JP2013081480A - 標的化された細胞死 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】神経障害の病因および、特に、ニューロン脱髄の解明は、効果的な動物モデルの継続的欠如によって妨げられてきた。かくして、ニューロン障害のための治療剤に対するスクリーニングを行うための組成物および方法に対する緊急の要望が存在する。本発明は、神経障害を研究するための組成物および方法を提供する。本明細書中に提供される組成物および方法は、治療および/または診断潜在能力の薬剤をスクリーニングするのに特に有用である。
【選択図】なし
Description
の進行性劣化によって引き起こされる。
役割を演じているが、それらはプロテアーゼ、サイトカイン、および酸化窒素(NO)のようなフリーラジカルを含めた炎症メディエーターも放出する。最後に、抗体および補体もまた、急性炎症の間に軸索損傷において役割を演じ得る。抗ガングリオシド抗体のレベルは、二次的な進行性またはRRMSにおけるよりも一次的進行性MS(PPMS)において有意に高いことが判明し、脱髄後に補体に暴露された軸索は、補体カスケードを直接的に活性化し得る。
え核酸分子を提供し、ここに、前記核酸配列は神経細胞特異的調節エレメントに作動可能に連結されている。また、核酸配列は、GFPまたは他の蛍光マーカーのようなマーカー蛋白質をコードする第2の核酸配列に作動可能に連結できる。また、本発明は、細胞死メディエーター蛋白質(CDMP)をコードする核酸配列を含む組換え核酸分子を含む宿主細胞も提供し、ここに、前記核酸配列は神経細胞特異的調節エレメントに作動可能に連結されている。前記宿主細胞は神経細胞または壁細胞であり得、例えば、それはニューロン細胞または神経膠細胞で有り得る。例えば、神経膠細胞は、乏突起神経膠細胞、神経膠星状細胞、小神経膠細胞またはシュワン細胞であり得る。ニューロン細胞は頸部神経節ニューロン、皮質ニューロン、セロトニンニューロン、後根神経節、結節性神経節ニューロン、脊髄運動ニューロン、中脳ドーパミン作動性ニューロン、中枢ノルアドレナリン作動性ニューロンまたは腸ニューロンであり得る。壁細胞は内皮細胞、血管周囲細胞または平滑筋細胞であり得る。いくつかの実施形態において宿主細胞はBまたはTリンパ球のような免疫細胞であり得る。
DGFR−β、またはスルファチド遺伝子からのものであり得る。
引用による援用
本明細書中で言及された全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が引用により援用されることが具体的かつ個々に意図されているのと同等の程度まで引用によりここに援用される。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
細胞死メディエーター蛋白質(CDMP)をコードする核酸配列を含む組換え核酸分子であって、ここで、前記核酸配列は神経細胞特異的調節エレメントに作動可能に連結されている、組換え核酸分子。
(項目2)
前記CDMPがカスパーゼ2、カスパーゼ5、カスパーゼ8、カスパーゼ9、カスパーゼ10、またはカスパーゼ11である、項目1記載の組換え核酸分子。
(項目3)
前記CDMPが、FK506型リガンド、FKBP12型リガンド、サイクロスポリンA型リガンド、テトラサイクリンまたはステロイドリガンドについての結合ドメインを含むキメラ蛋白質である、項目1記載の組換え核酸分子。
(項目4)
前記CDMPの発現が誘導性である、項目1記載の組換え核酸分子。
(項目5)
前記CDMPのアポトーシス促進活性が誘導性である、項目1記載の組換え核酸分子。(項目6)
前記活性が二量体化化学誘導因子(CID)によって誘導される、項目5記載の組換え核酸分子。
(項目7)
前記CDMPが誘導性カスパーゼ9(iCP9)である、項目5記載の組換え核酸分子。
(項目8)
前記CIDがAP20187である、項目6記載の組換え核酸分子。
(項目9)
前記神経細胞特異的調節エレメントが神経膠細胞特異的調節エレメントである、項目1記載の組換え核酸分子。
(項目10)
前記神経膠細胞が乏突起神経膠細胞、神経膠星状細胞、小神経膠細胞、またはシュワン細胞である、項目1記載の組換え核酸分子。
(項目11)
前記神経膠細胞特異的調節エレメントがCC1、ミエリン塩基性蛋白質(MBP)、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ(CGT)、プロテオリピド蛋白質(PLP)、乏突起神経膠細胞−ミエリン糖蛋白質(OMG)、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ(CNP)、NOGO、ミエリン蛋白質ゼロ(MPZ)、末梢ミエリン蛋白質22(PMP22)、蛋白質2(P2)、GFAP、AQP4、PDGFR−α、PDGF−α、RG5、P糖蛋白質、ニュールツリン(neurturin)(NRTN)、アルテミン(ARTN)、ペルセフィン(PSPN)、PDGFR−β、またはスルファチド遺伝子からのものである、項目9記載の組換え核酸分子。
(項目12)
細胞死メディエーター蛋白質(CDMP)をコードする核酸配列を含む組換え核酸分子を含む宿主細胞であって、ここで、前記核酸配列は神経細胞特異的調節エレメントに作動可能に連結されている、宿主細胞。
(項目13)
前記CDMPがカスパーゼ2、カスパーゼ5、カスパーゼ8、カスパーゼ9、カスパーゼ10、またはカスパーゼ11である、項目12記載の宿主細胞。
(項目14)
前記CDMPがFK506型リガンド、FKBP12型リガンド、サイクロスポリンA型リガンド、テトラサイクリンまたはステロイドリガンドについての結合ドメインを含むキメラ蛋白質である、項目12記載の宿主細胞。
(項目15)
前記CDMPの発現が誘導性である、項目12記載の宿主細胞。
(項目16)
前記CDMPのアポトーシス促進活性が誘導性である、項目12記載の宿主細胞。
(項目17)
前記活性が二量体化化学誘導因子(CID)によって誘導される、項目16記載の宿主細胞。
(項目18)
前記CDMPが誘導性カスパーゼ9(iCP9)である、項目12記載の宿主細胞。
(項目19)
前記CIDがAP20187である、項目17記載の宿主細胞。
(項目20)
前記神経細胞特異的調節エレメントが神経膠細胞特異的調節エレメントである、項目12記載の宿主細胞。
(項目21)
前記神経膠細胞が乏突起神経膠細胞、神経膠星状細胞、小神経膠細胞、またはシュワン細胞である、項目20記載の宿主細胞。
(項目22)
前記神経膠細胞特異的調節エレメントがCC1、ミエリン塩基性蛋白質(MBP)、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ(CGT)、プロテオリピド蛋白質(PLP)、乏突起神経膠細胞−ミエリン糖蛋白質(OMG)、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ(CNP)、NOGO、ミエリン蛋白質ゼロ(MPZ)、末梢ミエリン蛋白質22(PMP22)、蛋白質2(P2)、GFAP、AQP4、PDGF−α、RG5、P糖蛋白質、ニュールツリン(NRTN)、アルテミン(ARTN)、ペルセフィン(PSPN)、PDGFR−β、PDGFR−α、またはスルファチドから選択される遺伝子からのものである、項目20記載の宿主細胞。
(項目23)
前記宿主細胞が神経細胞または壁細胞である、項目12記載の宿主細胞。
(項目24)
前記宿主細胞が神経膠細胞である、項目23記載の宿主細胞。
(項目25)
前記神経膠細胞が乏突起神経膠細胞、神経膠細胞星状細胞、小神経膠細胞、またはシュワン細胞である、項目24記載の宿主細胞。
(項目26)
CDMPをコードする前記核酸配列が前記宿主細胞のゲノムに組み込まれる、項目12記載の宿主細胞。
(項目27)
CDMPをコードする前記核酸配列がエピソームのものである、項目12記載の宿主細胞。
(項目28)
前記組換え核酸分子がウイルスベクターによって前記宿主細胞に送達される、項目12記載の宿主細胞。
(項目29)
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、項目28記載の宿主細胞。
(項目30)
細胞型特異的発現調節エレメントに作動可能に連結された細胞死メディエーター蛋白質(CDMP)をコードするヌクレオチド配列を含むトランスジェニック動物であって、ここで、前記動物は前記ヌクレオチド配列を含まない動物と比較してより大きな程度の神経障害を呈する、トランスジェニック動物。
(項目31)
前記動物が哺乳動物、霊長類、またはげっ歯類である、項目30記載の動物。
(項目32)
前記動物がマウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、チンパンジーまたはサルである、項目30記載の動物。
(項目33)
前記神経障害がニューロン脱髄および/または血液脳関門における欠陥を含む、項目30記載の動物。
(項目34)
前記動物が対照動物の場合と比較してアポトーシス乏突起神経膠細胞または血管周囲細胞の増加を呈する、項目30記載の動物。
(項目35)
前記CDMPがカスパーゼ2、カスパーゼ5、カスパーゼ8、カスパーゼ9、カスパーゼ10またはカスパーゼ11である、項目30記載の動物。
(項目36)
前記CDMPがFK506型リガンド、FKBP12型リガンド、サイクロスポリンA型リガンド、テトラサイクリンまたはステロイドリガンドについての結合ドメインを含むキメラ蛋白質である、項目30記載の動物。
(項目37)
前記CDMPの発現が誘導性である、項目30記載の動物。
(項目38)
前記CDMPの発現が中枢神経系に異所的に制限される、項目30記載の動物。
(項目39)
前記CDMPのアポトーシス促進活性が誘導性である、項目30記載の動物。
(項目40)
前記アポトーシス促進活性が、特異的に、前記動物の神経細胞におけるものである、項目39記載の動物。
(項目41)
前記活性が二量体化化学誘導因子(CID)によって誘導される、項目39記載の動物。
(項目42)
前記CDMPが誘導性カスパーゼ9(iCP9)である、項目39記載の動物。
(項目43)
前記CIDがAP20187である、項目41記載の動物。
(項目44)
前記細胞型特異的発現調節エレメントが神経または壁細胞特異的調節エレメントである、項目30記載の動物。
(項目45)
前記神経細胞特異的調節エレメントが神経膠細胞特異的調節エレメントである、項目44記載の動物。
(項目46)
前記神経膠細胞が乏突起神経膠細胞、神経膠星状細胞、小神経膠細胞、またはシュワン細胞である項目45記載の動物。
(項目47)
前記神経膠細胞特異的調節エレメントがCC1、ミエリン塩基性蛋白質(MBP)、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ(CGT)、プロテオリピド蛋白質(PLP)、乏突起神経膠細胞−ミエリン糖蛋白質(OMG)、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ(CNP)、NOGO、ミエリン蛋白質ゼロ(MPZ)、末梢ミエリン蛋白質22(PMP22)、蛋白質2(P2)、GFAP、AQP4、PDGFα、RG5、P糖蛋白質、ニュールツリン(NRTN)、アルテミン(ARTN)、ペルセフィン(PSPN)、PDGFR−α、PDGFR−β、またはスルファチドから選択される遺伝子からのものである、項目45記載の動物。
(項目48)
前記核酸配列がマーカー蛋白質をコードする第2の核酸配列に作動可能に連結されている、項目30記載の動物。
(項目49)
脱髄または血液脳関門障害に関連する現象を調節する生物活性剤についてスクリーニングする方法であって;
a)候補剤を、細胞死メディエーター蛋白質(CDMP)をコードする核酸を含む細胞
と接触させる工程であって、ここで、前記核酸は細胞型特異的発現調節エレメントに作動可能に連結されている工程;
b)前記現象に対する効果を検出する工程;
c)前記CDMPの活性のレベルが対照細胞と比べて調節されている場合、前記薬剤を前記現象を調節するのに効果的であるとして選択する工程
を含む、方法。
(項目50)
前記細胞が神経細胞、神経膠細胞または壁細胞である、項目49記載の方法。
(項目51)
前記細胞が乏突起神経膠細胞、神経膠星状細胞、小神経膠細胞、血管周囲細胞、またはシュワン細胞である、項目49記載の方法。
(項目52)
脱髄または血液脳関門障害に関連する現象を調節する生物活性剤についてスクリーニングする方法であって;
a)非−ヒトトランスジェニック動物に候補剤を投与する工程であって、ここで、前記現象は、細胞死メディエーター蛋白質(CDMP)をコードする核酸配列の発現に際して前記動物で起こり;ここで、前記核酸配列の発現は細胞特異的発現調節エレメントによって調節される工程;
b)前記CDMPを活性化して、前記動物における少なくとも1つの細胞においてアポトーシスをもたらす工程であって、ここで、前記細胞は脱髄または血液脳関門障害に関連する工程;
c)前記現象における前記薬剤の効果を検出する工程
を含む、方法。
(項目53)
工程b)後に、前記動物を前記現象から回復させる、項目52記載の方法。
(項目54)
前記現象が、前記動物における乏突起神経膠細胞、神経膠星状細胞、血管周囲細胞、シュワン細胞の喪失によって特徴付けられる、項目52記載の方法。
(項目55)
前記現象が髄鞘形成軸索の減少、または血液脳関門透過性の増加によって特徴付けられる、項目52記載の方法。
(項目56)
前記調節エレメントがCC1、ミエリン塩基性蛋白質(MBP)、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ(CGT)、乏突起神経膠細胞−ミエリン糖蛋白質(OMG)、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ(CNP)、NOGO、ミエリン蛋白質ゼロ(MPZ)、末梢ミエリン蛋白質22(PMP22)、蛋白質2(P2)、GFAP、AQP4、PDGFα、RG5、P糖蛋白質、ニュールツリン(NRTN)、アルテミン(ARTN)、ペルセフィン(PSPN)、スルファチド、PDGFR−β、PDGFR−α、またはプロテオリピド蛋白質(PLP)遺伝子から選択される遺伝子からのものである、項目49または52記載の方法。
(項目57)
前記脱髄障害が多発性硬化症である、項目52記載の方法。
(項目58)
前記効果を決定することがPCR、イムノアッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイまたはそれらの組合せを含む、項目49または52記載の方法。
(項目59)
前記候補剤がアンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、抗体、リポソーム、低分子干渉RNA、低分子有機化合物または無機化合物である、項目49または52記載の方法。
(項目60)
前記少なくとも1つの細胞が、ニューロン細胞、神経膠細胞または壁細胞である、項目52記載の方法。
(項目61)
前記少なくとも1つの細胞が乏突起神経膠細胞、神経膠星状細胞、小神経膠細胞、血管周囲細胞、またはシュワン細胞である、項目60記載の方法。
(項目62)
前記CDMPがカスパーゼ2、ガスパーゼ5、ガスパーゼ8、カスパーゼ9、カスパーゼ10またはカスパーゼ11である、項目49または52記載の方法。
(項目63)
前記CDMPがFK506型リガンド、FKBP12型リガンド、サイクロスポリンA型リガンド、テトラサイクリンまたはステロイドリガンドについての結合ドメインを含むキメラ蛋白質である、項目49または52記載の方法。
(項目64)
前記CDMPの発現が誘導性である、項目49または52記載の方法。
(項目65)
前記CDMPのアポトーシス促進活性が誘導性である、項目49または52記載の方法。
(項目66)
前記活性が二量体化化学誘導因子(CID)によって誘導される、項目65記載の方法。
(項目67)
前記CDMPが誘導性カスパーゼ9(iCP9)である、項目49または52記載の方法。
(項目68)
前記CIDがAP20187である、項目67記載の方法。
(項目69)
多発性硬化症(MS)または多発性硬化症に関連するMS関連疾患に関連する現象を特徴付けるためのプロファイルデータセットを編集する方法であって:
a)細胞死メディエーター蛋白質(CDMP)をコードする核酸を含むトランスジェニック動物または細胞を供する工程であって、ここで、前記核酸はニューロンまたは神経膠細胞特異的発現調節エレメントに作動可能に連結されている工程;
b)前記CDMPを活性化し、それによりアポトーシスを誘導する工程;
c)前記活性化に続いて少なくとも1つの生存するニューロン細胞または神経膠細胞を得る工程;
d)前記生存する神経膠細胞または神経細胞におけるRNA転写物および/またはコードされる産物をプロファイルし、それにより多発性硬化症または多発性硬化症に関連するMS−関連障害に関連する現象を特徴付けるプロファイルデータセットを編集する工程
を含む、方法。
(項目70)
前記CDMPがカスパーゼ9またはカスパーゼ11である、項目69記載の方法。
(項目71)
前記CDMPのアポトーシス誘導活性が誘導性である、項目69記載の方法。
(項目72)
前記神経膠細胞特異的発現調節エレメントがCC1、ミエリン塩基性蛋白質(MBP)、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ(CGT)、およびプロテオリピド蛋白質(PLP)、CC1、ミエリン塩基性蛋白質(MBP)、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ(CGT)、乏突起神経膠細胞−ミエリン糖蛋白質(OMG)、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ(CNP)、NOGO、ミエリン蛋白質ゼロ(MPZ)、末梢ミエリン蛋白質22(PMP22)、蛋白質2(P2)、GFAP、AQP4、PDGFα、PDGFR−β、PDGFR−α、RG5、P糖蛋白質、ニュールツリン(NRTN)
、アルテミン(ARTN)、ペルセフィン(PSPN)、スルファチド、またはプロテオリピド蛋白質(PLP)遺伝子からなる群のものである、項目69記載の方法。
一般的な技術
本発明の実施は、特に断りのない限り、当業者の技量内にある、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミックスおよび組換えDNAの慣用的な技術を使用する。Sambrook,Fritsch and Maniatis,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,第2版(1989);CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel,ら編,(1987));METHODS IN ENZYMOLOGYのシリーズ(Academic Press Inc.);PCR2:A
PRACTICAL APPROARCH(M.J.MacPherson,B.D.
Hames and G.R.Taylor編(1995)),Harlow and Lane編(1988)ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL,and ANIMAL CELL CULTURE (R.I.Freshney編(1987))参照。
定義
明細書および特許請求の範囲で用いるように、単数形「ある」、および「前記」は文脈が明瞭にそうでないことを指示するのでなければ、複数への言及を含む。例えば、用語「ある細胞」はその混合物を含めた複数の細胞を含む。
ペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質に翻訳されているプロセスをいう。転写物およびコードされたポリペプチドは、集合的に、「遺伝子産物」といわれる。もしポリヌクレオチドがゲノムDNAに由来するならば、発現は、真核生物細胞におけるmRNAのスプライシングを含むことができる。
細胞死メディエーター蛋白質(CDMP)
本発明は、細胞または組織特異的に発現された細胞死メディエーター蛋白質(CDMP)を含む方法および組成物を提供する。例えば、発現はCNSまたはPNSに対して、あるいは特異的神経細胞または壁細胞に対して特異的であってよい。発現は動物におけるも
のであり得るが、動物におけるそのような発現は、例えば、髄鞘形成または髄鞘再形成において役割を持つ細胞において特異的に細胞死を誘導することによって脱髄を引き起こすことができる。発現はインビトロでもあり得る。細胞死メディエーター蛋白質の発現は、インビボまたはインビトロにて誘導性であり得る。
二量体化
いくつかの実施形態において、二量体化は生物学的プロセス(例えば、カスパーゼ9の活性化を介するアポトーシス)を活性化し、種々のキメラ蛋白質を利用することができる。キメラ蛋白質は、種々のドメインが(例えば、天然では一緒に連結しては見出されない異なる源に由来する)相互に対して異種である点で組換体である。天然では直接的に相互に連結しては見出されない、例えば、特定のドメインまたは発現制御配列をコードする異種成分を含む組換えDNA構築体は、インビトロまたはインビボにて標的宿主細胞を遺伝子工学的に作成するのに用いられる。そのように操作された細胞は、少なくとも1つのそのようなキメラ蛋白質、またはキメラ蛋白質をコードする遺伝子構築体の第1のシリーズを含有する。1つのそのようなDNA構築体は、(b)異種のさらなる(「作用」)蛋白質ドメインに融合した(a)(選択されたリガンドに結合することができる)少なくとも1つの受容体ドメインを含むキメラ蛋白質をコードする。前記リガンドは、好ましくは、ほぼ10−6から<10−9までの範囲のKd値でもって、キメラ蛋白質内の2(またはそれ以上)の受容体ドメインに結合することができ、好ましくは、ほぼ1kDa、5kDa、10kDa、15kDaまたは20kDa未満の分子量を有する非蛋白質の化合物である。そのようにオリゴマー化されたキメラ蛋白質受容体のドメインは同一または異なってもよい(すなわち、ホモ二量体化またはヘテロ二量体化)。リガンドへの暴露および受容体のオリゴマー化に際して、キメラ蛋白質は生物学的プロセス(例えば、補体カスケード)を開始することができる。コードされたキメラ蛋白質は、さらに、キメラ蛋白質を所望の細胞区画に向けることができる細胞内標的化ドメイン(例えば、蛋白質に指令して核と会合させる配列)を含むことができる。
Biochem.Mol.Biol.(2002)35:94−105)。
調節された発現
本発明の種々の態様において、細胞または組織特異的および/または誘導性発現調節エレメントは細胞死メディエーター蛋白質に作動可能に連結されて、発現に際して選択的な細胞死をもたらす。前記したように、組織特異的および細胞特異的調節配列が、中枢神経系において導入遺伝子を発現させるために入手可能である。調節配列は、特定の細胞型において中枢神経系または末梢神経系での導入遺伝子の異所性発現を可能とする。例えば、選択的死滅は、限定されるものではないが、乏突起神経膠細胞、小神経膠細胞、シュワン細胞または神経膠星状細胞のような細胞において達成することができる。
用いられる「可逆性」Tet系を含めることによって、真核生物細胞における遺伝子発現の密接な制御を提供することができる。これらの系は、例えば、Gossen and Bujard(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1992)89:5547)において、および、Pujardらによる米国特許第5,464,758号;同第5,650,298号;および同第5,589,362号に開示されている。
トランスジェニック動物
本発明の1つの態様において、目的の蛋白質をコードする遺伝子に作動可能に連結された神経細胞特異的調節エレメントをコードするトランスジェニックヌクレオチド配列がゲノムに安定に組み込まれたトランスジェニック動物が生成される。前記遺伝子の発現は誘導性プロモーターの制御下とすることができる。いくつかの実施形態において、細胞特異性は神経細胞(例えば、神経膠細胞、好ましくは神経膠星状細胞、乏突起神経膠細胞および/またはシュワン細胞;頸部神経節ニューロン、後根神経節細胞、結節性神経節ニューロン、脊髄運動ニューロン、中脳ドーパミン作動性ニューロン、中枢ノルアドレナリン作動性ニューロンおよび腸ニューロンのようなニューロン細胞)に対するものである。
調節エレメントに作動可能に連結された細胞死メディエーター蛋白質(CDMP)をコードするヌクレオチド配列を含むことができ;ここで、動物は、細胞型特異的発現調節エレメントに作動可能に連結されたCDMPをコードするヌクレオチド配列がない動物に対してより大きな程度の神経障害を呈する。神経障害は多発性硬化症のようなニューロン脱髄であり得る。トランスジェニック動物は、対照動物のそれに対してアポトーシス乏突起神経膠細胞の増加を呈することができ、CDMPの発現は中枢神経系に異所的に制限することができる。いくつかの実施形態において、神経障害は、血液脳関門の欠陥によるものであり、またはBBBおよび脱髄双方の欠陥によるものである。例えば、神経障害は筋委縮性側索硬化症(ALS)、多発性硬化症(MS)、免疫機能不全筋肉中枢神経系破壊、筋ジストロフィ(MD)、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、脳虚血症、脳性麻痺、皮質基底神経節変性、クロイツェルフェルト・ヤコブ症候群、ダンディー・ウォーカー症候群、認知症、血管性脳炎、脳脊髄炎、癲癇、本態性振せん、クル・ランダウ・クレッフナー症候群、レーヴィ体病、マチャド・ジョセフ病、メージ症候群、偏頭痛障害、ポリオ、多系統萎縮症、髄膜炎、ドラガー症候群、チューレット症候群、ハレルフォルデン・シュパッツ症候群、水頭症、オリーブ橋小脳萎縮、核上麻痺、または脊髄空洞症であり得る。
しいモデルの非限定的例は、ラット、マウス、モルモット、ネコ、イヌ、ウサギ、ブタ、チンパンジー、およびサルである。テスト動物は野生型またはトランスジェニックであり得る。1つの実施形態において、動物はげっ歯類である。なおさらなる実施形態において、動物はマウスである。もう1つの実施形態において、動物はサル種である。なおさらなる実施形態において、動物は、神経学的疾患を調べるのに通常利用されるキヌザルである(例えば、Eslamboi,A.Brain Res Bull.(2005)68,140−149;Kirikら、Proc.Natl.Acad.Sci.(2004)100:2884−89)。
動物実験
動物モデルを、神経障害現象(例えば、脱髄障害)に関連する標的細胞において選択的
または制御された細胞死をアッセイする本発明の1以上の方法で利用する。前記現象は、髄鞘を有する軸索の減少、乏突起神経膠細胞マーカー、神経膠星状細胞マーカーまたはシュワン細胞マーカーの低下によって特徴付けられる脱髄障害と関連付けることができる。脱髄障害は遺伝的、または病原体またはウイルスによって罹るものであり得る。
かを決定するする工程を含む。
きる。他の実施形態において、テスト動物における細胞特異的マーカー蛋白質の発現を同一動物において種々の時点になした測定値と比較して、ニューロンの死滅または成長の開始または進行を決定する。
シンとしてカテゴリー化することができる。
動細胞ベースのイメージングシステムを含めた、種々の自動/または高スループット機器システムのいずれか1つで容易に検出し、定量される。種々の機器システムが、検出を自動化するために開発されており、Cellomics、Amersham、TTP、Q3DM、Evotec、Universal ImagingおよびZeissによって開発された自動蛍光イメージング、および自動顕微鏡検査システムを含む。光漂白後の蛍光回復(FRAP)および微速度蛍光顕微鏡法は、生きた細胞における蛋白質の移動度を研究するためにやはり用いられてきた。
脱髄
本発明の1つの態様において、本発明の組成物および方法を利用して、全身抗原送達、または免疫応答を開始させるためのアジュバントプライミングの必要性なくして、病巣脱髄を達成する。本発明の種々の実施形態において、細胞特異的な様式での細胞死メディエーター蛋白質の発現は、標的細胞における細胞死および/またはニューロン喪失を誘導するのに利用される。細胞死メディエーター蛋白質の発現および/または活性もまた誘導性であり得る。
には支持する様式で作用するように見える。同様に、神経栄養因子はニューロンの成長および生存を支持する。この群の分子は、限定されるものではないが:神経膠由来神経栄養因子(GDNF)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、脳由来神経栄養因子(BNDF)、神経成長因子(NGF)、NT−3およびNT−4/5を含む。これらの因子は、急性CNS傷害後にアップレギュレートされると考えられている。さらに、乏突起神経膠細胞はニューロンに対する栄養支持を供すると考えられている。PLPを欠如するトランスジェニックマウスにおける、および誕生時における乏突起神経膠細胞前駆体の照射後に、急性MS病巣における乏突起神経膠細胞の喪失を記載するインビボの観察はインビトロ実験によって確証されている。具体的には、乏突起神経膠細胞前駆体細胞またはそれらの馴化培地の、黒質への添加は、ニューロンの生存を有意に増強させた。同様に、視神経乏突起神経膠細胞前駆体細胞またはそれらの培養された培地は、網膜神経節細胞の生存を有意に増強させた。NGF、BDNF、GDNF、ニューレグリンおよびNT−3は、全て、乏突起神経膠細胞の培養した培地において同定されている。
的最近に規定された態様である。証拠は、ニューロンの継続的喪失が患者における不能の蓄積を説明することを示唆する。
細胞ベースのスクリーニングアッセイ
本発明のいくつかの態様において、細胞培養物は、本発明の1以上の方法で利用される。標的細胞は被験体に由来することができ、かつ形質転換され得る(例えば、遺伝子的に修飾された)か、または本発明のトランスジェニック動物は細胞/組織培養物のための源となり得る。もう1つの態様において、本発明の細胞は細胞系に由来する細胞であってよい。
−α、PDGFR−β、またはプロテオリピド蛋白質(PLP)の1以上を含めた群から選択される遺伝子からのものである。
形質導入のために、細胞を、目的の産物を送達する当該分野で公知の種々のベクタービヒクルでトランスフェクトすることができる。従って、種々の実施形態において、本発明の核酸構築体は、やはり、マーカー蛋白質をコードする1以上の配列に作動可能に連結される。
生物活性剤
ニューロン髄鞘再形成を調節するのに有効な生物学的に活性な剤または生物活性剤は、限定されるものではないが、単純なまたは複雑な有機または無機分子、ペプチド、ペプチドミメティック、蛋白質(例えば、抗体)、リポソーム、低分子干渉RNA、またはポリヌクレオチド(例えば、アンチセンス)のような生物学的または化学的化合物を含むことが意図される。
医薬組成物
本発明の方法を用いて、脱髄障害の処置で引き続いて実施できる生物学的に活性な剤を選択することができる。髄鞘再形成を調節するのに有効な選択された生物学的に活性な剤は、脱髄障害を処置するための医薬の調製で用いることができる。1つの態様において、本発明の同定された/選択された生物学的に活性な剤を投与して、細菌およびウイルスのような病原体によって冒されたニューロン脱髄を処置することができる。もう1つの態様において、選択された薬剤を用いて、例えば、橋中央ミエリン溶解およびビタミン欠乏症におけるように、毒性物質によって引き起こされたニューロン脱髄、または身体中への毒性代謝産物の蓄積を処置することができる。なおもう1つの態様において、前記薬剤を用いて、脊髄負傷のような物理的負傷によって引き起こされた脱髄を処置することができる。さらになおもう1つの態様において、前記薬剤を投与して、遺伝的特質を有する障害、限定されるものではないが、白質萎縮症、副腎脳白質ジストロフィー、変性多系統萎縮症、ビンスヴァンガー脳障害、中枢神経系における腫瘍および多発性硬化症を含む遺伝的障害において発現される脱髄を処置することができる。
複製不能のウイルスを生産すること
図1および2は、本明細書中で用いる導入ベクターについての一般的な模式図を描く。第1世代自己不活性化レンチウイルスベクターpLpMGは、サイトメガロウイルスプロモーター配列(pCMV)、ラットミエリン塩基性蛋白質プロモーター(pMBP)の断片、ラット神経膠細胞繊維状酸性蛋白質プロモーター(pGFAP)の断片、または血小板由来成長因子受容体(PDGFR)−アルファプロモーター(pPDGFR)の断片いずれかの挿入によって修飾した。得られたベクター(pLpCMVXMG、pLpMBPXMG、pLpGFAPXMG、pLpPDGFRXMG)は、さらに、鋳型として元来のベクター(David Spencer博士,Baylor Medical Centerの親切な贈り物)を用いてPCRを介して得られたiCP9 cDNA配列の連結によって修飾し、新しいプロモーター配列の下流にクローン化した。
ーター配列から駆動されるだろうからである。また、それは、いずれのプロモーターを用いたかに基づいて遺伝子発現を特定の細胞型に限定し、これは、時間制御様式で系の細胞型特異的除去を与える。
Detection) ELISA Plus(Roche Inc)を行って、ウイルスの種々の希釈物で感染させた細胞をCIDに暴露した後に、培養物におけるアポトーシスのレベルを決定した。該ELISAシステムは、アポトーシスを受けている細胞によって生産されるヒストン−複合体化DNA断片を検出する。該ELISAのデータは、感染、引き続いての遺伝子発現および細胞死の間の相関を示す(図6)。
実施例2:乏突起神経膠細胞の喪失
iCP細胞死系を乏突起神経膠細胞初代細胞培養物に適用し、細胞死の有効性、ならびに時間経過を規定した。第2に、該系を高密度皮質培養物に適用して、MSで起こる乏突起神経膠細胞の急性喪失をモデル化した。
上清に暴露されていない(従って、アポトーシスを受けないはずである)A2B5+細胞を用いて二連で行った。従って、細胞の100%についての死滅までの時間はCIDの添加の後に確立された。
実施例3:高密度混合皮質培養物
高密度混合皮質培養物を、従前に記載されているように、3匹のFischerラットからの大脳皮質の単離後に樹立した。大脳皮質を取り出し、氷冷ハンクスの平衡塩溶液に入れ、遠心し、トリプシンで37°で10分間消化した。組織を遠心し、加熱−不活化胎児ウシ血清およびウマ血清を含有するEarleの塩(Invitrogen)を含む最小必須培地に再懸濁させた。細胞懸濁液を細胞ストレイナーに通し、平板培養した。3時間後に、培地を、B27 Minus AO(Invitrogen)を補足したNeurobasal培地に代える。培養物を7日間維持し、次いで、免疫組織化学染色を行って、培養物の組成を確認した。
実施例4:急性傷害に対するニューロン応答の分析
応答の4つの主なクラス:アポトーシス誘導因子、抗−アポトーシス因子、神経栄養因子および神経栄養関連転写因子を分析する。神経栄養因子の分析は、製造業者のプロトコルに従い、GDNF、CNTF、BNDF、NGF、NT−3およびNT4/5についての市販のELISAアッセイを用いて行う。混合皮質培養物からの24時間上清を記載された時点においてアポトーシス後に収集し、そしてCID投与されていない混合皮質培養物からの上清を収集し、それは対照として役立つ。全ての試料は二連で行い、最終のデータは2つの値の平均を表す。
実施例5:急性乏突起神経膠細胞によって調節されたユニークな分子の同定
乏突起神経膠細胞の急性喪失および慢性不存在は、中枢神経系におけるユニークな病理学的状態を表し、従って、新規な遺伝子はこれらの事象に応答してニューロンでアップレギュレートされ、同定される。これらの遺伝子を検出するためには、マイクロアレイ分析を行う。傷害後種々の時点において、乏突起神経膠細胞の誘導されたアポトーシス後に残る培養物から、RNeasy Miniキット(Qiagen,Valencia,CA)を用いて全RNAを単離する。対照アレイを生じさせるには、CIDを差し控えることによってイン・ビトロにて、乏突起神経膠細胞死に暴露されていない培養物から全RNAを同様に単離する。RNAプロセッシングおよび分析は、標準的なプロトコルを用い、Case Western Medical Schoolのコア施設によって行う。走査された出力ファイルはハイブリダイゼーションアーティファクトについて視覚的に調べられるであろう。アレイを平均強度に対して一定の基準で決め、次いで、Affymetrix Microarray5.0ソフトウエアを用いて分析する。もし発現が対照RNAに対して<1.5倍変化すれば、遺伝子はアップレギュレートされていると考えられる。
い、コンピューターは閾値サイクルについての標準曲線を計算する。平均閾値サイクルは各試料について3つのウエルから計算され、平均TCおよび標準曲線を用いて、試料のmRNAの量を外挿する。各細胞培養物において、mRNAはβ―アクチンmRNAの割合として定量され、対照培養物からの平均割合を比較する。
実施例6−動物モデル
誘導性カスパーゼ9配列を含有する前記したウイルスpΔmbpICP9m/EGFPを成体ラットのCNSに適用して、CNS脱髄のイン・ビボモデルを作成した。ウイルスベクターの投与は、投与の速度(対流性分布)およびウイルス力価に基づく、実質の可変領域における遺伝的情報の有効な導入を可能とした。データは、CNSの領域がレンチウイルスで効果的に感染されることを示した。まず、成体Fischerラットをケタミン塩酸塩(80mg/kg)およびキシラジン(4mg/ml)の腹腔内注射によって麻酔し、定位フレームに入れた。中央頭皮切開を行う。脳実質へのアクセスは、病巣の所望の位置に依存し、種々の所定の座標において、頭蓋を通って右側穿頭孔に設置することによって達成された。標的領域サイズに依存した速度にてNo.32S−ゲージ針を備えた滅菌10μlハミルトンシリンジを用いてレンチウイルスを無血清培地で投与した(ウイルスの対流性分布は0.1ないし0.5μl/分の速度で最も有効である)。送達されたウイルスベクター(例えば、レンチウイルス)の容量は、本明細書中で決定される感染有効性および標的領域のサイズに依存する。注射の後に、針を5分間所定の場所に残し、次いで、次の4分間にわたってゆっくりと引き出す。皮膚を縫合糸を用いて閉じた。
る最初の負ピークから測定される。応答潜時は、刺激の開始および最初のピークの間の時間として測定される。振幅および潜時の値は3つの独立した測定の平均として記録した。これらの測定を、CIDの投与から1、2、7および14日後に反復して、CNS損傷および修復の測定可能なパターンを確立した。急性病巣の免疫組織化学分析。iCP9乏突起神経膠細胞死に関連する細胞変化を評価するために、動物を、CIDの投与後種々の時点で犠牲にした。
実施例7:急性病巣における軸索相互作用およびニューロンアポトーシスの同定
薄い切片を用いて、横断軸索またはアポトーシスニューロンの形態の病巣の部位における病巣ニューロン損傷を検出する。免疫組織化学染色を、抗−アミロイド前駆体蛋白質(APP)抗体を用い、脱髄病巣を含む薄い切片で行う。これは、APPは当該軸索の末端で蓄積するので、軸索の輸送および横断の乱れを同定する。同様に、Bielschowskys銀含浸染色を用いて、ニューロンおよび横断軸索を検出する。固定された切片を予め温められた(40℃)10%硝酸銀で10分間染色し、次いでPBS中で洗浄する。水酸化アンモニウムを硝酸銀溶液に加え、スライドを40℃にて30分間インキュベートし、その時点の後、スライドを発色剤作用溶液(40%ホルムアルデヒド、クエン酸、硝酸溶液)に直接的に1分間入れる。
実施例8:急性脱髄病巣後の離れたニューロン喪失の同定
CNS中の脱髄の結果、病巣を横切る軸索を持つ離れたニューロンの死滅がもたらされるか否かを決定するために、種々の時点において、脊髄の側方束中での脱髄病巣の生成に続いて、対側性赤核においてニューロンを調べる。脊髄における乏突起神経膠細胞死の誘導後におけるラットの赤核中のニューロンの数を、CIDを受けていないウイルスを感染させたラットの赤核における数と比較する。また、TdT−媒介dUTPニック末端−標識アッセイ(TUNELアッセイ,Roche,Indianapolis,IN)を利用して、アポトーシス活性を検出する。これは製造業者のプロトコルに従って薄い切片で
行う。皮質下病巣負荷および脊髄萎縮。広範な脊髄萎縮はMSのよく規定された特徴である。CNSの離れた領域における脱髄事象は脊髄萎縮を誘導し、この誘導は脱髄負荷の程度に関連することを決定する。
実施例9:カスパーゼ−9を発現するトランスジェニック動物
ミエリン塩基性プロモーターの制御下にあるカスパーゼ−9を発現するトランスジェニックマウスは、まず、トランスジェニック標的化ベクター構築体を生じさせることによって作り出される。種々の核酸エレメントを組み込んで、マウスにおけるカスパーゼ−9の発現を確実とする。合成イントロンエレメントを、ベクターに由来するプレ−mRNAの適切なプロセッシングのためにカスパーゼ−9 cDNAの前面に置く。ポリアデニル化シグナルを、mRNAの適切なプロセッシングのためにカスパーゼ−9 cDNAの末端に組み込む。カスパーゼ−9の誘導性発現を可能とするために、2つのLoxP部位(Cre−レコンビナーゼ認識部位)によってフロックスされた停止コドンをミエリン塩基性プロモーターおよび合成イントロンの間に組み込む。このベクターは、ゲノムへのベクターの有効な組込みのために線状化され、マイクロインジェクションによって多数の前核に注射される。注射された前核を偽妊娠FVB/N株マウスに移植する。動物の子供を、注射されたベクターの宿主ゲノムへの組み込みについてスクリーニングする。スクリーニングにおいて陽性と同定された動物の子供を離乳させ、ER−Cre導入遺伝子を含有するトランスジェニックマウスと交配させる。交配からの動物の子供を、カスパーゼ−9およびER−Cre導入遺伝子双方を保有する動物についてスクリーニングする。タモキシフェンを腹腔内に注射してER−Cre導入遺伝子からのCre蛋白質の発現を誘導する。LoxP部位の切り出し、およびミエリン鞘におけるカスパーゼ−9の結果としての発現は、抗−カスパーゼ−9抗体を用いて免疫蛍光染色で確認される。
実施例10:イン・ビボでのアポトーシスの細胞特異的誘導
該系をイン・ビボでテストして、細胞特異的アポトーシスを誘導することができ、および細胞除去のタイミングはそれがイン・ビトロであるように制御されたことを確認した。
この目的で、ウイルスを成体Fischerラットの脳梁に注射し、次いで、3週間後に、CIDを同側脳室に投与した。それから24時間後にラットを犠牲にし、脳を全部摘出し、固定し、分析のために低温切断した。ラットにpLpGFAP(iCP9)MG(GFAPプロモーターは発現を神経膠星状細胞に制限する)およびその後CIDを注射し、24時間後に犠牲にし、ウイルス感染の部位におけるTUNEL陽性染色を示した(というのは、該ベクターは、EGFPの構成的な発現をもたらすので、EGFP陽性細胞によって境界が画定されるからである)。TUNEL(TdT−媒介dUTP−Xニック末端−標識)系は、アポトーシスカスケードの間に断片化されたDNAにタグを加え、標準的に免疫組織化学を用いる標識を可能とした。CIDよりはむしろグリセロールを受ける対照ラットに由来する薄い切片はTUNEL陰性であった。次いで、連続した薄い切片を抗−GFAP抗体で染色して、神経膠星状細胞を同定した。GFAP+細胞は、グリセロールを受ける対照ラットに由来する切片とは対照的に、CIDが投与されたラットに由来する薄い切片におけるウイルス感染の領域で検出されなかった(図10)。これは、イン・ビボにて、iCP9系がCID投与後のみにアポトーシスを誘導し、GFAP+神経膠星状細胞を効果的に除去することを確認した。
実施例11:CNSにおける急性乏突起神経膠細胞アポトーシスに対する細胞応答
脊髄および脳双方におけるラットでの脱髄および修復プロセスは、ケタミン塩酸塩(80mg/kg)、アセプロマジン(2.1mg/kg)、およびキシラジン(4mg/ml)の腹腔内注射によって麻酔され、および定位フレーム(Stoelting Co)に入れられたラットの3日齢子供(P3)を用いることによって規定される。No.26S−ゲージ針を備えた10μlのハミルトンシリンジを、ブレグマの0.5mm前方かつ0.5mm側方の柔軟な頭蓋を0.2mmの深さで通す。無血清培地中の5マイクロリットルのpLpMBP(iCP9)MGウイルス(乏突起神経膠細胞を選択的に除去する)を、No.26S−ケージ針を備えた10μlのハミルトンシリンジを用いて2μl/分の速度で注射する。胸脊髄への注射を受けるラットについては、No.26S−ゲージ針を備えた10μlのハミルトンシリンジを手動で脊髄に通す。次いで、マイクロインジェクションシステム(Harvard Co)によって、脳におけるのと同一速度でウイルスを注射する。注射の後に、針を5分間所定の場所に残し、次いで、次の4分間にわたってゆっくりと引き抜く。
まず、150mlの0.9%NaCl生理食塩水で、次に等容量の氷冷4%パラホルムアルデヒドで経心的に灌流する。次いで、全脳および/または脊髄を摘出し、パラホルムアルデヒド中で少なくとも4時間、後固定し、続いて、組織が容器の底に沈むまで、30%スクロース中で低温保護する。次いで、試料をOCT中で凍結させ、スーパーフロスト+スライド上で10ないし20μmにて低温切断する。この実験を同様に脊髄において反復する。
免疫組織化学。CIDから1、7、14、21及び28日後の動物から由来する組織を、蛍光顕微鏡検査法を用いて調べて、感染の領域を同定する。急性脱髄および引き続いての髄鞘再形成の領域を規定するために、ミエリンの黒色金染色を、各時点において急性乏突起神経膠細胞の死滅の誘導後に薄い切片で行う。この実験における脱髄までの時間は、感染の領域が黒色金で染色されない時点と定義され、およびこの実験における髄鞘再形成までの時間は、黒色金が隣接する影響されていないミエリンと同等な強度で感染の領域を染色する脱髄後の時点と定義され、これを各動物について記され、そして平均および標準偏差を計算する。これらのデータを、対照動物についての脱髄までの時間および髄鞘再形成までの時間と比較する。統計学的解析は行わない。というのは、対照は脱髄/髄鞘再形成すると予測されないからである。しかしながら、これらのデータ点はさらなる実験のための対照として働く。
在である。
実施例12:イン・ビボでの乏突起神経膠細胞の急性喪失に対するニューロンの応答
急性病巣における軸索横断の同定。脱髄病巣は、実施例11に記載したように生じさせる。動物を実施例11からのデータによって決定された時点で犠牲にする。対照ラットに、CIDよりはむしろグリセロールの注射(CIDはグリセロール中で希釈する)を受ける以外は、実験動物と同様にウイルスを注射する。ラットを犠牲にし、記載したように調製する。病巣内の軸索の応答を特徴付けるために、薄い切片を抗−ニューロフィラメント(NF)抗体および抗−アミロイド前駆体蛋白質(APP)で標識する。前者は病巣中の軸索を同定し、他方、後者は軸索の輸送および横断の乱れを同定する。NF+軸索およびAPP陽性軸索を、目での形態計測グリットによって規定された0.01mm2視野を用いてカウントし、100×対物レンズ下でカウントする。脱髄された病巣内の4つの区別される領域をカウントし平均する。
。ラットをCID注射から28日後に犠牲にし、脳および脊髄からの組織を前記したように調製する。分析の時点は変化し得るが、病巣が髄鞘を再形成した後には完了する。対照ラットは同一ウイルス注射を受けるが、P20においてはCIDよりはむしろグリセロールを受ける。前記したように、本実施例においては多病巣である病巣誘導の後に、黒質中のニューロンの完全性をTUNELアッセイおよびニューロンカウンティングを介して調べる。100×対物レンズ下で目での形態計測グリットによって規定された0.01mm2視野当たりの生きたニューロンおよびアポトーシス細胞の数を、同一切片における黒質内の4つの別々の視野から平均し、同様にカウントされた対照動物と比較する。細胞カウントを標準t−検定を用いて比較する。
実施例13:成体ラットでの髄鞘再形成プロセスにおける乏突起神経膠細胞前駆体細胞の役割
OPCを選択的に除去するために、新規なウイルスベクターを記載されたベクター戦略を用いて作成した。細胞の形態学変化に基づき、A2B5標識細胞は、前記したように、pLpPDGFR(iCP9)MGでの感染、およびCID暴露の後にアポトーシスを受ける。パン精製A2B5+細胞(抗体で細胞を捕獲することによってA2B5+を富化した培養物)および並行して成長させたP3由来混合皮質培養物(先に記載された培養物を記載するための方法)を感染させるが、CIDに暴露せず、標識およびELISA研究のための対照として供する。培養物の双方の組を抗−A2B5抗体およびTUNEL染色で染色して、細胞除去の特異性を決定する。A2B5発現はPDGFR−α発現と重複し、イン・ビトロで標識するのがより容易であり、従って、PDGFR−α+細胞の代理マーカーとして役立つ。混合皮質培養物を抗−GFAP(神経膠星状細胞標識)および抗−MBP(乏突起神経膠細胞標識)でやはり染色して、他の細胞型はこのウイルス構築体での感染によって影響されないことを確認する。パン−精製A2B5+細胞培養物を、pLpPDGFR(iCP9)MGウイルスの系列希釈物に暴露し、CIDに暴露する。次いで、(予備的実験に記載された)製造業者のプロトコルに従い、培養物を細胞死検出(Cell Death Detection)Elisa Plus(Roche Inc)システムに付して、アポトーシスレベルを定量する。これは、PDGFR+細胞は感染およびCID暴露の後に除去された唯一の細胞であることを確認する。次いで、全ての培養を三連で行って、再現性を確認する。
iCP9)MG感染の領域内のLPC誘導脱髄病巣の存在は、蛍光顕微鏡検査法を用いて薄い切片上のウイルス感染の領域を同定することによって確認される。引き続いて、EGFP+細胞を含む切片は黒色金で染色され、重ねられた脱髄病巣の存在が確認される。私は、元来のウイルス感染の領域内でLPC病巣を再現性よく私が作成できることを確認するために4匹の動物の使用を提案する。対照はなく、この実験についての統計学的分析はない。
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