KR102673031B1 - 피리미도 피리미디논 화합물 및 그를 포함하는 약제학적 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 PD-L1 발현을 억제하는 효과를 가지는 피리미도 피리미디논 화합물 및 그를 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 피리미도 피리미디논 화합물은 암의 치료 또는 예방에 효과적으로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 피리미도 피리미디논 화합물 및 그를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 PD-L1 발현을 억제하는 효과를 가지는 피리미도 피리미디논 화합물 및 그를 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
PD-1 (Programmed death-1, CD279)은 T 세포 상의 수용체 단백질로, 이는 그의 리간드인 PD-L1 (Programmed death-Ligand 1, CD274) 또는 PD-L2 (Programmed death-Ligand 2, CD273)가 결합하는 경우에 T 세포 수용체로부터 활성화 신호를 억제하는 것으로 알려져 있다. 즉, T 세포의 PD-1 수용체 단백질이 리간드 PD-L1/2와 결합하면 T-세포의 증식, 싸이토카인 분비, 및 세포용해 활성을 포함한 T-세포의 기능적 활성이 감소되어 정상세포를 보호하게 된다. PD-1과 PD-L1/2 상호작용은 감염, 종양 또는 자가면역 질환에서 면역 반응을 하향 조절한다(Keir Me, Butte MJ, Freeman GJ, et al. PD-1 and its ligands in tolerance and immunity. Annu. Rev. Immunol. 2008; 26).
PD-1 및 PD-L1에 대한 항체를 사용한 PD-1/PD-L1 상호작용의 차단은 많은 시스템에서 T 세포 활성화를 회복 및 증대시키는 것으로 밝혀졌다. 흑색종, 비소세포성 폐암, 신장암 등의 암 환자에 있어서 모노클로날 항체를 사용한 PD-1/PD-L1의 결합 억제요법 등이 알려져 있다.
αvβ3-인테그린을 타겟으로 암세포의 PD-L1 발현 및 면역 항암 반응 조절에 대한 연구에서 β3-인테그린-제거된 종양 세포 이식은 일차 종양의 성장을 급격히 감소시키고 그 결과는 PD-L1 발현 감소에 기인함이 밝혀져 β3-인테그린의 저해가 흑색종의 면역 항암제의 효능을 증가시킬 수 있음이 알려졌다(Proc Natl Acad Sci USA., 2019 Oct 1, 116(40), 20141-20150). 종양 억제제로 알려진 망막 모세포종 단백질 RB가 NF-kB 활성 저해작용으로 PD-L1 발현 억제를 통하여 항암 효능을 나타냄이 알려져 있다. 또한, 흑색종 모델에서 커큐민과 아피게닌은 흑색종 세포의 성장 억제 효능을 나타냈으며 특히, 아피게닌은 IFN-γ에 의해 유도되는 PD-L1 발현을 현저히 억제하는 것으로 밝혀졌다. 아울러, EGCG 및 녹차 추출물(GTE)을 전처리한 폐암 세포주 A549에서 IFN-γ에 의해 유도된 PD-L1의 발현이 40 내지 80% 감소되는 것으로 알려져 있다. 한편, 흑색종을 대상으로 면역 항암 효과를 증가시킬 수 있는 키나제 억제제 라이브러리 스크리닝 연구에서, 세포 표면 PD-L1 발현 수준을 50% 이상 감소시키는 약 20 종의 약물 중 레고라페닙(Regorafenib)이 가장 강력한 효과를 나타내는 약물로 확인되었다. 상기 약물은 세포 및 생체내에서 IFN-γ 또는 면역관문차단제(ICB)와 결합했을 때 항 종양 효능을 강력하게 촉진하며 JAK1/2-STAT1 및 MAPK 신호를 강력하게 억제하고 이어서 IFN-γ에 의해 유도되는 PD-L1 및 IDO1 발현을 감소시키는 것으로 알려졌다(Clin Cancer Res., 2019 Jul 15, 25(14), 4530-4541).
단백질 키나제 저해제로서 3,4-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-2-온 유도체는 Abl, BCR-Abl, Bmx, c-Raf, Csk, Fes, FGFR, Flt3, Ikk, IR, JNK, Lck, Mkk, PKC, PKD, Rsk, SAPK, Syk, Trk, RTK, Src, EGFR, IGF, Mek, Ros, Tie2 키나제 활성 저해제로서 공지되어 있으나, 이 유도체의 PD-L1에 미치는 영향에 대해서는 언급되어 있지 않다. 또한 3-페닐-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미디논 유도체가 Src 키나제에 대해 1 내지 5nM(IC50)의 억제 활성을 나타내는 것으로 알려져 있으나 역시 PD-L1에 미치는 영향에 대해서는 언급되어 있지 않다(국제 특허공개 제WO 2005/011597호).
따라서, 항 종양 효능을 위한 PD-L1 발현 억제 활성 효과를 가지는 화합물의 개발이 요구되고 있다.
Annu. Rev. Immunol., 2008, 26
Proc Natl Acad Sci USA., 2019 Oct 1, 116(40), 20141-20150
Clin Cancer Res., 2019 Jul 15, 25(14), 4530-4541
본 발명의 한 목적은 PD-L1 발현을 억제하는 효과를 나타내는 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 화학식 I의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 실시형태는 하기 화학식 I의 피리미도 피리미디논 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염에 관한 것이다.
[화학식 I]
상기 식에서,
R1은 C5-C15의 아릴기, C5-C15의 헤테로아릴기, C3-C10의 시클로알킬기 또는 C3-C10의 헤테로시클로알킬기이고,
R2는 수소, C1-C4의 알킬기 또는 C1-C4의 알콕시기이며,
R3는 수소, 할로겐, C1-C4의 알킬기 또는 C1-C4의 알콕시기이고,
R4는 C1-C4의 알킬기, C1-C4의 할로알킬기 또는 C5-C15의 헤테로아릴기로 치환되거나 치환되지 않은 C5-C15의 아릴기 또는 C5-C15의 헤테로아릴기이다.
본 명세서에서 사용되는 C5-C15의 아릴기는 아로메틱기와 이의 부분적으로 환원된 유도체를 모두 포함한다. 상기 아로메틱기는 탄소수 5 내지 15개로 구성된 단순 또는 융합 고리형이다. 대표적인 아릴기의 예로는 페닐, 나프틸, 테트라하이드로나프틸 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 C5-C15의 헤테로아릴기는 헤테로아로메틱기와 이의 부분적으로 환원된 유도체를 모두 포함한다. 상기 헤테로아로메틱기는 탄소수 5 내지 15개로 구성된 단순 또는 융합 고리형이며, 산소, 황 또는 질소를 하나 이상 포함한다. 대표적인 헤테로아릴기의 예로는 피리디닐(pyridinyl), 푸라닐(furanyl), 싸이오페닐(thiophenyl), 인돌릴(indolyl), 퀴놀리닐(quinolinyl), 이미다졸리닐(imidazolinyl), 옥사졸릴(oxazolyl), 다이하이드로옥사졸릴(dihydrooxazolyl), 싸이아졸릴(thiazolyl) 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 C3-C10의 시클로알킬기는 탄소수 3 내지 10개로 구성된 단순 또는 융합 고리형 탄화수소를 의미하며, 예를 들어 시클로프로필, 시클로뷰틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 등이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 C3-C10의 헤테로시클로알킬기는 탄소수 3 내지 10개로 구성된 단순 또는 융합 고리형 탄화수소의 환 탄소 중 하나 이상이 산소, 황 또는 질소로 치환된 작용기를 의미하며, 예를 들어 싸이아졸리디닐, 옥시라닐 등이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 C1-C4의 알킬기는 탄소수 1 내지 4개로 구성된 직쇄형 또는 분지형의 1가 탄화수소를 의미하며, 예를 들어 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-뷰틸, i-뷰틸, t-뷰틸 등이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 C1-C4의 알콕시기는 탄소수 1 내지 4개로 구성된 직쇄형 또는 분지형 알콕시기를 의미하며, 메톡시, 에톡시, n-프로판옥시 등이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 C1-C4의 할로알킬기는 불소, 염소, 브롬 및 요오드로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 할로겐으로 치환된 탄소수 1 내지 4의 직쇄형 또는 분지형 탄화수소를 의미하며, 예를 들어 트라이플루오로메틸, 트라이클로로메틸, 트라이플루오로에틸 등이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 화학식 I의 화합물은,
R1은 할로겐 또는 히드록시로 치환되거나 치환되지 않은 페닐이고,
R2는 C1-C4의 알킬기이며,
R3는 수소, 할로겐, C1-C4의 알킬기 또는 C1-C4의 알콕시기이고,
R4는 C1-C4의 알킬기, C1-C4의 할로알킬기, 알킬다이하이드로옥사졸릴로 치환되거나 치환되지 않은 페닐, 또는 알킬싸이아졸릴이다.
본 명세서에서 사용되는 알킬다이하이드로옥사졸릴은 하나 이상의 C1-C4의 알킬기로 치환된 다이하이드로옥사졸기를 의미하며, 다이메틸다이하이드로옥사졸릴 등이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 알킬싸이아졸릴은 하나 이상의 C1-C4의 알킬기로 치환된 싸이아졸릴기를 의미하며, t-뷰틸싸이아졸릴 등이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 화학식 I의 화합물은,
R1은 페닐, 플루오로페닐 또는 히드록시페닐이고,
R2는 메틸이며,
R3는 수소, 클로로, 브로모, 메틸 또는 메톡시이고,
R4는 트라이플루오로메틸페닐, t-뷰틸페닐, 다이메틸다이하이드로옥사졸릴페닐 또는 t-뷰틸싸이아졸릴이다.
본 명세서에서 약제학적으로 허용되는 염은 무독성 무기산염 및 유기산염이 모두 포함될 수 있으며, 예를 들어 염산염, 인산염, 황산염, 질산염, 주석산염, 메탄술폰산염, p-톨루엔술폰산염, 아세트산염, 트리플루오로아세트산염, 시트르산염, 말레인산염, 숙신산염, 옥살산염, 벤조산염, 타르타르산염, 푸마르산염, 만데르산염, 프로피온산염, 구연산염, 젖산염, 글리콜산염, 글루콘산염, 갈락투론산염, 글루탐산염, 글루타르산염, 글루쿠론산염, 아스파르트산염, 아스코르브산염, 카본산염, 바닐릭산염, 히드로아이오딕산염, 말산염, 말론산염 등이 포함된다.
본 발명의 화합물 중 대표적인 화합물은 하기 그룹에서 선택된다.
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2-(t-뷰틸)-N-(6-클로로-5-(1-메틸-2-옥소-7-(페닐아미노)-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)싸이아졸-4-카복사마이드 (I-10); 및
N-(6-클로로-5-(7-((4-히드록시페닐)아미노)-1-메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)-3-(트라이플루오로메틸)벤즈아마이드 (I-11).
본 발명의 화학식 I의 화합물의 제조방법을 하기 반응식 1에 나타내었다. 하기 반응식에 기재된 방법은 본 발명에서 대표적으로 사용된 방법을 예시한 것일 뿐 단위조작의 순서, 반응시약, 반응조건 등은 경우에 따라 얼마든지 변경될 수 있다.
[반응식 1]
상기 반응식 1에서, R1, R2, R3 및 R4는 상기 화학식 I에서 정의된 바와 같으며, R5는 할로겐 또는 옥소(=O)이다.
본 발명의 일 실시형태에서, R5는 클로로, 브롬, 요오드 또는 옥소(=O), 특히 클로로 또는 옥소(=O)이다.
상기 반응식 1은 화학식 II의 화합물과 화학식 III의 화합물을 출발물질로 하여 화학식 I의 화합물을 제조하기 위한 4단계의 제조과정을 나타낸다.
제1단계에서는 화학식 II의 화합물과 화학식 III의 화합물을 반응시켜 화학식 IV의 화합물을 수득한다.
이때, R5가 할로겐인 경우에는 유기염기 존재 하에 아민화반응시켜 화학식 IV의 화합물을 수득하고, R5가 옥소(=O)인 경우에는 환원제를 가하여 환원적 아민화반응시켜 화학식 IV의 화합물을 수득한다. 상기 유기염기로는 트라이에틸아민, N,N-다이아이소프로필에틸아민(DIPEA) 등을 사용할 수 있으며, 상기 환원제로는 소듐보로하이드라이드(수소화붕소나트륨, NaBH4), 소듐시아노보로하이드라이드(NaCNBH3), 소듐트라이아세톡시 보로하이드라이드(Na(CH3COO)3BH) 등을 사용할 수 있다.
상기 반응용매로는 아세토나이트릴, 테트라하이드로퓨란, 1,4-다이옥세인, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-다이클로로에탄, 다이메틸포름아미드, 다이메틸아세트아미드, 메틸알콜, 에틸알콜 등을 사용할 수 있으며, 반응온도는 -10 ~ 25℃가 바람직하다.
제2단계에서는 상기 화학식 IV의 화합물에 트라이포스겐을 가하여 헤테로고리 우레아 형성 반응시켜 화학식 V의 화합물을 수득한다. 이때, 상기 헤테로고리 우레아 형성 반응은 유기염기 존재 하에 수행될 수 있다. 상기 유기염기로는 트라이에틸아민, N,N-다이아이소프로필에틸아민(DIPEA) 등을 사용할 수 있다.
상기 반응용매로는 아세토나이트릴, 테트라하이드로퓨란, 1,4-다이옥세인 등을 사용할 수 있으며, 반응온도는 -10 ~ 100℃가 바람직하다.
제3단계에서는 상기 화학식 V의 화합물의 설파이드기를 산화반응시켜 설폰기를 갖는 화학식 VI의 설폰화합물을 수득한다.
상기 산화반응은 산화제로서 옥손, 메타-클로로퍼옥시 벤조산(mCPBA) 등을 사용하여 수행할 수 있다.
상기 반응용매로는 다이클로로메탄, 1,2-다이클로로에탄, 아세토나이트릴, 테트라하이드로퓨란, 1,4-다이옥세인, 물 등을 사용할 수 있으며, 반응온도는 -10 ~ 100℃가 바람직하다.
제4단계에서는 상기 화학식 VI의 화합물에 화학식 VII의 아민 화합물을 치환반응시켜 화학식 I의 화합물을 수득한다.
상기 반응용매로는 아세토나이트릴, 테트라하이드로퓨란, 1,4-다이옥세인, 클로로포름, 다이클로로메탄, 1,2-다이클로로에탄, 에틸아세테이트, 다이메틸포름아미드, 메틸알콜, 에틸알콜 등을 사용할 수 있으며, 치환반응 시 필요에 따라 트라이에틸아민, N,N-다이아이소프로필에틸아민, 피리딘과 같은 유기 염기 또는 무기 염기를 함께 사용하거나 트라이플루오로아세트산과 같은 유기 산을 함께 사용할 수 있고, 반응온도는 50 내지 150℃, 보다 바람직하게는 80℃ 내지 100℃이다.
상기 화학식 II의 화합물 및 화학식 III의 화합물은 공지된 방법에 따라 제조하여 사용하거나 시판되는 제품을 입수하여 사용할 수 있다.
예를 들어, 상기 화학식 II의 화합물 및 화학식 III의 화합물의 제조방법을 하기 반응식 2 내지 4에 각각 나타내었다. 하기 반응식에 기재된 방법은 본 발명에서 대표적으로 사용된 방법을 예시한 것일 뿐 단위조작의 순서, 반응시약, 반응조건 등은 경우에 따라 얼마든지 변경될 수 있다.
[반응식 2]
상기 반응식 2에서, R2는 상기 화학식 I에서 정의된 바와 같으며, R5는 상기 반응식 1에서 정의된 바와 같다.
상기 반응식 2에 도시된 바와 같이, 상기 화학식 II의 화합물은 에틸 4-클로로-2-(메틸싸이오)피리미딘-5-카복실레이트와 화학식 XIII의 아민 화합물을 반응시켜 화학식 VIII의 화합물을 수득하고, 상기 화학식 VIII의 화합물을 리튬 알루미늄 하이드라이드(LiAlH4)와 같은 환원제를 사용하여 환원반응시켜 화학식 IX의 화합물을 수득한 다음, 상기 화학식 IX의 화합물의 알코올기를 싸이오닐 클로라이드(SOCl2) 등을 사용하여 할로겐화하거나 망가니즈 다이옥사이드(MnO2) 등을 사용하여 산화반응시켜 알데하이드화하여 제조할 수 있다.
[반응식 3]
상기 반응식 3에서, R3 및 R4는 상기 화학식 I에서 정의된 바와 같으며, Y는 할로겐 또는 히드록시이다.
본 발명의 일 실시형태에서, Y는 클로로, 브롬, 요오드 또는 히드록시, 특히 클로로 또는 히드록시이다.
상기 화학식 III의 화합물은 상기 반응식 3에 도시된 바와 같이, 화학식 X의 화합물과 화학식 XI의 화합물을 DIPEA와 같은 유기 염기 또는 커플링제의 존재 하에 반응시켜 화학식 XII의 화합물을 수득하고, 상기 화학식 XII의 화합물의 니트로기를 아민기로 환원반응시켜 제조할 수 있다. 이때, 상기 환원반응은 칼륨 t-부톡사이드와 비스(피나콜라토)다이보론을 조합하여 사용하거나, 팔라듐 카본 촉매 하에 수소 기체를 사용하여 수행할 수 있다.
[반응식 4]
상기 반응식 4에서, R3 및 R4는 상기 화학식 I에서 정의된 바와 같으며, Y는 상기 반응식 3에서 정의된 바와 같다.
대안적으로, 상기 화학식 III의 화합물은 상기 반응식 4에 도시된 바와 같이, 화학식 X'의 다이아민 피리딘 화합물과 화학식 XI의 화합물을 DIPEA와 같은 유기 염기 또는 커플링제의 존재 하에 반응시켜 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염은 우수한 PD-L1 발현 억제 활성을 나타낸다(시험예 1).
따라서, 본 발명은 상기 화학식 I의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 프로그램화된 세포사멸 리간드 1(Programmed death-Ligand 1, PD-L1) 억제용 약제학적 조성물, 구체적으로 암의 치료 또는 예방용인 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 화학식 I의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염은 PD-L1의 발현을 억제함으로써 면역 세포의 활성화를 통한 항암 효과를 유도하여, 대장암, 폐암, 유방암, 위암, 자궁경부암, 방광암, 혈액암 또는 비호즈킨스 림프종 등의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 경구적으로(예를 들면, 복용 또는 흡입) 또는 비경구적으로(예를 들면, 주사, 침착, 이식, 좌약) 투여될 수 있으며, 주사는 예를 들면, 정맥주사, 피하주사, 근육내주사 또는 복강내주사일 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 투여 경로에 따라, 정제, 캡슐제, 과립제, 파인 서브틸래(fine subtilae), 분제, 설하 정제, 좌약, 연고, 주사제, 유탁액제, 현탁액제, 시럽제, 분무제 등으로 제형화될 수 있다. 상기 여러 가지 형태의 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 각 제형에 통상적으로 사용되는 약제학적으로 허용되는 담체(carrier)를 사용하여 공지기술에 의해 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예는 부형제, 결합제, 붕해제(disintegrating agent), 윤활제, 방부제, 항산화제, 등장제(isotonic agent), 완충제, 피막제, 감미제, 용해제, 기제(base), 분산제, 습윤제, 현탁화제, 안정제, 착색제 등을 포함한다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 약제의 형태에 따라 다르지만, 본 발명의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 약 0.01 내지 95 중량%로 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물의 구체적인 투여량은 치료되는 사람을 포함한 포유동물의 종류, 체중, 성별, 질환의 정도, 의사의 판단 등에 따라 다를 수 있다. 바람직하게는, 경구투여의 경우에는 하루에 체중 1 kg당 활성성분 0.01 내지 50 mg이 투여되고, 비경구투여의 경우에는 하루에 체중 1 kg당 활성성분 0.01 내지 10 mg이 투여된다. 상기 총 일일 투여량은 질환의 정도, 의사의 판단 등에 따라 한번에 또는 수회로 나누어 투여될 수 있다.
본 발명의 화합물은 PD-L1 발현을 억제하는 효과를 가지므로, 암의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물에 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1은 B16F10 세포로 암을 유발한 마우스에 실시예 화합물 투여 후 시간에 따른 종양 부피 변화를 나타낸 그래프이다.
도 2는 B16F10 세포로 암을 유발한 마우스에 실시예 화합물 투여 후 마우스로부터 적출된 종양의 무게를 나타낸 그래프이다.
도 3은 B16F10 세포로 암을 유발한 마우스에 실시예 화합물 투여 후 마우스로부터 적출된 종양에서 PD-L1의 발현 억제 정도를 웨스턴-블럿을 통해 측정한 결과이다.
도 4는 PD-L1 과발현 세포에 실시예 화합물 처리 후 PD-L1 발현 억제 효능을 웨스턴-블럿을 통해 측정한 결과이다.
도 2는 B16F10 세포로 암을 유발한 마우스에 실시예 화합물 투여 후 마우스로부터 적출된 종양의 무게를 나타낸 그래프이다.
도 3은 B16F10 세포로 암을 유발한 마우스에 실시예 화합물 투여 후 마우스로부터 적출된 종양에서 PD-L1의 발현 억제 정도를 웨스턴-블럿을 통해 측정한 결과이다.
도 4는 PD-L1 과발현 세포에 실시예 화합물 처리 후 PD-L1 발현 억제 효능을 웨스턴-블럿을 통해 측정한 결과이다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오직 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업자에게 있어서 자명하다.
제조예 1: 화학식 II의 화합물의 제조
제조예 1-1: 5-(클로로메틸)-N-메틸-2-(메틸싸이오)피리미딘-4-아민 (II-1)
에틸 4-클로로-2-(메틸싸이오)피리미딘-5-카복실레이트 (10.00 g, 42.98 mmol)를 테트라히드로퓨란 100 mL에 용해하고 트라이에틸아민(7.37 mL, 52.86 mmol)과 메틸아민 40% 용액 (3.54 g, 45.55 mmol)을 가한 후 20 ~ 25℃에서 16시간 동안 교반 하였다. 반응이 종결되면 침전된 염을 여과하고 감압 하에서 용매를 제거한 후, 농축 잔사에 포화 탄산수소나트륨 용액과 에틸아세테이트를 넣고 추출하였다. 유기층을 소금물로 씻어주고 무수 황산나트륨으로 건조시킨 후 감압 농축하여 에틸 4-(메틸아미노)-2-(메틸싸이오)피리미딘-5-카복실레이트 (VIII-1, 8.82 g, 90 %)를 수득하였다.
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 1.37 (t, 3H), 2.55 (s, 3H), 3.09 (d, 3H), 4.33 (q, 2H), 8.18 (bs, 1H), 8.61 (s, 1H)
상기에서 수득한 에틸 4-(메틸아미노)-2-(메틸싸이오)피리미딘-5-카복실레이트 VIII-1 (8.80 g, 38.72 mmol)을 무수 테트라히드로퓨란 200 mL에 용해하고 0℃로 냉각하였다. 1M 리튬알루미늄하이드라이드(116.16 mL, 116.16 mmol)를 천천히 적가하고 20 ~ 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면 반응혼합물에 물 5 mL, 15% 수산화나트륨용액 15 mL, 그리고 다시 물 15 mL를 순차적으로 천천히 적가한 후 반응을 종료시키고 1 시간 동안 교반하였다. 생성된 흰색 침전물을 여과한 후 여액을 에틸아세테이트로 2회 추출하고 유기층을 합하여 소금물로 추출하였다. 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조하고 감압 농축하여 (4-(메틸아미노)-2-(메틸싸이오)피리미딘-5-일)메탄올 (IX-1, 6.00 g, 84 %)를 수득하였다.
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 2.53 (s, 3H), 3.05 (d, 3H), 4.40 (s, 2H), 5.22 (m, 1H), 6.95 (br,1H), 7.96 (s, 1H)
상기에서 수득한 (4-(메틸아미노)-2-(메틸싸이오)피리미딘-5-일)메탄올 IX-1 (5.72 g, 30.88 mmol)을 무수 테트라히드로퓨란 240 mL에 녹여 0℃로 냉각하고 싸이오닐클로라이드 (5.59 mL, 77.19 mmol)를 천천히 적가하고 70℃에서 4시간 교반하였다. 생성된 흰색고체를 여과하여 표제화합물 7.20 g (100 %)를 수득하였다.
제조예 1-2: 4-(메틸아미노)-2-(메틸싸이오)피리미딘-5-카브알데하이드 (II-2)
(4-(메틸아미노)-2-(메틸싸이오)피리미딘-5-일)메탄올 IX-1 (0.74 g, 4.00 mmol)에 다이클로로메탄 15 mL를 가한 후, 망가니즈 다이옥사이드 (3.47 g, 39.95 mmol)를 첨가한 뒤 20 ~ 25℃에서 20 시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면 반응 혼합물을 셀라이트로 여과시킨 후, 감압 하에서 용매를 제거하여 표제화합물 0.67 g (92 %)을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 9.70 (s, 1H), 8.56(bs, 1H), 8.30(s,1H), 3.12 (d, 3H), 2.57(s, 3H)
ES-MS m/z: 184.18 [M+H]+
제조예 2: 화학식 III의 화합물의 제조
제조예 2-1: N-(5-아미노-6-메틸피리딘-3-일)-3-(트라이플루오로메틸)벤즈아마이드 (III-1)
6-메틸-5-나이트로피리딘-3-아민 X-1 (1.00 g, 6.53 mmol)을 다이클로로메탄 50 mL에 용해시킨 후 0℃로 냉각하였다. 반응용액에 3-(트라이플루오로메틸)벤조일 클로라이드 XI-1 (0.97 mL, 6.52 mmol)와 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (3.33 mL, 19.59 mmol)를 첨가한 후 20~25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응이 완결되면 다이클로로메탄과 증류수 그리고 소금물을 사용하여 순차적으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 감압 농축하여 농축잔사를 컬럼크로마토그래피로 정제하여 N-(6-메틸-5-나이트로피리딘-3-일)-3-(트라이플루오로메틸)벤즈아마이드 XII-1 (1.76 g, 83 %)을 수득하였다.
상기에서 수득한 N-(6-메틸-5-나이트로피리딘-3-일)-3-(트라이플루오로메틸)벤즈아마이드 XII-1 (1.16 g, 3.57 mmol)을 메틸알코올 50 mL에 녹이고 10% 팔라듐 카본 0.32 g을 가한 후 수소 대기 하에서 3시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면 반응 혼합물을 셀라이트로 여과하고 메탄올로 세척한 후, 감압 농축하여 표제화합물 1.04 g (99 %)를 수득하였다.
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 2.55 (m, 3H), 4.07 (br, 2H), 6.71(d, 1H), 7.01(s, 1H), 7.29(d, 1H), 7.45(d, 1H), 7.65(t, 1H), 7.85 (s, 1H), 8.02 (d, 1H)
제조예 2-2: N-(5-아미노-6-메틸피리딘-3-일)-3-(t-뷰틸)벤즈아마이드 (III-2)
3-(t-뷰틸)벤조산 (0.6 g, 3.37 mmol)을 다이클로로메탄 20 mL에 현탁 시킨 후 옥살릴클로라이드 (0.58 mL, 6.73 mmol)와 촉매량의 다이메틸포름아미드 1 ~ 2방울을 첨가하여 상온에서 3시간 동안 교반 하였다. 반응 완결 후 반응 용매를 감압 농축한 후 정제 없이 3-(t-뷰틸)벤조일 클로라이드 XI-2 (0.67 g, Quant)를 얻었다.
6-메틸-5-나이트로피리딘-3-아민 X-1 (0.90 g, 5.88 mmol)을 다이클로로메탄 50 mL에 용해시킨 후 0℃에서 상기에서 수득한 3-(t-뷰틸)벤조일 클로라이드 XI-2 (1.15 g, 5.88 mmol)와 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (3.07 mL, 17.63 mmol)를 첨가한 후 20 ~ 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응이 완결되면 다이클로로메탄과 증류수 그리고 소금물을 사용하여 순차적으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 감압 농축하여 농축잔사를 컬럼크로마토그래피로 정제하여 3-(t-뷰틸)-N-(6-메틸-5-나이트로피리딘-3-일)벤즈아마이드 XII-2 (1.39 g, 76 %)을 수득하였다.
ES-MS m/z: 314.25 [M+H]+
상기에서 수득한 3-(t-뷰틸)-N-(6-메틸-5-나이트로피리딘-3-일)벤즈아마이드 XII-2 (1.39 g, 4.44 mmol)을 메틸알코올 40 mL에 녹이고 10% 팔라듐 카본 0.32 g을 가한 후 수소 대기 하에서 3시간 동안 교반 하였다. 반응이 종결되면 반응 혼합물을 셀라이트로 여과하고 메탄올로 세척한 후, 감압 농축하여 표제화합물 III-2 (1.18 g, 94 %)를 수득하였다.
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 1.34(s, 9H), 2.55 (m, 3H), 4.10 (br, 2H), 6.71(s, 1H), 7.21(d, 1H), 7.32(d, 1H), 7.45(d, 1H), 7.65(t, 1H), 7.85 (s, 1H), 8.02 (d, 1H)
ES-MS m/z: 239.31 [M+H]+
제조예 2-3: N-(5-아미노-6-메톡시피리딘-3-일)-3-(트라이플루오로메틸)벤즈아마이드(III-3)
2-메톡시-3,5-다이나이트로피리딘 (0.55 g, 2.76 mmol)을 에틸알코올 20 mL에 용해시킨 후, 6N 염산 (4.00 mL)과 철 (1.30 g)을 가하고 1시간 동안 가열 환류 시켰다. 반응이 종결되면 20~25 ℃로 냉각시킨 후, 5M 수산화나트륨 용액으로 중화한 후 반응 혼합물을 셀라이트로 여과하였다. 여과시킨 용액을 감압 농축하고 에틸아세테이트에 용해시킨 다음, 물로 1회 추출한 후 소금물로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 감압 농축하여 2-메톡시피리딘-3,5-다이아민 X'-1 (0.21 g ,55 %)을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 3.23 (s, 3H), 3.90 (br, 4H), 6.46 (s, 1H), 6.69 (s, 1H)
ES-MS m/z : 140.11 [M+H]+
상기에서 수득한 2-메톡시피리딘-3,5-디아민 X'-1 (0.21 g, 1.51 mmol)을 아세톤 30 mL에 용해시킨 후 0 ℃로 냉각하고, 트라이에틸아민 (0.23 g, 2.27 mmol)과 3-(트라이플루오로메틸)벤조일 클로라이드 XI-1 (0.25 g, 1.21 mmol)를 가하고 20분 동안 교반하였다. 반응이 완결되면 용매를 농축한 후, 에틸아세테이트와 증류수 그리고 소금물을 사용하여 순차적으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 감압 농축한 후 컬럼크로마토 그래피로 정제하여 표제화합물 0.17 g (45%)을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 3.23 (s, 3H), 3.90 (br, 2H), 6.59 (s, 1H), 6.78 (dd, 1H), 7.38 (d, 1H), 7.65 (t, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.82 (d, 1H), 8.10 (s, 1H)
ES-MS m/z: 312.10 [M+H]+
제조예 2-4 : N-(5-아미노-6-메틸피리딘-3-일)-4-(4,4-다이메틸-4,5-다이하이드로옥사졸 -2-일)벤즈아마이드 (III-4)
6-메틸-5-나이트로피리딘-3-아민 Ⅹ-1 (1.00 g, 6.52 mmol)을 다이클로로메탄 50 mL에 용해시킨 후 0 ℃로 냉각하고, N,N-다이아이소프로필에틸아민 (3.41 mL, 19.59 mmol)과 4-(4,4-다이메틸-4,5-다이하이드로옥사졸-2-일)벤조일 클로라이드 XI-3 (1.55 g, 6.52 mmol)를 첨가하고 2시간 동안 교반하였다. 반응이 완결되면 다이클로로메탄과 증류수 그리고 소금물을 사용하여 순차적으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 감압 농축하여 농축 잔사를 컬럼크로마토그래피로 정제하여 4-(4,4-다이메틸-4,5-다이하이드로옥사졸-2-일)-N-(6-메틸-5-나이트로피리딘-3-일)벤즈아마이드 XII-6 (1.99 g, 86 %)을 수득하였다.
ES-MS m/z: 355.25 [M+H]+
상기에서 수득한 4-(4,4-다이메틸-4,5-다이하이드로옥사졸-2-일)-N-(6-메틸-5-나이트로피리딘-3-일)벤즈아마이드 XII-6 (1.95 g, 5.50 mmol)을 메틸알코올 50 mL에 녹이고 10% 팔라듐 카본 0.30 g을 가한 후 수소 대기 하에서 5시간 동안 교반 하였다. 이후 제조예 2-1과 동일한 방법으로 표제화합물 1.64 g (92 %)를 수득하였다.
ES-MS m/z: 325.25 [M+H]+
제조예 2-5 : N-(5-아미노-6-메틸피리딘-3-일)-3-(4,4-다이메틸-4,5-다이하이드로옥사졸-2-일)벤즈아마이드 (III-5)
6-메틸-5-나이트로피리딘-3-아민 Ⅹ-1 (1.00 g, 6.52 mmol)를 테트라하이드로퓨란 60 mL에 용해시킨 후 0 ℃로 냉각하고, N,N-다이아이소프로필에틸아민 (3.41 mL, 19.59 mmol)과 3-(4,4-다이메틸-4,5-다이하이드로옥사졸-2-일)벤조일클로라이드 XI-4 (1.55 g, 6.52 mmol)를 가하고 2시간 동안 교반하였다. 반응이 완결되면 다이클로로메탄과 증류수 그리고 소금물을 사용하여 순차적으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 감압 농축하여 농축잔사를 컬럼크로마토그래피로 정제하여 3-(4,4-다이메틸-4,5-다이하이드로옥사졸-2-일)-N-(6-메틸-5-나이트로피리딘-3-일)벤즈아마이드 XII-7 (1.39 g, 60 %)을 수득하였다.
상기에서 수득한 3-(4,4-다이메틸-4,5-다이하이드로옥사졸-2-일)-N-(6-메틸-5-나이트로피리딘-3-일)벤즈아마이드 XII-7 (1.39 g, 3.92 mmol)을 메틸알코올 30 mL에 녹이고 10% 팔라듐 카본 0.30 g을 가한 후 수소 대기 하에서 3시간 동안 교반 하였다. 이후 제조예 2-1과 동일한 방법으로 표제화합물 1.17 g (92 %)를 수득하였다.
ES-MS m/z : 325.16 [M+H]+
제조예 2-6 : N-(5-아미노-6-메톡시피리딘-3-일)-3-(t-뷰틸)벤즈아마이드 (III-6)
2-메톡시피리딘-3,5-디아민 X'-1 (0.44 g, 3.18 mmol)을 아세톤 40 mL에 용해시킨 후 0 ℃로 냉각하고, 트라이에틸아민 (0.48 g, 4.77 mmol)과 3-(t-뷰틸)벤조일 클로라이드 XI-2 (0.50 g, 2.54 mmol)를 가하고 2 시간 동안 교반하였다. 반응이 완결되면 용매를 농축한 후, 에틸아세테이트와 증류수 그리고 소금물을 사용하여 순차적으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 감압 농축하여 표제화합물 0.34 g (45%)을 수득하였다.
ES-MS m/z : 300.28 [M+H]+
제조예 2-7 : N-(5-아미노-6-메톡시피리딘-3-일)-3-(4,4-다이메틸-4,5-다이하이드로옥사졸-2-일)벤즈아마이드 (III-7)
2-메톡시피리딘-3,5-디아민 X'-1 (0.40 g, 2.87 mmol)을 아세톤 40 mL에 용해시킨 후 0 ℃로 냉각하고, 트라이에틸아민 (0.44 g, 4.31 mmol)과 3-(4,4-다이메틸-4,5-다이하이드로옥사졸-2-일)벤조일 클로라이드 XI-4 (0.55 g, 2.30 mmol)를 가하고 2 시간 동안 교반하였다. 반응이 완결되면 용매를 농축한 후, 에틸아세테이트와 증류수 그리고 소금물을 사용하여 순차적으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 감압 농축하여 표제화합물 0.34 g (43%)을 수득하였다.
ES-MS m/z : 341.36 [M+H]+
제조예 2-8 : N-(5-아미노-6-클로로피리딘-3-일)-3-(트라이플루오로메틸)벤즈아마이드 트라이플루오로아세트산염 (III-8)
t-뷰틸 (5-아미노-2-클로로피리딘-3-일)카바메이트 (1.20 g, 4.92 mmol)을 다이클로로메탄 60 mL에 용해시킨 후 0 ℃로 냉각하고, N,N-다이아이소프로필에틸아민 (2.51 mL, 14.77 mmol)과 3-(트라이플루오로메틸)벤조일 클로라이드 XI-1 (1.13 g, 5.42 mmol)를 가하고 4시간 동안 20 ~ 25℃에서 교반하였다. 반응이 종결되면 다이클로로메탄과 증류수 그리고 포화 염화나트륨 용액을 사용하여 순차적으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 감압 농축하여 잔사를 컬럼크로마토그래피로 정제하여 t-뷰틸 (2-클로로-5-(3-(트라이플루오로메틸)벤즈아미도)피리딘-3-일카바메이트 1.59 g (78 %)을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, CDCl3) : δ 1.53 (s, 9H), 7.06 (br, 1H), 7.64 (m, 1H), 7.84 (m, 1H), 8.10 (m,3H), 8.58 (d, 1H), 8.78 (d, 1H).
상기에서 수득한 t-뷰틸 (2-클로로-5-(3-(트라이플루오로메틸)벤즈아미도)피리딘-3-일카바메이트 1.50 g (3.61 mmol)을 다이클로로메탄:트라이플루오로아세트산(1:1)에 용해한 후 20 ~ 25℃에서 5시간 동안 교반하였다. 반응종결 후 반응 용매를 감압 농축하여 표제화합물 트라이플루오로아세트산염 1.10 g (71 %)을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) : δ 5.69 (br,2H), 5.76 (br,1H), 7.73 (d, 1H), 7.79(t,1H), 7.97 (m, 2H), 8.26 (m, 2H), 10.53 (S, 1H).
제조예 2-9 : N-(5-아미노-6-클로로피리딘-3-일)-3-(t-뷰틸)벤즈아마이드 트라이플루오로아세트산염 (III-9)
t-뷰틸 (5-아미노-2-클로로피리딘-3-일)카바메이트 (0.84 g, 3.45 mmol)을 다이클로로메탄 50 mL에 용해시킨 후 0 ℃로 냉각하고, N,N-다이아이소프로필에틸아민 (1.76 mL, 10.34 mmol)과 3-(t-뷰틸)벤조일 클로라이드 XI-2 (0.68 g, 3.45 mmol)를 가하고 5시간 동안 20 ~ 25℃에서 교반하였다. 이후 제조예 2-14와 동일한 방법으로 t-뷰틸 (5-(3-(t-뷰틸)벤즈아미도)-2-클로로피리딘-3-일)카바메이트 (0.90 g, 65 %)을 수득하였다.
상기에서 수득한 t-뷰틸 (5-(3-(t-뷰틸)벤즈아미도)-2-클로로피리딘-3-일)카바메이트 (0.88 g, 2.18 mmol)을 다이클로로메탄:트라이플루오로아세트산(1:1)에 녹인 후 제조예 2-14와 동일한 방법으로 표제화합물 트라이플루오로아세트산염 0.88 g을 정량적으로 수득하였다.
1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 1.38 (s, 9H), 5.69 (br,2H), 5.76 (br,1H), 7.73 (d, 1H), 7.79 (t,1H), 7.97 (m, 2H), 8.26 (m, 2H), 10.53 (S, 1H).
제조예 2-10 : N-(5-아미노-6-클로로피리딘-3-일)-2-(t-뷰틸)싸이아졸-4-카복사마이드 트라이플루오로아세트산염 (III-10)
t-뷰틸 (5-아미노-2-클로로피리딘-3-일)카바메이트 (0.84 g, 3.45 mmol)을 다이클로로메탄 50 mL에 용해시킨 후 0 ℃로 냉각하고, N,N-다이아이소프로필에틸아민 (1.76 mL, 10.34 mmol)과 2-(t-뷰틸)싸이아졸-4-카보닐클로라이드 XI-5 (0.70g, 3.45 mmol)를 가하고 5시간 동안 20 ~ 25℃에서 교반하였다. 제조예 2-14와 동일한 방법으로 t-뷰틸 (5-(2-(t-뷰틸)싸이아졸-4-카복사미도)-2-클로로피리딘-3-일)카바메이트 (0.94 g, 67 %)을 수득하였다.
상기에서 수득한 t-뷰틸 (5-(2-(t-뷰틸)싸이아졸-4-카복사미도)-2-클로로피리딘-3-일)카바메이트 (0.92 g, 2.24 mmol)을 다이클로로메탄:트라이플루오르아세트산(1:1)에 용해한 후 제조예 2-14와 동일한 방법으로 표제화합물 트라이플루오로아세트산염 0.92 g을 정량적으로 수득하였다.
제조예 3 : 화학식 IV의 화합물의 제조
제조예 3-1 : N-(6-메틸-5-(((4-(메틸아미노)-2-(메틸싸이오)피리미딘-5-일)메틸)아미노)피리딘-3-일)-3-(트라이플루오로메틸)벤즈아마이드 (IV-1)
제조예 2-1에서 제조한 화합물 III-1 (0.60 g 2.03 mmol)를 아세토나이트릴 50 mL에 녹인 후, 0℃에서 N,N-다이아이소프로필에틸아민(1.06 mL, 6.10 mmol)를 첨가하였다. 반응용액에 제조예 1-1에서 제조한 화합물 II-1 (0.40 g, 1.63 mmol)을 아세토나이트릴 30mL에 용해하여 천천히 적가하고 20 ~ 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 용매를 감압 농축하여 에틸아세테이트와 물 그리고 소금물을 사용하여 순차적으로 추출한 다음 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 감압 농축하였다. 농축 잔사를 컬럼크로마토그래피로 정제하여 표제화합물 0.70 g (70 %)을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, CDCl3) : δ 2.55 (s, 3H), 3.05 (d, 3H), 4.16 (s, 2H), 5.57 (m, 1H), 6.88 (dd, 1H), 7.29 (d, 1H), 7.43 (d, 1H), 7.65 (t, 1H), 7.82-7.85 (m, 2H), 7.93 (s, 1H), 8.06 (d, 1H), 8.12 (s, 1H)
ES-MS m/z: 463.03 [M+H]+
제조예 3-2 : 3-(t-뷰틸)-N-(6-메틸-5-(((4-(메틸아미노)-2-(메틸싸이오)피리미딘-5-일)메틸)아미노)피리딘-3-일)벤즈아마이드 (IV-2)
화합물 III-1 대신에 제조예 2-2에서 제조한 화합물 III-2 (0.90 g, 3.18 mmol)과 제조예 1-1에서 제조한 화합물 II-1 (0.76 g, 3.16 mmol)를 사용하여 제조예 3-1 과 동일한 방법으로 표제화합물 0.80 g (56 %)을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ1.34 (s, 9H), 2.47 (s, 6H), 2.55 (s, 3H), 4.16 (s, 2H), 4.32 (m, 2H), 6.76 (dd, 1H), 7.36 (m, 1H), 7.54 (m, 1H), 7.75 (m, 2H), 7.98 (m, 1H), 8.25 (m, 1H)
ES-MS m/z: 451.14 [M+H]+
제조예 3-3 : 3-(t-뷰틸)-N-(6-메틸-5-(((4-(메틸아미노)-2-(메틸싸이오)피리미딘-5-일)메틸)아미노)피리딘-3-일)벤즈아마이드 (IV-2)
화합물 III-1 대신에 제조예 2-2에서 제조한 화합물 III-2 (2.08 g, 7.33 mmol)를 메틸알코올 50 mL에 용해하고 아세트산 (0.88 mL, 15.28 mmol)과 제조예 1-2에서 제조한 화합물 II-2 (1.12 g, 6.11 mmol)를 첨가한 뒤 15 분 동안 교반하였다. 반응 용액에 나트륨시아노보로하이드라이드 (2.30 g, 36.68 mmol)를 가한 후, 45 ℃로 승온시켜 18시간동안 교반하였다. 반응이 종결되면 20~25 ℃로 냉각시킨 후, 반응용매를 감압 농축하고 에틸아세테이트와 포화 탄산수소나트륨 용액으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 감압 농축하였다. 농축 잔사를 컬럼크로마토그래피로 정제하여 표제화합물 1.10 g (40 %)을 수득하였다.
ES-MS m/z: 451.14 [M+H]+
제조예 3-4 : N-(4-메톡시-3-(((4-(메틸아미노)-2-(메틸싸이오)피리미딘-5-일)메틸)아미노)피리딘-3-일)-3-(트라이플루오로메틸)벤즈아마이드 (IV-3)
화합물 III-1 대신에 제조예 2-3에서 제조한 화합물 III-3 (0.17 g, 0.69 mmol)를 사용하여 제조예 3-1 와 동일한 방법으로 표제화합물 0.10 g (30 %)을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 2.55 (s, 3H), 2.87 (d, 3H), 4.01 (s, 3H), 4.25 (s, 2H), 5.60 (dd, 2H), 6.88 (dd, 1H), 7.12 (d, 1H), 7.42-7.89 (m, 4H), 7.93 (s, 1H), 8.12 (s, 1H)
ES-MS m/z: 527.97 [M+H]+
제조예 3-5 : 4-(4,4-다이메틸-4,5-다이하이드로옥사졸-2-일)-N-(6-메틸-5-(((4-(메틸아미노)-2-(메틸싸이오)피리미딘-5-일)메틸)아미노)피리딘-3-일)벤즈아마이드 (IV-4)
화합물 III-1 대신에 제조예 2-4에서 제조한 화합물 III-4 (1.00 g, 3.08 mmol)를 사용하여 제조예 3-1 와 동일한 방법으로 표제화합물 0.45 g (30 %)을 수득하였다.
ES-MS m/z: 492.54 [M+H]+
제조예 3-6 : 3-(4,4-다이메틸-4,5-다이하이드로옥사졸-2-일)-N-(6-메틸-5-(((4-(메틸아미노)-2-(메틸싸이오)피리미딘-5-일)메틸)아미노)피리딘-3-일)벤즈아마이드 (IV-5)
화합물 III-1 대신에 제조예 2-5에서 제조한 화합물 III-5 (1.00 g, 3.08 mmol)를 사용하여 제조예 3-1 와 동일한 방법으로 표제화합물 0.40 g (30 %)을 수득하였다.
ES-MS m/z: 492.54 [M+H]+
제조예 3-7 : 3-(t-뷰틸)-N-(6-메톡시-5-(((4-(메틸아미노)-2-(메틸싸이오)피리미딘-5-일)메틸)아미노)피리딘-3-일)벤즈아마이드 (IV-6)
화합물 III-1 대신에 제조예 2-6에서 제조한 화합물 III-6 (0.34 g, 1.14 mmol)를 사용하여 제조예 3-1 과 동일한 방법으로 표제화합물 0.18 g (51%)을 수득하였다.
ES-MS m/z : 467.61 [M+H]+
제조예 3-8 : 3-(4,4-다이메틸-4,5-다이하이드로옥사졸-2-일)-N-(6-메톡시-5-(((4-(메틸아미노)-2-(메틸싸이오)피리미딘-5-일)메틸)아미노)피리딘-3-일)벤즈아마이드 (IV-7)
화합물 III-1 대신에 제조예 2-7에서 제조한 화합물 III-7 (0.34 g, 1.00 mmol)를 사용하여 제조예 3-1 과 동일한 방법으로 표제화합물 0.15 g (45%)을 수득하였다.
ES-MS m/z : 508.55 [M+H]+
제조예 3-9 : N-(6-클로로-5-(((4-(메틸아미노)-2-(메틸싸이오)피리미딘-5-일)메틸)아미노)피리딘-3-일)-3-(트라이플루오로메틸)벤즈아마이드 (IV-8)
화합물 III-1 대신에 제조예 2-8에서 제조한 화합물 III-8 화합물 (1.15 g 1.99 mmol)를 사용하여 제조예 3-1 과 동일한 방법으로 표제화합물 0.26 g (41 %)을 수득하였다.
제조예 3-10 : 3-(t-뷰틸)-N-(6-클로로-5-(((4-(메틸아미노)-2-(메틸싸이오)피리미딘-5-일)메틸)아미노)피리딘-3-일)벤즈아마이드 (IV-9)
화합물 III-1 대신에 제조예 2-9에서 제조한 화합물 III-9 화합물 (1.17 g 2.91 mmol)를 사용하여 제조예 3-1 과 동일한 방법으로 표제화합물 0.28 g (41 %)을 수득하였다.
제조예 3-11 : 2-(t-뷰틸)-N-(6-클로로-5-(((4-(메틸아미노)-2-(메틸싸이오)피리미딘-5-일)메틸)아미노)피리딘-3-일)싸이아졸-4-카복사마이드 (IV-10)
화합물 III-1 대신에 제조예 2-10에서 제조한 화합물 III-10 화합물 (0.67 g 3.33 mmol)를 사용하여 제조예 3-1 과 동일한 방법으로 표제화합물 0.32 g (41 %)을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 9.24 (s, 1H), 8.07 (m, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.87 (d, 1H), 5.45 (br, 1H), 4.15-4.19 (m, 2H), 3.07 (d, 2H), 2.55 (s, 3H), 1.47(s, 9H).
제조예 4 : 화학식 V의 화합물의 제조
제조예 4-1 : N-(6-메틸-5-(1-메틸-7-(메틸싸이오)-2-옥소-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)-3-(트라이플루오로메틸)벤즈아마이드 (V-1)
제조예 3-1에서 제조한 화합물 Ⅳ-1 (0.70 g, 1.51 mmol)을 1,4-다이옥세인 60 mL에 용해한 후 0 ℃에서 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (0.78 mL, 4.54 mmol)과 트라이포스겐 (0.63 g, 2.12 mmol)을 가하고 100℃에서 3 시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면 포화된 탄산수소나트륨 용액과 에틸아세테이트로 추출한 후 유기층을 소금물로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 감압 농축하여 농축 잔사를 컬럼크로마토그래피로 정제하여 표제화합물 0.37 g (50 %)을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, CDCl3) : δ 2.55 (s, 3H), 2.63 (s, 3H), 3.65 (d, 3H), 5.16 (s, 2H), 6.88 (dd, 1H), 7.29 (d, 1H), 7.43 (d, 1H), 7.65 (t, 1H), 7.82-7.85 (m, 2H), 7.93 (s, 1H), 8.12 (s, 1H)
ES-MS m/z: 489.50 [M+H]+
제조예 4-2 : 3-(t-뷰틸)-N-(6-메틸-5-(1-메틸-7-(메틸싸이오)-2-옥소-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)벤즈아마이드 (V-2)
화합물 Ⅳ-1 대신에 제조예 3-2에서 제조한 화합물 Ⅳ-2 (0.80 g, 1.78 mmol)을 사용하여 제조예 4-1과 동일한 방법으로 표제화합물 0.50 g (60 %)을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 1.34 (s, 9H), 2.47 (d, 3H), 2.55 (d, 3H), 2.70 (d, 3H), 4.42 (d, 2H), 6.76 (m, 1H), 7.36 (m, 1H), 7.54 (m, 1H), 7.75 (m, 2H), 7.98 (m, 1H), 8.25 (m, 1H)
ES-MS m/z: 477.60 [M+H]+
제조예 4-3 : N-(6-메톡시-5-(1-메틸-7-(메틸싸이오)-2-옥소-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)-3-(트라이플루오로메틸)벤즈아마이드 (V-3)
화합물 Ⅳ-1 대신에 제조예 3-4에서 제조한 화합물 Ⅳ-3 (0.10 g, 0.21 mmol)를 사용하여 제조예 4-1과 동일한 방법으로 표제화합물 0.10 g (95 %)을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 2.55 (s, 3H), 3.34 (d, 3H), 4.25 (s, 3H), 5.06 (s, 2H), 6.88 (dd, 1H), 7.31-7.42 (m, 2H), 7.65-7.95 (m, 4H), 8.06 (d, 1H), 8.12 (s, 1H)
ES-MS m/z: 505.09 [M+H]+
제조예 4-4 : 4-(4,4-다이메틸-4,5-다이하이드로옥사졸-2-일)-N-(6-메틸-5-(1-메틸l-7-(메틸싸이오)-2-옥소-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)벤즈아마이드 (V-4)
화합물 Ⅳ-1 대신에 제조예 3-5에서 제조한 화합물 Ⅳ-4 (0.40 g, 0.81 mmol)를 사용하여 제조예 4-1과 동일한 방법으로 표제화합물 0.32 g (76%)을 수득하였다.
ES-MS m/z: 518.09 [M+H]+
제조예 4-5 : 3-(4,4-다이메틸-4,5-다이하이드로옥사졸-2-일)-N-(6-메틸-5-(1-메틸-7-(메틸싸이오)-2-옥소-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일) 벤즈아마이드 (V-5)
화합물 Ⅳ-1 대신에 제조예 3-6에서 제조한 화합물 Ⅳ-5 (0.40 g, 0.81 mmol)를 사용하여 제조예 4-1과 동일한 방법으로 표제화합물 0.35 g (83%)을 수득하였다.
ES-MS m/z: 518.09 [M+H]+
제조예 4-6 : 3-(t-뷰틸)-N-(6-메톡시-5-(1-메틸-7-(메틸싸이오)-2-옥소-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)벤즈아마이드 (V-6)
화합물 Ⅳ-1 대신에 제조예 3-7에서 제조한 화합물 Ⅳ-6 (0.18 g, 0.39 mmol)을 사용하여 제조예 4-1과 동일한 방법으로 표제화합물 0.17 g (90%)을 수득하였다.
ES-MS m/z : 493.62 [M+H]+
제조예 4-7 : 3-(4,4-다이메틸-4,5-다이하이드로옥사졸-2-일)-N-(6-메톡시-5-(1-메틸-7-(메틸싸이오)-2-옥소-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)벤즈아마이드 (V-7)
화합물 Ⅳ-1 대신에 제조예 3-8에서 제조한 화합물 Ⅳ-7 (0.15 g, 0.30 mmol)을 사용하여 제조예 4-1과 동일한 방법으로 표제화합물 0.15 g (93%)을 수득하였다.
ES-MS m/z : 534.65 [M+H]+
제조예 4-8 : N-(6-클로로-5-(1-메틸-7-(메틸싸이오)-2-옥소-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)-3-(트라이플루오로메틸)벤즈아마이드 (V-8)
화합물 Ⅳ-1 대신에 제조예 3-9에서 제조한 화합물 Ⅳ-8 (0.27 g, 0.56 mmol)을 사용하여 제조예 4-1과 동일한 방법으로 표제화합물 0.27 g (96 %)을 수득하였다.
제조예 4-9 : 3-(t-뷰틸)-N-(6-클로로-5-(1-메틸-7-(메틸싸이오)-2-옥소-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)벤즈아마이드 (V-9)
화합물 Ⅳ-1 대신에 제조예 3-10에서 제조한 화합물 Ⅳ-9 (0.28 g, 0.59 mmol)을 사용하여 제조예 4-1과 동일한 방법으로 표제화합물 0.23 g (78 %)을 수득하였다.
제조예 4-10 : 2-(t-뷰틸)-N-(6-클로로-5-(1-메틸-7-(메틸싸이오)-2-옥소-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)싸이아졸-4-카복사마이드 (V-10)
화합물 Ⅳ-1 대신에 제조예 3-11에서 제조한 화합물 Ⅳ-10 (0.31 g, 0.65 mmol)을 사용하여 제조예 4-1과 동일한 방법으로 표제화합물 0.25 g (77 %)을 수득하였다.
제조예 5 : 화학식 VI의 화합물의 제조
제조예 5-1 : N-(6-메틸-5-(1-메틸-7-(메틸설폰일)-2-옥소-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)-3-(트라이플루오로메틸)벤즈아마이드 (VI-1)
제조예 4-1에서 제조한 화합물 Ⅴ-1 (0.37 g, 0.76 mmol)을 테트라하이드로퓨란:증류수 (2:1, 30mL)에 용해하고 산화제인 옥손 (4.66 g, 7.57 mmol)을 가한 후 65℃에서 5시간동안 교반하였다. 반응 완결 후 반응 용매를 감압 농축하여 에틸아세테이트와 물 그리고 소금물로 순차적으로 세척한 다음 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 감압 농축하였다. 농축 잔사를 컬럼크로마토그래피로 정제하여 표제화합물 0.17 g (44 %)을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 2.70 (s, 3H), 3.38 (s, 3H), 3.40 (s, 3H), 4.42 (d, 2H), 6.76 (m, 1H), 7.36 (m, 1H), 7.48 - 7.99 (m, 4H), 8.25 (m, 1H), 9.12(s, 1H)
ES-MS m/z: 521.60 [M+H]+
제조예 5-2 : 3-(t-뷰틸)-N-(6-메틸-5-(1-메틸-7-(메틸설폰일)-2-옥소-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)벤즈아마이드 (VI-2)
화합물 Ⅴ-1 대신에 제조예 4-2에서 제조한 화합물 Ⅴ-2 (0.51 g, 1.07 mmol)를 사용하여 제조예 5-1 와 동일한 방법으로 표제화합물 0.22 g (42 %)을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 1.34 (s, 9H), 2.70 (s, 3H), 3.38 (s, 3H), 3.40 (s, 3H), 4.42 (d, 2H), 6.76 (m, 1H), 7.36 (m, 1H), 7.54 (m, 1H), 7.75 (m, 2H), 7.98 (m, 1H), 8.25 (m, 1H), 9.15(s, 1H)
ES-MS m/z: 509.72 [M+H]+
제조예 5-3 : N-(6-메톡시-5-(1-메틸-7-(메틸설폰일)-2-옥소-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)-3-(트라이플루오로메틸)벤즈아마이드 (VI-3)
화합물 Ⅴ-1 대신에 제조예 4-3에서 제조한 화합물 Ⅴ-3 (0.09 g, 0.17 mmol)를 사용하여 제조예 5-1과 동일한 방법으로 표제화합물 90 mg (97 %)을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 3.10 (s, 3H), 3.45 (s, 3H), 4.63 (s, 3H), 5.51(s, 2H), 6.56 (dd, 1H), 7.13 - 7.81 (m, 3H), 8.16-8.17 (m, 2H), 8.28 (d, 1H), 9.10 (s, 1H)
ES-MS m/z: 537.01 [M+H]+
제조예 5-4 : 4-(4,4-다이메틸-4,5-다이하이드로옥사졸-2-일)-N-(6-메틸-5-(1-메틸-7-(메틸설폰일)-2-옥소-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)벤즈아마이드 (VI-4)
화합물 Ⅴ-1 대신에 제조예 4-4에서 제조한 화합물 Ⅴ-4 (0.30 g, 0.58 mmol)를 사용하여 제조예 5-1과 동일한 방법으로 표제화합물 0.24 g (76 %)을 수득하였다.
ES-MS m/z : 550.25 [M+H]+
제조예 5-5 : 3-(4,4-다이메틸-4,5-다이하이드로옥사졸-2-일)-N-(6-메틸-5-(1-메틸-7-(메틸설폰일)-2-옥소-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)벤즈아마이드 (VI-5)
화합물 Ⅴ-1 대신에 제조예 4-5에서 제조한 화합물 Ⅴ-5 (0.35 g, 0.58 mmol)를 사용하여 제조예 5-1과 동일한 방법으로 표제화합물 0.24 g (76 %)을 수득하였다.
ES-MS m/z: 550.21 [M+H]+
제조예 5-6 : 3-(t-뷰틸)-N-(6-메톡시-5-(1-메틸-7-(메틸설폰일)-2-옥소-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)벤즈아마이드 (VI-6)
화합물 Ⅴ-1 대신에 제조예 4-6에서 제조한 화합물 Ⅴ-6 (0.17 g, 0.35 mmol)을 사용하여 제조예 5-1과 동일한 방법으로 표제화합물 0.17 g (91%)을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 1.36 (s, 9H), 3.37 (s, 3H), 3.90 (s, 3H), 4.82 (s, 2H), 7.41 (t, 1H), 7.60 (d, 1H), 7.66 (d, 1H), 7.94 (s, 1H), 8.21 (dd, 1H), 8.24 (s, 1H), 8.38 (t, 1H)
ES-MS m/z : 525.61 [M+H]+
제조예 5-7 : 3-(4,4-다이메틸-4,5-다이하이드로옥사졸-2-일)-N-(6-메톡시-5-(1-메틸-7-(메틸설폰일)-2-옥소-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)벤즈아마이드 (VI-7)
화합물 Ⅴ-1 대신에 제조예 4-7에서 제조한 화합물 Ⅴ-7 (0.15 g, 0.28 mmol)을 사용하여 제조예 5-1과 동일한 방법으로 표제화합물 0.14 g (89%)을 수득하였다.
ES-MS m/z : 566.50 [M+H]+
제조예 5-8 : N-(6-클로로-5-(1-메틸-7-(메틸설포닐)-2-옥소-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)-3-(트라이플루오로메틸)벤즈아마이드 (VI-8)
화합물 Ⅴ-1 대신에 제조예 4-8에서 제조한 화합물 Ⅴ-8 (0.26 g, 0.51 mmol)을 사용하여 제조예 5-1과 동일한 방법으로 표제화합물 0.21 g (77 %)을 수득하였다.
제조예 5-9 : 3-(t-뷰틸)-N-(6-클로로-5-(1-메틸-7-(메틸설포닐)-2-옥소-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)벤즈아마이드 (VI-9)
화합물 Ⅴ-1 대신에 제조예 4-9에서 제조한 화합물 Ⅴ-9 (0.23 g, 0.46 mmol)을 사용하여 제조예 5-1과 동일한 방법으로 표제화합물 0.21 g (86 %)을 수득하였다.
제조예 5-10 : 2-(t-뷰틸)-N-(6-클로로-5-(1-메틸-7-(메틸설포닐)-2-옥소-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)싸이아졸-4-카복사마이드 (VI-10)
화합물 Ⅴ-1 대신에 제조예 4-10에서 제조한 화합물 Ⅴ-10 (0.26 g, 0.52 mmol)을 사용하여 제조예 5-1과 동일한 방법으로 표제화합물 0.19 g (67 %)을 수득하였다.
실시예 : 화학식 I의 화합물의 제조
실시예 1 : N-(6-메틸-5-(1-메틸-2-옥소-7-(페닐아미노)-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)-3-(트라이플루오로메틸)벤즈아마이드 (I-1)
제조예 5-1에서 제조한 화합물 Ⅵ-1 (0.17 g, 0.33 mmol)을 1,4-다이옥세인 10ml에 용해하고, 아닐린 4 mL에 가한 후 100℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 완결 후 에틸아세테이트와 물 그리고 소금물로 순차적으로 추출한 다음 유기층을 무수황산나트륨으로 건조시키고 감압 농축하였다. 농축 잔사를 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제화합물 87 mg (50 %)을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 2.55 (s, 3H), 3.09 (s, 3H), 4.42 (d, 2H), 6.46-7.54 (m, 6H), 7.75 (m, 2H), 8.01(m, 1H), 8.17 (m, 1H), 9.60(s, 1H), 10.36(s, 1H)
ES-MS m/z: 534.62 [M+H]+
실시예 2 : 3-(t-뷰틸)-N-(6-메틸-5-(1-메틸-2-옥소-7-(페닐아미노)-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)벤즈아마이드 (I-2)
화합물 Ⅵ-1 대신에 제조예 5-2에서 제조한 화합물 Ⅵ-2 (0.21 g, 0.41 mmol)를 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 표제화합물 86 mg (40 %)을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 1.34 (s, 9H), 2.55 (s, 3H), 3.11 (s, 3H), 4.42 (d, 2H), 6.46-7.54 (m, 9H), 7.75 (m, 1H), 7.98(m, 1H), 8.25 (m, 1H), 9.53(s, 1H), 10.35(s, 1H)
ES-MS m/z: 522.72 [M+H]+
실시예 3 : N-(6-메톡시-5-(1-메틸-2-옥소-7-(페닐아미노)-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)-3-(트라이플루오로메틸)벤즈아마이드 (I-3)
화합물 Ⅵ-1 대신에 제조예 5-3에서 제조한 화합물 Ⅵ-3 (90 mg, 0.17 mmol)를 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 표제화합물 25 mg (27 %)을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, DMSO-d6): 3.35(s, 3H), δ 3.90 (s, 3H), 4.63 (s, 2H), 6.95 (t, 1H), 7.29 (t, 1H), 7.70 (d, 2H), 7.79 (t, 2H), 8.00 (d, 1H), 8.16-8.17 (m, 2H), 8.28 (d, 1H), 8.33 (s, 1H), 8.51 (s, 1H), 9.60 (s, 1H), 10.67 (s, 1H)
ES-MS m/z: 550.07 [M+H]+
실시예 4 : 4-(4,4-다이메틸-4,5-다이하이드로옥사졸-2-일)-N-(6-메틸-5-(1-메틸-2-옥소-7-(페닐아미노)-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)벤즈아마이드 (I-4)
화합물 Ⅵ-1 대신에 제조예 5-4에서 제조한 화합물 Ⅵ-4 (0.20 g, 0.36 mmol)를 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 표제화합물 0.10 g (55 %)을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 1.31 (s, 6H), 2.89 (d, 3H), 3.36 (s, 3H), 4.16 (s, 2H), 4.61(d, 1H), 4.73(d, 1H), 7.12-7.23 (m, 5H), 7.83 (t, 1H), 8.03(d, 1H), 8.29(d, 1H), 8.37(s, 1H), 8.56 (d, 1H), 8.66(s, 1H), 8.77 (s, 1H), 9.53(s, 1H), 10.98 (s, 1H)
ES-MS m/z: 563.72 [M+H]+
실시예 5 : 3-(4,4-다이메틸-4,5-다이하이드로옥사졸-2-일)-N-(6-메틸-5-(1-메틸-2-옥소-7-(페닐아미노)-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)벤즈아마이드 (I-5)
화합물 Ⅵ-1 대신에 제조예 5-5에서 제조한 화합물 Ⅵ-5 (0.23 g, 0.42 mmol)를 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 표제화합물 0.14 g (58 %)을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 1.41 (s, 6H), 2.59 (d, 3H), 3.36 (s, 3H), 4.13 (s, 2H), 4.61(d, 1H), 4.73(d, 1H), 7.12-7.23 (m, 5H), 7.81 (s, 1H), 8.03(d, 1H), 8.29(d, 1H), 8.37(s, 1H), 8.56 (d, 1H), 8.66(s, 1H), 8.77 (s, 1H), 9.53(s, 1H), 10.98 (s, 1H)
ES-MS m/z: 563.62 [M+H]+
실시예 6 : 3-(t-뷰틸)-N-(6-메톡시-5-(1-메틸-2-옥소-7-(페닐아미노)-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)벤즈아마이드 (I-6)
화합물 Ⅵ-1 대신에 제조예 5-6에서 제조한 화합물 Ⅵ-6 (0.17 g, 0.32 mmol)을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 표제화합물 83 mg (47%)을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) : δ 1.34 (s, 9H), 3.37 (s, 3H), 3.90 (s, 3H), 4.63 (d, 2H), 6.95 (t, 1H), 7.29 (t, 1H), 7.47 (t, 1H), 7.64 (d, 1H), 7.76-7.81 (m, 2H), 7.96 (t, 1H), 8.14 (d, 1H), 8.16 (s, 1H), 8.52(d, 1H), 9.59 (s, 1H), 10.38 (s, 1H)
ES-MS m/z : 538.64 [M+H]+
실시예 7 : 3-(4,4-다이메틸-4,5-다이하이드로옥사졸-2-일)-N-(6-메톡시-5-(1-메틸-2-옥소-7-(페닐아미노)-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)벤즈아마이드 (I-7)
화합물 Ⅵ-1 대신에 제조예 5-7에서 제조한 화합물 Ⅵ-7 (0.14 g, 0.25 mmol)을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 표제화합물 65 mg (44%)을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 1.34 (s, 9H), 3.37 (s, 3H), 3.90 (s, 3H), 4.15(s, 2H), 4.63 (d, 1H), 4.71(d, 1H), 6.95 (t, 1H), 7.29 (t, 1H), 7.47 (t, 1H), 7.64 (d, 1H), 7.78-7.85 (m, 2H), 8.01-8.12 (m, 2H), 8.35 (t, 1H), 8.56 (d, 1H), 8.66 (s, 1H), 8.77 (s, 1H), 9.57 (s, 1H), 10.98 (s, 1H)
ES-MS m/z : 579.65 [M+H]+
실시예 8 : N-(6-클로로-5-(1-메틸-2-옥소-7-(페닐아미노)-1,2-다이하이드로피리미도 [4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)-3-(트라이플루오로메틸)벤즈아마이드 (I-8)
화합물 Ⅵ-1 대신에 제조예 5-8에서 제조한 화합물 Ⅵ-8 (0.20 g, 0.37 mmol)을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 표제화합물 92 mg (46 %)을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 3.33 (s, 3H), 4.59-4.74 (m, 2H), 6.91 (t, 1H), 7.25 (t, 2H), 7.72-7.81 (m, 3H), 7.99 (d, 1H), 8.15 (s, 1H), 8.26 (m, 2H), 8.46 (s, 1H), 8.73 (s, 1H), 9.59 (s, 1H), 10.92 (s, 1H)
ES-MS m/z: 553.97 [M+H]+
실시예 9 : 3-(t-뷰틸)-N-(6-클로로-5-(1-메틸-2-옥소-7-(페닐아미노)-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)벤즈아마이드 (I-9)
화합물 Ⅵ-1 대신에 제조예 5-9에서 제조한 화합물 Ⅵ-9 (0.21 g, 0.40 mmol)을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 표제화합물 98.3 mg (46 %)을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 1.31 (s, 9H), 3.33 (s, 3H), 4.59-4.74 (m, 2H), 6.91 (t, 1H), 7.26 (t, 2H), 7.46 (t, 1H), 7.63 (d, 1H), 7.72-7.79 (m, 3H), 7.79 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 8.44 (d, 1H), 8.75 (d, 1H), 9.58 (s, 1H), 10.65 (s, 1H)
ES-MS m/z: 542.14 [M+H]+
실시예 10 : 2-(t-뷰틸)-N-(6-클로로-5-(1-메틸-2-옥소-7-(페닐아미노)-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)싸이아졸-4-카복사마이드 (I-10)
화합물 Ⅵ-1 대신에 제조예 5-10에서 제조한 화합물 Ⅵ-10 (0.18 g, 0.33 mmol)을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 표제화합물 0.12 g (64 %)을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 1.47 (s, 9H), 3.37 (s, 3H), 4.62-4.77 (m, 2H), 6.95 (t, 1H), 7.27-7.31 (t, 2H), 7.78 (d, 2H), 8.18 (s, 1H), 8.39 (s, 1H), 8.51 (d, 1H), 8.90 (d, 1H), 9.62 (s, 1H), 10.43 (s, 1H)
ES-MS m/z: 549.16 [M+H]+
실시예 11 : N-(6-클로로-5-(7-((4-히드록시페닐)아미노)-1-메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)-3-(트라이플루오로메틸)벤즈아마이드 (I-11)
화합물 Ⅵ-1 대신에 제조예 5-8에서 제조한 화합물 Ⅵ-8 (1.00 g, 1.85 mmol)을 1,4-다이옥세인 20 ml에 용해하고, 4-아미노페놀 (1.00 g, 9.24 mmol), 트라이플루오로아세트산(0.71 mL, 9.24 mmol)을 가한 후 85℃에서 7시간 동안 교반하였다. 반응 완결 후 반응 용매를 제거하고 메탄올을 가한 후 2시간 동안 환류하여 표제화합물 0.63 g (60 %)을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 3.33 (s, 3H), 4.58-4.74 (m, 2H), 6.68-6.72 (m, 2H), 7.47-7.50 (m, 2H), 7.81-7.85 (m, 1H), 8.01-8.03 (m, 1H), 8.11 (s, 1H), 8.28-8.34 (m, 2H), 8.47 (d, 1H), 8.77 (d, 1H), 9.05 (s, 1H), 9.29 (s, 1H), 10.95 (s, 1H)
ES-MS m/z: 569.16 [M+H]+
시험예 1: PD-L1 발현 억제 활성 분석
PD-L1 프로모터(promoter) 유전자 부위는 유전자 전사 활성을 측정하기 위한 프로모터-리포터 구조체(promoter-reporter construct)를 제조하기 위하여 pGL4.14-[luc2/Hygro] 벡터(vector) (promega, Madison, WI)에 다음과 같은 방법으로 삽입되었다.
PD-L1에 KpnI 및 XhoI 제한효소 부위를 포함해 프라이머(primer)를 제작한 후 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하였고, 아가로스 겔에 전기영동을 시행하여 프로모터 부위 DNA를 분리하였다. 파이어플라이 루시퍼라제(firefly luciferase)를 리포터 유전자로 함유한 pGL4.14-[luc2/Hygro] 벡터를 동일한 제한효소로 처리한 후 아가로스 겔 전기영동 및 겔 추출(gel extraction)을 시행하여 분리하였다. 순수 분리된 PD-L1 프로모터 유전자 부위와 pGL4.14-[luc2/Hygro] 벡터는 인-퓨젼(In-fusion) DNA 리가아제(ligase) (Takara)를 통해 50℃에서 1 시간 동안 반응시킨 후 대장균(E. coli)에 형질전환하여 PCSK9 프로모터가 삽입된 프로모터-리포터 구조체를 제조하였으며 이를 pGL4.14-PD-L1이라 명명하였다.
PD-L1 유전자 프로모터의 전사 활성을 측정하기 위하여 A549 세포에 PD-L1 프로모터-리포터 구조체를 다음과 같이 일시적인 형질감염(transient transfection)시킨 후 세포 추출물의 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
DNA-리포펙타민 복합체(DNA-lipofectamine complex)는 0.1μg의 프로모터-리포터 구조체 플라스미드(plasmid) 및 리포펙타민 2000 시약(Invitrogen)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 제조하였다. DNA와 리포펙타민 2000이 복합체를 이루는 과정에는 opti-MEM 배지 (Invitrogen)를 사용하였다. A549 세포는 DNA를 가하기 직전 세포의 수를 확인하여 12 웰 플레이트에 웰 당 2.5 × 105개 (1 ml) 준비하였다. DNA-리포펙타민 복합체를 A549 세포에 조심스럽게 섞은 후 37℃ 인큐베이터에서 6시간 반응시켰다. 이후 배지를 갈아주면서 형질감염이 된 세포를 찾는 작업을 진행하였고, 루시퍼라제 테스트를 통해 PD-L1이 형질감염이 된 A549 세포를 찾을 수 있었다. 이를 A549 pGL4.14-PD-L1 세포주로 명명하여 실험을 진행하였다. PD-L1 유도 물질로는 IFNγ (50 ng/ml)을 사용하였다.
인간 정상 폐상피 세포주(human normal lung epithelial cell line)인 Beas-2B 세포에서 PD-L1을 유도하는 것으로 알려진 EGF와 IFNγ를 사용하여 PD-L1의 발현 조건을 설정하였다. RNA level에서는 EGF를 25, 50, 100 ng/ml의 농도로 처리한 경우 PD-L1의 활성화가 보이지 않았고, IFNγ만이 PD-L1을 증가시키는 것을 확인하였다. 또한, IFNγ를 50ng/ml 처리한 후 2시간 이후부터 PD-L1의 mRNA level이 증가하였으며, 최종적으로 IFNγ를 50ng/ml 처리한 후 4시간 뒤에 mRNA level이 가장 뚜렷하게 증가한 것을 확인할 수 있었다.
마찬가지로 PD-L1의 protein level을 Beas-2B 세포에서 확인한 결과 IFNγ를 처리하였을 때, 8시간 이전에는 큰 변화를 보이지 않았지만 8시간 이후부터 PD-L1의 발현 양이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, IFNγ를 50 ng/ml 처리한 후 20시간 뒤에 단백질(protein)을 용해(lysis)하여 사용하였다.
상기 A549 pGL4.14-PD-L1 세포주에 실시예의 피리미도 피리미디논 유도체를 각각 0.1 μM 및 1.0 μM의 농도로 처리하여 루미노미터(luminometer)로 PD-L1 발현 억제율을 평가하였다. 비교를 위하여, PD-L1 발현 억제 활성을 갖는 것으로 알려진 GS9973(Entospletinib)에 대해서도 동일한 실험을 수행하였다.
PD-L1 발현 억제율은 하기 수학식 1로 계산하였다.
[수학식 1]
PD-L1 발현 억제율(%) = 100-[(A/B) Х 100]
상기 식에서, A는 약물 처리시 값이고, B는 약물 미처리시 값이다.
그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
| A549에서의 PD-L1 발현 억제율(%) | ||
| 0.1 μM | 1.0 μM | |
| GS9973(Entospletinib) | 10.3 | 47.1 |
| I-1 | 12.8 | 87.1 |
| I-2 | 32.6 | 72.5 |
| I-3 | 29.3 | 92.5 |
| I-4 | 20.1 | 82.5 |
| I-5 | 19.4 | 81.9 |
| I-6 | 13.9 | 94.1 |
| I-7 | 13.1 | 85.3 |
| I-8 | 60.4 | 97.5 |
| I-9 | 48.8 | 97.2 |
| I-10 | 67.0 | 98.0 |
| I-11 | 65.0 | 98.0 |
상기 표 1을 통해, 본 발명에 따른 피리미도 피리미디논 화합물이 GS9973(Entospletinib) 대비 우수한 PD-L1 발현 억제 활성을 가지며, 이러한 PD-L1 발현 억제 활성이 농도의존적으로 나타나는 것을 확인할 수 있다.
시험예 2: PD-L1 발현 저해물질의 생체내 효능 평가
흑색종 멜라노마 B16F10 세포를 6주령 수컷 C57BL/6 마우스 한 마리당 1×106 세포수/100㎕로 마우스의 경배부 피하에 주입하여 질환모델을 제작하였다. 질환모델 제작 후 다음 날을 투여 1일차로 하여 하기 표 2와 같이 14일간 1일 1회 경구투여 하였고, 시험시작 15일차에 종양을 적출하였다. 종양 볼륨 변화 및 종양 크기를 측정하였다.
그 결과를 도 1 내지 도 2에 나타내었다.
| 군 | 성별 | 동물 수 | 동물번호 | 투여량 (mg/kg) |
|
| G1 | Normal control | M | 8 | 1 ~ 8 | - |
| G2 | I-8 | M | 8 | 9 ~ 16 | 10 |
| G3 | I-9 | M | 8 | 17 ~ 24 | 10 |
| G4 | I-2 | M | 8 | 25 ~ 32 | 20 |
| G5 | I-3 | M | 8 | 33 ~ 40 | 20 |
도 1 내지 도 2를 통해, 화합물 I-2, I-3, I-8 및 I-9가 대조군 대비 22 내지 59%의 종양 성장 억제능을 갖는 것을 확인할 수 있다.
시험예 3: 웨스턴-블럿 분석
시험예 3-1:
시험예 2의 화합물 I-8을 이용한 생체내 종양 억제 시험 후, 마우스에서 적출한 종양 세포내에서의 PD-L1 발현 억제 효능을 웨스턴-블럿 분석을 통하여 확인하였다. 비교를 위하여, 대조군의 마우스에서 적출한 종양 세포내에서의 PD-L1 발현 억제 효능도 웨스턴-블럿 분석을 통하여 확인하였다.
단백질은 화학발광(ECL) 키트 (elpis biotec, EBP-1073)를 사용하여 ChemiDocTM 이미징 시스템(Bio-rad)으로 결과를 확인하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3을 통해, 화합물 I-8 투여 시 대조군 대비 PD-L1의 발현이 감소되는 것을 확인할 수 있다.
시험예 3-2:
PD-L1 과발현 세포에 실시예 화합물 처리 후 PD-L1 발현 억제 효능을 웨스턴-블럿 분석을 통하여 확인하였다.
PD-L1 단백질 수준의 변화를 보기 위해 NCI-H358(NSCLC) 세포주를 6×105 cells/ml로 분주하였다. 이후 24시간이 지나 NCI-H358(NSCLC) 세포주에 IFN-γ (20 ng/ml)를 처리하여 PD-L1을 과발현시킨 후 24시간 뒤에 화합물을 1 μM, 10 μM로 각각 추가 처리하였다. 24시간 뒤에 단백질은 화학발광(ECL) 키트 (elpis biotec, EBP-1073)를 사용하여 ChemiDocTM 이미징 시스템(Bio-rad)으로 확인하였다. 웨스턴-블럿 분석 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4를 통해, 실시예 화합물들이 약물을 처리하지 않은 대조군에 비해 농도 의존적으로 PD-L1 발현 억제 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.
Claims (7)
- 하기 화학식 I의 피리미도 피리미디논 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염:
[화학식 I]
상기 식에서,
R1은 할로겐 또는 히드록시로 치환되거나 치환되지 않은 페닐이고,
R2는 C1-C4의 알킬기이며,
R3는 수소, 할로겐, C1-C4의 알킬기 또는 C1-C4의 알콕시기이고,
R4는 C1-C4의 알킬기, C1-C4의 할로알킬기 또는 알킬다이하이드로옥사졸릴로 치환되거나 치환되지 않은 페닐, 또는 알킬싸이아졸릴이다. - 삭제
- 제1항에 있어서,
R1은 페닐, 플루오로페닐 또는 히드록시페닐이고,
R2는 메틸이며,
R3는 수소, 클로로, 브로모, 메틸 또는 메톡시이고,
R4는 트라이플루오로메틸페닐, t-뷰틸페닐, 다이메틸다이하이드로옥사졸릴페닐 또는 t-뷰틸싸이아졸릴인 피리미도 피리미디논 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염. - 제1항에 있어서, 하기 화합물로부터 선택되는 피리미도 피리미디논 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염:
N-(6-메틸-5-(1-메틸-2-옥소-7-(페닐아미노)-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)-3-(트라이플루오로메틸)벤즈아마이드 (I-1);
3-(t-뷰틸)-N-(6-메틸-5-(1-메틸-2-옥소-7-(페닐아미노)-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)벤즈아마이드 (I-2);
N-(6-메톡시-5-(1-메틸-2-옥소-7-(페닐아미노)-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)-3-(트라이플루오로메틸)벤즈아마이드 (I-3);
4-(4,4-다이메틸-4,5-다이하이드로옥사졸-2-일)-N-(6-메틸-5-(1-메틸-2-옥소-7-(페닐아미노)-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)벤즈아마이드 (I-4);
3-(4,4-다이메틸-4,5-다이하이드로옥사졸-2-일)-N-(6-메틸-5-(1-메틸-2-옥소-7-(페닐아미노)-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)벤즈아마이드 (I-5);
3-(t-뷰틸)-N-(6-메톡시-5-(1-메틸-2-옥소-7-(페닐아미노)-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)벤즈아마이드 (I-6);
3-(4,4-다이메틸-4,5-다이하이드로옥사졸-2-일)-N-(6-메톡시-5-(1-메틸-2-옥소-7-(페닐아미노)-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)벤즈아마이드 (I-7);
N-(6-클로로-5-(1-메틸-2-옥소-7-(페닐아미노)-1,2-다이하이드로피리미도 [4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)-3-(트라이 플루오로메틸)벤즈아마이드 (I-8);
3-(t-뷰틸)-N-(6-클로로-5-(1-메틸-2-옥소-7-(페닐아미노)-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)벤즈아마이드 (I-9);
2-(t-뷰틸)-N-(6-클로로-5-(1-메틸-2-옥소-7-(페닐아미노)-1,2-다이하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)싸이아졸-4-카복사마이드 (I-10); 및
N-(6-클로로-5-(7-((4-히드록시페닐)아미노)-1-메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리미도[4,5-d]피리미딘-3(4H)-일)피리딘-3-일)-3-(트라이플루오로메틸)벤즈아마이드 (I-11). - 제1항 및 제3항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 피리미도 피리미디논 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항암용 약제학적 조성물.
- 삭제
- 제5항에 있어서, 대장암, 폐암, 유방암, 위암, 자궁경부암, 방광암, 혈액암 또는 비호즈킨스 림프종의 치료 또는 예방용인 약제학적 조성물.
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