KR102636202B1 - 현삼의 원산지 판별용 대사체 마커 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 현삼의 원산지 판별용 대사체 마커에 관한 것으로서, 고압 분리능 액체 크로마토그래피-4배 비행시간 질량분석법(ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry, UPLC-QTOF/MS) 및 다변량 통계 분석법을 이용하여 현삼의 원산지에 따라서, 차별적으로 포함되어 있는 대사체 마커 6종을 확인하였으며, 간단히는 한국산 현삼의 주요 대사체 마커로서 8-O-E-p-메톡시시나모일하르파자이드(8-O-E-p-methoxycinnamoylharpagide)를 검출하여, 현삼의 신속하고 정확한 한국산 또는 중국산 판별에 이용할 수 있는 것을 확인하였다.
Description
본 발명은, 현삼의 원산지 판별용 대사체 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
현삼은 Scrophularia buergeriana Miq. (현삼과 Scrophulariaceae)의 뿌리이다. 중국에서는 玄蔘(현삼) S. ningpoensis Hemsl.의 뿌리를 쓴다. 현삼의 약용부위는 건조한 뿌리를 사용하며, 형태적 특징은 불규칙하게 구부러지며긴 원주형으로 길이 4∼15㎝, 지름 1∼3㎝ 정도이다. 한방에서는 자음청열(滋陰淸熱), 해독골장(解毒滑腸), 설강번갈(舌絳煩渴), 연견윤조(軟堅潤燥) 등에 사용하며, 열병, 종창, 인두염, 신경염 및 후두염 치료에도 사용되어 왔으며 다양한 약리작용이 있다고 알려져 왔다. 또한, 현삼 추출물은 TNF-α의 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)을 유의하게 억제하여 염증 및 과량의 cytokine 생성과 관련된 면역치료에 효과가 있음을 보고하였으며, 현삼 추출물이 활성화된 비만세포로부터 탈과립 현상을 막아 알레르기 염증 반응을 억제 및 아세틸콜린 에스테라아제(Acetylcholine esterase) 저해 작용과 항산화 작용을 통해 인지능 향상이 보고되었다.
현삼의 주요성분은 이리도이드(iridoid)와 페닐프로파노이드(phenylpropanoid) 계열 화합물들이 대표적으로 보고되어 있으며 이리도이드(iridoid)의 계열로는 E-하르파고사이드(E-harpagoside), 8-O-E-메톡시시나모일하르파자이드(8-O-E-p-methoxycinnamoylharpagide), 버르제르닌(buergerinin), 버르제르닌 F(buergerinin F), 버르제르닌 G(buergerinin G) 등이 알려져 있으며, 페닐프로파노이드(phenylpropanoid) 계열은 버르제리사이드(buergeriside) A1, 버르제리사이드(buergeriside) B1, 버르제리사이드(buergeriside) B2, 버르제리사이드(buergeriside) C1, 및 E-p-메톡시시나믹 산(E-p-methoxycinnamic acid, E-p-MCA) 등이 알려져 있다.
국내에서 유통되고 있는 현삼 중 기원이 부정확하거나 원산지를 명시 하지 않으면 생긴 모양이 비슷하여 혼·오용되는 사례가 많다. 뿐만 아니라 한국, 중국, 일본 등의 생약재를 약으로 사용하는 나라에서 약용식물의 기원을 다르게 규정하고 있어 80% 이상을 수입에 의존하고 있는 우리나라는 이러한 혼·오용에 직접 노출되어 있다고 할 수 있다. 전통적으로 혼·오용 한약재의 구분이나 원산지와 관련된 감별법으로는 형태학적 관점에서의 관능검사, 이화학적 검사, 세포학적 및 생리학적 검사법 등이 이용되고 있으나 한약재는 천연물이기 때문에 일정한 품질을 확보하기가 어렵다. 이는 각 개체간의 성분 변이가 심하고 번식방법, 채취시기, 생육환경, 약재의 부위 등에 따라 큰 차이를 보이기 때문이다.
따라서, 건조한 모양과 색깔이 거의 같아 육안으로 구분하기가 매우 어려운 현삼을 높은 민감도로 정확하게 판별할 수 있는 마커의 발굴 이 필요한 실정이다. 또한 발굴된 마커를 동정하고 그 마커를 이용해, 간단하게 현삼의 원산지를 판별할 수 있는 방법의 개발이 필요하다.
본 발명의 목적은 8-O-E-p-메톡시시나모일하르파자이드(8-O-E-p-methoxycinnamoylharpagide)를 포함하는 현삼(Scrophularia buergeriana Miq)의 원산지 판별용 대사체 마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 조성물을 유효성분으로 포함하는 현삼의 원산지 판별용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 1) 현삼 시료를 준비하는 단계;
2)상기 단계 1)에서 준비된 시료에 제1항의 조성물을 이용하여 대사체 마커를 분석하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서 분석된 대사체 마커를 이용하여, 현삼의 원산지를 판별하는 것을 특징으로 하는 현삼의 원산지 판별 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 8-O-E-p-메톡시시나모일하르파자이드(8-O-E-p-methoxycinnamoylharpagide)를 포함하는 현삼(Scrophularia buergeriana Miq)의 원산지 판별용 대사체 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 조성물을 유효성분으로 포함하는 현삼의 원산지 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 현삼 시료를 준비하는 단계;
2)상기 단계 1)에서 준비된 시료에 제1항의 조성물을 이용하여 대사체 마커를 분석하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서 분석된 대사체 마커를 이용하여, 현삼의 원산지를 판별하는 것을 특징으로 하는 현삼의 원산지 판별 방법을 제공한다.
본 발명의 현삼 원산지 특이적 대사체 마커는, 고압 분리능 액체 크로마토그래피-4배 비행시간 질량분석법(ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry, UPLC-QTOF/MS) 및 다변량 통계 분석법을 이용하여 현삼의 원산지에 따라서, 차별적으로 포함되어 있는 대사체 마커 6종을 확인하였으며, 간단히는 한국산 현삼의 주요 대사체 마커로서 8-O-E-p-메톡시시나모일하르파자이드(8-O-E-p-methoxycinnamoylharpagide)를 검출하여, 현삼의 신속하고 정확한 한국산 또는 중국산 판별에 이용할 수 있어, 관련 산업에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 현삼 대사체 마커를 고압 분리능 액체 크로마토그래피-4배 비행시간 질량 분석법(ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry, UPLC-QTOF/MS)으로 분석한 것이다.(A: 한국산 현삼 분석, B: 중국산 현삼 분석)
도 2는 본 발명의 현삼 대사체 마커를 UPLC-QTOP/MS에 기초하여 주성분 분석법(Principal Component Analysis, PCA)으로 분석하여 PC1 및 PC2의 스코어 플롯을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 현삼 대사체 마커를 UPLC-QTOP/MS에 기초하여 직교부분최소자승판별분석법(Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis, OPLS-DA)으로 분석하여 스코어 플롯을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 현삼 대사체 마커를 UPLC-QTOP/MS에 기초하여 OPLS-DA로 분석한 것이다.
도 5A는 본 발명의 현삼 원산지 특이적 마커 1을 OPLS-DA 분석법으로 확인한 것이다.
도 5B는 본 발명의 현삼 원산지 특이적 마커 2를 OPLS-DA 분석법으로 확인한 것이다.
도 5C는 본 발명의 현삼 원산지 특이적 마커 3을 OPLS-DA 분석법으로 확인한 것이다.
도 5D는 본 발명의 현삼 원산지 특이적 마커 4를 OPLS-DA 분석법으로 확인한 것이다.
도 5E는 본 발명의 현삼 원산지 특이적 마커 5를 OPLS-DA 분석법으로 확인한 것이다.
도 5F는 본 발명의 현삼 원산지 특이적 마커 6을 OPLS-DA 분석법으로 확인한 것이다.
도 6은 본 발명의 현삼 특이적 마커를 박층 크로마토 그래피(Thin Layer Chromatography, TLC) 분석을 이용하여 분석한 도이다.(A: 순상 TLC 분석, B: 역상 TLC 분석)
도 2는 본 발명의 현삼 대사체 마커를 UPLC-QTOP/MS에 기초하여 주성분 분석법(Principal Component Analysis, PCA)으로 분석하여 PC1 및 PC2의 스코어 플롯을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 현삼 대사체 마커를 UPLC-QTOP/MS에 기초하여 직교부분최소자승판별분석법(Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis, OPLS-DA)으로 분석하여 스코어 플롯을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 현삼 대사체 마커를 UPLC-QTOP/MS에 기초하여 OPLS-DA로 분석한 것이다.
도 5A는 본 발명의 현삼 원산지 특이적 마커 1을 OPLS-DA 분석법으로 확인한 것이다.
도 5B는 본 발명의 현삼 원산지 특이적 마커 2를 OPLS-DA 분석법으로 확인한 것이다.
도 5C는 본 발명의 현삼 원산지 특이적 마커 3을 OPLS-DA 분석법으로 확인한 것이다.
도 5D는 본 발명의 현삼 원산지 특이적 마커 4를 OPLS-DA 분석법으로 확인한 것이다.
도 5E는 본 발명의 현삼 원산지 특이적 마커 5를 OPLS-DA 분석법으로 확인한 것이다.
도 5F는 본 발명의 현삼 원산지 특이적 마커 6을 OPLS-DA 분석법으로 확인한 것이다.
도 6은 본 발명의 현삼 특이적 마커를 박층 크로마토 그래피(Thin Layer Chromatography, TLC) 분석을 이용하여 분석한 도이다.(A: 순상 TLC 분석, B: 역상 TLC 분석)
본 발명은 8-O-E-p-메톡시시나모일하르파자이드(8-O-E-p-methoxycinnamoylharpagide)를 포함하는 현삼(Scrophularia buergeriana Miq)의 원산지 판별용 대사체 마커 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용하는 용어인 “고압 분리능 액체 크로마토그래피-4배 비행시간 질량분석법(UPLC-QTOF/MS)”은 고압 분리능 액체 크로마토그래피(UPLC; Ultra performance Liquid chromatography) 장치와 4배 비행시간 질량분석(QTOF/MS; Quadrupole time-of-flight Mass Spectrometer) 장치를 연결한 것이다.
본 발명에서 사용하는 용어인 “기울기 용리법”은 이동상의 용리역(조성)을 연속적으로 변화시키면서 용리(칼럼 액체 크로마토그래피) 혹은 전개(박층 크로마토그래피)를 하는 방법으로, 경사 용리, 구배 용리, 그레이디언트 용리라고도 한다.
본 발명에서 사용하는 용어인 “다변량 통계분석법”은 서로 상관이 있는 다종의 변량(다변량)의 자료 특성을 분석하고, 또한 그 종합적인 성격을 표현하는데 쓰이는 통계적 해석 방법이며, 둘 이상의 변수를 분석한다. 예를 들면 인자분석, 주성분분석, 결정체 분석 등이 있다.
본 발명에서 사용하는 용어인 “주성분 분석(PCA, principle component analysis)”은 여러 개의 변수 간의 변화를 적은 수의, 주성분으로 부르는, 독립적인 요인들의 혼합의 형태로 설명하는 통계학적 기법이다.
본 발명에서 사용하는 용어인 “직교부분최소자승판별 분석(OPLS-DA; orthogonal partial least square discriminant analysis)”은 계급 구분에 기여하는 숨은 변수를 도출하기 위하여 상을 회전시키켜, 분리된 가장 유력한 변수인 생물지표를 도출시키는 분석법이다. OPLS-DA 분석법에서는 Y에 직각인 X의 편차를 처리하도록 설계되어 있다.
본 발명에서 사용하는 용어인 “m/z”는 "mass to charge ratio"의 약자로 질량(m)과 전하(Z)의 비(m/z)를 나타낸다.
본 발명에서 사용하는 용어인 “[M-H]”는 음이온 전자분무 방식 (Negative ion mode)에서 측정된 것으로 원산지 특이적 마커의 분자량에서 수소[H] 1개가 빠진 값을 의미한다.
본 발명에서 사용하는 용어인 “RT(retention time)”는 머무름 시간 또는 보유 시간이라고도 하며, 가스 크로마토그래피나 액체 크로마토그래피에서 시료를 주입하고 나서 유출할 때까지 요하는 시간을 의미한다. 칼럼의 종류, 칼럼온도, 이동상의 종류와 유속 등의 크로마토그래피의 조건이 일정하면 물질 고유의 값이 되기 때문에 동정의 지표가 될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 8-O-E-p-메톡시시나모일하르파자이드는, 화학식 1로 표시되는 것일 수 있다
[화학식 1]
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 현삼의 원산지는 한국산 또는 중국산인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 8-O-E-p-메톡시시나모일하르파자이드가 검출되면 한국산 현삼인 것으로 판별하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 현삼의 대사체 마커는, 고압 분리능 액체 크로마토그래피-4배 비행시간 질량분석법(ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry, UPLC-QTOF/MS) 및 다변량 통계 분석법을 이용하여 검출되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 다변량 통계 분석법은, 주성분 분석(Principal Component Analysis, PCA) 또는 직교부분최소자승판별(Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis, OPLS-DA)을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 대사체 마커는 머무름 시간(retention time, RT) 약 2.81분에 m/z(분자량) 523[M-H]를 나타내는 한국산 특이적 마커 1, RT 약 3.19분에 m/z 739[M-H]를 나타내는 한국산 특이적 마커 2 및 RT 약 4.76분에 m/z 853[M-H]을 나타내는 한국산 특이적 마커 3으로 이루어진 대사체 마커가 검출되면, 한국산 현삼인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 대사체 마커는 머무름 시간(retention time, RT) 약 0.44분에 m/z 665[M-H]를 나타내는 중국산 마커 4, RT 약 0.45분에 m/z 383[M-H]을 나타내는 중국산 마커 5 및 RT 약 0.45분에 m/z 665[M-H]를 나타내는 중국산 마커 6으로 이루어진 대사체 마커가 검출되면, 중국산 현삼인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 현삼의 대사체 마커는, 순상 또는 역상 박층 크로마토 그래피(Thin Layer Chromatography, TLC) 분석법을 이용하여 검출되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 순상 TLC 분석법은, 머무름 인자(retention factor, Rf) 값이 0.4 내지 0.5일 때 8-O-E-p-메톡시시나모일하르파자이드로 확인하여 한국산 현삼으로 판별하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 역상 TLC 분석법은, 머무름 인자(retention factor, Rf) 값이 0.3 내지 0.4일 때 8-O-E-p-메톡시시나모일하르파자이드로 확인하여 한국산 현삼으로 판별하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기의 조성물을 유효성분으로 포함하는 현삼의 원산지 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 현삼 시료를 준비하는 단계;
2)상기 단계 1)에서 준비된 시료에 제1항의 조성물을 이용하여 대사체 마커를 분석하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서 분석된 대사체 마커를 이용하여, 현삼의 원산지를 판별하는 것을 특징으로 하는 현삼의 원산지 판별 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1> 현삼의 UPLC-QTOF/MS용 시료의 준비
본 발명에서, 현삼의 원산지를 판별하기 위하여, 한국산 현삼(대한민국 경상북도 안동시) 및 중국산 현삼(중국 사천성)을 구입하여 사용하였다. 각각의 샘플 3 내지 5개체를 무작위로 섞어서 믹서로 분쇄한 후 20개의 샘플군으로 선별하였고, 고압 분리능 액체 크로마토그래피-4배 비행시간 질량분석법(UPLC-QTOP/MS)에 사용하였다.
<실시예 2>UPLC-QTOF/MS 분석
<2-1> UPLC 분석 조건 확립
본 발명에서 UPLC-QTOF/MS 분석을 위하여, UPLC 분석은 Waters ACQUITY UPLCTM system (Waters Corp., MA, USA)을 이용해 수행하였다. ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 x 100mm, 1.7) 컬럼(column)을 사용하고 이동상으로는 0.1% 포름산 (formic acid)이 첨가된 물(A)과 0.1% 포름산(formic acid)이 첨가된 아세토니트릴 (acetonitrile; B)을 사용하였다. 컬럼 오븐을 30℃로 유지시켰고, 이동상을 용매 A (물 중 0.1% 포름산, v/v) 및 용매 B (아세토니트릴 중 0.1% 포름산, v/v)로 구성하였다. 최적 LC 용리 조건을 하기와 같이 적용하였다: 0-7 분, 10-90% B; 7-8 분, 90-100% B; 8-9 분, 100% 유동률은 0.5 mL/분이었다. 2 μL 분액을 자동-샘플러를 사용하여 컬럼에 주입시켰다.
<2-2> Q-TOF/MS 분석 조건 확립
본 발명에서 UPLC-QTOF/MS 분석을 위하여, Q-TOF/MS 분석은 Q-TOF Micro mass detector (Waters, Manchester, UK)를 사용해 네거티브(negative)와 포지티브 모드(positive mode)에서 현삼의 원산지에 따른 대사체 분석을 위한 최적의 조건을 확립하였다. 비교 결과, 음이온 전자분무 방식(Negative ion mode)에서 다양한 대사체가 효과적으로 분석됐으며, 분석조건은 다음과 같다; Capillary voltage 2.2 kV, Cone voltage 40 V, Low collision energy 6 V, High collision energy 20- 45 V, Desolvation temperature 320℃, Source temperature 120℃, Cone gas flow 30 L/h, Desolvation gas flow 600 L/h. 전구체 이온 정보는 50 및 2,000 m/z 사이에서 데이터를 수집하였다.
<2-3> UPLC-QTOF/MS 결과
한국산 및 중국산 현삼으로 3 내지 5개로 풀링되어 만들어진 40 개의 시료에 대해 UPLC-QTOF/MS 스펙트럼을 3 회 기록하였다. 여러가지 대사체에 대해 정확한 질량 측정이 가능한 QTOF/MS와 조합된 UPLC 분석을 진행하였다. 최적 분석 조건 하에서 원사지에 따른 현삼의 대사체는 우수한 분리능을 나타내었다. 또한, 등용매용리는 대사체의 유사 극성 및 구조로 인해 분명한 분리를 나타내지 않지만 기울기 용리는 보다 분리가 잘 이루어진다는 것을 확인하였다. 전자분무 이온화 장치는 양이온 및 음이온 방식으로 시험되었으나, 음이온 방식이 현삼의 모든 성분에 보다 잘 검출되었다. 각 대사체 피크는 질량 스펙트럼에서 분자량 또는 프래그먼트 이온을 매칭시킴으로써 전체 이온 크로마토그램에서 식별될 수 있다.
그 결과 도 1에 나타낸 바와 같이, 한국산 현삼 20점 및 중국산 현삼 20점 중 각각을 대표하는 샘플 하나의 UPLC와 Q-TOF/MS의 크로마토그램을 나타낸다. 각 크로마토그램은 0.1 분 내지 15.0 분까지를 나타내었다. 크로마토그램의 y축은(BPI counters) 개별 화합물의 이온 값들의 양을 나타낸다. 이 크로마토그램 자료는 이후에 수행될 다변량 통계 분석에 사용되었다.
<실시예 3> UPLC-QTOF/MS 데이터 기반의 다변량 통계 분석
<3-1> 주성분 분석(PLS-DA)
한국산 현삼(20개 시료) 및 중국산 현삼(20개 시료)의 UPLC-QTOF/MS 결과로 얻어진 대사체의 프로파일 정보를 통해 PLS-DA분석하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, y축을 기준으로, 왼쪽에 위치한 대사체는 중국산 현삼이고, 오른쪽에 위치한 대사체는 한국산 현삼의 대사체인 것을 확인할 수 있었으며, x축에 따른 분별은 없는 것을 확인하였다.
<3-2> 직교부분최소자승판별 분석(OPLS-DA)
한국산 현삼(10개 시료)과 중국산 현삼(10개 시료)의 UPLC-QTOF/MS 결과로 얻어진 대사체의 프로파일 정보는 두 개의 샘플군을 극대화 시켜서 통계처리가 되는 OPLS-DA분석에 제공되었다. OPLS-DA는 EZinfo software 3.0.3 (Umetrics, Umea, Sweden)를 사용하여 수행되었다. OPLS-DA 스코어 플롯 상의 각 포인트는 풀링된 각 시료를 나타내고, y축을 기점으로 왼쪽은 중국산 현삼 오른쪽은 한국산 현삼으로 정확하게 판별되는 것을 확인 할 수 있다(도 3).
<3-3> 직교부분최소자승판별 분석(OPLS-DA)기반의 S-Plot
상기 실시예 3-2의 OPLS-DA 분석을 기반으로, S-Plot을 나타내었다. S-plot 은 OPLS-DA 분석 방법에서 어떤 신호들에 의하여 그룹의 구분이 결정지어지는지에 대한 정보를 제공하며, 전체 질량값(m/z)에 대한 S-plot을 보여준다.
실제로 x축을 기점으로 위쪽에 표시된 대표 질량 값들은 한국산 현삼 샘플에서 특징을 나타내는 마커들을 나타내고 아래쪽에 표시된 대표 질량값들은 중국산 현삼 샘플에서 특징을 나타내는 마커인 것을 확인하였다. 이는 OPLS-DA을 구별하는데 가장 기여도가 높은 화합물인 것으로 판단 할 수 있다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 한국산 및 중국산 현삼을 구별함에 있어서 S-플롯에서 상, 하 바깥쪽에 위치에 있는 질량 값들(파란원 및 빨간원 참조)이 가장 큰 영향을 미치며, 본 발명에서 마커로 제안된 RT(retention time) 약 2.81분에 m/z(분자량) 523[M-H]를 나타내는 한국산 특이적 마커 1(도 5A), RT 약 3.19분에 m/z 739[M-H]를 나타내는 한국산 특이적 마커 2(도 5B), RT 약 4.76분에 m/z 853[M-H]을 나타내는 한국산 특이적 마커3(도 5C), RT 약 0.44분에 m/z 665[M-H]를 나타내는 중국산 마커 4(도 5D), RT 약 0.45분에 m/z 383[M-H]을 나타내는 중국산 마커5(도 5E) 및 RT 약 0.45분에 m/z 665[M-H]를 나타내는 중국산 마커6(도 5F)인 것을 확인하였다. 관측 된 특이적 마커들은 음이온 전자분무 방식 (Negative ion mode)에서 측정된 것으로 구조가 갖는 분자량(분자구조)에서 약 1값 정도가 빠진 것을 알 수 있었다. 따라서, 상기의 마커들은 현삼의 원산지에 따라 차별적으로 검출되는 마커로서, 현삼의 원산지 판별에 이용할 수 있다는 것을 확인하였다. 또한, 상기 현삼 대사체 마커중, 한국산에서 주요하게 검출되는 한국산 특이적 마커 1을 동정하여, 하기 화학식 1의 구조를 가지는 8-O-E-p-메톡시시나모일하르파자이드(8-O-E-p-methoxycinnamoylharpagide)인 것을 확인하였다
[화학식 1]
또한, 한국산 특이적 마커 2를 동정하였으며, 아직 천연에서 보고되지 않은 신규화합물로 추정하였다.
<실시예 4> 박층 크로마토 그래피 분석(TLC)
<4-1> 순상 TLC 분석
간단한 TLC 분석을 이용하여, 현삼의 원산지를 판별하기 위하여, 상기 실시예 1 내지 3에서, 핵심 대사체로 동정한 8-O-E-p-메톡시시나모일하르파자이드(8-O-E-p-methoxycinnamoylharpagide)를 검출하고자 하였다. 간단한 순상 TLC 분석법은 CHCl3-MeOH-H2O = 10:3:1의 부피부로 혼합한 전개 용매를 이용하여 중국산 현삼, 한국산 현삼 및 8-O-E-p-메톡시시나모일하르파자이드를 동량으로 점직하여 분석하였다. 그 결과, 도 6A에 나타낸 바와같이, 순상 TLC 분석에서, 한국산 현삼에서만, 8-O-E-p-메톡시시나모일하르파자이드(8-O-E-p-methoxycinnamoylharpagide)의 머무름 인자(retention factor, Rf) 값이 0.4 내지 0.5로 검출되는 것을 확인하였다.
<4-2> 역상 TLC 분석
간단한 역상 TLC 분석을 이용하여, 현삼의 원산지를 판별하기 위하여, 상기 실시예 1 내지 3에서, 핵심 대사체로 동정한 8-O-E-p-메톡시시나모일하르파자이드(8-O-E-p-methoxycinnamoylharpagide)를 검출하고자 하였다. 간단한 역상 TLC 분석법은 MeOH-H2O = 2:1의 부피부로 혼합한 전개 용매를 이용하여 중국산 현삼, 한국산 현삼 및 8-O-E-p-메톡시시나모일하르파자이드를 동량으로 점직하여 분석하였다. 그 결과, 도 6B에 나타낸 바와 같이, 역상 TLC 분석에서, 한국산 현삼에서만, 8-O-E-p-메톡시시나모일하르파자이드(8-O-E-p-methoxycinnamoylharpagide)의 머무름 인자(retention factor, Rf) 값이 0.3 내지 0.4로 검출되는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 현삼 원산지 특이적 대사체 마커는, 고압 분리능 액체 크로마토그래피-4배 비행시간 질량분석법(ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry, UPLC-QTOF/MS) 및 다변량 통계 분석법을 이용하여 현삼의 원산지에 따라서, 차별적으로 포함되어 있는 대사체 마커 6종을 확인하였으며, 간단히는 한국산 현삼의 주요 대사체 마커인 8-O-E-p-메톡시시나모일하르파자이드(8-O-E-p-methoxycinnamoylharpagide)를 검출하여, 현삼의 신속하고 정확한 한국산 또는 중국산 판별에 이용할 수 있는 것을 확인하였다.
Claims (22)
- 현삼 시료의 대사체를 분리하여, 고압 분리능 액체 크로마토그래피-4배 비행시간 질량분석법(ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry, UPLCQTOF/MS) 및 다변량 통계 분석법으로 검출되는 조성물로서,
상기 다변량 통계 분석법은 주성분 분석(Principal Component Analysis, PCA) 및 직교부분최소자승판별(Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis, OPLS-DA)이며,
상기 조성물은 한국산 현삼을 판별하기 위한 머무름 시간(retention time, RT) 2.81분에 m/z(분자량) 523[M-H]를 나타내는 한국산 특이적 마커 1(8-O-E-p-메톡시시나모일하르파자이드(8-O-E-p-methoxycinnamoylharpagide)), RT 3.19분에 m/z 739[M-H]를 나타내는 한국산 특이적 마커 2 및 RT 4.76분에 m/z 853[M-H]을 나타내는 한국산 특이적 마커 3 및 ,
중 국산 현삼 을 판별하 기 위한 머무름 시간(retention time, RT) 0.44분에 m/z 665[M-H]를 나타내는 중국산 마커 4, RT 0.45분에 m/z 383[M-H]을 나타내는 중국산 마커 5 및 RT 0.45분에 m/z 665[M-H]를 나타내는 중국산 마커 6 을 포함 하며,
상기 한국산 특이적 마커 1은 하기 화학식 1로 표시되는 것인, 조성물
[화학식 1]
- 현삼 시료의 대사체를 분리하여, 순상 및 역상 박층 크로마토 그래피(Thin Layer Chromatography, TLC) 분석법을 이용하여 검출되는 8-O-E-p-메톡시시나모일하르파자이드(8-O-E-p-methoxycinnamoylharpagide)를 포함하는 조성물로서,
상기 8-O-E-p-메톡시시나모일하르파자이드(8-O-E-p-methoxycinnamoylharpagide)는 하기 화학식 1로 표시되며,
상기 순상 TLC 분석에서, 클로로포름, 메탄올 및 물이 10 : 3 : 1의 부피비로 혼합된 전개 용매에서, 머무름 인자(retention factor, Rf) 값이 0.4 내지 0.5일 때 8-O-E-p-메톡시시나모일하르파자이드로 확인하여, 한국산 현삼으로 판별하고,
상기 역상 TLC 분석에서, 메탄올 및 물이 2 : 1의 부피비로 혼합된 전개 용매에서, 머무름 인자(retention factor, Rf) 값이 0.3 내지 0.4일 때 8-O-E-p-메톡시시나모일하르파자이드로 확인하여, 한국산 현삼으로 판별하는 것인, 조성물
[화학식 1]
. - 삭제
- 삭제
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- 제 1항 또는 제 2항의 어느 한항의 조성물을 유효성분으로 포함하는 현삼의 원산지 판별용 키트.
- 1) 현삼 시료를 준비하는 단계;
2)상기 단계 1)에서 준비된 시료에 제1항의 조성물을 이용하여 대사체 마커를 고압 분리능 액체 크로마토그래피-4배 비행시간 질량분석법(ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry, UPLCQTOF/MS) 및 다변량 통계 분석법으로 분석하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서 분석된 대사체 마커를 이용하여, 현삼의 원산지를 판별하는 것을 특징으로 하는 현삼의 원산지 판별 방법으로서,
상기 다변량 통계 분석법은 주성분 분석(Principal Component Analysis, PCA) 및 직교부분최소자승판별(Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis, OPLS-DA)이며,
상기 대사체 마커는 머무름 시간(retention time, RT) 2.81분에 m/z(분자량) 523[M-H]를 나타내는 한국산 특이적 마커 1(8-O-E-p-메톡시시나모일하르파자이드(8-O-E-p-methoxycinnamoylharpagide)), RT 3.19분에 m/z 739[M-H]를 나타내는 한국산 특이적 마커 2 및 RT 4.76분에 m/z 853[M-H]을 나타내는 한국산 특이적 마커 3의 대사체 마커가 검출되면, 한국산 현삼인 것으로 판별하고,
머무름 시간(retention time, RT) 0.44분에 m/z 665[M-H]를 나타내는 중국산 마커 4, RT 0.45분에 m/z 383[M-H]을 나타내는 중국산 마커 5 및 RT 0.45분에 m/z 665[M-H]를 나타내는 중국산 마커 6의 대사체 마커가 검출되면, 중국산 현삼인 것으로 판별하며,
상기 한국산 특이적 마커 1은 하기 화학식 1로 표시되는 것인, 방법
[화학식 1]
- 1) 현삼 시료를 준비하는 단계;
2)상기 단계 1)에서 준비된 시료에 제2항의 조성물을 이용하여 8-O-E-p-메톡시시나모일하르파자이드(8-O-E-p-methoxycinnamoylharpagide)를 순상 및 역상 박층 크로마토 그래피(Thin Layer Chromatography, TLC) 분석법으로 분석하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서 분석된 대사체 마커를 이용하여, 현삼의 원산지를 판별하는 것을 특징으로 하는 현삼의 원산지 판별 방법으로서,
상기 8-O-E-p-메톡시시나모일하르파자이드(8-O-E-p-methoxycinnamoylharpagide)는 하기 화학식 1로 표시되며,
상기 순상 TLC 분석에서, 클로로포름, 메탄올 및 물이 10 : 3 : 1의 부피비로 혼합된 전개 용매에서, 머무름 인자(retention factor, Rf) 값이 0.4 내지 0.5일 때 8-O-E-p-메톡시시나모일하르파자이드로 확인하여, 한국산 현삼으로 판별하고,
상기 역상 TLC 분석에서, 메탄올 및 물이 2 : 1의 부피비로 혼합된 전개 용매에서, 머무름 인자(retention factor, Rf) 값이 0.3 내지 0.4일 때 8-O-E-p-메톡시시나모일하르파자이드로 확인하여, 한국산 현삼으로 판별하는 것인, 방법
[화학식 1]
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101273574B1 (ko) * | 2011-10-14 | 2013-06-11 | 경희대학교 산학협력단 | 인삼 뿌리의 원산지 및 연근의 판별 방법 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Microchemical Journal 99 (2011) 213-217(공지시점 2011.5월)* |
| Pharmaceutical biology, 2017, Vol.55, No.1, pp.2211-2233(공지시점 2017년)* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20220041473A (ko) | 2022-04-01 |
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