KR102788397B1 - 균질한 올리고머의 제조를 위한 키랄 시약 - Google Patents

균질한 올리고머의 제조를 위한 키랄 시약 Download PDF

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Abstract

본 발명은 부분입체이성질체적으로 순수한 또는 실질적으로 부분입체이성질체적으로 순수한 활성화된 포스포르아미도클로리데이트 모르폴리노 뉴클레오시드, 그의 제조 방법, 및 부분입체이성질체적으로 순수한 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)의 입체특이적 합성을 위한 입체특이적 커플링에서 그를 사용하는 방법을 제공한다.

Description

균질한 올리고머의 제조를 위한 키랄 시약
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2015년 8월 5일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/201,510을 우선권으로 주장한다. 상기 출원은 본원에 참고로 포함된다.
배경기술
기술분야
실시양태는 포스포르아미도클로리데이트 모르폴리노 아단위인 실질적으로 부분입체이성질체적으로 순수한 활성화된 단량체의 제조에 관한 것일 수 있다. 실시양태는 또한 입체특이적 커플링 반응을 통해 분자를 제조하기 위한 실질적으로 부분입체이성질체적으로 순수한 활성화된 인산화 모르폴리노 단량체의 용도에 관한 것일 수 있다.
부분입체이성질체적으로 순수한 포스포로디아미데이트 올리고뉴클레오티드의 합성은 실질적으로 키랄성 인 연결의 존재로 인해 복잡하다. 이는 예를 들어 키랄성 인을 갖지 않는 포스포디에스테르 연결과는 대조적이다. 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 (키랄성 인을 또한 포함함), 및 포스포로디아미데이트를 비교하는 예를 도 1에서 확인할 수 있다.
키랄성 인의 존재는 일련의 포스포로디아미데이트 뉴클레오티드의 연결을 수반하는 합성 경로에 대한 실질적인 도전을 제시한다. 포스포로디아미데이트 연결의 입체특이적 형성을 가능하게 하는 입체화학적으로 순수한 시약 (주형, 아단위, 빌딩 블록)의 결여는, 생성된 화합물의 인 키랄성이 조절될 수 없는 입체중심에서의 반응을 유도한다.
도 2에 도표로 도시된 바와 같이, 임의의 상당한 길이 및 서열의 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위해, 입체화학적으로 조절되지 않는 커플링으로 뉴클레오티드의 부분입체이성질체 혼합물을 사용하면, 여러 부분입체이성질체의 불균질한 혼합물이 생성된다. 부분입체이성질체의 개수는 이론적으로 2(n-1)이고, 여기서 n은 올리고뉴클레오티드를 형성하기 위해 연결되는 뉴클레오티드의 개수이다. 도 2에 도시된 바와 같이, 심지어 적당한 4개-뉴클레오티드 올리고뉴클레오티드 (테트라뉴클레오티드)도 8가지 별도의 부분입체이성질체 혼합물을 생성할 수 있다.
상당한 개수의 부분입체이성질체의 형성은 합성 이후에 민감한 분리 기술을 요구할 수 있다. 원하는 생성물의 수율은 원료 물질의 사용에 의해 불리한 영향을 받아서, 원치않는 다수의 부분입체이성질체가 제조될 수 있다.
합성 이전에 특이적 부분입체이성질체를 선택한 다음, 선택된 부분입체이성질체를 입체화학적으로 순수한 또는 실질적으로 순수한 형태로 합성할 수 있는 것이 유용할 것이다.
실시양태는 표 1의 1종 이상의 입체화학적으로 순수한 또는 실질적으로 입체화학적으로 순수한 화합물을 제공할 수 있다. 추가의 실시양태는 또한 표 1의 화합물의 거울상이성질체를 제공할 수 있다. 전형적으로, 이들 거울상이성질체의 입체화학은 모르폴리노 고리의 입체화학 변경에 의해 표 1의 화합물의 입체화학과 달라진다.
<표 1>
Figure 112018021757960-pct00001
Figure 112018021757960-pct00002
Figure 112018021757960-pct00003
R1 및 R2는 동일하거나 상이할 수 있고, -H, 임의로 치환된 C1-C3 알킬, 임의로 치환된 페닐, 임의로 치환된 나프틸일 수 있거나, 또는 그들이 부착되어 있는 질소와 함께, 예를 들어 피롤리딘, 피페라진 또는 모르폴린일 수 있는 임의로 치환된 헤테로사이클을 형성할 수 있다.
임의로 치환된 모이어티는 메틸, 에틸, 할로겐, 니트로, 메톡시 또는 시아노 중 하나 이상에 의해 치환될 수 있다.
R3은, 예컨대 MMTr (p-메톡시페닐디페닐메틸)을 비제한적으로 포함하는 치환된 트리틸일 수 있는 트리틸 (Tr), 임의로 치환된 벤질, 4-메톡시벤질 (PMB, MPM), 3,4-디메톡시벤질, 디페닐메틸 (Dpm), 또는 절단가능한 술포닐일 수 있는 술포닐이다. 일부 실시양태에서, 술포닐은 2-니트로벤젠술포닐, 4-니트로벤젠술포닐 또는 2,4-디니트로벤젠술포닐이다.
R4, R5, R6은 -H, -C(O)R7 또는 -C(O)OR7일 수 있고, 여기서 R7은 알킬 (메틸, 에틸, 이소프로필 또는 다른 C1-C6 알킬), 벤질, 2,2,2-트리클로로에틸 또는 아릴 (예컨대 비제한적으로 페닐, 4-메톡시 페닐, 4-브로모페닐 및 4-니트로페닐)이다. R9는 임의로 치환된 알킬, 시아노에틸, 아실, 카르보네이트, 카르바메이트, 임의로 치환된 벤질, 4-피발로일옥시 벤질 및 실릴일 수 있다.
추가의 실시양태에서, 표 1에 도시된 것 이외의 모르폴리노 뉴클레오시드를 부분입체이성질체적으로 순수한 또는 실질적으로 부분입체이성질체적으로 순수한 형태로 제조할 수 있다.
실시양태는 또한 상기 개시된 화합물의 부분입체이성질체 혼합물을 입체화학적으로 순수한 또는 실질적으로 입체화학적으로 순수한 화합물로 분리하는 방법을 제공할 수 있다. 추가의 실시양태는 본원에서 보고된 입체화학적으로 순수한 또는 실질적으로 입체화학적으로 순수한 화합물을 포함하는 제약 조성물을 제공할 수 있다. 추가의 실시양태는 본원에서 보고된 입체화학적으로 순수한 또는 실질적으로 입체화학적으로 순수한 화합물의 제약상 허용가능한 염을 포함하는 제약 조성물을 제공할 수 있다. 제약 조성물은 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량으로 투여될 수 있다. 제약 조성물은 제약상 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표 1의 각각의 화합물에서 하기 모이어티는 위치 a, b 및 e에서 1개 또는 2개의 메틸 기로 치환될 수 있고, 위치 c 및 d에서 1개의 메틸 기로 치환될 수 있다. 각각의 경우에, 메틸 기는 모르폴리노 고리면의 양측에 배향될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 1개 이상의 메틸 기로 임의로 치환된 추가의 메틸렌은 모르폴리노 기에서 질소에 인접하게 삽입되어, 7-원 고리로 확장될 수 있다.
실시양태는 활성화된 단량체의 입체특이적 커플링을 통해 입체화학적으로 순수한 올리고뉴클레오티드를 제조하는 것을 추가로 제공한다. 추가의 실시양태는 활성화된 단량체의 입체특이적 커플링에 의해 제조된 실질적으로 부분입체이성질체적으로 순수한 올리고머를 제공한다. 여전히 추가의 실시양태는 본원에서 보고된 실질적으로 부분입체이성질체적으로 순수한 화합물을 포함하는 실질적으로 부분입체이성질체적으로 순수한 조성물을 제공한다.
도 1은 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 및 포스포로디아미데이트 올리고뉴클레오티드 연결을 도시한다.
도 2는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)에서의 R- 및 S- 인 연결을 도시한다. 도 2는 또한 포스포로디아미데이트 올리고머 전구체의 부분입체이성질체 혼합물을 사용하여 디뉴클레오티드 (2합체), 트리뉴클레오티드 (3합체), 테트라뉴클레오티드 (4합체) 및 N합체를 합성하는 경우에 전형적으로 생성되는 부분입체이성질체의 증식을 도시한다.
도 3은 부분입체이성질체적으로 순수한 포스포르아미도클로리데이트의 사용 및 포스포르아미도클로리데이트의 부분입체이성질체 혼합물의 사용 둘 다에 의해 부분입체이성질체적으로 순수한 디뉴클레오티드를 제조하는 것을 도시한다.
도 4a 및 도 4b는 부분입체이성질체적으로 순수한 또는 실질적으로 부분입체이성질체적으로 순수한 부분입체이성질체 아단위의 제조에 유용할 수 있는 포스포르아미도클로리데이트의 일반화된 부분입체이성질체 혼합물을 도시한다.
도 5는 본원에서 보고된 부분입체이성질체적으로 순수한 포스포르아미도클로리데이트를 사용하여 부분입체이성질체적으로 순수한 (균질한) 올리고뉴클레오티드를 제조하는 것을 도시한다.
도 6은 16합체 PMO의 입체특이적 합성 및 생물리학적 검정에 의한 입체이성질체의 구별에 대한 개략도를 도시한다.
도 7은 하기 보고되는 바와 같이 16합체 PMO의 입체특이적 합성 및 생물리학적 검정에 의한 입체이성질체의 구별을 기재하는 실시예의 입체이성질체 1 및 2의 융점을 도시한다.
도 8은 하기 보고되는 바와 같이 결정질 화합물 100의 ORTEP 플롯을 도시한다.
도 9a 및 도 9b는 하기 보고되는 바와 같이 화합물 100의 2개 단편의 ORTEP 플롯을 도시한다.
상세한 설명
본 발명자들은 활성화된 모르폴리노 아단위의 2가지 부분입체이성질체가 그들의 물리적 성질에 의해 분류될 수 있어서, 부분입체이성질체적으로 순수한 이성질체의 제조를 가능하게 한다는 것을 발견하였다. 이는 조절된 반응 조건하에 입체화학적으로 순수한 또는 실질적으로 입체화학적으로 순수한 PMO의 제조를 허용하며, 이어서 이를 사용하여 원하는 입체화학을 갖는 올리고뉴클레오티드를 선택적으로 제조할 수 있다.
실시양태는 또한 상기 개시된 화합물의 부분입체이성질체 혼합물을 입체화학적으로 순수한 또는 실질적으로 입체화학적으로 순수한 화합물로 분리하는 방법을 제공할 수 있다. 이전의 부분입체이성질체 혼합물로부터 순수한 부분입체이성질체가 분리되면, 이를 사용하여 입체특이적 커플링 반응을 통해 부분입체이성질체적으로 순수한 화합물을 제조할 수 있다.
상기 기재된 바와 같이 제조된 부분입체이성질체적으로 순수한 화합물 및 실질적으로 부분입체이성질체적으로 순수한 화합물은 부분입체이성질체적으로 순수한 포스포로디아미데이트 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 이들 부분입체이성질체적으로 순수한 및 실질적으로 부분입체이성질체적으로 순수한 포스포로디아미데이트 올리고뉴클레오티드는 여러 용도를 가질 수 있다. 예를 들어, 이들은 의약으로서 유용할 수 있다. 이들은 포스포로디아미데이트 올리고뉴클레오티드의 부분입체이성질체의 불균질한 혼합물 (입체적으로 무작위한 혼합물)에 비해 잠재적으로 우수한 성질에 대해 선택될 수 있다. 예를 들어, 이들은 잠재성, 효능, 안정성, 안전성 및 특이성에서의 차이에 대해 선택될 수 있다. 부분입체이성질체적으로 순수한 및 실질적으로 부분입체이성질체적으로 순수한 올리고머는 올리고머의 입체화학적으로 불균질한 혼합물과는 상이한 물리적, 화학적 및 생물학적 성질을 가질 수 있다.
"입체이성질체"는 원자의 공간적 배열만이 상이한 이성질체를 지칭한다.
"부분입체이성질체"는 서로에 대해 거울상이 아닌 입체이성질체를 지칭한다.
"거울상이성질체"는 서로에 대해 겹쳐지지 않는 거울상인 입체이성질체를 지칭한다. 거울상이성질체에는 실질적으로 단일 거울상이성질체, 예를 들어 90%, 92%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 또는 100%의 단일 거울상이성질체를 포함하는 "거울상이성질체으로 순수한" 이성질체가 포함된다.
"활성화된 단량체"는 친핵체, 예컨대 비제한적으로 아민 및 알콜과의 치환 반응을 거치는 이탈기, 예컨대 비제한적으로 클로라이드 및 할라이드 이탈기를 갖는 반응성 인을 보유하는 5'-O-인산화 모르폴리노 아단위를 지칭한다.
이성질체를 기재하는 용어로서 "R" 및 "S"는 비대칭적으로 치환된 원자, 예컨대 비제한적으로 탄소, 황, 인 및 암모늄 질소에서의 입체화학적 배치의 표시이다. 비대칭적으로 치환된 원자를 "R" 또는 "S"로 지정하는 것은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고 International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) Rules for the Nomenclature of Organic Chemistry. Section E, Stereochemistry에 기재된 바와 같이 칸-인골드-프렐로그(Cahn-Ingold-Prelog) 순위 규칙을 적용하여 수행된다.
거울상이성질체는 화학 분야의 기술자에게 널리 공지된 바와 같이 평면 편광의 면을 회전시키는 방향을 특징으로 할 수 있다. 빛을 시계 방향으로 회전시키는 경우에는 (관찰자가 빛이 이동하는 방향을 향해 봤을 때), 해당 거울상이성질체는 (+)로 표시되고, 우선성으로 지칭된다. 그의 거울상은 평면 편광을 시계 반대 방향으로 회전시킬 것이며, (-) 또는 좌선성으로 표시된다. 광학 회전의 기호로 표시되는, 거울상이성질체으로 순수한 화합물의 평면 편광의 회전 방향은 편광계로 공지된 표준 기기에서 용이하게 측정될 수 있다.
"라세미체"는 동등한 분량의 개별 거울상이성질체를 함유하는 혼합물을 지칭한다.
"비라세미체"는 동등하지 않은 분량의 개별 거울상이성질체의 혼합물을 지칭한다. 비라세미체 혼합물은 R- 또는 S-배치가 풍부할 수 있으며, 예컨대 비제한적으로 약 50/50, 약 60/40 및 약 70/30의 R- 대 S-거울상이성질체 또는 S- 대 R-거울상이성질체 혼합물일 수 있다.
"실질적으로 입체화학적으로 순수한" 및 "실질적인 입체화학적 순도"는, 각각 거울상이성질체 과잉률 또는 부분입체이성질체 과잉률이 80% 이상인 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, "실질적으로 입체화학적으로 순수한" 및 "실질적인 입체화학적 순도"는, 각각 거울상이성질체 과잉률 또는 부분입체이성질체 과잉률이 87% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상인 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체를 지칭한다. "실질적으로 부분입체이성질체적으로 순수한"은 부분입체이성질체 과잉률이 87% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상인 부분입체이성질체를 지칭한다.
거울상이성질체의 "거울상이성질체 과잉률" (ee)은 [(주 거울상이성질체의 몰 분획) - (부 거울상이성질체의 몰 분획)] × 100이다. 2가지 부분입체이성질체의 혼합물 중 한 부분입체이성질체의 부분입체이성질체 과잉률 (de)은 유사하게 정의된다.
본원에서 사용된 "제약상 허용가능한 염"은 본 개시내용에서 화합물의 산 부가염 또는 염기 부가염을 지칭한다. 제약상 허용가능한 염은 본 발명의 화합물의 활성을 보유하는 임의의 염이며, 그것이 투여되는 대상체에 대해 및 그것이 투여되는 환경에서 임의의 과도하게 해롭거나 바람직하지 않은 효과를 부여하지 않는다. 제약상 허용가능한 염에는 무기산 및 카르복실산 둘 다의 금속 착물 및 염이 포함되지 이로 제한되지 않는다. 제약상 허용가능한 염에는 또한 금속 염, 예컨대 알루미늄, 칼슘, 철, 마그네슘, 망가니즈 및 착물 염이 포함된다. 또한, 제약상 허용가능한 염에는 산 염, 예컨대 아세트산, 아스파르트산, 알킬술폰산, 아릴술폰산, 악세틸산, 벤젠술폰산, 벤조산, 중탄산, 중황산, 중타르타르산, 부티르산, 칼슘 에데테이트, 캄실산, 탄산, 클로로벤조산, 시트르산, 에데트산, 에디실산, 에스톨산, 에실, 에실산, 포름산, 푸마르산, 글루셉트산, 글루콘산, 글루탐산, 글리콜산, 글리콜릴아르사닐산, 헥삼산, 헥실레조르신산, 히드라밤산, 브로민화수소산, 염산, 아이오드화수소산, 히드록시나프토산, 이세티온산, 락트산, 락토비온산, 말레산, 말산, 말론산, 만델산, 메탄술폰산, 메틸질산, 메틸황산, 점액산, 뮤콘산, 나프실산, 질산, 옥살산, p-니트로메탄술폰산, 팜산, 판토텐산, 인산, 일수소인산, 이수소인산, 프탈산, 폴리갈락토우론산, 프로피온산, 살리실산, 스테아르산, 숙신산, 술팜산, 술파닐산, 술폰산, 황산, 탄닌산, 타르타르산, 테오클산, 톨루엔술폰산 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
치료제의 조합물 (예를 들어, 화합물 1 및 CDK 4/6 억제제)의 "유효량"은 대상체 또는 환자에서 치료하지 않고 둔 HCC 또는 IHCC에 비해 관찰가능한 치료적 이익을 제공하는데 충분한 양이다.
본원에서 보고된 활성제는 제약상 허용가능한 담체와 조합되어 그의 제약 제형을 제공할 수 있다. 담체 및 제형의 특정한 선택은 조성물에 대해 의도되는 특정한 투여 경로에 따라 좌우될 것이다.
본원에서 사용된 "제약상 허용가능한 담체"는 함께 제형화되는 화합물의 약리학적 활성을 파괴하지 않는 무독성 담체, 아주반트 또는 비히클을 지칭한다. 본 발명의 조성물에서 사용될 수 있는 제약상 허용가능한 담체, 아주반트 또는 비히클에는 소르브산, 소르브산칼륨, 포화 식물성 지방산의 부분 글리세리드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 삼규산마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스-기재 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물은 비경구, 경구, 흡입 분무, 국소, 직장, 비측, 협측, 질 또는 이식 저장소 투여 등에 적합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제형은 천연 또는 비천연 공급원으로부터의 성분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제형 또는 담체는 멸균성 형태로 제공될 수 있다. 멸균성 담체의 비제한적인 예에는 외독소-무함유 물 또는 발열원-무함유 물이 포함된다.
본원에 사용된 용어 "비경구"에는 피하, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액내, 흉골내, 경막내, 간내, 병변내 및 두개내 주사 또는 주입 기술이 포함된다. 특별한 실시양태에서, 화합물은 정맥내, 경구, 피하 또는 근육내 투여를 통해 투여된다. 본 발명의 조성물의 멸균성 주사가능한 형태는 수성 또는 유성 현탁액일 수 있다. 이들 현탁액은 적합한 분산화제 또는 습윤제 및 현탁화제를 이용하여 관련 분야에 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다. 멸균성 주사가능한 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용가능한 희석제 또는 용매 중의 멸균성 주사가능한 용액 또는 현탁액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매는 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액일 수 있다. 또한, 멸균성 고정유가 용매 또는 현탁화 매질로서 편리하게 사용된다.
본 발명의 실시양태는 입체화학적으로 순수한 이성질체 또는 실질적으로 입체화학적으로 순수한 이성질체를 제조한 후, 상기 순수한 이성질체를 사용하여 부분입체이성질체적으로 순수한 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)를 입체특이적으로 제조하는 것을 제공한다. 포스포르아미도클로리데이트 뉴클레오티드의 부분입체이성질체 혼합물을 분리함으로써 제조할 수 있다. 분리는 예를 들어 크로마토그래피; 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피 또는 "HPLC"에 의해 이루어질 수 있다. 분리는 또한 결정화를 통해 달성될 수 있다.
분리된 단량체는 "활성" 단량체로 지칭될 수 있다. "활성"이란, 단량체가 아민, 알콜/알콕시드, 티올/티올레이트, 알킬리튬 및 그리냐드(Grignard) 시약을 비롯한 이로 제한되지 않는 다양한 친핵체에 대해 반응성인 포스포르아미도클로리데이트 모이어티를 포함하는 것을 의미한다.
I. 부분입체이성질체 이성질체의 제조
한 실시양태에서, 입체화학적으로 순수한 또는 실질적으로 입체화학적으로 순수한 활성화된 단량체는 단량체의 부분입체이성질체 혼합물의 분리에 의해 제조될 수 있다. 분리는 물리적 성질을 이용하여 입체이성질체의 구별을 허용하는 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 분리는 크로마토그래피 또는 결정화를 통해 달성될 수 있다. 적합한 유형의 크로마토그래피에는 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 모의 이동층 크로마토그래피, 향류 크로마토그래피, 및 다른 유형의 분리성 크로마토그래피가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 부분입체이성질체 혼합물을 빠른 이동 분획 및 느린 이동 분획으로 용리시키는 HPLC에 적용할 수 있다. 이들 각각의 분획은 상이한 입체화학적으로 순수한 또는 실질적으로 입체화학적으로 순수한 양의 단량체이다. 하기 기재되는 바와 같이, 이들 단량체를 이용하여 조절된 반응 조건을 이용하여 입체특이적 커플링을 통해 원하는 입체화학을 갖는 올리고머를 제조할 수 있다.
본 발명자들은, 입체화학적으로 순수한 활성화된 단량체가 분리되면 이들이 추가의 화학적 반응에 사용하기에 충분한 안정성을 가짐을 추가로 알아내었다. 더욱이, 본 발명자들은, 입체화학적으로 순수한 활성화된 단량체가 입체특이적 화학적 반응을 거칠 수 있음을 알아내었다. 따라서, 하기에 더욱 상세히 논의되는 바와 같이, 이들 입체화학적으로 순수한 활성화된 단량체를 입체특이적 커플링 반응에 사용하여 입체화학적으로 순수한 생성물을 제조할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 실시양태는 입체이성질체에서 상이한 물리적 성질의 이점을 고려하여 제조될 수 있는, 표 1의 1종 이상의 입체화학적으로 순수한 또는 실질적으로 입체화학적으로 순수한 화합물을 제공할 수 있다. 추가의 실시양태는 또한 표 1의 화합물의 거울상이성질체를 제공할 수 있다. 전형적으로, 이들 거울상이성질체의 입체화학은 모르폴리노 고리의 입체화학 변경에 의해 표 1의 화합물의 입체화학과 달라진다.
<표 1>
Figure 112018021757960-pct00005
상기 식에서, R3은 임의로 치환된 트리페닐메틸 ("트리틸"로도 지칭됨), 임의로 치환된 벤질, 또는 술포닐이다. R4, R5 및 R6은 -C(O)R7 또는 -C(O)OR8일 수 있고, 여기서 R7은 메틸, 에틸 또는 페닐이고, R8은 벤질 또는 2,2,2-트리클로로에틸이다. R9는 임의로 치환된 알킬, 시아노에틸 (보호기로 사용됨, 예를 들어, 미국 특허 출원 공보 번호 US2013/0197220 참고), 아실, 술포닐, 아세탈/케탈, 카르보네이트, 카르바메이트, 임의로 치환된 벤질, 4-피발로일옥시 벤질 및 실릴일 수 있다.
일부 실시양태에서, 임의로 치환된 벤질은 4-메톡시벤질 (PMB, MPM)이다. 일부 실시양태에서, 술포닐은 절단가능한 술포닐이다. 일부 실시양태에서, 술포닐은 2-니트로벤젠술포닐, 4-니트로벤젠술포닐 또는 2,4-디니트로벤젠술포닐이다.
R1 및 R2는 동일하거나 상이할 수 있고, -H, 임의로 치환된 C1-C3 알킬, 임의로 치환된 페닐, 임의로 치환된 나프틸일 수 있거나, 또는 그들이 부착되어 있는 질소와 함께, 예를 들어 피롤리딘, 피페라진 또는 모르폴린일 수 있는 임의로 치환된 헤테로사이클을 형성할 수 있다.
임의로 치환된 모이어티는 메틸, 에틸, 할로겐, 니트로 또는 시아노 중 1개 이상으로 치환될 수 있다.
R3은, 예컨대 MMTr (p-메톡시페닐디페닐메틸)을 비제한적으로 포함하는 치환된 트리틸일 수 있는 트리틸 (Tr), 벤질, 4-메톡시벤질 (PMB, MPM), 및 3,4-디메톡시벤질, 디페닐메틸 (Dpm)일 수 있다,
R4, R5, R6은 -H, -C(O)R7 또는 -C(O)OR7일 수 있고, 여기서 R7은 알킬 (메틸, 에틸, 이소프로필 또는 다른 C1-C6 알킬) 또는 아릴 (예컨대 비제한적으로 페닐, 4-메톡시 페닐, 4-브로모페닐 및 4-니트로페닐)이다.
II. 입체특이적 커플링
분리 기술을 이용하여 실질적으로 입체화학적으로 순수한 양의 활성화된 단량체를 제조할 수 있음을 알아낸 것 외에도, 본 발명자들은 이들 활성화된 단량체를 일부 반응 조건하에 사용하여 입체화학적으로 순수한 디뉴클레오티드, 입체화학적으로 순수한 트리뉴클레오티드, 및 입체화학적으로 순수한 더 큰 올리고머의 제조를 위해 입체특이적 커플링을 달성할 수 있음을 알아내었다. 본원에서 보고된 방법을 사용하여, 새로 형성된 PMO 연결의 키랄성을 올리고머의 형성을 위해 사용되는 입체화학적으로 순수한 활성 단량체의 키랄성에 특이적으로 코딩시킬 수 있다.
입체특이적 커플링을 위한 전형적인 반응 조건에는 비양성자성 용매 중에서의 반응이 포함된다. 이들 용매는 예를 들어 아세토니트릴, 테트라히드로푸란 (THF), 1,3-디메틸이미다졸리디논 (DMI), 디메틸포름아미드 (DMF), N-메틸-2-피롤리디논 (NMP), 디메틸아세트아미드 (DMAc), 디클로로메탄 (DCM), 1,2-디클로로에탄 (DCE), 클로로포름, 1,4-디옥산, 에틸 아세테이트, 2-메틸테트라히드로푸란, 및 이소프로필 아세테이트이나 이로 제한되지 않는다. 커플링 반응은 비친핵성 3급 아민 염기 및 방향족 염기의 존재하에 수행될 수 있다. 적합한 염기에는 디이소프로필에틸아민, 트리에틸아민, 2,6-루티딘, 트리메틸피리딘 (콜리딘) 및 N-에틸모르폴린이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 반응 온도는 실온 (약 20℃) 내지 50℃의 범위일 수 있다. 일부 경우에는 초음파 처리를 적용하여 기질(들)의 용해를 보조할 수 있다.
입체특이적 커플링의 실행가능성을 결정하기 위해, 여러 실질적으로 입체화학적으로 순수한 PMO 디뉴클레오티드를 빠른 용리 및 느린 용리의 실질적으로 입체화학적으로 순수한 활성 단량체 (포스포르아미도클로리데이트)의 입체특이적 PMO 커플링에 의해 제조하였다. 하기 표 2는 이들 실질적으로 입체화학적으로 순수한 PMO 디뉴클레오티드의 HPLC 체류 프로파일을 요약한다. 표는 표의 좌측에 열거된 5'-말단 단량체와 상단에 열거된 3'-말단 단량체의 빠른 용리 및 느린 용리 이성질체 둘 다의 조합으로부터 제조된 디뉴클레오티드에 대한 체류 시간을 비교한다. 표는 실질적으로 입체화학적으로 순수한 활성 단량체의 입체특이적 커플링에 의해 상이한 물리적 성질을 갖는 상이한 부분입체이성질체적으로 순수한 디뉴클레오티드를 제공함을 입증한다.
<표 2>
Figure 112018021757960-pct00006
표 2의 실질적으로 입체화학적으로 순수한 PMO 디뉴클레오티드의 프로파일링에 대한 분석용 HPLC 조건을 하기에 나타내었다:
Figure 112018021757960-pct00007
실시예
III. 활성화된 단량체의 부분입체이성질체 분리의 실시예
하기 실시예는 본원에 제시된 특정 실시양태에 따른 활성화된 단량체의 부분입체이성질체 분리를 제공한다.
A. U-단량체
Figure 112018021757960-pct00008
활성화된 U 단량체에 대한 분석용 HPLC 조건:
Figure 112018021757960-pct00009
활성화된 U 단량체에 대한 제조용 HPLC 조건:
키랄팩(Chiralpak) IC, 21 x 250mm, 5μ; 에틸 아세테이트를 사용하여 11 ml/분에서 칼럼을 용리시킴, 실온, 260nm 검출.
[U1에 대한 1H-NMR 데이터]
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.18 (br, 1H), 7.45 (m, 6H), 7.15-7.32 (m, 10H), 6.12 (dd, 1H, J= 2.0 & 9.6 Hz), 5.62 (d, 1H, J= 8.0 Hz), 4.39 (m, 1H), 4.11 (m, 2H), 3.39 (d, 1H, J= 11 Hz), 3.15 (d, 1H, J= 11 Hz), 2.65 (s, 3H), 2.62 (s, 3H), 1.49 (t, 1H, J= 11 Hz), 1.39 (t, 1H, J= 11 Hz)
[U2에 대한 1H-NMR 데이터]
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.07 (br, 1H), 7.44 (m, 6H), 7.14-7.34 (m, 10 H), 6.12 (dd, 1H, J= 2 & 9 Hz), 5.61 (d, 1H, 8.0 Hz), 4.39 (m, 1H), 4.08 (m, 2H), 3.39 (d, 1H, J= 12 Hz), 3.15 (d, 1H, J= 12 Hz), 2.66 (s, 3H), 2.62 (s, 3H), 1.46 (t, 1H, J= 11 Hz), 1.38 (t, 1H, J= 11 Hz)
B. A-단량체
Figure 112018021757960-pct00010
활성화된 A 단량체에 대한 분석용 HPLC 조건:
Figure 112018021757960-pct00011
활성화된 A 단량체에 대한 제조용 HPLC 조건:
키랄팩 IC, 21 x 250mm, 5u; 100% 에틸 아세테이트를 사용하여 15 ml/분에서 용리시킴, 실온, uv 260nm 검출.
[A1에 대한 1H-NMR 데이터]
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.01 (br, 1H), 8.79 (s, 1H), 8.00 (m, 3H), 7.58 (m, 1H), 7.4-7.6 (m, 8 H), 7.2-7.4 (m, 10H), 6.42 (d, 1H, J= 8.4 Hz), 4.51 (m, 1H), 4.12 (m, 3H), 3.54 (d, 1H, J= 12 Hz), 3.25 (d, 1H, J= 12 Hz), 2.62 (s, 3H), 2.59 (s, 3H), 1.81 (t, 1H, J= 11 Hz), 1.62 (t, 1H, J= 11 Hz)
[A2에 대한 1H-NMR 데이터]
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.04 (br, 1H), 8.79 (s, 1H), 8.00 (m, 3H), 7.56 (m, 1H), 7.4-7.6 (m, 8H), 7.2-7.4 (m, 10H), 6.41 (d, 1H, J= 8.4 Hz), 4.51 (m, 1H), 4.12 (m, 3H), 3.54 (d, 1H, J= 12 Hz), 3.25 (d, 1H, J= 12 Hz), 2.64 (s, 3H), 2.61 (s, 3H), 1.82 (t, 1H, J= 11 Hz), 1.63 (t, 1H, J= 11 Hz)
C. C-단량체
Figure 112018021757960-pct00012
활성화된 C 단량체에 대한 분석용 HPLC 조건:
Figure 112018021757960-pct00013
활성화된 C 단량체에 대한 제조용 HPLC 조건:
키랄팩 IC, 75% 에틸 아세테이트 및 25% n-헵탄을 사용하여 15 ml/분에서 용리시킴. 실온 및 uv 260nm 검출.
[C1에 대한 1H-NMR 데이터]
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.66 (d, 1H, J= 7.8 Hz), 7.43 (m, 6H), 7.33 (d, 1H, J= 7.4 Hz), 7.15-7.32 (m, 9H), 6.18 (dd, 1H, J= 2.2 & 9.2 Hz), 4.42 (m, 1H), 4.08-4.16 (m, 2H), 3.54 (d, 1H, J= 11 Hz), 3.14 (d, 1H, J= 12 Hz), 2.64 (s, 3H), 2.60 (s, 3H), 2.23 (s, 3H), 1.51 (t, 1H, J= 11 Hz), 1.25 (m, 1H).
[C2에 대한 1H-NMR 데이터]
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.64 (d, 1H, J= 7.8 Hz), 7.43 (m, 6H), 7.32 (d, 1H, J= 7.4 Hz), 7.15-7.32 (m, 9H), 6.19 (dd, 1H, J= 2.1 & 9.2 Hz), 4.41 (m, 1H), 4.06-4.15 (m, 2H), 3.54 (d, 1H, J= 11 Hz), 3.15 (d, 1H, J= 12 Hz), 2.64 (s, 3H), 2.61 (s, 3H), 2.22 (s, 3H), 1.49 (t, 1H, J= 11 Hz), 1.25 (m, 1H)
D. G-단량체 (단일 보호된 구아닌)
Figure 112018021757960-pct00014
활성화된 G 단량체에 대한 분석용 HPLC 조건:
Figure 112018021757960-pct00015
활성화된 G 단량체에 대한 제조용 HPLC 조건:
키랄팩 IC, 100% 에틸 아세테이트를 사용하여 15 ml/분에서 용리시킴. 실온 및 uv 260nm 검출.
E. T-단량체
Figure 112018021757960-pct00016
활성화된 T 단량체에 대한 분석용 HPLC 조건:
Figure 112018021757960-pct00017
활성화된 T 단량체에 대한 제조용 HPLC 조건:
키랄팩 IC, 50 x 500mm, 20u. 에틸 아세테이트를 사용하여 60 ml/분에서 칼럼을 용리시킴, 실온, 260nm 검출. 체류 시간은 25분 및 40분이다.
[T1에 대한 1H-NMR 데이터]
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.4-7.5 (m, 5H), 7.26-7.33 (m, 6H), 7.16-7.22 (m, 3H), 7.04 (d, 1H, J= 1 Hz), 6.12 (dd, 1H, J= 2 & 10 Hz), 4.39 (m, 1H), 4.12 (m, 2H), 3.37 (d, 1H, J= 12 Hz), 3.15 (d, 1H, J= 12 Hz), 2.66 (s, 3H), 2.63 (s, 3H), 1.83 (d, 1H, J= 1 Hz), 1.49 (t, 1H, J= 11 Hz), 1.41 (t, 1H, J= 11 Hz))
[T2에 대한 1H-NMR 데이터]
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.4-7.5 (m, 6H), 7.24-7.35 (m, 6H), 7.14-7.22 (m, 3H), 7.03 (s, 1H), 6.12 (dd, 1H, J= 2 & 10 Hz), 4.39 (m, 1H), 4.09 (m, 2H), 3.37 (d, 1H, J= 11 Hz), 3.15 (d, 1H, J= 11 Hz), 2.66 (s, 3H), 2.62 (s, 3H), 1.82 (s, 3H), 1.48 (t, 1H, J= 11 Hz), 1.40 (t, 1H, J= 11 Hz)
F. C-단량체 (NBz)
Figure 112018021757960-pct00018
활성화된 C 단량체 (NBz)에 대한 분석용 HPLC 조건:
Figure 112018021757960-pct00019
활성화된 C 단량체 (NBz)에 대한 제조용 HPLC 조건:
키랄팩 IB, 20 x 250mm 5u, 100% 아세토니트릴을 사용하여 9 ml/분에서 용리시킴. 실온 및 uv 260nm 검출. 체류 시간은 13분 및 16분이다.
G. G-단량체 (이중 보호된 구아닌)
Figure 112018021757960-pct00020
활성화된 G 단량체 (이중 보호된 구아닌)에 대한 분석용 HPLC 조건:
Figure 112018021757960-pct00021
활성화된 G 단량체 (이중 보호된 구아닌)에 대한 제조용 HPLC 조건:
키랄팩 IA 50 x 500mm, 100% 에틸 아세테이트를 사용하여 60 ml/분에서 용리시킴. 실온 및 uv 260nm 검출. 체류 시간은 20분 및 24분이다.
[G1 (이중 보호된 구아닌)에 대한 1H-NMR 데이터]
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.76 (s, 2H), 7.50 (d, 2H, J= 9 Hz), 7.4-7.5 (m, 6 H), 7.26-7.32 (m, 6H), 7.16-7.22 (m, 3H), 7.02 (d, 2H, J= 9 Hz), 6.24 (dd, 1H, J= 2 & 10 Hz), 5.61 (d, 1H, J= 12 Hz), 5.56 (d, 1H, J= 12 Hz), 4.48 (m, 1H), 4.1 (m, 2H), 3.47 (d, 1H, J= 11 Hz), 3.23 (d, 1H, J=12 Hz), 3.2 (m, 1H), 2.62 (s, 3H), 2.59 (s, 3H), 1.75 (t, 1H, J= 11 Hz), 1.57 (t, 1H, J= 12 Hz), 1.33 (s, 9H), 1.33 (t, 6H, J= 7 Hz)
[G2 (이중 보호된 구아닌)에 대한 1H-NMR 데이터]
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.78 (s, 1H), 7.77 (s, 1H), 7.50 (d, 2H, J= 9 Hz), 7.4-7.5 (m, 6H), 7.26-7.33 (m, 6H), 7.15-7.22 (m, 3H), 7.02 (d, 2H, J= 9 Hz), 6.23 (dd, 1H, J= 2 & 10 Hz), 5.61 (d, 1H, J= 12 Hz), 5.56 (d, 1H, J= 12 Hz), 4.47 (m, 1H), 4.1 (m, 2H), 3.47 (d, 1H, J= 11 Hz), 3.22 (d, 1H, J= 12 Hz), 3.2 (m, 1H), 2.64 (s, 3H), 2.60 (s, 3H), 1.75 (t, 1H, J= 11 Hz), 1.58 (t, 1H, J= 11 Hz), 1.33 (s, 9H), 1.33 (t, 6H, J= 7 Hz)
IV. 부분입체이성질체적으로 순수한 활성화된 단량체와의 입체특이적 PMO 커플링의 실시예
하기 실시예는 입체특이적 커플링을 이용하여 입체화학적으로 균질한 생성물을 제조하는 것을 보고한다.
A. 활성화된 U-단량체 (U1 & U2) + U-모르폴린-NH (1)
Figure 112018021757960-pct00022
U 1 (11 mg, 0.018 mmol, 1 eq, 99.0% de)을 아세토니트릴 (0.11 ml)에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민 (8 ㎕, 0.05 mmol, 2.5 eq)과 혼합하였다. U-모르폴린-NH (1; 14 mg, 0.030 mmol, 1.6 eq)를 첨가하고, 초음파 처리를 적용하여 용해를 보조하였다. 0.5시간 교반한 후, 적은 분취량의 반응 혼합물을 CDCl3로 희석하고, 1H NMR에 의해 분석하였다. 나머지 모든 반응 혼합물을 HPLC 분석을 위해 아세토니트릴 (8 ml)로 희석하고, 냉동고에서 유지시켰다. 2의 입체특이적 형태를 HPLC 분석 (99.4% de)에 의해 확인하였다. 상기 프로토콜을 U 2 (95.6% de)의 커플링에 대해서도 사용하여, 3 (96.0% de)을 입체특이적으로 수득하였다.
U/U-커플링에 대한 분석용 HPLC 조건:
Figure 112018021757960-pct00023
Figure 112018021757960-pct00024
[2에 대한 1H-NMR 데이터]
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.6 (m, 4H), 7.2-7.5 (m, 20H), 7.1-7.2 (m, 3H), 6.15 (d, 1H, J= 8.0 Hz), 5.73 (d, 1H, J= 8.0 Hz), 5.66 (d, 1H, J= 8.0 Hz), 5.54 (d, 1H, J= 8.0 Hz), 4.40 (m, 1H), 3.93 (m, 2H), 3.81 (m, 1H), 3.70 (m, 2H), 3.41 (m, 2H), 3.40 (m, 3H), 3.11 (d, 1H, J= 12 Hz), 2.78 (m, 1H), 2.56 (s, 3H; NMe), 2.54 (s, 3H; NMe), 2.48 (m, 1H), 1.47 (t, 1H, J= 11 Hz), 1.35 (t, 1H, J= 11 Hz), 1.04 (s, 9H)
[3에 대한 1H-NMR 데이터]
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.6 (m, 4H), 7.3-7.5 (m, 11H), 7.2-7.3 (m, 9H), 7.1 (m, 3H), 6.12 (dd, 1H, J= 2.0 & 9.6 Hz), 5.71 (d, 1H, J= 8.4 Hz), 5.70 (d, 1H, J= 8.0 Hz), 5.47 (dd, 1H, J= 2.0 & 10.4 Hz), 4.31 (m, 1H), 3.97 (m, 1H), 3.85 (m, 1H), 3.73 (m, 2H), 3.65 (m, 1H), 3.31 (m, 2H), 3.24 (m, 1H), 3.07 (d, 1H, J= 12 Hz), 2.68 (m, 1H), 2.65 (s, 3H; NMe), 2.62 (s, 3H; NMe), 2.26 (m, 1H), 1.45 (t, 1H, J= 12 Hz), 1.29 (t, 1H, J= 11 Hz), 1.04 (s, 9H)
B. 활성화된 C-단량체 (C1 & C2) + C-모르폴린-NH (4)
Figure 112018021757960-pct00025
C 1 (20 mg, 0.031 mmol, 1 eq, 93.5% de)을 THF (0.40 ml)에 용해/현탁시키고, 디이소프로필에틸아민 (12 ㎕, 0.069 mmol, 2.3 eq)과 혼합하였다. THF (0.20 mL)에 용해된 모르폴리노-시토신 (4; 16 mg, 0.035 mmol, 1.1 eq)을 첨가하였다. 1.0-2.0시간 교반한 후, 적은 분취량의 반응 혼합물을 아세토니트릴로 희석하고, LC/MS에 의해 분석하였다. 분취량 (30-50 ㎕)의 반응 혼합물을 HPLC 분석을 위해 디클로로메탄 (0.6 ml)으로 희석하였다. 6의 입체특이적 형태를 HPLC 분석 (94.3% de)에 의해 확인하였다. 반응 혼합물을 바로 실리카 겔 칼럼 상에 로딩하고, 에틸 아세테이트 중 0-15%의 메탄올의 구배 이동 상으로 용리시켰다. 상기 프로토콜을 C 2 (90.2% de)의 C/C 커플링에 대해서도 사용하여, 5 (90.0% de)를 입체특이적으로 수득하였다.
C/C-커플링에 대한 분석용 HPLC 조건:
Figure 112018021757960-pct00026
Figure 112018021757960-pct00027
[5에 대한 1H-NMR 데이터]
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.9 (br, 1H), 7.69 (d, 1H, J = 7.4 Hz), 7.62 (m, 5H), 7.35-7.44 (m, 13H), 7.21-7.35 (m, 6H), 7.15 (m, 4H), 6.14 (br d, 1H, J= 7.8 Hz), 5.58 (dd, 1H, J= 2.4 & 9.4 Hz), 5.53 (br, 1H), 4.51 (dd, 1H, J= 8.6 & 10 Hz), 4.09 (m, 1H), 3.70-3.80 (m, 4H), 3.60 (dd, 1H, J= 6.3 & 10 Hz), 3.56 (d, 1H, J= 11 Hz), 3.28 (m, 1H), 2.96 (d, 1H, J= 11 Hz), 2.69 (s, 3H; NMe), 2.67 (s, 3H; NMe), 2.65 (m, 1H), 2.25 (m, 1H), 2.07 (s, 3H), 1.31 (t, 1H, J= 11 Hz), 1.13 (t, 1H, J= 11 Hz), 1.04 (s, 9H).
[6에 대한 1H-NMR 데이터]
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.57 (br, 1H), 7.62-7.70 (m, 7H), 7.35-7.50 (m, 14H), 7.23-7.35 (m, 4H), 7.12 (m, 4H), 6.31 (m, 1H), 5.79 (m, 1H), 5.70 (m, 1H), 4.61 (m, 1H), 4.03 (m, 1H), 3.80-3.90 (m, 2H), 3.72 (m, 2H), 3.58 (m, 1H), 3.48 (m, 1H), 3.09 (m, 1H), 2.75 (m, 1H), 2.58 (s, 3H; NMe), 2.55 (s, 3H; NMe), 2.53 (m, 1H), 2.38 (m, 1H), 2.21 (s, 3H), 1.47 (t, 1H, J= 10 Hz), 1.22 (t, 1H, J= 10 Hz), 1.06 (s, 9H).
C. 활성화된 A-단량체 (A1 & A2) + U-모르폴린-NH (1)
Figure 112018021757960-pct00028
A 1 (5.9 mg, 0.008 mmol)을 아세토니트릴 (118 ㎕)에 현탁시켰다. 디이소프로필에틸아민 (5 ㎕, 0.03 mmol)에 이어 모르폴리노-우라실 (1; 4.6 mg, 0.01 mmol)을 첨가하였다. 1분 동안 초음파 처리를 적용하고, 생성된 균질한 혼합물을 주위 온도에서 교반하였다. 밤새 교반한 후, 혼합물 (진한 백색 페이스트)을 아세토니트릴 (5.0 ml) 및 메탄올 (0.30 ml)의 혼합물로 희석하여, 균질하고 투명한 용액을 수득하였다. 적은 분취량을 추가의 희석없이 바로 HPLC에 의해 분석하였다.
A 2 (F2; 5.0 mg, 0.007 mmol)를 아세토니트릴 (100 ㎕)에 현탁시켰다. 디이소프로필에틸아민 (4 ㎕, 0.02 mmol)에 이어 모르폴리노-우라실 (4.1 mg, 0.009 mmol)을 첨가하였다. 1분 동안 초음파 처리를 적용하고, 생성된 진한 현탁액을 주위 온도에서 교반하였다. 밤새 교반한 후, 아세토니트릴 (5.0 ml)을 첨가하고, 초음파 처리를 적용하여, 균질하고 투명한 용액을 수득하였다. 적은 분취량을 추가의 희석없이 바로 HPLC에 의해 분석하였다.
U/A-커플링에 대한 분석용 HPLC 조건:
Figure 112018021757960-pct00029
Figure 112018021757960-pct00030
D. 활성화된 G-단량체 (G1 & G2) + U-모르폴린-NH (1)
Figure 112018021757960-pct00031
G 1 (6.5 mg, 0.009 mmol, 1 eq, 99.9% de)을 THF (0.13 ml)에 용해/현탁시키고, 디이소프로필에틸아민 (3.6 ㎕, 0.02 mmol, 2.2 eq)과 혼합하였다. THF (0.07 mL)에 용해된 모르폴리노-우라실 (1; 4.7 mg, 0.010 mmol, 1.1 eq)을 첨가하였다. 1.0-2.0시간 교반한 후, 적은 분취량의 반응 혼합물을 아세토니트릴로 희석하고, LC/MS에 의해 분석하였다. 분취량 (100 ㎕)의 반응 혼합물을 HPLC 분석을 위해 디클로로메탄 (0.4 ml)으로 희석하였다. 9의 입체특이적 형태를 HPLC 분석 (99.9% de)에 의해 확인하였다.
U/G-커플링에 대한 분석용 HPLC 조건:
Figure 112018021757960-pct00032
Figure 112018021757960-pct00033
상기 보고된 실질적으로 부분입체이성질체적으로 순수한 화합물을 사용하여 입체화학적으로 순수한 올리고뉴클레오티드 및 다른 화합물을 제조하였다. 잠재적인 올리고뉴클레오티드의 예는 예를 들어 Summerton, J (1999). "Morpholino Antisense Oligomers: The Case for an RNase-H Independent Structural Type.". Biochimica et Biophysica Acta 1489 (1): 141-58; 및 Summerton, J; Weller D. (1997). "Morpholino Antisense Oligomers: Design, Preparation and Properties". Antisense & Nucleic Acid Drug Development 7 (3): 187-95에 도시되어 있다. 상기 두 문헌은 본원에 참고로 포함된다.
V. 16합체 PMO의 입체특이적 합성 및 생물리학적 검정에 의한 입체이성질체의 구별의 실시예
이 실시예는 활성화된 단량체를 사용하는 입체특이적 커플링을 통해 한 쌍의 입체적으로 순수한 16합체 PMO를 표적으로 하는 합성을 보고한다. 이들 PMO는 그들의 인 연결에 대해 반대의 입체화학적 정렬을 가졌다.
표적 서열:
Figure 112018021757960-pct00034
입체적으로 순수한 활성 단량체 (빌딩 블록):
Figure 112018021757960-pct00035
Figure 112018021757960-pct00036
16합체 PMO의 입체특이적 합성 및 생물리학적 검정에 의한 입체이성질체의 구별의 개략도는 도 6에 도시된다. 16합체 PMO 입체이성질체 1 및 입체이성질체 2는 50 mg 규모 (출발 수지 중량)에서 아미노메틸폴리스티렌-디술피드 수지 (~300 ㎛ol/g 로딩, 미국 특허 출원 공보 번호 20090131624A1을 참고하며, 이는 본원에 참고로 포함됨) 상에서의 고체 상 합성에 의해 수동으로 제조하였다.
고체 상 합성을 위한 스톡 용액:
Figure 112018021757960-pct00037
각각의 PMO 커플링에 대한 작동 사이클:
Figure 112018021757960-pct00038
수지로부터 방출 및 탈보호:
수지-결합된 16합체 (탈트리틸화 이후)에 1:3 (v/v)의 28% 수성 암모니아/에탄올 (~5 ml)을 첨가하였다. 혼합물을 밀봉하고, 45℃에서 20시간 동안 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 혼합물을 여과하고, 메탄올로 세척하였다. 여액을 농축시키고, 15 mM 트리에틸암모늄 (TEAA) 완충제 pH 7.0에 대해 정용여과시켰다. 사용된 장치는 울트라셀(Ultracel) 1kDa UF 막을 구비한 아미콘 스터드 셀 (Amicon Stirred Cell, 50 mL)이었다. 원래의 용매가 1% 원래 농도로 감소될 때까지 (대략 5 사이클) 샘플을 희석/농축에 의해 정용여과시킨 다음, 역상 제조용 HPLC 정제에 적용하였다.
PMO 정제를 위한 역상 제조용 HPLC 방법:
Figure 112018021757960-pct00039
PMO의 품질 평가를 위한 LC/MS 방법:
Figure 112018021757960-pct00040
융점 (Tm) 측정을 위한 물질 및 조건
입체화학적으로 구별되는 PMO와 상보성 RNA의 착물의 열 용융 특징:
Figure 112018021757960-pct00042
입체이성질체 1 및 2에 대한 융점을 도 7에 도시하였다. 상이한 융점을 기준으로 하여, 별도의 양의 실질적으로 순수한 입체이성질체를 제조하였음을 결론내릴 수 있다.
VI. 입체적으로 순수한 PMO 디뉴클레오티드 화합물 100 (5'-TA2-3')의 입체특이적 합성 및 절대 입체화학 지정
Figure 112018021757960-pct00043
늦게 용리되는 활성 A 단량체 (A 2 ; 200 mg, 0.277 mmol, 1 eq)를 아세토니트릴 (2.0 ml) 및 DIPEA (0.12 ml, 0.69 mmol, 2.5 eq)의 혼합물에 용해시켰다. 이어서, T-모르폴린-NH (1; 146 mg, 0.305 mmol, 1.1 eq)를 첨가하고, 투명한 용액이 수득될 때까지 생성된 현탁액을 수분 동안 초음파 처리하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. LC/MS에 의해 반응의 완료를 모니터링한 후, 혼합물을 농축시키고, 칼럼 크로마토그래피 (DCM 중 3% 메탄올, 바이오테이지 스냅울트라(Biotage SnapUltra) 10 g SiO2)에 적용하였다. 깨끗한 생성물 분획들을 합하고, 진공하에 농축시켜, 완전히 보호된 입체적으로 순수한 5'-TA-3' 디뉴클레오티드 2를 백색 고체 (240 mg, 0.206 mmol, 74% 수율)로서 수득하였다.
Figure 112018021757960-pct00044
25 ml 플라스크 중 완전히 보호된 디뉴클레오티드 2 (500 mg, 0.429 mmol)에 2,2,2-트리플루오로에탄올 (TFE; 4.0 ml) 및 아세트산 (1.0 ml)을 실온에서 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 교반하고, LC/MS에 의해 모니터링하였다. 30분 후, 반응을 포화 수성 NaHCO3 및 DCM으로 켄칭시켰다. 2개의 층을 분리하고, 수성 층을 다시 추출하였다. 모든 유기 층들을 합하고, 절반-포화된 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축하여, 조 생성물을 백색 발포체로서 수득하였다. 조 생성물을 칼럼 크로마토그래피 (아세톤 중 20% MeOH, 바이오테이지 스냅 울트라 25 g SiO2 카트리지)에 의해 정제하여, 부분적으로 보호된 디뉴클레오티드 3을 유리질 고체 (300 mg, 0.325 mmol, 76% 수율)로서 수득하였다.
부분적으로 보호된 디뉴클레오티드 3 (250 mg, 0.271 mmol)을 메탄올 (12.5 ml) 및 THF (12.5 mL)의 혼합물에 용해시키고, 실온에서 1 M NaOH (10.8 ml)로 처리하였다. 실온에서 22시간 동안 교반한 후 (LC/MS에 의해 진행을 모니터링함), 혼합물을 1 M HCl (10.8 mL)로 중화시켜, pH를 8로 조정한 다음, 진공하에 농축 건조시켰다. 잔류물을 물 (5 mL)에 용해시키고, EtOAc (5 mL)로 세척하였다. 수성 층을 진공하에 농축 건조시켜, 조 생성물을 백색 고체 (480 mg)로서 수득하였다. 조 생성물을 크기 배제 크로마토그래피 (세파덱스(Sephadex®) LH-20, MeOH/물 4:1)에 의해 정제하여, 완전히 탈보호된 디뉴클레오티드 화합물 100을 백색 고체 (137 mg, 0.236 mmol, 87% 수율)로서 수득하였다.
화합물 100 수성 용액 (200 mg/ml)의 액적을 순수한 물과 함께 1일 동안 웰에 밀봉시켜, 단결정을 성장시켰다. 단결정의 X-선 구조를 통해 인 연결의 절대 배치가 S임을 확인하였다. 이 X-선 구조를 도 8에서 ORTEP 플롯으로 도시하였다. 별도의 단편의 ORTEP 플롯을 도 9a 및 도 9b에 도시하였다. X-선 데이터를 하기 보고된 바와 같이 수집하였다.
데이터 수집
화합물 100 (C22H33N10O7P)의 단결정을 유리 섬유 상에 탑재하였다. 모든 측정은 흑연 단색화 Cu-Kα 방사선 조사를 이용하여 회절계 상에서 수행하였다.
7.75 < 2θ < 147.10o 범위에서 주의해서 중심을 맞춘 36473개 반사의 설정 각을 이용하여 최소 제곱법 정밀화(least-squares refinement)로부터 수득한, 데이터 수집을 위한 셀 상수 및 배향 행렬(orientation matrix)은 하기 치수를 갖는 C-중심 단사정계 셀에 상응하였다:
a = 33.3523(2) Å
b = 13.80020(11) Å β = 96.8075(6)o
c = 14.19956(10) Å
V = 6489.53(8) Å3
Z = 4 및 F.W. = 580.54의 경우, 계산된 밀도는 0.594 g/cm3이었다. hkl: h+k = 2n의 반사 조건, 팩킹 고려사항, 강도 분포의 통계적 분석, 및 구조의 성공적인 해결(solution) 및 정밀화(refinement)를 기준으로 하여, 공간 군을 C2 (#5)로 결정하였다.
데이터를 23 ± 1℃의 온도에서 ω-2θ 스캔 기술을 이용하여 147.7o의 최대 2θ 값에 대해 수집하였다. 데이터 수집 이전에 이루어진 몇몇 강력한 반사의 오메가 스캔은 6.0o의 인출각(take-off angle)하에 0.00o의 절반-높이에서의 평균 폭을 가졌다. (0.00 + 0.00 tanθ)o의 스캔은 0.0o/분 (ω)의 속도에서 이루어졌다.
데이터 정리
50795개 반사를 수집하였고, 여기서 12008개는 특유의 반사였다 (Rint = 0.0453). 데이터를 크리스알리스프로(CrysAlisPro, 리가쿠 옥스포드 디프랙션(Rigaku Oxford Diffraction))를 이용하여 수집 및 가공하였다. (크리스알리스프로: 데이터 수집 및 가공 소프트웨어, 리가쿠 코퍼레이션(Rigaku Corporation) (2015). 일본 196-8666 도쿄). 감쇠 보정은 적용하지 않았다.
Cu-Kα 방사선 조사에 대한 선형 흡수 계수 μ는 6.011 cm- 1이었다. 실험적 흡수 보정을 0.341 내지 1.000 범위의 투과 인자에서 생성된 것에 적용하였다. 데이터를 로렌츠(Lorentz) 및 편광 효과에 대해 보정하였다.
구조 해결 및 정밀화
구조를 직접적인 방법 (쉘렉스티 ( SHELXT ) 버젼 2014/5: Sheldrick, G. M. (2014). Acta Cryst. A70, C1437)에 의해 해결하고, 푸리에(Fourier) 기술을 이용하여 확장시켰다. 비-수소 원자를 이방성으로 정밀화하였다. 수소 원자를 라이딩(riding) 모델을 이용하여 정밀화하였다. F2에 대한 전체 행렬(full-matrix) 최소 제곱법 정밀화의 최종 사이클 (최소화된 최소 제곱법 함수 이용: (쉘렉스엘(SHELXL) 버젼 2014/7); Σw(Fo 2-Fc 2)2, 여기서 w = 최소 제곱법 중량임)은 12008개 관찰된 반사 및 849개 변수 파라미터를 기준으로 하였고, 비칭량된 및 칭량된 하기 동의 인자(agreement factor)를 이용하여 수렴하였다 (가장 큰 파라미터 이동은 그의 esd의 0.00배이었음):
R1 = Σ||Fo| - |Fc|| / Σ|Fo| = 0.0522
wR2 = [Σ(w(Fo 2 - Fc 2)2) / Σw(Fo 2)2]1/2 = 0.1632
적합도(goodness of fit)는 1.45이었다. 적합도는 [Σw(Fo 2-Fc 2)2/(No-Nv)]1/2 (여기서, No = 관찰의 개수 및 Nv = 변수의 개수임)로서 정의된다.
단위 중량을 이용하였다. 푸리에 최종 차이 맵(final difference map)에 대한 최대 및 최소 피크는 각각 1.79 및 -0.69 e-/Å3에 상응하였다. 최종 플랙(Flack) 파라미터는 0.029(7)이었고, 이는 구조가 인버젼-트윈(inversion-twin)임을 나타낸다. (Parsons, S. and Flack, H. (2004), Acta Cryst. A60, s61; Flack, H.D. and Bernardinelli (2000), J. Appl. Cryst. 33, 114-1148).
중성 원자 산란 인자를 International Tables for Crystallography (IT), Vol. C, Table 6.1.1.4로부터 구하였다. (International Tables for Crystallography, Vol.C (1992). Ed. A.J.C. Wilson, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Netherlands, Table 6.1.1.4, pp. 572). 변칙 분산 효과를 Fcalc에 포함시켰고 (Ibers, J. A. & Hamilton, W. C.; Acta Crystallogr., 17, 781 (1964)); Δf' 및 Δf"에 대한 값은 크리그(Creagh) 및 맥올리(McAuley)에 의한 것이었다. (Creagh, D. C. & McAuley, W.J.; "International Tables for Crystallography", Vol C, (A.J.C. Wilson, ed.), Kluwer Academic Publishers, Boston, Table 4.2.6.8, pages 219-222 (1992)). 질량 감쇠 계수에 대한 값은 크리그 및 허벨(Hubbell)에 의한 것이었다. (Creagh, D. C. & Hubbell, J.H..; "International Tables for Crystallography", Vol C, (A.J.C. Wilson, ed.), Kluwer Academic Publishers, Boston, Table 4.2.4.3, pages 200-206 (1992)). 모든 계산은, 쉘렉스엘 버젼 2014/7을 이용하여 수행한 정밀화를 제외하고는, 크리스탈스트록쳐(CrystalStructure) 결정학 소프트웨어 팩키지를 이용하여 수행하였다. (크리스탈스트록쳐 4.2: 결정 구조 분석 팩키지, 리가쿠 코퍼레이션 (2000-2015). 일본 196-8666 도쿄; 쉘렉스엘 버젼 2014/7: Sheldrick, G. M. (2008). Acta Cryst. A64, 112-122).
결정 데이터, 강도 측정, 및 구조 해결 및 정밀화는 하기에 나타낸 바와 같다:
A. 결정 데이터
실험식 C22H33N10O7P
화학식 중량 580.54
결정 색상, 습성 nONE, nONE
결정 치수 기재되지 않음
결정계 단사정계
격자 유형 C-중심
단위에 대해 이용된 반사의 개수
셀 측정 (2θ 범위) 36473 (7.7 - 147.1o)
절반 높이에서 오메가 스캔 피크 폭 0.00o
격자 파라미터 a = 33.3523(2) Å
b = 13.80020(11) Å
c = 14.19956(10) Å
β = 96.8075(6)o
V = 6489.53(8) Å3
공간 군 C2 (#5)
Z 값 4
Dcalc 0.594 g/cm3
F000 1224.00
μ(CuKα) 6.011 cm-1
B. 강도 측정
회절계
방사선 조사 CuKα (λ = 1.54187 Å)
흑연 단색화
인출각 2.8°
검출기 구경 2.0 - 2.5 mm 수평
2.0 mm 수직
결정과 검출기의 거리 21 mm
온도 23.0℃
스캔 유형 ω-2θ
스캔 속도 0.0o/분 (ω) (0 스캔까지)
스캔 폭 (0.00 + 0.00 tanθ)o
2θmax 147.7o
측정된 반사의 개수 총: 50795
특유의 반사: 12008 (Rint = 0.0453)
파슨스 지수(Parsons quotient)
(플랙 x 파라미터): 4813
보정 로렌츠-편광
흡수
(투과 인자: 0.341 - 1.000)
C. 구조 해결 및 정밀화
구조 해결 직접적인 방법
(쉘렉스티 버젼 2014/5)
정밀화 F2에 대한 전체 행렬 최소 제곱법
최소화된 함수 Σw (Fo2 - Fc2)2
최소 제곱법 중량 w = 1/[σ2(Fo2) + (0.1000·P)2
+ 0.0000·P]
여기서, P = (Max(Fo2,0) + 2Fc2)/3
2θmax 컷오프 147.7o
변칙 분산 모든 비-수소 원자
관찰의 개수 (모든 반사) 12008
변수의 개수 849
반사/파라미터 비 14.14
잔차: R1 (I>2.00σ(I)) 0.0522
잔차: R (모든 반사) 0.0534
잔차: wR2 (모든 반사) 0.1632
적합도 지표 1.450
플랙 파라미터 (파슨스 지수 = 4813) 0.029(7)
최종 사이클에서 최대 이동/오차 0.001
최종 차이 맵에서 최대 피크 1.79 e-/Å3
최종 차이 맵에서 최소 피크 -0.69 e-/Å3
[화합물 100에 대한 1H-NMR 데이터]
1H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.25 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.40 (s, 1H), 5.85 (d, 1H), 5.45 (d, 1H), 4.25 (m, 2H), 4.05 (m, 1H), 3.85 (m, 1H), 3.6 (m, 2H), 3.4 (m, 4H), 2.90 (m, 4H), 2.60 (d, 6H), 1.8 (s, 3H).
본 출원에서 언급된 모든 문헌들은 본원에 참고로 포함된다. 인용된 문헌과 본 문헌 사이에 임의의 불일치함이 있는 경우에는, 본 문헌이 우선이다.
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Claims (27)

1종 이상의 입체화학적으로 순수한 포스포르아미도클로리데이트 모르폴리노 단량체를 선택하는 단계; 및
선택된 1종 이상의 입체화학적으로 순수한 포스포르아미도클로리데이트 모르폴리노 단량체의 입체특이적 커플링에 의해 부분입체이성질체적으로 순수한 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머를 합성하는 단계를 포함하고,
여기서, 상기 입체특이적 커플링은 비양성자성 용매 중에서 비-친핵성 3급 아민 또는 방향족 염기의 존재 하에 20℃ 내지 50℃의 온도에서 수행되고,
여기서, 1종 이상의 입체화학적으로 순수한 포스포르아미도클로리데이트 모르폴리노 단량체는 포스포르아미도클로리데이트 모르폴리노 단량체의 부분입체이성질체 혼합물을 입체화학적으로 순수한 포스포르아미도클로리데이트 단량체로 분리함으로써 수득되고,
여기서, 입체화학적으로 순수하다는 것은 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체 과잉률이 각각 87% 이상인 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체를 지칭하고, 부분입체이성질체적으로 순수하다는 것은 부분입체이성질체 과잉률이 87% 이상인 부분입체이성질체를 지칭하는 것인,
키랄성 인 연결을 포함하는 부분입체이성질체적으로 순수한 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 부분입체이성질체적으로 순수한 올리고머가 적어도 90% 부분입체이성질체적으로 순수한 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 부분입체이성질체적으로 순수한 올리고머가 적어도 95% 부분입체이성질체적으로 순수한 것인 방법.
제3항에 있어서, 상기 부분입체이성질체적으로 순수한 올리고머가 적어도 99% 부분입체이성질체적으로 순수한 것인 방법.
제4항에 있어서, 상기 부분입체이성질체적으로 순수한 올리고머가 100% 부분입체이성질체적으로 순수한 것인 방법.
제1항에 있어서, 부분입체이성질체 혼합물의 분리가, 크로마토그래피 및 결정화로 이루어진 군의 적어도 하나의 구성원에 의해 일어나는 것인 방법.
제6항에 있어서, 크로마토그래피가 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 모의 이동층 크로마토그래피 및 향류 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항 내지 제5항, 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 입체화학적으로 순수한 포스포르아미도클로리데이트 모르폴리노 단량체가 하기 화학식 20의 화합물, 화학식 21의 화합물, 화학식 22의 화합물, 화학식 23의 화합물, 화학식 24의 화합물, 화학식 25의 화합물, 화학식 26의 화합물, 화학식 27의 화합물, 화학식 28의 화합물, 화학식 29의 화합물, 화학식 30의 화합물 및 화학식 31의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물 중 어느 하나 및 이들의 거울상 이성질체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법:



상기 식에서,
R1 및 R2는 동일하거나 상이할 수 있고, -H, 치환 또는 비치환된 C1-C3 알킬, 치환 또는 비치환된 페닐, 치환 또는 비치환된 나프틸로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 그들이 부착되어 있는 질소와 함께, 피롤리딘, 피페라진 및 모르폴린으로부터 선택되는, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클을 형성하고;
R3은 치환 또는 비치환된 트리틸 (Tr), MMTr (p-메톡시페닐디페닐메틸), 치환 또는 비치환된 벤질, 4-메톡시벤질 (PMB, MPM), 3,4-디메톡시벤질, 디페닐메틸 (Dpm), 4-메톡시벤질, 및 2-니트로벤젠술포닐, 4-니트로벤젠술포닐 및 2,4-디니트로벤젠술포닐로 이루어진 군으로부터 선택된 절단가능한 술포닐로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4, R5 및 R6은 -H, -C(O)R7 및 -C(O)OR7로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R7은 C1-C6 알킬, 벤질, 2,2,2-트리클로로에틸, 또는 치환 또는 비치환된 아릴이고;
R9는 치환 또는 비치환된 알킬, 시아노에틸, 아실, 카르보네이트, 카르바메이트, 치환 또는 비치환된 벤질, 4-피발로일옥시 벤질 및 실릴로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제8항에 있어서, R7이 이소프로필, 페닐, 4-메톡시 페닐, 4-브로모페닐 및 4-니트로페닐로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
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