KR102640737B1

KR102640737B1 - 고 호흡성 입자의 제조를 위한 새로운 시스테아민의 염

Info

Publication number: KR102640737B1
Application number: KR1020237011259A
Authority: KR
Inventors: 파올로 콜롬보; 알레싼드라 로씨; 그레타 아도르니; 마르코 바르키엘리
Original assignee: 레코다티인더스트리아치미카이파마슈티카에스.피.에이.
Priority date: 2018-05-22
Filing date: 2019-05-17
Publication date: 2024-02-23
Also published as: EP3796888A1; CN112020348A; JP7281485B2; EP3796888B1; BR112020023812A2; JP2021523893A; UA126705C2; ES2908829T3; IL277933A; CA3094909A1; EA202092751A1; CO2020013561A2; WO2019224130A1; LT3796888T; IL277933B1; KR20230051306A; PT3796888T; MX2020012471A; PL3796888T3; US20210236439A1

Abstract

본 발명은 히알루론산 시스테아민 염을 포함하는 흡입성 미세 입자를 제공한다. 또한 이의 제조 방법 및 제약 조성물이 제공된다.

Description

고 호흡성 입자의 제조를 위한 새로운 시스테아민의 염{NEW SALT OF CYSTEAMINE FOR THE PREPARATION OF HIGHLY RESPIRABLE PARTICLES}

시스테아민은 시스틴증(cystinosis)의 치료에 유용한 것으로 알려진 활성 성분이다. 현재까지 Cystagon^®(중주석산 시스테아민 캡슐), Procysbi^®(중주석산 시스테아민의 위액 내성(gastro-resistant) 캡슐) 및 Cystadrops^®(시스테아민 염산염 점안약)과 같은 몇몇 의약품이 유럽에서 이 치료적 표시로 허가되었다.

비교적 최근에 시스테아민은 낭포성 섬유증에 대한 희귀의약품(orphan) 지정을 받았다. 낭포성 섬유증(Cystic Fibrosis; CF)은 각각 점액 또는 소화액과 같은 체액을 분비하는 장/췌장의 분비선과 폐의 세포에 영향을 미치는 유전성 질환이다. 결과적으로 이러한 체액은 탁하고 점성이 있어, 기도와 소화액의 흐름을 모두 차단한다. 이것은 음식의 소화 및 흡수에 문제를 일으킬 뿐만 아니라 최악의 경우에도 장기간의 감염 및 폐의 염증을 가져온다. 폐 기능의 저하로 인해 종종 세균성 감염증의 결과로 발생하는 CF 폐 증상의 악화 또는 급성 악화가 질병율과 사망률(morbidity and mortality)의 주요 원인이다.

현재까지 낭포성 섬유증의 폐 질환은 주로 항생제, 항염증제, 기관지 확장제 및 점액 용해제의 조합으로 치료된다.

시스테아민은 점액의 두께를 줄여 점액을 더 쉽게 제거하고(점액 용해 활성), 동시에 폐의 박테리아에 직접 작용하여 CF 증상을 유리하게 치료하는(항균 활성) 것으로 나타났다.

따라서 시스테아민의 전반적인 (기도에서의 과도한 점액을 낮추고, 반복적인 호흡기 감염을 일으키는 데에 책임이 있는 박테리아를 죽이고, 이들이 집단적으로 서식하는 생물막을 파괴하는) 다중 활성 특성은 CF 환자에게 치료적으로 유익할 수 있다(Graham Devereux 외 "Cysteamine as a Future Intervention in Cystic Fibrosis Against Current and Emerging Pathogens: A Patient-based ex vivo Study Confirming its Antimicrobial and Mucoactive Potential in Sputum" EBioMedicine (2015) 1507-1512; 및 Charrier 외, 2014: http://dx.doi.org/10.1186/s13023-014-0189-2 참조.)

이러한 발견의 결과로 폐 질환 치료를 위한 흡입 가능한 시스테아민 제제가 필요하다. 실제로 폐에서 시스테아민의 효과를 높이기 위해 약물은 환자의 기도에 직접 에어로졸 형태로 전달되어야 한다.

폐 약물 전달은 비 침습적 투여 경로, 낮은 대사 활성, 제 1 통과 대사 기피, 신속한 전신 흡수 및 무엇보다 폐 점막 감염/염증을 대조하고, 및 조직의 치유를 향상시킬 수 있는 높은 국소 약물 농도와 같은 약물의 투여 측면에서 많은 이점을 가지고 있다. 그러나 인체에 유입된 외래 입자에 맞서기 위해 폐는 여러 가지 제거 메커니즘(점액 섬모 수송, 폐포대식세포, 흡수 및 대사 저하)을 제시하며, 이는 불행히도 치료 효능을 절충시키는 흡입 약물에 대한 장벽으로서 역할을 할 수 있다. 따라서 폐 제거 메커니즘을 제한하고 향상된 치료 효과 및/또는 제어된 약물의 방출을 제공하기 위해, 입자 기반의 약물 전달 시스템이 기존의 흡입 약물 솔루션에 대한 혁신적이고 유망한 대안으로 부상했다.

예를 들어, US 2017/0348254는 활성 성분을 트레할로스 및 류신과 같은 안정화제와 함께 분무-건조하여 제조된 중주석산 시스테아민(cysteamine bitartrate)의 미세 입자(microparticle)를 개시한다. 그러나, 수득된 분말의 공기 역학적 성능은 낮았고 미세 입자 용량은 최소로 보고되었는데, 약 160 내지 270mg 양의 분무-건조된 분말의 에어로졸 화 후 중주석산 시스테아민의 미세 입자 용량이 3 내지 6.9mg에 불과했다. 따라서, 100mg 이상의 분말을 에어로졸 화 한 후 폐에 침착되는 매우 적은 양의 약물을 고려할 때, 높은 호흡성을 갖는 효과적인 흡입 가능한 시스테아민 제제가 여전히 필요하다.

해결해야 할 또 다른 문제는 흡입을 통한 투여 관점에서 고체 상태의 시스테아민의 불안정성이다. 불행하게도 폐 전달을 위한 최적의 크기 범위(1-5μm)에 있는 기존 시스테아민 염(예 : US 2017/0348254에 설명된 것)으로 만든 흡입 가능한 폐 미세 입자는 주로 환경 조건에 대한 활성 성분의 높은 감도로 인해 폐에 침투하는 것이 매우 불량한 것으로 나타난다. 사실, 전술한 염은 흡습성 및 조해성을 가지며 산화 분해되기 쉽다. 게다가, 염산 및 중주석산염(bitartrate)과 같은 상업적으로 입수 가능한 제품으로부터 알려진 시스테아민 염은 상기 염을 건조 분말 제제로서 흡입에 적합하지 않게 만드는 불량한 공기 역학적 특성을 결정하는 바람직하지 않은 입자 크기를 가진다.

게다가 CN 101 367 884는 시스테아민을 공유 결합(아미드 결합)하는 티올화 히알루론산 접합체 및 이의 제조 방법을 개시한다. 상기 방법은 카복실기 그룹을 활성화하기 위해 히알루론산 용액에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노 프로필)-카보디이미드(EDAC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)를 첨가하는 단계; 그 다음, 시스테아민 염산염을 첨가하고 반응 혼합물을 동결 건조하면 비-주사 제제를 위한 생접착성 물질로서 유용한 약물/중합체 접합체가 제공된다. 그러나 이 방법은 EDAC와 NHS를 모두 포함하며, 시약은 흡입에 안전하지 않은 것으로 인식된다. 더욱이 접합체는 인체용 시스테아민의 인정된 안전성을 수정하는 새로운 화학 물질이다. 마지막으로, 수득된 접합체는 동결 건조된 분말이며, 건조 분말 흡입기(inhaler)에서의 흡입에도 적합하지 않다.

따라서 폐 질환의 치료에서 흡입용 건조 분말로서 시스테아민을 사용하려면 약물의 새로운 안정적이고 호흡 가능한 건조 유도체를 발견해야 한다.

도 1 : a) 시스테아민 염기 입자 및 b) 히알루론산 시스테아민 분무-건조된 미세 입자의 SEM 사진. 분무-건조된 미세 입자는 둥근 구조와 수축된 표면을 보인 반면 시스테아민 염기는 플레이크와 유사한 입자를 나타낸다.
도 2 : a) 시스테아민 염기, b) 히알루론산 나트륨 및 c) 히알루론산 분무-건조 미세 입자의 FT-IR 스펙트럼.
도 3 : 히알루론산 시스테아민 분무-건조된 미세 입자의 FT-IR 스펙트럼.
도 4 : 히알루론산 나트륨, 히알루론산 시스테아민 분무-건조 미세 입자, 히알루론산 분무-건조 분말 및 시스테아민 염기의 ¹³C-NMR 스펙트럼. 히알루론산 시스테아민의 스펙트럼을 다른 것들과 비교하면, 염 형성은 반대 이온, 히알루론산 및 시스테아민 모두의 피크의 존재에 의해 분명하게 입증된다. 그러나, 히알루론산 시스테아민 분무-건조된 미세 입자의 스펙트럼은 반대 이온 단독 및 히알루론산 나트륨의 스펙트럼과 비교할 때 차이를 보여준다.
도 5 : 히알루론산 시스테아민 분무-건조된 미세 입자의 SEM 이미지:
a) 제형 #2 : 2.2% 시스테아민/87.8% 히알루론산 나트륨.
b) 제형 #5 : 13.1% 시스테아민/78.2% 히알루론산 나트륨/8.7% L-류신.
c) 제형 #7 : 13.4% 시스테아민/69.1% 히알루론산 나트륨/17.5% L-류신.
d) 제형 #8 : 12.1% 시스테아민/70.2% 히알루론산 나트륨/17.7% L-류신.

정의

본 발명의 목적을 위해, 용어 "호흡성"은 에어로졸 화 될 분말의 양과 관련하여 폐에 침착된 약물의 양과 관련이 있다.

용어 "미립자 투여 용량"(FPD)은 입자가 5μm 미만의 공기 역학적 직경을 갖는 전달된 투여 용량에서 약물의 양이다. 이 입자는 흡입 중에 폐를 관통할 수 있다. 용어 "미립자 분획"(FPF)은 흡입기를 떠나는 분말의 양인 전달된 투여 용량의 백분율로 표현되는 FPD이다.

용어 "중간 입자 크기"는 입자 크기 분포가 두 집단으로 균등하게 분할되는 μm 단위에서의 입자 직경을 설명한다. 본 발명의 목적을 위해, 중간 입자 크기는 부피 분포(D_V50)에서 계산된다.

이온 교환 수지를 지칭할 때 용어 "총 용량"은 반대 이온(counterion)이 이온 교환을 위해 연결할 수 있는 중량 단위당 이용 가능한 총 사이트(site) 수를 의미한다. 이것은 그램당 밀리그램당량(meq/g)으로 표시된다.

용어 "폐 질환"은 예를 들어 낭포성 섬유증 및 COPD와 같이 폐에 영향을 미치는 모든 호흡기 질환을 포함한다.

약어 "NaHA"는 히알루론산 나트륨(sodium hyaluronate)을 의미하고 "HA"는 히알루론산(hyaluronic acid)을 의미한다. 값을 지칭할 때 용어 "약"은 명시된 값 플러스 또는 마이너스 5%를 의미하고, 범위를 지칭할 때 가장 바깥 쪽 값 플러스 또는 마이너스 5%를 의미한다.

본 발명의 상세한 설명

현재까지 히알루론산과 같은 고분자 물질은 새로운 시스테아민 염의 제조에 사용된 적이 없다.

HA(히알루론산)는 D-글루쿠론산과 N-아세틸글루코사민의 선형 사슬로 구성된 자연 발생 다당류이며, 결합 조직, 활액, 배아 중간엽 및 유리 체액의 세포 외 기질의 풍부한 구성 요소이다. 항염 작용으로 알려져 있지만 히알루론산은 시스테아민의 염을 만드는 반대 이온으로 간주된 적이 없다. 사실, 산도가 좋지 않기 때문에, HA는 고체 형태의 약 염기성 시스테아민으로 안정적인 염을 형성할 것으로 예상되지 않는다. 또한, HA는 약염기성 시스테아민과 염 형성을 방지하는 히알루론산의 나트륨 염의 형태로 시판되고 있다.

광범위한 실험 후, 본 발명의 발명자들은 이제 놀랍게도 고체 형태로 안정하고 높은 호흡성 미세 입자(microparticle)를 만드는 데 유리하게 작용할 수 있는 히알루론산 시스테아민 염(cysteamine hyaluronate salt)을 쉽게 얻을 수 있다는 것을 발견했다.

따라서, 본 발명의 첫 번째 목적은 히알루론산 시스테아민(cysteamine hyaluronate) 미세 입자의 제조 방법이며, 상기 방법은 다음 단계들을 포함한다:

a. 히알루론산 나트륨을 용해하는 단계.

b. 이온 교환 수지를 추가하는 단계.

c. 얻은 용액을 필터링하는 단계.

d. 시스테아민 염기를 추가하는 단계.

e. 얻어진 용액을 분무-건조하는 단계.

자세히 설명하면, 단계 a는 22 kDa 내지 2 MDa, 바람직하게는 30 kDa 내지 1 MDa의 분자량을 갖는 히알루론산염 나트륨을 적합한 용매에서 용해시키는 단계이다. 상기 용매는 극성 용매, 바람직하게는 물일 수 있다. 히알루론산염 용액의 pH 값은 6.1에서 6.9 사이이다.

단계 b는 이온 교환 수지, 바람직하게는 양이온 교환 수지를 히알루론산염 용액에 첨가하는 단계이다. 바람직한 실시 예에서, 강산 양이온 교환 수지가 사용된다(예를 들어, 작용기로서 스티렌-DVB 겔 및 술폰산의 Dowex Monosphere™ 650C (H) 매트릭스). 강한 양이온 수지는 일괄 또는 연속 모드로 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 수지는 이온 교환을 완료하는 데 필요한 시간 동안 히알루론산염 용액이 수지와 직접 접촉한 다음 제거됨을 의미하는 일괄 모드로 사용된다. 히알루론산염 나트륨과 수지 사이의 접촉을 증가시키기 위해, 용액은 예를 들어 1 내지 3 시간과 같은 적절한 시간 동안의 교반 하에 유지될 수 있다. 따라서 H⁺ 이온을 Na⁺ 이온으로 교환하는 수지의 능력을 이용하여 히알루론산염 용액에서 유리 히알루론산을 얻는다. 얻어진 HA 용액의 pH 값은 2.2에서 2.8 사이이다.

고갈된 수지는 여과에 의해 HA 용액에서 제거된다(단계 c). 용어 "여과"는 예를 들어, 뷰흐너 깔때기에 의한 여과 또는 막에 의한 여과와 같이 당업자에게 공지된 임의의 여과 방법을 포함하는 것을 의미한다. HA 용액의 회수 후, 시스테아민 유리 염기를 첨가하여(단계 d) 시스테아민 염기/히알루론산의 염 용액을 형성하였다. 단계 d에서 얻은 염 용액은 시스테아민 염기:(히알루론산염으로서) 히알루론산의 중량비(w/w)가 1:3 내지 1:10, 바람직하게는 1:5 내지 1:8, 더욱 바람직하게는 약 1:7의 범위를 가진다. 수득된 염 용액의 pH 값은 약 3.7 내지 6.9 범위이다.

염 용액은 마지막으로 분무-건조 공정(단계 e)을 거친다. 분무-건조는 예를 들어 Bchi 미니 분무-건조기 B-191 또는 B-290과 같은 적합한 분무-건조기를 사용하여 수행되었다. 본 발명의 목적을 위해, 바람직하지만 제한되지 않는 작동 조건 범위는 다음과 같을 수 있다: 120 ~ 160℃의 유입 온도, 80 ~ 100%의 흡인, 2 내지 6mL/min의 공급 속도 및 400 내지 700 L/h의 기류 속도. 또한 노즐 청소 간격은 레벨 5(7초마다 한 번의 압력 타격)로 조정되었다.

유익하게도 상기 건조 단계 e에서는 흡입 가능한 히알루론산 시스테아민의 미세 입자를 쉽게 얻을 수 있다.

실제로, 상기 미세 입자는 중간 입자 크기(D_V50)가 10μm 미만, 바람직하게는 5μm 미만이고 평균의 표준 편차가 ±0.5μm 이하인 로그 정규 크기 분포를 갖는다. 분무-건조 분말의 입자 크기 분포는 레이저 광 산란(SprayTec, Malvern, U.K.)에 의해 결정되었다. 약 10mg의 분말을 시클로헥세인 중의 0.1% (w/V) Span 80의 20ml 용액에 분산시키고, 5분 동안 초음파 처리하였다. [표 1]에 보고된 제제 #2와 #8 중 D_v50과 표준 편차의 값은 각각 2.66 ± 0.03과 2.57 ± 0.06이었다.

분무-건조된 미세 입자의 형태학적 특성은 주사 전자 현미경(SEM, SUPRA 40, Carl Zeiss NTS GmbH, Oberkochen, DE)에 의해 연구되었다. 구체적으로, 시스테아민 염기(도 1(a))는 플레이크와 유사한 입자를 보여주는 반면, 히알루론산 시스테아민 분무-건조된 미세 입자 (b)는 표면이 축소된 둥근 구조를 보여준다. 이 구조는 빈 입자로 만든 분말의 벌크 밀도의 값이 낮기 때문에 소금 입자가 비어 있음을 보여주어 호흡성(respirability)에 중요한 이점을 제공한다. 분말의 벌크 밀도는 Ph. Eur. 최신판에 따라 결정되었다. 얻어진 벌크 밀도의 값은 분말 #2의 경우 0.24 ± 0.02 g/cm³이고 분말 #8의 경우 0.22 ± 0.01 g/cm³이다.

추가로, 분무-건조 조건들은 물리적 및 화학적으로 안정적인 미세 입자 분말을 제공한다. 위에서 논의한 바와 같이, 시스테아민 유리 염기(pKa 9.42)는 용액에서뿐만 아니라 환경 조건에서 분말로도 매우 불안정한 분자이다. 염 반대 이온으로서 히알루론산은 티올레이트 아민(thiolate amine)을 안정화 시킨다. 히알루론산의 중합체 구조에 시스테아민이 포함되어 있기 때문에 흡입용 분무-건조된 미세 입자 분말은 다른 시스테아민 염보다 저장 환경 조건에 대해 더 내성이 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 히알루론산 시스테아민(cysteamine hyaluronate) 및 임의로 제약상 허용되는 첨가제를 포함하는 미세 입자에 관한 것이다. 이 정도까지, 단계 d는 히알루론산 용액에 입자 성형을 개선하거나 입자 안정성을 증가시키는 데 유용한 첨가제(들)를 첨가하는 것을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 제약상 허용되는 첨가제(들)는 류신(leucine)과 같은 아미노산, 트레할로스(trehalose)와 같은 당, 또는 아스코르브산(ascorbic acid) 또는 아세트산과 같은 유기산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 히알루론산 시스테아민의 코팅된 미세 입자에 관한 것이다. 이 정도까지, 단계 e는 노즐에 대해 두 개의 분리된 용액, 내부적으로(내부 오리피스) 활성 성분 중 하나 및 외부적으로(외부 오리피스) 첨가제(들) 중 하나를 동시에 분무할 수 있다. 구체적으로, 내부 오리피스에는 시스테아민 염기/히알루론산 용액이 공급되고, 외부 오리피스에는 첨가제(들)를 포함하는 용액이 공급된다. 그 다음으로 두 용액을 동시에 그러나 개별적으로 직경이 0.5 내지 0.9mm, 바람직하게는 0.7mm인 노즐, 바람직하게는 동축 노즐(coaxial nozzle)을 통해 분사하여 균일한 특성을 갖는 분무-건조 코팅된 미세 입자를 얻을 수 있다.

바람직한 실시 예에서, 선택된 첨가제는 L-류신이다. 류신은 흡입 가능한 입자의 제조에 적합한 윤활제로 알려져 있다. 그러나, 본 발명에 따르면, 외부에 침착된 류신은 히알루론산 시스테아민에 대한 보호 작용을 촉진하여 히알루론산 시스테아민 미세 입자의 물리적/화학적 안정성을 증가시킨다. 사실, 본 발명자들은 놀랍게도 류신이 히알루론산의 접착성과 시스테아민의 흡습성을 모두 상쇄시키는 귀중한 특성을 가지고 있음을 발견했다.

본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 미세 입자는 다음을 포함한다:

10 내지 30% w/w의 시스테아민,

50 내지 80% w/w의 히알루론산, 및

6 내지 20% w/w의 류신.

본 발명에 따른 방법은 느린 공기 흐름을 갖는 안정적인 에어로졸의 형성에 적합한 크기, 밀도 및 모양을 가지는 입자의 분말을 얻을 수 있게 한다. 수득된 에어로졸은 호흡기의 기관지 및 폐포(alveolar) 부분에 도달하기 위해 흡입을 통해 약물 입자가 예측 가능하고 재현 가능한 방식으로 폐로 이동하는 것을 촉진한다.

본 발명의 임의의 측면에 따르면, 수득된 미세 입자 분말의 호흡가능 분획(FPF)은 놀랍게도 60% 이상의 값에 도달할 수 있다. 이것은 첨가제 류신이 첨가된 분말에서 특히 명확하다. 동축 노즐을 사용하여 류신 비율이 10% w/v보다 높은 류신 용액을 분사하면 최적의 결과를 얻을 수 있다. 대신 류신 농도가 낮은 용액은 기존의 노즐을 사용하면 성능이 더 뛰어나다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 히알루론산 시스테아민 미세 입자를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 건조 분말 흡입기에서 히알루론산 시스테아민 미세 입자 또는 이의 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 발명에 의해 다뤄지고 해결된 중요한 문제는 시스테아민의 새로운 안정적인 염 유도체를 제공하는 것이다. 유리하게도, 본 발명의 방법은 히알루론산 시스테아민인 시스테아민의 신규 염을 얻을 수 있게 한다. 따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 히알루론산 시스테아민 염(cysteamine hyaluronate salt)이다.

본 발명의 공정을 통한 신규 히알루론산 시스테아민 염의 형성은 푸리에 변환 적외선(FT-IR) 분광법에 의해 입증되었다.

FT-IR 스펙트럼 측정은 4000-650 nm^-1의 파수 범위에서 투과 모드에서 FT/IR-460 Plus Jasco를 사용하여 실온에서 수행되었다. 분석된 샘플은 분말을 KBr과 함께 모르타르에 1:9(w/w) 비율로 분산시킨 다음, 유압 프레스로 블렌드를 압축하여 준비했다. 히알루론산 분무-건조 미세 입자의 FT-IR 스펙트럼(도 2c)은 카복실기(1734 cm^-1)의 C=O 피크의 신장 진동, 2차 아미드기(1641 cm^-1)의 C=O 피크의 신장 진동 및 NH 변형(II 아미드)(1561 cm^-1)에 기인하는 세 개의 피크로 이루어진 포크 밴드가 있다는 점에서 히알루론산 나트륨 분말(도 2b)의 스펙트럼과 다르다. 또한, 히알루론산 나트륨에 대해서 1417, 1378 및 1320 cm^-1에서 피크의 강도 및 이동의 측면에서 변화가 관찰된다. 마지막으로 1043 cm^-1의 밴드에서 차이가 분명하며 1077 cm^-1에서의 어깨가 피크가 된다.

히알루론산 시스테아민 분무-건조 분말의 FT-IR 스펙트럼과 관련하여(도 3), ~ 1645 cm^-1의 밴드는 시스테아민의 -NH₂ 기의 신장과 히알루론산의 카복실기의 C=O의 신장 모두에 해당한다. 시스테아민 유리 염기 및 히알루론산의 FT-IR 스펙트럼과 비교하여 히알루론산 시스테아민 분무-건조 분말에서 이러한 작용기의 상호 작용을 나타내는 차이가 분명하다. 더욱이, 히알루론산 시스테아민 염(cysteamine hyaluronate salt) 분무-건조 분말의 FT-IR 스펙트럼 분석에서, 1410 cm^-1에서 밴드의 어깨가 되는 1370 cm^-1에서 피크 강도의 감소(히알루론산염 메틸기의 신축 진동)가 관찰된다. 카복실기의 C-O의 신축 진동에 해당하는 1077 cm^-1에서 피크의 강도는 어깨에서의 변형(히알루론산 나트륨의 스펙트럼에서와 같이)에 의해 입증된 것처럼 감소한다. 이것은 히알루론산의 카복실기 및 시스테아민의 아미노기의 레벨에서 시스테아민 염기와 히알루론산 사이의 상호 작용을 추가로 지원한다.

새로운 히알루론산 시스테아민 염(cysteamine hyaluronate salt)의 형성은 고체 상태에서 ¹³C-NMR 분석에 의해 추가로 조사되었다. 시스테아민 유리 염기, 히알루론산 나트륨, 히알루론산 분무-건조 분말 및 히알루론산 시스테아민 분무-건조 분말의 스펙트럼을 고체 모드에서 JNM-ECZR 400 NMR 분광계(Jeol, Peabody, USA)로 수집했다. 히알루론산 시스테아민의 스펙트럼을 다른 것들과 비교해 보면, 두 반대 이온의 피크가 존재함(도 4)으로써 염 형성이 명확하게 입증되며, 이들 반대 이온들(히알루론산 및 시스테아민) 단독에 비해 다른 이웃의 영향으로 인해 이러한 피크가 약간 이동한다. 또한, 히알루론산 나트륨과 히알루론산의 스펙트럼에서 상당한 차이가 관찰된다. 특히, 히알루론산의 스펙트럼에서 약 175ppm에서의 피크에 어깨가 나타나고, 히알루론산염 나트륨의 스펙트럼에 존재하는 약 69ppm에서 피크가 사라진다.

히알루론산 시스테아민은 환경 조건에서 안정적이며 산화 분해, 비 흡습성 및 비 조해성에 취약하지 않다.

실제로 25℃/60% R.H.에서 한 달 후, HPLC 분석에 의한 화학적 안정성과 체외(in vitro) 호흡 테스트에 의한 물리적 안정성을 평가했다. 시간 0에서 히알루론산 시스테아민 분무-건조 분말에 대해서는 시스테아민 불순물 함량 및 미립자 분획의 측면에서 변동이 관찰되지 않았다.

더욱이, 히알루론산염 나트륨은 다중의 폐의 제거 메커니즘을 제한하여 운반된 약물의 폐에 대한보다 효과적이고 지속적인 치료 효과를 얻을 수 있는 것으로 밝혀졌습니다(Ibrahim M. El-Sherbiny 외 "Inhaled nano- and microparticles for drug delivery", Glob Cardiol Sci Pract (2015), 2, 1-14 참조). 따라서, 히알루론산 시스테아민 염의 치료 효과는 시스테아민 및 히알루론산 성분들(moiety) 모두에 할당되어야 한다.

따라서, 본 발명자들은 유리한 화학적/물리적 특성 뿐만 아니라 폐 상피에 대한보다 효과적이고 지속적인 치료 효과 때문에 당업계에 공지된 단점을 극복하는 새로운 시스테아민 염을 놀랍게도 발견했다.

본 발명은 추가로 약제, 특히 폐 질환의 치료, 더욱 특히 낭포성 섬유증 감염 상태의 치료에 사용하기 위한 히알루론산 시스테아민(cysteamine hyaluronate)을 제공한다.

결론적으로, 본 발명의 제조 방법은 이미 쉽게 흡입 가능한 미세 입자 형태의 시스테아민의 안정적인 염 유도체, 즉 히알루론산 시스테아민을 얻을 수 있게 한다.

바람직한 실시 예

여기에 설명된 실시 예는 단지 예시적인 목적을 가지며 본 발명의 범위를 제한하는 것을 의미하지 않는다. 더욱이, 당업자에게 명백한 아래 실시 예의 수정 및 변경은 첨부된 청구 범위에 포함되도록 의도된다.

분무-건조된 히알루론산 시스테아민의 미세 입자의 특성

히알루론산염 나트륨 0.35 MDa (#2-#6) 또는 0.9 MDa (#1)로부터 시작하여, 첨가제(들)가 있거나 없는 히알루론산 시스테아민의 분무-건조된 분말이 본 발명에 따라 제조되었다(표 1). 분자량이 다른 히알루론산염 나트륨의 사용은 분무-건조 분말의 시스테아민 분석, 부피 밀도 및 입자 크기 분포 측면에서 최종 제품의 특성에 악영향을 미치지 않는다.

표 1. 분무-건조된 시스테아민 파우더의 조성물

잔류 수의 양은 25℃ ~ 150℃의 온도 범위에서 열 중량 분석(TGA)으로 평가되었다.

분무-건조된 분말에서 시스테아민의 함량은 구배 모드에서 HPLC 분석에 의해 결정되었다. 구체적으로 HPLC에는 LC-10AS 펌프와 SPD-10A UV-VIS 분광기가 함께 제공되는 Shimadzu LC-10AT 크로마토그래프가 장착되어있다. C18 컬럼은 고정 상으로 사용되었으며, 이동 상은 용매 A(Milli-Q 등급의 물 380ml에 용해된 나트륨 도데실 설페이트 11.52g / 아세토니트릴 300ml / 메탄올 320ml 및 H₃PO₄ 85% v/v 1.4ml) 및 1.4ml/min의 유속에서 구배 방법으로 혼합된 용매 B(아세토니트릴)로 구성되었다. 검출 파장은 210nm로 설정되었다.

흡입 가능한 분말로서 적용에 대한 분말 호흡성의 값은 공기 역학적 직경 결정의 측면에서 특성화되었다.

본 발명에 따라 수득된 분무-건조 분말의 체외 공기 역학적 평가는 고속 스크리닝 임팩터(Fast Screening Impactor; FSI)(Copley Scientific, UK)를 사용하여 수행되었다. FSI는 흡입기에서 배출되는 분말을 두 개의 공기 역학적 입자 분획, 즉 굵은 분획과 미세 분획(공기 역학적 직경이 각각 5μm보다 높고 낮음)으로 분류한다. 굵은 분획 수집기(Coarse Fraction Collector; CFC)에는 60 L/min의 특정 컷오프 크기를 가능하게 하는 인서트가 장착되어 있다: 5μm 이상의 모든 입자는 수집되는 반면, 해당 크기 미만의 모든 입자는 통과한다. CFC에 포획되지 않은 입자는 에어로졸 분말의 호흡 가능한 분획을 구성하고 공기 흐름을 계속 따라간다. 이들은 모두 후속하는 미세 분획 수집기(Fine Fraction Collector; FFC), 예를 들어 필터(타입 A/E 유리 필터, 76mm (Pall 183 Corporation, USA))에 의해 포획된다.

호흡성을 측정하기 위해 정확한 무게의 분무-건조 분말(약 20mg)을 크기 3 경질 HPMC 캡슐에 수동으로 주입했다.

캡슐을 건조 분말 장치(RS01^®, Plastiape Spa, Osnago LC, Italy)의 홀더 챔버에 삽입하고 구멍을 뚫었다. 장치를 FSI에 연결하고 60L/min에서 4초 동안 공기 흐름으로 활성화했다(이 흡입기의 압력 강하 4kPa에 해당함). 따라서, FFC 필터에 침착된 시스테아민의 비율 대 미립자 분획(FPF)으로 정의되는 캡슐에 로드된 양을 HPLC 분석으로 정량화 했다. 각 분말은 이중으로 테스트되었다.

히알루론산 시스테아민 분무-건조된 미세 입자의 형태학적 특성은 주사 전자 현미경(SEM)에 의해 수행되었다. 분무-건조된 미세 입자는 둥근 구조와 작은 수축된 표면을 모두 보여준다. 특히 동축 노즐의 바깥 쪽 오리피스에서 L-류신 용액을 분사하면 해면질 미세 입자가 얻어졌다(도 5(b) 내지 5(d)). 이 입자 모양은 입자 간의 접촉을 줄여 에어로졸 화 측면에서 성능을 보다 효율적으로 만들 수 있다.

실시 예들

염기와 반응하는 히알루론산 용액의 용량

63.25 mg의 NaHA 0.35 MDa를 함유하는 25 ml의 히알루론산 용액을 지시약으로서 브로모티몰 블루를 사용하여 적정하였다. 적정제(0.01 N NaOH 용액)를 지시약이 노란색에서 파란색(pH 약 7.0)으로 변할 때까지 천천히 첨가했다. HA 용액의 중화에는 12.13 ml의 0.01 N NaOH (즉, 0.1213 meq); 따라서 63.25 mg의 NaHA 0.35 MDa는 평균적으로 0.1213 밀리그램당량의 HA를 포함한다. 따라서 63.25mg의 히알루론산 나트륨에서 얻은 히알루론산과 반응할 수 있는 시스테아민 염기(MW 77.15)의 양은 다음과 같이 계산되었다: 0.1213 X 77.15 = 9.358 mg.

용액에서 시스테아민 염기:히알루론산(히알루론산 나트륨 MW 0.35 MDa로서)의 중량비는 약 1:7 w/w이었다.

분무-건조 용 용액은 이 추정된 계산에 따라 제조되었다.

히알루론산 시스테아민의 분무-건조된 미세 입자의 제조

예 #1

500mg의 히알루론산염 나트륨(MW 0.9 MDa)을 자기 교반 하에 50℃에서 170ml의 정제수를 포함하는 플라스크에 도입하였다. 그런 다음 Dowex Monosphere 650C (H) 수지의 용량이 2meq/ml(밀도 1.22g/ml)인 것을 고려하여 500mg의 수지를 히알루론산염 용액에 첨가하고 pH 값이 안정될 때(pH 3.03)까지 약 2 시간 동안 자기 교반 하에 실온에서 접촉시켰다. 얻어진 히알루론산 용액을 뷰흐너 깔때기를 사용하여 여과하고 200ml 부피 플라스크에 수집하였다. 필터에 남아있는 레진을 10ml의 정제수로 세척하여 레진과 깔때기에 남아있는 히알루론산을 추출하였다. 그 후, HA 플라스크에 74 mg의 시스테아민 염기를 용해시켜 혼합하면서 시스테아민/히알루론산의 염 용액을 수득하고, 부피 플라스크는 정제수로 용적이 되도록 하였다.

이어서 상기 개시된 바와 같이 수득된 용액을 분무-건조시켰다. 분무-건조기(Bchi mini B-290)의 작동 조건은 다음과 같이 설정되었다:

T_inlet (℃) 150

T_outlet (℃) 75

흡인 (%) 100

공급 속도 (ml/min) 5

풍량 (L/h) 600

공정의 수율은 62.5%였다. 분무-건조된 미세 입자의 약물 함량은 HPLC 분석에 의해 결정되었다. 수득된 분말은 13.4±1.5%의 시스테아민 함량을 가졌다. 분말의 잔류 수는 25 ~ 150℃의 온도 범위에서 열 중량 분석(Thermogravimetric Analysis; TGA)에 의해 수행되었다. 분말은 7.35%의 수분 함량을 가졌다.

예 #3 - #4 - #5

첨가제를 포함하는 히알루론산 시스테아민 분무-건조된 미세 입자는 시스테아민 염기를 첨가하기 전에 상기 개시된 바와 같이 수득된 히알루론산 용액에 첨가제가 추가로 첨가된다는 유일한 차이점을 가지고 예 #1에 따라 제조되었다.

예 #6

첨가제 류신을 포함하는 히알루론산 시스테아민 분무-건조된 미세 입자는 예 #5에 대해 보고된 방법을 변경하여 제조된 시스테아민/히알루론산 염 용액을 분무-건조하여 제조하였다. 구체적으로 히알루론산염 나트륨을 자기 교반 하에 50℃에서 80ml의 정제수를 담은 플라스크에 도입하였다. 그 후, 수지를 히알루론산염 용액에 첨가하고 pH 값이 안정될 때까지 약 2 시간 동안 자기 교반 하에 실온에서 접촉시켰다. 얻어진 히알루론산 용액을 뷰흐너 깔때기를 사용하여 여과하고 100ml 부피 플라스크에 수집하였다. 필터에 남아있는 레진을 10ml의 정제수로 세척하여 레진과 깔때기에 남아있는 히알루론산을 추출하였다. 그 후, 시스테아민 염기를 HA 플라스크에 용해시켜 혼합하면서 시스테아민/히알루론산의 염 용액을 얻고, 부피 플라스크는 정제수로 용적이 되도록 하였다.

첨가 용액은 정제수와 함께 100ml 부피 플라스크에 류신을 용해시켜 제조하였다.

분무-건조 과정에서 약물과 첨가제의 두 용액이 분리된 동축 노즐을 사용하여 시스테아민/히알루론산 용액에 첨가 용액을 첨가하고, 노즐에서 나오는 용액 흐름이 시스테아민/히알루론산 염 용액(농도 0.46 % w/v)의 내부 흐름과 류신 용액(농도 0.04 % w/v)의 외부 흐름에 의해 만들어지는 방식으로 분무하였다.

Claims

a. 히알루론산 나트륨(sodium hyaluronate)을 용해시키는 단계;
b. 이온 교환 수지를 추가하는 단계;
c. 수득된 용액을 필터링하는 단계;
d. 시스테아민 염기(cysteamine base)를 추가하는 단계; 및
e. 흡입구 온도(T_inlet)는 150℃이고, 토출구 온도(T_outlet)는 60℃이며, 공급 속도는 5mL/min인 분무 건조기의 작동 조건으로, 수득된 용액을 분무-건조(Spray-drying)하는 단계를 포함하는 히알루론산 시스테아민(cysteamine hyaluronate) 미세 입자(microparticle)의 제조 방법으로서,
상기 단계 e에서 수득된 용액의 중량비(w/w)는 시스테아민:히알루론산=12.8:78.5인, 히알루론산 시스테아민 미세 입자의 제조 방법.
a. 히알루론산 나트륨을 용해시키는 단계;
b. 이온 교환 수지를 추가하는 단계;
c. 수득된 용액을 필터링하는 단계;
d. 시스테아민 염기를 추가하는 단계; 및
e. 흡입구 온도(T_inlet)는 120℃이고, 토출구 온도(T_outlet)는 62℃이며, 공급 속도는 4mL/min인 분무 건조기의 작동 조건으로, 수득된 용액을 분무-건조하는 단계를 포함하는 히알루론산 시스테아민 미세 입자 제조 방법으로서,
상기 단계 e에서 수득된 용액의 중량비(w/w)는 시스테아민:히알루론산=13.4:69.1인, 히알루론산 시스테아민 미세 입자의 제조 방법.
a. 히알루론산 나트륨을 용해시키는 단계;
b. 이온 교환 수지를 추가하는 단계;
c. 수득된 용액을 필터링하는 단계;
d. 시스테아민 염기를 추가하는 단계; 및
e. 흡입구 온도(T_inlet)는 150℃이고, 토출구 온도(T_outlet)는 75℃이며, 공급 속도는 4mL/min인 분무 건조기의 작동 조건으로, 수득된 용액을 분무-건조하는 단계를 포함하는 히알루론산 시스테아민 미세 입자 제조 방법으로서,
상기 단계 e에서 수득된 용액의 중량비(w/w)는 시스테아민:히알루론산=12.1:70.2인, 히알루론산 시스테아민 미세 입자의 제조 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 d는 제약적으로 허용되는 첨가제의 첨가를 더 포함하는 히알루론산 시스테아민 미세 입자의 제조 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 e는 노즐에 대해 내부적으로(내부 오리피스) 히알루론산 시스테아민을 포함하는 용액 및 외부적으로(외부 오리피스) 첨가제를 포함하는 용액의 동시 분무를 제공하는 히알루론산 시스테아민 미세 입자의 제조 방법.
제 4항에 있어서,
상기 첨가제는 류신, 트레할로스, 아스코르브산 및 아세트산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 히알루론산 시스테아민 미세 입자의 제조 방법.
제 5항에 있어서,
상기 첨가제는 류신, 트레할로스, 아스코르브산 및 아세트산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 히알루론산 시스테아민 미세 입자의 제조 방법.
시스테아민 12.9%와 87.1% NaHA의 중량비, 시스테아민 12.2%와 NaHA 87.8%의 중량비, 시스테아민 12.7%와 NaHA 87.1%와 아스코르브산 0.2%의 중량비, 시스테아민15%와 NaHA 85%의 중량비에 0.8mL 아세트산, 시스테아민 12.8%와 NaHA 78.5%와 L-류신 8.7%의 중량비, 시스테아민 13.1%와 NaHA 78.2%와 L-류신 8.7%의 중량비, 시스테아민 13.4%와 NaHA 69.1%와 L-류신 17.5%의 중량비, 또는 시스테아민 12.1%와 NaHA 70.2%와 L-류신 17.7%의 중량비로 구성되는 히알루론산 시스테아민 염(cysteamine hyaluronate salt)을 포함하는 미세 입자.
제 8항에 있어서, 5μm 미만의 평균 입자 크기를 갖는 미세 입자.
제 8항에 있어서, 60% 보다 높은 FPF를 갖는 미세 입자.
삭제
청구항 제 8항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 미세 입자를 포함하는 COPD(만성 폐쇄성 폐질환)의 치료에 이용하기 위한 제약 조성물.
청구항 제 8항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 미세 입자를 포함하는 낭포성 섬유증의 치료에 이용하기 위한 제약 조성물.