KR102628159B1 - 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스에 중화 활성을 갖는 펩타이드 - Google Patents
제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스에 중화 활성을 갖는 펩타이드 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)의 단백질 또는 그 일부를 특이적으로 인지하는 펩타이드에 관한 것으로서, 본 발명의 펩타이드는 SARS-CoV-2 표면의 스파이크 단백질에 대한 우수한 결합 능력을 가지며 SARS-CoV-2 감염에 대한 예방, 치료 또는 진단에 매우 유용하다.
Description
본 발명은 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-Cov-2)에 중화 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.
제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-Cov-2)는 단일 가닥 RNA(single-stranded RNA) 바이러스로 코로나바이러스아과에 속하며, 2019년 12월 중국 우한에서 발생한 원인 불명의 폐렴 환자에서 처음 원인 바이러스가 발견되었다. 중증급성호흡기증후군 감염증과 혼동하지 않도록 세계보건기구(WHO)는'2019년 코로나바이러스감염증 바이러스' 또는 '2019년 코로나바이러스감염증 유책 바이러스'라 부르기도 한다.
2019년 12월부터 2020년 7월 초까지 전 세계 214개국에서 1,157만명의 확진 환자가 발생하였으며 이 중 537,138명이 사망하여 치사율은 4.64에 달하는 것으로 알려져 있다. SARS-CoV-2의 임상적 증상은 발열을 동반한 호흡기 증상이 주로 나타나며, 주요 취약 대상은 60대 이상의 기저 질환 및 면역 질환 등을 앓고 있는 노약자이다. 이전의 바이러스들과는 다른 강력한 전염성, 빠른 증상 악화를 보여 최초 발생 보고 후 3개월 남짓한 2020년 3월에 WHO에서는 세계적 대유행, 펜데믹을 선언하였다.
아직까지 특별한 치료제는 없으나, 항바이러스제에 관한 연구가 진행되어 RNA 중합효소 억제제인 렘데시비르, 말라리아 치료제인 클로로퀸, 항레트로바이러스 인간면역결핍 I 단백질분해효소 억제제인 로피나비르/리토나비르 등의 항바이러스 치료제가 세포 수준에서 SARS-CoV-2 억제 효과를 보이는 것으로 보고되었다. 그러나, 현재까지 효과가 있다고 알려진 치료제들은 실제 임상에서는 그 효과가 미미하거나, 다양한 부작용을 야기할 수 있어 문제가 되고 있다.
이에 본 발명자들은 SARS-CoV-2를 억제할 수 있는 새로운 치료제를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 본 발명의 펩타이드들이 코로나 바이러스 감염증의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 목적은 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)의 단백질 또는 그 일부를 특이적으로 인지하는 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 SARS-CoV-2 감염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 일 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 SARS-CoV-2 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
이를 위하여, 본 발명의 일 측면은, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)의 단백질 또는 그 일부를 특이적으로 인지하는 펩타이드를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 일 측면은, 상기 펩타이드를 포함하는 SARS-CoV-2 감염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 일 측면은, 상기 펩타이드를 포함하는 SARS-CoV-2 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 SARS-CoV-2 표면의 스파이크 단백질에 결합하여 SARS-CoV-2를 중화시킴으로써 바이러스와 숙주 세포의 막 융합을 저해하는 효과가 있으므로 SARS-CoV-2 감염을 예방, 치료 또는 진단하는 용도로 사용될 수 있다.
다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 서열번호 1 내지 6의 펩타이드가 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD에 결합하는 능력을 ELISA로 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 서열번호 1 내지 6의 펩타이드가 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD가 숙주 세포의 안지오텐신 전환효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2, ACE2) 단백질에 결합하는 것을 저해하는 활성을 ELISA로 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 인간 페암세포주 A549의 세포 표면에 발현하는 ACE2에 대한 RBD의 결합을 본 발명의 서열번호 1 내지 4의 펩타이드가 저해시키는 능력이 있는지 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 서열번호 1 내지 6의 펩타이드가 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD가 숙주 세포의 안지오텐신 전환효소 2 (Angiotensin-converting enzyme 2, ACE2) 단백질에 결합하는 것을 저해하는 활성을 ELISA로 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 인간 페암세포주 A549의 세포 표면에 발현하는 ACE2에 대한 RBD의 결합을 본 발명의 서열번호 1 내지 4의 펩타이드가 저해시키는 능력이 있는지 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면은 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)의 단백질 또는 그 일부를 특이적으로 인지하고, 서열번호 1 내지 서열번호 6의 서열로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 제공한다.
본 명세서에서, 용어 '펩타이드'는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형 또는 환형의 분자를 의미한다. 상기 펩타이드의 제작은 본 기술분야에서 공지된 통상의 생물학적 또는 화학적 합성 방법에 의해 달성될 수 있는 것이고, 일 예로 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques)과 같은 방법에 의해 달성될 수 있다.
상기 '펩타이드'는 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체들, 또는 단편들일 수 있다. 상기 펩타이드의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 교환은 본 기술 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다. 따라서, 본 발명은 서열번호 1 내지 6으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 단백질이란 상기 서열번호 1 내지 6으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열과 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 예컨대, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 의미하나 이에 한정되지 않으며, 75% 이상의 아미노산 서열의 상동성을 가지며 동일한 활성을 가진다면 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열을 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 보다 나은 화학적 안정성, 강화된 약리 특성(반감기, 흡수성, 역가, 효능 등), 변경된 특이성(예를 들어, 광범위한 생물학적 활성 스펙트럼), 감소된 항원성을 획득하기 위하여, 본 발명의 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 보호기가 결합되어 있을 수 있다. 예컨대, 상기 보호기는 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)일 수 있으나, 펩타이드의 개질, 특히 펩타이드의 안정성 증진시킬 수 있는 성분이라면, 제한없이 포함할 수 있다. 상기 '안정성'은 생체 내 단백질 절단 효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 생체내(in vivo)에서의 안정성뿐만 아니라, 저장안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 포함하는 의미로 사용된다.
일 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다:
RSYMTTHHEQF (서열번호 1);
KFNRRHH (서열번호 2);
KYLLVHRPYYRR (서열번호 3);
WVPYQARVPYPR (서열번호 4);
RLYCKNGGFFLR (서열번호 5); 및
KHRGGGNRR (서열번호 6).
본 발명의 펩타이드는 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질(Spike protein, S protein)에 특이적으로 결합할 수 있다. 더욱 구체적으로 본 발명의 펩타이드는 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질에 존재하는 RBD(Receptor binding domain)에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 명세서에서 용어 “특이적으로 결합”은 관심 대상의 단백질, 즉 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질 또는 그 일부인 RBD에 결합하지만 샘플 중의 다른 분자는 실질적으로 인식하지 않고 결합하지 않는 것을 의미한다.
본 발명의 펩타이드는 SARS-CoV-2 표면의 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하여 숙주세포의 세포막 수용체와 스파이크 단백질의 결합을 억제할 수 있다.
상기 숙주세포의 세포막 수용체는 안지오텐신 전환효소 2(Angiotensin-convering enzyme 2, ACE2)이고, 안지오텐신 전환효소 2는 진핵생물과 세균에서 발견되는 막관통 단백질로서 SARS-CoV-2를 포함하는 코로나바이러스가 세포에 침입할 때 이용하는 수용체이다.
일 구현예에서, 본 발명의 펩타이드가 SARS-CoV-2 표면의 스파이크 단백질 RBD에 특이적으로 결합하여 SARS-CoV-2를 중화시킬 수 있고, SARS-CoV-2가 숙주 세포의 세포막에 결합하는 것을 저해할 수 있음을 확인하였다.
본 명세서에서 용어 “중화”는 중화가 달성되는 기작과 상관없이, 생체 내에서 및/또는 시험관 내에서 SARS-CoV-2가 복제되는 것을 저해하는 능력을 의미한다. 일 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 표적 세포에 SARS-CoV-2가 부착하여 바이러스 막과 세포 막이 융합되는 것을 저해함으로써 SARS-CoV-2를 중화시킨다.
본 발명의 다른 일 측면은, 상기 펩타이드를 포함하는 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 표면의 스파이크 단백질에 결합하여 숙주세포의 세포막 수용체와 스파이크 단백질의 결합을 억제함으로써 SARS-CoV-2의 감염을 예방하거나 치료할 수 있다.
본 발명의 SARS-CoV-2 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구제 제형, 외용제, 좌제, 및 멸균 주사용액 형태로 제형화되어 사용할 수 있고, 제형화를 위하여 상기 펩타이드 이외에 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학적으로 허용되는 담체는 제제시 통상적으로 이용되는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아, 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 더 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 근육 내, 정맥 내, 복강 내, 피하, 피내, 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 '약학적으로 유효한 양'은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 배설 속도, 질병 종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라 증감될 수 있으며, 예를 들어 상기 약학적 조성물을 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.0001㎍ 내지 500mg, 바람직하게는 0.01㎍ 내지 100mg 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 추가로 적어도 하나의 다른 치료제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 펩타이드와 함께 인터페론, 항-S 단백질 단일클론 항체, 항-S 단백질 폴리클로날 항체, 뉴클레오시드 유사체, DNA 폴리머라아제 저해제, siRNA 제제 또는 치료백신을 항바이러스 약물로서 추가로 포함할 수 있다. 이들은 본 발명의 펩타이드와 조합되어 사용될 수 있다. 본 명세서에서 “조합되어”는 별개의 제형으로서 또는 하나의 단일 병용 제형으로서 동시에, 또는 임의의 순서로 별개의 제형으로 순차적으로 투여하는 요법에 따름을 의미한다.
또 다른 일 측면에서, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 SARS-CoV-2 검출용 조성물은 생물학적 샘플과 상기 펩타이드를 접촉시킨 후 반응을 확인하여 생물학적 샘플 내에 SARS-CoV-2의 존재 여부를 검출하는 데 사용할 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 검출 가능하도록 표지될 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 표지의 예로는 효소, 방사성 동위원소, 콜로이드금속, 형광 화합물, 화학발광 화합물 및 생발광 화합물이 있다. 통상적으로 사용되는 표식들은 형광물질(가령, 플루레신, 로다민, 텍사스 레드 등), 효소(가령, 고추냉이 퍼옥시다아제, β-갈락토시다아제, 알칼리포스파타아제), 방사성 동위원소(가령, 32P 또는 125I), 바이오틴, 디곡시게닌, 콜로이드 금속, 화학발광 또는 생발광 화합물(가령, 디옥세탄, 루미놀 또는 아크리디늄)을 포함한다. 효소 또는 바이오티닐기의 공유 결합법, 요오드화법, 인산화법, 바이오틴화법 등과 같은 표식 방법들이 당분야에 잘 알려져 있다.
상기 SARS-CoV-2의 존재 여부 검출은 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블롯팅(Western Blotting), 면역형광(Immunofluorescence), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry staining), 유세포분석법(Flow cytometry), 면역세포화학법, 방사능면역분석법(RIA), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법 (Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay) 및 단백질칩(Protein Chip)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나에 의해 실시될 수 있다.
상기 효소면역흡착법(ELISA)에는 고체 지지체에 부착된 펩타이드를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 펩타이드를 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다.
상기 생물학적 샘플은 대상체의 가래, 침, 혈액, 땀, 호흡기 조직 및 타액으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 샘플을 준비할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 펩타이드를 포함하는 SARS-CoV-2 감염 또는 질환을 진단하기 위한 키트를 제공한다.
본 명세서에서 용어 “SARS-CoV-2 감염 또는 질환”은 SARS-CoV-2에 의한 세포 또는 대상체의 감염에서 생기는 병리학적 상태를 의미하며, 예를 들어, 상기 질환은 SARS-CoV-2에 의해 야기되는 호흡기 질환일 수 있다.
본 발명의 진단용 키트에 있어서, 키트에는 고체 담체가 포함될 수 있다. 본 발명의 펩타이드는 고체 담체에 부착될 수 있고, 이와 같은 고체 담체는 다공성, 또는 비다공성, 평면 또는 비평면일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 펩타이드의 선별
SARS-CoV-2의 스파이크 단백질(Spike protein, S protein)과 안지오텐신전환효소 2(Angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)의 결합을 저해하는 펩타이드를 개발하기 위하여 펩타이드 라이브러리에서 스크리닝을 통해 6종의 펩타이드를 선별하였다. 선별된 펩타이드의 서열과 분자량 측정기를 이용하여 측정한 펩타이드의 분자량을 하기 표 1에 기재하였다.
| NO | 아미노산 서열 | 분자량(Da) | 서열번호 |
| 1 | RSYMTTHHEQF | 1437 | 1 |
| 2 | KFNRRHH | 994.1 | 2 |
| 3 | KYLLVHRPYYRR | 1664 | 3 |
| 4 | WVPYQARVPYPR | 1532 | 4 |
| 5 | RLYCKNGGFFLR | 1474 | 5 |
| 6 | KHRGGGNRR | 1037 | 6 |
본 발명 펩타이드의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 RBD에 대한 결합능 확인
본 발명의 펩타이드들이 SARS-CoV-2의 숙주 세포 침입을 차단할 수 있는지 확인하기 위하여 먼저, SARS-CoV-2의 스파이크 단백질 내의 RBD를 본 발명의 펩타이드들이 인식하고 결합할 수 있는지 확인하였다.
구체적으로, 실험예 1에서 선별한 6종의 펩타이드를 2mM의 나트륨 바이카보네이트와 동일 부피로 혼합하여 96-웰 플레이트에 100 μL씩 분주한 다음, 4℃ 에서 밤새 배양하여 웰 표면을 펩타이드로 코팅하였다. 0.1% PBS-T (0.1% Tween-20 in PBS) 로 3회 세척한 다음 3% BSA 를 100 μL씩 분주한 뒤, 실온에서 1시간 블로킹시키고, 0.1% PBS-T 로 3회 세척하였다. 그 후 재조합 SARS-CoV-2 스파이크 RBD-His (Sino Biological, Cat. No.: 40592-V08B, China) 를 웰 당 100 ng 처리하고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 0.1% PBS-T 로 3회 세척한 다음 항-His 항체-HRP (Abcam, Cat. No.: ab1187, US) 를 1:1000으로 PBS에 희석하여 처리하고 실온에서 1시간 반응시킨 후 0.1% PBS-T 로 3회 세척하였다. TMB 용액 (ThermoFisher, Cat. No.: N301, US) 을 100 μL 씩 분주하여 약 5분 반응시킨 뒤, 1M의 황산 50 μL 을 처리하여 반응을 종결시켰다. 분광기를 이용하여 450nm 파장에서 O.D. 값을 측정하였다.
그 결과, [도 1]에 나타난 바와 같이 서열번호 1 내지 6의 펩타이드각각의 RBD에 대한 결합 패턴을 ELISA로 관찰하였을 때 펩타이드의 농도 의존적으로 RBD에 대한 결합 폴드(fold)가 증가하는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 펩타이드가 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 RBD를 인식하고, 결합하는 능력이 있음을 알 수 있다.
본 발명 펩타이드의 ACE2-RBD 결합 저해능 확인
본 발명의 펩타이드들이 SARS-CoV-2의 숙주 세포 침입을 차단할 수 있는지 확인하기 위하여, 본 발명의 펩타이드들이 숙주 세포의 막 단백질인 ACE2와 SARS-CoV-2의 RBD와의 결합을 저해하는지 확인하였다.
구체적으로, 2mM의 나트륨 바이카보네이트와 ACE2-FC 단백질(Sino Biological, Cat. No.: 10108-H02H, China)을 동일 부피로 혼합하여 96-웰 플레이트에 100ng/100 μL/웰씩 분주한 다음, 4℃ 에서 밤새 배양하여 웰 표면을 ACE2 단백질로 코팅하였다. 0.1% PBS-T (0.1% Tween-20 in PBS) 로 3회 세척한 다음 3% BSA 를 100 μL씩 분주한 뒤, 실온에서 1시간 블로킹시켰다. PBS에 재조합 SARS-CoV-2 스파이크 RBD His (Sino Biological, Cat. No.: 40592-V08B, China) 100 ng 과 농도 별 펩타이드 용액을 혼합하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 웰을 0.1% PBS-T 로 3회 세척한 다음 상기 단백질 펩타이드 혼합물을 웰에 처리하였다. 실온에서 2시간 동안 반응시킨 다음 0.1% PBS-T 로 3회 세척하였다. 항-His 항체-HRP (Abcam, Cat. No.: ab1187, US) 를 1:1000으로 PBS에 희석하여 처리하고 실온에서 1시간 반응시킨 후 0.1% PBS-T 로 3회 세척하였다. TMB 용액 (ThermoFisher, Cat. No.: N301, US) 을 100 μL 씩 분주하여 약 5분 반응시킨 뒤, 1M의 황산 50 μL 을 처리하여 반응을 종결시켰다. 분광기를 이용하여 450nm 파장에서 O.D. 값을 측정하였다.
그 결과, [도 2]에 나타난 바와 같이, 서열번호 1 내지 6의 펩타이드각각은 농도 의존적으로 ACE2 단백질에 대한 RBD의 결합을 저해하는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 펩타이드가 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 RBD에 결합함으로써 ACE2 단백질에 스파이크 단백질이 결합하는 것을 저해하는 것을 알 수 있다.
인간폐암세포에서 본 발명 펩타이드의 ACE2-RBD 결합 저해능 확인
본 발명의 펩타이드가 포유동물 세포의 코로나바이러스 감염의 예방, 개선 및 치료 능력이 있는지 확인하기 위하여, 인간폐암세포주에 펩타이드들을 처리한 후 숙주세포의 ACE2에 대한 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 RBD의 결합능이 감소하는지 확인하였다.
구체적으로, 인간폐암세포주(adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells)인 A549 세포(Korean Cell Line Bank, Cat.No.: 10185, Korea)를 6웰 플레이트에 5x105 세포/웰의 밀도로 접종하고 24시간 동안 배양하였다. DMEM 배지 1 mL에 재조합 SARS-CoV-2 스파이크 RBD His (Sino Biological, Cat. No.: 40592-V08B, China) 500 ng 과 농도 별 펩타이드 용액을 혼합하여 실온에서 1시간 동안 반응시켜 준비하였다. 하루 동안 배양한 A549 세포를 DMEM 배지로 세척한 다음 900 μL의 재조합 SARS-CoV-2 스파이크 RBD/펩타이드 혼합물을 세포에 첨가하였다. 37℃의 CO2 인큐베이터에서 2시간 동안 배양한 후 PBS로 세포를 2회 세척하고, 용해 버퍼 200 μL 처리하여 세포를 용해시켰다. 5X 샘플 버퍼를 처리하여 샘플을 준비한 후 10% SDS-PAGE 겔을 이용하여 SDS-PAGE를 진행하였다. SDS-PAGE 를 통해 분리한 단백질을 PVDF 멤브레인으로 이동시킨 다음 5% 스킴 밀크를 이용하여 1시간 동안 실온에서 블로킹 시켰다. 다음으로 항-His 항체-HRP (Abcam, Cat. No.: ab1187, US) 를 1:1000으로 5% 스킴 밀크에 희석하여 멤브레인과 2시간 동안 반응시키고, 0.1% PBS-T (0.1% Tween-20 in PBS) 로 10분씩 3회 세척하였다. ECL 용액(GE Healthcare, Cat. No.: RPN2232, US)을 이용하여 필름으로 검출하였다.
그 결과, [도 3]에 나타난 바와 같이, 본 발명의 서열번호 1 내지 4의 펩타이드 각각이 모두 농도 의존적으로 숙주세포의 ACE2와 SARS-CoV-2 스파이크 RBD와의 결합을 저해하는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 펩타이드가 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질에 결합하여 숙주세포의 ACE2에 스파이크 단백질이 결합하는 것을 저해함으로서 바이러스가 숙주세포에 감염되는 것을 예방 또는 치료 할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명 펩타이드의 SARS-CoV-2 세포 감염 억제 효과 확인
본 발명의 펩타이드가 SARS-CoV-2에 의한 세포 감염을 억제하는 효과가 있는지 직접적으로 확인하기 위하여 Focus Reduction Neutralizing Test (FRNT)를 수행하였다.
구체적으로, Vero E6 세포(ATCC, USA)를 96-well plate에 2X104 세포/웰의 밀도로 접종한 후, 90-100 % confluency까지 배양하였다. 500 focus-forming units (FFU)/well의 SARS-CoV-2와 농도 별 펩타이드 샘플을 1:1로 혼합한 후 37 ℃ 에서 1시간 동안 반응시켰다. 펩타이드와 바이러스 혼합물을 Vero E6 세포 monolayer 에 처리하고 37 ℃ 에서 1시간 동안 배양하였다. 상등액을 제거한 후 1.6 % carboxymethylcellulose (CMC)가 포함된 DMEM 배지를 처리하여 37 ℃ 에서 24시간 동안 배양하였다. 상등액 제거 후 4 % paraformaldehyde를 처리하여 세포를 고정한 후 PBS로 세척하였다. 0.2 % Triton X-100 과 1 % BSA를 포함하는 PBS를 30분 동안 처리하여 cell permeabilization을 진행한 후 PBS로 세척하였다. 1 % BSA가 포함된 PBS에 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드에 대한 1차 항체(Sino Biological, China)를 1:1000로 희석한 후 세포에 1시간 동안 처리하고, PBST (PBS containing 1 % Tween-20)로 세척하였다. 1 % BSA가 포함된 PBS에 2차 항체(Sino Biological, China)를 1:2000로 희석한 후 세포에 1시간 동안 처리하고, PBST로 세척하였다. KPL TrueBlue™ Peroxidase Substrate (SeraCare Life Sciences, USA)를 처리한 후 증류수로 세척하고 SARS-CoV-2 foci 의 수를 Elispot reader (Cellular Technology Limited, USA) 로 분석하였다. 하기 수학식을 이용하여 바이러스 감염 저해율을 계산하였다.
[수학식 1]
그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이 본 발명의 서열번호 1 내지 4의 펩타이드를 각각 처리하였을 때 4종의 펩타이드 모두 농도 의존적으로 바이러스의 감염 저해율이 상승하는 것을 확인하였다.
| 서열번호 | 농도 (mM) | 저해율 (%) |
| 1 | 2.5 | 21 |
| 10 | 100 | |
| 2 | 2.5 | 51 |
| 10 | 96 | |
| 3 | 2.5 | 98 |
| 10 | 98 | |
| 4 | 2.5 | 55 |
| 10 | 98 |
이를 통해, 본 발명의 펩타이드가 SARS-CoV-2에 의한 세포 감염을 억제함으로써 SARS-CoV-2 감염을 예방, 개선 및 치료할 수 있음을 알 수 있다.
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<220>
<223> Peptide 6
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Lys His Arg Gly Gly Gly Asn Arg Arg
1 5
Claims (7)
- 서열번호 1 내지 6의 서열로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 포함하는 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서,
상기 조성물은 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 표면의 스파이크 단백질에 결합하여 숙주세포의 세포막 수용체와 스파이크 단백질의 결합을 억제하는 것인, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서,
상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서,
상기 약학적 조성물은 경구용 제제, 주사용 제제 또는 외용제의 형태로 제형화되는 것인, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 서열번호 1 내지 6의 서열로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 포함하는 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 검출용 조성물.
- 청구항 5에 있어서,
상기 펩타이드는 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)의 단백질 또는 그 일부를 특이적으로 인지하는 것인, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 검출용 조성물.
- 청구항 6에 있어서,
상기 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스의 단백질은 스파이크 단백질인, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 검출용 조성물.
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