 용액을 질소로 퍼지하면서, [1,1'-비스(다이페닐포스피노)페로센]다이클로로팔라듐(II)(93㎎, 0.11 m㏖) 및 세슘 카보네이트(3.4㎖, 1M, 3.4 m㏖)를 첨가하였다. 반응물을 60℃에서 30분 동안 교반하였다. 혼합을 에틸 아세테이트와 물로 희석하고, 수성 층을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 농축시키고 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 갈색 고체로서 미정제 생성물(490㎎)을 수득하였다. ESI MS m/z 392 [M + H]+.
단계 2. 메틸 2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)피라진-2-일)아미노)-2-(다이에톡시포스포릴)아세테이트(JRW-0226)
일반 절차 A에 따라, 3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)피라진-2-아민(450㎎, 1.15 m㏖)을 메틸 2-다이아조-2-(다이에톡시포스포릴)아세테이트(814㎎, 3.45 m㏖)와 반응시켜 갈색 고체로서 목적하는 생성물(500㎎, 72%)을 수득하였다. ESI MS m/z 600 [M + H]+.
단계 3. 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-2-(3-(메톡시메틸)벤질리덴)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(JRW-0370)
일반 절차 B에 따라, 메틸 2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)피라진-2-일)아미노)-2-(다이에톡시포스포릴)아세테이트(275㎎, 0.46 m㏖)를 3-(메톡시메틸)벤즈알데하이드(75㎎, 0.50 m㏖)와 반응시켜 자흑색 고체로서 생성물과 탈실릴화된 생성물의 혼합물(157㎎)을 수득하였다. ESI MS m/z 564, 450 [M + H]+.
단계 4. 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-2-(3-(메톡시메틸)벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-0372)
일반 절차 F에 따라, 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-2-(3-(메톡시메틸)벤질리덴)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(155㎎, 0.27 m㏖)을 소듐 보로하이드라이드(52㎎, 1.37 m㏖)와 반응시켜 주황색 고체로서 목적하는 생성물(81㎎, 52%)을 수득하였다. ESI MS m/z 566 [M + H]+.
실시예 2. 8-벤질-6-(3-하이드록시페닐)-2-(3-(메톡시메틸)벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-0373)
일반 절차 D에 따라, 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-2-(3-(메톡시메틸)벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(70㎎, 0.12 m㏖)을 TFA(1㎖)와 반응시켜 주황색 고체로서 목적하는 생성물(23㎎, 42%)을 수득하였다. ESI MS m/z 452 [M + H]+.
실시예 3. 2-(벤조[d][1,3]다이옥솔-5-일메틸)-8-벤질-6-(3-하이드록시페닐)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-0777)
단계 1. 2-(벤조[d][1,3]다이옥솔-5-일메틸렌)-8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(JRW-0775)
일반 절차 B에 따라, 메틸 2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)피라진-2-일)아미노)-2-(다이에톡시포스포릴)아세테이트(72㎎, 0.12 m㏖)를 벤조[d][1,3]다이옥솔-5-카브알데하이드(20㎎, 0.13 m㏖)와 반응시켜 적흑색 고체로서 생성물과 탈실릴화된 생성물의 혼합물(20㎎)을 수득하였다. ESI MS m/z 564, 450 [M + H]+.
단계 2. 2-(벤조[d][1,3]다이옥솔-5-일메틸)-8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-0776)
일반 절차 F에 따라, 2-(벤조[d][1,3]다이옥솔-5-일메틸렌)-8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(20㎎, 0.035 m㏖)을 소듐 보로하이드라이드(7㎎, 0.18 m㏖)와 반응시켜 황색 유리로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 566 [M + H]+.
단계 3. 2-(벤조[d][1,3]다이옥솔-5-일메틸)-8-벤질-6-(3-하이드록시페닐)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-0777)
일반 절차 D에 따라, 2-(벤조[d][1,3]다이옥솔-5-일메틸)-8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(0.035 m㏖)을 TFA(1㎖)와 반응시켜 주황색 고체로서 목적하는 생성물(5㎎, 3단계에 걸쳐 9%)을 수득하였다. ESI MS m/z 452 [M + H]+.
실시예 4. 8-벤질-2-(4-플루오로벤질)-6-(3-하이드록시페닐)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-0786)
단계 1. 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-2-(4-플루오로벤질리덴)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(JRW-0784)
일반 절차 B에 따라, 메틸 2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)피라진-2-일)아미노)-2-(다이에톡시포스포릴)아세테이트(130㎎, 0.22 m㏖)를 4-플루오로벤즈알데하이드(32㎎, 0.26 m㏖)와 반응시켜 적흑색 고체로서 생성물과 탈실릴화된 생성물의 혼합물(110㎎)을 수득하였다. ESI MS m/z 538, 424 [M + H]+.
단계 2. 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-2-(4-플루오로벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-0785)
일반 절차 F에 따라, 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-2-(4-플루오로벤질리덴)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(110㎎, 0.20 m㏖)을 소듐 보로하이드라이드(39㎎, 1.0 m㏖)와 반응시켜 주황색 거품으로서 미정제 생성물(98㎎)을 수득하였다. ESI MS m/z 540 [M + H]+.
단계 3. 8-벤질-2-(4-플루오로벤질)-6-(3-하이드록시페닐)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-0786)
일반 절차 G에 따라, 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-2-(4-플루오로벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(98㎎, 0.18 m㏖)을 HCl(1㎖, 6M)과 반응시켜 주황색 고체로서 목적하는 생성물(50㎎, 3단계에 걸쳐 54%)을 수득하였다. ESI MS m/z 426 [M + H]+.
실시예 5. 8-벤질-6-(3-하이드록시페닐)-2-(티오펜-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1040)
단계 1. 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-2-(티오펜-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(JRW-1038)
일반 절차 B에 따라, 메틸 2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)피라진-2-일)아미노)-2-(다이에톡시포스포릴)아세테이트(110㎎, 0.18 m㏖)를 티오펜-2-카브알데하이드(25㎎, 0.22 m㏖)와 반응시켜 적흑색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 526 [M + H]+.
단계 2. 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-2-(티오펜-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1039)
일반 절차 F에 따라, 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-2-(티오펜-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(0.18 m㏖)을 소듐 보로하이드라이드(20㎎, 0.54 m㏖)와 반응시켜 주황색 거품으로서 목적하는 생성물(20㎎, 21%)을 수득하였다. ESI MS m/z 528 [M + H]+.
단계 3. 8-벤질-6-(3-하이드록시페닐)-2-(티오펜-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1040)
일반 절차 G에 따라, 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-2-(티오펜-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(20㎎, 0.038 m㏖)을 HCl(1㎖, 6M)과 반응시켜 황색 고체로서 목적하는 생성물(9㎎, 60%)을 수득하였다. ESI MS m/z 414 [M + H]+.
실시예 6. 2,8-다이벤질-6-(3-하이드록시페닐)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1043)
단계 1. 8-벤질-2-벤질리덴-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(JRW-1041)
일반 절차 B에 따라, 메틸 2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)피라진-2-일)아미노)-2-(다이에톡시포스포릴)아세테이트(100㎎, 0.16 m㏖)를 벤즈알데하이드(21㎎, 0.20 m㏖)와 반응시켜 적색 고체로서 생성물과 탈실릴화된 생성물의 혼합물을 수득하였다. ESI MS m/z 520, 406 [M + H]+.
단계 2. 2,8-다이벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1042)
일반 절차 F에 따라, 8-벤질-2-벤질리덴-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(0.16 m㏖)을 소듐 보로하이드라이드(31㎎, 0.83 m㏖)와 반응시켜 주황색 거품으로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 522 [M + H]+.
단계 3. 2,8-다이벤질-6-(3-하이드록시페닐)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1043)
일반 절차 G에 따라, 2,8-다이벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(40㎎, 0.077 m㏖)을 HCl(1㎖, 6M)과 반응시켜 황색-주황색 고체로서 목적하는 생성물(41㎎, 3단계에 걸쳐 61%)을 수득하였다. ESI MS m/z 408 [M + H]+.
실시예 7. 8-벤질-6-(3-하이드록시페닐)-2-(3-메톡시벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1047)
단계 1. 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-2-(3-메톡시벤질리덴)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(JRW-1045)
일반 절차 B에 따라, 메틸 2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)피라진-2-일)아미노)-2-(다이에톡시포스포릴)아세테이트(125㎎, 0.21 m㏖)를 3-메톡시벤즈알데하이드(34㎎, 0.25 m㏖)와 반응시켜 적색 고체로서 생성물과 탈실릴화된 생성물의 혼합물을 수득하였다. ESI MS m/z 550, 436 [M + H]+.
단계 2. 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-2-(3-메톡시벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1046)
일반 절차 F에 따라, 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-2-(3-메톡시벤질리덴)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(0.21 m㏖)을 소듐 보로하이드라이드(38㎎, 1.0 m㏖)와 반응시켜 주황색 거품으로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 552 [M + H]+.
단계 3. 8-벤질-6-(3-하이드록시페닐)-2-(3-메톡시벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1047)
일반 절차 G에 따라, 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-2-(3-메톡시벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(0.21 m㏖)을 HCl(1㎖, 6M)과 반응시켜 주황색 고체로서 목적하는 생성물(58㎎, 3단계에 걸쳐 63%)을 수득하였다. ESI MS m/z 438 [M + H]+.
실시예 8. 8-벤질-6-(3-하이드록시페닐)-2-(4-메톡시벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1052)
단계 1. 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-2-(4-메톡시벤질리덴)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(JRW-1049)
일반 절차 B에 따라, 메틸 2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)피라진-2-일)아미노)-2-(다이에톡시포스포릴)아세테이트(100㎎, 0.16 m㏖)를 4-메톡시벤즈알데하이드(27㎎, 0.20 m㏖)와 반응시켜 적색 고체로서 생성물과 탈실릴화된 생성물의 혼합물을 수득하였다. ESI MS m/z 550, 436 [M + H]+.
단계 2. 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-2-(4-메톡시벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1051)
일반 절차 F에 따라, 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-2-(4-메톡시벤질리덴)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(0.16 m㏖)을 소듐 보로하이드라이드(31㎎, 0.83 m㏖)와 반응시켜 주황색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 552 [M + H]+.
단계 3. 8-벤질-6-(3-하이드록시페닐)-2-(4-메톡시벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1052)
일반 절차 G에 따라, 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-2-(4-메톡시벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(0.16 m㏖)을 HCl(1㎖, 6M)과 반응시켜 주황색 고체로서 목적하는 생성물(41㎎, 3단계에 걸쳐 57%)을 수득하였다. ESI MS m/z 438 [M + H]+.
실시예 9. 8-벤질-6-(3-하이드록시페닐)-2-((5-메틸퓨란-2-일)메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1056)
단계 1. 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-2-((5-메틸퓨란-2-일)메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(JRW-1054)
일반 절차 B에 따라, 메틸 2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)피라진-2-일)아미노)-2-(다이에톡시포스포릴)아세테이트(100㎎, 0.16 m㏖)를 5-메틸퓨란-2-카브알데하이드(22㎎, 0.20 m㏖)와 반응시켜 적색 고체로서 생성물과 탈실릴화된 생성물의 혼합물을 수득하였다. ESI MS m/z 524, 410 [M + H]+.
단계 2. 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-2-((5-메틸퓨란-2-일)메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1055)
일반 절차 F에 따라, 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-2-((5-메틸퓨란-2-일)메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(0.16 m㏖)을 소듐 보로하이드라이드(31㎎, 0.83 m㏖)와 반응시켜 황색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 526 [M + H]+.
단계 3. 8-벤질-6-(3-하이드록시페닐)-2-((5-메틸퓨란-2-일)메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1056)
일반 절차 G에 따라, 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-2-((5-메틸퓨란-2-일)메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(0.16 m㏖)을 HCl(1㎖, 6M)과 반응시켜 주황색 고체로서 목적하는 생성물(17㎎, 3단계에 걸쳐 25%)을 수득하였다. ESI MS m/z 412 [M + H]+.
실시예 10. 8-벤질-6-(3-하이드록시페닐)-2-((5-(트라이플루오로메틸)퓨란-2-일)메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1180)
단계 1. tert-뷰틸 2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)피라진-2-일)아미노)-2-(다이에톡시포스포릴)아세테이트(JRW-1165)
일반 절차 A에 따라, 3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)피라진-2-아민(410㎎, 1.05 m㏖)을 tert-뷰틸 2-다이아조-2-(다이에톡시포스포릴)아세테이트(582㎎, 2.1 m㏖)와 반응시켜 갈색 고체로서 목적하는 생성물(580㎎, 86%)을 수득하였다. ESI MS m/z 642 [M + H]+.
단계 2. tert-뷰틸 2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(5-(트라이플루오로메틸)퓨란-2-일)아실레이트(JRW-1168)
일반 절차 B에 따라, tert-뷰틸 2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)피라진-2-일)아미노)-2-(다이에톡시포스포릴)아세테이트(250㎎, 0.39 m㏖)를 5-트라이플루오로메틸퓨란-2-카브알데하이드(70㎎, 0.43 m㏖)와 반응시켜 자색 거품으로서 목적하는 생성물(180㎎, 71%)을 수득하였다. ESI MS m/z 652 [M + H]+.
단계 3. tert-뷰틸 2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(5-(트라이플루오로메틸)퓨란-2-일)프로파노에이트(JRW-1170)
에탄올(25㎖) 중 tert-뷰틸 2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(5-(트라이플루오로메틸)퓨란-2-일)아실레이트(180㎎, 0.27 m㏖)의 용액에 윌킨슨 촉매[클로리도트리스(트라이페닐포스페인)로듐(I)](25㎎, 0.027 m㏖)를 첨가하였다. 용액을 스틸 반응 용기에 넣고, 80 psi의 수소 가스로 채웠다. 반응물을 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 그런 다음, 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 에탄올로 세척하고, 농축시키고, 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 주황색 오일로서 목적하는 생성물(123㎎, 68%)을 수득하였다. ESI MS m/z 654 [M + H]+.
단계 4. 2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(5-(트라이플루오로메틸)퓨란-2-일)프로판산(JRW-1176)
일반 절차 D에 따라, tert-뷰틸 2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(5-(트라이플루오로메틸)퓨란-2-일)프로파노에이트(123㎎, 0.18 m㏖)를 TFA(1㎖)와 반응시켜 주황색 겔로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 598 [M + H]+.
단계 5. 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-2-((5-(트라이플루오로메틸)퓨란-2-일)메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1178)
일반 절차 E에 따라, 2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(5-(트라이플루오로메틸)퓨란-2-일)프로판산(0.18 m㏖)을 CDI(58㎎, 0.36 m㏖)와 반응시켜 주황색 거품으로서 목적하는 생성물(70㎎, 67%)을 수득하였다. ESI MS m/z 579 [M + H]+.
단계 6. 8-벤질-6-(3-하이드록시페닐)-2-((5-(트라이플루오로메틸)퓨란-2-일)메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1180)
일반 절차 G에 따라, 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-2-((5-(트라이플루오로메틸)퓨란-2-일)메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(70㎎, 0.12 m㏖)을 HCl(1㎖, 6M)과 반응시켜 주황색 고체로서 목적하는 생성물(46㎎, 82%)을 수득하였다. ESI MS m/z 465 [M + H]+.
실시예 11. 2-(퓨란-2-일메틸)-6-(3-하이드록시페닐)-8-(3-메틸벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1368)
단계 1. 5-브로모-3-(3-메틸벤질)피라진-2-아민(JRW-1341)
DMF/THF(1:1, 40㎖) 중 3,5-다이브로모피라진-2-아민(2.5g, 9.9 m㏖)의 용액에 비스(트라이페닐포스핀)팔라듐(II) 다이클로라이드(346㎎, 0.49 m㏖)를 질소로 퍼지하면서 첨가하였다. (3-메틸벤질)아연(II) 클로라이드(45㎖, THF 중 0.5M)를 첨가하고, 반응물을 50℃로 1시간 동안 가열하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트와 물로 희석하고, 수성 층을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 농축시키고, 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 황색 오일로서 목적하는 생성물(2.45g, 89%)을 수득하였다. ESI MS m/z 279 [M + H]+.
단계 2. tert-뷰틸 2-((5-브로모-3-(3-메틸벤질)피라진-2-일)아미노)-2-(다이에톡시포스포릴)아세테이트(JRW-1348)
일반 절차 A에 따라, 5-브로모-3-(3-메틸벤질)피라진-2-아민(2.45g, 8.8 m㏖)을 tert-뷰틸 2-다이아조-2-(다이에톡시포스포릴)아세테이트(3.68g, 13.2 m㏖)와 반응시켜 주황색 오일로서 목적하는 생성물(3.38g, 72%)을 수득하였다. ESI MS m/z 529 [M + H]+.
단계 3. tert-뷰틸 2-((5-브로모-3-(3-메틸벤질)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(JRW-1349)
일반 절차 B에 따라, tert-뷰틸 2-((5-브로모-3-(3-메틸벤질)피라진-2-일)아미노)-2-(다이에톡시포스포릴)아세테이트(3.38g, 6.4 m㏖)를 퍼퓨랄(737㎎, 7.7 m㏖)과 반응시켜 주황색 오일로서 목적하는 생성물(2.8g, 93%)을 수득하였다. ESI MS m/z 471 [M + H]+.
단계 4. tert-뷰틸 2-((5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-3-(3-메틸벤질)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(JRW-1352)
다이옥세인(5㎖) 중 tert-뷰틸 2-((5-브로모-3-(3-메틸벤질)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(230㎎, 0.49 m㏖)의 용액에 (3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)보론산(185㎎, 0.73 m㏖)을 첨가하였다. 용액을 질소로 퍼지하면서, [1,1'-비스(다이페닐포스피노)페로센]다이클로로팔라듐(II)(39㎎, 0.049 m㏖) 및 세슘 카보네이트(0.98㎖, 1M, 0.98 m㏖)를 첨가하였다. 반응물을 60℃에서 18시간 동안 교반하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트와 물로 희석하고, 수성 층을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 농축시키고, 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 황색 오일로서 미정제 생성물(241㎎)을 수득하였다. ESI MS m/z 598 [M + H]+.
단계 5. 2-((5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-3-(3-메틸벤질)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(JRW-1358)
일반 절차 D에 따라, tert-뷰틸 2-((5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-3-(3-메틸벤질)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(240㎎, 0.40 m㏖)를 TFA(1㎖)와 반응시켜 주황색-갈색 겔로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 542 [M + H]+.
단계 6. 6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-2-(퓨란-2-일메틸렌)-8-(3-메틸벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(JRW-1364)
일반 절차 E에 따라, 2-((5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-3-(3-메틸벤질)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(0.40 m㏖)을 CDI(130㎎, 0.80 m㏖)와 반응시켜 적흑색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 524 [M + H]+.
단계 7. 6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)-8-(3-메틸벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1366)
일반 절차 F에 따라, 6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-2-(퓨란-2-일메틸렌)-8-(3-메틸벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(0.40 m㏖)을 소듐 보로하이드라이드(45㎎, 1.2 m㏖)와 반응시켜 주황색 고체로서 목적하는 생성물(160㎎, 2단계에 걸쳐 75%)을 수득하였다. ESI MS m/z 526 [M + H]+.
단계 8. 2-(퓨란-2-일메틸)-6-(3-하이드록시페닐)-8-(3-메틸벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1368)
일반 절차 G에 따라, 6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)-8-(3-메틸벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(160㎎, 0.30 m㏖)을 HCl(1㎖, 6M)과 반응시켜 주황색 고체로서 목적하는 생성물(83㎎, 66%)을 수득하였다. ESI MS m/z 412 [M + H]+.
실시예 12. 6-(2-플루오로-3-하이드록시페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)-8-(3-메틸벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1370)
단계 1. tert-뷰틸 2-((5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-3-(3-메틸벤질)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(JRW-1353)
다이옥세인(5㎖) 중 tert-뷰틸 2-((5-브로모-3-(3-메틸벤질)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(200㎎, 0.43 m㏖)의 용액에 (3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)보론산(172㎎, 0.64 m㏖)을 첨가하였다. 용액을 질소로 퍼지하면서, [1,1'-비스(다이페닐포스피노)페로센]다이클로로팔라듐(II)(34㎎, 0.043 m㏖) 및 세슘 카보네이트(0.85㎖, 1M, 0.85 m㏖)를 첨가하였다. 반응물을 60℃에서 18시간 동안 교반하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트와 물로 희석하고, 수성 층을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 농축시키고, 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 황색 거품으로서 미정제 생성물(210㎎, 80%)을 수득하였다. ESI MS m/z 616 [M + H]+.
단계 2. 2-((5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-3-(3-메틸벤질)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(JRW-1359)
일반 절차 D에 따라, tert-뷰틸 2-((5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-3-(3-메틸벤질)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(210㎎, 0.34 m㏖)를 TFA(1㎖)와 반응시켜 갈색 오일로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 560 [M + H]+.
단계 3. 6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸렌)-8-(3-메틸벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(JRW-1367)
일반 절차 E에 따라, 2-((5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-3-(3-메틸벤질)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(0.34 m㏖)을 CDI(110㎎, 0.68 m㏖)와 반응시켜 적흑색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 542 [M + H]+.
단계 4. 6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)-8-(3-메틸벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1369)
일반 절차 F에 따라, 6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸렌)-8-(3-메틸벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(0.34 m㏖)을 소듐 보로하이드라이드(38㎎, 1.0 m㏖)와 반응시켜 주황색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 544 [M + H]+.
단계 5. 6-(2-플루오로-3-하이드록시페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)-8-(3-메틸벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1370)
일반 절차 G에 따라, 6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)-8-(3-메틸벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(0.34 m㏖)을 HCl(1㎖, 6M)과 반응시켜 주황색 고체로서 목적하는 생성물(88㎎, 4단계에 걸쳐 60%)을 수득하였다. ESI MS m/z 430 [M + H]+.
실시예 13. 8-벤질-6-(2-플루오로-3-하이드록시페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1404)
단계 1. tert-뷰틸 2-((3-벤질-5-브로모피라진-2-일)아미노)-2-(다이에톡시포스포릴)아세테이트(JRW-1350)
일반 절차 A에 따라, 5-브로모-3-(3-메틸벤질)피라진-2-아민(1.0g, 3.8 m㏖)을 tert-뷰틸 2-다이아조-2-(다이에톡시포스포릴)아세테이트(1.26g, 4.5 m㏖)와 반응시켜 갈색 오일로서 목적하는 생성물(1.7g, 87%)을 수득하였다. ESI MS m/z 514 [M + H]+.
단계 2. tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-브로모피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(JRW-1372)
일반 절차 B에 따라, tert-뷰틸 2-((3-벤질-5-브로모피라진-2-일)아미노)-2-(다이에톡시포스포릴)아세테이트(1.1g, 3.3 m㏖)를 퍼퓨랄(0.47g, 5.0 m㏖)과 반응시켜 주황색 오일로서 목적하는 생성물(1.3g, 74%)을 수득하였다. ESI MS m/z 456 [M + H]+.
단계 3. tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(JRW-1394)
일반 절차 C에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-브로모피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.20g, 0.44 m㏖)를 (3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)보론산(0.18g, 0.66 m㏖)과 반응시켜 황색 거품으로서 목적하는 생성물(0.16g, 59%)을 수득하였다. ESI MS m/z 602 [M + H]+.
단계 4. (Z)-2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(JRW-1398)
일반 절차 D에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.16g, 0.26 m㏖)를 트라이플루오로아세트산(1㎖)과 반응시켜 갈색 오일로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 546 [M + H]+.
단계 5. (Z)-8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(JRW-1400)
일반 절차 E에 따라, (Z)-2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(0.26 m㏖)을 다이(1H-이미다졸-1-일)메탄온(0.084g, 0.52 m㏖)과 반응시켜 적갈색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 528 [M + H]+.
단계 6. 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1402)
일반 절차 F에 따라, (Z)-8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(0.26 m㏖)을 소듐 보로하이드라이드(0.049g, 1.3 m㏖)와 반응시켜 갈색 거품으로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 530 [M + H]+.
단계 7. 8-벤질-6-(2-플루오로-3-하이드록시페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1404)
일반 절차 G에 따라, 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(0.26 m㏖)을 HCl(1㎖, 6M)과 반응시켜 주황색-갈색 거품으로서 목적하는 생성물(0.071g, 4단계에 걸쳐 65%)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, 메탄올-d4) δ 7.72(s, 1H), 7.47 - 7.38(m, 3H), 7.36 - 7.29(m, 2H), 7.29 - 7.22(m, 1H), 7.16 - 7.01(m, 3H), 6.34(dd, J = 3.2, 1.9 Hz, 1H), 6.13(dd, J = 3.2, 1.0 Hz, 1H), 4.42(s, 2H), 4.22(s, 2H); ESI MS m/z 416 [M + H]+.
실시예 14. 8-벤질-6-(2-플루오로-5-하이드록시페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1405)
단계 1. tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(5-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(JRW-1395)
일반 절차 C에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-브로모피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.20g, 0.44 m㏖)를 (5-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)보론산(0.18g, 0.66 m㏖)과 반응시켜 황색 거품으로서 목적하는 생성물(0.18g, 67%)을 수득하였다. ESI MS m/z 602 [M + H]+.
단계 2. (Z)-2-((3-벤질-5-(5-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(JRW-1399)
일반 절차 D에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(5-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.18g, 0.29 m㏖)를 트라이플루오로아세트산(1㎖)과 반응시켜 갈색 오일로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 546 [M + H]+.
단계 3. (Z)-8-벤질-6-(5-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(JRW-1401)
일반 절차 E에 따라, (Z)-2-((3-벤질-5-(5-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(0.29 m㏖)을 다이(1H-이미다졸-1-일)메탄온(0.094g, 0.58 m㏖)과 반응시켜 흑자색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 528 [M + H]+.
단계 4. 8-벤질-6-(5-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1403)
일반 절차 F에 따라, (Z)-8-벤질-6-(5-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(0.29 m㏖)을 소듐 보로하이드라이드(0.054g, 1.4 m㏖)와 반응시켜 주황색-갈색 거품으로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 530 [M + H]+.
단계 5. 8-벤질-6-(2-플루오로-5-하이드록시페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1405)
일반 절차 G에 따라, 8-벤질-6-(5-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(0.29 m㏖)을 HCl(1㎖, 6M)과 반응시켜 갈색-주황색 거품으로서 목적하는 생성물(0.083g, 4단계에 걸쳐 69%)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, 메탄올-d4) δ 7.49 - 7.37(m, 3H), 7.37 - 7.21(m, 3H), 7.16 - 6.99(m, 2H), 6.94 - 6.85(m, 1H), 6.34(dd, J = 3.2, 1.9 Hz, 1H), 6.19 - 6.06(m, 1H), 4.42(s, 2H), 4.21(s, 2H); ESI MS m/z 416 [M + H]+.
실시예 15. 6-(5-아미노-2-플루오로페닐)-8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1411)
단계 1. tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(5-((tert-뷰톡시카보닐)아미노)-2-플루오로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(JRW-1406)
일반 절차 C에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-브로모피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.25g, 0.55 m㏖)를 (5-((tert-뷰톡시카보닐)아미노)-2-플루오로페닐)보론산(0.21g, 0.82 m㏖)과 반응시켜 밝은 황색 거품으로서 목적하는 생성물(0.30g, 94%)을 수득하였다. ESI MS m/z 587 [M + H]+.
단계 2. (Z)-2-((5-(5-아미노-2-플루오로페닐)-3-벤질피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(JRW-1408)
일반 절차 D에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(5-((tert-뷰톡시카보닐)아미노)-2-플루오로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.30g, 0.51 m㏖)를 트라이플루오로아세트산(1㎖)과 반응시켜 흑녹색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 431 [M + H]+.
단계 3. (Z)-6-(5-아미노-2-플루오로페닐)-8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(JRW-1410)
일반 절차 E에 따라, (Z)-2-((5-(5-아미노-2-플루오로페닐)-3-벤질피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(0.51 m㏖)을 다이(1H-이미다졸-1-일)메탄온(0.25g, 1.5 m㏖)과 반응시켜 적흑색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 413 [M + H]+.
단계 4. 6-(5-아미노-2-플루오로페닐)-8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1411)
일반 절차 F에 따라, (Z)-6-(5-아미노-2-플루오로페닐)-8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(0.51 m㏖)을 소듐 보로하이드라이드(0.058g, 1.5 m㏖)와 반응시켜 주황색 고체로서 목적하는 생성물(0.006g, 3단계에 걸쳐 2%)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, 메탄올-d4) δ 7.70(s, 1H), 7.47 - 7.36(m, 3H), 7.36 - 7.19(m, 4H), 7.07 - 6.87(m, 2H), 6.84 - 6.77(m, 1H), 6.34(dd, J = 3.2, 1.9 Hz, 1H), 6.12(dd, J = 3.2, 1.0 Hz, 1H), 4.41(s, 2H), 4.21(s, 2H); ESI MS m/z 415 [M + H]+.
실시예 16. 8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸)-6-(3-나이트로페닐)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1424)
단계 1. tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(3-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(JRW-1417)
일반 절차 C에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-브로모피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.34g, 0.74 m㏖)를 (3-나이트로페닐)보론산(0.19g, 1.1 m㏖)과 반응시켜 주황색 고체로서 목적하는 생성물(0.37g, 99%)을 수득하였다. ESI MS m/z 499 [M + H]+.
단계 2. (Z)-2-((3-벤질-5-(3-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(JRW-1421)
일반 절차 D에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(3-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.26g, 0.52 m㏖)를 트라이플루오로아세트산(1㎖)과 반응시켜 갈색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 443 [M + H]+.
단계 3. (Z)-8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸렌)-6-(3-나이트로페닐)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(JRW-1423)
일반 절차 E에 따라, (Z)-2-((3-벤질-5-(3-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(0.52 m㏖)을 다이(1H-이미다졸-1-일)메탄온(0.17g, 1.0 m㏖)과 반응시켜 적흑색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 425 [M + H]+.
단계 4. 8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸)-6-(3-나이트로페닐)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1424)
일반 절차 F에 따라, (Z)-8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸렌)-6-(3-나이트로페닐)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(0.52 m㏖)을 소듐 보로하이드라이드(0.098g, 2.6 m㏖)와 반응시켜 어두운 주황색 고체로서 목적하는 생성물(0.13g, 3단계에 걸쳐 60%)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, 메탄올-d4) δ 8.75(s, 1H), 8.35 - 8.12(m, 3H), 7.74(t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.49 - 7.38(m, 3H), 7.37 - 7.29(m, 2H), 7.29 - 7.20(m, 1H), 6.34(dd, J = 3.2, 1.9 Hz, 1H), 6.12(dd, J = 3.2, 1.0 Hz, 1H), 4.49(s, 2H), 4.22(s, 2H); ESI MS m/z 427 [M + H]+.
실시예 17. 8-벤질-6-(3-클로로-5-하이드록시페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1479)
단계 1. tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-5-클로로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(JRW-1470)
일반 절차 C에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-브로모피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.20g, 0.44 m㏖)를 (3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-5-클로로페닐)보론산(0.25g, 0.87 m㏖)과 반응시켜 밝은 갈색 거품으로서 목적하는 생성물(0.24g, 88%)을 수득하였다. ESI MS m/z 618 [M + H]+.
단계 2. (Z)-2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-5-클로로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(JRW-1474)
일반 절차 D에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-5-클로로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.24g, 0.39 m㏖)를 트라이플루오로아세트산(1㎖)과 반응시켜 갈색 오일로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 562 [M + H]+.
단계 3. (Z)-8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-5-클로로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(JRW-1476)
일반 절차 E에 따라, (Z)-2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-5-클로로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(0.39 m㏖)을 다이(1H-이미다졸-1-일)메탄온(0.13g, 0.78 m㏖)과 반응시켜 적색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 544 [M + H]+.
단계 4. 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-5-클로로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1477)
일반 절차 F에 따라, (Z)-8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-5-클로로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(0.39 m㏖)을 소듐 보로하이드라이드(0.044g, 1.2 m㏖)와 반응시켜 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 546 [M + H]+.
단계 5. 8-벤질-6-(3-클로로-5-하이드록시페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1479)
일반 절차 G에 따라, 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-5-클로로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(0.39 m㏖)을 HCl(1㎖, 6M)과 반응시켜 주황색 거품으로서 목적하는 생성물(0.12g, 4단계에 걸쳐 71%)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, 메탄올-d4) δ 7.85(s, 1H), 7.47 - 7.36(m, 3H), 7.36 - 7.29(m, 2H), 7.29 - 7.17(m, 2H), 7.08(s, 1H), 6.90(t, J = 2.1 Hz, 1H), 6.34(dd, J = 3.2, 1.9 Hz, 1H), 6.12(dd, J = 3.2, 1.0 Hz, 1H), 4.44(s, 2H), 4.21(s, 2H); ESI MS m/z 432 [M + H]+.
실시예 18. 6-(3-아미노-2-플루오로페닐)-8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1482)
단계 1. tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(2-플루오로-3-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(JRW-1469)
일반 절차 C에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-브로모피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.20g, 0.44 m㏖)를 (2-플루오로-3-나이트로페닐)보론산(0.12g, 0.66 m㏖)과 반응시켜 황색 고체로서 목적하는 생성물(0.22g, 97%)을 수득하였다. ESI MS m/z 517 [M + H]+.
단계 2. (Z)-2-((3-벤질-5-(2-플루오로-3-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(JRW-1471)
일반 절차 D에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(2-플루오로-3-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.22g, 0.42 m㏖)를 트라이플루오로아세트산(1㎖)과 반응시켜 주황색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 461 [M + H]+.
단계 3. (Z)-8-벤질-6-(2-플루오로-3-나이트로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(JRW-1473)
일반 절차 E에 따라, (Z)-2-((3-벤질-5-(2-플루오로-3-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(0.43 m㏖)을 다이(1H-이미다졸-1-일)메탄온(0.14g, 0.85 m㏖)과 반응시켜 적색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 443 [M + H]+.
단계 4. 8-벤질-6-(2-플루오로-3-나이트로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1475)
일반 절차 F에 따라, (Z)-8-벤질-6-(2-플루오로-3-나이트로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(0.42 m㏖)을 소듐 보로하이드라이드(0.048g, 1.3 m㏖)와 반응시켜 목적하는 생성물(0.17g, 3단계에 걸쳐 90%)을 수득하였다. ESI MS m/z 445 [M + H]+.
단계 5. 6-(3-아미노-2-플루오로페닐)-8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1482)
일반 절차 H에 따라, 8-벤질-6-(2-플루오로-3-나이트로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(0.17g, 0.38 m㏖)을 수소(1atm)와 반응시켜 주황색 고체로서 목적하는 생성물(0.058g, 37%)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, 메탄올-d4) δ 7.67(s, 1H), 7.47 - 7.38(m, 3H), 7.37 - 7.29(m, 2H), 7.29 - 7.19(m, 1H), 7.07 - 6.99(m, 1H), 6.96(td, J = 8.2, 1.8 Hz, 1H), 6.83(s, 1H), 6.34(dd, J = 3.2, 1.9 Hz, 1H), 6.13(dd, J = 3.2, 1.0 Hz, 1H), 4.41(s, 2H), 4.22(s, 2H); ESI MS m/z 415 [M + H]+.
실시예 19. 8-벤질-6-(4-클로로-3-하이드록시페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1483)
단계 1. tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-4-클로로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(JRW-1472)
일반 절차 C에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-브로모피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.20g, 0.44 m㏖)를 (3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-4-클로로페닐)보론산(0.25g, 0.88 m㏖) 주황색 고체로서 목적하는 생성물(0.23g, 84%)을 수득하였다. ESI MS m/z 618 [M + H]+.
단계 2. (Z)-2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-4-클로로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(JRW-1478)
일반 절차 D에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-4-클로로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.23g, 0.37 m㏖)를 트라이플루오로아세트산(1㎖)과 반응시켜 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 562 [M + H]+.
단계 3. (Z)-8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-4-클로로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(JRW-1480)
일반 절차 E에 따라, (Z)-2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-4-클로로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(0.37 m㏖)을 다이(1H-이미다졸-1-일)메탄온(0.12g, 0.74 m㏖) 흑색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 544 [M + H]+.
단계 4. 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-4-클로로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1481)
일반 절차 F에 따라, (Z)-8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-4-클로로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(0.37 m㏖)을 소듐 보로하이드라이드(0.070g, 1.8 m㏖)와 반응시켜 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 546 [M + H]+.
단계 5. 8-벤질-6-(4-클로로-3-하이드록시페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1483)
일반 절차 G에 따라, 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-4-클로로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(0.37 m㏖)을 HCl(1㎖, 6M)과 반응시켜 어두운 주황색 고체로서 목적하는 생성물(0.11g, 4단계에 걸쳐 66%)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, 메탄올-d4) δ 7.49 - 7.36(m, 5H), 7.36 - 7.21(m, 4H), 7.18(s, 1H), 6.34(dd, J = 3.2, 1.9 Hz, 1H), 6.16 - 6.09(m, 1H), 4.44(s, 2H), 4.21(s, 2H); ESI MS m/z 432 [M + H]+.
실시예 20. 8-벤질-6-(2-클로로-3-하이드록시페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1488)
단계 1. tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-클로로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(JRW-1484)
일반 절차 C에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-브로모피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.20g, 0.44 m㏖)를 tert-뷰틸(2-클로로-3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-다이옥사보로란-2-일)페녹시)다이메틸실레인(0.24g, 0.66 m㏖)과 반응시켜 황색 고체로서 목적하는 생성물(0.19g, 69%)을 수득하였다. ESI MS m/z 618 [M + H]+.
단계 2. (Z)-2-((3-벤질-5-(2-클로로-3-하이드록시페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(JRW-1485)
일반 절차 D에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-클로로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.18g, 0.29 m㏖)를 트라이플루오로아세트산(1㎖)과 반응시켜 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 448 [M + H]+.
단계 3. (Z)-8-벤질-6-(2-클로로-3-하이드록시페닐)-2-(퓨란-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(JRW-1487)
일반 절차 E에 따라, (Z)-2-((3-벤질-5-(2-클로로-3-하이드록시페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(0.29 m㏖)을 다이(1H-이미다졸-1-일)메탄온(0.094g, 0.58 m㏖)과 반응시켜 적색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 430 [M + H]+.
단계 4. 8-벤질-6-(2-클로로-3-하이드록시페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1488)
일반 절차 F에 따라, (Z)-8-벤질-6-(2-클로로-3-하이드록시페닐)-2-(퓨란-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(0.29 m㏖)을 소듐 보로하이드라이드(0.055g, 1.4 m㏖)와 반응시켜 주황색 고체로서 목적하는 생성물(0.076g, 3단계에 걸쳐 60%)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, 메탄올-d4) δ 7.50(s, 1H), 7.45 - 7.38(m, 3H), 7.36 - 7.22(m, 4H), 7.09(dd, J = 8.3, 1.5 Hz, 1H), 7.03(dd, J = 7.5, 1.5 Hz, 1H), 6.34(dd, J = 3.2, 1.9 Hz, 1H), 6.14(dd, J = 3.2, 1.0 Hz, 1H), 4.39(s, 2H), 4.23(s, 2H); ESI MS m/z 432 [M + H]+.
실시예 21. 8-(4-플루오로벤질)-2-(퓨란-2-일메틸)-6-(3-하이드록시페닐)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1498)
단계 1. 5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)피라진-2-아민(JRW-1407)
일반 절차 C에 따라, 5-브로모피라진-2-아민(1.0g, 5.7 m㏖)을 (3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)보론산(1.7g, 6.9 m㏖)과 반응시켜 백색 고체로서 목적하는 생성물(1.56g, 90%)을 수득하였다. ESI MS m/z 302 [M + H]+.
단계 2. 3-브로모-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)피라진-2-아민(JRW-1409)
DMF(20㎖) 중 5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)피라진-2-아민(1.56g, 5.2 m㏖)의 용액을 제조하고, 얼음 수조로 냉각시키고, N-브로모석신아마이드(1.0g, 5.7 m㏖)를 첨가하고, 반응물을 30분 동안 교반하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트와 물로 희석하고, 수성 층을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 농축시키고, 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 갈색 고체로서 목적하는 생성물(1.5g, 76%)을 수득하였다. ESI MS m/z 380 [M + H]+.
단계 3. 5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-3-(4-플루오로벤질)피라진-2-아민(JRW-1412)
일반 절차 C에 따라, 3-브로모-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)피라진-2-아민(0.50g, 1.3 m㏖)을 2-(4-플루오로벤질)-4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-다이옥사보로레인(0.47g, 2.0 m㏖)과 반응시켜 주황색 고체로서 목적하는 생성물(0.28g, 52%)을 수득하였다. ESI MS m/z 410 [M + H]+.
단계 4. tert-뷰틸 2-((5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-3-(4-플루오로벤질)피라진-2-일)아미노)-2-(다이에톡시포스포릴)아세테이트(JRW-1489)
일반 절차 A에 따라, 5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-3-(4-플루오로벤질)피라진-2-아민(0.28g, 0.68 m㏖)을 tert-뷰틸 2-다이아조-2-(다이에톡시포스포릴)아세테이트(0.28g, 1.0 m㏖)와 반응시켜 갈색 오일로서 목적하는 생성물(0.28g, 62%)을 수득하였다. ESI MS m/z 660 [M + H]+.
단계 5. tert-뷰틸(Z)-2-((5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-3-(4-플루오로벤질)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(JRW-1490)
일반 절차 B에 따라, tert-뷰틸 2-((5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-3-(4-플루오로벤질)피라진-2-일)아미노)-2-(다이에톡시포스포릴)아세테이트(0.28g, 0.42 m㏖)를 퍼퓨랄(0.081g, 0.84 m㏖)과 반응시켜 목적하는 생성물(0.15g, 59%)을 수득하였다. ESI MS m/z 602 [M + H]+.
단계 6. (Z)-2-((5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-3-(4-플루오로벤질)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(JRW-1493)
일반 절차 D에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-3-(4-플루오로벤질)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.15g, 0.25 m㏖)를 트라이플루오로아세트산(1㎖)과 반응시켜 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 546 [M + H]+.
단계 7. (Z)-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-8-(4-플루오로벤질)-2-(퓨란-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(JRW-1495)
일반 절차 E에 따라, (Z)-2-((5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-3-(4-플루오로벤질)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(0.25 m㏖)을 다이(1H-이미다졸-1-일)메탄온(0.081g, 0.50 m㏖)과 반응시켜 적색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 528 [M + H]+.
단계 8. 6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-8-(4-플루오로벤질)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1497)
일반 절차 F에 따라, (Z)-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-8-(4-플루오로벤질)-2-(퓨란-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(0.25 m㏖)을 소듐 보로하이드라이드(0.047g, 1.2 m㏖)와 반응시켜 적색-주황색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 530 [M + H]+.
단계 9. 8-(4-플루오로벤질)-2-(퓨란-2-일메틸)-6-(3-하이드록시페닐)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1498)
일반 절차 G에 따라, 6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)페닐)-8-(4-플루오로벤질)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(0.25 m㏖)을 HCl(1㎖, 6M)과 반응시켜 주황색-갈색 거품으로서 목적하는 생성물(0.083g, 4단계에 걸쳐 77%)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, 메탄올-d4) δ 7.74(s, 1H), 7.50 - 7.37(m, 3H), 7.32(t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.20 - 7.00(m, 4H), 6.93 - 6.88(m, 1H), 6.34(dd, J = 3.2, 1.9 Hz, 1H), 6.13(dd, J = 3.2, 1.0 Hz, 1H), 4.42(s, 2H), 4.21(s, 2H); ESI MS m/z 416 [M + H]+.
실시예 22. 8-벤질-6-(2-클로로-5-하이드록시페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1525)
단계 1. tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(2-클로로-5-하이드록시페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(JRW-1515)
일반 절차 C에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-브로모피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.20g, 0.44 m㏖)를 (2-클로로-5-하이드록시페닐)보론산(0.15g, 0.088 m㏖)과 반응시켜 황색 거품으로서 목적하는 생성물(0.22g, 99%)을 수득하였다. ESI MS m/z 504 [M + H]+.
단계 2. (Z)-2-((3-벤질-5-(2-클로로-5-하이드록시페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(JRW-1519)
일반 절차 D에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(2-클로로-5-하이드록시페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.22g, 0.44 m㏖)를 트라이플루오로아세트산(1㎖)과 반응시켜 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 448 [M + H]+.
단계 3. (Z)-8-벤질-6-(2-클로로-5-하이드록시페닐)-2-(퓨란-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(JRW-1523)
일반 절차 E에 따라, (Z)-2-((3-벤질-5-(2-클로로-5-하이드록시페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(0.44 m㏖)을 다이(1H-이미다졸-1-일)메탄온(0.14g, 0.089 m㏖)과 반응시켜 적흑색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 430 [M + H]+.
단계 4. 8-벤질-6-(2-클로로-5-하이드록시페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1525)
일반 절차 F에 따라, (Z)-8-벤질-6-(2-클로로-5-하이드록시페닐)-2-(퓨란-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(0.44 m㏖)을 소듐 보로하이드라이드(0.051g, 1.3 m㏖)와 반응시켜 주황색 고체로서 목적하는 생성물(0.12g, 3단계에 걸쳐 64%)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, 메탄올-d4) δ 7.84(s, 1H), 7.47 - 7.37(m, 3H), 7.36 - 7.29(m, 2H), 7.29 - 7.21(m, 1H), 7.03 - 6.88(m, 2H), 6.62(dt, J = 10.5, 1.9 Hz, 1H), 6.33(dd, J = 3.2, 1.9 Hz, 1H), 6.12(dd, J = 3.2, 0.9 Hz, 1H), 4.44(s, 2H), 4.21(s, 2H); ESI MS m/z 432 [M + H]+.
실시예 23. 8-벤질-6-(3-플루오로-5-하이드록시페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1526)
단계 1. tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(3-플루오로-5-하이드록시페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(JRW-1516)
일반 절차 C에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-브로모피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.20g, 0.44 m㏖)를 (3-플루오로-5-하이드록시페닐)보론산(0.14g, 0.088 m㏖)과 반응시켜 황색 거품으로서 목적하는 생성물(0.20g, 94%)을 수득하였다. ESI MS m/z 488 [M + H]+.
단계 2. (Z)-2-((3-벤질-5-(3-플루오로-5-하이드록시페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(JRW-1520)
일반 절차 D에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(3-플루오로-5-하이드록시페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.20g, 0.41 m㏖)를 트라이플루오로아세트산(1㎖)과 반응시켜 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 432 [M + H]+.
단계 3. (Z)-8-벤질-6-(3-플루오로-5-하이드록시페닐)-2-(퓨란-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(JRW-1524)
일반 절차 E에 따라, (Z)-2-((3-벤질-5-(3-플루오로-5-하이드록시페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(0.41 m㏖)을 다이(1H-이미다졸-1-일)메탄온(0.13g, 0.082 m㏖)과 반응시켜 자흑색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 414 [M + H]+.
단계 4. 8-벤질-6-(3-플루오로-5-하이드록시페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1526)
일반 절차 F에 따라, (Z)-8-벤질-6-(3-플루오로-5-하이드록시페닐)-2-(퓨란-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(0.41 m㏖)을 소듐 보로하이드라이드(0.047g, 1.2 m㏖)와 반응시켜 갈색-주황색 거품으로서 목적하는 생성물(0.13g, 3단계에 걸쳐 76%)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, 메탄올-d4) δ 7.50(s, 1H), 7.45 - 7.37(m, 3H), 7.37 - 7.18(m, 4H), 6.97(d, J = 2.9 Hz, 1H), 6.92(dd, J = 8.7, 2.9 Hz, 1H), 6.34(dd, J = 3.2, 1.9 Hz, 1H), 6.14(dt, J = 3.2, 1.0 Hz, 1H), 4.39(s, 2H), 4.22(s, 2H); ESI MS m/z 416 [M + H]+.
실시예 24. 6-(3-아미노-5-플루오로페닐)-8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1535)
단계 1. tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(3-플루오로-5-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(JRW-1527)
일반 절차 C에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-브로모피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.20g, 0.44 m㏖)를 2-(3-플루오로-5-나이트로페닐)-4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-다이옥사보로레인(0.23g, 0.088 m㏖)과 반응시켜 황색-주황색 거품으로서 목적하는 생성물(0.21g, 92%)을 수득하였다. ESI MS m/z 517 [M + H]+.
단계 2. (Z)-2-((3-벤질-5-(3-플루오로-5-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(JRW-1529)
일반 절차 D에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(3-플루오로-5-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.21g, 0.41 m㏖)를 트라이플루오로아세트산(1㎖)과 반응시켜 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 461 [M + H]+.
단계 3. (Z)-8-벤질-6-(3-플루오로-5-나이트로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(JRW-1531)
일반 절차 E에 따라, (Z)-2-((3-벤질-5-(3-플루오로-5-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(0.41 m㏖)을 다이(1H-이미다졸-1-일)메탄온(0.13g, 0.081 m㏖)과 반응시켜 적색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 443 [M + H]+.
단계 4. 8-벤질-6-(3-플루오로-5-나이트로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1533)
일반 절차 F에 따라, (Z)-8-벤질-6-(3-플루오로-5-나이트로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(0.41 m㏖)을 소듐 보로하이드라이드(0.076g, 2.0 m㏖)와 반응시켜 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 445 [M + H]+.
단계 5. 6-(3-아미노-5-플루오로페닐)-8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1535)
일반 절차 H에 따라, 8-벤질-6-(3-플루오로-5-나이트로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(0.41 m㏖)을 수소(1atm)와 반응시켜 주황색-갈색 거품으로서 목적하는 생성물(0.037g, 4단계에 걸쳐 22%)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, 메탄올-d4) δ 7.74(s, 1H), 7.47 - 7.36(m, 3H), 7.36 - 7.28(m, 2H), 7.28 - 7.18(m, 1H), 6.85 - 6.70(m, 1H), 6.70 - 6.57(m, 1H), 6.48(dt, J = 11.0, 2.2 Hz, 1H), 6.33(dd, J = 3.2, 1.9 Hz, 1H), 6.12(dd, J = 3.2, 1.0 Hz, 1H), 4.43(s, 2H), 4.21(s, 2H); ESI MS m/z 415 [M + H]+.
실시예 25. 6-(3-아미노-4-플루오로페닐)-8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1536)
단계 1. tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(4-플루오로-3-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(JRW-1528)
일반 절차 C에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-브로모피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.20g, 0.44 m㏖)를 (4-플루오로-3-나이트로페닐)보론산(0.16g, 0.088 m㏖)과 반응시켜 황색 거품으로서 목적하는 생성물(0.20g, 88%)을 수득하였다. ESI MS m/z 517 [M + H]+.
단계 2. (Z)-2-((3-벤질-5-(4-플루오로-3-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(JRW-1530)
일반 절차 D에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(4-플루오로-3-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.20g, 0.39 m㏖)를 트라이플루오로아세트산(1㎖)과 반응시켜 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 461 [M + H]+.
단계 3. (Z)-8-벤질-6-(4-플루오로-3-나이트로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(JRW-1532)
일반 절차 E에 따라, (Z)-2-((3-벤질-5-(4-플루오로-3-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(0.39 m㏖)을 다이(1H-이미다졸-1-일)메탄온(0.12g, 0.077 m㏖)과 반응시켜 적흑색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 443 [M + H]+.
단계 4. 8-벤질-6-(4-플루오로-3-나이트로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1534)
일반 절차 F에 따라, (Z)-8-벤질-6-(4-플루오로-3-나이트로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(0.39 m㏖)을 소듐 보로하이드라이드(0.073g, 1.9 m㏖)와 반응시켜 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 445 [M + H]+.
단계 5. 6-(3-아미노-4-플루오로페닐)-8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1536)
일반 절차 H에 따라, 8-벤질-6-(4-플루오로-3-나이트로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(0.41 m㏖)을 수소(1atm)와 반응시켜 주황색-갈색 거품으로서 목적하는 생성물(0.028g, 4단계에 걸쳐 17%)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, 메탄올-d4) δ 7.65(s, 1H), 7.47 - 7.38(m, 3H), 7.36 - 7.28(m, 2H), 7.28 - 7.20(m, 1H), 7.17 - 7.01(m, 2H), 6.95 - 6.82(m, 1H), 6.33(dd, J = 3.2, 1.9 Hz, 1H), 6.13(dd, J = 3.2, 1.0 Hz, 1H), 4.43(s, 2H), 4.21(s, 2H); ESI MS m/z 415 [M + H]+.
실시예 26. 6-(3-아미노-2-플루오로페닐)-8-벤질-2-(3-(메톡시메틸)벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1609)
단계 1. tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-브로모피라진-2-일)아미노)-3-(3-(메톡시메틸)페닐)아실레이트(JRW-1598)
일반 절차 B에 따라, tert-뷰틸 2-((3-벤질-5-브로모피라진-2-일)아미노)-2-(다이에톡시포스포릴)아세테이트(0.33g, 0.64 m㏖)를 3-(메톡시메틸)벤즈알데하이드(0.12g, 0.77 m㏖)와 반응시켜 목적하는 생성물(0.094g, 28%)을 수득하였다. ESI MS m/z 511 [M + H]+.
단계 2. tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(2-플루오로-3-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(3-(메톡시메틸)페닐)아실레이트(JRW-1600)
일반 절차 C에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-브로모피라진-2-일)아미노)-3-(3-(메톡시메틸)페닐)아실레이트(0.09g, 0.18 m㏖)를 2-(2-플루오로-3-나이트로페닐)-4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-다이옥사보로레인(0.070g, 0.26 m㏖)과 반응시켜 황색 고체로서 목적하는 생성물(0.077g, 77%)을 수득하였다. ESI MS m/z 571 [M + H]+.
단계 3. (Z)-2-((3-벤질-5-(2-플루오로-3-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(3-(메톡시메틸)페닐)아크릴산(JRW-1601)
일반 절차 D에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(2-플루오로-3-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(3-(메톡시메틸)페닐)아실레이트(0.077g, 0.13 m㏖)를 트라이플루오로아세트산(1㎖)과 반응시켜 밝은 적색 오일로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 515 [M + H]+.
단계 4. (Z)-8-벤질-6-(2-플루오로-3-나이트로페닐)-2-(3-(메톡시메틸)벤질리덴)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(JRW-1603)
일반 절차 E에 따라, (Z)-2-((3-벤질-5-(2-플루오로-3-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(3-(메톡시메틸)페닐)아크릴산(0.14 m㏖)을 다이(1H-이미다졸-1-일)메탄온(0.044g, 0.27 m㏖)과 반응시켜 적색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 497 [M + H]+.
단계 5. 8-벤질-6-(2-플루오로-3-나이트로페닐)-2-(3-(메톡시메틸)벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1604)
일반 절차 F에 따라, (Z)-8-벤질-6-(2-플루오로-3-나이트로페닐)-2-(3-(메톡시메틸)벤질리덴)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(0.14 m㏖)을 소듐 보로하이드라이드(0.025g, 0.67 m㏖)와 반응시켜 주황색 고체로서 목적하는 생성물(0.040g, 3단계에 걸쳐 59%)을 수득하였다. ESI MS m/z 499 [M + H]+.
단계 6. 6-(3-아미노-2-플루오로페닐)-8-벤질-2-(3-(메톡시메틸)벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1609)
일반 절차 H에 따라, 8-벤질-6-(2-플루오로-3-나이트로페닐)-2-(3-(메톡시메틸)벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(0.040g, 0.080 m㏖)을 수소(1atm)와 반응시켜 주황색 고체로서 목적하는 생성물(0.018g, 48%)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, 메탄올-d4) δ 7.73 - 7.58(m, 1H), 7.45 - 7.38(m, 2H), 7.37 - 7.14(m, 8H), 7.06 - 6.99(m, 1H), 6.95(td, J = 8.2, 1.8 Hz, 1H), 6.88 - 6.76(m, 1H), 4.43(s, 2H), 4.40(s, 2H), 4.21(s, 2H), 3.36(s, 3H); ESI MS m/z 467 [M + H]+.
실시예 27. 6-(3-아미노-2-플루오로페닐)-8-벤질-2-((5-(트라이플루오로메틸)퓨란-2-일)메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1610)
단계 1. tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-브로모피라진-2-일)아미노)-3-(5-(트라이플루오로메틸)퓨란-2-일)아실레이트(JRW-1602)
일반 절차 B에 따라, tert-뷰틸 2-((3-벤질-5-브로모피라진-2-일)아미노)-2-(다이에톡시포스포릴)아세테이트(0.38g, 0.74 m㏖)를 5-(트라이플루오로메틸)퓨란-2-카브알데하이드(0.15g, 0.89 m㏖)와 반응시켜 적색 거품으로서 목적하는 생성물(0.21g, 54%)을 수득하였다. ESI MS m/z 525 [M + H]+.
단계 2. tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(2-플루오로-3-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(5-(트라이플루오로메틸)퓨란-2-일)아실레이트(JRW-1605)
일반 절차 C에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-브로모피라진-2-일)아미노)-3-(5-(트라이플루오로메틸)퓨란-2-일)아실레이트(0.080g, 0.15 m㏖)를 2-(2-플루오로-3-나이트로페닐)-4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-다이옥사보로레인(0.061g, 0.23 m㏖)과 반응시켜 밝은 갈색 고체로서 목적하는 생성물(0.080g, 89%)을 수득하였다. ESI MS m/z 585 [M + H]+.
단계 3. (Z)-2-((3-벤질-5-(2-플루오로-3-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(5-(트라이플루오로메틸)퓨란-2-일)아크릴산(JRW-1606)
일반 절차 D에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(2-플루오로-3-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(5-(트라이플루오로메틸)퓨란-2-일)아실레이트(0.10g, 0.17 m㏖)를 트라이플루오로아세트산(1㎖)과 반응시켜 자색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 529 [M + H]+.
단계 4. (Z)-8-벤질-6-(2-플루오로-3-나이트로페닐)-2-((5-(트라이플루오로메틸)퓨란-2-일)메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(JRW-1607)
일반 절차 E에 따라, (Z)-2-((3-벤질-5-(2-플루오로-3-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(5-(트라이플루오로메틸)퓨란-2-일)아크릴산(0.17 m㏖)을 다이(1H-이미다졸-1-일)메탄온(0.055g, 0.34 m㏖)과 반응시켜 적색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 511 [M + H]+.
단계 5. 8-벤질-6-(2-플루오로-3-나이트로페닐)-2-((5-(트라이플루오로메틸)퓨란-2-일)메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1608)
일반 절차 F에 따라, (Z)-8-벤질-6-(2-플루오로-3-나이트로페닐)-2-((5-(트라이플루오로메틸)퓨란-2-일)메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(0.17 m㏖)을 소듐 보로하이드라이드(0.032g, 0.85 m㏖)와 반응시켜 주황색 고체로서 목적하는 생성물(0.071g, 81% 3단계에 걸쳐)을 수득하였다. ESI MS m/z 513 [M + H]+.
단계 6. 6-(3-아미노-2-플루오로페닐)-8-벤질-2-((5-(트라이플루오로메틸)퓨란-2-일)메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1610)
일반 절차 H에 따라, 8-벤질-6-(2-플루오로-3-나이트로페닐)-2-((5-(트라이플루오로메틸)퓨란-2-일)메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(0.071g, 0.14 m㏖)을 수소(1atm)와 반응시켜 주황색-갈색 고체로서 목적하는 생성물(0.012g, 18%)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, 메탄올-d4) δ 7.68(s, 1H), 7.49 - 7.37(m, 2H), 7.35 - 7.22(m, 3H), 7.08 - 7.00(m, 1H), 6.96(td, J = 8.2, 1.8 Hz, 1H), 6.93 - 6.77(m, 2H), 6.33(d, J = 3.4 Hz, 1H), 4.42(s, 2H), 4.29(s, 2H); ESI MS m/z 483 [M + H]+.
실시예 28. 8-벤질-6-(2-플루오로-3-하이드록시페닐)-2-((5-(트라이플루오로메틸)퓨란-2-일)메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1619)
단계 1. tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(5-(트라이플루오로메틸)퓨란-2-일)아실레이트(JRW-1611)
일반 절차 C에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-브로모피라진-2-일)아미노)-3-(5-(트라이플루오로메틸)퓨란-2-일)아실레이트(0.130g, 0.25 m㏖)를 tert-뷰틸(2-플루오로-3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-다이옥사보로란-2-일)페녹시)다이메틸실레인(0.13g, 0.37 m㏖)과 반응시켜 밝은 갈색 거품으로서 목적하는 생성물(0.12g, 75%)을 수득하였다. ESI MS m/z 700 [M + H]+.
단계 2. (Z)-2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(5-(트라이플루오로메틸)퓨란-2-일)아크릴산(JRW-1612)
일반 절차 D에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(5-(트라이플루오로메틸)퓨란-2-일)아실레이트(0.12g, 0.19 m㏖)를 트라이플루오로아세트산(1㎖)과 반응시켜 적색 오일로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 614 [M + H]+.
단계 3. (Z)-8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-2-((5-(트라이플루오로메틸)퓨란-2-일)메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(JRW-1615)
일반 절차 E에 따라, (Z)-2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(5-(트라이플루오로메틸)퓨란-2-일)아크릴산(0.19 m㏖)을 다이(1H-이미다졸-1-일)메탄온(0.060g, 0.37 m㏖)과 반응시켜 자색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 596 [M + H]+.
단계 4. 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-2-((5-(트라이플루오로메틸)퓨란-2-일)메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1618)
일반 절차 F에 따라, (Z)-8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-2-((5-(트라이플루오로메틸)퓨란-2-일)메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(0.19 m㏖)을 소듐 보로하이드라이드(0.035g, 0.93 m㏖)와 반응시켜 황색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 598 [M + H]+.
단계 5. 8-벤질-6-(2-플루오로-3-하이드록시페닐)-2-((5-(트라이플루오로메틸)퓨란-2-일)메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1619)
일반 절차 G에 따라, 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-2-((5-(트라이플루오로메틸)퓨란-2-일)메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(0.19 m㏖)을 HCl(1㎖, 6M)과 반응시켜 목적하는 생성물(0.059g, 4단계에 걸쳐 66%)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, 메탄올-d4) δ 7.71(s, 1H), 7.48 - 7.39(m, 2H), 7.36 - 7.21(m, 3H), 7.16 - 6.98(m, 3H), 6.92 - 6.88(m, 1H), 6.38 - 6.28(m, 1H), 4.42(s, 2H), 4.29(s, 2H); ESI MS m/z 484 [M + H]+.
실시예 29. 8-벤질-6-(2-플루오로-3-하이드록시페닐)-2-(티오펜-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1624)
단계 1. tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-브로모피라진-2-일)아미노)-3-(티오펜-2-일)아실레이트(JRW-1595)
일반 절차 B에 따라, tert-뷰틸 2-((3-벤질-5-브로모피라진-2-일)아미노)-2-(다이에톡시포스포릴)아세테이트(0.32g, 0.62 m㏖)를 티오펜-2-카브알데하이드(0.084g, 0.75 m㏖)와 반응시켜 분홍색 고체로서 목적하는 생성물(0.24g, 83%)을 수득하였다. ESI MS m/z 473 [M + H]+.
단계 2. tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(티오펜-2-일)아실레이트(JRW-1613)
일반 절차 C에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-브로모피라진-2-일)아미노)-3-(티오펜-2-일)아실레이트(0.10g, 0.21 m㏖)를 tert-뷰틸(2-플루오로-3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-다이옥사보로란-2-일)페녹시)다이메틸실레인(0.11g, 0.32 m㏖)과 반응시켜 황색 오일로서 목적하는 생성물(0.10g, 77%)을 수득하였다. ESI MS m/z 618 [M + H]+.
단계 3. (Z)-2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(티오펜-2-일)아크릴산(JRW-1616)
일반 절차 D에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(티오펜-2-일)아실레이트(0.10g, 0.16 m㏖)를 트라이플루오로아세트산(1㎖)과 반응시켜 주황색 유리로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 562 [M + H]+.
단계 4. (Z)-8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-2-(티오펜-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(JRW-1620)
일반 절차 E에 따라, (Z)-2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(티오펜-2-일)아크릴산(0.16 m㏖)을 다이(1H-이미다졸-1-일)메탄온(0.052g, 0.32 m㏖)과 반응시켜 적색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 544 [M + H]+.
단계 5. 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-2-(티오펜-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1622)
일반 절차 F에 따라, (Z)-8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-2-(티오펜-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(0.16 m㏖)을 소듐 보로하이드라이드(0.030g, 0.80 m㏖)와 반응시켜 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 546 [M + H]+.
단계 6. 8-벤질-6-(2-플루오로-3-하이드록시페닐)-2-(티오펜-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1624)
일반 절차 G에 따라, 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-2-(티오펜-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(0.16 m㏖)을 HCl(1㎖, 6M)과 반응시켜 목적하는 생성물(0.042g, 4단계에 걸쳐 61%)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, 메탄올-d4) δ 7.69(s, 1H), 7.48 - 7.39(m, 2H), 7.36 - 7.20(m, 4H), 7.15 - 7.00(m, 3H), 7.00 - 6.90(m, 2H), 4.41(s, 2H), 4.39(s, 2H); ESI MS m/z 432 [M + H]+.
실시예 30. 8-벤질-6-(2-플루오로-3-하이드록시페닐)-2-(4-플루오로벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1634)
단계 1. tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-브로모피라진-2-일)아미노)-3-(4-플루오로페닐)아실레이트(JRW-1596)
일반 절차 B에 따라, tert-뷰틸 2-((3-벤질-5-브로모피라진-2-일)아미노)-2-(다이에톡시포스포릴)아세테이트(0.32g, 0.62 m㏖)를 4-플루오로벤즈알데하이드(0.093g, 0.75 m㏖)와 반응시켜 밝은 적색 고체로서 목적하는 생성물(0.22g, 73%)을 수득하였다. ESI MS m/z 485 [M + H]+.
단계 2. tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(4-플루오로페닐)아실레이트(JRW-1626)
일반 절차 C에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-브로모피라진-2-일)아미노)-3-(4-플루오로페닐)아실레이트(0.10g, 0.21 m㏖)를 tert-뷰틸(2-플루오로-3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-다이옥사보로란-2-일)페녹시)다이메틸실레인(0.11g, 0.31 m㏖)과 반응시켜 백색 거품으로서 목적하는 생성물(0.080g, 61%)을 수득하였다. ESI MS m/z 630 [M + H]+.
단계 3. (Z)-2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(4-플루오로페닐)아크릴산(JRW-1628)
일반 절차 D에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(4-플루오로페닐)아실레이트(0.080g, 0.13 m㏖)를 트라이플루오로아세트산(1㎖)과 반응시켜 주황색 겔로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 574 [M + H]+.
단계 4. (Z)-8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-2-(4-플루오로벤질리덴)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(JRW-1630)
일반 절차 E에 따라, (Z)-2-((3-벤질-5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(4-플루오로페닐)아크릴산(0.13 m㏖)을 다이(1H-이미다졸-1-일)메탄온(0.041g, 0.25 m㏖)과 반응시켜 적색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 556 [M + H]+.
단계 5. 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-2-(4-플루오로벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1632)
일반 절차 F에 따라, (Z)-8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-2-(4-플루오로벤질리덴)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(0.13 m㏖)을 소듐 보로하이드라이드(0.024g, 0.63 m㏖)와 반응시켜 주황색 오일로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 558 [M + H]+.
단계 6. 8-벤질-6-(2-플루오로-3-하이드록시페닐)-2-(4-플루오로벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1634)
일반 절차 G에 따라, 8-벤질-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-2-(4-플루오로벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(0.13 m㏖)을 HCl(1㎖, 6M)과 반응시켜 목적하는 생성물(0.040g, 4단계에 걸쳐 71%)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, 메탄올-d4) δ 7.68(s, 1H), 7.44 - 7.20(m, 7H), 7.16 - 6.95(m, 5H), 4.40(s, 2H), 4.18(s, 2H); ESI MS m/z 432 [M + H]+.
실시예 31. 6-(3-아미노-2-플루오로페닐)-8-벤질-2-(4-플루오로벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1635)
단계 1. tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(2-플루오로-3-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(4-플루오로페닐)아실레이트(JRW-1627)
일반 절차 C에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-브로모피라진-2-일)아미노)-3-(4-플루오로페닐)아실레이트(0.11g, 0.23 m㏖)를 2-(2-플루오로-3-나이트로페닐)-4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-다이옥사보로레인(0.091g, 0.34 m㏖)과 반응시켜 밝은 갈색 고체로서 목적하는 생성물(0.10g, 81%)을 수득하였다. ESI MS m/z 545 [M + H]+.
단계 2. (Z)-2-((3-벤질-5-(2-플루오로-3-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(4-플루오로페닐)아크릴산(JRW-1629)
일반 절차 D에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(2-플루오로-3-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(4-플루오로페닐)아실레이트(0.10g, 0.18 m㏖)를 트라이플루오로아세트산(1㎖)과 반응시켜 주황색 오일로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 489 [M + H]+.
단계 3. (Z)-8-벤질-6-(2-플루오로-3-나이트로페닐)-2-(4-플루오로벤질리덴)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(JRW-1631)
일반 절차 E에 따라, (Z)-2-((3-벤질-5-(2-플루오로-3-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(4-플루오로페닐)아크릴산(0.19 m㏖)을 다이(1H-이미다졸-1-일)메탄온(0.060g, 0.37 m㏖)과 반응시켜 적색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 471 [M + H]+.
단계 4. 8-벤질-6-(2-플루오로-3-나이트로페닐)-2-(4-플루오로벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1633)
일반 절차 F에 따라, (Z)-8-벤질-6-(2-플루오로-3-나이트로페닐)-2-(4-플루오로벤질리덴)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(0.19 m㏖)을 소듐 보로하이드라이드(0.035g, 0.93 m㏖)와 반응시켜 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 473 [M + H]+.
단계 5. 6-(3-아미노-2-플루오로페닐)-8-벤질-2-(4-플루오로벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1635)
일반 절차 H에 따라, 8-벤질-6-(2-플루오로-3-나이트로페닐)-2-(4-플루오로벤질)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(0.19 m㏖)을 수소(1atm)와 반응시켜 주황색 고체로서 목적하는 생성물(0.029g, 4단계에 걸쳐 35%)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, 메탄올-d4) δ 7.64(s, 1H), 7.45 - 7.34(m, 4H), 7.34 - 7.20(m, 3H), 7.07 - 6.91(m, 4H), 6.88 - 6.77(m, 1H), 4.40(s, 2H), 4.18(s, 2H); ESI MS m/z 443 [M + H]+.
실시예 32. 6-(3-아미노-2-메틸페닐)-8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1642)
단계 1. tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(2-메틸-3-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(JRW-1637)
일반 절차 C에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-브로모피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.13g, 0.28 m㏖)를 4,4,5,5-테트라메틸-2-(2-메틸-3-나이트로페닐)-1,3,2-다이옥사보로레인(0.11g, 0.42 m㏖)과 반응시켜 밝은 주황색 고체로서 목적하는 생성물(0.14g, 98%)을 수득하였다. ESI MS m/z 513 [M + H]+.
단계 2. (Z)-2-((3-벤질-5-(2-메틸-3-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(JRW-1639)
일반 절차 D에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(2-메틸-3-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.14g, 0.27 m㏖)를 트라이플루오로아세트산(1㎖)과 반응시켜 주황색 오일로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 457 [M + H]+.
단계 3. (Z)-8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸렌)-6-(2-메틸-3-나이트로페닐)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(JRW-1640)
일반 절차 E에 따라, (Z)-2-((3-벤질-5-(2-메틸-3-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(0.27 m㏖)을 다이(1H-이미다졸-1-일)메탄온(0.087g, 0.54 m㏖)과 반응시켜 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 439 [M + H]+.
단계 4. 8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸)-6-(2-메틸-3-나이트로페닐)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1641)
일반 절차 F에 따라, (Z)-8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸렌)-6-(2-메틸-3-나이트로페닐)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(0.27 m㏖)을 소듐 보로하이드라이드(0.051g, 1.3 m㏖)와 반응시켜 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 441 [M + H]+.
단계 5. 6-(3-아미노-2-메틸페닐)-8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1642)
일반 절차 H에 따라, 8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸)-6-(2-메틸-3-나이트로페닐)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(0.27 m㏖)을 수소(1atm)와 반응시켜 갈색-주황색 고체로서 목적하는 생성물(0.061g, 4단계에 걸쳐 55%)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, 메탄올-d4) δ 7.45 - 7.35(m, 4H), 7.35 - 7.20(m, 3H), 7.07(t, J = 7.8 Hz, 1H), 6.87(dd, J = 7.8, 1.3 Hz, 1H), 6.74(dd, J = 7.4, 1.3 Hz, 1H), 6.35(dd, J = 3.2, 1.9 Hz, 1H), 6.15(dd, J = 3.2, 1.0 Hz, 1H), 4.37(s, 2H), 4.23(s, 2H), 1.97(s, 3H); ESI MS m/z 411 [M + H]+.
실시예 33. 8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸)-6-(3-하이드록시-2-메틸페닐)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1645)
단계 1. tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(3-하이드록시-2-메틸페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(JRW-1636)
일반 절차 C에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-브로모피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.19g, 0.42 m㏖)를 2-메틸-3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-다이옥사보로란-2-일)페놀(0.14g, 0.62 m㏖)과 반응시켜 밝은 적색 거품으로서 목적하는 생성물(0.17g, 84%)을 수득하였다. ESI MS m/z 484 [M + H]+.
단계 2. (Z)-2-((3-벤질-5-(3-하이드록시-2-메틸페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(JRW-1643)
일반 절차 D에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-벤질-5-(3-하이드록시-2-메틸페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.35 m㏖)를 트라이플루오로아세트산(1㎖)과 반응시켜 갈색-주황색 오일로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 428 [M + H]+.
단계 3. (Z)-8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸렌)-6-(3-하이드록시-2-메틸페닐)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(JRW-1644)
일반 절차 E에 따라, (Z)-2-((3-벤질-5-(3-하이드록시-2-메틸페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(0.35 m㏖)을 다이(1H-이미다졸-1-일)메탄온(0.056g, 0.35 m㏖)과 반응시켜 적색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 410 [M + H]+.
단계 4. 8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸)-6-(3-하이드록시-2-메틸페닐)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1645)
일반 절차 F에 따라, (Z)-8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸렌)-6-(3-하이드록시-2-메틸페닐)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(0.35 m㏖)을 소듐 보로하이드라이드(0.066g, 1.7 m㏖)와 반응시켜 목적하는 생성물(0.10g, 3단계에 걸쳐 71%)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, 메탄올-d4) δ 7.45 - 7.35(m, 4H), 7.35 - 7.20(m, 3H), 7.12(t, J = 7.8 Hz, 1H), 6.94 - 6.83(m, 2H), 6.35(dd, J = 3.2, 1.9 Hz, 1H), 6.15(dd, J = 3.2, 1.0 Hz, 1H), 4.37(s, 2H), 4.23(s, 2H), 2.03(s, 3H); ESI MS m/z 412 [M + H]+.
실시예 34. 6-(3-아미노-2-플루오로페닐)-8-(2-플루오로벤질)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1667)
단계 1. 5-브로모-3-(2-플루오로벤질)피라진-2-아민(JRW-1648)
HCl(20㎖, 1M) 중 아연 분말(5.2g, 79.4 m㏖)의 현탁액을 10분 동안 교반하였다. 고체를 여과하고, 메탄올과 THF로 세척하고, 플라스크로 옮기고 진공하에 18시간 동안 건조시켰다. THF(50㎖) 중 1-(브로모메틸)-2-플루오로벤젠(5.0g, 26.5 m㏖)의 용액을 아연 분말에 첨가하였다. 혼합물 환류로 2시간 동안 가열한 후 냉각시키고, 침전시켰다. 상청액을 THF(50㎖) 중 3,5-다이브로모피라진-2-아민(3.0g, 12.0 m㏖)과 비스(트라이페닐포스핀)팔라듐(II) 다이클로라이드(0.42g, 0.60 m㏖)의 용액에 첨가하였다. 현탁액을 50℃로 18시간 동안 가열하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트와 물로 희석하고, 수성 층을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 농축시키고, 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 밝은 황색 고체로서 목적하는 생성물(1.3g, 38%)을 수득하였다. ESI MS m/z 283 [M + H]+.
단계 2. tert-뷰틸 2-((5-브로모-3-(2-플루오로벤질)피라진-2-일)아미노)-2-(다이에톡시포스포릴)아세테이트(JRW-1652)
일반 절차 A에 따라, 5-브로모-3-(2-플루오로벤질)피라진-2-아민(1.3g, 4.6 m㏖)을 tert-뷰틸 2-다이아조-2-(다이에톡시포스포릴)아세테이트(1.9g, 6.9 m㏖)와 반응시켜 갈색 고체로서 목적하는 생성물(2.2g, 87%)을 수득하였다. ESI MS m/z 533 [M + H]+.
단계 3. tert-뷰틸(Z)-2-((5-브로모-3-(2-플루오로벤질)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(TU-1301)
일반 절차 B에 따라, tert-뷰틸 2-((5-브로모-3-(2-플루오로벤질)피라진-2-일)아미노)-2-(다이에톡시포스포릴)아세테이트(1.1g, 2.1 m㏖)를 퍼퓨랄(0.25g, 2.6 m㏖)과 반응시켜 황색 오일로서 목적하는 생성물(0.61g, 61%)을 수득하였다. ESI MS m/z 475 [M + H]+.
단계 4. tert-뷰틸(Z)-2-((5-(2-플루오로-3-나이트로페닐)-3-(2-플루오로벤질)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(JRW-1657)
일반 절차 C에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((5-브로모-3-(2-플루오로벤질)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.20g, 0.42 m㏖)를 2-(2-플루오로-3-나이트로페닐)-4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-다이옥사보로레인(0.17g, 0.63 m㏖)과 반응시켜 주황색 거품으로서 목적하는 생성물(0.14g, 62%)을 수득하였다. ESI MS m/z 535 [M + H]+.
단계 5. (Z)-2-((5-(2-플루오로-3-나이트로페닐)-3-(2-플루오로벤질)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(JRW-1659)
일반 절차 D에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((5-(2-플루오로-3-나이트로페닐)-3-(2-플루오로벤질)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.14g, 0.26 m㏖)를 트라이플루오로아세트산(1㎖)과 반응시켜 갈색 오일로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 479 [M + H]+.
단계 6. (Z)-6-(2-플루오로-3-나이트로페닐)-8-(2-플루오로벤질)-2-(퓨란-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(JRW-1661)
일반 절차 E에 따라, (Z)-2-((5-(2-플루오로-3-나이트로페닐)-3-(2-플루오로벤질)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(0.26 m㏖)을 다이(1H-이미다졸-1-일)메탄온(0.084g, 0.52 m㏖)과 반응시켜 적색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 461 [M + H]+.
단계 7. 6-(2-플루오로-3-나이트로페닐)-8-(2-플루오로벤질)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1663)
일반 절차 F에 따라, (Z)-6-(2-플루오로-3-나이트로페닐)-8-(2-플루오로벤질)-2-(퓨란-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(0.26 m㏖)을 소듐 보로하이드라이드(0.049g, 1.3 m㏖)와 반응시켜 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 463 [M + H]+.
단계 8. 6-(3-아미노-2-플루오로페닐)-8-(2-플루오로벤질)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1667)
일반 절차 H에 따라, 6-(2-플루오로-3-나이트로페닐)-8-(2-플루오로벤질)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(0.26 m㏖)을 수소(1atm)와 반응시켜 주황색-갈색 거품으로서 목적하는 생성물(0.023g, 4단계에 걸쳐 20%)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, 메탄올-d4) δ 7.81(s, 1H), 7.39(d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.36 - 7.25(m, 2H), 7.19 - 7.08(m, 2H), 7.06 - 6.81(m, 3H), 6.33(dd, J = 3.2, 1.9 Hz, 1H), 6.11(dd, J = 3.2, 1.0 Hz, 1H), 4.49(s, 2H), 4.20(s, 2H); ESI MS m/z 433 [M + H]+.
실시예 35. 6-(2-플루오로-3-하이드록시페닐)-8-(2-플루오로벤질)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1668)
단계 1. tert-뷰틸(Z)-2-((5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-3-(2-플루오로벤질)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(JRW-1658)
일반 절차 C에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((5-브로모-3-(2-플루오로벤질)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.20g, 0.42 m㏖)를 tert-뷰틸(2-플루오로-3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-다이옥사보로란-2-일)페녹시)다이메틸실레인(0.22g, 0.63 m㏖)과 반응시켜 주황색 오일로서 목적하는 생성물(0.21g, 80%)을 수득하였다. ESI MS m/z 620 [M + H]+.
단계 2. (Z)-2-((5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-3-(2-플루오로벤질)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(JRW-1660)
일반 절차 D에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-3-(2-플루오로벤질)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.21g, 0.34 m㏖)를 트라이플루오로아세트산(1㎖)과 반응시켜 적색 오일로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 564 [M + H]+.
단계 3. (Z)-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-8-(2-플루오로벤질)-2-(퓨란-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(JRW-1662)
일반 절차 E에 따라, (Z)-2-((5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-3-(2-플루오로벤질)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(0.34 m㏖)을 다이(1H-이미다졸-1-일)메탄온(0.11g, 0.67 m㏖)과 반응시켜 적색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 546 [M + H]+.
단계 4. 6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-8-(2-플루오로벤질)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1664)
일반 절차 F에 따라, (Z)-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-8-(2-플루오로벤질)-2-(퓨란-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(0.34 m㏖)을 소듐 보로하이드라이드(0.064g, 1.7 m㏖)와 반응시켜 주황색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 548 [M + H]+.
단계 5. 6-(2-플루오로-3-하이드록시페닐)-8-(2-플루오로벤질)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1668)
일반 절차 G에 따라, 6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-8-(2-플루오로벤질)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(0.34 m㏖)을 HCl(1㎖, 6M)과 반응시켜 목적하는 생성물(0.050g, 4단계에 걸쳐 34%)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, 메탄올-d4) δ 7.88(s, 1H), 7.40(d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.36 - 7.26(m, 2H), 7.19 - 6.97(m, 5H), 6.33(dd, J = 3.2, 1.9 Hz, 1H), 6.12(dd, J = 3.2, 1.0 Hz, 1H), 4.50(s, 2H), 4.20(s, 2H); ESI MS m/z 434 [M + H]+.
실시예 36. 6-(3-아미노-2-플루오로페닐)-8-(2,6-다이플루오로벤질)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1747)
단계 1. 5-브로모-3-(2,6-다이플루오로벤질)피라진-2-아민(JRW-1727)
HCl(20㎖, 1M) 중 아연 분말(9.5g, 145 m㏖)의 현탁액을 10분 동안 교반하였다. 고체를 여과하고, 메탄올과 THF로 세척하고, 플라스크로 옮기고 진공하에 18시간 동안 건조시켰다. THF(50㎖) 중 2-(브로모메틸)-1,3-다이플루오로벤젠(10.0g, 48.3 m㏖)의 용액을 아연 분말에 첨가하였다. 혼합물을 환류로 2시간 동안 가열한 후, 냉각시키고 침전시켰다. 상청액을 THF(50㎖) 중 3,5-다이브로모피라진-2-아민(5.6g, 22.0 m㏖)과 비스(트라이페닐포스핀)팔라듐(II) 다이클로라이드(0.77g, 1.1 m㏖)의 용액에 첨가하였다. 현탁액을 50℃로 18시간 동안 가열하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트와 물로 희석하고, 수성 층을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 농축시키고, 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 밝은 황색 고체로서 목적하는 생성물(4.2g, 63%)을 수득하였다. ESI MS m/z 301 [M + H]+.
단계 2. tert-뷰틸 2-((5-브로모-3-(2,6-다이플루오로벤질)피라진-2-일)아미노)-2-(다이에톡시포스포릴)아세테이트(JRW-1730)
일반 절차 A에 따라, 5-브로모-3-(2,6-다이플루오로벤질)피라진-2-아민(1.0g, 3.3 m㏖)을 tert-뷰틸 2-다이아조-2-(다이에톡시포스포릴)아세테이트(1.4g, 5.0 m㏖)와 반응시켜 갈색 고체로서 목적하는 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 551 [M + H]+.
단계 3. tert-뷰틸(Z)-2-((5-브로모-3-(2,6-다이플루오로벤질)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(JRW-1733)
일반 절차 B에 따라, tert-뷰틸 2-((5-브로모-3-(2,6-다이플루오로벤질)피라진-2-일)아미노)-2-(다이에톡시포스포릴)아세테이트(3.3 m㏖)를 퍼퓨랄(0.38g, 4.0 m㏖)과 반응시켜 적색 거품으로서 목적하는 생성물(1.0g, 2단계에 걸쳐 65%)을 수득하였다. ESI MS m/z 493 [M + H]+.
단계 4. tert-뷰틸(Z)-2-((3-(2,6-다이플루오로벤질)-5-(2-플루오로-3-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(JRW-1740)
일반 절차 C에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((5-브로모-3-(2,6-다이플루오로벤질)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.21g, 0.42 m㏖)를 2-(2-플루오로-3-나이트로페닐)-4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-다이옥사보로레인(0.17g, 0.64 m㏖)과 반응시켜 주황색 오일로서 목적하는 생성물(0.087g, 37%)을 수득하였다. ESI MS m/z 553 [M + H]+.
단계 5. (Z)-2-((3-(2,6-다이플루오로벤질)-5-(2-플루오로-3-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(JRW-1742)
일반 절차 D에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((3-(2,6-다이플루오로벤질)-5-(2-플루오로-3-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.087g, 0.16 m㏖)를 트라이플루오로아세트산(1㎖)과 반응시켜 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 497 [M + H]+.
단계 6. (Z)-8-(2,6-다이플루오로벤질)-6-(2-플루오로-3-나이트로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(JRW-1745)
일반 절차 E에 따라, (Z)-2-((3-(2,6-다이플루오로벤질)-5-(2-플루오로-3-나이트로페닐)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(0.16 m㏖)을 다이(1H-이미다졸-1-일)메탄온(0.051g, 0.31 m㏖)과 반응시켜 적색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 479 [M + H]+.
단계 7. 8-(2,6-다이플루오로벤질)-6-(2-플루오로-3-나이트로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1746)
일반 절차 F에 따라, (Z)-8-(2,6-다이플루오로벤질)-6-(2-플루오로-3-나이트로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(0.16 m㏖)을 소듐 보로하이드라이드(0.018g, 0.47 m㏖)와 반응시켜 적색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 481 [M + H]+.
단계 8. 6-(3-아미노-2-플루오로페닐)-8-(2,6-다이플루오로벤질)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1747)
일반 절차 H에 따라, 8-(2,6-다이플루오로벤질)-6-(2-플루오로-3-나이트로페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(0.16 m㏖)을 수소(1atm)와 반응시켜 주황색 고체로서 목적하는 생성물(0.014g, 4단계에 걸쳐 20%)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, 메탄올-d4) δ 8.45 - 7.78(m, 1H), 7.45 - 7.30(m, 2H), 7.07 - 6.84(m, 5H), 6.34(t, J = 2.6 Hz, 1H), 6.11(d, J = 3.2 Hz, 1H), 4.53(s, 2H), 4.19(s, 2H); ESI MS m/z 451 [M + H]+.
실시예 37. 8-(2,6-다이플루오로벤질)-6-(2-플루오로-3-하이드록시페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1759)
단계 1. tert-뷰틸(Z)-2-((5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-3-(2,6-다이플루오로벤질)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(JRW-1752)
일반 절차 C에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((5-브로모-3-(2,6-다이플루오로벤질)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.20g, 0.41 m㏖)를 tert-뷰틸(2-플루오로-3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-다이옥사보로란-2-일)페녹시)다이메틸실레인(0.21g, 0.61 m㏖)과 반응시켜 거품으로서 목적하는 생성물(0.095g, 36%)을 수득하였다. ESI MS m/z 638 [M + H]+.
단계 2. (Z)-2-((5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-3-(2,6-다이플루오로벤질)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(JRW-1754)
일반 절차 D에 따라, tert-뷰틸(Z)-2-((5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-3-(2,6-다이플루오로벤질)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아실레이트(0.095g, 0.15 m㏖)를 트라이플루오로아세트산(1㎖)과 반응시켜 적색 거품으로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 582 [M + H]+.
단계 3. (Z)-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-8-(2,6-다이플루오로벤질)-2-(퓨란-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(JRW-1757)
일반 절차 E에 따라, (Z)-2-((5-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-3-(2,6-다이플루오로벤질)피라진-2-일)아미노)-3-(퓨란-2-일)아크릴산(0.15 m㏖)을 다이(1H-이미다졸-1-일)메탄온(0.048g, 0.30 m㏖)과 반응시켜 적색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 564 [M + H]+.
단계 4. 6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-8-(2,6-다이플루오로벤질)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1758)
일반 절차 F에 따라, (Z)-6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-8-(2,6-다이플루오로벤질)-2-(퓨란-2-일메틸렌)이미다조[1,2-a]피라진-3(2H)-온(0.15 m㏖)을 소듐 보로하이드라이드(0.017g, 0.44 m㏖)와 반응시켜 주황색 고체로서 미정제 생성물을 수득하였다. ESI MS m/z 566 [M + H]+.
단계 5. 8-(2,6-다이플루오로벤질)-6-(2-플루오로-3-하이드록시페닐)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(JRW-1759)
일반 절차 G에 따라, 6-(3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-플루오로페닐)-8-(2,6-다이플루오로벤질)-2-(퓨란-2-일메틸)이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(0.15 m㏖)을 HCl(1㎖, 6M)과 반응시켜 목적하는 생성물(0.030g, 4단계에 걸쳐 45%)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, 메탄올-d4) δ 8.21(s, 1H), 7.44 - 7.31(m, 2H), 7.23 - 7.11(m, 1H), 7.07 - 6.93(m, 4H), 6.34(t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.11(d, J = 3.2 Hz, 1H), 4.54(s, 2H), 4.20(s, 2H); ESI MS m/z 434 [M + H]+.
실시예 38. 발광 특성
발광 검정 절차: 스크리닝 할 각각의 화합물을 DMSO(5mM)에 용해시킨 후, NANO-GLO® 루시퍼레이스 검정 완충액에 100μM로 더 희석하였다. 500㎕의 NANO-GLO® 루시퍼레이스 검정 완충액으로 500㎕의 기질 용액을 연속 희석하여 각각의 기질에 대해 2배 희석 시리즈를 제조하였다. 그런 다음, 각각의 희석된 기질 적정을 CO2 독립 배지+10% FBS로 희석된 정제된 NANOLUC® 루시퍼레이스와 동일한 부피로 합하였다. 각각의 기질에 대한 초기 광 출력을 신호 반감기를 결정하기 위한 수단으로서 기질 추가 3분 후 GLOMAX®-Multi+발광계에서 측정한 후 5분 간격으로 측정하였다. 신호 반감기는 그래프패드 프리즘 단일 위상 디케이(GraphPad Prism One Phase Decay) 회귀를 사용하여 계산하였고, Km 및 Vmax는 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 회귀를 사용하여 그래프패드 프리즘을 사용하여 계산하였다.
합성된 코엘렌테라진 유사체(화학식 (I) 및 화학식 (II)의 화합물)을 루시퍼레이스 기질로서의 적합성에 대해 평가하였다. 작고(19kDa), 안정적이며 특히 밝은 효소이기 때문에, NANOLUC® 루시퍼레이스를 스크리닝에 사용하였다. 표 1은 합성된 화합물이 루시퍼레이스 기질로서 코엘렌테라진보다 우수한 것으로 알려진 공지의 코엘렌테라진 유사체인 8-벤질-2-(퓨란-2-일메틸)-6-페닐이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온(퓨리마진)에 필적하는 상대 광 단위(RLU) 및 반감기 데이터를 가짐을 보여준다. 퓨리마진에 대한 RLU, 반감기 및 Km 값은 1.0으로 설정하였다.
실시예 39. 반감기 향상
코엘렌테라진 코어의 6번 위치의 파라 또는 메타 위치에 하이드록실을 갖는 화합물에 대해 신호 감쇠(signal decay)를 비교하였다. 하이드록실기(또는 아미노기 등)를 파라 위치에서 메타 위치로 이동시키면 신호 역학이 10배 이상 증가하여 이러한 기질을 더 광범위하게 사용할 수 있다. 대표적인 예에 대한 구조 및 반감기 값을 1로 설정된 퓨리마진에 대해 아래에서 비교하였다.
실시예 40. 안정성 테스트
용해도를 평가하기 위해, 테스트 화합물을 43mM로 에탄올/프로필렌 글리콜(1:1)의 혼합물에 용해시켰다. 그런 다음, 이 5× 스톡 용액을 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린/물/PEG400의 용액에 첨가하여 에탄올/프로필렌 글리콜/하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린/PEG 400/물(10:10:10:35:35) 중 8.7mM의 제형 혼합물을 수득하였다. 혼합물을 볼텍싱하고 원심분리하였다. 상청액을 샘플링하고, UV-Vis 분광계에서 측정하였다. 혼합물을 0.2 마이크론 주사기 필터를 통해 여과하고, 여과액을 측정하여 상청액과 비교하였다.
도 1은 상청액과 여과액을 비교한, 제형 내 JRW-1040의 UV 스펙트럼을 나타낸 것이다. 2개의 UV 스펙트럼이 중첩되어, JRW-1040이 제형에 완전히 용해됨을 보여준다. 도 2는 퓨리마진을 이용한 동일한 실험을 나타낸 것이다. 스펙트럼의 차이는 퓨리마진이 제형에 완전히 용해되지 않음을 보여준다. 이는 퓨리마진에 비해 용해도가 개선됨을 보여주는 예이다.
전술한 상세한 설명 및 첨부한 실시예는 단지 예시일 뿐이며, 첨부된 청구범위 및 그 균등범위에 의해서만 정의되는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다는 것이 이해된다.
개시된 실시형태에 대한 다양한 변경 및 수정은 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명의 화학 구조, 치환기, 유도체, 중간체, 합성, 조성물, 제형 또는 사용 방법과 관련된 것들을 제한없이 포함하는 그러한 변경 및 수정은 이의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다.

Claims (40)

  1. 하기 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 호변이성질체 또는 염:

    식 중,
    X는 나이트로, -ORx1, -NRx1Rx2, 또는 -OSi(C1-10알킬)3이고;
    m은 0 또는 1이며;
    R1은, 각 경우에, 독립적으로 할로겐 또는 C1-10알킬이고;
    n은 0, 1, 또는 2이고;
    m+n은 1, 2, 또는 3이고;
    R2는, 각 경우에, 독립적으로 할로겐 또는 C1-10알킬이며;
    G는 1개의 RD기로 치환된 퓨란-2-일, 또는 1개의 RE기로 선택적으로 치환된, 퓨란-2-일 이외의 5-원 헤테로아릴이며;
    RD 및 RE는, 각 경우에, 독립적으로 할로겐, C1-10알킬, 또는 C1-10할로알킬이고;
    Rx1 및 Rx2는 H이다.
  2. 제1항에 있어서, G는 1개의 RD기로 치환된 퓨란-2-일인, 화합물, 또는 이의 호변이성질체 또는 염.
  3. 제1항에 있어서, G는 1개의 RE기로 선택적으로 치환된, 퓨란-2-일 이외의 5-원 헤테로아릴인, 화합물, 또는 이의 호변이성질체 또는 염.
  4. 제1항에 있어서, G는 , 또는 인, 화합물, 또는 이의 호변이성질체 또는 염.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, m는 0인, 화합물, 또는 이의 호변이성질체 또는 염.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, m은 1이고, R1은 할로겐인, 화합물, 또는 이의 호변이성질체 또는 염.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, n은 0인, 화합물, 또는 이의 호변이성질체 또는 염.
  8. 제1항에 있어서, 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물, 또는 이의 호변이성질체 또는 염:
  9. 하기 화학식 (II)의 화합물, 또는 이의 호변이성질체 또는 염:

    식 중,
    Y는 나이트로, -ORy1, -NRy1Ry2, 또는 -OSi(C1-10알킬)3이고;
    p는 0 또는 1이며;
    q는 0, 1, 또는 2이고;
    p+q는 1, 2, 또는 3이고;
    R3은, 각 경우에, 독립적으로 할로겐 또는 C1-10알킬이고;
    R4는, 각 경우에, 독립적으로 할로겐 또는 C1-10알킬이며;
    Ry1 및 Ry2는 H이다.
  10. 제9항에 있어서, q는 0인, 화합물, 또는 이의 호변이성질체 또는 염.
  11. 제9항에 있어서, Y는 나이트로, ORy1 또는 NRy1Ry2인, 화합물, 또는 이의 호변이성질체 또는 염.
  12. 제9항에 있어서, Y는 ORy1이고, Ry1은 H인, 화합물, 또는 이의 호변이성질체 또는 염.
  13. 제9항에 있어서, Y는 NRy1Ry2이고, Ry1 및 Ry2는 H인, 화합물, 또는 이의 호변이성질체 또는 염.
  14. 제9항에 있어서, p+q는 1 또는 2인, 화합물, 또는 이의 호변이성질체 또는 염.
  15. 제9항에 있어서, p는 1이고, R3은 플루오린인, 화합물, 또는 이의 호변이성질체 또는 염.
  16. 제9항에 있어서, R4는, 각 경우에, 플루오린인, 화합물, 또는 이의 호변이성질체 또는 염.
  17. 제9항에 있어서, q는 1 또는 2이고, R4는 플루오린인, 화합물, 또는 이의 호변이성질체 또는 염.
  18. 제9항에 있어서, q는 1이고, R4는 C1-10알킬인, 화합물, 또는 이의 호변이성질체 또는 염.
  19. 제9항에 있어서, 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물, 또는 이의 호변이성질체 또는 염:


  20. 제9항에 있어서, 화합물이 인, 화합물, 또는 이의 호변이성질체 또는 염.
  21. 제1항 내지 제4항 및 제8항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 이의 호변이성질체 또는 염 및 루시퍼레이스(luciferase) 및/또는 완충 시약을 포함하는 키트.
  22. 샘플에서 발광(luminescence)을 검출하는 방법으로서,
    상기 샘플을 제1항 내지 제4항 및 제8항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 이의 호변이성질체 또는 염과 접촉시키는 단계;
    코엘렌테라진-이용 루시퍼레이스(coelenterazine-utilizing luciferase)가 샘플에 존재하지 않는 경우, 상기 샘플을 코엘렌테라진-이용 루시퍼레이스와 접촉시키는 단계; 및
    발광을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 샘플은 살아있는 세포를 함유하는, 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 샘플은 코엘렌테라진-이용 루시퍼레이스를 함유하는, 방법.
  25. 형질전환 동물에서 발광을 검출하는 방법으로서,
    상기 형질전환 동물에게 제1항 내지 제4항 및 제8항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 이의 호변이성질체 또는 염을 투여하는 단계; 및
    발광을 검출하는 단계를 포함하되,
    상기 형질전환 동물은 코엘렌테라진-이용 루시퍼레이스를 발현하는, 방법.
  26. 삭제
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