KR102685685B1 - 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법, 이 방법에 의해 제조된 뇌 종양 동물 모델, 및 이 모델을 이용한 뇌 종양 치료제의 스크리닝 방법 - Google Patents
뇌 종양 동물 모델의 제조 방법, 이 방법에 의해 제조된 뇌 종양 동물 모델, 및 이 모델을 이용한 뇌 종양 치료제의 스크리닝 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법, 이 방법에 의해 제조된 뇌 종양 동물 모델, 및 이 모델을 이용한 뇌 종양 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 절제술 후 뇌 종양이 다시 발생하는 현상, 특히 신경교종 환자에서 절제술 후 절제 부위에 국소적으로 종양이 다시 발생하는 현상을 매우 효과적으로 대변하게 되는 뇌 종양 동물 모델을 제공함으로써, 해당 뇌 종양 동물 모델을 이용하는 경우 뇌 종양 환자의 재발암 치료제를 매우 효과적으로 스크리닝할 수 있게 한다.
Description
본 발명은 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법, 이 방법에 의해 제조된 뇌 종양 동물 모델, 및 이 모델을 이용한 뇌 종양 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 피질 영역에 뇌 종양을 갖는 형질전환 동물 모델의 제조 방법, 이 방법에 의해 제조된 뇌 종양 동물 모델, 및 이 모델을 이용한 뇌 종양 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
암은 전세계적으로 가장 보편적인 사망원인 중의 하나이다. 약 1천만건의 새로운 케이스가 매년 발생하며, 전체 사망원인의 약 12%를 차지하여 세번째로 많은 사망원인으로 보고되고 있다. 다양한 암 중에서 특히 뇌 종양은 연령에 관계없이 발생되며, 소아에 발생 빈도가 다른 암에 비하여 높은 특징이 있다. 뇌 종양은 뇌조직과 뇌를 싸고 있는 뇌막에서 발생되는 원발성 뇌 종양과 두개골이나 신체의 다른 부위에서 발생된 암으로부터 전이된 이차성 뇌 종양을 통칭하는 것이다. 이와 같은 뇌 종양은 다른 장기에서 발생하는 암과 구분되는 점이 많다. 우선 폐, 위, 유방 등에 생기는 암은 장기별로 한 두 종류에 국한되고, 그 성질이 동일, 유사한 편이다. 그러나 뇌에는 매우 다양한 종류의 암이 발생한다. 예를 들면 다형성아교모세포종, 신경교종(Glioma), 악성신경 교종, 임파선종, 배아세포종, 전이성 종양 등 다양하다.
상기 신경교종(Glioma)은 원발성 뇌 종양(Primary brain tumor)의 60%를 차지하는 종양으로서, 발생 빈도가 높고 치료가 어려워, 현재까지도 방사선 치료 외엔 특별한 치료법이 없는 악성 종양에 해당한다. 신경교종 중에서 가장 악성으로 분류되고 있는 교모세포종(Glioblastoma, GBM)의 경우, 다른 암과 비교하였을 때 방사선 및 항암제 치료에 대한 저항성이 매우 높아 일단 진단되면 생존기간이 1년에 불과하므로, 각 환자의 발생 기원과 과정에 대한 적절한 진단 및 이해가 중요하다. 특히, 뇌에 발생되는 교모세포종은 성인 악성 뇌 종양 중에서 가장 높은 빈도로 발생되는 종양이며, 최선의 치료로도 중앙 생존기간이 12~18개월로 완치율이 극히 낮다. 나아가, 이와 같은 질환의 재발이 발생되는 경우 생존율을 높일 수 있는 유의한 약제가 없는 상황이다.
상기 뇌 종양의 경우에는 뇌혈관 장벽(Brain blood barrier)이 존재하기 때문에 치료를 위한 약물 전달이 목적하는 뇌 부위로 전달되기 어려울 뿐만 아니라, 상대적으로 뇌신경 생물학에 대한 이해가 부족하여 치료제 개발이 활발하지 못한 것이 현실이다. 더욱이, 교모세포종은 다른 뇌 종양과 비교해볼 때 공격적 변이(Aggressive variant)를 나타내어, 이를 빠른 시일 내에 치료하지 않으면 몇 주 이내에 치명적인 결과를 초래할 수 있다.
따라서, 뇌 종양의 치료에는 외과적 처치 이외에 방사선 치료 및 화학 약물 치료가 함께 수행되고 있으나, 상기 치료는 내성 변이의 발생, 종양줄기세포에 의한 재발 등의 원인으로 인하여 완벽한 치료법이 없다. 따라서, 발생 기원에 대한 초기 진단과 이해 및 그에 기반한 새로운 치료법 개발이 요구되고 있는 실정이다.
전술한 문제점을 해소함에 있어, 본 발명의 목적은 피질 영역에 뇌 종양을 갖는 형질전환 동물 모델의 제조 방법 및 이 방법에 의해 제조된 뇌 종양 동물 모델을 제공함에 있다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 뇌 종양 동물 모델을 이용한 뇌 종양 치료제의 스크리닝 방법을 제공함에 있다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 실시예에서는 뇌 종양을 갖는 형질전환 동물의 제조하는 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법은 피질 영역에 뇌 종양을 갖는 형질전환 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법으로서, (a) EGFR 녹아웃 동물을 준비하는 단계; (b) Trp53 및 Pten을 녹아웃하는 벡터를 준비하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 제조된 벡터를 (a) 단계에서 제조된 동물의 뇌실하영역에 전기천공법을 이용하여 주입하는 단계;를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법은 상기 (c) 단계를 통해 벡터가 주입된 동물에 개두술을 수행하여 뇌 피질을 절제하는 단계인 (d) 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법에서, 상기 뇌 종양은, 악성 신경교종, 예를 들면, 교모세포종(Glioblastoma, GBM)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법에서, 상기 뇌실하영역은, 뇌실하영역의 신경줄기세포를 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들면 뇌실하영역의 신경줄기세포를 의미한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법에서, 상기 뇌실하영역이란, 측뇌실(lateral ventricle)의 측벽(lateral wall)에 뇌실막층과 거의 맞닿은 곳에 위치하는 영역으로, 증식하는 세포들은 뇌실하 영역에 많이 모여 있을 뿐만 아니라, 다양한 성숙단계에 있는 다양한 종류의 신경계열 세포들로 구성되어 있다는 특징이 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법에서, 상기 (a) 단계의 변이 EGFR을 갖는 동물을 준비하는 단계는 상업적으로 목적 돌연변이를 가지는 동물을 구입하여 얻는 방법을 포함할 수 있다. 상기 EGFR 변이는, 예를 들면, EGFRⅷ 변이(FEBS J. 2013 Nov;280(21):5350- 70)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법에서, 상기 (b) 단계의 Trp53 및 Pten을 녹아웃하는 벡터는 유전자 편집에 사용되는 벡터를 사용하는 것일 수 있다. Trp53 및 Pten을 녹아웃 할 수 있는 벡터라면 종류에 상관없이 필요에 따라 통상의 기술자가 적절한 벡터를 선택할 수 있고, 예를 들어, 상동성 재조합(Homologous recombination), TALEN, ZFN, AAV 플라스미드 또는 CRISPR/Cas9 벡터를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법에서, 상기 벡터는 Cre 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 "Cre 유전자"란, Cre recombinase라는 효소로, 특정 서열의 DNA를 인식하여 잘라내고 이어붙이는 기능을 한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법에서, 상기 벡터는 당업계에 널리 알려진 방법으로 합성 또는 상업적으로 구입하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법에서, 상기 sgRNA의 게놈-편집 테스트는 당업계에 알려진 방법을 사용해 자유롭게 이루어질 수 있으며, 구체적으로, 형질도입 후 T7E1 분석을 통해 게놈-편집 효율을 계산할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법에서, 상기 sgRNA의 게놈-편집 테스트는 돌연변이 빈도를 계산하는 과정을 추가로 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법에서, 상기 Trp53을 표적하는 sgRNA 염기 서열은 서열번호 1 내지 4로 표시되는 염기 서열 중 어느 하나 이상의 염기 서열로 표시되는 것으로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법에서, 상기 Pten을 표적하는 sgRNA 염기 서열은 서열번호 5 내지 9로 표시되는 염기 서열 중 어느 하나 이상의 염기 서열로 표시되는 것으로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법에서, 상기 sgRNA의 게놈 편집 효율(genome-editing frequency)은 돌연변이 빈도 30 내지 99.9%, 40 내지 99.9%, 45 내지 99.9%, 50 내지 99.9%, 55 내지 99.9%, 60 내지 99.9%, 65 내지 99.9%, 70 내지 99.9%, 75 내지 99.9%, 80 내지 99.9%, 85 내지 99.9%, 30 내지 95%, 40 내지 95%, 45 내지 95%, 50 내지 95%, 55 내지 95%, 60 내지 95%, 65 내지 95%, 70 내지 95%, 75 내지 95%, 80 내지 95%, 85 내지 95%, 또는 50 내지 90%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법에서, 상기 (c) 단계에서, 전기천공 방법으로 벡터를 주입함으로써 뇌실하 영역(SVZ)에 특이적으로 유전자를 전달한다. 상기 전기천공법을 통해 바이러스 등 다른 주입법을 사용할 경우 뇌실하영역 외의 다른 지역으로도 유전자 전달이 일어날 수 있는 위험성을 극복할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법에서, 상기 (c) 단계에서, 벡터 주입량은 0.1 내지 10 ng, 0.1 내지 8 ng, 0.1 내지 6 ng, 0.1 내지 5 ng, 0.1 내지 4 ng, 0.1 내지 3 ng, 0.1 내지 2.7 ng, 0.1 내지 2.5 ng, 0.5 내지 10 ng, 0.5 내지 8 ng, 0.5 내지 6 ng, 0.5 내지 5 ng, 0.5 내지 4 ng, 0.5 내지 3 ng, 0.5 내지 2.7 ng, 0.5 내지 2.5 ng, 1 내지 10 ng, 1 내지 8 ng, 1 내지 6 ng, 1 내지 5 ng, 1 내지 4 ng, 1 내지 3 ng, 1 내지 2.7 ng, 1 내지 2.5 ng, 1.5 내지 10 ng, 1.5 내지 8 ng, 1.5 내지 6 ng, 1.5 내지 5 ng, 1.5 내지 4 ng, 1.5 내지 3 ng, 1.5 내지 2.7 ng, 또는 1.5 내지 2.5 ng, 예를 들면 2 ng일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 필요에 따라 당업계의 기술 상식에 따라 적절히 변형하여 주입량을 결정할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법에서, 상기 뇌 종양 동물 모델은, 인간 뇌실하영역의 GFAP-양성 신경줄기세포(GFAP- positive neural stem cell)로부터 교모세포종(Gliablastoma)이 발생하는 인간 환자의 현상을 그대로 반영하는 특징을 가진다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법에서, 상기 Cre 유전자의 상류에 GFAP 프로모터가 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법에서, 상기 프로모터란, 세포에서 작동 가능-하게 연결된 유전자의 상류에 존재하는 염기 서열로서, 전사가 개시되도록 하기 위하여 RNA 폴리머라제(RNA Polymerase)가 결합될 수 있는 DNA 컨스트럭트의 특정 부위의 염기 서열을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 프로모터는 GFAP 프로모터일 수 있다. GFAP 프로모터를 이용하는 경우, 전기천공법을 통해 SVZ에 국한된 유전자 전달 후, SVZ 내에 존재하는 정상적인 세포에는 발현되지 않고 GFAP 양성 신경줄기세포에서만 특이적으로 발현되어 뇌실하영역 내 줄기세포 이외 다른 세포에서 벡터의 발현이 유도되는 것을 방지할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법에서, 상기 작동 가능하게 연결(Operably linked)이란, 목적하는 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 기능적으로 연결되어, 목적하는 하나의 핵산 단편의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법에서, 상기 동물은 마우스, 햄스터, 랫트, 기니 피그, 토끼, 돼지 및 개로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 예를 들면, 마우스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법에서, 상기 뇌 종양은 교모세포종인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법에서, 상기 교모세포종이란, 난치성 뇌 종양의 일종으로, 진단 후 평균 총 생존기간이 15개월 정도에 불과하다. 교모세포종은 정상적으로 뇌조직에 풍부하게 존재하고 있는 신경교세포에서 기원한 종양을 통틀어 일컫는다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법에서, 상기 뇌 종양은 재발암인 것일 수 있고, 상기 재발암은 뇌 종양 절제술 후 재발되어 절제 부위에 국소적으로 종양이 다시 발생된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법에서, 상기 동물 모델은, 돌연변이 주입 위치와 종양 발생 위치가 이격되어 있다. 예를 들면, 돌연변이 주입 위치로부터 등측면 방향으로 이격된 위치, 예를 들어 뇌실하영역에서 이격된 피질 영역에 종양을 형성하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법에서, 상기 뇌 종양 동물 모델은 상기 Trp53, Pten, 및 EGFR 돌연변이를 가지는 뇌실하영역은 돌연변이의 유전자형을 가지고 표현형은 정상 조직을 유지하는 것을 특징으로 한다. 따라서 돌연변이 주입 위치에서는 종양이 발생하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법에서, 상기 뇌 종양 동물 모델은 상기 Trp53, Pten 및 EGFR 돌연변이는 전기천공 부위, 예를 들어 뇌실하영역의 신경줄기세포 위치에 특이적으로 존재하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서는 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법에 의해 제조된 뇌 종양 동물 모델을 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법에 의해 제조된 뇌 종양 동물 모델에서, 뇌 종양, 교모세포종, 재발암 등과 관련된 내용은 앞서 기재된 바와 동일하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 본 발명의 다른 실시예에 따른 뇌 종양 동물 모델을 이용한 뇌 종양 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델을 이용한 뇌 종양 치료제의 스크리닝 방법은 뇌 종양 동물 모델을 준비하는 단계; 및 상기 준비된 동물 모델에 뇌 종양 치료 후보 물질을 투여한 후 뇌종양 경감 또는 치료 여부를 확인하는 단계;를 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델을 이용한 뇌 종양 치료제의 스크리닝 방법에서, 제조 방법, 뇌 종양, 교모세포종, 재발암 등과 관련된 내용은 앞서 기재된 바와 동일하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델을 이용한 뇌 종양 치료제의 스크리닝 방법에서, 상기 후보 물질은 당업계의 상식에 따라 임의이 경로를 선택하여 투여할 수 있고, 예를 들면, 피하주사, 근육주사, 안연고, 점안, 점이, 흡입, 삽항투여, 경구투여, 설하투여, 경피투여 등을 통해 투여할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델을 이용한 뇌 종양 치료제의 스크리닝 방법에서, 상기 뇌종양의 경감 또는 치료 여부를 확인하는 단계는 NeuN, nestin, GFAP, OliG2, S100b, MBP 및 Ki67로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 마커의 유전자 또는 단백질을 측정하여 수행할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델을 이용한 뇌 종양 치료제의 스크리닝 방법에서, 상기 유전자는 그 발현 수준을 측정하는 것일 수 있고, 상기 단백질은 그 발현 수준 또는 활성 정도를 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델을 이용한 뇌 종양 치료제의 스크리닝 방법에서, 상기 유전자의 발현 수준 측정은 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법으로 수행하는 것일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델을 이용한 뇌 종양 치료제의 스크리닝 방법에서, 상기 단백질의 발현 또는 활성 수준 측정은, 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법 (immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군 으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질 발현 또는 활성 수준을 측정하는 방법으로 수행하는 것일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따른 상기 뇌 종양 동물 모델을 이용한 뇌 종양 치료제의 스크리닝 방법에서, 상기 후보 물질은 뇌 종양, 예를 들면 교모세포종의 치료제로서 가능성이 잇는 물질로서 예를 들면, 추출물, 단백질, 올리고펩티드, 소형 유기 분자, 다당류, 항체, 폴리뉴클레오티드 및 광범위한 화합물 등의 임의 분자를 포함할 수 있다. 이러한 후보 물질은 천연물질 외에 합성물질도 포함한다.
서열목록
서열번호 1: GGTGTAATAGCTCCTGCATGG
서열번호 2: GGCTACCACGCGCCTTCCTACC
서열번호 3: GGTGGTATACTCAGAGCCGGCC
서열번호 4: GGTATACTCAGAGCCGGCCTG
서열번호 5: GGTTGGTCAAGATCTTCACAGA
서열번호 6: GGAGAGGCCCTAGATTTTTATG
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서열번호 9: GGTGTCATCTTCACTTAGCCAT
서열번호 10: GGCAGCAATTCACTGTAAAGC
서열번호 11: GGTGCGAATACGCCCACGCGAT
본 발명에 의한 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법, 이 방법에 의해 제조된 뇌 종양 동물 모델, 및 이 모델을 이용한 뇌 종양 치료제의 스크리닝 방법은, 절제술 후 뇌 종양이 다시 발생하는 현상, 특히 신경교종 환자에서 절제술 후 절제 부위에 국소적으로 종양이 다시 발생하는 현상을 매우 효과적으로 대변하게 되는 뇌 종양 동물 모델을 제공함으로써, 해당 뇌 종양 동물 모델을 이용하는 경우 뇌 종양 환자의 재발암 치료제를 매우 효과적으로 스크리닝할 수 있게 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 마우스의 뇌에 존재하는 SVZ의 NSCs(Neural stem cells)에 LSL-Cas9-eGFP f/+ 및 LSL-EGFRⅷ f/+ 를 이용하여 Trp53(p53 또는 TP53) 및 Pten 돌연변이를 유도할 수 있도록 벡터를 전기천공을 이용하여 주입하고, 마우스의 뇌 피질에 2 mm 지름의 뇌 절제술을 시행하는 과정을 통해 뇌 종양(특히, 교모세포종) 마우스 모델을 제작하는 방법에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 벡터가 제대로 제작되었는지 확인하기 위해 Trp53(도면 윗부분) 및 Pten(도면 아랫부분)을 표적하는 sgRNA를 Neuro-2a 세포에서 추출된 DNA를 주형으로 PCR을 수행한 뒤 돌연변이가 유도된 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물 모델을 제작하기 위한 전체적인 프로세스를 모식도로 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 전기천공 5일 경과 후 NSC(Neural stem cells)의 면역염색 이미지를 나타낸 것으로서, 스케일 바는 50 ㎛를 의미한다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 본 발명의 동물 모델에서 전기 천공 및 절제술 수행한 뒤에 형광현미경을 이용하여 측정된 마우스 뇌의 연속 절편 사진을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 대조군 마우스 모델에서 전기 천공 및 절제술 수행한 뒤에 형광현미경을 이용하여 측정된 마우스 뇌의 연속 절편 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 벡터가 제대로 제작되었는지 확인하기 위해 Trp53(도면 윗부분) 및 Pten(도면 아랫부분)을 표적하는 sgRNA를 Neuro-2a 세포에서 추출된 DNA를 주형으로 PCR을 수행한 뒤 돌연변이가 유도된 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물 모델을 제작하기 위한 전체적인 프로세스를 모식도로 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 전기천공 5일 경과 후 NSC(Neural stem cells)의 면역염색 이미지를 나타낸 것으로서, 스케일 바는 50 ㎛를 의미한다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 본 발명의 동물 모델에서 전기 천공 및 절제술 수행한 뒤에 형광현미경을 이용하여 측정된 마우스 뇌의 연속 절편 사진을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 대조군 마우스 모델에서 전기 천공 및 절제술 수행한 뒤에 형광현미경을 이용하여 측정된 마우스 뇌의 연속 절편 사진을 나타낸 것이다.
본 발명에 있어 첨부된 도면은 종래 기술과의 차별성 및 명료성, 그리고 기술 파악의 편의를 위해 과장된 표현으로 도시되어 있을 수 있다. 또한, 후술되는 용어들은 본 발명에서의 기능을 고려하여 정의된 용어로써, 사용자, 운용자의 의도 또는 관례에 따라 달라질 수 있으므로, 이러한 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 기술적 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 한편, 실시예는 본 발명의 청구범위에 제시된 구성요소의 예시적 사항에 불과하고, 본 발명의 권리범위를 한정하는 것이 아니며, 권리범위는 본 발명의 명세서 전반에 걸친 기술적 사상을 토대로 해석되어야 한다.
실험 방법
[실시예 1]
뇌 종양 마우스 모델 제작
도 1에 도시된 바와 같이, 마우스의 뇌에 존재하는 SVZ의 NSCs(Neural stem cells)에 LSL(LoxP-Stop-LoxP)-Cas9-eGFP f/+ 및 LSL(LoxP-Stop-LoxP)-EGFRⅷ f/+를 이용하여 Trp53(p53 또는 TP53), Pten, 및 EGFR 돌연변이를 유도하고, 마우스의 뇌 피질에 2 mm 지름의 뇌 절제술을 시행하는 과정을 통해 뇌 종양(특히, 교모세포종) 마우스 모델을 제작하였다. 상기 유전자의 돌연변이(Trp53, Pten 및 EGFR)는 인간 교모세포종(GBM) 환자의 종양이 없는 SVZ에서 재발성 암 유발 돌연변이를 일으키는 돌연변이에 해당한다.
[1-1]
마우스 실험 정보 및 LSL EGFRvii f/+; LSL Cas9-eGFP f/+ 마우스 제작
격리된 케이지에서 물과 사료에 자유롭게 접근할 수 있도록 하는 조건에서 준비된 각각의 마우스를 사육하였다. 병원성 미생물이 없는 조건(SPF), 23℃의 온도가 유지 및 19시에 조명을 소등하는 12시간 명-암 사이클 조건을 유지하도록 사육실의 조건을 설정하였다. 나아가, 해당 마우스들을 사육하는 동안 규칙적으로 실험 수행자가 해당 마우스의 건강 상태를 점검할 수 있도록 하였다.
질병 특이적 생존(Disease Specific Survival; DSS)의 종점은 마우스의 사망 혹은 IACUC 프로토콜에 따른 안락 사에서 결정되었다. 안락사 조건은 다음과 같다:
(i) 20% 이상의 극심한 체중 감소,
(ⅱ) 마비, 발작 및 운동능력 손상에 의한 활처럼 휜 자세를 포함하는 극심한 신경학적 손상, 및
(ⅲ) 머리가 부풀어오르는 증상
NCI mouse repository로부터 구매한 LSL EGFRⅷ 마우스(FVB strain)와 The Jackson Laboratory로부터 구매한 LSL-Cas9-eGFP 마우스(C57BL/6)를 교배하여 LSL EGFRⅷ f/+; LSL Cas9-eGFP f/+ 마우스를 제작하였다. 상기 쥐가 Postnatal day 0 (P0)-P2 pups 상태일 때, 캐필러리를 통해 Right ventricle에 1㎕의 플라스미드 용액을 주입하였다. 또한, ECM830 electroporator (BTX-Harvard apparatus) 및 5-mm tweezer electrodes (45-0489, BTX-Harvard apparatus)를 이용하여 five electrical pulses (100 V, 50 ms, separated by 950 ms intervals)를 가해 플라스미드를 SVZ 세포에 주입하였다.
[1-2]
Cre-포함 벡터 제작
고효율의 sgRNAs 타겟팅 Trp53 및 Pten을 포함하며, Cre 재조합효소(recombinase)를 포함하는 단일 벡터를 제작하였다. 해당 벡터는 마우스 SVZ의 신경줄기세포에 Trp53 및 Pten 돌연변이를 주입하는데 매우 적합하도록 제작되었다.
구체적으로, pU6-(BbsI)_CBh-Cas9-T2A-BFP 플라스미드는 R. Kuehn (Addgene plasmid 64323)로부터 제공받았다. Trp53을 타겟팅하는 sgRNA(sgP53) 및 Pten을 타겟팅하는 sgRNA(sgPTEN)는 잠재적인 타겟 외 효과를 최소화하기 위해 CRISPRtool (http://crispr.mit.edu)을 사용하여 설계되었다. Lacz에 대한 sgRNA 후보군은 기존에 알려진 방법(Cancer Cell 28, 429-440 (2015))으로 제작되었다. sgRNA 염기서열을 하기 표 1에 나타내었다.
| 서열번호 | 표적 유전자 | 서열(5'-> 3') |
| 1 | Trp53 | GGTGTAATAGCTCCTGCATGG |
| 2 | Trp53 | GGCTACCACGCGCCTTCCTACC |
| 3 | Trp53 | GGTGGTATACTCAGAGCCGGCC |
| 4 | Trp53 | GGTATACTCAGAGCCGGCCTG |
| 5 | PTEN | GGTTGGTCAAGATCTTCACAGA |
| 6 | PTEN | GGAGAGGCCCTAGATTTTTATG |
| 7 | PTEN | GGTCTGTGAAGATCTTGACCAA |
| 8 | PTEN | GGTGATAAGTTCTAGCTGTGGT |
| 9 | PTEN | GGTGTCATCTTCACTTAGCCAT |
| 10 | PTEN | GGCAGCAATTCACTGTAAAGC |
| 11 | LacZ | GGTGCGAATACGCCCACGCGAT |
코스모진텍에서 각 sgRNA 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 합성하였고, 써모사이클러(Thermocycler)를 사용하여 시험관 내에서 어닐링하였다. pU6-(BbsI)_CBhCas9-T2A-BFP 플라스미드에 BbsI 제한효소를 넣은 뒤에 어닐링된 올리고 뉴클레오티드와 연결(ligate)하였다.
당업계에 기존에 공지된 방법(Nat. Protocols 8, 2281-2308 (2013))으로 sgRNA를 포함하는 플라스미드를 이용한 게놈-편집 테스트를 수행하였다. 구체적으로, Neur-2a 세포에 jetPRIME 트랜스펙션 시약(Polyplus)을 사용하여 sgRNA 후보 서열이 포함된 플라스미드를 트랜스펙션하고, 2일 후에 Qiamp mini DNA 키트(Qiagen)를 이용하여 DNA를 추출한 뒤에, 이렇게 추출된 DNA를 주형으로 하여 목적하는 부위를 PCR을 통해 증폭하였다. 이후, T7 엔도뉴클레아제 I 분석(T7E1 assay; NEB)을 수행하여 sgRNA 후보 물질의 게놈-편집 효율을 확인하였다. T7E1 결과를 도 2에 나타내었다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정한 밴드의 세기와 하기 [식 1]을 통해 돌연변이 빈도(mutation frequency)를 계산하였다.
[식 1]
돌연변이 빈도(%)= 100 x (1-(1-fraction cleaved) 1/2)
도 1에 도시된 바와 같이, Trp53, Pten 및 Cre 재조합효소를 목적으로 하는 sgRNAs를 포함하는 단일 벡터를 얻기 위해, GFAP-Cre-WPRE 플라스미드(pAAV.GFAP.Cre.WPRE.hGH, Addgene Cat no. #105550)를 증폭하였다. 그런 다음, 각각의 pU6-sgP53 및 pU6-sgPTEN 유전자를 증폭한 뒤, 상기 GFAP-Cre-WPRE 플라스미드에 삽입하는 과정을 통해 GFAP-Cre-WPRE-pU6-sgP53-pU6-PTEN 플라스미드를 제작하였다. 추가적으로, GFAP-Cre-WPRE-pU6-sgLacz를 제작하기 위해 상기와 동일한 방법으로 p-U6-sgLacz를 증폭한 뒤에 상기 GFAP-Cre-WPRE 플라스미드에 삽입하였다.
여기서, 상기 GFAP 프로모터는 신경줄기세포에서 특이적으로 활성화되는 프로모터로서 해당 프로모터를 사용함으로써, P53 및 PTEN를 포함하는 sgRNA가 SVZ 내에서 특히 신경줄기세포에서만 특이적으로 발현되도록 하는 세포 특이성이 부여되도록 한다.
또한, 상기 플라스미드에서 대조군 마우스의 경우 상기 GFAP-Cre-WPRE 플라스미드를 대신하여 pU6-(BbsI)_CBh-Cas9T2A-BFP에 포함되어 있는 T2A-BFP를 P2A-Cre로 치환하였다. 그런 다음, pU6-sgP53 및 pU6-sgPTEN를 증폭하고, pU6-(BbsI)_CBh-Cas9-P2A-Cre플라스미드의 pU6-(BbsI)을 pU6-sgP53-pU6-sgPTEN으로 치환하는 과정을 통해 pU6-sgP53-pU6-sgPTEN_CBh-Cas9-P2A-Cre 플라스미드를 제작하였다.
[1-3]
전기천공을 이용한 마우스 SVZ에 벡터 주입
마우스의 SVZ의 특정 위치 내에 있는 NSCs에 암 유발 돌연변이를 부여하고, SVZ로부터 돌연변이된 세포의 이동을 확인하기 위하여, LSP EGFRviii f/+; LSP Cas9-eGFP 마우스의 대뇌반구 한쪽 부위의 앞면 SVZ에 상기 실시예 1-2의 방법으로 제작된 GFAP-Cre-WPRE-pU6-sgP53-pU6-PTEN 벡터를 전기 천공법으로 주입하였다.
구체적으로, 생후 2-3일 된 마우스 신생아(P2-P3)를 저온마취(5분 이상)한 후, 지지대에 접착 석고를 사용하여 고정하였다. 일반적인 위치 마커로서 오늘쪽 눈과 람다를 연결하는 가상의 선을 설정하고 모세관 주사 (capillary needle)를 이 선의 눈으로부터 1/3 지점에 삽입하였다. 우측 뇌실에는 두개골에서 2 mm 지점에 플라스미드 용액 1 ㎕(2 ㎍/㎕, 1%(v/v) FastGreen 함유) 주입되었다. 뇌측실의 형상이 Fast Green 염색되는 것으로 주사의 성부를 확인하였다. 주사가 성공적으로 이루어진 동물을 선별하고, 해당 동물에게 1 mm 트위저 전극(CUY650P1, Nepagene)과 ECM830 전기천공기(BTX-Harvard apparatus)를 사용하여 전기 펄스(100V, 50ms, 90ms 인터벌) 5회를 주었다. 양극은 눈을 향하도록 했고, 음극은 측실의 반대 방향을 향하도록 하였다. 전기천공 후, 쥐들을 37℃의 가열판에서 완전히 회복시키고 모체에 돌려보냈다. 주사 2일 후, 주로 뇌측실 전방각(anterior horn)의 주둥이-등측면(rostral-dorsolateral side)에 eGFP를 발현하는 형질전환을 통해 도입된 세포들이 위치한 것을 확인하였다. 그러나, 상기 형질전환을 통해 도입된 세포들은 꼬리 방향으로 갈수록 서서히 감소하였고, 해마의 앞쪽 관상면(coronal section)에서 관찰되지 않았다.
[1-4]
뇌 절제술 시행
도 3에 도시된 바와 같이, 뇌 절제술을 위해 상기 [1-3]에서 제작된 형질전환 쥐에 케타민(Ketamine)과 자일라진(Xylazine)의 혼합물을 복강 내 주사하여 마취하고, 정위 프레임(Stoelting)에 위치시켰다. 세로 방향으로 뇌의 피부를 절개한 후, 정수리점(Bregma)에서 2 mm, 2 mm이동한 지점에서 휴대용 드릴로 2 mm 직경의 개두술을 수행하였다. 펌프(VACUSIP, INTEGRA Biosciences)에 부착된 평평한 피펫 팁을 이용하여 뇌량은 손상되지 않도록 하면서 피질만을 특이적으로 절제하였다. 절제 후, 마우스는 완전히 회복될 때까지 37℃가열 플레이트에서 위치될 수 있도록 한 뒤에 회복된 후 케이지로 돌려보냈다.
도 4에 전기천공 3일 후의 Trp53/Pten/EGFR 돌연변이 마우스의 면역염색 결과를 나타내었다. 흰색 화살표 표시 부분은 마우스의 SVZ(뇌실하영역)에서 eGFP 양성 반응이 GFAP 또는 nestin과 함께 나타난 부위를 나타낸다. 따라서, eGFP 양성 세포가 SVZ에 위치한 것을 확인할 수 있었다. 또한, eGFP 양성과 nestin 또는 GFAP가 함께 염색된 세포의 산포도를 나타내었다.
[실시예 2]
마우스 모델의 뇌 종양 발생 확인
상기 실시예 1에서 제작된 마우스 모델의 뇌를 형광현미경을 이용하여 연속 절편을 촬영한 뒤, 그 결과를 도 5 및 6에 나타내었다. 단, 여기서 대조군의 경우 실험적인 비교를 위해 한국 특허출원번호 제10-2019-0095074호에 기재된 방법과 동일하게 마우스 모델의 돌연변이를 유도하는 방법 등을 통해 제작하였다.
구체적으로, 본 발명의 마우스 모델의 경우 상기 [1-4]의 절제술을 수행하기 전인 전기천공 수행 2일 뒤(POD2), 절제술 수행 2주(14일) 뒤(POD14) 및 절제술 수행 4주(28일) 뒤(POD28)에 각각 촬영하였다. 또한, P2A 프로모터를 포함하고, 절제술을 수행하지 않은 대조군의 경우 절제술 없이 전기천공만을 수행한 지 2일, 8주, 13주 및 16주에 각각 촬영하여 그 결과를 나타내었다.
도 5 및 도 6에서 보는 바와 같이, 절제술 수행 4주 후(POD28)에 붉은색(eGFP)으로 종양이 뇌 절제 부위에 발생한 반면(도 5), 대조군의 경우 8주 이상이 되어야 붉은색으로 종양이 발생되었으며, 종양이 뇌에 산발적으로 위치하는 것을 확인하였다(도 6).
상기 결과를 통해 본 발명에 따른 마우스 모델은 대조군 마우스와 비교하여 매우 빠른 시간 내에 높은 비율로 종양이 발생되었으며, 나아가 절제 부위에만 특이적으로 종양이 국한되어 위치하는 것을 알 수 있다. 이는 뇌 종양, 특히 신경교종 환자에서 절제술 후에 잔여하는 SVZ 지역의 신경줄기세포가 수술 절제 부위로 다시 이동함으로써, 종양을 재구축하여 암을 재발하는 현상이 유도될 수 있음을 나타낸다.
이와 같은 마우스 모델을 뇌종양 치료제 스크리닝 목적으로 이용하는 경우, 종야 발생 시점 및 위치를 대조군보다 쉽게 예측이 가능하므로 치료제 효과 탐색에 실용적이며, 실험 소요 시간 및 비용을 줄이는데 효과적이다.
이상에서와 같이, 본 발명에 의한 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법, 이 방법에 의해 제조된 뇌 종양 동물 모델, 및 이 모델을 이용한 뇌 종양 치료제의 스크리닝 방법은, 절제술 후 뇌 종양이 다시 발생하는 현상, 특히 신경교종 환자에서 절제술 후 절제 부위에 국소적으로 종양이 다시 발생하는 현상을 매우 효과적으로 대변하게 되는 뇌 종양 동물 모델을 제공함으로써, 해당 뇌 종양 동물 모델을 이용하는 경우 뇌 종양 환자의 재발암 치료제를 매우 효과적으로 스크리닝할 수 있게 한다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 도면에 도시된 실시예를 참고로 하여 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술이 속하는 분야에서 통상의 지식을 기초로 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해해야 한다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호범위는 이하 기술할 청구범위과 그 등가물에 의하며, 상술한 발명의 구체적 내용을 토대로 정해져야 할 것이다.
본 발명은 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법, 이 방법에 의해 제조된 뇌 종양 동물 모델, 및 이 모델을 이용한 뇌 종양 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 암 치료와 관련된 의료 산업 분야에 이용 가능하다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation
<120> MANUFACTURING METHOD OF ANIMAL MODEL HAVING BRAIN TUMOR, ANIMAL
MODEL MANUFACTURED BY THE METHOD, AND SCREENING METHOD OF
MEDICINE FOR BRAIN TUMOR USING THE MODEL
<130> ZDP213038
<160> 11
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<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA target sequence Trp53
<400> 1
ggtgtaatag ctcctgcatg g 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA target sequence Trp53
<400> 2
ggctaccacg cgccttccta cc 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA target sequence Trp53
<400> 3
ggtggtatac tcagagccgg cc 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA target sequence Trp53
<400> 4
ggtatactca gagccggcct g 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA target sequence PTEN
<400> 5
ggttggtcaa gatcttcaca ga 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA target sequence PTEN
<400> 6
ggagaggccc tagattttta tg 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA target sequence PTEN
<400> 7
ggtctgtgaa gatcttgacc aa 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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ggtgataagt tctagctgtg gt 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA target sequence PTEN
<400> 9
ggtgtcatct tcacttagcc at 22
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA target sequence PTEN
<400> 10
ggcagcaatt cactgtaaag c 21
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA target sequence LacZ
<400> 11
ggtgcgaata cgcccacgcg at 22
Claims (16)
- 피질 영역에 뇌 종양을 갖는 형질전환 동물을 제조하는 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법으로서,
(a) EGFR 녹아웃 동물을 준비하는 단계;
(b) Trp53 및 Pten을 녹아웃하는 벡터를 준비하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 제조된 벡터를 (a) 단계에서 제조된 동물의 뇌실하영역에 전기천공법을 이용하여 주입하는 단계;
를 포함하고,
상기 벡터는 상류에 GFAP 프로모터가 작동 가능하게 연결된 Cre 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하고,
상기 Trp53을 표적하는 sgRNA 염기 서열은 서열번호 2 내지 서열번호 4로 표시되는 염기 서열 중 어느 하나 이상으로 이루어진 염기 서열인 것을 특징으로 하고,
상기 Pten을 표적하는 sgRNA 염기 서열은 서열번호 6 내지 서열번호 10으로 표시되는 염기 서열 중 어느 하나 이상으로 이루어진 염기 서열인 것을 특징으로 하며,
상기 뇌 종양 동물 모델은, 인간 뇌실하영역의 GFAP-양성 신경줄기세포(GFAP- positive neural stem cell)로부터 교모세포종(Gliablastoma)이 발생하는 인간 환자의 현상을 반영하는 것을 특징으로 하는 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법.
- 제1항에 있어서,
(d) 상기 (c) 단계를 통해 벡터가 주입된 동물에 개두술을 수행하여 뇌 피질을 절제하는 단계;
를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 동물은 마우스, 햄스터, 랫트, 기니 피그, 토끼, 돼지 및 개로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 뇌 종양은 교모세포종인 것을 특징으로 하는 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법에 의해 제조된 뇌 종양 동물 모델.
- 제5항에 있어서,
상기 뇌 종양은 교모세포종인 것을 특징으로 하는 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법에 의해 제조된 뇌 종양 동물 모델.
- 제5항에 있어서,
상기 뇌 종양은 재발암인 것을 특징으로 하는 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법에 의해 제조된 뇌 종양 동물 모델.
- 제7항에 있어서,
상기 재발암은 개두술 후 재발되어 절제 부위에 국소적으로 종양이 다시 발생되는 것을 특징으로 하는 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법에 의해 제조된 뇌 종양 동물 모델.
- 제5항에 있어서,
상기 동물은 마우스, 햄스터, 랫트, 기니 피그, 토끼, 돼지 및 개로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 뇌 종양 동물 모델의 제조 방법에 의해 제조된 뇌 종양 동물 모델.
- 제5항의 뇌 종양 동물 모델을 준비하는 단계; 및
상기 준비된 뇌 종양 동물 모델에 뇌 종양 치료 후보 물질을 투여한 후 뇌종양 경감 또는 치료 여부를 확인하는 단계;
를 포함하는 뇌 종양 동물 모델을 이용한 뇌 종양 치료제의 스크리닝 방법.
- 제10항에 있어서,
상기 뇌 종양은 재발암인 것을 특징으로 하는 뇌 종양 동물 모델을 이용한 뇌 종양 치료제의 스크리닝 방법.
- 제10항에 있어서,
상기 뇌 종양의 경감 또는 치료 여부를 확인하는 단계는 NeuN, nestin, GFAP, OliG2, S100b, MBP 및 Ki67로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 마커의 유전자 또는 단백질을 측정하여 수행하는 것을 특징으로 하는 뇌 종양 동물 모델을 이용한 뇌 종양 치료제의 스크리닝 방법. - 삭제
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|---|---|---|---|---|
| CN116218914A (zh) * | 2023-03-28 | 2023-06-06 | 武汉大学 | 一种构建肿瘤复发动物模型的方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102138131B1 (ko) * | 2018-02-06 | 2020-07-27 | 한국과학기술원 | 뇌 종양 동물 모델 및 이의 제조 방법 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101838394B1 (ko) * | 2016-08-29 | 2018-03-14 | 연세대학교 산학협력단 | 뇌실하 영역의 돌연변이 유전자를 이용한 교모세포종 조직 기원의 예측 방법 및 동물 모델 |
| KR20180037449A (ko) * | 2016-10-04 | 2018-04-12 | 주식회사 에이치바이온 | 뇌종양 동물모델 및 이의 용도 |
-
2021
- 2021-09-17 KR KR1020210125143A patent/KR102685685B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102138131B1 (ko) * | 2018-02-06 | 2020-07-27 | 한국과학기술원 | 뇌 종양 동물 모델 및 이의 제조 방법 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Brain Pathol. vol.19 no.1 pp.132-143(2009.01.31.)* |
| J Control Release vol.319 pp.311-321(2020.01.03.)* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20230041475A (ko) | 2023-03-24 |
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