KR102628545B1 - 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-48 균주 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-48 균주 및 이를 포함하는 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum; KACC92308P) KCC-48 균주와 상기 KCC-48 균주를 이용한 조성물을 제공하여, 항당뇨 및 항산화 효과를 제공할 수 있으며, 프로바이오틱스 조성물, 사일리지 발효용 미생물 첨가제 등의 형태로 제공될 수 있다.
Description
본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum; 기탁번호 : KACC92308P) KCC-48 균주와 상기 KCC-48 균주를 이용한 조성물을 제공한다.
비만은 당뇨병과 지방간과 같은 대사성 질환, 고혈압 및 심근 경색과 같은 심장질환, 골관절염과 같은 근골격계 질환, 알츠하이머, 우울증 및 유방암, 간암, 대장암의 위험을 크게 증가시킨다. 대사 장애 또는 비만의 원인은 순환계 염증과 관련이 있다. 비만은 삶의 질, 낮은 생산량, 실업률 등과 같은 사회적 문제를 발생시킬 우려가 있다. 따라서, 많은 연구자들은 에너지가 풍부한 음식을 섭취함으로써 발생하는 과도한 에너지 입력을 보상하기 위한 식이 보충제 개발이 요구된다.
논문 : LWT - Food Science and Technology, Vol85(Epub20170718)
논문 : Nutrients, Vol10, No643(Epub20180519)
본 발명은 상기와 같은 기술적 과제를 해결하기 위하여, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum; KACC92308P) KCC-48 균주를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 KCC-48 균주를 포함하는 지방 생성 억제, 항산화용 조성물을 제공한다.
본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-48(기탁번호 : KACC92308P) 균주를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 균주는 프로바이오틱스 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 균주일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 균주는 지방세포 분해 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 균주일 수 있다.
본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-48(기탁번호 : KACC92308P) 균주를 포함하는 항당뇨 또는 항산화용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 균주는 위액, 장액, 담즙염, 또는 십이지장액 중 적어도 하나 이상에 내성을 가질 수 있다.
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 KCC-48(기탁번호 : KACC92308P) 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 프로바이오틱스 조성물을 제공한다.
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 KCC-48(기탁번호 : KACC92308P) 균주를 포함하는 사일리지 발효용 미생물 첨가제를 제공한다.
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 KCC-48(기탁번호 : KACC92308P) 균주를 포함하는 사료용 조성물을 제공한다.
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본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-48; (기탁번호 KACC92308P) 균주를 이용하여 항당뇨 및 항산화 효과를 갖는 항당뇨 및 항산화 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 상기 KCC-48 균주를 이용한 조성물은 불필요한 지방 생성을 억제할 수 있다. 본 발명의 지방 생성 억제용 조성물은 독성이 없어 우수한 생균제 효과를 가지므로, 식품, 의약품, 화장품, 건강식품 등 다양한 형태로 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 실험 설계를 간략히 도시한 것이다.
도 2a 내지 도 2c는 인공 위액, 인공 십이지장액, 인공 장액에서의 KCC-48 균주 및 KACC 91016 균주의 생존율을 나타낸 도면이다.
도 2d는 자일렌 및 클로로포름의 존재 하에서 KCC-48 균주 및 KACC 91016 균주의 소수성 특성을 나타낸 도면이다.
도 2e는 상이한 시간 조건에서 KCC-48 균주 및 KACC 91016 균주의 자동 응집 특성을 나타낸 도면이다.
도 2f는 상이한 시간 조건에서 KCC-48 균주 및 KACC 91016 균주의 공동 응집 특성을 나타낸 도면이다.
도 2g는 라피노스 및 이눌린을 포함한 프리바이오틱스를 이용하는 KCC-48 균주 및 KACC 91016 균주의 효과를 나타낸다.
도 3a는 1.9531-500μg/mL 농도의 CFM으로 처리하고 5% CO2, 37°C에서 24시간 배양한 결과를 나타낸 것이다.
도 3b는 1.9531-500μg/mL 농도의 CFM으로 처리하고 5% CO2, 37°C에서 48시간 배양한 결과를 나타낸 것이다.
도 3c는 대조군 지방세포를 나타낸 것이다.
도 3d는 대조군 및 CFM 처리 지방 세포에서의 지방 축적을 나타낸 것이다.
도 4a 내지 도 4f는 실험 지방 세포에서 PPAR-γC/EBP-βα, FAS, ACC 및 aP2의 전사 수준을 나타낸 도면이다.
도 5a 내지 도 5c는 실험 세포에서 PPAR-γ, C/EBP-α, SREBP-1, FAS, pACC, AdipoQ, pAMPK, pp38 pErk1/2Erk의 번역 수준을 나타낸 도면이다.
도 6a 및 도 6b는 CFM 처리된 지방세포에서 분화 및 지방 축적 억제에 관여하는 분자 경로를 도시한 것이다.
도 7a는 오일 레드 O로 염색된 세포를 현미경으로 관찰한 것을 나타낸 도면이다.
도 7b는 490nm에서 KCC-48 균주의 흡광도를 대조군, RGZ, RGZ+CFM 및 CFM에 대하여 나타낸 것이다.
도 7c는 PPAR-γ2에 대한 KCC-48 균주의 발현 수준을 대조군, RGZ, RGZ+CFM 및 CFM에 대하여 나타낸 것이다.
도 8a는 대조군, HFD첨가군, HFD+KCC-48 균주 첨가군의 체중을 나타낸 것이다.
도 8b는 대조군, HFD첨가군, HFD+KCC-48 균주 첨가군의 지방량을 나타낸 것이다.
도 8c는 대조군, HFD첨가군, HFD+KCC-48 균주 첨가군에서 실험용 생쥐의 혈청 내 AST 및 ALT 활성을 나타낸 것이다.
도 8d는 대조군, HFD첨가군, HFD+KCC-48 균주 첨가군에서 실험용 생쥐의 혈청 내 콜레스테롤, 중성 지방 (TG), 고밀도 지단백질 (HDL) 및 저밀도 지단백질 (LDL)의 수준을 나타낸 것이다.
도 8e는 대조군, HFD첨가군, HFD+KCC-48 균주 첨가군에서 실험용 생쥐의 총 단백질 및 크레아티닌 수준을 나타낸 것이다.
도 9a 내지 9d는 대조군, HFD첨가군, HFD+KCC-48 균주 첨가군에서의 MDA, GSH, SOD 및 CAT의 수치를 나타낸 것이다.
도 10a 내지 10d는 대조군, HFD첨가군, HFD+KCC-48 균주 첨가군에서 실험용 IL1β, IL6, TNFα 및 Leptin 전사체를 나타낸 것이다.
도 11a 내지 11c는 대조군, HFD첨가군, HFD+KCC-48 균주 첨가군의 지방 조직에서 PPAR-γ, C / EBP-α, ACC, FAS, aP2, AadipoQ, pAMPK/AMPK, pp38/p38 및 pErk1/2Erk의 번역 수준을 나타낸 것이다.
도 12a 내지 도 12g는 미생물 다양성의 변화를 나타낸 것이다.
도 2a 내지 도 2c는 인공 위액, 인공 십이지장액, 인공 장액에서의 KCC-48 균주 및 KACC 91016 균주의 생존율을 나타낸 도면이다.
도 2d는 자일렌 및 클로로포름의 존재 하에서 KCC-48 균주 및 KACC 91016 균주의 소수성 특성을 나타낸 도면이다.
도 2e는 상이한 시간 조건에서 KCC-48 균주 및 KACC 91016 균주의 자동 응집 특성을 나타낸 도면이다.
도 2f는 상이한 시간 조건에서 KCC-48 균주 및 KACC 91016 균주의 공동 응집 특성을 나타낸 도면이다.
도 2g는 라피노스 및 이눌린을 포함한 프리바이오틱스를 이용하는 KCC-48 균주 및 KACC 91016 균주의 효과를 나타낸다.
도 3a는 1.9531-500μg/mL 농도의 CFM으로 처리하고 5% CO2, 37°C에서 24시간 배양한 결과를 나타낸 것이다.
도 3b는 1.9531-500μg/mL 농도의 CFM으로 처리하고 5% CO2, 37°C에서 48시간 배양한 결과를 나타낸 것이다.
도 3c는 대조군 지방세포를 나타낸 것이다.
도 3d는 대조군 및 CFM 처리 지방 세포에서의 지방 축적을 나타낸 것이다.
도 4a 내지 도 4f는 실험 지방 세포에서 PPAR-γC/EBP-βα, FAS, ACC 및 aP2의 전사 수준을 나타낸 도면이다.
도 5a 내지 도 5c는 실험 세포에서 PPAR-γ, C/EBP-α, SREBP-1, FAS, pACC, AdipoQ, pAMPK, pp38 pErk1/2Erk의 번역 수준을 나타낸 도면이다.
도 6a 및 도 6b는 CFM 처리된 지방세포에서 분화 및 지방 축적 억제에 관여하는 분자 경로를 도시한 것이다.
도 7a는 오일 레드 O로 염색된 세포를 현미경으로 관찰한 것을 나타낸 도면이다.
도 7b는 490nm에서 KCC-48 균주의 흡광도를 대조군, RGZ, RGZ+CFM 및 CFM에 대하여 나타낸 것이다.
도 7c는 PPAR-γ2에 대한 KCC-48 균주의 발현 수준을 대조군, RGZ, RGZ+CFM 및 CFM에 대하여 나타낸 것이다.
도 8a는 대조군, HFD첨가군, HFD+KCC-48 균주 첨가군의 체중을 나타낸 것이다.
도 8b는 대조군, HFD첨가군, HFD+KCC-48 균주 첨가군의 지방량을 나타낸 것이다.
도 8c는 대조군, HFD첨가군, HFD+KCC-48 균주 첨가군에서 실험용 생쥐의 혈청 내 AST 및 ALT 활성을 나타낸 것이다.
도 8d는 대조군, HFD첨가군, HFD+KCC-48 균주 첨가군에서 실험용 생쥐의 혈청 내 콜레스테롤, 중성 지방 (TG), 고밀도 지단백질 (HDL) 및 저밀도 지단백질 (LDL)의 수준을 나타낸 것이다.
도 8e는 대조군, HFD첨가군, HFD+KCC-48 균주 첨가군에서 실험용 생쥐의 총 단백질 및 크레아티닌 수준을 나타낸 것이다.
도 9a 내지 9d는 대조군, HFD첨가군, HFD+KCC-48 균주 첨가군에서의 MDA, GSH, SOD 및 CAT의 수치를 나타낸 것이다.
도 10a 내지 10d는 대조군, HFD첨가군, HFD+KCC-48 균주 첨가군에서 실험용 IL1β, IL6, TNFα 및 Leptin 전사체를 나타낸 것이다.
도 11a 내지 11c는 대조군, HFD첨가군, HFD+KCC-48 균주 첨가군의 지방 조직에서 PPAR-γ, C / EBP-α, ACC, FAS, aP2, AadipoQ, pAMPK/AMPK, pp38/p38 및 pErk1/2Erk의 번역 수준을 나타낸 것이다.
도 12a 내지 도 12g는 미생물 다양성의 변화를 나타낸 것이다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
본 명세서에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다.
연구에 따르면, 위장에서 많은 수의 미생물이 발견되었으며, 상기 미생물은 장내 미세 환경에서 면역 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 하고 있다. 유엔식량농업기구 (FAO)와 세계보건기구 (WHO)는 프로바이오틱스가 충분한 양으로 보충된 살아있는 미생물이라고 하였으며, 숙주에게 건강상의 이점을 부여한다. 프로바이오틱스 균주의 건강상의 이점은 영양소 활용, 감염에 대한 내성, 장내 미생물 다양성 관리, 면역계 발달 및 숙주 대사 조절과 같은 인간 건강에 상당한 이점을 제공한다. 위장의 미생물 다양성은 나이, 식이, 스트레스, 질병, 약물 및 생활 습관 변화를 포함한 외부 요인에 매우 민감하다. 또한 장 관련 미생물의 변화는 비만, 천식, 정신과적 문제 및 암과 같은 많은 장애를 유발할 수 있다.
위장관에서 소비되는 박테리아의 생존율은 유력한 미생물의 선택 및 개발뿐만 아니라 유익한 미생물에서 생균제 활동의 근본 원인을 이해하는 데 중요한 기준이다. 프로바이오틱 선택에 있어서, 높은 세포밀도를 가질 때 식품에서 생존하는 것, 제품의 유통기한 동안 안정적으로 생존 가능한 것, 담즙염, 인공 위 또는 인공 장을 통과할 수 있을 것, 상피세포를 부착하여 콜로니화 할 수 있고, 병원균 억제 및 프리바이오틱 활용 능력이 있을 것과 같은 몇몇 특징들이 고려된다. 본 발명은 상기 관점에서 시험 관내 모델에서 KCC-48 균주에 대한 상기 기준을 분석하였다. 분석결과 KCC-48 균주가 시간 의존적 방식으로 인공 위, 인공 십이지장 및, 인공 장액에서 상당한 수로 생존함을 나타냈다. 락토바실러스 플란타룸에 의해 충족되는 프로바이오틱스 기준에 대한 많은 데이터가 이용가능하고 산, 담즙염 및 부착 특성에 저항하는 능력을 갖지만 각각의 락토바실러스 플란타룸 간에는 차이가 존재한다. 또한 KCC-48 균주는 유의한 소수성 및 응집 특성을 가지고 있어 KCC-48 균주가 점막 또는 상피 세포와 상호 작용하여 병원체 부착을 제어할 수 있다. 병원성 박테리아와 프로바이오틱스의 응집은 프로바이오틱스에서 생산된 항균제의 작용으로 상기 병원성 박테리아를 죽인다. 또한, KCC-48 균주는 라피노스 및 이눌린이 보충된 MRS(De Man Rogosa Sharpe) 배지에서 잘 활용되고 성장하였다. 일반적으로 프리바이오틱스는 소화가 잘 되지 않는 탄수화물로서, 대장에서 유익한 박테리아의 활동이나 성장을 자극하여 숙주 건강을 개선한다. 전반적으로, KCC-48 균주가 중요한 생물학적 기능을 갖는 생균제 개발에 대한 잠재적인 균주로 간주될 수 있다.
비만 대유행은 지난 수십년 동안 사회 경제적 발전과 비슷한 에너지 이용률, 좌식 및 주변 온도의 높은 제어와 밀접한 관련이 있다. 에너지 섭취와 지출 사이의 불균형은 비만이 증가하게 되는 핵심 요소이다. 최근 연구에 따르면 그람 음성 박테리아에 의한 고농도의 지질 다당류(LPS) 생산이 만성 염증을 유발했으며 비만인 사람들은 위장관에 그람 음성 박테리아가 더 높은 것으로 보고되었다. 중요하게도, LPS는 염증 상태에서 손상된 장 내벽을 통해 누출되고 문맥을 통해 간으로 순환하는 것으로 알려져 있다. 이것은 PPARγ의 증가를 동반하여 염증성 면역 반응을 통해 비만과 대사 질환을 일으켰다. 프로바이오틱 섭취는 소화 건강을 촉진하고 장과 관련된 미생물의 항상성을 유지하며 혈청에서 콜레스테롤 수치를 낮추고 지방 세포 크기와 지방 축적을 감소시킬 수 있으며 장내 세균을 조절하여 당뇨병 상태를 완화시킬 수 있다. 비만 관련 대사 장애와의 싸움, 특히 락토바실러스 플란타룸은 미생물의 항상성 조절을 통해 비만으로 인한 다양한 대사 질환 또는 장애의 완화에 중요한 역할을 한다.
KCC-48 균주는 시험관 내에서 다양한 생물학적 활성을 갖는 강력한 콜레스테롤 동화 특성 및 유의한 생균제 특성을 나타냈다. 콜레스테롤 저하 능력은 생균제 가능성이 있는 젖산 박테리아의 필수 특성 중 하나이다. 콜레스테롤 저하 능력은 3T3-L1 지방 세포에서 지방 축적에 대한 KCC-48 균주의 CFM(cell free metabolites)의 효율을 조사하도록 자극했다. 또한, HFD(High-fat diet)를 공급한 생쥐에 대해 살아있는 KCC-48 균주의 보충에 따른 혈액의 중량, 지방 조직 질량 감소 및 임상 파라미터 변경을 평가하였다. 평가결과 CFM 처리가 3T3-L1 지방 세포에서 지방 축적 및 분화를 감소 시켰음을 나타내었다.
HFD-유도 비만 생쥐에서 109CFU/일의 밀도에서 KCC-48 균주의 섭취는 체중, 지방량, 혈청 지질 및 간 병리 생리학적 마커를 감소시켰다. 지방 세포 수와 크기의 증가는 비만과 밀접한 관련이 있다. 지방 세포의 비대는 성인 비만의 주요 요인으로 평가된다. 본 발명에서는 CFM 및 KCC-48 균주의 처리시, 지방 조직의 크기와 지방 세포와 HFD 유발 비만 생쥐에서 감소되는 각각의 질량을 나타냈다. 다른 실험모델에서, 락토바실러스 플란타룸 Q180, 락토바실러스 플란타룸 FH185, 락토바실러스 플란타룸 LMT1, 락토바실러스 플란타룸 LG42, 락토바실러스 플란타룸 KLDS1, 락토바실러스 플란타룸 No.14, 락토바실러스 플란타룸 PS128 투여 후 지방 축적 및 크기 지방 세포의 수준이 감소되었다. 현재의 결과는 KCC-48 균주 및 그의 CFM이 HFD을 단독 공급한 생쥐와 비교하여 지방 세포 및 생쥐의 체중에서 지방 축적을 감소시킬 수 있는 능력을 가짐을 확인 하였다. 대사 장애 또는 질병은 특히 내장 지방에서 만성 저급 염증과 인슐린 저항성 사이의 복잡한 상호 작용을 특징으로 한다. 본 발명에서는 실험 동물의 지방 조직에서 염증 마커의 수준을 정량화하였으며, HFD를 먹인 비만 쥐의 지방 조직에서 IL1βIL6 TNFα 및 렙틴의 수준이 크게 증가하는 것을 발견하였다. KCC-48 균주의 처리에도 불구하고 지방 조직에서 측정된 모든 염증 마커의 성장 수준이 약화되었다. 다수의 사이토카인 IL1βIL10, IFNγ케모카인 MCP-1RANTES 및 아디포카인 렙틴은 상이한 락토 바실러스 속으로 처리 한 후 현저하게 감소하였다. 지방량 및 염증성 마커 둘 모두의 감소는 또한 렙틴 mRNA의 하향 조절 된 발현과 동시에 일어난다. 일반적으로, 고혈당증은 저급 염증 단계 및 인슐린 저항성을 유발하는 전 염증성 마커 급증과 관련이 있다.
KCC-48 균주 및 그의 CFM 대사 산물에 의한 지방 세포 분화의 감소 및 체중 감소의 근본적인 분자 작용이 본 발명에 개시되어 있다. 지방 세포에서의 분화 및 지방 축적은 주요 전사인자인 PPAR-γC/EBP-α, C/EBP-β및 SREBP-1m에 의해 조절된다. 지방 세포 및 HFD-유도 비만 생쥐에서의 CFM 및 KCC-48 균주의 감소된 지질 침착은 상기 주요 전사 인자 및 이들의 다운스트림 표적(downstream target)의 발현에서의 변화로 인한 것일 수 있다.
프로바이오틱스에 의해 분비된 짧은 사슬 지방산(Short-chain fatty acids; SCFA)은 지질 및 포도당 대사 관련 마커의 조절을 통해 항 비만 효과를 발휘하여 지방 세포 크기를 감소시킨다. 특히, 짧은 사슬 지방산은 HFD를 제공한 생쥐에서 지방산 산화를 가속화하여 생쥐의 지방 세포에서 지방 축적물을 감소시키는데 중요한 역할을 한다. RT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석 결과는 CFM 및 KCC-48 균주가 지방 세포-특이적 마커 PPAR-γ, C/EBP-α, C/EBP-β및 SREBP-1를 하향 조절함으로써 지방 세포 및 HFD-유도 비만 생쥐에서 지방 축적을 유의하게 감소시켰음을 나타낸다. 주요 전사 인자 C/EBP-α, PPAR-γ및 SREBP-1 자체는 지방 세포의 분화를 촉진하기 위해 활성화된다. 그러나 효과적인 차별화를 위해서는 이러한 모든 요인들의 조직화된 기능이 필요하다. 대부분의 지방 생성 인자는 PPARγ유도 발현을 포함한다. C/EBP 및 KLF(Kruppel-like factor)는 또한 두 개의 PPARγ프로모터 중 하나 이상을 자극 할 수 있다. C/EBP-β는 지방 세포 분화에 필수적인 역할을 한다. 세포 분화는 분화 유도 후 빠르게 발현된다. 또한, PPAR-γ및 C/EBP-α는 분화의 초기 단계에서 자극될 수 있고 지방 형성 특이적 마커 ACC, FAS 및 aP2를 활성화시킬 수 있는 인자이다. FAS와 aP2는 지방 생성에 관여하는 중요한 요소이다. 지방 조직에서 증가된 FAS 발현은 내장 지방 축적, 손상된 인슐린 감수성, 더 높은 순환 공복 인슐린 및 RBP4와 관련하여 종결된다. 지방산 결합 단백질(aP2)은 세포의 특정 구획으로 지질의 수송을 용이하게 한다. SCFA는 PPARγ의 발현 및 HFD를 공급한 비만 생쥐의 다운스트림 표적을 조절함으로써 대사 상태를 지방 생성에서 지질 산화로 전환할 수 있다. AMPK-α의 활성화는 ACC 활성을 억제하고 말로닐-CoA 수준을 감소시킴으로써 FAS를 억제하고 지방산 산화를 촉진하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서, 인산화 된 AMPK-α 상태가 대조군 생쥐와 비교하여 HFD를 공급한 생쥐에서 감소된 것을 발견하였다. 그러나 KCC-48 균주와 CFM의 첨가는 3T3-L1과 비만 생쥐에서 인산화 수준을 증가시켜 AMPK-α의 활성화를 증가시킨다. 그것은 HFD를 공급하는 것은 AMPK-α의 탈 인산화 과정을 유도하여 지방산 신합성(de-novo lipogenesis)에 의해 혈청 콜레스테롤과 TG의 수준을 높인다는 것을 나타냈다. CFM의 첨가 및 KCC-48 균주의 처리는 AMPK-α 활성화를 증가시키고 ACC 및 SREBP-1을 억제하여 3T3-L1 및 비만 생쥐에서 지방 축적을 약화시킬 수 있다. 명백히 락토바실러스 플란타룸의 개입은 활성화 된 AMPK-α로 지방 생성 관련 효소의 억제를 통해 HFD 유도 지방 축적을 상당히 약화시켰다. 이러한 결과는 HFD를 공급한 비만 생쥐에서 오일 레드 O로 염색된 지방 세포 및 지방 조직 질량에 의해 입증되는 바와 같이 지질 액적 축적 보고서와 매우 일치 하였다. 최근에, 아디포넥틴은 순환 수준의 감소가 비만의 증가, 인슐린 저항성, 제 2 형 진성 당뇨병 및 죽상 동맥 경화증을 유발하기 때문에 비만 감소에 큰 관심을 끌고 있다. 또한 아디포넥틴은 제2 형 당뇨병 진단에 중요한 요소로 판단되고 있다. 예상한 바와 같이, KCC-48 균주 및 CFM을 공급하여 제조된 후 지방 세포 및 지방 조직에서 아디포(adipo) Q의 수준이 상향 조절되었으며, 비만 마우스에서 HFD 유도 인슐린 저항성을 감소시키기 위해 KCC-48 균주의 개입이 가능할 수 있다고 하였다.
장 관련 미생물 군은 특히 염증 반응, 에너지 대사 및 체중의 변화에 관한 외부 환경과 숙주 사이의 대사 매개체로서 상당한 연구가 수행되었다. 위장에는 다양한 생물학적 반응에 참여하는 수조 개의 미생물과 수천 개의 미생물 종을 포함하는 복잡한 생태계가 있다. 사람마다 장내 미생물 군집의 차이는 에너지 유지에 영향을 미치는 주요 요인을 나타낸다. 그람 음성 박테리아 살균제와 그람 양성 후벽균(Firmicutes)은 생쥐와 인간의 장에서 지배적인 종이다. 일부 데이터는 속과 종 수준에서 존재하지만, 생쥐와 인간 모델은 비만이 박테리오데테스(Bacteriodetes)의 상대적 충분도의 감소와 관련이 있으며 비만인 사람이 마른 사람에 비해 박테리아 다양성이 낮은 것으로 나타났다. 비만 개체에서, 대변 내 낮은 대변 박테리아 유전자 풍부성은보다 현저한 지방 및 이상 지질 혈증, 포도당 항상성 장애 및 경증 염증을 증가시키는 것과 관련이 있다. 식량농업기구 및 세계보건기구가 공동으로 작성한 식품의 프로바이오틱스에 대한 평가 지침에서는, 살아있는 미생물로 불리는 프로바이오틱스를 적절한 양으로 보충할 때, 숙주에게 건강상의 이점을 부여한다고 하였다. 프로바이오틱스의 섭취는 소화관 건강과 항당뇨를 촉진하여 장 점막의 항상성을 회복시키고, 고 콜레스테롤 식단에서 콜레스테롤을 낮추는데 주된 영향을 미친다. 무작위 대조 실험의 체계적인 검토 및 메타 분석 결과, 프로바이오틱스의 보충이 체중, 체질량 지수 및 지방 백분율 및 총 혈청 콜레스테롤의 현저한 감소를 나타냈다. 또한, 프로바이오틱스로 발효된 우유는 생쥐의 지방 세포 크기를 줄이고, 식이 지방 흡수를 억제하고, 혈청 및 간의 콜레스테롤을 감소시켰으며, 간 기능과 지방 축적을 개선하였다. 또한, 프로바이오틱스 및 식물 추출물의 조합은 고지방식이(High-fat diet; HFD)를 공급한 생쥐의 장 미생물 조성을 조절하여 체중 증가를 완화시키고 지방 감소를 나타낸다. 특히 락토바실러스는 잠재적인 생균제 균주로 이용될 수 있으며, 생체 내에서 강한 콜레스테롤 저하 효과를 나타낸다. 락토바실러스는 콜레스테롤과 트리글리세라이드 대사에 미치는 영향뿐만 아니라 장 관련 미생물을 유지시킨다. Million et al., 2012는 다른 락토바실러스 종이 숙주의 특정 체중 변화에 다른 영향을 미친다고 하였다. 이에, 프로바이오틱스가 많은 건강 문제를 해결하기 위한 대안으로 떠오르고 있다. 락토바실러스 플란타룸은 QPS(Qualified Presumption of safety)상태에서 가장 안전한 것으로 간주되고 오랜 기간 사용되어 왔다. 락토바실러스 플란타룸을 이용한 치료는 염증성 장 질환, 이상 지질 혈증, 고 콜레스테롤 혈증, 인슐린 저항성 비만과 같은 다양한 대사 장애를 약화시키고 장과 관련된 미생물을 긍정적으로 조절한다.
식이가 풍부한 프로바이오틱스를 통해 장 관련 미생물을 변화시키는 것이 비만의 치료를 위한 중요한 작용제로 이용될 수 있기 때문에 이를 통해 비만 치료의 발전 과정을 나타낼 수 있다. 기존에 락토바실러스 속이 동물 및 지방 세포에서 과도한 체중 증가 및 지방 축적을 감소시키는 효과적인 제제일 수 있다. 그러나, 세포주 및 동물 모델 모두에서 락토바실러스 플란타룸의 항 비만 활성에 관한 분자 메커니즘은 불분명하였다. 대사 질환에 대한 락토바실러스의 영향은 종마다 다를 수 있다. 따라서, 더 효과적인 생균제 균주를 찾는 것이 수행되었다. 이 연구에서 락토바실러스 플란타룸 KCC-48 균주를 분리하고, 그 프로바이오틱스 특성을 조사하였다. 지방 축적 및 분화에 대한 락토바실러스 플란타룸 KCC-48 균주의 무세포 대사물의 효과는 3T3-L1 미분화 지방 세포에서 결정되었다. 고지방식이-유도 비만 생쥐모델에서 락토바실러스 플란타룸 KCC-48 균주의 역할을 조사하기 위해 연구를 추가로 수행하였고, 대변 미생물 군의 변화를 연구하였다. 지방 조직에서 지질 및 포도당 대사와 관련된 상이한 유전자의 발현을 측정하였다.
[재료 및 방법]
알팔파에서 콜레스테롤 동화 박테리아의 분리 및 특성
한국의 천안에서 알팔파 샘플을 채취하고 MRS(De Man Rogosa Sharpe) 배지를 사용하여 젖산균을 분리 하였다. 이후, 분리물의 콜레스테롤 동화 특성을 조사하였다. 종 식별은 솔젠트 사(Solgent Co., 서울, 한국)에서 16S rRNA 유전자 시퀀싱 방법으로 수행하였다. BLAST 분석 보고서는 균주가 락토바실러스 플란타 룸과 높은 유사성을 나타낸다고 하였다. 락토바실러스 플란타룸의 16S rRNA 서열은 최근 NCBI 젠뱅크(Genbank) 데이터베이스 (기탁번호 : KACC92308P; KCC-48로 명명 됨)에 기탁되었다. 표준 락토바실러스 플란타룸 KACC 91016 균주는 한국의 농업미생물은행(KACC)에 기탁하였다. 표준 락토바실러스 플란타룸의 생화학적 특성과 효소 생산은 각각 API 50 CH와 API-ZYM 키트 (Marcy l' Etoile, France)로 분석하였다. 항생제 감수성, 항산화 및 담즙 내염성 테스트는 앞에서 설명한 방법으로 수행하였다.
인공 소화액 준비
포스페이트 완충 식염수(PBS, pH 7.4, Sigma-Aldrich, MO, USA)의 pH를 1M HCl 또는 1M NaOH를 사용하여 2.5, 5.0 및 8.0으로 조정 한 다음 121 ℃에서 15 분 동안 멸균(오토 클레이브)했다. 인공 위액(Gastric juice)을 펩신 (3 mg / ml) (Sigma Aldrich, MO 및 USA)과 함께 포스페이트 완충 식염수(pH 2.5)로부터 제조했다. 십이지장 액(Duodenal juice)은 담즙염 (0.3 %) 및 트립신 (미국 미주리 주 시그마 알드리치) (0.1 %) 내지 PBS(pH 5)를 함유한다. 장액 (Intestinal juice)에는 포스페이트 완충 식염수(pH8)에 트립신 (0.1 %)이 포함되어 있다. 모든 인공 소화액을 0.2 μM 막 필터를 통해 여과하였다. 락토바실러스 플란타룸 KCC-48 균주 및 락토바실러스 플란타룸 KACC 91016 균주의 위장관 내성이 분석하였다. 클로로포름 및 자일렌을 사용하여 박테리아의 소수성을 측정 하였다. 박테리아의 응집 특성과 프리바이오틱 활용 능력도 조사했다.
조건부 미생물 대사 산물 준비
살아있는 락토바실러스 플란타룸 KCC-48 균주를 항생제 없이 소 태아 혈청(Fetal bovine serum; FBS)을 10% 함유하는 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Media) 배지에서 배양하고 회전교반기(120rpm)에서 약하게 진탕하며 37 ℃에서 48시간 동안 배양했다. 무세포 상청액을 4℃에서 1 시간 동안 4000rpm으로 원심분리하여 제조한 다음, 상청액 0.2μm를 막 필터 (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)를 통해 여과했다. 이후, 상청액을 50 m Torr 압력 미만에서 -40 ℃미만에서 동결 건조시켰다. 그 후, 동결 건조된 펠릿을 살균 하였다. 락토바실러스 플란타룸 KCC-48 균주가 없는 소 태아 혈청(Fetal bovine serum; FBS)을 10% 함유하는 DMEM 배지도 대조군의 처리와 동일한 방식으로 처리되었다.
3T3-L1 세포 생존력에 대한 CFM(Cell free metabolites)의 영향
3T3-L1 미분화 지방세포(10,000 세포/웰, ATCC CL-173, 6 번째 계대 사용)를 96-웰 플레이트에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션 한 다음 세포를 다른 농도의 CFM(cell free metabolites)에 24시간 및 48시간 동안 노출시킨다. 이후, 실험 세포를 10 μL의 EZ-사이톡스 시약(DoGenBio, Seoul # EZ-1000)으로 처리하고 1시간 동안 정상적인 세포배양 조건에서 배양하고 450nm에서 각 웰의 흡광도를 측정(i3 Spectramax (Molecular Device, CA, USA)사용)하였다.
3T3-L1 미분화 지방세포의 분화 유도
3T3-L1 미분화 지방세포(6 회 계대)를 12-웰 / 6-웰 플레이트 (각각 15000 / 또는 30000 세포/웰)에 접종하고 5 % CO2와 함께 37 ℃에서 배양하였다. 10 % FBS-DMEM 배지, 3-이소부틸-1-메틸크산틴(IBMX) 0.5mM, 덱사메타손(DEX) 1μM 및 인슐린 1.0 μg/mL을 함유하는 분화유도배지를 48시간의 혼합한 후에 분화를 개시하고 48시간 동안 유지시켰다. 이어서, 세포를 추가로 48시간 동안 1.0 ㎍/mL의 인슐린과 반응시켰다. 지방 세포 분화에 대한 CFM의 효과를 조사하기 위해, 미분화 지방세포는 혼합 후 2일부터 실험이 끝날 때까지 이틀마다 10 % FBS-DMEM 배지에서 CFM의 농도를 다르게 받았다
오일 레드 O 염색에 의한 지질 함량의 정량
세포를 1시간 동안 포르말린(10%)으로 고정한 다음, 이소프로필알코올 (40 %)로 3회 세척하였다. 이어서, 3mL의 오일레드스테인을 첨가하고 15분 동안 실온에서 유지시켰다. 플레이트를 물 또는 PBS(포스페이트 완충 식염수)로 3회 세척하였다. 염색된 세포를 현미경(Evos cell image system, Fisher Scientific, MA, USA)으로 사진을 찍었다. 또한, 지방 세포로부터 100% 이소프로필알코올을 사용한 추출된 오일레드스테인의 광학 밀도를 490 nm에서 관찰하였다.
RT-PCR을 이용한 유전자 발현의 정량
RNeasy 지질 조직 미니키트(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 스펙트라맥스(Spectramax) i3 및 스펙트라드롭 마이크로-볼륨 마이크로플레이트(SpectraDrop Micro-volume Microplate (Molecular Devices, CA, USA))를 사용하여 RNA를 정량 하였다. 아이스크립트 cDNA(iScript cDNA) 합성 키트 (BioRad, Hercules, USA)에 의해 500나노 그램의 RNA를 역전사시켰다. 표 1은 연구에 사용 된 프라이머 시퀀스를 나타낸 것이다. 표적 에드 유전자(cDNA)의 발현 수준을 SYBR 그린-기반 RT-PCR 5μL, 정방향 및 역방향 프라이머 10 pmol, cDNA 1μL 및 DEPC 3 μL를 포함하는 SYBR 그린 버퍼 [BioRad, Hercules, USA] 1μL의 10 pmol, 1μL의 cDNA 및 3 μL의 DEPC 물을 측정하였다. 유전자 발현 수준을 Livak 방법을 통해 계산하였다. 모든 유전자는 하우스 키핑 유전자로 정규화되었다.
| S.No | Gene Name | Forward Primers | Reverse Primers |
| 1 | PPAR-γ | GTG CTC CAG AAG ATG ACA GAC | GGT GGG ACT TTC CTG CTA A |
| 2 | C/EBP-α | GCA GGA AGA TAC AGG AAG | CAG ACT CAA ATC CCA ACA |
| 3 | FAS | CCC AGC CCA TAA GAG TTA | ATC GGG AAG TCA GCA CAA |
| 4 | ACC | GAGAGGGGTCAAGTCCTTCC | CTGCTGCCGTCATAAGACAA |
| 5 | β-actin | ACTCAT TCA CTA TTG GCA AC | ACTCATCGTACTCCTGCT TG |
| 6 | C/EBP-β | GTTTCGGGACTT GATGCAATC | AACAACCCCGCAGGAACA |
| 7 | ap2 | TGT GTG ATG CCT TTG TGG | TGT GTG ATG CCT TTG TGG |
| 8 | Leptin | CTT CACCCCATTCTG AGTTTG T | TTCTCCAGGTCATTGGCT ATC |
| 9 | IL1β | TGTTGATGTGCTGCTGTGAG | GTTGACGGACCCCAAAAGAT |
| 10 | IL6 | GACAGGTCTGTTGGGAGTGG | AGTTGCCTTCTTGGGACTGA |
| 11 | TNFα | CACCCCGAAGTTCAGTAGACA | GGGGCTTCCAGAACTCCA |
동물과 급식ICR 생쥐는 오리엔트-바이오(Orient-Bio (Seongnam, South Korea))에서 구입하였다(25 ± 3g / 7 주령 / 수컷). 동물 연구는 동물 연구 생체 내 실험 (ARRIVE) 절차에 따라 수행되었으며 전북대학교 동물관리 및 사용안내서의 권장사항을 따랐다. 실험설계는 실험실 동물의 관리 및 사용에 관한 대학 윤리위원회의 승인을 받았다. 정상 및 고지방식이(HFD, 45 % 지방 칼로리)는 한국의 피드 코리아 랩(Feed Korea Lab)에서 얻었다. 표 2는 본 발명에 사용된 일반 식단 및 고지방 식단의 사료 배합 및 칼로리를 나타낸 것이다. 생쥐를 12시간 명/암 스케줄로 냉방가동 환경에서 20 ± 2°C로 유지시켰다. 생쥐를 음식 및 물에 자유롭게 접근하도록 하여 1주일 동안 실험 시설에 적응시켰다.
| Formulations | AIN-93G | HFD 45%cal | ||
| gm% | kcal% | gm% | kcal% | |
| Protein | 20 | 20 | 24 | 20 |
| Carbohydrate | 64 | 64 | 41 | 35 |
| Fat | 7 | 16 | 24 | 45 |
| kcal/kg | 4,000 | 4,776 | ||
| Ingredient | g | kcal | g | kcal |
| Casein from milk | 200 | 200 | 200 | 800 |
| Corn starch | 397.486 | 1590 | 155.036 | 620 |
| Sucrose | 100 | 400 | 50 | 200 |
| Dextrose | 132 | 528 | 132 | 528 |
| Cellulose | 50 | 0 | 50 | 0 |
| Soybean Oil | 70 | 630 | 25 | 225 |
| Lard | 0 | 0 | 175 | 1575 |
| Minerals mixture | 35 | 0 | 35 | 0 |
| Vitamin mixture | 10 | 40 | 10 | 40 |
| TBHQ* | 0.014 | 0 | 0.014 | 0 |
| L-Cystine | 3 | 15 | 3 | 12 |
| Choline Bitartrate | 2.5 | 0 | 2.5 | 0 |
* 3차 부틸 하이드로퀴논실험 설계
총 30마리의 생쥐를 3개의 그룹으로 나누었다. 각 그룹은 10마리의 생쥐(47, 48)로 구성되었다. 그룹 A는 정상 사료(AIN 93G, Feed Korea Lab diet, Korea)를 먹인 대조군 생쥐였고, 그룹 B는 고지방 다이어트 (HFD, 45 % 지방 칼로리)를 먹인 실험군 생쥐였다. 그리고 그룹 C는 8주 동안 매일 109 CFU KCC-48 균주가 첨가된 4그램의 고지방식을 생쥐에게 먹였다. 매일 아침 정상, HFD 및 HFD-KCC-48 식이를 각 그룹에 보충하고 식이 및 수분 섭취량을 정기적으로 모니터링하였다.
도 1은 본 발명에 따른 실험 설계를 간략히 도시한 것이다.
실험 기간 동안 충전재는 일주일에 두 번 교체하였다. 전체 실험은 8주 동안 수행되었다. 모든 생쥐를 12시간 동안 식이에서 제거하고, 8주 후에 생쥐를 마취시키고 (Isoflurane # N01AB06) 희생시켰다. 혈청을 1500 ℃에서 4분 내지 10분 동안 원심 분리하여 수집하고 임상 파라미터 분석을 위해 -80 ℃에서 저장하였다. 부고환 지방 페이드를 수집하고 추가적인 분석을 위해 -80 ℃에서 보관하였다. 실험 생쥐의 체중은 매주 측정되었다. 생쥐의 분변 샘플은 4주와 8주에 수집되었다.
간 마커, 지질 프로파일, 크레아티닌, 혈청 내 산화물 및 항산화 마커
아스파테이트 트랜스아미나제(AST), 알라닌트랜스 아미나제활성(ALT), 콜레스테롤, 트리글리세리드(TG), 저밀도 지단백질(LDL), 고밀도 지단백질(HDL)을 포함한 지질 프로파일, 신장 마커 크레아티닌은 각각의 분석 키트 (Sigma Aldrich, MO, USA)를 사용하여 정량화되었다. 혈청 MDA-말론디알데하이드(MDA-malondialdehyde), CAT-카탈라아제(CAT), SOD-수퍼옥사이드 디스뮤타아제(SOD-Superoxide dismutase) 57 및 GSH 감소 글루타티온(glutathione)은 실험 샘플에서 정량화되었다.
대변 미생물 군 다양성의 피로시퀀싱(pyrosequencing)
4주차 및 8주차에 각 그룹으로부터 생쥐 분변 샘플을 수집하고 미생물 다양성 분석을 위해 모든 샘플로부터 DNA를 추출 하였다. 일루미나 시퀀싱은 한국의 마크로젠에서 수행되었다. V3 및 V4 영역 (519F-816R)을 증폭시키기 위해 16S 메타제노믹 시퀸싱 라이브러리(Metagenomic Sequencing Library) 프로토콜에 따라 각각의 시퀀싱된 샘플을 제조 하였다.
단백질 및 웨스턴 블롯 분석
실험 단백질을 프로테아제 및 포스파타제 억제제 (Roche, Basel, Switzerland, Sigma Aldrich, MO, USA)의 존재하에 세포용해완충제로 추출하였다. f 단백질의 양은 제조 프로토콜(Thermo Fisher Scientific)에 따라 정량화하였다. 동일한 양의 단백질을 SDS-PAGE (Mini Protean 프리캐스트 겔, 12 %, Bio-Rad, Hercules, USA)로 분리 한 다음 분리된 단백질을 터보 트랜스퍼 겔(Turbo Transfer gel) 방법(BioRad, Hercules, 미국)으로 정량화하였다. 웨스턴-브리즈(Western-Breeze) 화학 발광 키트 (Invitrogen, MA USA)를 사용하여 실험 샘플에서 단백질 발현을 검출하였다. 전달된 막을 토끼 모노클로날 및 폴리클로날 항체(PPARγ (# 2435), C / EBP-α (# 8178), FAS (# 3180), ACC (# 3676), pSREBP1 (# 9874), 아디포넥틴(# 2789), AMPK (# 5831), pAMPK (# 50081), p38MAPK (8690), p38MAPK (4511), pp44 / 42 (# 4370), p44 / 42 (# 4695) 및 GAPDH (# 5174), USA Cell Signaling Technology, USA) 4 ℃에서 밤새도록 면역 블롯팅하였다. 면역반응밴드의 강도는 화학 발광 영상 시스템(Davinch Chemiluminescence, Seoul, South Korea)에서 검출되었다. 단백질 밴드의 강도는 이미지 J 소프트웨어-1.49 버전 (32 비트) (Wayne Rasband, National Institute of Health, USA)으로 정량화되었다.
통계 분석
사후 테스트를 사용한 일원분산분석 및 던컨의 테스트와 다변량 비교를 사용하여 p<0.05 유의 수준을 갖는 대조군과 처리된 그룹 사이의 통계적 유의성을 결정하였다(통계 과학 패키지 (SPSS- 버전 16.0), SPSS, Inc., KCC-48). 락토바실러스 플란타룸 KCC-48 균주를 조작한 장 관련 미생물 군의 상대적 풍부도와 비만 관련 지표 간의 스피어맨(spearman)의 상관관계는 상관분석을 위해 R 소프트웨어 3.4.1에 의해 수행되었다. p-값<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
결과
분리한 락토바실러스 플란타룸 KCC-48 균주의 물리화학적 특성
본 발명에서, 여러 프로바이오틱 박테리아를 알팔파에서 분리하고, 시험 관내 방법으로 콜레스테롤 동화, 항산화 활성 및 담즙염 내성 특성을 검사했다. 이들 분리물 중, 단일 분리물은 다른 분리물과 비교하여 강한 콜레스테롤 동화 작용, 항산화 특성 및 담즙염 내성을 나타내었고, 이를 KCC-48 균주로 지칭 하였다. 이어서, 상기 분리물은 물리화학적 및 16S rRNA 서열분석 방법에 의해 특성화되었다. BLAST 분석 보고서에 따르면 KCC-48 균주는 L. plantarum과 유사성이 높았다. 표 3은 API 50 CH 방법을 사용하여 분리된 L. plantarum KCC-48 균주 및 KACC 91016 균주의 생화학적 특성을 나타낸 것이다. 물리 화학적 분석을 통해 KCC-48 균주는 크림색, 막대 모양, 그람 양성 박테리아로 나타났으며 리보스, 포도당, 과당 및 셀로 비오스와 같은 많은 탄수화물 기질을 발효 시켰다.
| S. No | Names of carbohydrates | KACC 91016 | KCC-48 |
| 1 | Glycerol | - | + |
| 2 | Erythritol | + | + |
| 3 | D-Arabinose | - | + |
| 4 | L-Arabinose | + | + |
| 5 | D-Ribose | - | + |
| 6 | D-Xylose | + | - |
| 7 | L-Xylose | + | + |
| 8 | D-Adonitol | - | + |
| 9 | Methyl-β | - | + |
| 10 | D-Galactose | + | + |
| 11 | D-Glucose | - | + |
| 12 | D-Fructose | + | + |
| 13 | D-Mannose | - | + |
| 14 | L-Sorbose | + | + |
| 15 | L-Rhamnose | - | + |
| 16 | Dulcitol | + | + |
| 17 | Inositol | + | - |
| 18 | D-Mannitol | + | + |
| 19 | D-Sorbitol | - | + |
| 20 | Methyl-α-D-Mannopyranoside | + | + |
| 21 | Methyl-α-D-Glucopyranoside | + | + |
| 22 | N-Acetylglucosamine | + | + |
| 23 | Amygdalin | + | + |
| 24 | Arbutin | - | + |
| 25 | Esculin-ferric citrate | + | + |
| 26 | Salicin | + | + |
| 27 | D-Cellobiose | + | + |
| 28 | D-Maltose | + | + |
| 29 | D-Lactose | - | + |
| 30 | D-Melibiose | + | + |
| 31 | D-Melezitose | - | + |
| 32 | D-Raffinose | - | + |
| 33 | Glycogen | + | - |
| 34 | Gentiobiose | + | + |
| 35 | D-Turanose | + | + |
| 36 | D-Lyxose | - | + |
| 37 | D-Tagatose | - | + |
| 38 | D-Arabitol | + | + |
| 39 | Potassium 2-keto-gluconate | - | + |
| 40 | Potassium 5-keto-gluconate | + | + |
+: Positive response, - : Negative response표 4는 KCC-48 균주 및 KACC 91016 균주의 세포 외 효소 생산 분석을 나타낸 표이다.
| S. No | Names of Enzymes | KACC 91016 | KCC-48 |
| 1 | Alkaline phosphatase | ++ | +++ |
| 2 | Esterase (C4) | + | +++ |
| 3 | Esterase lipase (C8) | ++ | +++ |
| 4 | Lipase (C14) | ++ | +++ |
| 5 | Leucine arylamidase | + | ++ |
| 6 | Valine arylamidase | ++ | ++ |
| 7 | Cystine arylamidase | - | - |
| 8 | Trypsin | + | ++ |
| 9 | α-Chymotrypsin | ++ | ++ |
| 10 | Acid phosphatase | + | ++ |
| 11 | N. AS-biphosphohydrolase | - | ++ |
| 12 | α-Galactosidase | ++ | +++ |
| 13 | β-Galactosidase | +++ | +++ |
| 14 | β-Glucuronidase | ++ | +++ |
| 15 | α-Glucosidase | ++ | +++ |
| 16 | β-Glucosidase | +++ | +++ |
| 17 | N-Acetyl-β-glucosaminidase | - | + |
| 18 | α-Mannosidase | ++ | ++ |
| 19 | α-Fucosidase | - | - |
(+ 개수가 생산의 정도를 나타낸다.)KCC-48 균주는 β-갈락토시다제, β-글루코시다제 및 리파아제와 같은 다양한 산업적으로 유용한 효소를 분비하였다. 표 5는 KCC-48 균주 및 KACC 91016 균주의 항생제 감수성 패턴을 나타낸 표이다.
| S. No | Names of Antibiotics |
Concentrations
(μg) |
KACC 91016 | KCC-48 |
| 1 | Chloramphenicol (C) | 50 | S | S |
| 2 | Kanamycin (K) | 30 | S | S |
| 3 | Nitrofurantoin (NIT) | 50 | S | S |
| 4 | Tetracycline (TE) | 100 | S | S |
| 5 | Streptomycin (S) | 25 | S | S |
| 6 | Sulphafurazole (SF) | 300 | R | R |
| 7 | Colistin methane sulphonate (CL) | 100 | R | S |
| 8 | Dicloxacillin (D/C) | 1 | R | R |
| 9 | Ampicillin (AMP) | 10 | S | S |
| 10 | Amikacin (AK) | 30 | R | S |
| 11 | Gentamicin (GEN) | 10 | S | S |
| 12 | Cefoxitin (CX) | 30 | R | S |
| 13 | Cefalexin (CN) | 30 | S | S |
| 14 | Cefuroxime (CXM) | 30 | S | S |
| 15 | Co-Trimoxazole (COT) | 25 | R | S |
S = 감수성, R = 저항성KCC-48 균주는 클로람페니콜, 카나마이신, 테트라 사이클린 및 암피실린을 포함하여 일반적으로 사용되는 항생제에 대해 높은 민감성을 나타냈다. KCC-48 균주의 성장이 일반적으로 이용가능한 항생제에 의해 제한될 수 있음을 확인하였다. 이는 적합한 프로바이오틱스 선택에 필수적인 요소이다.인공 위장관 상태에서 KCC-48 균주 및 KACC 91016 균주의 생존율
도 2a 내지 도 2c는 인공 위액, 인공 십이지장액, 인공 장액에서의 KCC-48 균주 및 KACC 91016 균주의 생존율을 나타낸 도면이다.
인공 위장 조건 하에서 KCC-48 균주 및 KACC 91016 균주의 생존율을 분석하였다. 3 시간 인큐베이션 후 분석한 결과, 인공 위액(GJ), 인공 십이지장액(DJ) 및 인공 장액(IJ)에서 KCC-48 균주 및 KACC 91016 균주의 일반적인 생존율 감소를 나타냈다. 이는 인공 위액, 인공 십이지장액 및 인공 장액에 영양분이 없기 때문이다. 이와 달리, KCC-48 균주는 인공 위액(GJ), 인공 십이지장액(DJ) 및 인공 장액(IJ)에서 각각 32%, 42%, 45%에서 KACC 91016 균주보다 53%, 58%, 61%가 높은 생존율을 나타냈다(p <0.05)
KCC-48 균주 및 KACC 91016 균주의 소수성 및 응집 특성
도 2d는 자일렌 및 클로로포름의 존재 하에서 KCC-48 균주 및 KACC 91016 균주의 소수성 특성을 나타낸 도면이다.
자일렌 및 클로로포름의 존재 하에서 KCC-48 균주의 소수성 백분율은 각각 53% 및 35%이고 KACC 91016 균주의 백분율은 42% 및 21%였다.
도 2e는 상이한 시간 조건에서 KCC-48 균주 및 KACC 91016 균주의 자동 응집 특성을 나타낸 도면이다.
KCC-48 균주의 자동 응집 백분율은 30%, 61% 및 70% 였고, KACC 91016 균주의 백분율은 각각 1, 2 및 3 시간에서 25%, 50% 및 60%였다.
도 2f는 상이한 시간 조건에서 KCC-48 균주 및 KACC 91016 균주의 공동 응집 특성을 나타낸 도면이다.
대장균과 KCC-48 균주의 공동 응집은 각각 15%, 22% 및 29% 였고, KACC 91016 균주의 공동 응집은 각각 1, 2 및 3 시간에 5%, 10% 및 22 %였다. 응집 속도는 시간 의존적 방식으로 증가되었다(p <0.05).
프리바이오틱스 활용
도 2g는 라피노스 및 이눌린을 포함한 프리바이오틱스를 이용하는 KCC-48 균주 및 KACC 91016 균주의 효과를 나타낸다. 두 균주는 대조군으로서 사용된 포도당 사용에 비해 이눌린보다 높은 비율의 라피노스를 사용하였다. 그러나, KCC-48 균주는 KACC 91016 균주보다 더 많은 라피노스 및 이눌린을 사용하였다 (p <0.05).
L. plantarum
KCC-48 균주의 CFM의 세포독성
도 3a는 1.9531-500μg/mL 농도의 CFM으로 처리하고 5% CO2, 37°C에서 24시간 배양한 결과를 나타낸 것이다.
도 3b는 1.9531-500μg/mL 농도의 CFM으로 처리하고 5% CO2, 37°C에서 48시간 배양한 결과를 나타낸 것이다.
3T3-L1 미분화 지방세포를 96-웰 플레이트에 접종하고 24시간 내지 48시간 동안 상이한 농도(1.9531-500μg / mL)에서 CFM과 함께 배양하였다. 상기 결과는 1.9531 μg/mL 내지 62.5 μg/mL의 CFM 농도가 24시간 및 48시간에서 세포생존력에 영향을 미치지 않음을 보여주었다. 그러나, CFM 농도의 추가적인 증가는 세포에 대한 세포 독성 효과를 나타냈다. 이 데이터는 1.9531 μg/mL 내지 62.5 μg/mL의 CFM 농도가 추가 실험을 위해 안전하고 더 나은 농도임을 입증했다.
지방 세포에서 분화 및 지방 축적에 대한 CFM의 효과
본 발명에서는, KCC-48 균주의 CFM(12.5 μg/mL 내지 50 μg/mL)이 3T3-L1 지방 세포에서 분화 및 지방 축적에 조절 효과를 발휘할 수 있는지 조사했다. 분화 유도 배지(DMI)로 처리된 지방 세포는 더 높은 오일 레드 O-염색된 지방세포에 의해 입증되는 가속된 분화 및 지방 축적을 보여주었지만, 오일 레드 O-염색된 지방세포의 수는 다음에 비해 농도-의존적 방식으로 CFM 처리에 의해 점차 감소되었다.
도 3c는 대조군 지방세포를 나타낸 것이다.
도 3d는 대조군 및 CFM 처리 지방 세포에서의 지방 축적을 나타낸 것이다.
또한, 오일 레드 O-스테인을 100% 이소프로판올로 추출하고 광학 밀도를 측정하였고, 이는 대조군 지방 세포보다 CFM-처리된 지방 세포에 대해 더 낮은 흡광도 값을 나타냈다(p <0.05). 이러한 결과는 CFM이 25 ㎍/ml 및 50 ㎍/ml의 농도에서 3T3-L1 지방 세포의 지방 세포 분화를 효과적으로 억제함을 명시한다.
특정 지방 세포 mRNA 및 단백질 발현에 대한 CFM의 효과
도 4a 내지 도 4f는 실험 지방 세포에서 PPAR-γC/EBP-βα, FAS, ACC 및 aP2의 전사 수준을 나타낸 도면이다.
실험 지방 세포에서 C/CEB-βC/CEB-α, PPAR-γ와 같은 지방세포-특이적 전사인자의 발현수준, 및 FAS, ACC 및 aP2를 포함하는 이들의 다운스트림 표적은 RT-PCR에 의해 정량화되었다. 결과는 50 ㎍/mL의 농도에서 CFM 처리가 C/EBP-βC/EBP-α, PPAR-γFAS, ACC 및 aP2의 mRNA 발현을 효과적으로 억제하고 대조군 지방 세포와 비교 함을 보여 주었다.
도 5a 내지 도 5c는 실험 세포에서 PPAR-γ, C/EBP-α, SREBP-1, FAS, pACC, AdipoQ, pAMPK, pp38 pErk1/2Erk의 번역 수준을 나타낸 도면이다.
이러한 결과를 확인하기 위해, 웨스턴블롯에 의해 지방생성 및 지방형성-특이적 단백질 발현을 분석하였다. 결과는 CFM 처리 개시 후 10 일째에 PPAR-γC/CEB-α 및 SREBP-1 단백질과 같은 지방 생성-특이적 마커의 발현이 하향 조절되었음을 확인 하였다. FAS, ACC 및 aP2와 같은 지방 생성 단백질은 대조군 지방 세포와 비교하여 하향 조절되는 반면, 아디포넥틴 수준은 대조군 지방 세포와 비교하여 CFM으로 처리된 지방 세포에서 증가되었다. 상기 결과는 CFM이 지방세포 분화에 중요한 역할을 하는 주요 지방생성 및 지방형성 단백질의 하향조절을 유의하게 유도하고, 인슐린 감지 인자인 아디포넥틴 수준을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
분자 경로에 대한 CFM의 영향
도 6a 및 도 6b는 CFM 처리된 지방세포에서 분화 및 지방 축적 억제에 관여하는 분자 경로를 도시한 것이다. CFM 보충제는 대조군 지방 세포와 비교하여 그들의 인산화 수준을 증가시킴으로써 활성화 된 pAMPK-α, p38MAPK 및 p44 / 42 (ERK1 / 2)를 상향 조절하였는데, 동일한 AKT 발현에서 대조군 및 CFM-처리된 지방 세포는 유사하였다. 이 결과는 CFM이 pp38MAPK 및 pp44 / 42 (ERK1 / 2) 신호전달경로를 증가시키고, 주요 지방생성 전사인자와 그 다운스트림 표적을 감소시킴으로써 지방 세포의 분화를 억제할 수 있음을 나타낸다.
지방 세포에서 RGZ 유도 PPAR-γ2 및 지방 저장에 대한 CFM의 효과
도 7a는 오일 레드 O로 염색된 세포를 현미경으로 관찰한 것을 나타낸 도면이다.
도 7b는 490nm에서 KCC-48 균주의 흡광도를 대조군, RGZ, RGZ+CFM 및 CFM에 대하여 나타낸 것이다.
도 7c는 PPAR-γ2에 대한 KCC-48 균주의 발현 수준을 대조군, RGZ, RGZ+CFM 및 CFM에 대하여 나타낸 것이다.
로시 글리타존 처리(10-7M)는 대조군 지방 세포와 비교하여 지방 축적 및 PPAR-γ2의 발현 수준을 증가시켰다. 그러나, KCC-48 균주 및 RGZ와의 공동 처리는 RGZ 단독 처리보다 지방 축적 및 PPAR-γ발현을 감소시켰다(p <0.05). 상기 결과는 CFM이 PPAR-γ의 RGZ-매개유도 및 지방 축적을 수행하지 않음을 나타낸다. 또한, 이들 결과는 CFM이 지방 세포에서 PPAR-γ를 하향 조절함으로써 분화 및 지방 축적을 효과적으로 억제할 수 있음을 입증 하였다.
체중 및 지방 조직 질량에 대한 KCC-48 균주의 효과
도 8a는 대조군, HFD첨가군, HFD+KCC-48 균주 첨가군의 체중을 나타낸 것이다.
도 8b는 대조군, HFD첨가군, HFD+KCC-48 균주 첨가군의 지방량을 나타낸 것이다.
KCC-48 균주의 CFM은 지방 세포의 분화 및 지방 축적을 효과적으로 감소시켰다. 이에 따라, KCC-48 균주가 항 비만 작용을 가질 수 있다. 따라서, 고지방식이 HFD-유도 비만을 감소시키는 KCC-48 균주의 능력을 ICR 생쥐 모델에서 조사하였다. 실험 기간 중, 정상적인 식단이 제공된 생쥐 또는 HFD-KCC-48이 보충된 생쥐에서 비정상적인 활성은 관찰되지 않았다. 실험이 종료될 때, HFD 공급 생쥐는 대조군 생쥐와 비교하여 더 높은 체중 및 지방 조직 질량을 나타냈다. 그러나, 생쥐의 체중은 HFD-공급 생쥐에 비해 KCC-48 균주 보충에 의해 감소되었다. 그룹간에 실험용 생쥐의 식이 섭취량에는 유의한 차이가 없었다. 전반적으로, KCC-48 균주의 보충은 HFD-유도 비만 생쥐에서 체중 증가 및 지방 조직 질량을 상당히 감소시켰다.
혈청 간 마커 및 지질 프로파일에 대한 KCC-48 균주의 효과
도 8c는 대조군, HFD첨가군, HFD+KCC-48 균주 첨가군에서 실험용 생쥐의 혈청 내 AST 및 ALT 활성을 나타낸 것이다.
도 8d는 대조군, HFD첨가군, HFD+KCC-48 균주 첨가군에서 실험용 생쥐의 혈청 내 콜레스테롤, 중성 지방 (TG), 고밀도 지단백질 (HDL) 및 저밀도 지단백질 (LDL)의 수준을 나타낸 것이다.
도 8e는 대조군, HFD첨가군, HFD+KCC-48 균주 첨가군에서 실험용 생쥐의 총 단백질 및 크레아티닌 수준을 나타낸 것이다.
HFD를 공급한 생쥐는 대조군 생쥐에 비해 ALT 및 AST와 같은 혈청 간 마커 및 콜레스테롤, TG 및 LDL 수준을 포함한 지질이 증가한 반면, HDL 수준은 HFD 공급 생쥐에서 감소되었다. 그러나, 혈청 크레아티닌 및 총 단백질 수준은 실험군 간에 유의미한 차이가 없었다. HFD-KCC-48 균주가 보충된 생쥐는 ALT, AST, 콜레스테롤, TG 및 LDL 수준이 감소된 반면, HDL 수준은 HFD 단독 공급 생쥐와 비교하여 KCC-48 균주로 처리된 HFD 공급 생쥐에서 약간 증가 하였다.
도 9a 내지 9d는 대조군, HFD첨가군, HFD+KCC-48 균주 첨가군에서의 MDA, GSH, SOD 및 CAT의 수치를 나타낸 것이다.
실험 동물의 혈청에서 산화 스트레스(MDA)와 항산화제(CAT, SOD, GSH)를 분석하였다. 증가된 산화 마커 및 감소된 항산화 지표 CAT, SOD 및 GSH는 대조군과 비교하여 HFD 유도 비만 동물의 혈청에서 관찰되었으며, 이와 대조적으로, KCC-48 균주를 비만 생쥐에 보충한 후 상기 지표들이 유의하게 정상화되었다.
KCC-48 균주의 지방 조직 염증 감소효과
도 10a 내지 10d는 대조군, HFD첨가군, HFD+KCC-48 균주 첨가군에서 실험용 IL1β, IL6, TNFα 및 렙틴 전사체를 나타낸 것이다.
비만은 지방 조직에서 만성적인 경증 염증과 밀접한 관련이 있다. 따라서, 본 발명에서는 실험 동물의 지방 조직에서 염증 마커 변화를 분석하였다. 염증성 사이토카인 IL1βIL6, TNFα 및 렙틴과 같은 아디포카인의 mRNA발현을 측정하기 위해 RT-PCR 분석을 수행하였다. 결과는 측정된 모든 사이토카인 및 아디포카인이 대조군 생쥐에 비해 HFD 먹이 생쥐에서 증가한 반면, KCC-48 균주 보충제는 HFD 먹이 생쥐에 비해 IL1βIL6, TNFα 및 렙틴 mRNA 발현을 감소시키는 경향이 있음을 나타내었다.
부고환 지방에서 지방생성 및 지방생성단백질 발현에 영향을 미치는 KCC-48 균주
도 11a 내지 11c는 대조군, HFD첨가군, HFD+KCC-48 균주 첨가군의 지방 조직에서 PPAR-γ, C / EBP-α, ACC, FAS, aP2, AadipoQ, pAMPK/AMPK, pp38/p38 및 pErk1/2Erk의 번역 수준을 나타낸 것이다.
SDS-PAGE 및 웨스턴블롯 분석에 의한 단백질 분석을 위해 실험 생쥐로부터 부고환 지방 조직을 수집하였다. 상기 결과는 지방 세포 특이적 인자의 발현을 나타낸다. 상세하게는, PPAR-γC / EBP-α 및 SREBP-1을 포함하고, HFD-KCC-48가 보충된 생쥐에서 지방생성 특이적 마커 ACC, FAS 및 aP2는 HFD 유발 비만 생쥐에 비해 감소했다. 아디포넥틴 수준은 대조군 또는 HFD 공급 생쥐와 비교하여 KCC-48 균주의 보충에 의해 증가되었다. 대조군과 KCC-48 균주 단독 보충 군간에 유의한 변화는 없었다.
실험용 생쥐의 지방 조직에서 신호 경로에 대한 KCC-48 균주의 영향
상기에서 HFD 공급 생쥐에서 KCC-48 균주의 항 비만 활성에 관한 분자 메커니즘을 상술하였다. KCC-48 균주의 처리는 HFD-유도 비만 생쥐의 지방 조직의 인산화 수준을 증가시킴으로써 p38MAPK 및 p44 / 42 (ERK1/2)를 상향 조절 하였다. 또한, PPARK-α 발현은 PPAR-γ 및 C/EBP의 발현을 하향 조절하는 인산화를 증가시킴으로써 HFD-유도 비만 생쥐의 지방 조직에서 증가되었다. 이 결과는 KCC-48 균주가 p38MAPK 및 p44/42 (ERK1/2) 경로를 상향 조절함으로써 지방 세포 분화 및 하위 발현에 관여하는 주요 전사 인자를 감소시킬 수 있음을 나타낸다.
HFD를 공급한 생쥐의 위장에서
L. plantarum
KCC-48 균주 생존력에 대한 증거
도 12a 내지 도 12g는 미생물 다양성의 변화를 나타낸 것이다.
본 발명에서는, 보충된 L. plantarum KCC-48 균주가 생존하고 파이로 시퀀싱 도구를 사용하여 HFD를 섭취한 생쥐에서 장 미생물 다양성에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 조사했다. 분변 샘플로부터의 전체 장 미생물의 다양성은 HFD를 섭취한 생쥐 및 HFD를 공급한 KCC-48 균주를 섭취한 생쥐에서 유의하게 변경되었다. 초기 분석에서, 박테리오데테스의 상대적인 충분함은 4주차에 마른 및 HFD를 단독 공급한 생쥐보다 KCC-48 균주를 보충한 HFD를 공급한 생쥐에서 더 높은 것으로 밝혀졌지만, 이 문 수준은 8주에 모든 실험 그룹에서 변경되었다. 후벽균(firmicutes) 및 박테리오데테스의 문은 마른 동물과 HFD를 공급한 생쥐에서 차이가 없었다. 그러나, KCC-48 균주가 보충된 HFD를 공급한 생쥐는 다른 그룹에 비해 더 높은 후벽균 문의 백분율을 나타냈다(도 12a 및 도 12c). 레벨에 따른 분류에서, 클로스트리얼(clostriales) 기반 미생물은 다른 그룹에 비해 HFD를 먹인 비만 생쥐에서 더 높은 것으로 나타났다(도 12b). HFD를 공급한 생쥐에서 KCC-48 균주의 생존 능력에 대한 증거, 종 수준 스크리닝이 수행되었고, 데이터는 HFD를 공급한 비만 생쥐에서 많은 수의 L.planatrum이 발견되었음을 확인했으나, HFD를 단독 공급 및 마른 생쥐 대변 샘플에서는 L.plantarum이 발견되지 않았고, 수치가 낮았다(도 12d 내지 도 12e). 실험 분변 샘플에서 생물의 속 수준에서의 장 관련 미생물의 분포는 속 히트 맵(도 12f)에 의해 보여졌다. 락토바실러스 속 수준에서의 미생물의 총 비는 대조군 동물에 비해 HFD를 공급한 생쥐에서 더 낮았지만, 락토바실러스의 상대적 풍부는 HFD를 공급한 생쥐에서 KCC-48 균주 보충에 의해 증가되었다. 이들 결과는 보충된 KCC-48 균주가 생쥐의 위에서 생존할 수 있고 장 미생물의 다양성을 촉진하여 HFD를 공급한 비만 생쥐에서 비만의 개선을 나타낼 수 있음을 확인하였다. 속 수준에서 지배적 장내 미생물 군집의 상대적 존재 비(상대적 풍부도에 따른 상위 43 속)와 비만 관련 요인 사이의 상관 관계는 스피어맨(spearman)의 상관 분석에 의해 결정되었다. 실험 동물의 지방조직 및 혈청 임상 파라미터(AST, ALT, 크레아티닌, 콜레스테롤, HDL, LDL 및 TG)에서 비만 관련 단백질(PPARγC/EBPα, aP2, ACC, AdipoQ에 대한 Image J 데이터)이 포함되었다. 데이터는 엔테로랍두스(Enterorhabdus), 루미노코커스(Ruminococcus), 포도상구균(Staphylococcus), 펩토스트렙토코카세아(Peptostreptococcaceae), 클로스트리듐(Clostridium), 블라우티아(Blautia) 및 클로스트리디알리스(clostridiales)와 비교하여 PPARγFAS 및 C/EBPα와 양의 상관 관계가 있었고, 아디포넥틴과 음의 상관 관계를 보였고(p<0.05), 에리시펠로트리체세아(Erysipelotrichaceae)는 AST와 양의 상관 관계가 있음을 나타냈다(p<0.05). 페닐로박테리움(Phenylobacterium)에서 데설피도박테리움(desulfidobacterium)까지는 혈청 콜레스테롤과 음의 상관 관계가 있다(도 12g).
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