KR102645821B1 - 유자 발효물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유자 발효물 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 유자를 추출하고 락토바실러스 람노서스 균으로 발효하여 얻은 유자 발효물이 피부에 악영향을 주는 미세먼지가 피부에 흡착되지 않도록 할 수 있을 뿐만 아니라 피부장벽강화, 피부보습 개선, 항산화 효능, 손상세포 치유 효능을 갖는다.

Description

유자 발효물 및 이의 용도 {Citron fermented extracts and uses thereof}

본 발명은 유자 발효물 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 미세먼지 흡착방지 및 상처치유 활성, 보습, 아토피 개선 및 완화, 항산화 효과가 있는 유자발효물에 관한 것이다.

미세먼지를 비롯한 대기 오염 문제는 건강과 일상을 위협하는 재난이자, 사회적으로 대책을 고민하는 관심사가 되었다. 호흡기를 통해 들어온 미세먼지는 폐와 심장에만 유해한 것이 아니다. 미세먼지에 노출되면 피부도 숨을 못 쉬고 힘들어 한다. 피부는 우리 몸을 둘러싼 보호장벽이다. 사람의 피부는 크게 표피층과 진피층으로 구성돼 있고, 표피층은 벽돌로 촘촘히 쌓은 벽처럼 방어막을 형성해 미세먼지가 몸에 들어오는 것을 막는다. 하지만, 미세먼지는 모공을 손쉽게 통과한다. 피부를 뚫고 진피까지도 들어온다. 미세먼지에 피부가 직접 공격을 받고 있는 것이다.

피부에 내려앉은 미세먼지는 모공에 껴서 잘 제거되지 않고, 피부에 남아 여드름처럼 트러블을 일으킨다. 피부 표면의 지방질 균형이 깨지면서 가려움증과 건조증이 심해진다.

미세먼지 속에 함유된 중금속과 환경호르몬 등의 유해물질은 알레르기 반응을 일으켜 아토피 피부염을 악화시킨다. 미세먼지가 피부의 신진대사를 약화시키기 때문이다.

또 미세먼지는 색소세포를 자극해 주름과 검버섯을 만든다. 미세먼지는 몸속에서 독성물질인 활성산소(ROS)를 많이 만들어 피부 내 콜라겐 합성을 떨어뜨린다.

미세먼지가 사람 피부에 미치는 악영향에 대하여는 많은 연구자료가 축적되고 있다. 구체적으로 먼저 미세먼지는 염증반응을 일으키고 피부장벽에 손상을 주어 아토피피부염을 악화시킬 수 있다고 알려져 있다.(Kim J, Kim EH, Oh I, Jung K, Han Y, Cheong HK, et al. Symptoms of atopic dermatitis are influenced by outdoor air pollution. J Allergy Clin Immunol 2013;132:495-8.e1.)

또한 미세먼지에 노출된 세포는 노화 관련 베타-갈락토시다아제의 발현이 증가하여 세포의 노화가 일어나게 하며, 세포에 손상을 일으키면서 염증의 발현을 유도하는 것으로 알려져 있다.(이지현, 이주영, 김미정, 김현지, 이성호, 전병균.(2019).미세먼지가 다양한 사람 세포주에 미치는 세포 독성. 생명과학회지, 29(6), 724-734.)

또한 미세먼지가 피부 각질세포의 노화를 유도하는 인산화효소(p38 MAPK)를 활성화시켜 피부 염증 및 노화를 유발함을 입증한 연구(Particulate matter induces proinflammatory cytokines via phosphorylation of p38 MAPK possibly leading to dermal inflammaging)한 연구자료도 존재한다.

이러한 미세먼지의 피부에 대한 악영향으로 부터 피부를 보호하기 위해서는, 미세 먼지가 피부에 달라붙어 흡착되지 않도록 방지할 뿐만 아니라, 피부 장벽을 강화하고, 피부 보습을 개선하며, 미세먼지에 의해 야기된 산화스트레스를 방지하기 위하여 항산화제를 사용하는 것이 필요하다.

그러나 피부를 미세먼지로 부터 보호하기 위하여 미세먼지의 흡착을 방지하며, 피부장벽을 강화하고, 피부 보습을 개선하며, 피부 세포에 항산화 물질을 공급하며, 미세먼지에 의해 손상된 세포를 치유하는 효과를 동시에 갖는 조성물은 아직 개발되지 않은 실정이다.

0001)한국 공개특허 제10-2018-0011685호 0002)한국 공개특허 제10-2013-0038002호 0003)한국 공개특허 제10-2011-0086367호 0004)한국 등록특허 제10-2002-0077791호

본 발명은 이러한 문제를 해결하기 위하여 개발된 것으로, 미세먼지 흡착방지능 뿐만 아니라, 피부장벽강화, 피부보습 개선, 항산화 효능, 손상세포 치유 효능이 있는 유자 발효물을 포함하는 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

한편, 본 발명에서 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급하지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 유자발효물을 포함하는 미세먼지 흡착방지용 유자 발효 조성물을 제공한다.

상기 유자 발효 조성물은 미세먼지에 의해 유도되는 세포독성 차단능을 갖는 것을 특징으로 하는 미세먼지 흡착방지용 조성물일 수 있다.

상기 유자발효물은 유자 추출물을 락토바실러스 균으로 발효시킨 것을 특징으로 하는 미세먼지 흡착방지용 조성물일 수 있다.

본 발명은 유자 발효물을 포함하는 상처치유 활성용 조성물을 제공한다.

본 발명은 유자 발효물을 포함하는 아토피 증상의 개선 및 완화용 조성물을 제공한다.

본 발명은 유자 발효물을 포함하는 피부 보습 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명은 유자 발효물을 포함하는 항산화용 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 유자 발효물을 포함하는 피부장벽강화 용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 유자 발효물을 포함하는 화장료 또는 피부외용제 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 유자를 열수추출하여 유자추출물을 제조하는 단계; 및

상기 유자추출물을 락토바실러스 람노서스균으로 발효하는 단계;

상기 발효물을 여과하여 유자발효물을 제조하는 단계;를 포함하는 유자 발효물 제조방법을 제공한다.

상기 락토바실러스 람노서스 균은 유자추출액 중량 대비 0.1~1%인, 유자 발효물 제조방법일 수 있다.

상기 발효 온도는 32~37℃이고, 발효 시간은 3 내지 5일인, 유자 발효물 제조방법일 수 있다.

본 발명에 따른 유자발효물을 피부에 적용하면, 피부에 악영향을 주는 미세먼지가 피부에 흡착되지 않도록 할 수 있을 뿐 아니라, 피부보습 및 피부장벽 강화, 항산화, 손상된 피부세포의 상처치유 활성 효과를 제공할 수 있다.

다만, 본 발명에서 얻을 수 있는 효과는 이상에서 언급한 효과들로 제한되지 않으며, 언급하지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

도1은 피부장벽강화인자 Filaggrin (FLG) 생성량 증가효과를 확인한 실험 그래프에 대한 그림이다.
도3은 피부보습개선 시험에 대한 실험결과이다.
도4는 항산화 효과 (DPPH 라디칼소거활성)에 대한 실험결과이다.
도5는 미세먼지에 의해 유도되는 세포독성 차단효과에 대한 실험 그래프에 대한 그림이다.
도6은 인체 미세먼지 흡착방지 시험에 대한 실험 그래프 그림이다.
도7은 유자 발효물의 상처 치유 활성을 시험하기 위하여 세포의 표면을 일정하게 그어 주어 상처를 낸 후 평가 약물을 처리하고, 일정시간이 지난 후 세포 간격이 세포생육에 따라 채워지는 간격 변화를 현미경으로 측정하여 비교한 사진이다.
도8은 유자 발효물의 상처치유 활성시험 위하여 유자발효물의 처리 농도에 따른 흡광도를 비교한 것에 대한 그림이다.
본 발명의 특성 및 장점에 대한 중요성은 첨부된 도면을 참조하여 더욱 잘 이해하게 될 것이다. 그러나 도면은 단지 예시의 목적으로 고안된 것이지 본 발명의 제한을 정의하는 것이 아님을 이해하여야 한다.

이하에서는, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시 예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명에 관한 설명은 구조적 내지 기능적 설명을 위한 실시 예에 불과하므로, 본 발명의 권리범위는 본문에 설명된 실시 예에 의하여 제한되는 것으로 해석되어서는 아니 된다. 즉, 실시예는 다양한 변경이 가능하고 여러 가지 형태를 가질 수 있으므로 본 발명의 권리범위는 기술적 사상을 실현할 수 있는 균등물들을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 발명에서 제시된 목적 또는 효과는 특정 실시예가 이를 전부 포함하여야 한다거나 그러한 효과만을 포함하여야 한다는 의미는 아니므로, 본 발명의 권리범위는 이에 의하여 제한되는 것으로 이해되어서는 아니 될 것이다.

본 발명에서 서술되는 용어의 의미는 다음과 같이 이해되어야 할 것이다.

"제1", "제2" 등의 용어는 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하기 위한 것으로, 이들 용어들에 의해 권리범위가 한정되어서는 아니 된다. 예를 들어, 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다. 어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "연결되어" 있다고 언급된 때에는, 그 다른 구성요소에 직접적으로 연결될 수도 있지만, 중간에 다른 구성요소가 존재할 수도 있다고 이해되어야 할 것이다. 반면에, 어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "직접 연결되어" 있다고 언급된 때에는 중간에 다른 구성요소가 존재하지 않는 것으로 이해되어야 할 것이다. 한편, 구성요소들 간의 관계를 설명하는 다른 표현들, 즉 "~사이에"와 "바로 ~사이에" 또는 "~에 이웃하는"과 "~에 직접 이웃하는" 등도 마찬가지로 해석되어야 한다.

단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함하는 것으로 이해되어야 하고, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 설시된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이며, 하나 또는 그 이상의 다른 특징이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

여기서 사용되는 모든 용어들은 다르게 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 것으로 해석되어야 하며, 본 발명에서 명백하게 정의하지 않는 한 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미를 지니는 것으로 해석될 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 유자 발효물을 포함하는 미세먼지 흡착방지용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에서 유효성분으로 이용되는 유자(柚子)는 유자나무(Citrus junos)의 열매로서 한쪽으로 치우친 공 모양이며 지름 4∼7cm이다. 빛깔은 밝은 노랑색이고 껍질이 울퉁불퉁하다. 향기가 좋으며 과육이 부드러우나 신맛이 강하다. 원산지는 중국 양쯔강 상류이다. 종류에는 청유자, 황유자, 실유자가 있다. 한국·중국·일본에서 생산하는데, 한국산이 가장 향이 진하고 껍질이 두텁다. 국내 주요 산지로는 전라남도 고흥·완도·장흥·진도와 경상남도 거제·남해·통영 등이다.

한편, 본 명세서에서 용어 “유자”는 유자의 다양한 부위“가지, 뿌리, 잎, 꽃”를 의미하며 그 중에서도 열매 부분을 주 로 하여 본 발명을 완성하였다.

이하 실시예를 통하여 유자 추출물, 유자 추출물을 발효하여 얻은 유자 발효물의 제조방법과, 유자발효물의 효능을 실험예를 통하여 설명한다.

[실시예]

[제조예]

1. 유자 발효물 제조

(유자 추출물 제조 단계) 본 발명에 있어서, 유자는 과육전체를 건조 후 분쇄한 뒤 정제수를 시료 대비 10 내지 30배 부피량으로 가한 후 60 내지 100℃에서 1 내지 5시간동안 열수 추출을 수행하였다. 상기 추출을 수행한 후, 0.45 ㎛ 여과지로 여과하였다.

상기 정제수 부피가 10배 미만인 경우에는 유효성분이 충분히 추출되지 않고, 30배를 초과한 경우에는 부피대비 추출효율이 낮아 경제적이지 못하다.

또한, 추출온도가 60℃ 미만인 경우에는 추출성분이 충분히 추출되지 않고, 100℃를 초과한 경우 효능 성분이 파괴되고 기화로 인해 안전성 문제가 야기될 수 있다.

추출시간이 1시간 미만이면 유효성분이 충분히 용출되지 못하며, 5시간을 초과하면 유효성분이 파괴될 수 있다.

(유자 발효물 제조단계) 상기 유자추출물 제조단계에서 수득한 여액에 락토바실러스 람노서스균을 0.05~3% 용량으로 가한 후 32~37℃에서 3 내지 5일간 발효과정을 진행하였으며, 발효액을 필터하여 유자 발효물을 제조하였다.

상기 락토바실러스균은 아시도필루스(acidophilus), 람노서스(rhamnosus), 파라카제이(paracasei), 불가리쿠스(bulfaricus), 퍼맨텀(fermentum), 플란타룸(plantarum), 살리바리우스(salivarius), 브레비스(brevis) 등일 수 있으나, 바람직하게는 락토바실러스 람노서스이다.

상기 균이 0.05% 미만이면 충분히 발효되지 못하고, 3%를 초과하면 과발효될 수 있다.

본 발명의 유자 발효물의 효과가 가장 잘 발휘되는 최적의 실시예는 상기 락토바실러스 람노서스 균이 유자추출액 중량 대비 0.1~1%인 경우이다.

또한 발효 온도가 32℃ 미만이면 발효시간이 오래 걸리고, 37℃를 초과하면 빠른 발효로 인해 원하는 효능 성분이 충분히 생성되지 못할 수 있다.

발효 기간이 3일 미만이면 충분히 발효되지 못하고, 5일을 초과하면 유효성분이 과발효될 수 있다.

[시험예 1] 피부세포 배양

피부각질세포 배양

피부각질형성세포인 HaCaT 세포는 Cell Line Service GmbH. (Germany)에서 분양받아 사용하였다. penicillin-streptomycin과 fetal bovine serum(FBS)이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂항온기에서 배양하였으며, 2~3일 간격으로 계대배양을 시행하였다.

[시험예 2] 피부장벽강화

[시험예 2-1] 세포독성평가

세포에서의 독성을 확인하기 위하여 HaCaT 세포를 배양 DMEM 배지를 이용하여 1 × 10⁵ cells/mL로 분주하여 37℃, 5% CO2 조건에서 18 시간 동안 배양하였다. 배양된 세포에 serum-free 배지로 교환하여 평가하고자 하는 약물을 처리하였다. 이후 EZ-cytox를 각 well에 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건에서 30분 동안 반응시킨 후, microplate reader를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료 군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 세포생존율을 평가하였다.

[시험예 2-2] 피부장벽강화인자 Filaggrin (FLG) 생성량 증가효과 확인

HaCaT 세포를 24 well plate에 1.0 × 10⁵ cells/mL로 분주하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 18시간 동안 배양하였다. Serum-free DMEM으로 교환하고 상기 제조예에 의해 제조된 추출물 및 발효물을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 각 군마다 배양액 제거 및 PBS로 세척 후 단백질 정량에 영향을 줄 수 있는 약물이 포함되지 않은 PBS를 처리하였다. 이는 저온, 상온 incubation을 반복하여 세포를 용해시킨 후 단백질을 수거하였다. 정량은 Filaggrin-ELISA kit (Elabscience Biotechnology Co.,Ltd )를 이용하였으며 제조사에서 제공한 방법에 의해 진행하였다. (도1 및 표1 참조)

처리농도(%)	피부장벽 (필라그린)
	유자추출물	유자발효물
-	100 ± 0.1
0.5%	91.5 ± 0.1	112.0 ± 0.1
1.0%	101.3 ± 0.1	138.5 ± 0.1
2.0%	91.0 ± 0.2	165.8 ± 0.3
Retinoic acid (10 uM)	137.7 ± 0.2

* P<0.01 vs Control, # P<0.01 vs Yuza Extract

표 1을 참조하면, 유자발효물이 유자추출물보다 FLG 생성량이 현저히 증가하는 것을 확인하였다. 유자발효물의 경우, 농도의존적으로 증가하는 반면, 유자추출물은 1.0%까지는 증가하고 있으나, 2% 이상부터는 오히려 감소함을 확인하였다.

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[시험예 4] 피부보습개선 시험

피부 보습 측정은 Corneometer CM825(Courage-Khazaka eletronic GmbH, Germany)를 이용하여 측정하였다. 유자발효물 사용 전후에 동일한 부위를 측정하였고, 측정 시 Corneometer probe를 피부에 접촉시켜 Sensor를 통해 3회 실시하여 그 평균값을 수분함유량 평가 자료로 사용하였다. Corneometer는 피부를 기본적으로 부도체로 보고 수분이 많이 함유될수록 전기가 잘 통하는 성질을 응용한 장비로, 탐침이 접촉하는 곳의 정전용량(capacitance)을 측정한다. 따라서 수분함유량과 정전용량은 서로 비례하는 경향이 있어 피부의 보습도가 높을수록 측정되는 수치가 높아진다. 단위는 단위상수인 arbitrary unit(A.U)이며, 피부 수분함유량과 측정값은 비례한다.

시간	피부보습력(측정값)		피부보습력 변환률(%)
	비교군	유자발효물(2%)	비교균	유자발효물(2%)
처리전	28.656 ± 2.294	30.256± 8.001	100.0	100.0
0 min	28.600 ± 1.880	103.944 ± 5.395	99.8	343.5
5 min	29.378 ± 2.117	87.089 ± 13.419	102.5	287.9
15 min	29.744 ± 2.932	82.478 ± 12.144	103.8	272.6
30 min	28.444 ± 2.988	77.667 ± 7.304	99.3	256.7

비교군 부위 대비 유자발효물 사용부위는 2-2.5배 높은 보습력을 나타냈다. 따라서 유자발효물은 피부 보습력 개선에 도움을 줄 수 있는 원료로 판단된다.

위의 시험예 2-4를 종합하면, 본 발명의 유자발효물은 피부장벽 강화 능력 및 보습능력이 우수할 뿐 아니라 필라그린 생성능력이 우수함을 확인하였으며, 피부건조증 및 가려움증 등의 증상을 나타내는 아토피 증상의 개선 및 회복에 중요한 역할을 할 것으로 기대된다.

[시험예 5] 항산화 효과 (DPPH 라디칼소거활성)

자유라디칼 소거시험은 안정한 DPPH의 흡광도가 517 nm에서 최대 흡광도를 나타내는 것을 이용, 자유라디칼인 DPPH가 시료에 의해 소거되어 보라색에서 옅은 노란색이 될수록 즉, 자유라디칼 소거율이 증가될수록 상기 517 nm파장에서 흡광도가 줄어들게 됨을 응용하여 하기와 같은 검정시험방법에 의해 진행하였다.

먼저 300 uM 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl radical(DPPH, Sigma)용액 1 mL에 상기의 발효물 시료를 메탄올에 적당한 농도로 희석하여 1 mL를 혼합하고, 실온에서 15분간 방치한 후 microplate reader를 이용하여 517 nm파장에서 흡광도를 측정하였다.

상기 자유라디칼소거시험에서 대조군은 DPPH 1 ml과 메탄올 1 ml을 넣어 같은 방법으로 측정하였으며, 메탄올 1 ml과 시료 1 ml을 넣어 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정 값을 얻는 것으로 설정하였다.(도 4 및 표4 참조)

처리농도(%)	DPPH 라디칼소거활성 (%)
	유자추출물	유자발효물
처리전	0.0 ± 2.6
0.5%	12.7 ± 0.4	47.2 ± 1.6
1.0%	17.4 ± 0.8	73.0 ± 0.4
2.0%	23.9 ± 1.3	90.8 ± 0.5
5.0%	48.6 ± 1.6	92.2 ± 0.2
Ascorbic acid (0.005%)	48.3 ± 3.3

* P<0.05 vs Control, ** P<0.01 vs Control

유자 추출물 및 유자 발효물 모두 농도가 증가함에 따라 라디칼소거활성이 증가하였으나, 본 발명의 유자 발효물은 유자추출물보다 항산화효과가 3-4배 가량 높았다.

[시험예 6] 미세먼지에 의해 유도되는 세포독성 차단효과

EZ-cytox assay는 water solution tetrazolium salt (WST)가 살아있는 세포의 탈수소효소(Dehydrogenase)와 반응하여 주황색의 수용성 formazan을 생성하는 원리를 이용하여 세포생존율을 측정하는 대표적인 방법이다.

미세먼지에 의해 유도되는 세포독성에 유자발효물이 미치는 영향을 알아보기 위하여 HaCaT 세포를 배양 DMEM 배지를 이용하여 1 × 10⁵ cells/mL로 분주하여 37℃, 5% CO2 조건에서 18 시간 동안 배양하였다. 배양된 세포에 serum-free 배지로 교환하여 평가하고자 하는 약물을 처리하였다. 이후 PM10을 200 μg/ml로 처리하고 48시간 배양하였다. 배양이 끝난 후 EZ-cytox를 각 well에 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 30분 동안 반응시킨 후, microplate reader를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료 군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 세포생존율을 평가하였다.(도 5 및 표 5 참조)

구분			세포성장률 (%)
control		control	100.0 ± 5.1
PM10 (200ug/ml)	유자발효물	0	80.0 ± 0.6
		0.5%	92.8 ± 2.4
		1.0%	95.5 ± 2.1
		2.0%	103.1 ± 1.9

# P<0.01 vs Control, * P<0.01 vs PM10 treated

미세먼지 (PM10)에 의해 피부세포 생존율이 유자발효물을 처리하지 않은 경우에는 80%로 감소하였으나, 발효유자물을 처리한 경우에는 농도가 증가할 수록 세포 성장률도 함께 증가하는 것으로 보아 유자발효물이 미세먼지 (PM10)에 의해 야기되는 세포독성을 감소시키는데 유용함을 확인하였다.

[시험예 7]인체 미세먼지 흡착방지 시험

미세먼지 모사체 흡착방지를 확인하기 위해 시험대상자의 전박부에 시험부위 및 인공피지 도포 부위(가로*세로 1.5*4cm)를 구획한 뒤, 인공피지를 도포 한 후, 시험 부위에만 시험제품을 추가로 도포 하였다. 전박부에 인공피지를 도포하여 안면부위와 유사한 조건을 유도하였다. 시험대상자의 전박부를 미세먼지 모사체가 부유할 수 있는 분사기기 내 밀폐 공간으로 이동시킨 후, 미세먼지 모사체(Carbon)의 적당량(약 1.5g)을 사방으로 분사하여 흡착을 유도했다. Folliscope 5.0을 사용하여 시험부위를 촬영하였다. 촬영한 이미지는 Image-proⓡ plus(Media Cybernetics, USA)로 분석하고 이미지에 특정 영역을 지정한 다음 그 영역 내의 미세먼지 모사체의 Pixel을 분석하여 평가한다.(도 6 및 표 6 참조)

미세먼지 흡착방지
비교군	유자발효물(2%)
2178.667 ± 785.299	1954.333± 349.760

인공피지와 시험제품 사용부위는 인공피지 단독 사용부위보다 10.297% 미세먼지 모사체가 덜 부착되는 것으로 확인되었다. 따라서 유자발효물은 미세먼지 흡착방지에 도움을 줄 수 있는 물질로 판단된다.

[시험예 8]상처치유 활성시험

유자발효물의 상처 치유 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 실시하였다.

HaCaT 세포를 배양 DMEM 배지를 이용하여 1 × 10⁵ cells/mL로 분주하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 80%가 될 때까지 배양하였다. 배양되고 있는 세포의 표면을 일정하게 그어 주어 상처를 낸 후 배양된 세포에 serum-free 배지로 교환하여 평가하고자 하는 약물을 처리하고 24시간 배양하였다. 배양이 끝난 후 일정한 세포 간격이 세포 생육에 따라 그 간격이 채워지는 변화를 현미경하에서 측정하고 사진을 찍어 그 간격을 비교하였다( 도 7 참조)

또한, 같은 환경하에서 배양이 끝난 후 EZ-cytox를 각 well에 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 30분 동안 반응시킨 후, microplate reader를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료 군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 세포생존율을 평가하였다. (도 8 및 표 7 참조)

구분		세포성장률 (%)
control	0	100.0 ± 5.4
유자발효물	0.5%	104.4 ± 1.3
	1.0%	123.0 ± 1.9
	2.0%	147.3 ± 6.7

유자발효물 처리시 상처부위로의 세포이동을 농도의존적으로 증가시키는 것을 확인하였다.

본 발명의 유자 발효물은 피부외용제 또는 화장료에 적용될 수 있으며, 본 발명의 유자 발효물을 적용한 피부 외용제 또는 화장료 조성물에 포함되는 성분은 상기 유효 성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들어 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 로션, 토너, 크림, 밤, 에센스, 젤, 왁스 등일 수 있다. 예를 들어, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 바디로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 밤, 에센스, 영양에센스, 젤, 왁스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클렌저로로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 제형을 가질 수 있다.

상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 밤, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 피부 외용제 조성물은 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물 또는 피부 외용제 조성물은 통상적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있으며, 예컨대 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 허용 가능한 담체는 제형에 따라 달리할 수 있다. 예컨대, 연고, 페이스트, 크림 또는 젤로 제형화될 때 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물 또는 피부 외용제 조성물은 파우더 또는 스프레이로 제형화될 때, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있고, 스프레이의 경우 클로로플루오로히드로카본, 프로판, 부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 더 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물 또는 피부 외용제 조성물은 용액 또는 유탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 용매, 용해화제, 또는 유탁화제가 사용될 수 있고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-브틸글리콜 오일이 사용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물 또는 피부 외용제 조성물은 현탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리 옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물이 비누로 제형화될 때, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당등이 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물 또는 피부 외용제 조성물은 최종 제품의 품질이나 기능에 따라 업계에서 통상적으로 사용되는 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉 쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 차단제, 습윤화제, 필수오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 추가적으로 함유할 수 있다.

다만, 상기 보조제 및 그 혼합 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 영향을 미치지 않도록 적절히 선택할 수 있다.

Claims (12)

1. 유자발효물을 포함하는 미세먼지 흡착방지용 화장료 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 유자 발효 조성물은 미세먼지에 의해 유도되는 세포독성 차단능을 갖는 것을 특징으로 하는 미세먼지 흡착방지용 화장료 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 유자발효물은 유자 추출물을 락토바실러스 균으로 발효시킨 것을 특징으로 하는 미세먼지 흡착방지용 화장료 조성물.
   
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