KR102637622B1 - Composition and method for producing shinorine - Google Patents
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Abstract
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 이를 발현하는 미생물, 상기 미생물의 배양물 또는 분쇄물을 포함함으로써, 저비용, 고수율로 시노린을 생산할 수 있는 조성물 및 시노린 생산 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition capable of producing shinorine at low cost and high yield by comprising a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a microorganism expressing the protein, and a culture or pulverized product of the microorganism, and a method for producing shinorine. .
Description
본 발명은 시노린 생산용 조성물 및 생산 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition and production method for producing shinorine.
해조류는 자외선의 직접적인 영향을 받으며, 그로 인해 자외선 보호 관련 물질을 많이 함유하고 있다. 특히 시노린(shinorine), 포피라- 334(porphyra-334) 등의 마이코스포린 유사 아미노산 (mycosporine-like amino acis, MAAs)은 자외선을 흡수시키는 것으로 알려져 있으며, 특히 310-360 nm 영역의 파장을 효과적으로 흡수한다고 알려져 있어 화장품 소재로 활용되고 있다. 또한 삼투압 조절, 산화적 스트레스에 대한 방어 등 많은 생물학적 과정에 관여한다고 알려져 있으며, 이는 향후 항산화, 항염, 노화 방지 등의 기능성 식품소재로 활용될 가능성을 가진다. Seaweed is directly affected by ultraviolet rays, and as a result, it contains many substances related to UV protection. In particular, mycosporine-like amino acids (MAAs) such as shinorine and porphyra-334 are known to absorb ultraviolet rays, and are particularly effective in the wavelength range of 310-360 nm. It is known to absorb water, so it is used as a cosmetic material. It is also known to be involved in many biological processes, such as osmotic pressure regulation and defense against oxidative stress, and has the potential to be used as a functional food material for antioxidant, anti-inflammatory, and anti-aging purposes in the future.
MAAs는 대부분 해조류에서 얻어지고 있으며, 미세조류 배양 연구 및 분리 정제를 위한 연구가 수행되고 있다. 하지만 이러한 공정은 추출 수율이 낮고, 분리 정제에 많은 비용 및 시간이 소요된다. 따라서 재조합 미생물을 이용한 효율적인 MAAs 생산 공정을 구축한다면 MAAs의 대량 생산이 가능하며 향후 경제적 가치를 창출할 것으로 예상된다.MAAs are mostly obtained from seaweed, and research on microalgae culture and isolation and purification is being conducted. However, this process has a low extraction yield and requires a lot of cost and time for separation and purification. Therefore, if an efficient MAAs production process using recombinant microorganisms is established, mass production of MAAs is possible and is expected to create economic value in the future.
본 발명은 생산 수율이 우수한 시노린 생산용 조성물 및 시노린 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. The purpose of the present invention is to provide a composition for producing shinorine and a method for producing shinorine with excellent production yield.
1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 이를 발현하는 미생물, 상기 미생물의 배양물 또는 분쇄물을 포함하는 시노린 생산용 조성물.1. A composition for producing shinorine comprising a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a microorganism expressing the same, and a culture or pulverized product of the microorganism.
2. 위 1에 있어서, 상기 미생물은 내재적 또는 외인적으로 상기 단백질을 발현하는 것인 시노린 생산용 조성물.2. The composition for producing shinorine according to 1 above, wherein the microorganism expresses the protein intrinsically or exogenously.
3. 위 1에 있어서, 상기 미생물은 사카로마이세스 속 또는 에셰리키아 속 미생물인 시노린 생산용 조성물.3. The composition for producing shinorine according to 1 above, wherein the microorganism is a microorganism of the genus Saccharomyces or Escherichia genus.
4. 위 1에 있어서, 상기 미생물은 디하이드로 퀴네이트 합성효소, O-메틸 전이 효소 및 ATP-그래스프 리가아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 유전자로 더 형질전환된, 시노린 생산용 조성물.4. The method of 1 above, wherein the microorganism is shinorine further transformed with a gene encoding one or more proteins selected from the group consisting of dihydroquinate synthase, O-methyltransferase, and ATP-grasp ligase. Composition for production.
5. 위 4에 있어서, 상기 디하이드로 퀴네이트 합성효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 포함하고, 상기 O-메틸 전이 효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 포함하고, 상기 ATP-그래스프 리가아제를 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 염기서열을 포함하는, 시노린 생산용 조성물.5. In item 4 above, the gene encoding the dihydroquinate synthase includes the base sequence of SEQ ID NO: 2, and the gene encoding the O-methyltransferase includes the base sequence of SEQ ID NO: 3, A composition for producing shinorine, wherein the gene encoding the ATP-grasp ligase includes the base sequence of SEQ ID NO: 4.
6. 위 4에 있어서, 상기 미생물은 자일로스 리덕테이스, 자일리톨 디하이드로지나아제 및 자일룰로 키나아제를 코딩하는 유전자로 더 형질전환된, 시노린 생산용 조성물. 6. The composition for producing shinorine according to 4 above, wherein the microorganism is further transformed with genes encoding xylose reductase, xylitol dehydrogenase, and xylulo kinase.
7. 위 6에 있어서, 상기 자일로스 리덕테이스를 코딩하는 유전자는 서열번호 5 또는 서열번호 6의 염기서열을 포함하고, 상기 자일리톨 디하이드로지나아제를 코딩하는 유전자는 서열번호 7의 염기서열을 포함하고, 상기 자일룰로 키나아제를 코딩하는 유전자는 서열번호 8의 염기서열을 포함하는, 시노린 생산용 조성물.7. In item 6 above, the gene encoding the xylose reductase includes the base sequence of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6, and the gene encoding the xylitol dehydrogenase includes the base sequence of SEQ ID NO: 7. A composition for producing shinorine, wherein the gene encoding the xylulokinase includes the base sequence of SEQ ID NO: 8.
8. 위 4에 있어서, 상기 미생물은 TAL1(transaldolase) 유전자가 제거, 결실, 감쇄 또는 불활성화된 시노린 생산용 조성물.8. The composition for producing shinorine according to item 4 above, wherein the microorganism has the TAL1 (transaldolase) gene removed, deleted, attenuated, or inactivated.
9. 마이코스포린 글라이신을 위 1 내지 8 중 어느 한 항의 조성물과 반응시키는 단계를 포함하는 시노린의 생산 방법.9. A method for producing shinorine comprising the step of reacting mycosporine glycine with the composition of any one of 1 to 8 above.
10. 위 9에 있어서, 반응액에서 시노린을 분리 또는 정제하는 단계를 더 포함하는 시노린의 생산 방법.10. The method for producing shinorine according to item 9 above, further comprising the step of separating or purifying shinorine from the reaction solution.
11. 자일로스 또는 포도당을 위 4 내지 8 중 어느 한 항의 미생물, 상기 미생물의 배양물 또는 분쇄물과 반응시키는 단계를 포함하는 시노린의 생산 방법. 11. A method for producing shinorine comprising the step of reacting xylose or glucose with the microorganism of any one of 4 to 8 above, or a culture or pulverized product of the microorganism.
12. 위 11에 있어서, 반응액에서 시노린을 분리 또는 정제하는 단계를 더 포함하는 시노린의 생산 방법.12. The method for producing shinorine according to item 11 above, further comprising the step of separating or purifying shinorine from the reaction solution.
본 발명은 높은 수율로 시노린을 생산할 수 있다. The present invention can produce shinorine in high yield.
본 발명은 시노린의 생산 비용을 절감할 수 있다.The present invention can reduce the production cost of shinorine.
도 1은 시노린 생합성 경로를 나타낸 것이다.
도 2는 시노린 생산용 조성물을 얻는 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 Actinosynnema mirum 유래의 Amir4259 유전자, Amir4258 유전자, Amir4257 유전자와 Pseudonocardia pini 유래의 D-ala-D-ala ligase를 코딩하는 유전자를 나타낸 것이다.
도 4는 P. pini와 A.mirum의 D-ala-D-ala 리가아제를 코딩하는 유전자와 N.punctiforme의 NRPS-유사 합성효소의 아미노산 서열을 정렬한 것이다. P.pini로부터 유래한 D-ala-D-ala 리가아제는 N.punctiforme과 54.3 %의 유사성, A.mirum과는 61.1%의 유사성을 보여주었다.
도 5는 배치(batch) 발효 프로파일을 나타낸 것이다. 이는 포도당 10 g/L 및 자일로스 10g/L가 함유된 SCD(Leu-) 배지에서 30 ℃, 250 rpm으로 수행되었다. 세포는 초기 OD600=1로 접종되었다.
도 6은 SJSC001 및 SJSC001-pCRS 균주에 의해 생성된 세포 및 배지에서의 시노린 농도를 나타낸 것이다.
도 7은 SJSC001 및 SJSC001-pCRS 균주에 의해 생성된 시노린 함량을 나타낸 것이다.
도 8은 SJSC001 및 SJSC001-pCRS 균주에 의해 생성된 시노린의 생산성을 나타낸 것이다. 오차막대는 삼중 실험의 표준 편차를 나타낸다.
도 9의 A는 실제 표준 시노린(STD) 및 SJSC001-pCRS의 세포 분획과 대조군(SJSC001) 균주의 HPLC 스펙트럼을 나타낸 것이다. 도 9의 B는 SJSC001-pCRS 및 대조군(SJSC001) 균주의 배지 HPLC 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 10의 A는 실제 시노린 표준(STD) 및 SJSC001-pCRS 균주의 세포 추출물의 LC-MS/MS 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다. 도 10의 B는 SJSC001-pCRS 균주 세포 추출물의 LC-MS/MS 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다. Figure 1 shows the shinorine biosynthetic pathway.
Figure 2 shows the process of obtaining a composition for producing shinorine.
Figure 3 shows the genes encoding the Amir4259, Amir4258, and Amir4257 genes from Actinosynnema mirum and the D-ala-D-ala ligase from Pseudonocardia pini .
Figure 4 shows the alignment of the amino acid sequences of the genes encoding D-ala-D-ala ligase of P. pini and A.mirum and the NRPS-like synthase of N.punctiforme . D-ala-D-ala ligase derived from P.pini showed 54.3% similarity to N.punctiforme and 61.1% similarity to A.mirum .
Figure 5 shows the batch fermentation profile. This was performed at 30°C and 250 rpm in SCD (Leu-) medium containing 10 g/L of glucose and 10 g/L of xylose. Cells were seeded at an initial OD of 600 =1.
Figure 6 shows the concentration of shinorine in cells and medium produced by SJSC001 and SJSC001-pCRS strains.
Figure 7 shows the shinorine content produced by SJSC001 and SJSC001-pCRS strains.
Figure 8 shows the productivity of shinorine produced by SJSC001 and SJSC001-pCRS strains. Error bars represent standard deviation of triplicate experiments.
Figure 9A shows the HPLC spectra of the actual standard shinorine (STD) and SJSC001-pCRS cell fractions and the control (SJSC001) strain. Figure 9B shows the medium HPLC spectra of the SJSC001-pCRS and control (SJSC001) strains.
Figure 10A shows the LC-MS/MS spectrum results of the actual shinorine standard (STD) and cell extract of the SJSC001-pCRS strain. Figure 10B shows the LC-MS/MS spectrum results of the SJSC001-pCRS strain cell extract.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 시노린 생산용 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a composition for producing shinorine.
시노린(shinorine)은 남조류, 곰팡이 등이 생산하는 천연 자외선 차단 물질인 마이코스포린 유사 아미노산 (mycosporine-like amino acids, MAAs)에 포함되는 물질이다. 30가지 이상의 물질들이 알려져 있는 마이코스포린 유사 아미노산 중에서도 시노린은 자외선 흡수 파장대가 300 ~ 360 nm로 단독으로 사용하여도 지표면에 도달하는 자외선을 충분히 커버할 수 있고 높은 몰흡광계수에 의해 자외선 차단 효율이 높아서 천연 자외선 차단 물질로 사용하기에 적합하다.Shinorine is a substance included in mycosporine-like amino acids (MAAs), which are natural UV-blocking substances produced by blue-green algae and mold. Among the mycosporine-like amino acids, of which more than 30 substances are known, shinorine has an ultraviolet absorption wavelength range of 300 to 360 nm, so even when used alone, it can sufficiently cover ultraviolet rays reaching the earth's surface, and its high molar extinction coefficient makes it effective in blocking ultraviolet rays. Because it is high, it is suitable for use as a natural UV blocking material.
예를 들면 시노린은 하기 화학식 1로 표시되는 것일 수 있다.For example, shinorine may be represented by the following formula (1).
[화학식 1][Formula 1]
본 발명의 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 이를 발현하는 미생물, 상기 미생물의 배양물 또는 분쇄물을 포함한다. The composition of the present invention includes a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a microorganism expressing the protein, and a culture or pulverized product of the microorganism.
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하고 있는 유전자는 D-ala-D-ala ligase를 코딩하는 유전자이며, 이는 슈도노카르디아 피니(Pseudonocardia pini)로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 9의 염기서열을 갖는 유전자일 수 있다. The gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is a gene encoding D-ala-D-ala ligase, and may be derived from Pseudonocardia pini . The gene encoding the protein may be a gene having the base sequence of SEQ ID NO: 9.
상기 단백질을 발현하는 미생물은 내재적 또는 외인적으로 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 발현하는 것일 수 있다. The microorganism expressing the protein may endogenously or exogenously express a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
상기 단백질을 외인적으로 발현하는 경우, 상기 미생물은 상기 단백질을 코딩하는 유전자로 형질전환된 것일 수 있다. When the protein is exogenously expressed, the microorganism may be transformed with a gene encoding the protein.
형질전환 방법으로는, 당 분야에서 공지된 기술, 예들 들어, 전기천공법(electroporation), 전기주입법(electroinjection), 미세주입법(microinjection), 인산칼슘공동-침전법(calcium phosphate co-precipitation), 염화캄슘/염화루비듐법, 레트로바이러스 감염(retroviral infection), DEAE-덱스트란(DEAE-dextran), 양이온 리포좀(cationic liposome)법, 폴리에틸렌 글리콜 침전법(polyethyleneglycol-mediated uptake), 유전자총(gene gun) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Transformation methods include techniques known in the art, such as electroporation, electroinjection, microinjection, calcium phosphate co-precipitation, and chloride. Calcium/rubidium chloride method, retroviral infection, DEAE-dextran, cationic liposome method, polyethylene glycol-mediated uptake, gene gun, etc. can be used, but is not limited to this.
형질전환은 당 분야에 공지된 플라스미드, 레트로바이러스, 아데노바이러스 등의 바이러스성 벡터, 비바이러스성 벡터 등을 제한 없이 사용하여 유전자를 도입하는 방식으로 수행된 것일 수 있으며, 상기 벡터에 유전자의 도입하는 것은 CRISPR/Cas9 유전자 가위를 이용한 것일 수 있다. Transformation may be performed by introducing a gene using, without limitation, viral vectors such as plasmids, retroviruses, adenoviruses, etc. known in the art, non-viral vectors, etc., and the introduction of genes into the vectors This may be using CRISPR/Cas9 gene scissors.
상기 미생물은 시노린의 생산에 적합한 미생물이면 제한 없이 가능하다. 상기 미생물은 박테리아, 곰팡이, 또는 이들의 조합일 수 있으며, 박테리아는 그람 양성 박테리아, 그람 음성 박테리아, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 미생물은 사카로마이세스 속 또는 에셰리키아 속일 수 있으며, 예를 들어, 사카로마이세스 세르비지애(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다. The microorganism may be used without limitation as long as it is suitable for the production of shinorine. The microorganism may be a bacterium, a fungus, or a combination thereof, and the bacteria may be a gram-positive bacterium, a gram-negative bacterium, or a combination thereof. The microorganism may be of the genus Saccharomyces or Escherichia, for example, Saccharomyces cerevisiae .
상기 미생물은 인산 오탄당 경로에 관여하는 효소가 존재하거나 추가된 것일 수 있다. 예를 들면, 포도당-6-인산 탈수소효소, 글루코노락토나아제, 6-포스포글루코네이트 탈수소효소, 리보스-5-포스페이트 이성질화 효소 및 트랜스케톨레이스를 코딩하는 유전자가 미생물 내에 존재하거나, 미생물이 상기 유전자로 형질전환된 것일 수 있다.The microorganism may contain or have added enzymes involved in the phosphate pentose pathway. For example, genes encoding glucose-6-phosphate dehydrogenase, gluconolactonase, 6-phosphogluconate dehydrogenase, ribose-5-phosphate isomerase, and transketolase exist in microorganisms, or This may have been transformed with the above gene.
미생물의 배양물은 배양 후 미생물을 포함한 배지, 배양 후 미생물은 분리된 배지 또는 배양 중 미생물이 분비한 물질 등을 포함하는 것일 수 있다. 배지는 고체 배지 또는 액체 배지일 수 있다.A culture of microorganisms may include a medium containing microorganisms after culture, a medium from which microorganisms were separated after culture, or substances secreted by microorganisms during culture. The medium may be a solid medium or a liquid medium.
미생물의 분쇄물은 소니케이션(sonication) 등을 통한 미생물의 분쇄물로서, 상기 미생물 내의 상기 단백질을 포함하는 것일 수 있다.The pulverized product of microorganisms is a pulverized product of microorganisms through sonication, etc., and may include the proteins within the microorganisms.
상기 미생물은 디하이드로 퀴네이트 합성효소, O-메틸 전이 효소 및 ATP-그래스프 리가아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 유전자로 더 형질전환된 것일 수 있다.The microorganism may be further transformed with a gene encoding one or more proteins selected from the group consisting of dihydroquinate synthase, O-methyltransferase, and ATP-grasp ligase.
시노린은 오탄당 인산 경로의 중간체인 sedoheptulose 7-phosphate(S7P) 로부터 2-demethyl 4-deoxygadusol(DDG), 4-deoxygadusol(4-DG), myscosporine-glycine(MG) 순서로 전환된 후 생산될 수 있다.Shinorine can be produced by converting sedoheptulose 7-phosphate (S7P), an intermediate in the pentose phosphate pathway, into 2-demethyl 4-deoxygadusol (DDG), 4-deoxygadusol (4-DG), and myscosporine-glycine (MG). there is.
디하이드로 퀴네이트 합성효소(3-dehydroquinate synthase, DHQS)는 S7P를 DDG로 전환시키는 효소이며, 이를 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 유전자(Amir4259)일 수 있다. Dehydroquinate synthase (3-dehydroquinate synthase, DHQS) is an enzyme that converts S7P to DDG, and the gene encoding it may be a gene ( Amir4259 ) having the base sequence of SEQ ID NO: 2.
O-메틸 전이 효소(O-methyl transferase, O-MT)는 DDG를 4-DG로 전환시키는 효소이며, 이를 코딩하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 유전자(Amir4258)일 수 있다. O-methyl transferase (O-MT) is an enzyme that converts DDG to 4-DG, and the gene encoding it may be a gene ( Amir4258 ) having the base sequence of SEQ ID NO: 3.
ATP-그래스프 리가아제(ATP-grasp ligase)는 4-DG를 MG로 전환시키는 효소이며, 이를 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 염기서열을 갖는 유전자(Amir4257)일 수 있다. ATP-grasp ligase is an enzyme that converts 4-DG into MG, and the gene encoding it may be a gene ( Amir4257 ) having the base sequence of SEQ ID NO: 4.
형질전환에 대해서는 상기 설명과 같다.Transformation is the same as described above.
상기 미생물을 디하이드로 퀴네이트 합성효소, O-메틸 전이 효소 및 ATP-그래스프 리가아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 유전자로 더 형질전환 시켜, 포도당으로부터 시노린을 생산할 수 있다. The microorganism can be further transformed with a gene encoding one or more proteins selected from the group consisting of dihydroquinate synthase, O-methyltransferase, and ATP-grasp ligase to produce shinorine from glucose.
상기 미생물은 자일로스 리덕테이스, 자일리톨 디하이드로지나아제 및 자일룰로키나아제를 코딩하는 유전자로 더 형질전환된 것일 수 있다. The microorganism may be further transformed with genes encoding xylose reductase, xylitol dehydrogenase, and xylulokinase.
자일로스 리덕테이스, 자일리톨 디하이드로지나아제 및 자일룰로키나아제는 자일로스의 대사에 관여하는 효소이다. Xylose reductase, xylitol dehydrogenase, and xylulokinase are enzymes involved in the metabolism of xylose.
자일로스 리덕테이스(xylose reductase, XR)는 NADH 또는 NADPH 의존적으로 자일로스의 자일리톨로의 환원을 촉매한다. 이를 코딩하는 유전자는 서열번호 5 또는 6의 염기서열을 갖는 유전자일 수 있다. Xylose reductase (XR) catalyzes the reduction of xylose to xylitol in an NADH- or NADPH-dependent manner. The gene encoding this may be a gene having the base sequence of SEQ ID NO: 5 or 6.
자일리톨 디하이드로지나아제(xylitol dehydrogenase, XDH)는 자일리톨을 자일룰로스로 전환하는 효소이다. 이를 코딩하는 유전자는 서열번호 7의 염기서열을 갖는 유전자일 수 있다. Xylitol dehydrogenase (XDH) is an enzyme that converts xylitol to xylulose. The gene encoding this may be a gene having the base sequence of SEQ ID NO: 7.
자일룰로키나아제(xylulokinase, XK)는 자일룰로스를 자일룰로스 5-인산으로 전환하는 효소이다. 이를 코딩하는 유전자는 서열번호 8의 염기서열을 갖는 유전자일 수 있다.Xylulokinase (XK) is an enzyme that converts xylulose to xylulose 5-phosphate. The gene encoding this may be a gene having the base sequence of SEQ ID NO: 8.
형질전환에 대해서는 상기 설명과 같다.Transformation is the same as described above.
상기 미생물을 상기 자일로스 대사경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자로 더 형질전환 시켜, 탄소원으로 자일로스를 이용할 수 있다. The microorganism can be further transformed with a gene encoding an enzyme involved in the xylose metabolic pathway to use xylose as a carbon source.
상기 미생물은 TAL1(transaldolase) 유전자가 제거, 결실, 감쇄 또는 불활성화된 것일 수 있다. The microorganism may have the TAL1 (transaldolase) gene removed, deleted, attenuated, or inactivated.
TAL1 유전자는 트랜스 알돌레이스를 코딩하고 있는 유전자로 아래와 같은 반응을 촉매하여 시노린 합성의 경쟁경로에 관여한다. The TAL1 gene is a gene encoding trans aldolase and participates in the competitive pathway of shinorine synthesis by catalyzing the following reactions.
sedoheptulose 7-phosphate + glyceraldehyde 3-phosphate sedoheptulose 7-phosphate + glyceraldehyde 3-phosphate
→ erythrose 4-phosphate + fructose 6-phosphate→ erythrose 4-phosphate + fructose 6-phosphate
시노린 합성의 경쟁 경로에 관여하는 TAL1 유전자의 제거, 결실, 감쇄 또는 불활성화를 통해 시노린 합성 단계의 중간체인 S7P의 생산량을 늘려, 결과적으로 시노린의 생산량을 증대시킬 수 있다. By removing, deleting, attenuating, or inactivating the TAL1 gene involved in the competitive pathway of shinorine synthesis, the production of S7P, an intermediate in the shinorine synthesis step, can be increased, resulting in increased shinorine production.
유전자의 제거란 상동 재조합 등을 이용하여 어떤 유기체의 유전자가 작동하지 않도록 하는 것을 의미하고, 결실이란 염색체의 일부가 유전자 재조합 과정에서 누락되는 것을 의미하고, 감쇄란 대상 유전자의 발현이 감소되는 것을 의미하고, 불활성화란 특정 단백질을 암호화하는 유전자의 발현이 되지 않거나 발현이 되더라도 그 활성이 없는 경우를 의미한다. Removal of a gene means preventing the gene of an organism from working using homologous recombination, etc., deletion means missing a part of a chromosome during the genetic recombination process, and attenuation means reducing the expression of the target gene. Inactivation refers to a case where a gene encoding a specific protein is not expressed or is not active even if expressed.
본원의 일 실시예에서는 Saccharomyces cerevisiae를 디하이드로 퀴네이트 합성효소, O-메틸 전이 효소, ATP-그래스프 리가아제를 코딩하는 유전자 및 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 유전자로 형질전환 시켜 포도당으로부터 시노린을 생산할 수 있게 하였으며, 여기에 자일로스 대사 효소를 코딩하는 유전자로 더 형질전환시켜 기질로 자일로스도 이용할 수 있게 하였으며, 시노린 생합성 경로의 경쟁경로에 관여하는 TAL1 유전자를 제거함으로써 시노린의 생산량을 최대로 하였다. In one example of the present application, Saccharomyces cerevisiae is transformed with a gene encoding dihydroquinate synthase, O-methyltransferase, ATP-grasp ligase and a gene consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 9 to produce shinorine from glucose. It was possible to produce , and by further transforming it with a gene encoding a xylose metabolic enzyme, xylose could also be used as a substrate. By removing the TAL1 gene, which is involved in the competitive pathway of the shinorine biosynthetic pathway, the production of shinorine was increased. was maximized.
본 발명의 시노린 생산 방법은 마이코스포린 글라이신(MG)을 상기 시노린 생산용 조성물과 반응시키는 단계를 포함한다. The method for producing shinorine of the present invention includes reacting mycosporine glycine (MG) with the composition for producing shinorine.
본 발명의 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 이를 발현하는 미생물, 상기 미생물의 배양물 또는 분쇄물을 포함하는 것이므로, 상기 반응은 예를 들면 미생물 내에서 수행될 수 있다. Since the composition of the present invention includes a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a microorganism expressing the protein, and a culture or pulverized product of the microorganism, the reaction can be performed, for example, within the microorganism.
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질에 대해서는 상기 설명과 같다. The description for the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is the same as above.
상기 단백질을 발현하는 미생물은 내재적 또는 외인적으로 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 발현하는 것일 수 있다. The microorganism expressing the protein may endogenously or exogenously express a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
상기 단백질을 외인적으로 발현하는 경우, 상기 미생물은 상기 단백질을 코딩하는 유전자로 형질전환된 것일 수 있다. When the protein is exogenously expressed, the microorganism may be transformed with a gene encoding the protein.
형질전환에 대해서는 상기 설명과 같다. Transformation is the same as described above.
미생물, 미생물의 배양물 및 미생물의 분쇄물에 대해서는 상기 설명과 같다. Microorganisms, microbial cultures, and microbial pulverizers are as described above.
마이코스포린 글라이신을 상기 조성물과 반응시키는 단계는 마이코스포린 글라이신 존재 하에 상기 미생물에 의한 회분식 발효를 의미할 수 있다. The step of reacting mycosporine glycine with the composition may mean batch fermentation by the microorganism in the presence of mycosporine glycine.
상기 반응시키는 단계 이후에 시노린을 분리 또는 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다. After the reaction step, a step of separating or purifying shinorine may be further included.
본 발명의 시노린 생산방법은 자일로스 또는 포도당을 The method for producing shinorine of the present invention uses xylose or glucose.
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 이를 발현하는 미생물, 상기 미생물의 배양물 또는 분쇄물을 포함하고;It includes a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a microorganism expressing the same, and a culture or pulverized product of the microorganism;
상기 미생물은 디하이드로 퀴네이트 합성효소, O-메틸 전이 효소 및 ATP-그래스프 리가아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 유전자로 더 형질전환된;The microorganism is further transformed with a gene encoding one or more proteins selected from the group consisting of dihydroquinate synthase, O-methyltransferase and ATP-grasp ligase;
시노린 생산용 조성물과 반응시키는 단계를 포함한다. It includes the step of reacting with a composition for producing shinorine.
상기 반응은 예를 들면 미생물 내에서 수행될 수 있다. The reaction can be carried out, for example, in microorganisms.
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질에 대해서는 상기 설명과 같다. The description for the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is the same as above.
상기 단백질을 발현하는 미생물은 내재적 또는 외인적으로 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 발현하는 것일 수 있다. The microorganism expressing the protein may endogenously or exogenously express a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
상기 단백질을 외인적으로 발현하는 경우, 상기 미생물은 상기 단백질을 코딩하는 유전자로 형질전환된 것일 수 있다. When the protein is exogenously expressed, the microorganism may be transformed with a gene encoding the protein.
형질전환에 대해서는 상기 설명과 같다. Transformation is the same as described above.
미생물, 미생물의 배양물 및 미생물의 분쇄물에 대해서는 상기 설명과 같다. Microorganisms, microbial cultures, and microbial pulverizers are as described above.
자일로스 또는 포도당을 상기 조성물과 반응시키는 단계는 자일로스 또는 포도당 존재 하에 상기 미생물에 의한 회분식 발효를 의미할 수 있다. The step of reacting xylose or glucose with the composition may mean batch fermentation by the microorganism in the presence of xylose or glucose.
상기 반응시키는 단계 이후에 시노린을 분리 또는 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다. After the reaction step, a step of separating or purifying shinorine may be further included.
하기 표 1은 상기 서열번호 1 내지 서열번호 9의 서열을 나타낸 것이다. 서열번호 1은 아미노산 서열, 서열번호 2 내지 9는 염기서열이다. Table 1 below shows the sequences of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 9. SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence, and SEQ ID NOs: 2 to 9 are the base sequences.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples.
재료 및 방법Materials and Methods
균주strain
본 연구에 사용된 균주는 표 2에 설명되어 있다. 대장균 DH5α는 유전자 조작 및 복제에 사용되었다. 마이코스포린-글라이신 생합성 경로를 도입하고 MAA 생합성 유전자(Amir4257, Amir4258, Amir4259 및 P. pini 또는 aff. Roholtiella로부터 D-Ala-D-ala 리가아제를 코딩하는 유전자)의 다중 카피 통합(multi-copy integration)을 구성하기 위해 S. cerevisiae DXdT를 숙주로 사용하였다. Strains used in this study are described in Table 2. E. coli DH5α was used for genetic manipulation and cloning. Introduction of the mycosporine-glycine biosynthetic pathway and multi-copy integration of MAA biosynthetic genes (Amir4257, Amir4258, Amir4259 and genes encoding D-Ala-D-ala ligase from P. pini or aff. Roholtiella ). ), S. cerevisiae DXdT was used as a host to construct.
tal1ㅿtal1ㅿ
int#4::GPD P -Amir4258-CYC1 T -TEF P -Amir4259-GPM1 T,
int#7::GPD P -Amir4257-CYC1 T DXdT
int#4:: GPD P -Amir4258-CYC1 T -TEF P -Amir4259-GPM1 T ,
int#7:: GPD P -Amir4257-CYC1 T
delta:: GPDP-Amir4258-CYC1T-TEFP-Amir4259-GPM1TSJSC001
delta::GPDP-Amir4258-CYC1T-TEFP-Amir4259-GPM1T
int#6:: GPDP-WP_181781590.1-CYC1TSJSC001-m89
int#6::GPDP-WP_181781590.1-CYC1T
플라스미드 구성Plasmid construction
본 연구에 사용된 플라스미드는 표 3에 나와있다. 플라스미드와 균주 제작을 위한 프라이머는 표 4에 요약되어 있다(표 4에서 Gibson 어셈블리에 대한 상동 시퀀스는 소문자로 표시되었다. 게놈과 상동 재조합을 위한 서열은 밑줄이 그어져 있다). 콜로니 PCR과 정량 PCR(qPCR)을 위한 프라이머는 각각 표 5와 표 6에 요약되어 있다. MAA 생합성을 위한 P. pini의 D-Ala-D-ala 리가아제의 S. cerevisiae 코돈 최적화된 유전자는 상에 표 1에 서열번호 9로 설명되어있다. P. pini 와 aff. Roholtiella는 Macrogen(서울, 대한민국)에서 합성하였다. Plasmids used in this study are listed in Table 3. Primers for plasmid and strain construction are summarized in Table 4 (in Table 4, homologous sequences for the Gibson assembly are indicated in lowercase; sequences for homologous recombination with the genome are underlined). Primers for colony PCR and quantitative PCR (qPCR) are summarized in Table 5 and Table 6, respectively. The S. cerevisiae codon-optimized gene of the D-Ala-D-ala ligase of P. pini for MAA biosynthesis is described as SEQ ID NO: 9 in Table 1 above. P. pini and aff. Roholtiella was synthesized by Macrogen (Seoul, Korea).
Phusion high-fidelity DNA 폴리머레이스(뉴 잉글랜드 Biolabs, Ipswich, 미국)를 사용하여 이에 해당하는 프라이머를 가지고 표적 뉴클레오타이드를 얻기 위해 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하였다. Gibson Assembly kits (뉴 잉글랜드 Biolabs, Ipswich, 미국)를 사용하여 증폭된 DNA를 조립하였다. pCRS를 생성하기 위해, 합성된 P. pini 유래 유전자를 BamHI 및 XhoI로 처리한 p425GPD-CYC1와 조립하였다. 같은 방법으로 pCRP를 제작하였다. pRS405-GPD-Amir4258-CYC1-TEF-Amir4259-GPM1를 제작하기 위해, p426GPD-Amir4258-CYC1-TEF-Amir4259-GPM1에서 GPD-Amir4258-CYC1-TEF-Amir4259-GPM1의 발현 카세트를 증폭시켰다. pRS405을 XhoI 및 HindⅢ로 처리한 다음 증폭된 Amir4258-CYC1-TEF-Amir4259-GPM1로 조립하였다. pRS405-GPD-Amir4258-CYC1-TEF-Amir4259-GPM1는 선형화를 위해 KasI으로 처리하였다. 겔 추출 및 플라스미드 준비는 Promega(위스콘신주, 매디슨)의 키트를 사용하여 수행하였다. Polymerase chain reaction (PCR) was performed to obtain target nucleotides with the corresponding primers using Phusion high-fidelity DNA polymerase (New England Biolabs, Ipswich, USA). Amplified DNA was assembled using Gibson Assembly kits (New England Biolabs, Ipswich, USA). To generate pCRS, the synthesized P. pini- derived gene was assembled with p425GPD-CYC1 treated with BamHI and XhoI . pCRP was produced in the same way. To construct pRS405-GPD-Amir4258-CYC1-TEF-Amir4259-GPM1, the expression cassette of GPD-Amir4258-CYC1-TEF-Amir4259-GPM1 was amplified from p426GPD-Amir4258-CYC1-TEF-Amir4259-GPM1. pRS405 was treated with XhoI and HindIII and then assembled into amplified Amir4258-CYC1-TEF-Amir4259-GPM1. pRS405-GPD-Amir4258-CYC1-TEF-Amir4259-GPM1 was treated with KasI for linearization. Gel extraction and plasmid preparation were performed using kits from Promega (Madison, WI).
CRISPR-Cas 9을 이용한 게놈 편집Genome editing using CRISPR-Cas 9
MAA 생합성 경로에 관여하는 발현 카세트의 도입은 기존에 보고된 방법을 일부 수정하여 Cas9 매개 유전자 가위를 이용하여 수행하였다(Lee et al. 2017). Amir4259-Amir4258 유전자의 발현 카세트를 도입하기 위해 표 4의 P07과 P08의 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 공여자 단편(donor fragment)을 준비하였다. 증폭된 p426GPD-Amir4258-CYC1-TEF-Amir4259-tGPM1의 공여체 DNA는 INT#4의 유전자 간 부위를 통합하기 위해 50 bp의 상동성으로 설계되었다. 가이드 RNA의 발현은 pRS42H-INT#4에 의해 진행되었다. pRS42H-INT#4와 증폭된 공여체 DNA는 변형된 리튬 아세테이트 형질 전환 방법을 사용하여 pAUR-Cas9 균주를 보유한 DXdT로 형질전환 되었다(Gietz et al. 2007). 간단히 말하여, DXdT를 보유한 pAUR_Cas9을 포도당 20 g/L를 함유한 YP 배지 3 ml에서 30 ℃, 250 rpm으로 배양한 다음, 초기 OD600이 0.5일 때 포도당 20 g/L를 함유한 새로운 2X YP 배지로 세포를 형질전환 하였다. OD600이 2.0에 도달한 후 세포를 채취하여 멸균 증류수로 두 번 철저히 세척하였다. 세척된 세포를 50%(w/v) PEG 3350, 1.0 M 리튬 아세테이트, 변성 운반체 DNA, gRNA 플라스미드 및 증폭된 공여체 DNA 단편과 혼합했다. 혼합물을 42℃에서 40 분간 열 충격을 가한 후 20 g/L 포도당이 포함된 YP 배지 1 mL와 함께 30℃에서 2시간 동안 배양했다. 20 g/L 포도당, 0.5 μg/mL 아우레오바시딘 A(일본 타카라), 300 μg/mL 하이그로마이신 B(미주리주 세인트루이스 시그마-알드리치)가 포함된 YP 배지에서 형질전환체를 선별했다.The introduction of the expression cassette involved in the MAA biosynthesis pathway was performed using Cas9-mediated gene scissors by partially modifying a previously reported method (Lee et al. 2017). To introduce the expression cassette of the Amir4259-Amir4258 genes, a donor fragment was prepared through PCR using the primers P07 and P08 in Table 4. The amplified donor DNA of p426GPD-Amir4258-CYC1-TEF-Amir4259-tGPM1 was designed with 50 bp of homology to integrate the intergenic region of INT#4. Expression of guide RNA was carried out by pRS42H-INT#4. pRS42H-INT#4 and amplified donor DNA were transformed into DXdT carrying pAUR-Cas9 strain using a modified lithium acetate transformation method (Gietz et al. 2007). Briefly, pAUR_Cas9 carrying DXdT was cultured in 3 ml of YP medium containing 20 g/L glucose at 30 °C, 250 rpm, and then incubated in fresh 2X YP medium containing 20 g/L glucose when the initial OD600 was 0.5. Cells were transformed with . After OD 600 reached 2.0, cells were collected and thoroughly washed twice with sterile distilled water. Washed cells were mixed with 50% (w/v) PEG 3350, 1.0 M lithium acetate, denatured carrier DNA, gRNA plasmid, and amplified donor DNA fragment. The mixture was heat shocked at 42°C for 40 min and then incubated with 1 mL of YP medium containing 20 g/L glucose at 30°C for 2 h. Transformants were selected on YP medium containing 20 g/L glucose, 0.5 μg/mL aureobasidin A (Takara, Japan), and 300 μg/mL hygromycin B (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).
pAUR_Cas9 및 pRS42H-INT#4의 플라스미드를 큐어링(curing)하기 위해, 형질전환체를 아우레오바시딘 A 및 하이그로마이신 없이 20 g/L 포도당으로 YP 배지에서 2-3일 동안 순차적으로 농축했다. 그 후, 증폭된 단편 GPD-Amir4257-CYC1은 INT#7의 유전자 간 부위를 통합하도록 설계되었으며, 표 4의 P11 및 P12 프라이머를 사용하여 PCR로 얻었다. 공여체 DNA와 pRS42H-INT#7을 GPD-Amir4258-CYC1-TEF-Amir4259-tGPM1이 통합되고 pAUR_Cas9이 포함된 DXdT로 형질전환 하였다. 형질전환 및 대상 균주의 선별은 상기에서 설명된 것과 같이 수행되었다. 결과 균주는 Amir4259, Amir4258 및 Amir4257 유전자를 발현하는 SJSC001 균주로 명명하였다. To cure the plasmids of pAUR_Cas9 and pRS42H-INT#4, transformants were sequentially concentrated for 2-3 days in YP medium with 20 g/L glucose without aureobasidin A and hygromycin. . Afterwards, the amplified fragment GPD-Amir4257-CYC1 was designed to integrate the intergenic region of INT#7 and obtained by PCR using the P11 and P12 primers in Table 4. Donor DNA and pRS42H-INT#7 were transformed into DXdT containing pAUR_Cas9 and GPD-Amir4258-CYC1-TEF-Amir4259-tGPM1 integrated. Transformation and selection of target strains were performed as described above. The resulting strain was named strain SJSC001, which expresses the Amir4259, Amir4258, and Amir4257 genes.
증폭된 DNA 단편 GPD-WP_181781590.1-CYC1은 INT#6의 유전자 간 부위에 통합되도록 설계되었으며, 표 4의 P09 및 P10 프라이머를 사용하여 PCR로 얻었다. 공여체 DNA와 pRS42H-INT#6은 GPD-Amir4258-CYC1-TEF-Amir4259-tGPM1 및 GPD-Amir4257-CYC1이 통합된 SJSC001-m89으로 형질전환 되었으며, 특히 GPD-Amir4258-CYC1-TEF-Amir4259-tGPM1도 다중 통합되고 pAUR_Cas9도 통합(harbor)되었다. 형질전환과 대상 균주의 선별은 상기에서 설명된 것과 같이 수행되었다. Amir4259, Amir4258, Amir4257 및 WP_181781590.1 유전자를 발현하는 결과 균주는 SJSC001-m89-S2 균주로 명명하였다. 또한, 증폭된 DNA 단편 GPD-WP_194003356.1-CYC1은 INT#6의 유전자 간 부위를 통합하도록 설계되었으며, 표 4의 P09 및 P10 프라이머를 사용한 PCR로 얻었다. 공여체 DNA와 pRS42H-INT#6을 SJSC001-m89로 형질전환 하였다. 표적 균주의 형질전환 및 선별을 상기 설명과 같이 수행하였다. 결과 균주는 Amir4259, Amir4258, Amir4257 및 WP_194003356.1의 유전자를 발현하는 SJSC001-m89-P1로 명명되었다. The amplified DNA fragment GPD-WP_181781590.1-CYC1 was designed to be integrated into the intergenic region of INT#6 and was obtained by PCR using the P09 and P10 primers in Table 4. Donor DNA and pRS42H-INT#6 were transformed into SJSC001-m89, which integrates GPD-Amir4258-CYC1-TEF-Amir4259-tGPM1 and GPD-Amir4257-CYC1, especially GPD-Amir4258-CYC1-TEF-Amir4259-tGPM1. It was multiplexed and pAUR_Cas9 was also harbored. Transformation and selection of target strains were performed as described above. The resulting strain expressing the Amir4259, Amir4258, Amir4257, and WP_181781590.1 genes was named strain SJSC001-m89-S2. Additionally, the amplified DNA fragment GPD-WP_194003356.1-CYC1 was designed to integrate the intergenic region of INT#6 and was obtained by PCR using the P09 and P10 primers in Table 4. Donor DNA and pRS42H-INT#6 were transformed into SJSC001-m89. Transformation and selection of target strains were performed as described above. The resulting strain was named SJSC001-m89-P1, expressing the genes Amir4259, Amir4258, Amir4257 and WP_194003356.1.
배양 조건Culture conditions
E. coli는 필요시 암피실린 100 μg/mL를 첨가한 Lysogeny Broth (트립톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 염화나트륨 10 g/L, LB) 배지에서 배양하였다. S. cerevisiae 균주를 YP 배지 (효모 추출물 10 g/L 및 펩톤 20 g/L) 에서 30 ℃, 250 rpm으로 배양했다. 에피솜 발현을 확인하기 위해, 30 ℃, 250 rpm에서 포도당 20 g/L을 첨가한 SCD(Leu-) 배지 3 mL에서 배양하여 예비 배양액을 제조했다. 하룻밤 동안 배양된 세포를 수확하여 초기 OD600이 ~1.0이 되도록 신선한 SCD(Leu-) 배지에 접종했다. 본 배양은 250 mL 플라스크에서 10 g/L의 포도당 및 10 g/L의 자일로스와 함께 50 mL의 SCD(Leu-) 배지에 30℃, 250 rpm으로 수행되었다. 회분식 배양에서, 포도당 20 g/L가 포함된 YP 배지 3 ml에서 30℃, 250 rpm으로 배양하여 예비 배양액을 준비했다. 하룻밤 동안 배양된 세포를 수확하여 초기 OD600을 ~1.0로 하여 신선한 YP 배지에 접종하였다. 본 배양은 250 mL의 플라스크에서 10 g/L의 포도당 및 10 g/L의 자일로스와 함께 50 mL의 YP 배지에 30℃, 250 rpm으로 수행되었다. E. coli was cultured in Lysogeny Broth (10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L sodium chloride, LB) medium supplemented with 100 μg/mL of ampicillin when necessary. S. cerevisiae strains were cultured in YP medium (10 g/L yeast extract and 20 g/L peptone) at 30°C and 250 rpm. To confirm episome expression, a pre-culture was prepared by culturing in 3 mL of SCD (Leu-) medium supplemented with 20 g/L of glucose at 30°C and 250 rpm. Cells cultured overnight were harvested and inoculated into fresh SCD (Leu-) medium to an initial OD 600 of ~1.0. This culture was performed at 30°C and 250 rpm in 50 mL of SCD (Leu-) medium with 10 g/L of glucose and 10 g/L of xylose in a 250 mL flask. In batch culture, a pre-culture was prepared by culturing at 30°C and 250 rpm in 3 ml of YP medium containing 20 g/L of glucose. Cells cultured overnight were harvested and inoculated into fresh YP medium at an initial OD 600 of ~1.0. This culture was performed at 30°C and 250 rpm in 50 mL of YP medium with 10 g/L of glucose and 10 g/L of xylose in a 250 mL flask.
세포 성장 및 대사산물 모니터링Cell growth and metabolite monitoring
분광광도계(UV-1900i, Shimadzu, 교토, 일본)를 사용하여 600 nm (OD600)에서 광학 밀도(OD)로 세포 성장을 모니터링했다. 이전 연구에서, DCW(건조균체량)에 변환계수(0.35)를 곱하여 OD를 산출하였다고 보고했다(Kim et al. 2022). 포도당, 자일로스, 글리세롤, 아세테이트를 포함한 부산물의 농도는 굴절률(RI) 검출기가 내장된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC, SCL-40, Shimadzu, 교토, 일본)을 사용하여 측정했다. 60 ℃에서 0.6 mL/min의 유속으로 5 mM 황산과 함께 Rezex ROA-Organic Acid H+ 칼럼(Phenomenex, Torrance, USA)을 사용하였다. 배양 배지를 수확한 후, 13,000rpm에서 5분간 원심분리하였다. 그런 다음, 상층액을 수득하고 대사물질의 농도 측정을 위해 0.22 μm 주사기 필터를 사용하여 여과했다.Cell growth was monitored as optical density (OD) at 600 nm (OD 600 ) using a spectrophotometer (UV-1900i, Shimadzu, Kyoto, Japan). In a previous study, it was reported that OD was calculated by multiplying DCW (dry cell mass) by a conversion factor (0.35) (Kim et al. 2022). The concentrations of by-products, including glucose, xylose, glycerol, and acetate, were measured using high-performance liquid chromatography (HPLC, SCL-40, Shimadzu, Kyoto, Japan) with a built-in refractive index (RI) detector. A Rezex ROA-Organic Acid H+ column (Phenomenex, Torrance, USA) was used with 5 mM sulfuric acid at a flow rate of 0.6 mL/min at 60 °C. After harvesting the culture medium, it was centrifuged at 13,000 rpm for 5 minutes. Then, the supernatant was obtained and filtered using a 0.22 μm syringe filter to measure the concentration of metabolites.
MAA 분석MAA analysis
시노린과 포피라-334의 표준 물질(standard)는 전남대학교 조정용 교수로부터 Porphyra umbilicalis의 추출액을 기증받았다. 시노린과 포피라-334의 농도를 정량하기 위해 시료는 기존에 보고된 방법(Par et al. 2019)로 준비했다. 즉, 배양 중 4 ml의 배양액을 채취했다. 배양 배지를 4,000 rpm에서 10 분간 원심분리 한 후, 상층액을 배지 내 MAA 농도 분석에 사용했다. 상층액을 제거한 세포를 1 ml의 DDW에 다시 현탁시켰다. 재부유된 세포에 1.5 ml의 클로로포름(chloroform)을 첨가한 후, 혼합물을 3분간 교반하여 세포를 파괴했다. 혼합물을 4,000 rpm에서 10 분간 원심분리하고 0.22 μm 주사기 필터를 사용하여 수층(water layer)을 모아 여과하여 세포 내 MAA의 농도를 측정했다. 344 nm에서 가변 파장 검출기(VWD)가 내장된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC, SCL-40, Shimadzu, 교토, 일본)를 사용하여 MAA의 농도를 측정했다. 100 % 용매 A(용매 A: 물에 0.1 M 트리에틸암모늄 아세테이트, pH 7.0)를 3분 동안 사용하고, 용매 A에서 50 % 용매 B(용매 B: 아세토니트릴)로 12분 동안 상승, 2 분 동안 100 % 용매 B로 상승, 1 ml/min 유속에서 5분 동안 100 % 용매 B로 상승시켰다. Capcell Pak UG120 C18 칼럼(5 μm 입자크기, 250 X 4.6mm ID, 시세이도, 일본)을 35 ℃에서 유지했다. The standard for Shinorin and Porphyra-334 was an extract of Porphyra umbilicalis donated by Professor Cho Jeong-yong of Chonnam National University. To quantify the concentrations of shinorine and Porphyra-334, samples were prepared using a previously reported method (Par et al. 2019). That is, 4 ml of culture fluid was collected during culture. The culture medium was centrifuged at 4,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was used to analyze the MAA concentration in the medium. The cells with the supernatant removed were resuspended in 1 ml of DDW. After adding 1.5 ml of chloroform to the resuspended cells, the mixture was stirred for 3 minutes to destroy the cells. The mixture was centrifuged at 4,000 rpm for 10 minutes, and the water layer was collected and filtered using a 0.22 μm syringe filter to measure the concentration of intracellular MAA. The concentration of MAA was measured using high-performance liquid chromatography (HPLC, SCL-40, Shimadzu, Kyoto, Japan) equipped with a variable wavelength detector (VWD) at 344 nm. 100% Solvent A (Solvent A: 0.1 M triethylammonium acetate in water, pH 7.0) for 3 min, rising from Solvent A to 50% Solvent B (Solvent B: acetonitrile) for 12 min, 2 min. Ramp to 100% Solvent B, ramp to 100% Solvent B for 5 minutes at a flow rate of 1 ml/min. A Capcell Pak UG120 C18 column (5 μm particle size, 250 × 4.6 mm ID, Shiseido, Japan) was maintained at 35 °C.
시노린의 UPLC(초고성능 액체 크로마토그래피) 분석은 다음과 같이 수행되었다. 용매 조건은 100 %의 용매 A(용매 A: 0.1 % 포름산을 함유한 H20)를 2분 동안 사용하고, 용매 A에 10 % 용매 B(용매 B: 0.1 % 포름산을 함유한 아세토니트릴)를 5 분 동안, 10 % 용매 B를 7분 동안 0.35 ml/min의 유속으로 증량했다. Waters ACQUITY UPLC 시스템(Waters, Milford, USA)에 내장된 ACQUITY UPLC HSS T3 칼럼을 40 ℃에서 유지했다. QTOF/MS 분석은 Xevo G2 XS-Q-TOF 질량 분석기(Waters, Milford, USA)를 사용하여 수행했다. QTOF/MS 조건은 다음과 같다: 이온화 모드; ESI(positive), 모세관 전압; 2.5 kV, 스캔 범위; m/z 50~800, 콘 전압; 40 V, 용해 N2 가스 유량 800 L/h, 용해 온도; 500 ℃, 이온 소스 온도: 150 ℃, 칼리브레이터; 0.5 mM 소듐 포메이트, 잠금 질량(lock mass); 류신-엔케팔린(m/z 556.2771). MRM 분석의 조건은 다음과 같다. 화합물; 시노린, 유지 시간(retention time); 1.03 분. Quantifier transition; m/z 333.13 -> 255.10, CV; 40, CE; 20, 45. Ultra-performance liquid chromatography (UPLC) analysis of shinorine was performed as follows. The solvent conditions were 100% solvent A (solvent A: H 2 O containing 0.1% formic acid) for 2 minutes, and 10% solvent B (solvent B: acetonitrile containing 0.1% formic acid) was added to solvent A. Over 5 minutes, 10% solvent B was added at a flow rate of 0.35 ml/min for 7 minutes. The ACQUITY UPLC HSS T3 column housed in a Waters ACQUITY UPLC system (Waters, Milford, USA) was maintained at 40 °C. QTOF/MS analysis was performed using a Xevo G2 XS-Q-TOF mass spectrometer (Waters, Milford, USA). QTOF/MS conditions were as follows: ionization mode; ESI (positive), capillary voltage; 2.5 kV, scan range; m/z 50–800, cone voltage; 40 V, dissolution N 2 gas flow rate 800 L/h, dissolution temperature; 500 °C, ion source temperature: 150 °C, calibrator; 0.5 mM sodium formate, lock mass; Leucine-enkephalin (m/z 556.2771). The conditions for MRM analysis are as follows. compound; Shinorine, retention time; 1.03 minutes. Quantifier transition; m/z 333.13 -> 255.10, CV; 40, CE; 20, 45.
결과result
MAAs 생산을 위한 For MAAs production P. piniP. pini 및 and aff. Roholtiellaaff. Roholtiella 로부터 얻어진 신규한 D-ala-D-ala 리가아제 확인 Confirmation of novel D-ala-D-ala ligase obtained from
MAA의 전구체인 마이코스포린-글라이신(MG)을 생산하기 위해 A. mirum의 DHQS, O-MT 및 ATP-그래스프 리가아제를 코딩하는 Amir4259, Amir4258 및 Amir4257의 S. cerevisiae에 코돈 최적화된 3개의 유전자를 합성했다. 시노린을 생산하는 S. cerevisiae 균주를 구축하기 위해, 구성(constitutive) 프로모터, 터미네이터 및 표적 유전자를 발현 카세트에 구성하고 S. cerevisiae SJSC001 게놈에 도입했다. GPD P-Amir4258-CYC1 T-TEF P-Amir4259-GPM1 T 발현 카세트는 Cas9 매개 게놈 편집을 사용하여 DXdT 게놈의 인터제닉 부위(int#4)에 도입되었다. 결과적으로, GPD P-Amir4257-CYC1 T 카세트는 S. cerevisiae 게놈의 인터제닉 부위(int#7)에 도입되었다. Three codon-optimized genes in S. cerevisiae, Amir4259, Amir4258, and Amir4257 , encoding DHQS, O-MT, and ATP-grasp ligase in A. mirum to produce mycosporine-glycine (MG), the precursor of MAA. was synthesized. To construct a S. cerevisiae strain producing shinorine, a constitutive promoter, terminator, and target gene were constructed in an expression cassette and introduced into the S. cerevisiae SJSC001 genome. The GPD P - Amir4258 - CYC1 T - TEF P - Amir4259 - GPM1 T expression cassette was introduced into the intergenic site (int#4) of the DXdT genome using Cas9-mediated genome editing. As a result, the GPD P - Amir4257 - CYC1 T cassette was introduced into the intergenic site (int#7) of the S. cerevisiae genome.
P. pini의 D-ala-D-ala 리가아제를 코딩하는 유전자를 정렬하여 A. mirum의 D-ala-D-ala 리가아제를 코딩하는 유전자 및 Nostoc punctiforme의 NRPS-유사 합성효소를 코딩하는 유전자와 비교하였다(도 4). Alignment of the gene encoding the D-ala-D-ala ligase from P. pini to the gene encoding the D-ala-D-ala ligase from A. mirum and the gene encoding the NRPS-like synthase from Nostoc punctiforme. compared with (Figure 4).
P. pini의 새로운 D-ala-D-ala 리가아제에 의한 시노린의 생산을 확인하기 위해 P. pini의 D-ala-D-ala 리가아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드 pCRS를 이용하여 SJSC001 균주를 형질전환시켰다. 결과 균주인 SJSC001-pCRS로 포도당 10 g/L와 자일로스 10 g/L가 포함된 SCD(Leu-) 배지에서 회분발효(batch fermentation)를 수행했다(도 5). To confirm the production of shinorine by the new D-ala-D-ala ligase of P. pini , plasmid pCRS containing the gene encoding the D-ala-D-ala ligase of P. pini was used to identify the ligase SJSC001. The strain was transformed. Batch fermentation was performed with the resulting strain, SJSC001-pCRS, in SCD (Leu-) medium containing 10 g/L of glucose and 10 g/L of xylose (FIG. 5).
공학적으로 조작된 S. cerevisiae에 의한 시노린 생산을 확인하고 정량화하기 위해 배양액을 채취하고 원심분리했다. 상층액과 세포를 HPLC로 시노린 정량화에 사용했다. 상층액은 HPLC를 사용하여 배지 내 시노린 검출에 직접 사용했고, 세포 내 시노린은 추출 방법에 따라 세포를 파괴한 후 준비했다. HPLC 결과 SJSC001-pCRS 균주의 세포와 배지 모두에서 3.5분에 피크가 검출되었고, 이는 표준의 실제 시노린에 해당하는 피크이며, 시노린 생산 플라스미드를 보유하지 않은 대조군 균주(SJSC001)에서는 시노린 피크가 나타나지 않았다(도 9). To confirm and quantify shinorine production by engineered S. cerevisiae, cultures were harvested and centrifuged. Supernatants and cells were used for shinorine quantification by HPLC. The supernatant was directly used to detect shinorine in the medium using HPLC, and intracellular shinorine was prepared after disrupting the cells according to the extraction method. As a result of HPLC, a peak was detected at 3.5 minutes in both the cells and medium of the SJSC001-pCRS strain, and this peak corresponds to the actual shinorine of the standard, and in the control strain (SJSC001) that does not have a shinorine production plasmid, the shinorine peak was did not appear (Figure 9).
세포 분획을 LC-MS/MS 분석하여 SJSC001-pCRS 균주에 의한 시노린 생성을 추가로 확인했다. LC-MS/MS 스펙트럼에서 SJSC001-pCRS 균주에 대한 질량 단편화 프로파일은 시노린 표준의 프로파일과 동일했다(도 10). 그 결과, P. pini의 새로운 D-ala-D-ala 리가아제가 시노린을 생산할 수 있다는 것을 확인했다. Cell fractions were analyzed by LC-MS/MS to further confirm shinorine production by the SJSC001-pCRS strain. The mass fragmentation profile for the SJSC001-pCRS strain in the LC-MS/MS spectrum was identical to that of the shinorine standard (Figure 10). As a result, it was confirmed that the new D-ala-D-ala ligase of P. pini can produce shinorine.
최종적으로, SJSC001-pCRS 균주는 포도당 10 g/L와 자일로스 10 g/L에서 9 시간 만에 13.7 mg/L의 시노린을 생산한 반면, 대조군 균주(SJSC001)는 MAA를 전혀 생산하지 못함을 확인했다(도 6). MAA 생산을 제외하고는 포도당과 자일로스와 같은 탄소원의 소비와 에탄올, 글리세롤, 아세테이트의 생산 및 세포 성장에서는 두 균주 간에 유의미한 차이가 발견되지 않았다. Finally, the SJSC001-pCRS strain produced 13.7 mg/L of shinorine in 9 hours at 10 g/L of glucose and 10 g/L of xylose, while the control strain (SJSC001) did not produce MAA at all. Confirmed (Figure 6). Except for MAA production, no significant differences were found between the two strains in the consumption of carbon sources such as glucose and xylose, the production of ethanol, glycerol, and acetate, and cell growth.
Claims (12)
A composition for producing shinorine comprising a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a microorganism expressing the same, and a culture or pulverized product of the microorganism.
The composition for producing shinorine according to claim 1, wherein the microorganism expresses the protein intrinsically or exogenously.
The composition for producing shinorine according to claim 1, wherein the microorganism is a microorganism of the genus Saccharomyces or Escherichia genus.
The method of claim 1, wherein the microorganism is further transformed with a gene encoding one or more proteins selected from the group consisting of dihydroquinate synthase, O-methyltransferase, and ATP-grasp ligase, for producing shinorine. Composition.
The method of claim 4, wherein the gene encoding the dihydroquinate synthase includes the base sequence of SEQ ID NO: 2, the gene encoding the O-methyltransferase includes the base sequence of SEQ ID NO: 3, and the ATP - A composition for producing shinorine, wherein the gene encoding the graft ligase includes the base sequence of SEQ ID NO: 4.
The composition for producing shinorine according to claim 4, wherein the microorganism is further transformed with genes encoding xylose reductase, xylitol dehydrogenase, and xylulo kinase.
The method of claim 6, wherein the gene encoding the xylose reductase includes the base sequence of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6, and the gene encoding the xylitol dehydrogenase includes the base sequence of SEQ ID NO: 7 , A composition for producing shinorine, wherein the gene encoding the xylulokinase includes the base sequence of SEQ ID NO: 8.
The composition for producing shinorine according to claim 4, wherein the microorganism has a TAL1 (transaldolase) gene removed, deleted, attenuated, or inactivated.
A method for producing shinorine comprising the step of reacting mycosporine glycine with the composition of any one of claims 1 to 8.
The method of claim 9, further comprising the step of separating or purifying shinorine from the reaction solution.
A method for producing shinorine comprising the step of reacting xylose or glucose with the microorganism of any one of claims 4 to 8, a culture or pulverized product of the microorganism.
The method of claim 11, further comprising the step of separating or purifying shinorine from the reaction solution.
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| KR20150137244A (en) | 2014-05-28 | 2015-12-09 | 주식회사 바이오에프디엔씨 | Mass Production Method of Mycosporine-like amino acid |
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2023
- 2023-06-28 KR KR1020230083723A patent/KR102637622B1/en active IP Right Grant
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