KR102690377B1 - 그람 음성 외막 소포 상에서 항원의 표면 디스플레이 - Google Patents

그람 음성 외막 소포 상에서 항원의 표면 디스플레이 Download PDF

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Abstract

본 발명은 그람-음성 박테리아의 표면 발현된 리포단백질의 N-말단 부분을 포함하는 융합 단백질의 일부로서 발현된 병원체의 항원을 디스플레이하는 그람-음성 외막 소포에 기초한 백신 조성물 및 백신화에서 이러한 조성물의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 그람-음성 박테리아의 표면 발현된 리포단백질의 N-말단 부분 및 이에 융합된 병원체의 항원을 포함하는 융합 리포단백질, 이러한 융합 리포단백질을 발현하기 위한 DNA 구조물 및 박테리아 숙주 세포, 및 상기 융합 리포단백질을 디스플레이하는 외막 소포의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

그람 음성 외막 소포 상에서 항원의 표면 디스플레이
본 발명은 의학 분야, 특히 백신학, 의학 미생물학, 세균학 및 면역학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 병원체의 항원, 바람직하게는 보렐리아(Borrelia) 항원을 디스플레이하는 그람 음성 외막 소포(vesicle)에 기초한 백신 조성물 및 백신 접종에 이들 조성물의 용도에 관한 것이다.
외막 소포(OMV)는 그람 음성 박테리아에 의해 자발적으로 생성되는 외막(OM)의 구형 발아체이다. 이들은 OM 단백질, LPS, 인지질 및 포획된 주변세포질 성분을 포함하여 구성된다. 이들의 우수한 면역 자극 특성(1-3)과 생산 용이성 때문에, OMVs는 백신 후보물질로서 점점 더 많은 주목을 받고 있다. 마우스에서 면역화 연구에 따르면 OMVs는 다양한 병원성 박테리아를 갖는 챌린지에 대해 보호할 수 있는 것으로 입증되었다(4-12). 나이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis)의 경우, OMV 백신은 임상 시험에서 광범위하게 조사되었으며, 나이세리아(Neisseria)(MenBvac 및 MeNZB)에 대한 2개의 OMV-베이즈드 백신은 이미 인간용으로 이용가능하다(13, 14).
이들의 본질적인 애주번트(adjuvant) 특성 때문에, 이종 항원에 대한 운반 비이클(delivery vehicle)로서의 OMVs의 사용은 상당한 관심을 얻고 있다(15). 여러 연구에서 이종 단백질과 숙주의 신호 펩타이드 또는 캐리어 단백질의 융합에 의해 그람 음성 박테리아의 주변세포질 또는 OM에서 이종 항원이 발현되면 OMVs에 포함될 수 있음이 입증되었다(1-3, 16-19). 중요하게도, 그러한 재조합 OMVs는 면역화된 마우스에서 이종 항원에 대한 면역 반응을 유도할 수 있으며(2, 3, 12, 17, 18), 항원이 유래된 병원체로 치명적인 다른 챌린지에 대해 이들을 보호할 수 있다(3, 17).
어느 정도까지 OMV 내 이종 항원의 특정 위치(주변세포질/OM의 내부/OM의 외부)가 면역 반응에 영향을 미치는 지는 미결 문제로 남아있다. 이론적으로, OMV의 외부 표면은 B-세포 리셉터의 바인딩에 대한 최상의 접근성을 제공하므로 최상의 선택인 것으로 보인다(17). 표면 노출된 항원이 보다 우수한 면역 반응을 유발한다는 증거가 실제로 축적되어 있어서(20-24), 이종 항원을 특별히 관심있는 OMV 표면에 정확하게 표적할 수 있도록 한다.
박테리아 세포의 외부 표면에 이종 단백질의 발현을 특이적으로 표적하는 다양한 발현 시스템이 개발되었다(리뷰에 대해 (25-29) 참조). 그러나, 이러한 많은 시스템은 단백질의 작은 부분만 디스플레이할 수 있으며, 낮은 발현 수준으로 방해를 받는다(30). 가장 다용도적인(versatile) 두 가지 방법은 이종 단백질을 아이스 핵 형성 단백질(Ice Nucleation Protein)(25, 31) 또는 자가전달자(autotransporters)(21, 32-35)에 융합시켜 세포 표면에 도달시키는 것이다. 최근에, 두 시스템 모두 다중 효소/항원으로 OMVs의 표면을 데코레이션하는 데에도 사용되었다(21, 31).
리포단백질(Lipoproteins)은 탁월한 면역자극 특성 및 독성 인자로서의 역할 때문에 보호적 면역의 핵심 표적으로 떠오르고 있는 막 바인딩된 단백질이다. 예를 들어, OspA(보렐리아 버그도르페리(Borrelia burgdorferi))와 fHbp (N.메닝지티디스(N.meningitidis))는 모두 각각, 라임병(36-39) 및 수막염(40, 41)에 대한 백신 성분으로 광범위하게 연구되어 왔다. 그러나 OMVs에서 이종 리포단백질의 표면 발현은 지금까지 탐색되지 않았다.
리포단백질은 N-말단 시스테인 상에 지질-변형을 전달하며, 소수성 막에서의 친수성 단백질의 앵커링(anchoring)을 용이하게 한다. 이 고 보존된 단백질 리피드화(lipidation) 모티프는 Toll 유사 리셉터(Toll like receptor) TLR2를 통해 포유동물의 선천적 면역계에 의해 인식되어 우수한 면역자극 특성을 가진 리포단백질을 제공한다(44, 45). 그람 음성 박테리아에서, 대부분의 리포단백질은 내막 또는 외막의 주변세포질 측면 상에서 발견된다. 이들은 Lol(리포단백질의 국소화) 기계 장치에 의해 내막에서 외막으로 옮겨진다(46). 외막의 세포 외 측면 상에 위치한 리포단백질은 흔하지 않으며, 외막을 통한 전달을 안내하는 시스템 또는 신호는 아직 밝혀지지 않았다.
보렐리아(Borrelia)에서 리포단백질은 기본적으로(by default) 외막의 외부로 옮겨지는 것으로 보이기 때문에, 이 스피로헤타(spirochete)의 표면은 비정상적으로 리포단백질이 풍부하다(47). 표면 국소화가 있는 보렐리아(Borrelia) 리포단백질의 일 예는 OspA이며, OspA가 라임병(Lyme disease)에 대한 백신 성분으로 광범위하게 조사되어왔기 때문에, 그 면역원성 및 구조에 대한 상세한 지식이 이용가능하다.
라임병은 유럽과 미국에서 가장 흔한 벡터 매개(vector-borne) 질병이다. 라임 병은 감염된 진드기에 의한 물린 결과로 B. 버그도르페리 센수 라토(B. burgdorferi sensu lato) 복합체의 스피로헤타 감염에 의해 유발되는 다체계성(multisystemic) 염증 질환이다. 감염이 항생제로 치료되지 않으면, 결국 심각한 병리학이 있는 만성 질병으로 발전할 수 있다. 인간용으로 이용할 수 있는 유일한 백신(Lymerix)은 재조합 리피드화 OspA에 기초하였다. 자가 면역 부작용에 대한 클레임으로 인해 판매가 저조한 이 백신은 도입 후 3년 만인 2002년에 시장에서 자발적으로 철회되었다(49). 그러나, 부작용 클레임은 나중에 입증되지 않았으며(50), 최근의 라임 백신 개발은 논란의 여지가 많은 에피토프가 제거된 OspA를 여전히 목표로 하고 있다(38, 39).
그러나, 보렐리아(Borrelia) 항원과 같은 그 표면에 병원체의 항원을 디스플레이하는 그람 음성 외막 소포에 기초한 개선된 백신 조성물, 및 예를 들어 라임병에 대한 백신에서의 이들 조성물의 용도에 대해 당업계에 여전히 요구가 존재한다.
제1견지로, 본 발명은 N-말단 및 C-말단 융합 파트너를 포함하는 융합 리포단백질에 관한 것으로, 여기서 a) N-말단 융합 파트너는 N-말단에서 C-말단 순서로 i) 리피드화된 N-말단 시스테인; ii) 그람 음성 박테리아의 표면 노출된 리포단백질의 테더(tether), 여기서 바람직하게 테더는 리피드화된 N-말단 시스테인에 인접하여 위치함; 및 바람직하게는, iii) 그람 음성 박테리아의 표면 노출된 리포단백질의 아미노산 서열에서 테더의 C-말단에 위치하는 적어도 5개, 10개 또는 17개의 연속 아미노산의 스트레치를 포함하며; 그리고 여기서 상기 N-말단 융합 파트너는 그 안에서의 발현시 그람 음성 박테리아의 세포 외 외막 표면 상에서의 융합 리포단백질의 발현을 일으키고; 그리고, b) C-말단 융합 파트너는 감염성 질병 및/또는 종양과 관련된 항원의 적어도 하나의 에피토프를 포함하고, 그리고 여기서 바람직하게, 상기 융합 리포단백질의 아미노산 서열은 자연적으로 발생하지 않는다. 바람직하게, 융합 리포단백질에서, N-말단 융합 파트너는 그람 음성 박테리아의 표면 노출된 지단백질로부터의 N-말단 프래그먼트를 포함하고, 그리고 여기서 상기 프래그먼트는 그람 음성 박테리아에서 발현될 경우에 융합 리포단백질의 표면 발현을 일으킨다. 바람직하게, N-말단 프래그먼트는 나이세리아(Neisseria) 속 박테리아의 그람 음성 박테리아, 바람직하게는 나이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis), 나이세리아 고노로이애(Neisseria gonorrhoeae) 또는 N. 락타미카(N. lactamica)의 표면 노출된 리포단백질이고, 보다 바람직하게 표면 노출된 리포단백질은 fHbp, LpbB, TbpB, HpuA, NHBA 및 Ag473으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 바람직한 융합 리포단백질에서, N-말단 융합 파트너는 적어도 a) SEQ ID NO: 1의 20-38번 위치의 아미노산 서열과 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1의 20-50번 위치의 아미노산 서열과 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; b) SEQ ID NO: 2의 21-61 또는 21-63번 위치의 아미노산 서열과 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 바람직하게는 SEQ ID NO: 2의 21-73 또는 21-75번 위치의 아미노산 서열과 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는 c) SEQ ID NO: 3의 23-51번 위치의 아미노산 서열과 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 바람직하게는 SEQ ID NO: 3의 23-63번 위치의 아미노산 성ㄹ과 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 융합 리포단백질에서, C-말단 융합 파트너는 N-말단 융합 파트너의 서열이 유래된 표면 노출 리포단백질로부터의 아미노산 서열이 결여되어 있다.
본 발명의 융합 리포단백질의 C-말단 융합 파트너는 바람직하게는 감염 인자 또는 종양의 단백질성 항원으로부터 표면 노출된 에피토프를 포함하거나 이로부터 구성된다. 더욱 바람직하게는, C-말단 융합 파트너는 표면 노출된 박테리아 단백질 또는 리포단백질의 표면 노출된 도메인을 포함하거나 이로 구성된다. 표면 노출된 박테리아 단백질 또는 리포단백질은 바람직하게는 OspA, OspB, OspC, OspF, VlsE, BbCRASP1, Vsp1, P35(BBK32), P37(BBK50), P39, P66, DpbA 및 BB017로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 보렐리아(Borrelia) 표면 리포단백질이다. 보다 바람직하게, 보렐리아(Borrelia) 표면 리포단백질은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 29-273 또는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 29-273 또는 SEQ ID NO: 59의 아미노산 136-210을 포함하거나 이로 구성된다.
제2견지로, 본 발명은 본 발명의 융합 리포단백질을 포함하는 OMV에 관한 것으로, 여기서 OMV는 바람직하게는 계면활성제(detergent) 추출된 OMV가 아니다. 계면활성제 추출되지 않은 적합한 OMV는 상청액 OMV 또는 네이티브 OMV이며, 여기서 바람직하게 OMV는 네이티브 OMV이다.
본 발명의 융합 리포단백질을 포함하는 OMV는 바람직하게: a) 박테리아가 감소된 독성을 갖는 LPS를 생산하게 하는 유전적 변형(genetic modification), 여기서 바람직하게 유전적 변형은 lpxL1, lpxL2 및 lpxK 유전자 또는 그의 호모로그 중 적어도 하나의 발현을 감소시키거나 제거하고 및/또는 lpxE, lpxF 및 pagL 유전자 중 적어도 하나의 발현을 증가시킴; b) 소포 형성을 증가시키는 유전적 변형, 여기서 바람직하게 유전적 변형은 ompA 유전자 또는 이의 호모로그, 보다 바람직하게는 rmpM 유전자 또는 이의 호모로그의 발현을 감소시키거나 제거함; 및 c) 세포 표면 노출된 리포단백질의 단백질분해 방출을 억제하는 유전적 변형, 여기서 바람직하게, 유전적 변형은 nalP 유전자 또는 이의 호모로그의 발현을 감소시키거나 제거함;으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전적 변형을 갖는 그람 음성 박테리아로부터 획득되는/획득가능한 것이다. 본 발명의 OMV가 생산되는 그람 음성 박테리아는 바람직하게 나이세리아(Neisseria), 보르데텔라(Bordetella), 에세리키아(Echerichia) 및 살모넬라(Salmonella)로 구성되는 그룹에서 선택된 속에 속하며, 더욱 바람직하게 상기 박테리아는 나이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 에세리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)로 구성되는 그룹으로부터 선택된 종에 속한다.
제3견지로, 본 발명은 본 발명의 OMV 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
제4견지로, 본 발명은 의약으로서 사용하기위한, 본 발명에 따른 OMV 또는 OMV를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
제5견지로, 본 발명은 항원과 관련된 감염성 질병 또는 종양의 예방 또는 치료를 위한 본 발명에 따른 OMV 또는 OMV를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이며, 여기서 바람직하게는 감염성 질병이 보렐리아(Borrelia) 감염, 보다 바람직하게는 보렐리아 버그도르페리(Borrelia burgdorferi)) 감염이다.
제6견지로, 본 발명은 그람 음성 박테리아에서 발현시 프리-프로퓨전 리포단백질이 본 발명의 융합 리포 단백질로 성숙하는 프리-프로퓨전 리포단백질을 암호화하는 핵산 분자에 관한 것으로, 그리고 여기서 바람직하게는 핵산 분자는 그람 음성 박테리아에서 프리-프로퓨전 리포단백질의 발현을 위한 발현 구조물이다.
제7견지로, 본 발명은 핵산 분자 또는 프리-프로퓨전 리포단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자 또는 발현 구조물을 포함하는 그람 음성 박테리아 숙주 세포에 관한 것으로, 여기서 바람직하게 그람 음성 박테리아는 나이세리아(Neosseria), 보르데텔라(Bordetella), 에세리키아(Escherichia) 및 살모넬라(Salmonella)로 구성되는 그룹으로부터 선택된 속에 속하며, 보다 바람직하게 상기 박테리아는 나이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 에세리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)로 구성되는 그룹으로부터 선택된 종에 속한다.
제8견지로, 본 발명은 본 발명의 융합 리포단백질을 포함하는 OMV를 제조하는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 방법은 i) 프리-프로퓨전 리포단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자 또는 발현 구조물을 포함하는 그람 음성 박테리아 숙주 세포를 배양하는 단계; ii) 선택적으로 OMV를 추출하는 단계; 및 iii) OMV를 회수하는 단계를 포함하며, 여기서 회수는 적어도 OMV로부터 박테리아를 제거하는 것을 포함하고, 그리고 여기서 바람직하게 상기 방법은 계면활성제-프리이다.
정의
용어 "상동성(homology)", "서열 동일성(sequence identity)" 등은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 서열 동일성은 서열을 비교함으로써 결정된 바와 같이, 2개 이상의 아미노산(폴리펩타이드 또는 단백질) 서열 또는 2개 이상의 핵산(폴리뉴클레오타이드) 서열 간의 관계로 본 명세서에서 정의된다. 당해 분야에서, "동일성(identity)"은 아미노산 또는 핵산 서열 사이의 서열 관련성의 정도를 의미하며, 경우에 따라 그러한 서열의 스트링 사이의 일치에 의해 결정된다. 2개의 아미노산 서열 사이의 "유사성(similarity)"은 하나의 폴리펩타이드의 아미노산 서열 및 이의 보존된 아미노산 치환체를 제2폴리 펩타이드의 서열과 비교함으로써 결정된다. "동일성(identity)"과 "유사성(similarity)"은 알려진 방법으로 쉽게 계산할 수 있다.
"서열 동일성(sequence identity)" 및 "서열 유사성(sequence similarity)"은 두 서열의 길이에 따라 전역 또는 국소 정렬 알고리즘을 사용하여 두 펩타이드 또는 두 개의 뉴클레오타이드 서열을 정렬함으로써 결정될 수 있다. 유사한 길이의 서열은 전체 길이에 걸쳐 서열을 최적으로 정렬하는 전역 정렬 알고리즘(예, Needleman Wunsch)을 사용하여 정렬되는 것이 바람직하지만, 실질적으로 상이한 길이의 서열은 국소 정렬 알고리즘(예, Smith Waterman)을 사용하여 정렬되는 것이 바람직하다. 그 다음, 서열은 (예를 들어, 디폴트 파라미터를 사용하여 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬될 경우) 서열 동일성(하기 정의된 바와 같음)의 적어도 특정 최소 퍼센트를 공유할 경우, "실질적으로 동일(substantially identical)" 또는 "본질적으로 유사(essentially similar)"로 언급될 수 있다. GAP은 Needleman 및 Wunsch 글로벌 정렬 알고리즘을 사용하여 전체 길이(전장(full length))에 걸쳐 두 개의 서열을 정렬하고, 매치의 수를 최대화하며 갭의 수를 최소화한다. 전역 정렬은 두 서열이 유사한 길이를 갖는 경우, 서열 동일성을 결정하는 데 적합하게 사용된다. 일반적으로, gap 생성 패널티 = 50(nucleotides)/8 (proteins)과 gap 확장 패널티 = 3(nucleotides)/2(proteins)와 같은 GAP 디폴트 파라미터가 사용된다. 뉴클레오타이드의 경우 사용되는 디폴트 스코어링 매트릭스는 nwsgapdna이며, 그리고 단백질의 경우 디폴트 스코어링 매트릭스는 Blosum62이다(Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919). 서열 정렬 및 퍼센트 서열 동일성에 대한 스코어는 Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 USA에서 입수가능한 GCG Wisconsin Package, 버전 10.3과 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하거나, 또는 상기 GAP에 대해 동일한 파라미터를 사용하는 프로그램 "needle"(전역 Needleman Wunsch 알고리즘 사용)이나 EmbossWIN 버전 2.10.0의 "water"(국소 Smith Waterman 알고리즘 사용)와 같은 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여, 또는 디폴트 설정을 사용하여('needle'과 'water' 모두 그리고 단백질과 DNA 정렬 모두에 대해, 디폴트 Gap 오프닝 패널티는 10.0이고, 디폴트 갭 확장 패널티는 0.5이며; 디폴트 스코어링 매트릭스는 단백질의 경우 Blossum62이고 DNA의 경우 DNAFull이다) 결정될 수 있다. 서열의 길이가 실질적으로 다른 경우, Smith Waterman 알고리즘을 사용하는 것과 같은 국소 정렬이 바람직하다.
대안적으로, 백분율 유사성 또는 동일성은 FASTA, BLAST 등과 같은 알고리즘을 사용하여 공개 데이터베이스에 대해 검색함으로써 결정될 수 있다. 따라서, 본 발명의 핵산 및 단백질 서열은 "쿼리 서열(query sequence)"로서 추가로 사용되어, 예를 들어 다른 패밀리 멤버 또는 관련 서열을 확인하기 위해 공개 데이터베이스에 대해 검색을 수행할 수 있다. 이러한 검색은 Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403―10의 BLASTn 및 BLASTx 프로그램(버전 2.0)을 사용하여 수행될 수있다. BLAST 뉴클레오타이드 검색은 NBLAST 프로그램, 스코어 = 100, 워드길이 = 12로 수행되어 본 발명의 산화 환원 효소 핵산 분자에 상동적인 뉴클레오타이드 서열을 수득할 수 있다. 본 발명의 단백질 분자와 상동적인 아미노산 서열을 얻기 위해 BLASTx 프로그램, 스코어 = 50, 워드길이 = 3으로 BLAST 단백질 검색을 수행할 수 있다. 비교 목적으로 갭 정렬을 얻기 위해, Gapped BLAST는 Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 경우, 각각의 프로그램(예를 들어, BLASTx 및 BLASTn)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/에서 National Center for Biotechnology Information의 홈페이지를 참조바람.
선택적으로, 아미노산 유사성의 정도 결정시에, 당업자는 당업자에게 명백한 바와 같이 소위 "보존적(conservative)" 아미노산 치환을 고려할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 상호교환가능성을 지칭한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 기는 글리신, 알라닌, 발린, 루신 및 이소 루신이며; 지방족-하이드록시 측쇄를 갖는 아미노산의 기는 세린 및 트레오닌이며; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 기는 아스파라긴 및 글루타민이며; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 기는 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 기는 리신, 아르기닌 및 히스티딘이며; 그리고 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 기는 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환기는: 발린-루신-이소루신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린 및 아스파라긴-글루타민이다. 본 명세서에 개시된 아미노산 서열의 치환 변이체는 개시된 서열의 적어도 하나의 잔기가 제거되고 그 자리에 다른 잔기가 삽입된 것이다. 바람직하게, 아미노산 변화는 보존적이다. 자연 발생 아미노산의 각각에 대해 바람직한 보존적 치환은 다음과 같다: Ala 대 ser; Arg 대 lys; Asn 대 gln 또는 his; Asp 대 glu; Cys 대 ser 또는 ala; Gln 대 asn; Glu 대 asp; Gly 대 pro; His 대 asn 또는 gln; Ile 대 leu 또는 val; Leu 대 ile 또는 val; Lys 대 arg; gln 또는 glu; Met 대 leu 또는 ile; Phe 대 met, leu 또는 tyr; Ser 대 thr; Thr 대 ser; Trp 대 tyr; Tyr 대 trp 또는 phe; 및 Val 대 ile 또는 leu.
본 명세서에서 사용된, 용어 "선택적으로 하이브리드화(selectively hybridizing)", "선택적으로 하이브리드화하는(hybridizes selectively)" 및 유사한 용어는 뉴클레오타이드 서열이 적어도 66%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 85%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 바람직하게 적어도 95%, 보다 바람직하게 적어도 98% 또는 보다 바람직하게 적어도 99% 상동성이 일반적으로 서로 하이브리드화된 채로 유지되는 조건 하에서 하이브리다이제이션 및 세정에 대한 조건을 기술하기 위한 것이다. 즉, 이러한 하이브리드화 서열은 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 85%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95%, 보다 바람직하게 적어도 98% 또는 보다 바람직하게 적어도 99% 서열 동일성을 공유할 수 있다.
이러한 하이브리드화 조건의 바람직한 비제한적인 예는 약 45℃에서 6X 소듐 클로라이드/소듐 시트레이트(SSC)에서 하이브리드화한 다음, 약 50℃, 바람직하게는 약 55℃에서, 바람직하게는 약 60℃에서, 더욱 바람직하게는 약 65℃에서 1X SSC, 0.1% SDS에서 1회 이상 세척하는 것이다.
고도로 엄격한 조건은 예를 들어, 5x SSC/5x Denhardt 용액/1.0% SDS에서 약 68℃에서 하이브리드화하고, 상온에서 0.2x SSC/0.1% SDS에서 세척하는 것을 포함한다. 대안적으로, 42℃에서 세척을 수행할 수 있다.
당업자는 엄격하고 고도로 엄격한 하이브리드화 조건에 적용할 조건을 알 것이다. 이러한 조건에 관한 추가 지침은 당해 분야에서 용이하게 이용가능하다. 예, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; 및 Ausubel et al. (eds.), Sambrook and Russell (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.).
물론, 폴리 A 서열(mRNA의 3' 말단 폴리(A) 트랙과 같은)에, 또는 T(또는 U) 잔기의 상보적 스트레치에만 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드는, 본 발명의 핵산의 일부에 특이적으로 하이브리드화하는데 사용되는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 포함되지 않을 수 있으며, 그 이유는 이러한 폴리뉴클레오타이드는 폴리 (A) 스트레치 또는 이의 상보체(예를 들어, 사실상 어느 이중 가닥 cDNA 클론)를 함유하는 어느 핵산 분자에 하이브리드화할 수 있기 때문이다.
"핵산 구조물(nucleic acid construct)" 또는 "핵산 벡터(nucleic acid vector)"는 본 명세서에서 재조합 DNA 기술의 사용으로부터 생성된 인공 핵산 분자를 의미하는 것으로 이해된다. 따라서, 용어 "핵산 구조물"은 핵산 구조물은 자연 발생 핵산 분자를 포함하지 않으나, 그럼에도 불구하고 핵산 구조물은 자연 발생 핵산 분자(의 일부)를 포함할 수 있다. 용어 "발현 벡터(expression vector)" 또는 "발현 구조물(expression construct)"은 숙주 세포 또는 이러한 서열과 양립할 수있는 숙주 유기체에서 유전자의 발현에 영향을 줄 수있는 뉴클레오타이드 서열을 칭한다. 이러한 발현 벡터는 전형적으로 적어도 적합한 전사 조절 서열 및 선택적으로 3' 전사 종결 신호를 포함한다. 발현에 영향을 주는데 필요하거나 도움이 되는 추가적인 인자, 예를 들어 발현 인핸서 요소가 또한 존재할 수 있다. 발현 벡터는 적합한 숙주 세포 내로 도입되고, 숙주 세포의 시험 관내 세포 배양으로 암호 서열의 발현에 영향을 줄 수 있다. 발현 벡터는 숙주 세포 또는 본 발명의 유기체에서 복제에 적합할 것이다.
본 명세서에 사용된 용어 "프로모터(promoter)" 또는 "전사 조절 서열(transcription regulatory sequence)"은 하나 이상의 암호 서열의 전사를 조절하는 기능을 하는 핵산 프래그먼트를 칭하며, 암호 서열의 전사 개시 부위의 전사 방향에 대해 상류에 위치하며, DNA 의존성 RNA 폴리머라아제에 대한 바인딩 부위, 전사 개시 부위 및 이에 한정하는 것은 아니나 전사 인자 바인딩 부위, 리프레서 및 액티베이터 단백질 바인딩 부위, 및 프로모터로부터 전사의 양을 조절하기 위해 직접적으로 또는 간접적으로 작용하는 당업자에게 알려진 어느 다른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 어느 다른 DNA 서열의 존재에 의해 구조적으로 확인된다. "구성적인(constitutive)" 프로모터는 대부분의 생리학적 조건 및 발생 조건하에서 대부분의 조직에서 활성적인 프로모터이다. "유도성(inducible)" 프로모터는 예를 들어 화학 유도제의 적용에 의한 것과 같이 생리학적으로 또는 발달적으로 조절되는 프로모터이다.
용어 "선별 마커(selectable marker)"는 당업자에게 친숙한 용어이며, 발현시 선별 마커를 함유하는 세포 또는 세포들을 선별하는데 사용될 수 있는 어느 유전적 엔티티를 기술하기 위해 본 명세서에서 사용된다. "리포터(reporter)"라는 용어는 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 가시적 마커를 지칭하는데 주로 사용되지만, 마커와 상호교환적으로 사용할 수 있다. 선별 마커는 우성 또는 열성 또는 양방향성일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 기능적 관계로 폴리뉴클레오타이드 요소의 연결을 칭한다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 놓일 때 "작동가능하게 연결된"다. 예를 들어, 전사 조절 서열이 암호 서열의 전사에 영향을 주면, 전사 조절 서열은 암호 서열에 작동가능하게 연결된다. 작동가능하게 연결된 것은 연결된 DNA 서열이 전형적으로 연속적이며, 필요한 경우 2개의 단백질 인코딩 영역을 연결하기 위해 연속적이며 리딩 프레임에 있음을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "펩타이드(peptide)"는 일반적으로 확정된(defined) 서열을 갖는 아미노산 잔기의 사슬로서 정의된다. 본 명세서에 사용된 용어 펩타이드는 용어 "폴리펩타이드(polypeptide)" 및 "단백질(protein)"과 상호교환가능하다. 본 발명의 정황에서, 용어 "펩타이드"는 변형된 또는 비변형된 펩타이드 본드에 의해 연결된 적어도 2개의 아미노산을 포함하는 어느 펩타이드 또는 단백질인 것으로 정의된다. 용어 "펩타이드"는 올리고펩타이드 또는 올리고머와 같은 단쇄 분자 또는 단백질과 같은 장쇄 분자를 칭한다. 단백질/펩타이드는 선형, 분지형 또는 고리형일 수 있다. 펩타이드는 D 아미노산, L 아미노산 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 펩타이드는 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 또한 전사 후 변형과 같은 자연적인 공정 또는 화학적 공정에 의해 변형될 수 있다. 이러한 변형의 일부 예로는 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈과의 공유 결합, 헴과의 공유 결합, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체와의 공유 결합, 변형된 또는 비변형된 카보하이드레이트 부와의 공유 결합, 지질 또는 지질 유도체와의 결합, 포스포티딜이노시톨과의 공유 결합, 가교, 고리화, 이황화 결합 형성, 디메틸화, 시스테인 분자 형성, 피로글루타메이트 형성, 포밀화(formylation), 감마-카르복실화, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 산화, 인산화, 라세미화, 히드록실화 등이다. 따라서, 펩타이드의 면역원성을 제거하는 효과를 갖지 않는 펩타이드의 어느 변형은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
용어 "유전자(gene)"는 적절한 조절 영역(예, 프로모터)에 작동가능하게 연결된 세포에서 RNA 분자(예, mRNA)로 전사되는 영역(전사 영역)을 포함하는 DNA 프래그먼트를 의미한다. 유전자는 통상적으로 프로모터, 5' 리더 서열, 코딩 영역 및 폴리아데닐화 부위를 포함하는 3'-비번역 서열(3'-말단)과 같은 몇몇 작동가능하게 연결된 프래그먼트를 포함할 것이다. "유전자의 발현(Expression of a gene)"은 적절한 조절 영역, 특히 프로모터에 작동가능하게 연결된 DNA 영역이 생물학적으로 활성적인, 즉 생물학적으로 활성적인 단백질 또는 펩타이드로 번역될 수 있는 RNA로 전사되는 공정을 의미한다. 주어진 (재조합) 핵산 또는 폴리펩타이드 분자와 주어진 숙주 유기체 또는 숙주 세포 사이의 관계를 나타내기 위해 사용되는 용어 "상 동성(homologous)"은 본질적으로 동일한 종, 바람직하게는 동일한 변종 또는 스트레인의 숙주 세포 또는 유기체에 의해 생산되는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 숙주 세포에 상동성인 경우, 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열은 전형적으로 (그러나 필수적일 필요는 없음) 다른 (이종성) 프로모터 서열 및 적용가능한 경우에는 이의 자연적 환경에서보다는 (이종) 분비 신호 서열 및/또는 종결 서열과 작동가능하게 연결될 것이다. 조절 서열, 신호 서열, 종결 서열 등은 또한 숙주 세포에 상동적일 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 맥락에서 "상동성" 서열 요소만을 사용함으로써 "자가 클로닝된(self-cloned)" 유전자 변형 유기체(GMO's)를 만들 수 있다(자가 클로닝은 본 명세서에서 European Directive 98/81/EC Annex II에서 정의된 바와 같음). 두 핵산 서열의 관련성을 나타내기 위해 사용되는 경우, 용어 "상동성"은 하나의 단일 가닥 핵산 서열이 상보적 단일 가닥 핵산 서열에 하이브리드화될 수 있음을 의미한다. 하이브리드화의 정도는 서열 사이의 동일성의 양 및 후술되는 바와 같은 온도 및 염 농도와 같은 하이브리드화 조건을 포함하는 다수의 인자에 의존할 수 있다.
핵산(DNA 또는 RNA) 또는 단백질과 관련하여 사용된 "이종성(heterologous)" 및 "외인성(exogenous)"이란 용어는 유기체, 세포, 게놈 또는 DNA나 RNA 서열의 일부로서 자연적으로 발생하지 않거나, 또는 자연적으로 발견되는 것과는 다른 세포 또는 게놈 또는 DNA나 RNA 서열 내의 위치 또는 위치들에서 발견되는 핵산 또는 단백질을 의미한다. 이종성 및 외인성 핵산 또는 단백질은 이것이 도입된 세포에 내인성이지 않지만, 다른 세포로부터 얻어지거나 또는 합성적으로 또는 재조합적으로 생산된다. 일반적으로, 반드시 그런 것은 아니지만, 그러한 핵산은 DNA가 전사되거나 발현되는 세포에 의해 정상적으로 생산되지 않는 단백질, 즉 외인성 단백질을 코딩한다. 유사하게, 외인성 RNA는 외인성 RNA가 존재하는 세포에서 정상적으로 발현되지 않는 단백질을 코딩한다. 이종성/외인성 핵산 및 단백질은 또한 외래 핵산 또는 단백질로 지칭될 수 있다. 발현되는 세포에 대해 당해 분야의 숙련자가 외인성으로 인식할 수 있는 어느 핵산 또는 단백질이 본 명세서에서 이종성 또는 외인성 핵산 또는 단백질이라는 용어에 의해 포함된다. 이종성 및 외인성이란 용어는 핵산 또는 아미노산 서열의 비자연적인 조합, 즉 조합된 서열 중 적어도 2개가 서로에 대해 외래성인 조합에도 적용된다.
본 명세서에 사용된 용어 "면역 반응(immune response)"은 특정 항원 엔티티에 대해 지시받거나, 그리고/또는 분해 및/또는 억제를 돕는 항체 및/또는 세포를 생산하여, 그리고/또는 이의 표면에 항원 및/또는 항원 에피토프를 운반 및/또는 발현하거나 또는 제시하는 것을 칭한다. 본 발명의 목적에 있어서 "효과적인 면역보호 반응(effective immunoprotective response)", "면역보호(immunoprotection)" 및 이와 유사한 용어는 병원체, 병원체-감염된 세포 또는 암 세포의 하나 이상의 항원성 에피토프에 대해 지시되어 백신화된 대상자에서 병원체에 의한 감염에 대해 또는 암에 대해 보호하는 면역 반응을 의미한다. 본 발명의 목적에 있어서, 병원체에 의한 감염에 대한 보호 또는 암에 대한 보호는 감염 또는 암의 절대적인 예방뿐만 아니라 병원체 또는 암에 의한 감염의 정도 또는 비율의 검출가능한 감소, 또는 예를 들어, 백신화되지 않은 감염된 대상자와 비교하여 백신화된 대상자에서 병원체 또는 암에 의한 감염에 기인한 질병 또는 어느 증상이나 컨디션의 중증도의 어느 검출가능한 감소를 포함한다. 암의 경우에 효과적인 면역보호 반응은 또한 암 세포를 클리어 업(clearing up)하여 암의 크기를 감소시키거나 심지어 암을 없애는 것(abolishing)을 포함한다. 이것을 달성하기 위한 백신화는 치료 백신화라고도 한다. 대안적으로, 효과적인 면역보호 반응은 이전에 병원체에 감염되지 않았거나 그리고/또는 병원체에 감염되지 않았거나 또는 아직 백신화 당시 암을 앓지 않은 대상자에서 유도될 수 있으며, 이러한 백신화는 예방적 백신화로서 칭하여질 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "항원(antigen)"의 일반적인 사용은 항체에 특이적으로 바인딩하는 어느 분자를 칭한다. 이 용어는 또한 MHC 분자에 의해 바인딩되어 T 세포 리셉터에 제시될 수 있는 어느 분자 또는 분자 프래그먼트를 칭한다. 항원은 예를 들어, 단백질성 분자, 즉 폴리아미노산 서열일 수 있으며, 선택적으로 탄수화물 부 및/또는 지질 부와 같은 비단백질기를 포함하며, 또는 항원은 예를 들어, 탄수화물과 같은 단백질성이 아닌 분자일 수 있다. 항원은 예를 들어, 단백질의 어느 일부(펩타이드, 부분 단백질, 전장 단백질)일 수 있으며, 여기서 단백질은 자연 발생 또는 합성적으로 유도된, 세포 조성물(전체 세포, 세포 용해물 또는 파쇄된 세포), 유기체(전체 유기체, 용해물 또는 파쇄된 세포) 또는 탄수화물 또는 다른 분자, 또는 이의 일부이며, 특정 대상자에서 항원-특이적 면역 반응(체액성 및/또는 세포성 면역 반응)을 이끌어낼 수 있는 것으로, 여기서 면역 반응은 바람직하게 어세이 또는 방법을 통해 측정가능하다.
본 명세서에서 용어 "항원(antigen)"은 적응 면역 반응의 리셉터에 대한 표적으로 작용하는 구조적 물질로 이해된다. 따라서, 항원은 TCR(T 세포 리셉터) 또는 BCR(B 세포 리셉터) 또는 BCR의 분비된 형태, 즉 항체에 대한 표적으로서 작용한다. 따라서, 항원은 단백질, 펩타이드, 탄수화물 또는 예를 들어, 세포 또는 비리온과 같이 일반적으로 보다 큰 구조의 일부인 다른 합텐(hapten)일 수 있다. 항원은 신체 내("자기(self)") 또는 외부 환경("비자기(non-self)")에서 유래할 수 있다. 면역 시스템은 보통 흉선에서 T 세포의 음성 선택으로 인해 정상적인 조건에서 "자기" 항원에 대해 비반응성이며, 바깥 세상으로부터 "비자기" 칩입자만, 또는 예를 들어 질병 컨디션 하에서 체내에 존재하는 변형된/유해한 물질을 공격하는 것으로 되어 있다. 세포 면역 반응의 표적이 되는 항원 구조는 프로세스된 항원 펩타이드의 형태로 항원 제시 분자(APC)에 의해 조직접합성 분자를 통해 적응 면역 시스템의 T 세포에 제시된다. 제시된 항원 및 조직적합성 분자의 타입에 따라, 여러 유형의 T 세포가 활성화될 수 있다. T 세포 리셉터(TCR) 인식을 위해, 항원은 세포 내부에서 소 펩타이드 프래그먼트로 프로세스되고, 주요 조직적합성 복합체(MHC)에 의해 T 세포 리셉터에 제시된다.
용어 "면역원(immunogen)"은 항원의 적어도 하나의 에피토프를 포함하거나 또는 코딩하는 엔티티를 기술하는데 사용되며, 이는 대상자에게 투여시, 바람직하게는 적절한 애주번트(adjuvant)와 함께 대상자에게 투여시, 에피토프 및 에피토프를 포함하는 항원에 대해 대상자에서 특이적인 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유발한다. 면역원은 항원과 동일할 수 있거나, 또는 예를 들어, 항원의 에피토프를 포함하는 일부와 같이 적어도 항원의 일부를 포함한다. 따라서, 특정 항원에 대해 대상자를 백신화하는 것은, 일 구현으로, 항원의 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 면역원의 투여의 결과로서 면역 반응이 항원 또는 이의 면역원성 부분에 대해 유발된다는 것을 의미한다. 백신화는 바람직하게 보호 또는 치료 효과를 초래하며, 항원(또는 항원의 공급원)에의 후속 노출은 대상자에서 질환 또는 컨디션을 감소 시키거나 예방하는 항원(또는 공급원)에 대한 면역 반응을 유발한다. 백신화의 개념은 당 업계에 잘 알려져 있다. 본 발명의 예방적 또는 치료적 조성물의 투여에 의해 유발되는 면역 반응은, 백신 투여의 부재시와 비교하여, 면역 상태의 어느 양상(예를 들어, 세포 반응, 체액성 반응, 사이토카인 생산)의 어느 검출가능한 변화일 수 있다.
"에피토프(epitope)"는 본 명세서에서 대상자에서 면역 반응을 유발하기에 충분한 주어진 항원 내의 단일 면역원성 부위로서 정의된다. 당업자는 T 세포 에피토프가 B 세포 에피토프와 크기 및 조성이 상이하고, 클래스 I MHC 경로를 통해 제시된 T 세포 에피토프가 클래스 II MHC 경로를 통해 제시된 에피토프와 다르다는 것을 인식할 것이다. 에피토프는 면역 반응의 타입에 따라 선형 서열 또는 구조적 에피토프(보존된 바인딩 영역)일 수 있다. 항원은 단일 에피토프만큼 작거나 또는 더 클 수 있으며, 다수의 에피토프를 포함할 수 있다. 이와 같이, 항원의 크기는 약 5-12 아미노산(예, 펩타이드)만큼 작을 수 있으며, 다중결합(multimeric) 단백질, 단백질 복합체, 비리온, 입자, 전체 세포(whole cells), 전체 미생물(whole microorganisms), 또는 그 일부(예, 전체 세포의 용해물 또는 미생물의 추출물)를 포함하는 전장 단백질만큼 클 수 있다.
OMV("블레브스(blebs)")라고도 함)는 일반적으로 구형이며, 직경이 20-250nm (때때로 10-500nm) 범위 내인 이중층 멤브레인 구조이며, 그람-음성 박테리아의 외부 멤브레인으로부터 핀치 오프(pinch off)되어 있다. OMV 멤브레인은 내부에 인지질(PL)을 함유하며, 외부에 지질다당류(LPS)와 PL을 함유하며, 다양한 위치에서 멤브레인 단백질과 혼합되어 있으며, 주로 박테리아 외부 멤브레인의 구조를 반영하며, 이로부터 이들은 핀치 오프된다. OMV의 루멘은 단백질, RNA/DNA 및 펩티도글리칸(PG)과 같은 주변 세포질 또는 세포질로부터의 다양한 화합물을 함유할 수 있지만, 박테리아 세포와 달리 OMV는 자가 복제 능력이 없다. 본 발명의 정황에서, 3 가지 타입의 OMV는 그들의 생산 방법에 따라 구별될 수 있다. sOMV는 자발적 또는 자연적 OMV이며, 이는 이미 형성된 OMVs로부터 손상되지 않은 세포를 분리함으로써 배양 상청액으로부터 정제되고 농축된다. 디터전트 OMV인 dOMV는 디옥시콜레이트(deoxycholate)와 같은 디터전트로 세포로부터 추출되며, 이는 또한 면역학적 반응을 일으키는(reactogenic) LPS와 지단백질의 함량을 감소시킨다. 디터전트 추출 후 dOMV는 세포 및 세포 데브리스로부터 분리되고 추가로 정제 및 농축된다. 마지막으로, 네이티브 nOMV 라는 용어는, 야생형의 자발적인 OMVs 및 디터전트 추출된 dOMV로부터 분명히 구별할 수 있도록, 비디터전트(non-detergent) 세포 파괴 기술로 농축된 사멸 세포에서 생성되거나, 또는 다른 (비파괴(non-disruptive)) 디터전트가 없는 방법으로 세포에서 추출된 OMV에 대해 사용된다.
본 명세서에서 공개 서열 데이터 베이스에서 접근가능한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열에 대한 어느 레퍼런스는 본 문헌의 출원일에 이용가능한 서열 엔트리의 버전을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 백신화 목적으로 항원의 에피토프를 포함하는 표면 노출된 융합 지단백질을 포함하는 그람 음성 OMV에 관한 것이다. 표면 지단백질은 일반적으로 LPS의 통상적인 디터전트-기반 제거 동안에 OMV로부터 제거된다. 그러나, 최근의 생명공학적 발달은 디터전트-프리 OMV 추출 공정, 예를 들어 나이세리아(Neisseria)에서부터의 OMV 추출 공정을 이끌어 냈으며, 이는 표면 노출된 지단백질이 잠재적으로 OMV에 부착된 채로 남을 수 있도록 한다(42, 43). 본 발명자들은 이종성 지단백질을 포함하는 소위 네이티브 OMVs(nOMVs)에서 항원성 지단백질의 표면 발현에 대한 가능성을 조사하였다. 특히 본 발명자들은 나이세리아(Neisseria) nOMVs에서 보렐리아(Borrelia) OspA 지단백질의 이종성 발현을 시험하였다. 보렐리아(Borrelia)에서 표면 국소화와 면역원성 및 구조에 대한 자세한 지식으로 인해 OspA는 시험에 적합한 지단백질이 될 수 있다.
본 발명자들은 N. 메닝지티디스(N. meningitidis) 세포 및 nOMVs에서 OspA를 발현할 수 있었음에도 불구하고, 수막구균(meningococcal) 세포 표면에서 OspA를 검출할 수 없었다. 이것은 OM의 주변세포질 또는 주변세포질 측면에 대한 불국소화(mislocalization)를 나타낸다. 그러한 숙주-스위치 유도된 지단백질의 불국소화는 드문 일이 아니며, 아마도 대리(surrogate) 숙주의 분류 규칙을 따름으로써 발생하는 결과일 것이다(51).
놀랍게도 본 발명자들은 글로블러(globular) 도메인을 fHbp의 다른 부분, 즉 잘 연구된 수막구균 표면 지단백질(meningococcal surface lipoprotein)(41, 48)에 융합시킴으로써 OspA를 나이세리아(Neisseria)의 세포 표면으로 리다이렉팅(redirect)할 수 있었다. 본 발명자들은 fHbp의 특정 N-말단 부분에 대한 융합이 fHbp-OspA 융합 구조물의 표면 발현을 가능하게 한다는 것을 보여준다. 또한, 본 발명자들은 이러한 표면 노출된 fHbp-OspA 하이브리드를 발현하는 나이세리아(Neisseria) nOMV가 면역화된 마우스에서 강한 항체 반응을 이끌어내는 입증한다.
두 번째로, 구조적 수준에서 잘 특성화되어 있고 철 파이러시(piracy)에 관련된 코-리셉터인 트랜스페린 바인딩 단백질 B(TbpB)(63)의 다른 부분에 글로블러 도메인을 융합시킴으로써 OspA를 나이세리아(Neisseria)의 세포 표면으로 리다이렉팅할 수 있었다.
세 번째로, 본 발명자들은 OspC와 RmpM과 같은 다른 단백질을 논-보렐리얼(non-borrelial) 및 논-리포단백질(non-liporoteins)(RmpM과 같은)을 포함하는 나이세리아(Neisseria)의 세포 표면으로 리다이렉팅할 수 있었다.
제1견지로, 본 발명은 융합 리포단백질에 관한 것이다. 융합 리포단백질은 바람직하게는 적어도 N-말단 및 C-말단 융합 파트너를 포함한다.
융합 리포단백질의 N- 말단 융합 파트너는 그람 음성 박테리아의 외막의 세포외 표면에서 융합 단백질의 발현이 일어나도록 의도되며, 여기서 융합 단백질은 발현되고 또한 이의 공유결합된 지질을 통해 그 막 내로 정착된다. 이를 위해, 융합 리포단백질의 N-말단 융합 파트너는 바람직하게 적어도 N-말단에서 C-말단 순서로 다음을 포함한다: i) 리피드화 N-말단 시스테인; ii) 그람 음성 박테리아의 표면 노출된 리포단백질의 테더(tether), 여기서 바람직하게 테더는 리피드화된 N-말단 시스테인에 (바로 옆에) 인접하여 위치함; 및 바람직하게는 iii) 그람 음성 박테리아의 표면 노출된 리포단백질의 아미노산 서열에서 테더의 C-말단 바로 옆에 위치한 적어도 1 또는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 25, 28 또는 30 개의 연속 아미노산의 스트레치.
N-말단 융합 파트너는 바람직하게 그람 음성 박테리아에서 발현될 경우에 세포외 외막 표면에 융합 리포단백질의 표면 발현을 일으킨다. 융합 리포단백질의 이러한 표면 발현을 일으키는 N-말단 융합 파트너의 능력은 그람 음성 박테리아에서의 융합 리포단백질의 발현 및 그람 음성 박테리아의 외부에서의 융합 리포단백질의 검출에 의해 어세이될 수 있으며, 예를 들어, 융합 리포단백질에 대한 항체, 바람직하게는 C-말단 융합 파트너에 대한 항체를 사용하여 이에 따라 바인딩된 항체가 바람직하게는 본 명세서에서 실시예 1.5 및 2.3에 기술한 바와 같이, 면역 형광법(immunofluorescence)에 의해 검출된다. 표면 발현을 일으키는 N-말단 융합 파트너의 능력을 검출하기 위한 바람직한 어세이에서, N-말단 융합 파트너는 그람 음성 박테리아의 세포외 외막 표면 상의 리포단백질(의 일부)로서 표면 발현할 수 있는 것으로 알려진 C-말단 융합 파트너에 융합된다.
이러한 목적을 위한 적합한 C-말단 융합 파트너는 예를 들어, 보렐리아(Borrelia) OspA 리포단백질의 글로블러 도메인, 바람직하게는 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi) OspA 리포단백질의 글로블러 도메인이며, 이에 따라 바람직하게 글로블러 도메인은 예를 들어, 본 명세서에서 실시예에 사용된 SEQ ID NO: 4의 위치 29-273의 아미노산 서열과 같이, OspA 리포단백질의 위치 29-273의 아미노산 서열로 구성된다.
표면 발현을 유발하는 N-말단 융합 파트너의 능력을 시험하기 위한 대안적인 적합한 C-말단 융합 파트너는 예를 들어, 보렐리아 아프젤리(Borrelia afzelii) OspA 리포단백질의 글로블러 도메인을 포함하거나 이로 구성되며, 이에 따라 바람직하게 글로블러 도메인은 예를 들어, 본 명세서에서 실시예에서 사용된 바와 같은 SEQ ID NO: 58의 위치 29-273의 아미노산 서열로 구성된다.
표면 발현을 유발하는 N-말단 융합 파트너의 능력을 시험하기 위한 또 다른 적합한 C-말단 융합 파트너는 예를 들어, 보렐리아(Borrelia) OspC 리포단백질, 바람직하게는 B. 부르그도르페리(B. burgdorferi) OspC 리포단백질의 글로블러 도메인(의 단편)을 포함하거나 또는 이로 구성되며, 이에 따라 바람직하게 상기 단편은 예를 들어, 본 명세서에 사용된 바와 같은 SEQ ID NO: 59의 위치 136-210의 아미노산 서열과 같이, OspC 리포단백질의 위치 136-210의 아미노산 서열로 구성된다.
대안적으로, 표면 발현을 일으키는 N-말단 융합 파트너의 능력을 시험하기위한 C-말단 융합 파트너는 바람직하게 주변세포질(periplasmic) 박테리아 단백질의 도메인을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 바람직하게 주변세포질 박테리아 단백질의 도메인은 보르데텔라(Bordetella), 보렐리아(Borrelia), 콕시엘라(Coxiella), 나이세리아(Neisseria) 및 상기 언급된 어느 다른 병원성 박테리아 속으로 구성되는 속으로부터 선택된 박테리아로부터 유래된다. 주변세포질 박테리아 단백질의 도메인은 바람직하게 펩티도글리칸과 결합하고 및/또는 바람직하게는 상기 단백질의 C-말단 도메인이다. 보다 바람직하게, 주변세포질 나이세리아(Neisseria) 단백질의 도메인은 RmpM으로부터 유래되고, 더욱 바람직하게 나이세리아(Neisseria) 주변세포질 단백질은 본 명세서에서 실시예에서 사용된 바와 같은 SEQ ID NO: 7의 아미노산 90-242를 포함하거나 또는 이로 구성된다.
표면 발현을 일으키는 N-말단 융합 파트너의 능력을 검출하기위한 바람직한 어세이에서, 융합 리포단백질은 N-말단 융합 파트너에서 대다수의 서열이 이로부터 획득되거나/획득될 수 있는 박테리아와 동일한 종, 즉 N-말단 융합 파트너에 각 아미노산의 가장 높은 수를 제공하는 박테리아의 것인 그람 음성 박테리아 숙주 세포에서 발현된다. 따라서, 바람직하게 N-말단 융합 파트너는 그람 음성 박테리아에서 발현시, 적어도 (이의 C-말단에서) SEQ ID NO: 4의 위치 29-273의 아미노산 서열에 (또는 대안적으로 SEQ ID NO: 58의 위치 29-273의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 59의 위치 136-210의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 7의 위치 90-242의 아미노산 서열에) 융합된 N-말단 융합 파트너로 구성된 융합 리포단백질의 그람 음성 박테리아의 세포외 외막 표면 상에 발현을 일으키며, 이에 따라 그람 음성 박테리아는 N-말단 융합 파트너에서 대다수의 서열이 이로부터 획득가능한 박테리아와 동일한 종의 것이다. 바람직하게 이 융합 리포단백질의 표면 발현은 예를 들어, Rockland Immunochemicals Inc. (Limerick, PA 19468, USA; www.rockland-inc.com)로부터 입수가능한 항-OspA(토끼) 항체 200-401-C13S와 같은, 항-OspA(폴리클로날) 항체를 이용하여 면역형광 현미경에 의해 검출된다. 또한, OspC 융합 리포단백질의 표면 발현은 바람직하게 예를 들어 Rockland Immunochemicals Inc.로부터 입수가능한 항-OspC 항체 200-401-C11S와 같은 항-OspC (폴리클로날) 항체로 검출된다. RmpM 융합 리포단백질의 표면 발현은 바람직하게 공중 건강 및 환경을 위한 국립 연구소(National Institute for Public Health and the Environment)(Bilthoven, the Netherlands)로부터 입수가능한 항-RmpM 항체 MN2D6D로 검출된다.
리피드화된 시스테인은 바람직하게는 본 발명의 성숙한 융합 리포단백질에서 가장 많은 N-말단 아미노산이다. 박테리아 리포단백질은 처음에는 분비된 단백질의 신호 펩타이드의 전형적인 특성의 특징을 갖는 약 20개 아미노산의 N-말단 신호 펩타이드를 보유하는 프리프로리포단백질(preprolipoprotein)로 번역된다(Inouye et al., 1977, PNAS USA 74:1004-1008). 리포박스(lipobox)로서 칭하여지는 신호 펩타이드의 C-말단 부위, [LVI] [ASTVI] [GAS] C의 보존 서열은 디아실글리세롤 부가 필수적인 시스테인 잔기의 측쇄 상의 티올기에 공유 결합하는 것을 통해 변형된다(Babu et al., 2006, J. Bacteriol. 188: 2761-2773). 이러한 변형은 효소 리포단백질 디아실글리세릴 트랜스퍼라아제에 의해 촉진되어 단백질에 대한 티오에스테르 결합에 의해 연결된 디아실글리세롤 부로 이루어진 프로리포단백질을 생성한다. 프로리포단백질은 후속적으로 리포단백질 신호 펩티다아제에 의해 처리되어 신호 펩타이드를 절단하고(cleasves off), 리피드화된 시스테인을 성숙한 리포단백질을 형성하는 새로운 N-말단 잔기로 남겨둔다. 성숙한 리포단백질은 리포단백질 N-아실 트랜스퍼라아제에 의해 N-말단 시스테인 잔기에 부착된 추가의 아미드-결합된 지방산을 가질 수 있다.
리피드화된 시스테인의 (N-말단에서 C-말단 순서로) 하류에서, N-말단 융합 파트너는 바람직하게는 그람-음성 박테리아의 표면 노출된 리포단백질의 테더를 포함하며, 바람직하게 테더는 N-말단 리피드화된 시스테인에 바로 인접하여 위치하며, 이는 N-말단 리피드화된 시스테인과 테더 사이에 추가적인 아미노산이 존재하지 않는 것을 의미한다. 그람 음성 표면 리포단백질의 테더는 일반적으로 α-헬릭스 또는 β-스트랜드 또는 β-시트와 같은 2차 구조를 형성하는 성향이 낮은 5-50개의 아미노산의 스트레치이며, 이는 순서가 없고 유연한 리포펩타이드 테더를 노출된 구조 단백질의 나머지 부분에 제공한다. 이론으로 규정하려는 것은 아니며, 테더는 또한 리포단백질 국소화 장치(Lol)에 의해 외막으로 지시되거나, 또는 내막에 유지되는 것과 같은 리포단백질의 위치를 결정하는데 중요한 것으로 생각된다. 특히, +2 위치의 아미노산, 즉 N-말단 리피드화된 시스테인에 바로 인접한 아미노산의 아이덴티티는, 이것이 보편적인 규칙인 것으로 보이지 않으며, 테더에서 보다 하류에 있는 다른 아미노산들이 또한 리포단백질 위치화에 역할을 할 수 있을지라도, 리포단백질의 위치 결정에 중요한 것으로 보고되어 왔다(Kovacs-Simon et al., 2011, Infect. Immun. 79:548-561). 또한, 본 발명자들에 의해 또한 나타낸 바와 같이, 테더가 리포단백질의 표면 발현을 수행하는 능력은 종 특이적일 수 있다. 따라서, 바람직하게, 융합 단백질의 테더는 박테리아 속의 표면 발현 리포단백질, 보다 바람직하게 융합 리포단백질이 발현되는 본 발명의 박테리아 숙주 세포와 동일한 박테리아 종의 테더이다. 따라서, 융합 리포단백질 내의 테더는 바람직하게 융합 리포단백질이 발현되는 본 발명의 숙주 세포와 상동적이다.
본 발명의 융합 리포단백질을 나이세리아의(Neisserial) 숙주 세포에서 발현시키기위한 바람직한 테더는 예를 들어, N. 메닝지티디스(N. meningitidis), N. 고노로이애(N. gonorrhoeae) 및 N. 락타미카(N. lactamica)와 같은 나이세리아(Neisseria)로부터의 fHbp(팩터 H 바인딩 단백질), LpbB(락토페린 바인딩 단백질), TbpB 트랜스페린 바인딩 단백질), HpuA(헤모글로빈-합토글로빈 바인딩 단백질), NHBA(나이세리아 헤파린 바인딩 항원, GNA2132) 및 Ag473(Chu et al., 2012, PLoS One 7(7): e40873; Genbank NP_274477.1)과 같은 표면 발현된 나이세리아의(Neisserial) 리포단백질로부터의 테더이다. 그러므로, 나이세리아의 숙주 세포에서 본 발명의 융합 리포단백질의 발현을 위한 바람직한 테더는 a) SEQ ID NO: 1의 위치 20-33에서의 아미노산 서열과 적어도 60, 69, 76, 84, 92 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; b) SEQ ID NO: 2의 위치 21-56 또는 위치 21-58에서의 아미노산 서열과 적어도 60, 68, 75, 81, 87, 93 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열(예, TbpB, 스트레인 MC58로부터 유래된) 또는 SEQ ID NO: 60의 위치에서의 21-56 또는 위치 21-58에서의 아미노산 서열과 적어도 60, 68, 75, 81, 87, 93 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열(예, TbpB, 스트레인 H44/76으로부터 유래된); 및 c) SEQ ID NO: 3의 위치 23-46에서의 아미노산 서열과 적어도 60, 66, 70, 75, 79, 83, 87, 91, 95 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 그룹으로부터 선택된 테더이며, 여기서 바람직하게 테더는 표면 발현 그람-음성 리포단백질에서 자연적으로 발생하는 아미노산 서열을 갖는다. N-말단 리피드화된 시스테인은 상기 a), b) 및 c)에서의 테더의 아미노산 서열의 정의에 포함되는 것으로 이해된다.
바람직한 구현으로, 본 발명의 융합 리포단백질에서 N-말단 파트너는 그람-음성 박테리아의 표면 노출된 리포단백질로부터의 추가 서열을 포함한다. 본 발명자들은 그람-음성 박테리아의 표면 노출된 리포단백질의 추가 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 융합 파트너가 예를 들어, fA1 융합 리포단백질에 의해 예시되는 바와 같이 융합 리포단백질의 표면 발현의 수준을 현저히 증가시킬 수 있음을 발견하였다. 따라서, N-말단 융합 파트너는 바람직하게 그람-음성 박테리아의 표면 노출된 리포단백질의 아미노산 서열로부터의 적어도 하나 이상의 인접 아미노산을 포함하며, 여기서 바람직하게 이들 하나 이상의 인접 아미노산은 이들이 유래되는 표면 노출된 리포단백질 내의 테더의 C-말단 바로 옆에 존재한다. 이 아미노산 스트레치의 길이는 바람직하게 상기 나타낸 바와 같다.
바람직한 구현으로, 표면 노출된 리포단백질로부터의 아미노산의 추가적인 스트레치는 예를 들어 α-헬릭스, β-스트랜드 또는 β-플리티드(β-pleated) 시트와 같이 2차 구조의 국소적인 엘리먼트 또는 세그먼트, 또는 이의 일부를 형성하는 성향을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 융합 리포단백질의 표면 발현 수준을 증가시키기 위해 포함될 수 있는 표면 노출된 리포단백질로부터의 아미노산의 바람직한 추가적인 스트레치는 나이세리아의 fHbp 단백질, 보다 바람직하게 N. 메닝지티디스(N. meningitidis) fHbp 단백질의 위치 34-50에서의 아미노산 서열로부터 취해진 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17 개의 아미노산의 인접 스트레치이며, 가장 바람직하게 인접 스트레치는 SEQ ID NO: 1의 위치 34-50에서의 아미노산 서열로부터 취해진다. 바람직하게, 위치 34에서의 아미노산은 스트레치가 나이세리아의 fHbp 단백질의 아미노산 서열에서의 테더의 C-말단 바로 옆에 위치하도록 나이세리아의 fHbp 단백질의 위치 34-50에서의 아미노산 서열로부터 취해진 인접 스트레치에 포함된다.
본 발명의 융합 리포단백질의 N-말단 파트너에서 그람-음성 박테리아의 표면 노출된 리포단백질의 테더 및 그램-음성 박테리아의 표면 노출된 리포단백질의 아미노산 서열로부터의 하나 이상의 인접 아미노산, 즉 상기 엘리먼트 ⅱ) 및 ⅲ)은 2개의 상이한 표면 노출된 리포단백질로부터의 아미노산 서열로부터 획득될 수 있거나/획득가능하나(심지어 2개의 상이한 그람-음성 박테리아로부터 유래될 수 있음), 바람직하게 이들은 하나의 아미노산 서열 및 동일한 표면 노출된 리포단백질로부터 획득되거나/획득가능하다.
일 구현으로, 본 발명의 융합 리포단백질에서, 리포단백질의 N-말단 융합 파트너는 그람-음성 박테리아의 표면 노출된 리포단백질로부터의 N-말단 프래그먼트를 포함하며, N-말단 프래그먼트는 적어도 리피드화된 시스테인을 포함한다. 바람직하게, 리포단백질의 N-말단 융합 파트너는 성숙한 표면 노출된 리포단백질로부터의 N-말단 프래그먼트를 포함하고, 여기서 성숙한 리포단백질은 N-말단으로서 리피드화된 시스테인을 갖는 것으로 이해된다. 바람직하게, 리포단백질의 N-말단 융합 파트너는 상기 프래그먼트의 N-말단에 리피드화된 시스테인을 포함하고 이로부터 시작하는 성숙한 표면 노출된 리포단백질의 N-말단 프래그먼트로부터 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 25, 28, 30, 31, 32, 35, 38 또는 40 개의 인접한 아미노산을 포함한다. 바람직하게, N-말단 프래그먼트는 그람-음성 박테리아에서 발현될 경우에 융합 리포단백질의 표면 발현을 일으킨다. 융합 리포단백질의 표면 발현에 영향을 주는 N-말단 프래그먼트의 능력은 전술한 바와 같이 어세이될 수 있다.
바람직한 구현으로, 본 발명의 융합 리포단백질은 나이세리아의 숙주 세포에서의 발현에 사용될 수 있는 융합 리포단백질이다. 이러한 융합 리포단백질의 N-말단 파트너에서, 바람직하게 그람-음성 박테리아의 표면 노출된 리포단백질의 테더 및 그람-음성 박테리아의 표면 노출된 리포단백질의 아미노산 서열로부터의 하나 이상의 인접 아미노산, 즉 상기 엘리먼트 ii) 및 iii) 및/또는 상기 정의한 바와 같은 N-말단 프래그먼트는 나이세리아(Neisseria) 속 박테리아, 바람직하게는 나이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis) 또는 나이세리아 고노로이애(Neisseria gonorrhoeae) 또는 N. 락타미카(N. lactamica)의 박테리아로부터의 아미노산 서열로부터 획득되거나/획득가능하다. 보다 바람직하게, N-말단 융합 파트너에 대한 아미노산 서열이 획득되거나/획득가능한 나이세리아(Neisseria) 표면 노출된 리포단백질은 fHbp, LpbB, TbpB, HpuA, NHBA 및 Ag473으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 구현으로, 나이세리아의 숙주 세포에서의 발현을 위해 사용될 수 있는 본 발명의 융합 리포단백질에서, 융합 리포단백질의 N-말단 파트너는 적어도 a) SEQ ID NO: 1의 위치 20에서의 아미노산 서열 내지 위치 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 및 50 중 하나에 대해 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; b) SEQ ID NO: 2의 위치 21에서의 아미노산 서열 내지 위치 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 및 75 중 하나에 대해 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는 c) SEQ ID NO: 3의 위치 23에서의 아미노산 서열 내지 위치 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 및 63 중 하나에 대해 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
융합 리포단백질의 C-말단 융합 파트너는 바람직하게는 C-말단 융합 파트너에 에피토프가 존재하는 감염성 질병 및/또는 종양과 관련된 항원의 적어도 하나의 에피토프에 대한 면역 반응을 생성하도록 의도된다. 융합 리포단백질의 C-말단 융합 파트너는 이론적으로 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 어느 아미노산 서열일 수 있다.
본 명세서에서 본 발명의 융합 리포단백질은 바람직하게 N- 및 C-말단 융합 파트너가 그람-음성 숙주 세포에서 정상 단백질 합성에 의해 융합되는 융합 단백질이며, 여기서 융합 리포단백질은 코딩 서열이 표준 재조합 DNA 기술에 의해 프레임 내에서 작동 가능하게 연결된 N- 및 C-말단 융합 파트너를 각각 코딩하는 핵산 서열의 번역에 의해(하기 참조) 발현되는 것으로 이해된다. 선택적으로, N- 및 C-말단 융합 파트너는 코딩 서열이 N- 및 C-말단 융합 파트너를 코딩하는 각각의 핵산 서열과 프레임 내에서 작동 가능하게 연결된 링커 아미노산 서열을 통해 융합된다. 링커 아미노산 서열은 바람직하게 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15 또는 20 아미노산의 아미노산 서열이다. 바람직한 링커는 아미노산인 글리신, 프롤린, 세린 및 알라닌을 포함하여 구성된 아미노산 서열을 포함한다. 더욱 바람직하게, 링커는 아미노산 서열 PGGSGA(SEQ ID NO: 5), 또는 이의 (일부) 반복 단위를 포함한다.
융합 리포단백질의 C-말단 융합 파트너는 이론상으로 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 어느 아미노산 서열일 수 있다. 바람직하게, C-말단 융합 파트너는 적어도 5, 10, 15, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 또는 400 개의 아미노산 및/또는 800, 700, 600, 500 또는 450 개 이하의 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 융합 리포단백질의 C-말단 융합 파트너는 그람-음성 박테리아에서 발현될 경우에 융합 리포단백질의 표면 발현과 양립할 수 있다. 융합 리포단백질의 표면 발현과 C-말단 융합 파트너의 양립성은 전술한 바와 같이 어세이될 수 있다.
일 구현으로, 본 발명의 융합 리포단백질의 C-말단 융합 파트너는 N-말단 융합 파트너와 이종성이다. N-말단 융합 파트너와 이종성인 C-말단 융합 파트너는, C-말단 융합 파트너의 아미노산 서열이, N 말단 융합 파트너의 아미노산 서열이 이로부터 유래하는 단백질과 상이한 하나 이상의 단백질로부터 유래하는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 이종성 C-말단 융합 파트너는 N-말단 융합 파트너와 동일한 유기체로부터 유래될 수 있거나, 또는 N- 및 C-말단 융합 파트너는 상이한 유기체로부터 각각 존재할 수 있다. 바람직하게, 본 발명에 따른 융합 리포단백질에서, C-말단 융합 파트너는 N-말단 융합 파트너의 서열이 유래된 표면 노출된 리포단백질로부터의 아미노산 서열이 결핍되어 있다. 더욱 바람직하게, C-말단 융합 파트너는 이로부터 N-말단 융합 파트너가 유래되는 표면 노출된 리포단백질로부터 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20 개의 (인접) 아미노산 서열이 결핍되어 있다. 따라서, 바람직하게 C-말단 융합 파트너는 이로부터 N-말단 융합 파트너의 아미노 서열이 유래하는 표면 노출된 리포단백질과 상이한 하나 이상의 단백질성 항원으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
본 발명의 융합 리포단백질의 C-말단 융합 파트너는 바람직하게 에피토프를 포함하는 항원에 대한 면역 반응을 유도 및/또는 증진시키기 위한 적어도 하나의 에피토프를 포함한다. 바람직하게, B-세포, 체액성 또는 항체 반응은 C-말단 융합 파트너의 에피토프에 의해 유도된다. 바람직하게, C-말단 융합 파트너 내의 에피토프는 보호 및/또는 중화 항체 반응을 유도한다. 선택적으로 및/또는 부가적으로, C-말단 융합 파트너는 T 세포 반응을 유도하는 에피토프를 포함한다. 면역원성 펩타이드에 의해 유도 및/또는 증진된 바람직한 T-세포 반응은 HLA 클래스 I 제한 CTL 반응 및 HLA 클래스 II 제한 Th 반응 중 적어도 하나를 포함한다. 더욱 바람직하게, T 세포 반응은 HLA 클래스 I 제한 CTL 반응 및 동시에 HLA 클래스 II 제한 Th 반응 모두로 이루어지고, 유리하게는 B-세포 반응을 수반할 수 있다.
융합 리포단백질 내의 C-말단 융합 파트너는 병원체(감염원(infectious agent)) 및/또는 종양의 광범위한 항원으로부터의 하나 이상의 에피토프를 포함할 수 있다. 예를 들어, C-말단 융합 파트너는 바이러스, 박테리아, 균류 및 원충과 같은 병원체 및 감염원으로부터의 항원의 하나 이상의 에피토프를 포함할 수 있다. 항원으로부터 에피토프가 유래될 수 있는 감염 또는 종양을 일으키는 병원성 바이러스의 일부 예는 간염(A, B 또는 C) 바이러스, 헤르페스 바이러스(예, VZV, HSV-I, HAV-6, HSV-II 및 CMV, 엡스테인 바 바이러스(Epstein Barr virus)), 아데노 바이러스, SV40 바이러스(중피종을 일으킴), 인플루엔자 바이러스, 플라비 바이러스, 에볼라 바이러스, 에코 바이러스, 리노 바이러스, 콕사키 바이러스, 코로나 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 유행성 이하선염 바이러스(mumps virus), 로타 바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스(rubella virus), 파보 바이러스(parvovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus), HTLV 바이러스, 뎅기 바이러스, 연속종 바이러스(molluscum virus), 폴리오 바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스, 아르보 바이러스 뇌염 바이러스(arboviral encephalitis virus) 및 인간 면역 결핍 바이러스(HIV 바이러스; 예, I형 및 II형), 인유두종 바이러스(HPV)를 포함한다. 항원으로부터 에피토프가 유래될 수 있는 감염을 일으키는 병원성 박테리아의 일부 예는 보렐리아(Borrelia), 리스테리아(Listeria), 에세리키아(Escherichia), 클라미디아(Chlamydia), 콕시엘라(Coxiella), 리케치얼(Rickettsial) 박테리아, 마이코박테리아(Mycobacteria), 스타필로코시(Staphylococci), 스트렙토코시(Streptocci), 뉴모노코시(Pneumonococci), 메닝고코시(Meningococci), 고노코시(Gonococci), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 세라티아(Serratia), 슈도모나스(Pseudomonas), 레지오넬라(Legionella), 디프테리아(Diphtheria), 살모넬라(Salmonella), 바실리(Bacilli), 보르데텔라(Bordetella), 콜레라, 파상풍, 보툴리누스 중독, 탄저병, 흑사병(Plague), 렙토스피라증, 백일해(Whooping cough) 및 라임병(Lymes disease)을 일으키는 박테리아를 포함한다. 항원으로부터 에피토프가 유래될 수 있는 감염을 일으키는 병원성 균류의 일부 예는 칸디다(Candida)(예, 알비칸스(albicans), 크루세이(krusei), 글라브라타(glabrata), 트로피칼리스(tropicalis)), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 아스퍼질러스(Aspergillus)(예, 푸미가투스(fumigatus), 나이거(niger)), 뮤코랄레스(Mucorales) 속의 균류(뮤코르(Mucor), 압시디아(Absidia), 리조푸스(Rhizopus)), 스포로트릭스 센키(Sporothrix schenkii), 블라스토미세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 파라콕시디오이디즈 브라질리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis), 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis) 및 히스토플라스마 캡슐라툼(Histoplasma capsulatum)을 포함한다. 항원으로부터 에피토프가 유래될 수 있는 감염을 일으키는 병원성 기생충의 일부 예는 엔타모에바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica), 발란티디움 콜라이(Balantidium coli), 네글레리아(Naegleria), 포울러리(Fowleri), 아칸트아메바(Acanthamoeba) sp., 기아르디아 람비아(Giardia lambia), 크립토스포르디움(Cryptosporidium) sp., 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii), 플라스모디움 비박스(Plasmodium vivax), 바베시아 미크로티(Babesia microti), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 리슈마니아 도노바니(Leishmania donovani), 톡소플라즈마 곤디(Toxoplasma gondii) 및 플라스모디움 팔시파리스(Plasmodium falciparis)를 포함한다.
또한, C-말단 융합체는 예를 들어, MAGE, BAGE, RAGE, GAGE, SSX-2, NY-ESO-1, CT-항원, CEA, PSA, p53, XAGE 및 PRAME뿐만 아니라 인 유두중 바이러스(Human papilloma virus(HPV)), 카포시 육종 바이러스(Kaposi sarcoma herpes virus(KSHV)), 엡스테인 바 바이러스(Epstein Barr virus)) 유도된 림프종의 항원(EBV)을 포함하는 바이러스 유도된 악성 종양(malignancies)을 포함하는, 광범위한 종양 항원으로부터의 하나 이상의 에피토프를 포함할 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 에피토프가 유도될 수 있는 종양 항원의 다른 예는 암과 관련된 것으로 알려진 다양한 유비쿼터스로 발현되는 자가 항원(ubiquitously expressed self-antigens)이며, 예를 들어, p53, MDM-2, HDM2 및 p53 경로에서 한 역할을 하는 다른 단백질들, 생존하는 텔로머라아제, 시토크롬 P450 이소폼 1B1, Her-2/neu 및 CD19 및 모든 소위 하우스 홀드 단백질들을 포함한다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 암은 하기 리스트 중에 선택된다: 폐, 결장, 식도, 난소, 췌장, 피부, 위, 두경부, 방광, 육종, 전립선, 간세포, 뇌, 부신, 유방, 자궁 내막, 중피종, 신장, 갑상선, 혈액학적 암, 유암종(carcinoid), 흑색종, 부갑상선, 자궁경부암, 신경모세포종, 빌름스(Wilms), 고환, 뇌하수체 및 갈색세포종(pheochromocytoma) 암들.
일 구현으로, C-말단 융합 파트너는 감염성 제제(infectious agent) 또는 종양의 단백질성 항원으로부터의 하나 이상의 표면 노출된 에피토프를 포함하거나 또는 이로 구성된다. C-말단 융합 파트너는 예를 들어, 감염성 제제 또는 종양의 단백질성 항원의 세포외 및/또는 표면 노출된 도메인을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
바람직한 구현으로, C-말단 융합 파트너는 표면 노출된 박테리아 단백질 또는 리포단백질의 표면 노출된 도메인을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 바람직하게는 보르데텔라(Bordetella), 보렐리아(Borrelia), 콕시엘라(Coxiella) 나이세리아(Neisseria) 및 상기 언급된 어느 다른 병원성 박테리아 속으로 구성되는 속으로부터 선택된 박테리아로부터 표면 노출된 단백질 또는 리포단백질의 표면 노출된 도메인이다. 보다 바람직하게, 표면 노출된 도메인은 Schuijt et al.(2011, Trends in parasitology. 27(1):40-7), Steere and Livey(2013; 참고문헌 리스트에서 49), Embers and Narasimhan(2013, Frontiers in cellular and infection microbiology. 3:6) and Small et al.(2014, PloS one. 9(2):e88245) 중 하나 이상에 기재된 바와 같은, OspA, OspB, OspC, OspF, VlsE, BbCRASP1, Vsp1, P35(BBK32), P37(BBK50), P39, P66, DpbA 및 BB017로 구성되는 그룹로부터 선택된 보렐리아(Borrelia) 단백질 또는 리포단백질의 것이다. 가장 바람직하게, 표면 노출된 도메인은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 29-273, SEQ ID NO: 58의 아미노산 29-273, 또는 SEQ ID NO: 59의 아미노산 136-210을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
C-말단 융합 파트너의 아미노산 서열은 또한 SEQ ID NO: 4의 아미노산 29-273, SEQ ID NO: 58의 아미노산 29-273 또는 SEQ ID NO: 59의 서열과 또는 아미노산 136-210과 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다.
제2견지로, 본 발명은 상기 본 명세서에서 정의된 바와 같은 융합 리포단백질을 포함하는 OMV에 관한 것이다. 백신에 사용되는 OMV("blebs"라고도 알려짐)는 디터전트 추출(dOMV 정제 과정)에 의해 통상적으로 준비되어 왔으며, 이러한 디옥시콜레이트(deoxycholate)와 디터전트는 LPS를 제거하고 소포(vesicle) 방출을 증가시키는 데 사용된다. N. 메닝지티디스(N. meningitidis)와 같은 대부분의 그람 음성 박테리아의 LPS는 고 독성이지만, 소포 구조를 유지하기 위해 그리고 애주번트(adjuvant) 활성을 위해 OMV에 잔류량(약 1%)이 필요하다. 그러나, 대부분의 LPS와 함께, 디터전트 추출 공정은 또한 리포단백질을 제거하므로, 본 발명의 융합 리포단백질을 포함하는 OMV를 생산하기에 적합하지 않다. 따라서, 본 발명에 따른 융합 리포단백질을 포함하는 OMV는 바람직하게 디터전트로 추출된 OMV가 아니다. 그러나, 디터전트로 추출된 OMV가 아닌 OMV를 제조하는 방법은 어느 디터전트의 사용을 배제하지 않는 것으로 이해된다. 저농도의 디터전트 및/또는 약한 디터전트의 사용은 본 발명에 따른 대부분의 융합 리포단백질, 즉, 예를 들어, 동일한 배양물의 동등한 양으로부터 자발적인(spontaneous) 또는 상층물의 OMV에 존재하는 융합 리포단백질의 양과 비교하여, 융합 리포단백질의 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 99%가 유지되는 한 배제되지 않는다.
본 발명의 융합 리포단백질을 포함하는 바람직한 OMV는 상층물 또는 자발적인 OMV, 즉 상기 본 명세서에 정의된 바와 같은 sOMV, 또는 네이티브 OMV, 즉 상기 본 명세서에 정의된 바와 같은 nOMV이다. nOMV는 본 명세서의 실시예 1.6에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. nOMV를 제조하기 위한 추가의 방법은 예를 들어, Saunders et al.(1999, Infect Immun, 67, 113-119), van de Waterbeemd et al.(2012, Vaccine, 30: 3683-3690) 및 WO2013006055에 기재된 바와 같으며, 그리고 sOMV의 제조 방법은 예를 들어 van de Waterbeemd et al.(2013, PLoS ONE, 8(1): e54314. doi:10.1371/journal.pone.0054314) 및 Lee et al.(2007, Proteomics, 7: 3143-3153)에 기재된 바와 같으며, 이들 문헌은 모두 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다.
본 발명의 융합 리포단백질을 포함하는 OMV는 바람직하게 (i) 리포폴리사카라이드(LPS) 생합성 경로를 변경시키는 유전적 변형, 바람직하게는 보다 적은 내독소(endotoxic) 및 반응성 변이체를 얻기 위해 리포폴리사카라이드(LPS) 생합성 경로를 변경시키는 유전적 변형; (ii) 정상적으로 분비된 항원의 외막 유지를 야기하는 유전자 변형; (ⅲ) 외막 앵커 단백질을 제거함으로써 OMV 생산을 증가시키는 유전자 변형; (iv) 바람직하지 않은 타입의 면역 반응을 유발할 수 있는 면역-조절 성분을 제거하는 유전자 변형; 및 (v) 숙주 OMV 생산 스트레인 이외의 다른 병원체로부터 이종 항원의 발현을 유도하는 유전자 변형으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 유전적 변형을 갖는 그람-음성 박테리아로부터 획득되거나/획득가능하다.
본 발명의 융합 리포단백질을 포함하는 OMV는 바람직하게, 박테리아가 감소된 독성을 갖는 LPS를 생산하나 LPS가 이의 애주번트 활성의 적어도 일부를 보유하도록 하는 유전적 변형을 갖는 그람-음성 박테리아로부터 획득되거나/획득가능하며, 여기서 바람직하게 유전적 변형은 lpxL1, lpxL2 및 lpxK 유전자 또는 이의 호모로그 중 적어도 하나의 발현을 감소시키거나 제거하며, 그리고/또는 lpxE, lpxF 및/또는 pagL 유전자 중 적어도 하나의 발현을 증가시킨다. 보다 바람직하게, 그람-음성 박테리아는 lpxL1 유전자 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열과 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 호로모그의 발현을 감소시키거나 제거하는 유전적 변형을 갖는다.
본 발명의 융합 리포단백질을 포함하는 OMV를 획득하거나/획득할 수 있는 그람 음성 박테리아는 추가로 바람직하게 소포 형성을 증가시켜 이에 따라 OMV 수율을 증가시키기 위해 외막과 펩티도글리칸 사이의 앵커 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 감소시키거나 제거하는 유전적 변형을 포함한다. 이러한 목적을 위한 적절한 유전적 변형은 예를 들어, 그람-음성 박테리아에서 일반적으로 발견되는, 예를 들어 나이세리아(Neisseria)에서의 RmpM 단백질(Steeghs et al., 2002 Cell Microbiol, 4:599-611; van de Waterbeemd et al., 2010 Vaccine, 28:4810 - 4816)과 같은, OmpA 호모로그의 발현을 감소시키거나 제거한다. 따라서, 바람직하게, 그람-음성 박테리아는 rmpM 유전자 또는 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열과 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 이의 호모로그의 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 유전적 변형을 갖는다.
일 구현으로, 본 발명의 융합 리포단백질을 포함하는 OMV는 바람직하게 nalP 유전자 또는 이의 호모로그의 발현을 감소시키거나 제거하는 유전적 변형을 갖는 그람-음성으로부터 획득되거나/획득가능하다. NalP 프로테아제는 나이세리아(Neisseria)에서 LbpB 세포 표면-노출된 리포단백질의 단백질 분해성 방출을 담당하는 것으로 밝혀졌다(Roussel-Jazede et al., 2010, Infect Immun 78: 3083-3089). 본 발명의 융합 리포단백질의 단백질 분해성 방출을 방지하기 위해, 바람직하게, 본 발명의 융합 리포단백질을 포함하는 OMV를 생산하는 그람-음성 숙주는 nalP 유전자 또는 이의 호모로그의 발현을 감소시키거나 제거하는 유전적 변형을 갖는다. 더욱 바람직하게, nalP 유전자 또는 이의 호모로그의 발현은 N-말단 융합 파트너가 LbpB 아미노산 서열을 포함하는 융합 리포단백질을 포함하는 OMV를 생산하기위한 그람-음성 숙주에서 감소되거나 제거된다. 따라서, 바람직하게 그람-음성 박테리아는 nalP 유전자 또는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열과 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 이의 호모로그의 발현을 감소시키거나 제거하는 유전적 변형을 갖는다.
본 발명의 융합 리포단백질을 포함하는 OMV를 생산하기 위한 그람-음성 박테리아 숙주 세포는 cps, ctrA, ctrB, ctrC, ctrD, exbB, exbD, frpB, galE, htrB, msbB, lpbB, lpxK, lpxL1, nmb0033, opA, opC, rmpM, phoP, pilC, pmrE, pmrF, porA, porB, siaA, siaB, siaC, said, synA, synB, sync, tbpA 및 tbpB, 또는 이의 호모로그로 구성되는 그룹으로부터 선택된 유전자의 발현을 감소시키거나 제거하는 하나 이상의 유전적 변형을 추가로 가질 수 있으며; 이들 돌연변이의 다수는 WO02/09746에서 리뷰되어 있다.
본 발명의 융합 리포단백질을 포함하는 OMV를 생산하기 위한 그람-음성 박테리아 숙주 세포는 바람직하게 나이세리아(Neisseria), 보르데텔라(Bordetella), 에세리키아(Escherichia) 및 살모넬라(Salmonella)로 구성되는 그룹으로부터 선택된 속에 속하는 박테리아 숙주 세포이며, 더욱 바람직하게는 나이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 에세리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)로 구성되는 그룹으로부터 선택된 종에 속하는 박테리아 숙주 세포이다.
추가의 견지로, 본 발명은 본 발명에 따른 융합 리포단백질을 포함하는, 상기 정의된 바와 같은 OMV를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 당해 기술분야에서 통상적으로 알려진 바와 같은 약학적으로 허용가능한 담체, 매질 또는 전달 비히클을 더 포함하는 것이 바람직하다(참조: "Handbook of Pharmaceutical Excipients", Rowe et al., 7th edition, 2012, www.pharmpress.com). 약학적으로 허용가능한 안정화제, 삼투압제, 완충제, 분산제 등이 또한 약학적 조성물에 편입될 수 있다. 바람직한 형태는 의도된 투여 방식 및 치료학적 적용에 따라 달라진다. 약학적 담체는 활성 성분, 즉 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 OMV를 환자에게 전달하기에 적합한 임의의 양립가능한 무독성 물질일 수 있다.
비경구 전달을 위한 약학적으로 허용가능한 담체는 임의로 20% 알부민이 보충된 멸균 완충된 0.9% NaCl 또는 5% 글루코스로 예시된다. 대안적으로, 융합 단백질을 포함하는 OMV는 인산염 완충 식염수(PBS)에 현탁될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제조물은 멸균되어야 한다. 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 OMV의 투여를위한 비경구 경로는 공지된 방법, 예를 들어 복강 내, 근육 내, 동맥 내 또는 병소 내 경로에 의한 주사 또는 주입에 따른다. 근육 내 주사를 위한 전형적인 약학 조성물은 예를 들어, 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 OMV의 유효 투여량을 포함하는 인산염 완충 식염수 1 내지 10ml를 함유하도록 제조될 것이다. 비경구적으로 투여가능한 조성물을 제조하는 방법은 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy"(Ed. Allen, L. V. 22nd edition, 2012, www.pharmpress.com)를 포함하는 다양한 출처에 보다 상세히 기재되어 있다..
다른 견지로, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한, 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 OMV 또는 상기 OMV를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
또 다른 견지로, 본 발명은 본 명세서에 상기 정의된 바와 같은 항원과 관련된 감염성 질병 또는 종양의 예방 또는 치료를 위한, 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 OMV 또는 상기 OMV를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 바람직하게, 전염성 질병은 보렐리아(Borrelia) 감염, 보다 바람직하게는 보렐리아 버그도르페리(Borrelia burgdorferi) 감염이다.
이 견지에서, 본 발명은 따라서 치료학적 또는 예방학적 유효량의 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 OMV(를 포함하는 약학 조성물)를 이의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상자에게 투여함으로써 감염성 질병 또는 종양에 대한 백신화, 또는 이의 예방 또는 치료를 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 의약, 바람직하게는 감염성 질병 또는 종양에 대한 백신화, 또는 예방 또는 치료를 위한 의약으로서 사용하기 위한 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 OMV에 관한 것이다.
또 다른 견지에서, 본 발명은 프리-프로융합(pre-profusion) 리포단백질을 암호하는 핵산 분자에 관한 것으로, 여기서 그람-음성 박테리아에서 발현시 프리-프로융합 리포단백질은 상기 본 명세서에 정의된 바와 같이 융합 리포단백질로 성숙하고, 그리고 여기서 바람직하게 상기 핵산 분자는 그람-음성 박테리아에서 프리-프로융합 리포단백질의 발현을 위한 발현 구조물이다. 단백질 그람-음성 박테리아의 발현을 위한 발현 구조물을 제조하는 수단 및 방법은 일반적으로 당 업계에 잘 알려져 있다.
또한 추가의 견지에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 핵산 분자 또는 발현 구조물을 포함하는 그람-음성 숙주 세포에 관한 것이다. 바람직하게 상기 숙주 세포는 상기 정의된 속 또는 종에 속하는 박테리아 숙주 세포이다.
마지막 견지로, 본 발명은 본 발명의 융합 리포단백질을 포함하는 OMV를 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 바람직하게 a) 프리-프로융합 리포단백질의 숙주 세포에서의 발현을 위해 상기 정의된 바와 같은 핵산 분자 또는 발현 구조물을 포함하는 그람-음성 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 여기서 그람-음성 숙주 세포에서 발현시 프리-프로융합 리포단백질은 본 명세서에서 상기 정의된 바와 같은 융합 리포단백질로 성숙하는 배양 단계; 및, c) OMV를 회수하는 단계, 여기서 상기 회수는 적어도 OMV로부터 박테리아의 제거를 포함하는 회수 단계의 단계들을 포함한다. 바람직하게 상기 방법에서, 단계 c)에서 OMV의 회수는 OMV가 추출되는 단계 b)에 선행된다. 본 발명의 융합 리포단백질을 포함하는 OMV의 제조 방법은 바람직하게 본 명세서에서 정의된 바와 같이 그리고 상술한 바와 같이 디터전트-프리 방법이다.
본 문헌 및 이의 청구범위에서, "포함하다(to comprise)"라는 동사와 그 활용형들은 비-한정적인 의미로 사용되며, 그 단어 다음에 나오는 항목은 포함되지만 구체적으로 언급되지 않은 항목은 제외되지 않는다. 또한, 부정관사 "하나의(a 또는 an)"에 의한 구성요소에 대한 언급은 문맥에 구성요소 중 단 하나만 존재할 것을 명확하게 요구하지 않는 한, 구성요소 중 하나 이상이 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 따라서 부정관사 "하나의(a 또는 an)"는 일반적으로 "적어도 하나(at least one)"를 의미한다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 문헌은 그 전체가 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위를 한정하려는 것은 아니다.
도면의 설명
도 1. fHbp(해치된), OspA(화이트) 및 융합 구조물의 개요도. fHbp 및 OspA에 대한 아미노산 번호는 박스 영역에 표시된다. S.p. = 신호 펩타이드, α1 = 후속 루프를 포함하는 fHbp의 N-말단 알파-헬릭스, β1-4 = fHbp의 처음 네 개의 N-말단 베타-시트. 번호가 매겨진 화살표는 표 1에 나열된 프라이머를 지칭하며, 포워드 프라이머는 위에 도시되고 리버스 프라이머는 도식 (융합) 유전자 아래에 표시되며, 화살표 헤드의 위치는 3' 말단의 대략적인 위치를 반영한다. 일부 구조에 포함된 인공 링커(6)는 화이트로 표시된다. 구조물 fA1은 구조물 fA3b 및 fA5c를 생성하기 위한 주형으로 사용되었다.
도 2. OspA 또는 융합 구조물을 운반하는 N. 메닝지티디스(N. meningitidis) 세포(A) 또는 nOMVs(B)에서의 OspA 발현의 웨스턴 블롯 분석. 세포 및 nOMVs는 각각 OD600 및 단백질 함량에 기초하여 표준화되었다. 상이한 구조의 예측 분자량은 kDa로 표시된(괄호 안). 화살표는 전장 단백질을 나타낸다. Wt: '빈(empty)' 플라스미드 pEN11-Imp를 운반하는 N. 메닝지티디스(N. meningitidis) 세포 (또는 이들 세포로부터 수거된 nOMVs)(재료 및 방법 참조).
도 3. 마우스 혈청의 웨스턴 블롯 분석. 래인에 pEN11-OspA('OspA') 또는 pEN11-Imp('Imp')를 운반하는 E. 콜라이(E. coli)를 로딩하였다. (A) 왼쪽에서 오른쪽으로; (1) ~ 28kDa의 예상 밴드를 나타내는 항-OspA를 갖는 컨트롤 블롯 및 (2) PBS, (3) 고 투여량의 빈 nOMVS, (4) 고 투여량의 OspA nOMVs, 5) 고 투여량의 fA1 nOMVs, (6) 저 투여량 및 (7) 고 투여량의 fA4b nOMVs, 및 (8) 저 투여량 및 (9) 고 투여량의 fA6 nOMVs로 면역화된 5 마리의 마우스 그룹의 혼합(pooled) 혈청을 이용한 블롯들. (B) 고 투여량의 fA6 nOMVs로 면역화된 개별 마우스로부터의 혈청을 이용한 블롯들(이 그룹의 혼합 혈청은 도 4a에서 오른쪽 끝에 있다). 화살표는 OspA(~ 28 kDa)와 비슷한 분자량을 가진 밴드를 가리킨다.
도 4. 구조물 fA4b, fA4c, fA6 또는 fA7을 운반하는 20㎍/ml nOMVs로 면역화 된 개별 마우스의 혈청에 대한 ELISA 데이터. 빈 벡터 pEN11-Imp를 운반하는 20μg/ml nOMVs로 면역화된 마우스의 혼합 혈청을 음성 컨트롤로 사용하고 플로팅 전에 데이터에서 감하였다. 여기서 시험된 fA6으로 면역화된 마우스의 혈청은 도 4b에 나타낸 웨스턴 블롯의 혈청과 동일하며, 이는 개별 #2의 보다 낮은 반응성에 반영된다.
도 5. TbpB(해치된) 및 OspA(화이트) 융합 구조물의 개요도. TbpB 및 OspA에 대한 아미노산 번호는 박스 영역에 표시된다. S.p. = 신호 펩타이드. 번호가 매겨진 화살표는 표 1에 나열된 프라이머들을 지칭하며, 포워드 프라이머는 위에 도시되고 리버스 프라이머는 도식 (융합) 유전자 아래에 표시되며, 화살표 헤드의 위치는 3' 말단의 대략적인 위치를 반영한다.
도 6. OspA 폴리클로날(Rockland Immunochemicals)을 사용하여 구조물 fTA1-4를 운반하는 N. 메닝지티디스(N. meningitidis) 세포에서 OspA 발현의 웨스턴 블롯 분석. 여러 가지 구조물들의 예측 분자량은 kDa로 표시된(괄호 안). 화살표는 전장 단백질을 나타낸다.
도 7. fHbp-OspA 및 TbpB-OspA 융합 구조물의 개요도 및 웨스턴 블롯 분석. A) 구조물의 개요도. fHbp 프래그먼트들은 해치된 것이며, OspA 프래그먼트들은 그레이이고, TbpB 프래그먼트들은 화이트이다. fHbp, TbpB 및 OspA에 대한 아미노산 번호는 박스 영역에 표시된다. S.p. = 신호 펩타이드. 번호가 매겨진 화살표는 표 1에 나열된 프라이머들을 지칭하며, 포워드 프라이머는 위에 도시되고 리버스 프라이머는 도식 (융합) 유전자 아래에 표시되며, 화살표 헤드의 위치는 3' 말단의 대략적인 위치를 반영한다. B) OspA 모노클로날 항체(Santa Cruz Biotechnologies)를 사용하여 fA10 및 fTA5 구조물을 운반하는 N. 메닝지티디스(N. meningitidis) 세포에서 OspA 발현의 웨스턴 블롯 분석. 여러 가지 구조물들의 예상 분자량은 kDa로 표시된다(괄호 안). 화살표는 전장 단백질을 나타낸다.
도 8. fHbp-OspC 융합 구조물의 개요도 및 웨스턴 블롯 분석. A) 상기 구조물의 개요도. fHbp 프래그먼트는 해치된 것이며, OspC 프래그먼트는 화이트이다. fHbp 및 OspC에 대한 아미노산 번호는 박스 영역에 표시된다. S.p. = 신호 펩타이드. 번호가 매겨진 화살표는 표 1에 나열된 프라이머들을 지칭하며, 포워드 프라이머는 위에 도시되고 리버스 프라이머는 도식 (융합) 유전자 아래에 표시되며, 화살표 헤드의 위치는 3' 말단의 대략적인 위치를 반영한다. B) 구조물 fC9 및 OspC를 갖는 N. 메닝지티디스(N. meningitidis) 세포에서의 OspC 발현의 웨스턴 블롯 분석. OspC에 대한 명확한 발현은 관찰되지 않았다. 여러 가지 구조물들의 예상 분자량은 kDa로 표시된다(괄호 안). fC9 구조물은 호모다이머를 형성하지 않는다.
도 9. fHbp-RmpM 및 TbpB-RmpM 융합 구조물의 개요도 및 웨스턴 블롯 분석. A) 구조물의 개요도. fHbp 프래그먼트는 해치된 것이며, RmpM 프래그먼트는 회색이고, TbpB 프래그먼트는 화이트이다. fHbp, TbpB 및 RmpM에 대한 아미노산 번호는 박스 영역에 표시된다. S.p. = 신호 펩타이드. 번호가 매겨진 화살표는 표 1에 나열된 프라이머들을 지칭하며, 포원드 프라이머는 위에 도시되고 리버스 프라이머는 도식 (융합) 유전자 아래에 표시되며, 화살표 헤드의 위치는 3' 말단의 대략적인 위치를 반영한다. B) 구조물 fR1 및 fTR1을 갖는 N. 메닝지티디스(N. meningitidis) ΔRmpM 세포에서의 RmpM 발현의 웨스턴 블롯 분석. 여러 가지 구조물들의 예상 분자량은 kDa로 표시된다(괄호 안). 화살표는 전장 단백질을 나타낸다.
실시예
1. 재료 및 방법
1.1 항생제
앰피실린(Amp)과 클로팜페니콜(Cam)은 Sigma에서 구입하였다. 스톡 용액을 Milli-Q(MQ) 물에서 제조하고, 0.22 μm Steriflip(Milipore)을 사용하여 여과-멸균하고, 4℃에 보관하였다.
1.2 박테리아 스트레인 및 성장 조건
에세리키아 콜라이(Escherichia coli) 스트레인 JM109(Promega) 및 TOP10F'(Invitrogen)를 벡터 pGEM-T Easy 및 pEN11과 관련된 클로닝 단계에 각각 사용하였다. 두 스트레인은 37℃에서 15g agar/리터 및 적절한 항생제(pGEM-T Easy에 대해 50㎍/ml Amp 및 pEN11에 대해 25μg/ml Cam)가 보충된 Luria Bertani 배지(MP Biomedicals)에서 성장시켰다. JM109의 블루/화이트 스크리닝을 위해, 플레이트에 50μg/ml 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-베타-D-갈락토-피라노시드(X-gal, Fermentas) 및 0.1 mM 이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노시드(IPTG, Thermo Scientific). 액체 배양물을 37℃ 및 200 RPM에서 성장시켰다.
lpxL1 결실을 갖는 나이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis) 스트레인 HB-1(52)은 IsoVitaleX가 보충 된 Difco GC 배지 베이스(둘다 모두 Becton Dickinson)에서 37℃, 5% CO2를 함유하는 습한 분위기에서 성장시켰다. 플레이트는 pEN11로 형질전환시키는 경우 3㎍/ml Cam으로 보충되었다. 액체 배양물은 3μg/ml Cam과 1mM IPTG가 함유된 Tryptic Soy Broth(TSB, Becton Dickinson)에서 37℃ 및 150 RPM에서 성장시켰다.
보렐리아 버그도르페리(Borrelia burgdorferi) B31 스트레인은 J. Hovius(Amsterdam Medical Center)의 실험실에서 친절하게 제공받았다. B. 버그도르페리(B. burgdorferi)의 게놈 DNA는 제조사의 지침에 따라 DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen)을 사용하여 추출하였다.
1.3 재조합 DNA 기술
하이브리드는 fHbp(N. 메닝지티디스(N.meningitidis)), TbpB(N. 메닝지티디스(N.meningitidis)), OspA (B. 버그도르페리(B. burgdorferi) 또는 B. 아프젤리(B. afzelii)), OspC (B. 버그도르페리(B. burgdorferi)) 및 RmpM N. 메닝지티디스(N.meningitidis)로 만들어졌다. 모든 하이브리드는 Overlap Extension PCR(53)을 사용하여 작제되었다. Accuprime Taq DNA Polymerase System(Invitrogen)을 사용하여 모든 PCR을 수행하여 고 충실도 증폭과 3' A-오버행의 첨가 모두를 확실히 하였다. 다른 구조물에 대한 개요도는 도 1과 5를 참조바람.
Figure 112017129373883-pct00001
Figure 112017129373883-pct00002
Figure 112017129373883-pct00003
Figure 112017129373883-pct00004
앰플리콘은 pGEM-T Easy 벡터(Promega)에서 블런트-말단에 결찰시키고, 후속적으로 제조자의 지시에 따라 E. 콜라이(E. coli) JM109 세포(Promega) 내로 히트-쇼크 형질전환되었다. 형질전환체를 프라이머 M13-F 및 M13-R을 사용하여 정확한 길이의 삽입을 위해 스크리닝하였다(표 1 참조). 플라스미드는 Wizard Plus SV Plasmid Miniprep System(Promega)을 사용하여 양성 JM109 형질전환체의 하룻밤 배양물로부터 분리하였다. 분리된 플라스미드를 제한 효소 AatII 및 NdeI(Fermentas)를 사용하여 다이제스션하였다. 이어서, 생성된 프래그먼트를 겔 전기 영동에 의해 분리하고, 이어서 Wizard SV Gel 및 PCR Cleanup System(Promega)을 사용하여 겔-정제하였다. Shrimp Alkaline Phosphatase(Roche)의 존재하에 AatII 및 NdeI로 다이제스션한 후 유니버설 플라스미드 pEN11(54)를 벡터로 사용하였다. 삽입물 및 벡터를 제조자의 지시에 따라 T4 DNA 리가아제(Promega)를 사용하여 결찰시키고, 그 결과 생성된 플라스미드를 그 다음, E. 콜라이(E. coli) One Shot TOP10F' 컴피턴트 세포(Invitrogen)로 히트-쇼크 형질전화시킨다. 형질전환체를 프라이머 pEN11-F 및 각각의 구조물의 리버스 프라이머를 사용하여 정확한 길이의 삽입을 위해 스크리닝하였다. OspA 또는 fHbp-OspA 융합체를 운반하는 분리된 pEN11 플라스미드(상기한 바와 같은 분리 절차) 약 1㎍을 N. 메닝지티디스(N.meningitidis) 세포(OD600
Figure 112017129373883-pct00005
0.2)의 1ml 현탁액에 첨가하고 37℃에서 6시간 동안(쉐이킹 없음) 10mM MgCl2가 보충된 TSB에서 성장시켰다. 그 다음, 박테리아를 3μg/ml Cam을 함유한 GC 플레이트에 도말하였다. 24-48시간 후에 콜로니를 분리하고 전술한 바와 같이 정확한 삽입물을 갖는 pEN11의 존재 여부를 스크리닝하였다.
1.4 N. 메닝지티디스( N.meningitidis ) 세포와 nOMV에서의 구조물 발현
N. 메닝지티디스(N.meningitidis) 세포를 GC II 플레이트(Becton Dickinson)에 스트리킹하고 상술한 바와 같이 밤새 성장시켰다. 다음날, 멸균된 면봉으로 콜로니를 수거하고, 1mM IPTG 및 3μg/ml Cam을 함유하는 TSB에 현탁시키고, 보충제가 함유된 5ml의 동일한 브로스(broth)에 0.2의 OD600으로 추가 희석하였다. 세포를 37℃ 및 170 RPM에서 4시간 동안 성장시킨 후, OD600을 다시 측정하고 4.0 × 108 CFU에 해당하는 분액을 13,000 RPM에서 5분간 원심분리하고 인산 완충 식염수(PBS)에 재현탁시켰다. 그런 다음, 세포를 이전과 같이 원심분리한 후, 그 결과 형성된 펠렛을 40㎕ MQ에 용해하고, 10㎕ 5x 시료 버퍼(50% 글리세롤, 0.25% Tris pH 6.8, 10% 소듐 도데실 설페이트, 10% 디티오트레이톨 및 0.05% 브로모페놀 블루)와 혼합하고, 10분 동안 끓였다. 추가 분석을 위해 시료를 -20℃에서 보관하였다.
N. 메닝지티디스(N.meningitidis) 네이티브 OMVs(nOMVs)를 PBS에서 1ml 당 20㎍의 총 단백질로 희석한 후, 40㎕의 nOMV 현탁액을 이전과 같이 10㎕ 5 × 시료 버퍼와 함께 끓였다.
nOMVs 세포의 단백질 시료를 12% Precise Protein Gels(Thermo Scientific)에서 SDS-PAGE로 분리하였다. 그 다음, 분리된 단백질을 0.45 μm 니트로셀룰로오즈 멤브레인(BioRad)으로 옮겼다. 멤브레인을 0.1M Tris, 1.54M NaCl 및 5% Tween-80을 함유하는 버퍼 중에 항-OspA(Rockland)의 1:1000 희석으로 롤링 테이블에서 1시간동안 배양하였다. 그런 다음, 멤브레인을 0.5% Protifar(Nutricia)가 보충된 동일한 버퍼에서 염소-항-토끼 IgG AP(Southern BioTech)의 1:2000 희석으로 옮겼다. 블롯은 AP Conjugate Substrate Kit(BioRad)를 사용하여 디벨로핑되었다.
1.5 면역염색
다양한 구조물을 갖는 pEN11을 운반하는 N. 메닝지티디스(N.meningitidis) 세포를 폴리-l-리신(Sigma)으로 코팅된 커버슬립 상에 고정시켰다. 세포를 PBS 중 2% 포름알데히드로 10분간 고정시켰다. 3% Bovine Serum Albumin(BSA, Sigma)을 함유한 PBS에서 블로킹한 후, 커버슬립을 0.5% BSA가 함유된 PBS에서 항-OspA(Rockland)와 항-fHbp(변이체 1, NIBSC)의 1:300 희석으로 1차 배양하였다. 세척 후, 이들을 Alexa Fluor 488 염소-항-토끼 IgG와 Alexa Fluor 594 염소-항-마우스 IgG(Life Technologies)의 혼합물의 1:300 희석으로 배양하였다. 슬라이드들을 PBS 중 2% 포름알데히드로 후 고정시키고, Olympus CKX41 형광 현미경 하에서 40x 배율로 적절한 필터를 사용하여 관찰하였다.
1.6 nOMV 백신의 정제
면역화 실험을 위해 선택된 클론의 글리세롤-스톡을 GC II 플레이트에 스트리킹하고, 상술한 조건 하에서 밤새 성장시켰다. 다음날, 콜로니를 수거하고, 이를 사용하여 1M IPTG 및 3㎍/ml Cam을 함유하는 TSB에서 OD600 = 0.05의 200ml 배양을 시작하였다. 이 배양물은 37℃와 130 RPM에서 성장되었고, OD600은 규칙적인 간격으로 측정되었다. 배양물이 1.5의 OD600에 도달하면(~6시간 후) 얼음 위에 놓고, 후속적으로 3,500 RPM과 4℃에서 30분간 원심분리하였다. 펠렛을 Tris-EDTA 버퍼(100mM Tris, 10mM EDTA, pH = 8.6)에 재현탁시키고, 30분 동안 수평 교반 테이블에서 배양하였다. 이 버퍼는 OM을 불안정화시키는 킬레이트제(EDTA)를 함유하기 때문에, OMV의 방출이 자극된다. 상기 현탁액을 13,000 RPM으로 30분간 원심분리하고, 상층물을 Steriflip 0.22㎛ 필터(Millipore)를 사용하여 멸균하였다. 이어서, 멸균된 상층물을 40,000 RPM에서 65분 동안 원심분리한 후, 생성된 OMV 펠렛을 건조시키고, 그 후 1ml 수크로오스 버퍼에 재현탁시켰다. 현탁물을 이전과 같이 다시 여과하고 4℃에 보관하였다.
상술한 nOMV 분리 절차는 라이시스(lysis)로 인한 다른 세포 단백질의 히치하이킹 없이 가능한 많은 nOMVs를 수득하기 위해 개발되었다. 본 발명자들은 이 절차를 사용하여 수거한 nOMVs에서 OspA, fA1, fA2b, fA3b 및 fA5c의 발현이 다른 배양 단백질의 히치하이킹을 유의적으로 증가시키지 않으면서 각각의 배양물을 12시간 동안 성장시킴으로써 증가될 수 있음을 알아냈다(데이타로 나타내지는 않았음). 따라서 본 발명자들은 가능한 한 구조물의 발현을 동일하게 하기 위해 이러한 구조물에 대해 대안적인 분리 절차를 사용하기로 결정했다.
분리된 nOMVs의 총 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트(Pierce)를 사용하여 측정하였고, 그 다음, nOMVs는 백신 접종 당일에 ml 당 5 또는 20μg의 총 단백질로 PBS에 희석하였다.
1.7 마우스 및 면역화
5마리의 암컷, 6주에서 8주령의 BALB/cOlaHsd 마우스(Harlan)의 그룹을 저농도(5㎍/ml) 또는 고농도(20㎍/ml)의 200㎕의 nOMV로 피하 면역화시켰다. OspA(2 그룹) 또는 fHbp-OspA 융합(16 그룹)으로 '로드된(loaded)' nOMVs를 받은 그룹 다음에, 2 컨트롤 그룹은 ospA-구조물을 대체하는 imp 유전자를 갖는 pEN11 플라스미드(54)를 운반하는 세포로부터 수거된 '빈(empty)' nOMVS를 받았다). 추가 컨트롤 그룹을 PBS로 면역화하여, 총 21 그룹을 얻었다. 마우스를 0일과 28일에 면역화시키고, 마지막 면역화 후 14일째에 희생시켰다. 혈액을 Vacuette Z Serum Clot Activator 튜브(Greiner Bio-One)에 수집하고, 2000 RPM으로 15분간 원심분리하였다. 이어서, 혈청을 수집하고, 추가 분석을 위해 -20℃에서 보관하였다.
1.8 혈청 분석
혈청을 그룹(5마리 마우스)에 의해 일차 풀링하고(pooled), 항체의 존재를 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 멤브레인은 pEN11-Imp 또는 pEN11-OspA를 운반하는 E. 콜라이(E. coli) TOP10F' 세포로부터의 단백질로 로딩되었다. 멤브레인은 Tris 버퍼(이전에 기술됨)에서 1:1000으로 희석된 풀링된 혈청을 갖는 롤링 테이블에서 1시간 동안 배양한 후, 앞서 기술된 바와 동일한 버퍼 및 블롯 디벨롭먼트에서 2차 항체(염소-항-마우스 IgG AP, Southern BioTech)의 1:2000 희석에서 배양하였다. 2 개의 가장 강하게 반응하는 그룹(fA4b, 20㎍/ml 및 fA6, 20㎍/ml)의 모든 마우스의 10개의 개별 혈청을 동일한 방식으로 분석하였다.
ELISA의 경우, PBS로 희석된 0.5μg/ml OspA 컨트롤 단백질(Rockland) 100 μl를 Microlon 96-웰 플레이트(GreinerBio)의 웰 표면에 코팅하고, 실온(RT)에서 밤새 배양했다. 다음날, 플레이트를 200㎕ 0.5% Protifar를 PBS에 첨가하여 블로킹하고, 그 후 실온에서 30분 동안 배양하였다. 이어서, 플레이트를 세척 버퍼(0.05% 트윈-80을 갖는 물)에서 3회 세척하였다. 개별 마우스의 혈청을 0.1% tween-80을 함유하는 PBS로 적절히 희석하고, 웰당 100㎕를 첨가한 후, 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 이어서, 플레이트를 세척 버퍼에서 3회 세척한 후, 염소-항-마우스 IgG HRP(SouthernBiotech) 100㎕를 첨가하였다(0.1% tween-80을 함유한 PBS로 1:4000으로 희석). 1시간 동안 배양한 후, 플레이트를 이전과 같이 세척하고 100㎕의 TMB를 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 10분 동안 배양한 후, 2M H2SO4 100㎕로 착색을 멈췄다. 이어서, SynergyMx 플레이트 리더(Biotek) 상에서 OD450을 측정하였다.
2. 결과
2.1 fHbp-OspA 융합-유전자의 제작
리피드화된 N-말단 시스테인에 인접한 대부분의 특성화된 리포단백질은 2차 구조의 형성에 대한 성향이 낮은 아미노산 스트레치를 함유하고 있다. 이 소위 '테더(tether)'는 리피드 '앵커(anchor)'(리피드화된 시스테인)와 단백질의 구조적으로 제한된 부분 사이의 유연한 링커로서 작용하는 것으로 생각된다(55). 테더는 또한 외막보다 리포단백질의 수송에 한 역할을 한다. 왜냐하면, 이 영역에서의 결실은 외막의 표면에 표면 노출된 리포단백질의 불국소화(mislocalization)를 초래할 수 있기 때문이다.
본 발명자들은 나이세리아(Neisseria)에서 발현된 OspA의 표면 노출에 대한 증거를 발견하지 못했기 때문에, 본 발명자들은 박테리아 숙주의 전환이 단백질의 외막의 내부로의 불국소화를 일으키는 것으로 가정하였다. 그 다음, 본 발명자들은 표면-노출된 나이세리아의 리포단백질인 fHbp의 일부를 첨가하여 이 불국소화를 수정할 수 있는지 여부를 테스트하기 시작하였다. 나이세리아의 외막을 통한 수송에 대한 분류 규칙은 아직 밝혀지지 않았기 때문에, 본 발명자들은 OspA의 글로블러(globular) 도메인과 함께 fHbp의 다양한 부분을 결합시킨 하이브리드 유전자를 디자인하였다.
fHbp와 OspA 및 오버랩 익스텐션(Overlap extension) PCR에 의한 이들 두 유전자로부터 생성된 융합 유전자의 개요도가 도 1에 주어진다. 두 리포단백질의 구조에 관한 정보는 공개된 결정 구조(48, 56)로부터 얻어졌다. fHbp와 OspA는 모두 신호 펩티드(내막을 통해 수송된 후 절단됨)와 테더 영역을 포함한다. fHbp의 글로블러 도메인은 15 아미노산 링커로 분리된 N-말단 및 C-말단 도메인으로 구성된다.
N. 메닝지티디스(N. meningitidis) 스트레인 44/76의 게놈 DNA를 fHbp의 일부의 증폭을 포함하는 모든 PCR 반응에서 주형으로 사용하였다. fHbp-F 프라이머는 fHbp 프로모터(57)의 상류에서 어닐링하므로, 모든 융합-유전자는 fHbp 프로모터를 함유한다. OspA는 프라이머 OspA-F 및 OspA-R(표 1)을 사용하여 B. 부르그도르페리(B. burgdorferi) 스트레인 B31의 게놈 DNA로부터 증폭되었고(표 1), IPTG-유도성 tac-lacUV5 프로모터(54)를 함유하는 pEN11 플라스미드로부터 E. 콜라이(E. coli) TOP10F'에서 성공적으로 발현되었다.
fA2b, fA3b 및 fA4b 구조물에 도입된 6가지 아미노산 링커 펩타이드는 OspA와 칼모듈린을 성공적으로 연결시키는데 이전에 사용되었다(58).
본 발명자들은 fHbp와 OspA 사이에 8개의 여러 가지 융합 구조물을 생성하였다. 여기에서 본 발명자들은 이러한 구조를 'fA'라고 지칭한다. 융합 유전자 제작에 사용된 프라이머는 도 1의 도식 유전자(프라이머 번호는 표 1 참조)의 위(포워드 프라이머) 또는 아래(리버스 프라이머)에 표시된다. 모든 융합 유전자는 2 단계 PCR 프로토콜인 오버렙 익스텐션 PCR에 의해 생성되었다(53). 요약하면, 융합될 유전자 부분은 먼저 부분적으로 중첩되는 프라이머들을 사용하여 개별적으로 증폭된 후, 융합 유전자를 생성하는 두 번째 반응에서 두 부분(서로 어닐링할 수 있는)을 주형으로 사용했다. 예를 들어, 구조물 fA1을 위한 첫 번째 단계 PCR은 프라이머 쌍 1-10(N. meningitidis 게놈의 fHbp 프로모터, 신호 펩티드 및 테더를 증폭하기 위해) 및 4-9(B. burgdorferi 게놈의 OspA의 글로블러 도메인을 증폭하기 위해)를 사용하였다. 이어서, 생성된 PCR 산물을 혼합하고 두 번째 PCR 반응에서 주형으로 사용하였다. 이 두 번째 반응에서 두 PCR 산물은 서로 어닐링하며 동시에 프라이머 쌍 1-4에 대한 주형으로 작용하여 전장 PCR 산물 fA1을 생성한다. 다른 모든 융합 유전자는 동일한 방법을 사용하여 생성되었다. 구조물 fA1은 fA3b 및 fA5c의 제작을 위한 주형으로 제공되었음에 유의바람.
fA1에서, fHbp의 신호 펩타이드 및 테더는 OspA의 글로블러 도메인에 융합되었다. 구조물 fA2b 및 fA3b에서, fHbp의 C-말단 도메인(fA2b) 또는 N-말단 도메인(fA3b)은 OspA의 글로블러 도메인으로 대체되고, 인공 링커(PGGSGA)를 통해 연결되었다. 구조물 fA4b 및 fA4c에서, 컴플리트 fHbp 유전자는 인공 링커(fA4b) 또는 OspA 테더(fA4c)를 사용하여 OspA의 글로블러 도메인에 연결되었다. 구조물 fA5c는 fHbp 테더를 통해 fHbp의 글로블러 도메인에 연결된 fA1이다. 구조물 fA6은 fA1과 유사하지만 신호 펩타이드와 테더에 추가로 fHbp의 N-말단 도메인의 첫 번째 알파-헬릭스 및 후속 루프를 함유한다. 구조물 fA7은 fA6과 유사하지만 fHbp의 N-말단 도메인의 처음 네 개의 베타-시트를 추가로 함유한다. 모든 구조물은 나이세리아(Neisseria)에서 형질전환하기 전에 E. 콜라이(E. coli) TOP10F'에서 pEN11로부터 성공적으로 발현되었다(데이터는 나타내지 않음).
2.2 TbpB-OspA 융합 유전자의 제작
N. 메닝지티디스(N. meningitidis) H44/76의 TbpB는 신호 펩타이드(잔기 1-20), 38 아미노산 가요성 링커 또는 '테더'(잔기 21-58), 및 큰 글로블러 도메인(잔기 59-691)을 함유한다. OspA에 대한 TbpB의 N-말단 부분의 융합이 N. 메닝지티디스(N. meningitidis)에서 OspA의 표면 발현을 구제할 수 있는지 여부를 시험하기 위하여, 4개의 TbpB-OspA 융합 구조물을 디자인하였다. TbpB는 철-조절 프로모터를 가지고 있기 때문에, 먼저 프라이머 1, 25-27(표 1 참조)을 사용하여 오버랩 익스텐션 PCR을 사용하여 TbpB 프로모터를 구성적 fHbp 프로모터와 교환하였다. 그 결과 얻어진 구조물('fHbp 프로모터를 갖는 TbpB', 도 5 참조)은 그 다음, TbpB와 OspA 사이의 융합 PCRs에 대한 주형으로 사용하였다.
구조물 fTA1-4의 개요는 도 5에서 찾을 수 있으며, 오버랩-익스텐션 PCRs에 대한 프라이머는 표 1에서 찾을 수 있다. 나이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis) H44/76으로부터의 게놈 DNA는 TbpB 및 보렐리아 버그도르페리(Borrelia burgdorferi) 스트레인 B31의 게놈 DNA의 일부의 증폭을 위한 주형으로 사용되었다.
구조물 fTA1은 OspA의 잔기 17-273(테더 및 글로블러 도메인)에 융합된 TbpB의 잔기 1-20(신호 펩타이드)을 함유하였다. 구조물 fTA2는 OspA의 잔기 29-273(글로블러 도메인)에 융합된 TbpB의 잔기 1-58(신호 펩타이드 및 테더)를 함유하였다. 구조물 fTA3은 OspA의 잔기 29-273(글로블러 도메인)에 융합된 TbpB의 잔기 1-75(신호 펩타이드, 테더 및 글로블러 도메인의 처음 17개의 N-말단 아미노산)를 함유하였다. 구조물 fTA4는 OspA의 잔기 29-273(글로블러 도메인)에 융합된 TbpB의 잔기 1-99(신호 펩타이드, 테더 및 글로블러 도메인의 처음 41개의 N-말단 아미노산)를 함유하였다. fTA3 및 fTA4에 대한 TbpB 융합점은 TbpB 결정 구조(63)에 기초하여 2차 구조 요소들 사이의 루프에서 선택하였다.
혈청형 1(B. burgdorferi B31) 이외의 OspA 혈청형이 fHbp 또는 TbpB의 N-말단 부분을 이용하여 수막구균(meningococcal) 세포 표면으로 운반될 수 있는지를 시험하기 위해, fA6 및 fTA2와 유사한 융합 구조물을 만들었으며, 유일한 차이점은 이들이 보렐리아 아프젤리(Borrelia afzelii) PKo(잔기 29-273)의 OspA 혈청형 2의 글로블러 도메인을 함유한 것이었다. 모든 구조물은 오버랩 익스텐션 PCR에 의해 만들어졌으며 자세한 내용은 도 7과 표 1을 참조바람.
2.3 fHbp-OspC 융합 유전자의 제작
OspC는 표면-노출된 보렐리아 리포단백질이다. 일반적으로 OspA 이후에 가장 관심있는 백신으로 여겨진다(64). 그러나, 그 신호 서열을 포함하는 전장 OspC의 발현은 E. 콜라이(E. coli)에서 어려운 것으로 입증되었으며(65), 아마도 이의 집합 성향(tendency to aggregate)에 기인하는 것으로 여겨지며; 보렐리아(Borrelia) 외막에서, 이는 큰 멀티머릭 복합체의 형태로 존재한다. E. 콜라이(E. coli)와 N. 메닝지티디스(N. meningitidis)에서 전장 OspC의 발현은 이전에 본 발명자들의 수중에 유사한 문제를 일으켰으며, 결과적으로 웨스턴 블롯에서의 발현이 낮았다(데이터는 나타내지 않음).
보렐리아(Borrelia)에서 OspC는 세포-표면에 호모-다이머를 형성하는데, 주로 N-말단 α1-헬릭스 사이의 상호 작용에 의해 형성된다(66, 67). 대부분의 뮤린과 사람의 OspC 에피토프가 단백질의 C-말단쪽에 위치하기 때문에(68, 69), 상술한 바와 같은 (fA6에서 사용된 바와 같은) fHbp의 N-말단 부분과 OspC의 C-말단 잔기 136-210(도 8 참조)을 결합한 융합 구조물 fC9(도 8)가 생성되었다. 이를 위해, N. 메닝지티디스(N. meningitidis) 스트레인 H44/76의 게놈 DNA를 fHbp의 증폭을 위한 주형으로 사용하고, 부르그도르페리(burgdorferi) 스트레인 B31의 게놈 DNA를 OspC의 증폭을 위해 사용하였다.
2.4 fHbp-RmpM 및 TbpB-RmpM 융합 유전자의 제작
RmpM은 펩티도글리칸층과 비공유 결합하는 것으로 여겨지는 N. 메닝지티디스(N. meningitidis)의 외막 단백질이다(70). 이것은 신호 펩타이드, 가요성 N-말단 도메인(필수적인 외막 단백질에 바인딩함) 및 OmpA-유사 C-말단 도메인(펩티도글리칸과 결합하는 것으로 여겨짐)으로 구성된다. RmpM은 일반적으로 주로 주변세포질인 것으로 간주되기 때문에, N. 메닝지티디스(N. meningitidis)의 세포 표면에서 RmpM을 발현시키려는 시도가 있었다. 신호 펩타이드와 구조화되지 않은 N-말단 도메인으로 구성된 처음 89개의 잔기를 제거하기로 결정했다. 나머지 C-말단 도메인(잔기 90-242)은 OspA의 성공적인 표면 국소화를 위해 이전에 사용되었던 fHbp(잔기 1-50) 및 TbpB(잔기 1-58)의 N-말단 부분에 융합되었다. N. 메닝지티디스(N. meningitidis) 스트레인 H44/76의 게놈 DNA를 fHbp, TbpB 및 RmpM의 증폭을위한 주형으로 사용하였다. 구조물의 이름은 fR1과 fTR1이었다(도 9 참조).
2.5 OspA 및 fHbp-OspA 융합체는 N. 메닝지티디스( N. meningitidis ) 세포 및 nOMVs에서 발현된다.
N. 메닝지티디스(N. meningitidis)에서의 여러 가지 구조물들의 발현을 도 2a에 나타내었고, 이들 세포로부터 수거한 nOMVs에서의 발현을 도 2b에 나타내었다. N. 메닝지티디스(N. meningitidis) 세포에서의 발현 수준은 여러 가지 구조물들간에 분명히 다양하며, nOMVs에서 유사한 변이가 관찰되며, 구조물 fA4b, fA4c, fA6 및 fA7에 대한 높은 발현 수준이 관찰된다. 여러 가지 구조물들이 분명히 저하되는 경향이 있다. 일부 구조물(fA3b, fA5c)의 경우, 분해는 세포에 비해 nOMVs에서 증폭된 것으로 보인다.
2.6 적어도 4개의 fHbp-OspA 하이브리들이 표면 노출된다.
본 발명자들은 OspA와 8개의 fHbp-OspA 융합체가 면역염색법을 사용하여 N. 메닝지티디스(N. meningitidis)에서 표면-국소화되었는지 여부를 시험하였다. 간략히, 다양한 구조물들을 갖는 플라스미드 pEN11을 함유하는 세포를 항-OspA 및 항-fHbp(양성 컨트롤)의 혼합물과 함께 배양한 다음, 형광 2차 항체(OspA는 녹색, fHbp는 적색)와 함께 배양하였다. 구조물 fA4b, fA4c, fA6 및 fA7을 함유하는 세포들은 투명한 녹색 형광을 나타내었으며, 이는 이러한 구조물들의 표면 노출을 나타내었다(데이터는 나타내지 않음). OspA 또는 다른 구조물에 대한 녹색 형광은 관찰되지 않았으며(데이터는 나타내지 않음), 이는 표면 노출이 없음을 나타내지만, 본 발명자들은 더 낮은 발현 수준으로 인한 가능성을 배제할 수 없다(도 2a 참조).
2.7 발현 및 표면-노출 TbpB-OspA 하이브리드
E. 콜라이(E. coli)와 N. 메닝지티디스(N. meningitidis)에서 네 가지 모든 구조물들의 성공적인 발현은 OspA에 대한 폴리클로날 항혈청을 사용하여 웨스턴 블롯으로 확인되었다(Rockland Immunochemicals - 나이세리아 웨스턴 블롯을 위한 도6 참조). 면역염색(전술한 바와 같음)은 fTA1 구조물에 대한 신호를 나타내지 않았지만, 구조물 fTA2, fTA3 및 fTA4에 대한 강한 신호를 나타내었다(데이터는 나타내지 않음). 이것은 TbpB의 N-말단 부분이 OspA의 표면 국소화에 사용될 수 있고, 적어도 신호 펩타이드와 테더가 이를 위해 필요하다는 것을 입증한다.
2.8 대체 C-단백질 융합 파트너의 발현 및 표면-노출
2.8.1 대체 OspA 혈청형의 발현 및 표면 노출
E. 콜라이(E. coli)와 N. 메닝지티디스(N. meningitidis)에서 두 구조물의 성공적인 발현은 OspA에 대한 폴리클로날 항혈청을 사용하여 웨스턴 블롯으로 확인되었다(Rockland Immunochemicals - 나이세리아 웨스턴 블롯을 위한 도 7 참조). OspA 폴리클로날을 이용한 면역염색(Rockland Immunochemicals)은 어려운 것으로 입증되었으며, 아마도 (B. 버그도르페리(B. burgdorferi)로부터 혈청형 1 OspA에 대해 증가한) 항혈청이 B. 아페질리(B. afzelii) OspA에 상당히 보다 약한 바인딩을 보였기 때문일 가능성이 매우 높다. 따라서, OspA 모노클로날 항체(Santa Cruz Biotechnology)를 면역염색에 사용하였다. 구조물 fA10 및 fTA5를 발현하는 N. 메닝지티디스(N. meningitidis) 세포는 이 모노클로날을 면역염색에 사용하였을 때 강한 신호를 나타내었고(데이터는 나타내지 않음), 이는 혈청형 2 OspA가 실제로 세포 표면에서 성공적으로 발현되었음을 나타낸다.
2.8.2 OspC의 발현 및 표면 노출
N. 메닝지티디스(N. meningitidis)에서 저조한 발현에도 불구하고(도 8), fc9 구조물을 운반하는 세포는 놀랍게도 면역염색으로 신호를 나타내었다(데이터는 나타내지 않음). 이것은 fHbp의 N-말단 부분(fA6에서 앞서 기술한 바와 같음)이 OspC의 적어도 C-말단 부분의 표면 국소화에 사용될 수 있음을 나타낸다.
2.8.3 비-보렐리아의 비-리포단백질 RmpM의 발현 및 표면 노출
두 구조물(fR1 및 fTR1으로 명명됨, 도 11 참조)은 E. 콜라이(E. coli)와 N. 메닝지티디스(N. meningitidis)에서 성공적으로 발현되었다.
면역염색은 두 구조물 모두에서 밝은(bright) 신호를 나타내지만, 음성 컨트롤(구조물이 없는 N. 메닝지티디스(N. meningitidis) 세포) 또한 밝은 형광을 나타내었다. 이는 MN2D6D 모노클로날 항체의 나이세리아(Neisseria) 세포에 대한 하나의 특이적 바인딩, 또는 RmpM(의 일부)의 예기치 않은 표면 국소화를 나타내었다. 따라서, 플라스미드 pCF13을 사용하여 RmpM 녹아웃을 만들었다(71). 구조물 fR1 및 fTR1을 운반하는 플라스미드는 이전과 같이 이 ΔRmpM 스트레인에서 형질전환되고, 두 구조물의 성공적인 발현은 웨스턴 블롯에 의해 측정되었다(도 12 참조).
N. 메닝지티디스(N. meningitidis) 세포와 RmpM 녹아웃의 면역염색은 높은 항체 농도에서 RmpM 항체의 하나의 특이적 바인딩이 있음을 보여주었으며(1:300 희석에서 녹아웃의 강한 염색 및 1:2000 희석에서 녹아웃의 약한 염색, 데이터는 나타내지 않음), 한편 낮은 항체 농도(1:10,000)에서 녹아웃의 염색은 완전히 사라졌다(데이터는 나타내지 않음). 그러나, 일부 정상 나이세리아(Neisseria) 세포는 여전히 낮은 농도에서 염색을 나타내었으며(데이터는 나타내지 않음), 이는 세포 RmpM의 일부에 대해 적어도 (부분적으로) 표면 노출되어 있을 수 있음을 나타낸다.
RmpM 녹아웃 백그라운드에 놓았을 때, fR1과 fTR1 모두 최저 항체 농도(1:10,000)에서 형광 신호를 나타내었으나, 염색은 이 농도에서 구조물이 없는 RmpM 녹아웃에는 완전히 없었다(데이터는 나타내지 않음). 이것은 이전에 OspA의 표면 국소화에 사용되었던 fHbp 및 TbpB의 N-말단 부분이 또한 나이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis)의 다른 (주로) 주변세포질 비-리포단백질의 표면 국소화에 사용될 수 있음을 나타낸다.
2.9 OspA 및 fHbp-OspA 하이브리드를 운반하는 nOMVs의 면역원성
다음으로, 본 발명자들은 웨스턴 블롯을 이용하여 이종 (융합) 단백질을 운반하는 nOMVs로 면역화된 마우스의 혈청을 조사했다. 모두 21개 그룹의 풀링된 혈청이 pEN11-OspA 또는 pEN11-Imp 중 하나를 가진 E. 콜라이(E. coli)의 총 단백질 함량이 적재된 멤브레인에서 블로팅되었다(이들 그룹의 일부에 대해 도 3a 참조). 저용량 및 고용량의 구조물 fA4b, fA4c, fA6 및 fA7를 운반하는 nOMVs로 면역화된 그룹의 풀링된 혈청은 모두 OspA (~ 28 kDa)의 분자량을 갖는 강한 밴드를 나타내었으며, 이는 강한 항체 반응을 나타낸다. 또한, 20μg/ml 투여량의 OspA-운반 nOMVS로 면역화된 그룹의 풀링된 혈청은 ~ 28 kDa에서 매우 약한 밴드를 보였다(데이터는 나타내지 않음). 다른 모든 그룹은 감지할 수 있는 반응을 나타내지 않았다.
모든 개별 마우스가 OspA-특이 항체를 일으켰는지 확인하기 위해, 본 발명자들은 두 개의 고 반응성 그룹(20μg/ml fA4b 및 20μg/ml fA6)의 모든 10 마리의 개별 마우스의 혈청을 블로팅하였다. 모든 경우에, ~ 28 kDa 밴드가 검출되었다(20μg/ml fA6로 면역화된 5 마리의 마우스에 대하여 도 3b 참조, fA4b에 대한 데이터는 나타내지 않음). 이것은 풀링된 혈청에서 관찰된 신호가 그룹 내 단일 과반응자(hyper-responder)에 기인한 것이 아니었음을 보여준다. 고 투여량의 fA6 그룹(도 3a)의 풀링된 혈청에서 ~ 36kDa 백그라운드 신호가 단일 개체에 의해 명백하게 유발된다는 것을 유의해야한다(도 4b의 마우스 #4).
면역 반응을 정량화하기 위해, 구조물 fA4b, fA4c, fA6 또는 fA7을 운반하는 20㎍/ml nOMVs로 면역화된 모든 개별 마우스의 혈청을 정제된 OspA 단백질에 대한 결합 능력에 대해 시험하였다. 구조물 fA4b 및 fA6에 대한 결과는 도 4에 나타내었다. fA4b에 대해 검출된 신호는 fA6 및 fA7에서 관찰된 것보다 약 1.5 배 높았고 fA4c에서 관찰된 것보다 ~ 2.5 배 높았다(데이터는 나타내지 않음).
3. 디스커션
OMVs는 많은 박테리아성 질병에 대한 견고하고 공학적인 백신 플랫폼으로서 주목을 받고 있다. 백신 잠재력을 인정 받아, OMVs에서의 이종 발현에 대한 관심이 높아지고 있다. OMVs에서의 이종 발현과 관련하여 해결되지 않은 문제 중 하나는 이종 항원(루멘, OM의 내부, OM의 외부)이 그것이 나타내는 면역 반응에 영향을 미치는지 여부이다. 전세포(whole cells)의 경우, 이종성 항원은 세포 표면에 위치한 경우 이보다 아래에 잔류하는 경우보다 더 많은 면역원성을 띠는 것으로 나타났으며(59, 60), 이는 OMVs에서도 마찬가지일 수 있다고 제안되었다(21). 이것은 특별히 관심있는 OMV 표면에 이종성 단백질을 디스플레이하도록 한다.
여기서, 본 발명자들은 OMVs에 이종성 항원의 표면 디스플레이에 대한 새로운 접근 방식을 보여준다. 표면-노출된 리포단백질이 OMV에 부착된 채로 남아있게하는 디터전트-프리 OMV 추출 방법이 나이세리아(Neisseria)를 위해 최근 개발되었다. 이 새로운 추출 프로토콜은 이종성 리포단백질로 나이세리아(Neisseria) OMVs의 표면을 데코레이트할 가능성을 열어준다. 따라서, 본 발명자들은 N. 메닝지티디스(N. meningitidis)에서 보렐리아의 표면 리포단백질인 OspA를 발현시켰다. OspA가 나이세리아(Neisseria) 세포와 OMV에서 검출될 수 있었지만, 본 발명자들은 이의 표면 노출에 대한 증거는 발견하지 못하였다. 그 다음, 본 발명자들은 OspA와 수막구균 표면 리포단백질인 fHbp 간의 융합체를 만들었다. OspA에 연결된 fHbp의 N-말단 부분으로 구성된 이들 구조물 중 몇몇은 면역염색을 사용하여 세포 표면에서 검출될 수 있었다. 또한, 본 발명자들은 리포단백질 매개 표면 발현이 TbpB와 같은 다른 리포단백질의 N-말단 부분에 의해 매개될 수 있었기 때문에, 기술이 보다 광범위하게 적용가능함을 입증하였다. 또한, 본 발명자들은 RmpM과 같은 비-보렐리아성 비-리포단백질을 포함하는 다양한 항원 단백질이 리포단백질의 N-말단 부분에 융합함으로써 표면 발현될 수 있었음을 입증하였다. 따라서, 본 발명자들은 상기 기술이 특정 항원의 표면 발현을 매개하는 데 광범위하게 적용가능함을 보여주었다. 항원은 감염성 질병 및/또는 종양과 관련될 수 있다. 본 발명의 융합 단백질은 예를 들어, OMVs 상의 이러한 항원들의 표면 발현을 일으키며, 이는 면역 반응을 유발하여 항원과 관련된 감염성 질병이나 종양을 예방하거나 치료한다.
이와 관련하여, 이러한 구조물들을 운반하는 OMVs는 면역화된 마우스에서 강한 면역 반응을 이끌어내는 반면, 표면 노출의 증거를 보이지 않은 구조물들을 운반하는 OMVs는 그러하지 않았다.
3.1 외막 전위
OM을 통한 리포단백질의 전위를 지배하는 요인에 대한 지식은 빈약하고 불완전하다. 보렐리아(Borrelia)에서, 여러 표면 리포단백질(OspA, OspC 및 Vsp)의 리포단백질 테더(N-말단 시스테인에 인접한 구조화되지 않은 영역)는 OM 전위에 대한 필수 정보를 포함하는 것으로 보인다. 왜냐하면, 이 영역에서 아미노산의 결실 또는 돌연변이가 표면 국소화를 일으킬 수 있기 때문이다. 또한, 신호 펩타이드와 이들 3개의 리포단백질의 적색 형광 단백질 테더에 대한 융합은 보렐리아(Borrelia)에서 이러한 다른 주변세포질 리포터-단백질의 표면 국소화를 일으킨다(47, 51, 55).
나이세리아(Neisseria)는 몇몇 표면 리포단백질만을 가지고 있으며, OM에 대한 이들의 전위에 영향을 미치는 요인은 무엇인지 알려져 있지 않다. 본 발명자들의 데이터에 따르면 적어도 fHbp의 경우 이러한 요소는 보렐리아(Borrelia)에서 발견된 것과 다르다.
본 발명자들의 손으로, N. 메닝지티디스(N. meningitidis)에서의 OspA의 발현은 외막의 주변세포질 또는 주변세포질의 측면에서의 불국소화를 초래한다. 이것은 대체 숙주에서 리포단백질의 발현이 불굴소화를 유도할 수 있다는 이전 발견과 일치하며, 이는 아마도 숙주 요인이 국소화 규칙을 정의하기 때문일 것이다(51). 본 발명자들은 fHbp 또는 TbpB와 같은 나이세리아(Neisseria)의 자가 표면 노출된 리포단백질과의 하이브리드화가 이러한 불국소화를 구제할 수 있었으며, 따라서 OspA와 fHbp 또는 TbpB의 다른 부분 사이에 융합체를 만들수 있었다고 판단하였다. OspA 신호 펩타이드와 테더를 fHbp(구조물 fA1)로 대체한 결과, OspA 표면 국소화가 회복되지 않았다. 그러나, 이 융합 유전자의 fHbp 부분이 (첫 번째 알파-헬릭스 및 후속 루프로 구성되는) fHbp의 글로블러 도메인의 처음 17개 N-말단 아미노산으로 확장된 경우에, 생성된 구조물(fA6)은 세포 표면에서 검출될 수 있었다. 이것은 정렬(sorting) 규칙이 나이세리아(Neisseria)와 보렐리아(Borrelia) 사이에서 다를 수 있음을 의미한다. 왜냐하면, 전자의 경우 외막 전위에 영향을 미치는 영역이 테더 영역을 넘어서 확장된 것처럼 보이기 때문이다.
fA6의 것보다 더 긴 fHbp의 N-말단 부분에 대한 OspA의 융합으로 구성된 거의 모든 구조물들은 세포 표면(fA4b, fA4c, fA7)에서 검출되었다. 유일한 예외는 인공 링커를 통해 OspA에 결합된 fHbp의 아미노산 1-152 개(소위 N-말단 도메인)를 함유하는 구조물 fA2b이다. 그러나, 세포에서 fA2b의 발현 수준이 극도로 낮기 때문에(도 2a 참조), 면역염색 후 신호가 부족한지 여부가 표면 국소화 또는 발현 불량으로 인한 것인지를 구분할 수 없다는 점을 강조하는 것이 중요하다. 이 국소화-발현 문제에 대해서는 아래에서 더 논의한다. OspA가 fHbp(fA3b, fA5c)의 N-말단과 C-말단 부분 사이에 위치하는 구조물은 세포 표면에서 검출되지 않았다.
3.2 면역원성에 대한 항원 위치의 영향
본 발명자들은 나이세리아(Neisseria) 세포에서 구조물 fA4b, fA4c, fA6 및 fA7의 표면 노출에 대한 증거를 발견하였다. 이와 일치하게도, 면역화된 마우스에서 강한 항체 반응을 이끌어낼 수 있는 것은 이러한 구조물들을 운반하는 OMVs뿐이었다. 이것은 OMV의 표면에 위치한 항원만이 항체 반응을 유도할 수 있음을 시사한다. 그러나, 4개의 '표면' 구조물의 발현 수준이 세포와 nOMVs 모두에서 다른 구조물의 발현 수준보다 분명히 높다는 것을 인식하는 것이 중요하다(도 2 참조). 따라서, 면역염색 후 특정 구조물을 검출하지 못하는 것은 표면 국소화보다는 낮은 발현 수준에 기인한 것이라 할 수 있다. 예를 들어, fA1 및 fA2b와 같은 세포에서 매우 낮은 발현 수준을 갖는 구조물에 대해 이러한 시나리오를 배제하는 것이 불가능하다. 그러나, OspA, fA3b, 또는 fA5c를 발현하는 세포는 상당히 더 높은 발현 수준을 가지며, 표면 노출된 경우에 면역염색 후 관찰하지 않을 것으로 보인다.
OMVs를 운반하는 고 투여량 OspA와 저 투여량 fA6으로 면역화된 마우스 그룹의 웨스턴 블롯을 비교하면(도 2a, 왼쪽에서 블롯 4 및 5), 명백한 면역원성의 차이는 본 발명자들이 OMVs에서 이러한 구조물들의 관찰된 발현 수준에 기초하여 기대한 것보다 훨씬 더 높다(도 2b). 이는 OMV에서 이종성 항원의 표면 디스플레이가 실제로 향상된 면역원성을 이끌 수 있음을 나타낸다.
3.3 백신 잠재력
현재 개발중인 보렐리아(Borrelia) 백신은 다양한 재조합 리피드화 OspA 혈청형에 기초한 서브 유닛 백신이다(38, 39). 그러나, 서브 유닛 백신은 저조한 면역원성에 시달리고, 애주번트의 사용을 필요로 한다. 나이세리아의 nOMVs의 표면 상에 OspA의 제시는 nOMV의 내재적인 애주번트 활성과 이의 네이티브 형태의 항원 제시때문에 더 우수한 면역원성을 일으킬 수 있다.
본 발명자들의 OMV 표면 디스플레이 방법은 특히, 리포단백질과의 융합을 통한 비-리포단백질의 리피드화가 면역원성을 향상시킬 수 있다는 것으로 보여주었기 때문에(62), 또한 비-리포단백질을 포함하는 병원체로부터 다른 항원성 단백질에 일반적으로 적용가능하다. 또한, 다가 이종성 OMVs의 생산을 촉진하기 위해 다중의 이종성 항원들의 발현과 OMV 표면 디스플레이표현를 결합하는 것이 가능하다.
참고문헌
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Figure 112017129373883-pct00013
SEQUENCE LISTING <110> De Staat der Nederlanden, vert. door de minister van VWS, Ministerie van Volksgezondheid, Welzijn en Sport <120> Surface display of antigens on Gram-negative outer membrane vesicles <130> P6055577PCT <150> EP15170307.1 <151> 2015-06-02 <160> 60 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 274 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 1 Met Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser Leu Thr Thr Ala Leu Ile 1 5 10 15 Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly 20 25 30 Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys 35 40 45 Gly Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys 50 55 60 Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp 65 70 75 80 Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp 85 90 95 Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser 100 105 110 Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe 115 120 125 Gln Thr Glu Gln Ile Gln Asp Ser Glu His Ser 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His Thr Arg Leu Val Ala Gly Leu Gly Ala Asp Val Glu Phe Gly 1040 1045 1050 Asn Gly Trp Asn Gly Leu Ala Arg Tyr Ser Tyr Ala Gly Ser Lys 1055 1060 1065 Gln Tyr Gly Asn His Ser Gly Arg Val Gly Val Gly Tyr Arg Phe 1070 1075 1080 <210> 9 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fHbp-F primer <400> 9 catatgcgcc gttcggacga catttgattt ttgc 34 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fHbp-R primer <400> 10 gacgtcacgg taaattatcg tgttcg 26 <210> 11 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OspA-F primer <400> 11 catatgaagg agaatatatt atgaaaaaat atttattgg 39 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OspA-R primer <400> 12 gacgtctaaa gctaacgcta aagcaaatcc 30 <210> 13 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> M13-F primer <400> 13 gtaaaacgac ggccag 16 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> M13-R primer <400> 14 caggaaacag ctatgac 17 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pEN11-F primer <400> 15 aaaccgcatt ccgcaccaca ag 22 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pEN11-R primer <400> 16 gggcgacacg gaaatgttga atac 24 <210> 17 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fA1-F primer <400> 17 gtgtcgccgc cgacatcggt gcgagcgttt cagtagattt gc 42 <210> 18 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fA1-R primer <400> 18 gcaaatctac tgaaacgctc gcaccgatgt cggcggcgac ac 42 <210> 19 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fA2b-F primer <400> 19 ggcgacccgg gtggctcagg tgctagcgtt tcagtagatt tgc 43 <210> 20 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fA2b-R primer <400> 20 aaacgctagc acctgagcca cccgggtcgc cgattctgaa ctg 43 <210> 21 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fA3b-F primer <400> 21 ttaaaaccgg gtggctcagg tgctagggcg acatatcgcg ggacg 45 <210> 22 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fA3b-R primer <400> 22 cgccctagca cctgagccac ccggttttaa agcgttttta atttc 45 <210> 23 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fA4b-F primer <400> 23 aagcaaccgg gtggctcagg tgctagcgtt tcagtagatt tgc 43 <210> 24 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fA4b-R primer <400> 24 aaacgctagc acctgagcca cccggttgct tggcggcaag 40 <210> 25 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fA4c-F primer <400> 25 ccttgccgcc aagcaatgta agcaaaatgt tagc 34 <210> 26 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fA4c-R primer <400> 26 gctaacattt tgcttacatt gcttggcggc aagg 34 <210> 27 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fA5c-F primer <400> 27 gaaattaaaa acgctttaaa atgcagcagc ggagggggtg gtg 43 <210> 28 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fA5c-R primer <400> 28 caccaccccc tccgctgctg cattttaaag cgtttttaat ttc 43 <210> 29 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fA6-F primer <400> 29 ccataaagac aaaggtttga gcgtttcagt agatttgc 38 <210> 30 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fA6-R primer <400> 30 gcaaatctac tgaaacgctc aaacctttgt ctttatgg 38 <210> 31 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fA7-F primer <400> 31 caatacgggc aaattgaaga gcgtttcagt agatttgc 38 <210> 32 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fA7-R primer <400> 32 gcaaatctac tgaaacgctc ttcaatttgc ccgtattg 38 <210> 33 <211> 46 <212> DNA <213> artificial <220> <223> pfHbpTbpB-F primer <400> 33 cgtatgacta ggagtaaacc tatgaacaat ccattggtga atcagg 46 <210> 34 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> pfHbpTbpB-R primer <400> 34 ccaatggatt gttcataggt ttactcctag tcatacg 37 <210> 35 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> TbpB-R primer <400> 35 gacgtccgtc tgaagcctta ttctcg 26 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> artificial <220> <223> OspA afz-R long primer <400> 36 gacgtctact ttttggctca gtacc 25 <210> 37 <211> 31 <212> DNA <213> artificial <220> <223> OspC-F primer <400> 37 catatgaata aaaaggaggc acaaattaat g 31 <210> 38 <211> 33 <212> DNA <213> artificial <220> <223> OspC-R primer <400> 38 gacgtcttaa ttaaggtttt tttggacttt ctg 33 <210> 39 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220> <223> RmpM-R primer <400> 39 gacgtcgcat cggcaagata ttgc 24 <210> 40 <211> 38 <212> DNA <213> artificial <220> <223> fA10-F primer <400> 40 ccataaagac aaaggtttga gcgcttcagt agatttgc 38 <210> 41 <211> 38 <212> DNA <213> artificial <220> <223> fA10-R primer <400> 41 gcaaatctac tgaagcgctc aaacctttgt ctttatgg 38 <210> 42 <211> 46 <212> DNA <213> artificial <220> <223> fTA1-F primer <400> 42 cctgtgtttt tgttgagtgc ttgtaagcaa aatgttagca gccttg 46 <210> 43 <211> 46 <212> DNA <213> artificial <220> <223> fTA1-R primer <400> 43 caaggctgct aacattttgc ttacaagcac tcaacaaaaa cacagg 46 <210> 44 <211> 38 <212> DNA <213> artificial <220> <223> fTA2-F primer <400> 44 gcaagcccaa aaagaccaaa gcgtttcagt agatttgc 38 <210> 45 <211> 38 <212> DNA <213> artificial <220> <223> fTA2-R primer <400> 45 gcaaatctac tgaaacgctt tggtcttttt gggcttgc 38 <210> 46 <211> 44 <212> DNA <213> artificial <220> <223> fTA3-F primer <400> 46 caagcggcgg aattggtatc agaggagcgt ttcagtagat ttgc 44 <210> 47 <211> 44 <212> DNA <213> artificial <220> <223> fTA3-R primer <400> 47 gcaaatctac tgaaacgctc ctctgatacc aattccgccg cttg 44 <210> 48 <211> 44 <212> DNA <213> artificial <220> <223> fTA4-F primer <400> 48 ggatgatggt gatatcaaaa gcgtttcagt agatttgcct ggtg 44 <210> 49 <211> 44 <212> DNA <213> artificial <220> <223> fTA4-R primer <400> 49 caccaggcaa atctactgaa acgcttttga tatcaccatc atcc 44 <210> 50 <211> 38 <212> DNA <213> artificial <220> <223> fTA5-F primer <400> 50 gcaagcccaa aaagaccaaa gcgcttcagt agatttgc 38 <210> 51 <211> 38 <212> DNA <213> artificial <220> <223> fTA5-R primer <400> 51 gcaaatctac tgaagcgctt tggtcttttt gggcttgc 38 <210> 52 <211> 46 <212> DNA <213> artificial <220> <223> fC9-F primer <400> 52 gaccataaag acaaaggttt gaataaatta aaagaaaaac acacag 46 <210> 53 <211> 46 <212> DNA <213> artificial <220> <223> fC9-R primer <400> 53 ctgtgtgttt ttcttttaat ttattcaaac ctttgtcttt atggtc 46 <210> 54 <211> 40 <212> DNA <213> artificial <220> <223> fR1-F primer <400> 54 ccataaagac aaaggtttgc cgcaatatgt tgatgaaacc 40 <210> 55 <211> 40 <212> DNA <213> artificial <220> <223> fR1-R primer <400> 55 ggtttcatca acatattgcg gcaaaccttt gtctttatgg 40 <210> 56 <211> 40 <212> DNA <213> artificial <220> <223> fTR1-F primer <400> 56 gcaagcccaa aaagaccaac cgcaatatgt tgatgaaacc 40 <210> 57 <211> 40 <212> DNA <213> artificial <220> <223> fTR1-R primer <400> 57 ggtttcatca acatattgcg gttggtcttt ttgggcttgc 40 <210> 58 <211> 273 <212> PRT <213> Borrelia afzelii <400> 58 Met Lys Lys Tyr Leu Leu Gly Ile Gly Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ala 1 5 10 15 Cys Lys Gln Asn Val Ser Ser Leu Asp Glu Lys Asn Ser Ala Ser Val 20 25 30 Asp Leu Pro Gly Glu Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asp Lys 35 40 45 Asp Gly Lys Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Val Asp Lys Ile Glu Leu Lys 50 55 60 Gly Thr Ser Asp Lys Asp Asn Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Thr Lys 65 70 75 80 Asp Asp Lys Ser Lys Ala Lys Leu Thr Ile Ala Asp Asp Leu Ser Lys 85 90 95 Thr Thr Phe Glu Leu Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Arg 100 105 110 Lys Val Ser Ser Lys Asp Lys Thr Ser Thr Asp Glu Met Phe Asn Glu 115 120 125 Lys Gly Glu Leu Ser Ala Lys Thr Met Thr Arg Glu Asn Gly Thr Lys 130 135 140 Leu Glu Tyr Thr Glu Met Lys Ser Asp Gly Thr Gly Lys Ala Lys Glu 145 150 155 160 Val Leu Lys Asn Phe Thr Leu Glu Gly Lys Val Ala Asn Asp Lys Val 165 170 175 Thr Leu Glu Val Lys Glu Gly Thr Val Thr Leu Ser Lys Glu Ile Ala 180 185 190 Lys Ser Gly Glu Val Thr Val Ala Leu Asn Asp Thr Asn Thr Thr Gln 195 200 205 Ala Thr Lys Lys Thr Gly Ala Trp Asp Ser Lys Thr Ser Thr Leu Thr 210 215 220 Ile Ser Val Asn Ser Lys Lys Thr Thr Gln Leu Val Phe Thr Lys Gln 225 230 235 240 Asp Thr Ile Thr Val Gln Lys Tyr Asp Ser Ala Gly Thr Asn Leu Glu 245 250 255 Gly Thr Ala Val Glu Ile Lys Thr Leu Asp Glu Leu Lys Asn Ala Leu 260 265 270 Lys <210> 59 <211> 210 <212> PRT <213> Borrelia burgdorferi <400> 59 Met Lys Lys Asn Thr Leu Ser Ala Ile Leu Met Thr Leu Phe Leu Phe 1 5 10 15 Ile Ser Cys Asn Asn Ser Gly Lys Asp Gly Asn Thr Ser Ala Asn Ser 20 25 30 Ala Asp Glu Ser Val Lys Gly Pro Asn Leu Thr Glu Ile Ser Lys Lys 35 40 45 Ile Thr Asp Ser Asn Ala Val Leu Leu Ala Val Lys Glu Val Glu Ala 50 55 60 Leu Leu Ser Ser Ile Asp Glu Ile Ala Ala Lys Ala Ile Gly Lys Lys 65 70 75 80 Ile His Gln Asn Asn Gly Leu Asp Thr Glu Asn Asn His Asn Gly Ser 85 90 95 Leu Leu Ala Gly Ala Tyr Ala Ile Ser Thr Leu Ile Lys Gln Lys Leu 100 105 110 Asp Gly Leu Lys Asn Glu Gly Leu Lys Glu Lys Ile Asp Ala Ala Lys 115 120 125 Lys Cys Ser Glu Thr Phe Thr Asn Lys Leu Lys Glu Lys His Thr Asp 130 135 140 Leu Gly Lys Glu Gly Val Thr Asp Ala Asp Ala Lys Glu Ala Ile Leu 145 150 155 160 Lys Thr Asn Gly Thr Lys Thr Lys Gly Ala Glu Glu Leu Gly Lys Leu 165 170 175 Phe Glu Ser Val Glu Val Leu Ser Lys Ala Ala Lys Glu Met Leu Ala 180 185 190 Asn Ser Val Lys Glu Leu Thr Ser Pro Val Val Ala Glu Ser Pro Lys 195 200 205 Lys Pro 210 <210> 60 <211> 691 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 60 Met Asn Asn Pro Leu Val Asn Gln Ala Ala Met Val Leu Pro Val Phe 1 5 10 15 Leu Leu Ser Ala Cys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Phe Asp Leu Asp Ser 20 25 30 Val Asp Thr Glu Ala Pro Arg Pro Ala Pro Lys Tyr Gln Asp Val Ser 35 40 45 Ser Glu Lys Pro Gln Ala Gln Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Gly Phe Ala 50 55 60 Met Arg Phe Lys Arg Arg Asn Trp Tyr Gln Arg Ala Asn Pro Lys Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ile Lys Leu Ser Glu Asp Asp Trp Glu Gln Thr Asp Asp Gly 85 90 95 Asp Ile Lys Asn Pro Ser Lys Gln Lys Asn Ile Ile Asn Ala Leu Pro 100 105 110 Gly Asn Asn Glu Gly Ala Leu Leu Gln Asp Ser Ser Gln Glu Asn Gln 115 120 125 Gly Ile Ser Lys Val Lys Asp Tyr His Asn Phe Gln Tyr Val Trp Ser 130 135 140 Gly Phe Phe Tyr Lys Gln Ile Lys Asn Thr Ile Glu Lys Asn Gly Ser 145 150 155 160 Ser Ile Thr Ala Ala Arg Asn Gly Pro Asp Gly Tyr Ile Phe Tyr Lys 165 170 175 Gly Lys Asp Pro Ser Arg Lys Leu Pro Val Ser Gly Glu Val Met Tyr 180 185 190 Lys Gly Thr Trp Asp Phe Leu Thr Asp Val Lys Ala Asn Gln Lys Phe 195 200 205 Thr Asp Leu Gly Asn Ala Ser Thr Lys Pro Gly Asp Arg Tyr Ser Ala 210 215 220 Phe Ser Gly Glu Leu Asp Tyr Ile Val Lys Gln Glu Asn Asp Lys Lys 225 230 235 240 Asp Gly His Val Gly Leu Gly Leu Thr Thr Glu Ile Thr Val Asp Phe 245 250 255 Glu Lys Lys Thr Leu Ser Gly Lys Leu Ile Lys Asn Asn Ser Val Ile 260 265 270 Thr Thr Asn Asn Asp Lys His Thr Thr Gln Tyr Tyr Ser Leu Glu Ala 275 280 285 Thr Leu Lys Gly Asn Arg Phe Asn Gly Lys Ala Thr Ala Thr Asp Lys 290 295 300 Pro Lys Glu Asn Glu Thr Lys Gln His Pro Phe Val Ser Asp Ser Ser 305 310 315 320 Ser Leu Ser Gly Gly Phe Phe Gly Pro Gln Gly Glu Glu Leu Gly Phe 325 330 335 Arg Phe Leu Ser Asp Asp Lys Lys Val Ala Val Val Gly Ser Ala Lys 340 345 350 Thr Lys Asp Lys Pro Gly Asn Gly Ala Ala Ala Pro Gly Gly Thr Asp 355 360 365 Ala Ala Ala Ser Asn Gly Ala Ala Gly Thr Ser Ser Glu Asn Ser Lys 370 375 380 Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Lys Ser Gly Gly Lys Glu 385 390 395 400 Val Lys Asn Leu Asp Asn Phe Ser Asn Ala Ala Gln Leu Val Val Asp 405 410 415 Gly Ile Met Ile Pro Leu Leu Pro Lys Asp Ser Glu Ser Gly Asn Thr 420 425 430 Gln Ala Asp Lys Gly Lys Asn Gly Gly Thr Glu Phe Thr Arg Lys Phe 435 440 445 Glu His Thr Pro Glu Ser Asp Lys Lys Asp Ala Gln Ala Gly Thr Ala 450 455 460 Glu Asn Gly Asn Pro Ala Ala Ser Asn Thr Ala Gly Asp Thr Asn Gly 465 470 475 480 Lys Thr Lys Thr Tyr Ala Val Glu Val Cys Cys Ser Asn Leu Asn Tyr 485 490 495 Leu Lys Tyr Gly Leu Leu Thr Arg Lys Thr Ala Gly Asn Thr Gly Glu 500 505 510 Gly Gly Asn Gly Ala Ala Gln Thr Asp Ala Gln Ser Met Phe Leu Gln 515 520 525 Gly Glu Arg Thr Asp Glu Lys Glu Ile Pro Asn Asp Gln Asn Ile Val 530 535 540 Tyr Arg Gly Ser Trp Tyr Gly His Ile Ala Asn Gly Thr Ser Trp Ser 545 550 555 560 Gly Asn Ala Ser Asp Lys Glu Gly Gly Asn Arg Ala Glu Phe Thr Val 565 570 575 Asn Phe Ala Asp Lys Lys Leu Asn Gly Thr Leu Thr Ala Gly Glu Arg 580 585 590 Thr Ser Pro Thr Phe Thr Ile Thr Ala Thr Ile Gln Gly Asn Gly Phe 595 600 605 Glu Gly Thr Ala Lys Thr Gly Asp Asp Gly Phe Ala Leu Asp Thr Lys 610 615 620 Asn Thr Val Asp Thr His Lys Ala His Ile Thr Asp Ala Asn Val Gln 625 630 635 640 Gly Gly Phe Tyr Gly Pro Lys Ala Glu Glu Leu Gly Gly Trp Phe Ala 645 650 655 Tyr Pro Gly Asp Arg Gln Ala Gln Pro Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr 660 665 670 Ser Ala Ala Asn Ser Ala Thr Val Val Phe Gly Ala Lys Arg Gln Gln 675 680 685 Leu Val Gln 690

Claims (34)

  1. N-말단 및 C-말단 융합 파트너를 포함하는 융합 리포단백질로서,
    여기서,
    a) N-말단 융합 파트너는 N-말단에서 C-말단 순서로
    i) 리피드화된 N-말단 시스테인; 및
    ii) 그람-음성 박테리아의 표면 노출된 리포단백질의 테더(tether)
    를 포함하며;
    여기서 상기 N-말단 융합 파트너는 그 안에서의 발현시 그람-음성 박테리아의 세포 외 외막 표면 상에서의 융합 리포단백질의 발현을 일으키고; 그리고,
    b) C-말단 융합 파트너는 감염성 질병 또는 종양과 관련된 항원의 적어도 하나의 에피토프를 포함하고,
    여기서 C-말단 융합 파트너는 N-말단 융합 파트너의 서열이 유래되는 표면 노출된 리포단백질로부터의 적어도 10 개의 인접 아미노산의 아미노산 서열을 포함하지 않으며; 그리고
    여기서 상기 융합 리포단백질의 아미노산 서열은 자연적으로 발생하지 않는 것인,
    융합 리포단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 테더는 리피드화된 N-말단 시스테인에 인접하여 위치하는, 융합 리포단백질.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 N-말단 융합 파트너는 iii) 그람-음성 박테리아의 표면 노출된 리포단백질의 테더의 C-말단에 위치하는 적어도 5개, 10개 또는 17개의 연속 아미노산의 스트레치를 추가로 포함하는, 융합 리포단백질.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 N-말단 융합 파트너는 그람-음성 박테리아의 표면 노출된 리포단백질로부터의 N-말단 프래그먼트를 포함하며, 그리고 여기서 상기 프래그먼트는 그람-음성 박테리아에서 발현되는 경우에 융합 리포단백질의 표면 발현을 일으키는, 융합 리포단백질.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 그람-음성 박테리아는 나이세리아(Neisseria) 속의 것인, 융합 리포단백질.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 그람-음성 박테리아는 나이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis), 나이세리아 고노로이애(Neisseria gonorrhoeae) 또는 N. 락타미카(N. lactamica)인, 융합 리포단백질.
  7. 제1항에 있어서,

    표면 노출된 리포단백질은 fHbp, LpbB, TbpB, NHBA 및 Ag473으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 융합 리포단백질.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 N-말단 융합 파트너는 적어도
    a) SEQ ID NO: 1의 위치 20-38에서의 아미노산 서열과 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    b) SEQ ID NO: 2의 위치 21-61 또는 위치 21-63에서의 아미노산 서열과 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는
    c) SEQ ID NO: 3의 위치 23-51에서의 아미노산 서열과 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열
    을 포함하는, 융합 리포단백질.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 N-말단 융합 파트너는 적어도
    a) SEQ ID NO: 1의 위치 20-50에서의 아미노산 서열과 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    b) SEQ ID NO: 2의 위치 21-73 또는 위치 21-75에서의 아미노산 서열과 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는
    c) SEQ ID NO: 3의 위치 23-63에서의 아미노산 서열과 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열
    을 포함하는, 융합 리포단백질.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 C-말단 융합 파트너는 N-말단 융합 파트너의 서열이 유래된 표면 노출 리포단백질로부터의 적어도 5개의 아미노산의 아미노산 서열을 포함하지 않는, 융합 리포단백질.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 C-말단 융합 파트너는 감염성 제제(infectious agent) 또는 종양의 단백질성 항원으로부터의 표면 노출된 에피토프를 포함하거나 또는 이로 구성되는, 융합 리포단백질.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 C-말단 융합 파트너는 표면 노출된 박테리아 단백질 또는 리포단백질의 표면 노출된 도메인을 포함하거나 또는 이로 구성되는, 융합 리포단백질.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 리포단백질은 보렐리아(Borrelia) 표면 리포단백질인, 융합 리포단백질.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 보렐리아(Borrelia) 표면 리포단백질은 OspA, OspB, OspC, OspF, VlsE, BbCRASP1, Vsp1, P35 (BBK32), P37 (BBK50), P39, P66, DpbA 및 BB017로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 융합 리포단백질.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 보렐리아(Borrelia) 표면 리포단백질은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 29-273, SEQ ID NO: 58의 아미노산 29-273 또는 SEQ ID NO: 59의 아미노산 136-210을 포함하는, 융합 리포단백질.
  16. 제1항에 정의된 융합 리포단백질을 포함하는 OMV.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 OMV는 디터전트-추출된 OMV가 아닌, OMV.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 OMV는 상청액 OMV 또는 네이티브 OMV인, OMV.
  19. 제16항에 있어서,
    상기 OMV는
    a) 박테리아가 감소된 독성을 갖는 LPS를 생산하게 하는 유전적 변형(genetic modification);
    b) 소포 형성을 증가시키는 유전적 변형; 및
    c) 세포 표면-노출된 리포단백질의 단백질분해 방출을 억제하는 유전적 변형
    으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전적 변형을 갖는 그람-음성 박테리아로부터 획득가능한, OMV.
  20. 제19항에 있어서,
    하나 이상의 유전적 변형은
    a) lpxL1, lpxL2 및 lpxK 유전자 또는 이의 호모로그 중 적어도 하나의 발현을 감소 또는 제거하거나 또는 lpxE, lpxF 및 pagL 유전자 중 적어도 하나의 발현을 증가시키는 유전적 변형;
    b) ompA 유전자 또는 이의 호모로그의 발현을 감소 또는 제거하는 유전적 변형; 및
    c) nalP 유전자 또는 이의 호모로그의 발현을 감소 또는 제거하는 유전적 변형
    으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, OMV.
  21. 제16항에 있어서,
    상기 그람-음성 박테리아는 나이세리아(Neosseria), 보르데텔라(Bordetella), 에세리키아(Escherichia) 및 살모넬라(Salmonella)로 구성되는 그룹으로부터 선택된 속에 속하는, OMV.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 박테리아는 나이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 에세리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)로 구성되는 그룹으로부터 선택된 종에 속하는, OMV.
  23. 제16항에 따른 OMV 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 항원과 관련된 감염성 질병 또는 종양의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  24. 제16항에 따른 OMV를 포함하는 감염성 질병 또는 종양에 대한 백신화, 또는 이의 예방 또는 치료용 의약으로서 사용하기 위한 약학 조성물.
  25. 제24항에 있어서,
    항원과 관련된 감염성 질병 또는 종양의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약학 조성물.
  26. 제25항에 있어서,
    감염성 질병은 보렐리아(Borrelia) 감염인, 약학 조성물.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 보렐리아(Borrelia) 감염은 보렐리아 버그도르페리(Borrelia burgdorferi) 감염인, 약학 조성물.
  28. 프리-프로퓨전 리포단백질을 암호화하는 핵산 분자로서, 그람 음성 박테리아에서 프리-프로퓨전(pre-profusion) 리포단백질의 발현시, 프리-프로퓨전 리포단백질이 제1항에 따라 정의된 융합 리포단백질로 성숙하는 프리-프로퓨전 리포단백질을 암호화하는 핵산 분자.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 그람-음성 박테리아에서 프리-프로퓨전 리포단백질의 발현을 위한 발현 구조물인, 핵산 분자.
  30. 제28항에 따른 핵산 분자 또는 제29항에 기재된 발현 구조물을 포함하는 그람-음성 박테리아 숙주 세포.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 그람-음성 박테리아 숙주 세포는 나이세리아(Neosseria), 보르데텔라(Bordetella), 에세리키아(Escherichia) 및 살모넬라(Salmonella)로 구성되는 그룹으로부터 선택된 속에 속하는, 그람-음성 박테리아 숙주 세포.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 그람-음성 박테리아 숙주 세포는 나이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 에세리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)로 구성되는 그룹으로부터 선택된 종에 속하는, 그람-음성 박테리아 숙주 세포.
  33. 제16항에 따른 OMV를 제조하는 방법으로서, 여기서 상기 방법은
    i) 제30항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계;
    ii) 선택적으로 상기 OMV를 추출하는 단계; 및
    iii) 상기 OMV로부터 박테리아의 제거를 적어도 포함하는, 상기 OMV를 회수하는 단계,
    를 포함하는, 방법.
  34. 제33항에 있어서,
    상기 방법은 디터전트-프리(detergent-free)인, 방법.
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