KR102617574B1

KR102617574B1 - 암 면역요법의 임상 효과 예측을 위한 면역 바이오마커

Info

Publication number: KR102617574B1
Application number: KR1020237001717A
Authority: KR
Inventors: 히로시 카가무
Original assignee: 각코우호우징 사이타마이카다이가쿠
Priority date: 2017-02-07
Filing date: 2018-02-06
Publication date: 2023-12-22
Also published as: JP2020073924A; CN116712458A; JP2020512530A; CN110446928A; EP3580569A1; US20200025768A1; TW202323820A; TWI795386B; US11293924B2; AU2018218844B2; CA3052027A1; SG11201907102XA; WO2018147291A1; IL268524A; JP2022105066A; JP2024023862A; UY37594A; JP6664684B1; US20230349909A1; EP4039260A1

Abstract

본 발명은 피험자의 T-세포 조성물에 기초한 피험자의 암 면역요법에 대한 반응성의 예측 및 이러한 예측에 기초한 암 면역요법을 사용하는 치료 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 피험자의 암 면역요법에 대한 반응성을 개선 또는 유지하기 위한 방법을 제공한다. 암 면역요법에 대한 반응성은 피험자로부터 유래된 샘플 내의 항-종양 면역 반응 내에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단, 수지상 세포 아집단 및/또는 CD8⁺ T-세포 아집단의 상대적인 값을 결정함으로써 예측된다. CD62L^lowCD4⁺ T-세포와 같은 세포를 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물 또한 제공된다.

Description

암 면역요법의 임상 효과 예측을 위한 면역 바이오마커 {Immunological biomarker for predicting clinical effect of cancer immunotherapy}

본 발명은 암 면역요법 분야에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 피험자의 T-세포 조성에 기초한 피험자의 암 면역요법에 대한 반응성 예측 및 예측에 기초하여 암 면역요법을 이용한 치료 방법에 관한 것이다. 또 다른 측면에서 본 발명은 피험자의 암 면역요법에 대한 반응성을 개선 또는 유지하는 방법을 제공하는 것이다.

암 면역요법은 암세포 등의 대사를 표적으로 하는 통상적인 항암 요법(알킬화제, 백금 제형, 항 대사제, 토포이소머라아제 저해제, 미세소관 중합화 저해제, 미세소관 해중합화(depolymerization) 저해제 등)에 비해 부작용이 적고 효과가 더 큰 것으로 최근 주목을 받았다. 암 면역요법 중 항-PD-1 면역 체크포인트 저해는 특히 중요한 관심을 끌고 있다.

항-PD-1 항체 인 니볼루맙(nivolumab)은 일반적으로 비소세포 폐암의 2차 치료제로서 통상적으로 표준 요법이었던 도세탁셀보다 모든 생존 기간에서 큰 차이를 보이므로 폐암 학회 가이드라인에서 권장수준 A의 표준 요법이 되었다(Brahmer J, 등, N Engl J Med 2015; 373 : 123-135). 항-PD-1 항체인 펨브롤리주맙(Pembrolizumab)은 모든 생존 기간에서의 1차 치료에서 통상적인 표준 요법이었던 세포 독성 항암제보다 우수한 것이다(종양 세포에서 PD-L1의 발현이 50% 이상인 환자에서). 이 항암제가 장래에 비소세포 폐암의 표준 요법이 될 것으로 결정되었다.

항-PD-1 항체의 효과는 폐암에만 국한되지 않는다. 이 효과는 신장암, 두경부암, 위장암, 부인과암, 악성 림프종 및 유방암에서 입증되고 있다. 신장암은 일본에서 보험 적용된다. 내년에는 두경부암, 위장암 및 악성림프종이 포함될 것으로 예상된다.

항-PD-1 항체가 중요한 임상적 성공을 달성한 것으로 보이지만 항-PD-1 항체는 실제로 심각한 문제가 있다. 대부분의 항-PD-1 항체 임상 시험에서 3개월 이내에 상태가 악화되는 “무 효과 그룹”은 무진행 생존(PFS) 데이터에서 찾아 볼 수 있다. 한편 항-PD-1 항체가 1년 이상 유효했던 그룹에서는 그 이후의 상태 악화가 거의 관찰되지 않아 치유에 근접한 상태가 되는 것을 알 수 있다.

이는 임상 효과 측면에서 “무 효과 그룹”, “매우 효과적인 그룹” 및 “중간 그룹”의 세 가지 하위 그룹의 존재를 암시하지만, 이의 예측을 위한 바이오마커는 알려지지 않았다. 거의 모든 암 및 종양에서 표준 요법으로 예상되는 항-PD-1 항체를 약 40%를 차지하는 무 효과 그룹에 투여하는 것은 의학적 문제일 뿐만 아니라 의료 경제학의 문제이기도 하다.

Brahmer J, 등, N Engl J Med 2015; 373: 123-135

본 발명은 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 피험자의 CD4⁺ T-세포의 조성을 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 피험자의 수지상 세포 및/또는 CD8⁺ T-세포의 조성을 면역요법에 대한 피험자의 반응을 예측하는 지표로서 사용하는 방법을 제공한다.

본 발명은 부분적으로 암 면역요법에 대한 반응성이 환자의 T-세포 및/또는 수지상 세포의 조성과 관련되어 있으며, 반응성을 바이오마커로서 사용할 수 있다는 것을 확인하였다. 본 발명의 바이오마커는 종래 연구된 바이오마커보다 훨씬 높은 수준의 민감도 및 특이도를 지닌다.

본 발명자들은 암 면역요법(예를 들면 항-PD-1 요법 또는 항-PD-L1 요법)에 대한 치료적 효과에 상이한 면역학적 조건을 나타내는 3개 그룹을 발견하였다, 즉 진행성 질환(PD), 안정적 질환(SD) 및 반응(완전 반응(CR) + 부분 반응(PR))이다. 본 발명의 일부 실시형태는 암 면역요법이 피험자에 적용되었을 때 진행성 질환(PD), 안정적 질환(SD) 또는 반응(완전 반응(CR) + 부분 반응(PR))으로 암 면역요법에 대한 반응을 예측하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 부분 반응 그룹(PR)을 지니는 완전 반응 그룹(CR)을 포함하는 피험자 집단 또는 부분 반응 그룹(PR)을 지니지 않는 완전 반응 그룹(CR)을 포함하는 피험자 집단이 부분 반응 그룹(PR)과 동일하게 식별될 수 있음이 인식되어야 한다.

본 발명의 하나의 실시형태는 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 항-종양 면역반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 상대량을 사용하는 방법이다.

항-종양 면역반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 예는 다음과 같으며 이에 한정되지는 않는다. 2차 림프 기관에 대한 호밍 분자(homing molecule)의 발현이 감소된 CD4⁺ T-세포 아집단, 이펙터 T-세포에 의해 프라이밍된 CD4⁺ T-세포 아집단 및 항원 인식에 의해 프라이밍된 CD4⁺ T-세포 아집단 및 조절 T-세포 아집단이다.

CD4⁺ T-세포 아집단의 상대량은 다음 군에서 선택되며 이에 한정되지는 않는다:

CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율;

CD4⁺ T-세포 내에서 CCR7-CD4⁺ T-세포 아집단의 비율;

CD4⁺ T-세포 내에서 CD45RA-CD4⁺ T-세포 아집단의 비율;

CD4⁺ T-세포 내에서 CD45RO⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율;

CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내에서 LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율;

CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내에서 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율;

CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율;

CD4⁺ T-세포 내에서 CCR4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율;

CD4⁺ T-세포 내에서 CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; 및

CD4⁺ T-세포 내에서 Foxp3⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율.

본 발명은 예를 들어 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 피험자의 CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^low T-세포의 비율을 사용하는 방법을 제공한다. 하나의 실시형태에서 상기 방법은 피험자로부터 유래된 샘플의 CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^low T-세포의 비율을 측정하는 것을 포함한다. 비율이 임계치(무 효과 그룹 임계치)보다 높으면 암 면역요법과 관련하여 피험자가 무 효과 그룹의 일부가 아님을 나타내는 것이다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 항-종양 면역반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 수지상 세포 아집단의 상대량을 이용하는 방법이다.

항-종양 면역반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 수지상 세포 아집단의 예는 다음과 같으며 이에 한정되지는 않는다. CD4⁺T-세포 집단에서 호밍 분자의 발현 감소와 함께 세포 아집단의 증가로 인해 증가하는 수지상 세포 아집단; CD4⁺ T-세포 집단에서 이펙터 T-세포에 의해 프라이밍 된 CD4⁺ T-세포 아집단의 증가로 인해 증가하는 수지상 세포 아집단이다.

수지상 세포 아집단의 예로는 HLA-DR⁺ 수지상 세포 아집단, CD80⁺ 수지상 세포 아집단, CD86⁺ 수지상 세포 아집단 및 PD-L1⁺ 수지상 세포 아집단을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 수지상 세포의 예로는 골수 수지상 세포(mDC, CD141⁺CD11c⁺ 수지상 세포) 및 형질세포(plasmacytoid) 수지상 세포(pDC, CD123⁺CD11c⁺ 수지상 세포)가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 항-종양 면역반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD8⁺ T-세포 아집단의 상대량을 사용하는 방법이다.

항-종양 면역반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD8⁺ T-세포 아집단의 예는 다음과 같으며 이에 한정되지는 않는다. CD4⁺T-세포 집단에서 호밍 분자의 발현 감소와 함께 세포 아집단의 증가로 인해 증가하는 CD8⁺ T-세포 아집단, CD4⁺T-세포 집단에서 이펙터 T-세포에 의해 프라이밍된 CD4⁺ T-세포 아집단의 증가로 인해 증가하는 CD8⁺ T-세포 아집단, CD4⁺T-세포 집단에서 항원 인식에 의해 프라이밍된 CD4⁺T-세포 아집단의 증가로 인해 증가하는 CD8⁺ T-세포 아집단, 수지상 세포 집단에서 HLA-DR+ 수지상 세포 아집단의 증가로 인해 증가하는 CD8⁺ T-세포 아집단, 수지상 세포 집단에서 CD80⁺ T-세포 아집단의 증가로 인해 증가하는 CD8⁺ T-세포 아집단, 수지상 세포 집단에서 PD-L1⁺ 수지상 세포 아집단의 증가로 인해 증가하는 CD8⁺ T-세포 아집단이다.

또한 항-종양 면역반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD8⁺ T-세포 아집단 예로는 CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단, CD137⁺CD8⁺ T-세포 아집단 및 CD28⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단을 포함하며 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 하나의 실시형태는 항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 항-종양 면역 반응에서 CD4⁺ T-세포에 의한 수지상 세포 자극과 관련 있는 수지상 세포 아집단의 양; 항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD8⁺ T-세포 아집단의 양; 조절 T-세포와 관련 있는 CD4⁺ T-세포 또는 조절 T-세포의 양; 및 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양;에서 선택된 양을 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 식의 변수(지표)로서 피험자의 함량으로 사용하는 방법이다.

하나의 실시형태에서 본 발명의 변수 (X, Y) 각각은 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; CCR7^-CD4⁺ T-세포 아집단의 양; LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RA^-CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RO⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CCR4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; Foxp3⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; HLA-DR⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD80⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD86⁺ 수지상 세포 아집단의 양; PD-L1⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 양; CD137⁺CD8⁺ T-세포 아집단의 양; 및 CD28⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 양;으로 이루어진 군에서 선택된 것이다.

본 발명에 있어서 변수 (X)는 예를 들면 항-종양 면역반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 항-종양 면역반응에서 CD4⁺ T-세포에 의한 수지상 세포 자극과 관련 있는 수지상 세포 아집단의 양; 및 항-종양 면역반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD8⁺ T-세포 아집단의 양;으로 이루어진 군에서 선택된 양이다.

본 발명의 방법에서 변수 (X, Y)는 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; CCR7^-CD4⁺ T-세포 아집단의 양; LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RA^-CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RO⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; HLA-DR⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD80⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD86⁺ 수지상 세포 아집단의 양; PD-L1⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 양; CD137⁺ CD8⁺ T-세포 아집단의 양; 및 CD28⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 양;으로 이루어진 군에서 선택된 값을 (X)로 하여 계산할 수 있다.

예를 들면 본 발명의 방법은 조절 T-세포 아집단의 양 또는 조절 T-세포와 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 양을 (Y)로 하여 변수(X, Y)를 계산할 수 있다.

본 발명의 방법에서 변수(X, Y)는 CCR4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 양;으로 이루어진 군에서 선택된 값을 (Y)로 하여 계산할 수 있다.

본 발명의 방법은 예를 들어 X의 Y에 대한 상대 값과 임계치(무 효과 그룹 임계치)를 비교하여 사용할 수 있다. 이는 암 면역요법과 관련하여 피험자가 무 효과 그룹의 일부가 아니라고 예측하기 위한 지표로서 CD4⁺CD62L^low T-세포의 양 (X)를 측정하는 단계와 CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺ T-세포의 양 (Y)를 측정하는 단계를 포함한다.

조절 T-세포 아집단의 양 또는 조절 T-세포와 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 양 또는 비율은 (Y)로 사용할 수 있다. 특히, 바이오마커로서의 CD62L^lowCD4⁺ T-세포/조절 T-세포의 비율에 대한 연구는 아직까지 보고된 바 없으나 본 발명자들은 이 비율이 암 면역요법에 대한 반응을 예측하는 바이오마커로서 매우 유용하다는 것을 발견하였다.

본 발명의 방법은 예를 들어 X의 Y에 대한 상대 값과 임계치(무 효과 그룹 임계치)를 비교하여 사용할 수 있다. 이는 암 면역요법과 관련하여 피험자가 무 효과 그룹의 일부가 아니라고 예측하기 위한 지표로서 CD80⁺ 수지상 세포의 양 (X)를 측정하는 단계와 CD28⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포의 양 (Y)를 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명자들은 다수의 지표가 독립적으로 반응성과 상관관계를 나타내는 것을 발견하였기 때문에 다수의 지표를 조합하여 반응성의 지표로 사용할 수 있다. 2 이상의 지표가 반응성의 지표로 조합되면 여러 변수를 사용하는 식으로 표시되는 지표를 사용할 수 있다.

반응성 지표의 예는 다수의 지표(X₁, X₂, X₃, ... X_n)가 사용될 때 다음을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다:

F = a₁X₁ ^b1 + a₂X₂ ^b2 + a₃X₃ ^b3 … + a_nX_n ^bn

F = X₁ ^c1 * X₂ ^c2 * X₃ ^c3 … * X_n ^cn

a, b 및 c 각각은 임의의 실수이다.

반응성은 이러한 식(지표)에 의해 계산된 값을 임계치와 비교함으로써 유추된 차이로부터 예측될 수 있다. 본 발명자들에 의해 발견된 신규한 지표에 대한 판별 분석을 이용한 다변량 분석(예를 들면 로지스틱 회귀에 의한 평가)은 피험자의 암 면역요법에 대한 반응성의 지표로서 사용하기 위해 각각의 계수를 결정할 수 있다.

전형적으로 반응성은 변수로서 본 명세서에 개시된 2개의 지표 (X, Y)를 사용하여 식 F(X, Y)에 의해 예측될 수 있다. 특정 실시형태에서 상기 식은 X의 Y에 대한 상대 값이다.

X의 Y에 대한 상대 값으로는 X와 Y의 모든 함수(F(X, Y))를 사용할 수 있다. 특히 X가 반응성에 긍정적인 상관관계를 지니고 Y가 반응성에 부정적인 상관관계를 지니는 경우, X에 대해 단조롭게 증가하고 Y에 대해 단조롭게 감소하는 X 및 Y의 임의의 함수(F(X, Y))가 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 반응성을 나타내는 2 이상의 변수를 지닌 반응성을 나타내는 식은 각 변수의 반응성에 대한 기여도를 계산하여 회귀 분석을 통해 확인할 수 있다.

반응성을 나타내는 식 F(X, Y)의 예로는 다음을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.

F = aX^r + bY^s

F = X^r * Y^s

a, b, r 및 s는 임의의 실수이다.

수식을 단순화하기 위해 정수를 r 및 s로 사용할 수 있다. 일부 실시형태에서 X의 Y에 대한 상대 값의 예로는 X/Y 및 X²/Y와 같은 Xⁿ/Y^m(n 및 m은 임의의 정수와 같은 임의의 실수임)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

X와 Y가 서로 다른 메커니즘에서 요법에 대한 반응성을 각각 나타낼 때 이러한 지표의 조합은 반응성을 보다 정확하게 예측할 수 있다. 본 발명자들의 연구에 의하면, r 및 s가 -5 내지 5인 식을 사용하여 피험자의 암 면역요법에 대한 반응성을 보다 정확하게 예측할 수 있음이 증명되었다.

본 발명의 또 다른 목적은 무 효과 그룹에 속하지 않는 것으로 나타난 피험자 중에서 반응 그룹의 일부인 피험자(완전한 반응(CR) + 부분 반응(PR))를 추가로 예측하는 방법을 제공한다. 이는 암 면역요법에 대한 반응성의 지표로서 피험자의 CD4⁺ T-세포의 조성을 사용한다.

본 발명의 하나의 실시형태는 무 효과 그룹에 속하지 않는 것으로 나타난 피험자 내에서 CD4⁺ T-세포 내의 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포, CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내의 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포, CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내의 LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단, 또는 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내의 PD-1⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율을 피험자의 암 면역요법에 대한 반응의 지표로서 사용하는 방법이다.

CD4⁺ T-세포 내의 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포의 비율, CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내의 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율, CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내의 LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율 또는 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내의 PD-1⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율이 무 효과 그룹 임계치보다 높은 경우 피험자는 반응 그룹의 일부가 아님을 나타낸다.

피험자가 반응 그룹의 일부인지 여부를 확인하려면 비험자가 무 효과 그룹의 일부가 아닌지 결정해야 한다. 피험자가 무 효과 그룹의 일부인지 여부에 대한 이러한 결정은 본 명세서에 개시된 방법에 의해 달성될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 전술한 (X, Y)를 사용하여 무 효과 그룹의 일부가 아닌 것으로 결정된 피험자 집단에서 반응 그룹(PR) 및 안정 그룹(SD)을 식별하는 방법을 제공한다.

반응 그룹(PR) 및 안정 그룹(SD)을 확인하는 방법에서, ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양을 (Z)로 하고 CD4⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 양; CD4⁺Foxp3⁺ T-세포 아집단의 양; CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 양; CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CCR4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 및 CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양;으로 이루어진 군에서 선택된 값을 (W)로 하여 변수 (Z, W)를 계산함으로써 피험자가 반응 그룹(PR) 또는 안정 그룹(SD)의 일부인지 여부를 예측한다.

일반적으로 반응 그룹(PR) 및 안정 그룹(SD)을 확인하는 방법은 (Z)로서 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양, (W)로서 CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 양 및 지표로서 W⁵ * Z의 값을 사용함으로써 반응 그룹(PR) 및 안정 그룹(SD)을 결정할 수 있다.

임계치는 민감도 및 특이도를 고려하여 결정될 수 있다. 민감도 및 특이도는 무 효과 그룹의 검출, 반응 그룹의 검출 또는 안정 그룹의 검출에 대한 민감도 및 특이도가 될 수 있다.

하나의 실시형태에서 민감도 및 특이도의 임계치가 모두 100%가 되도록 본 발명의 바이오마커를 설정할 수 있다. 이러한 이유로 무 효과인 경우가 매우 정확하게 선택될 수 있으므로 기술적으로 현저하게 우수하다. 본 발명의 바이오마커로서 개시된 2개 이상의 지표를 사용하는 경우 각 지표에 대한 임계치를 결정할 수 있으며 필요에 따라 제 1 임계치, 제 2 임계치, 제 3 임계치 및 제 4 임계치로서 사용되고 구분될 수 있다.

무 효과 그룹의 검출, 반응 그룹의 검출 또는 안정 그룹의 검출을 위한 민감도가 약 90%를 초과하도록 임계치가 결정될 수 있다. 또 다른 실시형태에서 무 효과 그룹의 검출, 반응 그룹의 검출 또는 안정 그룹의 검출을 위한 민감도가 약 100%가 되도록 임계치가 결정될 수 있다.

또 다른 실시형태에서 무 효과 그룹의 검출, 반응 그룹의 검출 또는 안정 그룹의 검출을 위한 특이도가 약 90%를 초과하도록 임계치가 결정될 수 있다. 또 다른 실시형태에서 무 효과 그룹의 검출, 반응 그룹의 검출 또는 안정 그룹의 검출을 위한 특이도가 약 100%가 되도록 임계치가 결정될 수 있다.

하나의 실시형태에서 피험자의 T-세포 조성은 개체로부터 수득된 샘플 내의 T-세포 조성이다. 바람직하게는 샘플은 말초 혈액 샘플이다. 본 발명에서 제공되는 바이오마커는 말초 혈액 샘플을 사용하여 측정될 수 있으며 바이오마커는 비-침습성, 저비용 및 시간경과에도 구현 가능하므로 임상적 적용에 있어서 현저한 우월성을 지닌다.

하나의 실시형태에서 암 면역요법은 면역 체크포인트 저해제의 투여를 포함한다. 특히 본 발명의 바이오마커는 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 정확하게 예측할 수 있다.

하나의 실시형태에서 면역 체크포인트 저해제는 PD-1 저해제 또는 PD-L1 저해제를 포함한다. PD-1 저해제의 예로는 항-PD-1 항체 니볼루맙 및 펨브롤리주맙과 같이 PD-1 및 PD-L1 사이의 상호 작용(예를 들면 결합)을 저해하는 항-PD-1 항체를 포함하며 이에 한정되지는 않는다. PD-L1 저해제의 예로는 항-PD-L1 항체 두르발루맙(durvalumab), 아테졸리주맙(atezolizumab) 및 아벨루맙(avelumab)과 같이 PD-1 및 PD-L1 사이의 상호 작용(예를 들면 결합)을 저해하는 항-PD-L1 항체를 포함하며 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 암을 지닌 피험자를 치료하기 위해 피험자의 T-세포의 조성을 사용하여 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하는 방법을 제공한다. 대안적으로 T-세포의 특정 조성 또는 이의 조성으로 피험자에게서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 암 면역요법, 특히 면역 체크포인트 저해 요법은 개별 피험자에 대한 반응의 차이가 큰 것으로 알려져 있다. 본 발명의 바이오마커를 사용하여 피험자를 선택함으로써 암 면역요법을 적용하면 종양 퇴행 등의 치료 효과를 달성할 확률을 현저히 증가시킬 수 있다.

하나의 실시형태에서 본 발명은 다음 방법을 제공한다.

(1) 피험자로부터 유래된 샘플의 CD4⁺ T-세포 내에서 항-종양 면역반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 상대량; 항-종양 면역반응에서 CD4⁺ T-세포에 의한 수지상 세포 자극과 관련 있는 수지상 세포 아집단의 상대량; 항-종양 면역반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD8⁺ T-세포 아집단의 상대량;으로 이루어진 군에서 선택된 상대량을 결정하는 공정;및

(2) 상대량이 임계치(무 효과 그룹 임계치)보다 높으면 암 면역요법에 대한 반응과 관련하여 피험자가 무 효과 그룹의 일부가 아니라고 결정하고, 피험자가 무 효과 그룹의 일부가 아닌 것으로 결정되면 암 면역요법을 피험자에게 적용하는 공정;을 포함하는 암을 지닌 피험자를 치료하는 방법.

본 발명의 또 다른 실시형태는 암을 지닌 피험자를 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

피험자로부터 유래된 샘플의 CD4⁺ T-세포 내에서, 항-종양 면역반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 상대량; 항-종양 면역반응에서 CD4⁺ T-세포에 의한 수지상 세포 자극과 관련 있는 수지상 세포 아집단의 상대량; 및 항-종양 면역반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD8⁺ T-세포 아집단의 상대량;을 측정하여 피험자가 무 효과 그룹의 일부가 아닌 것으로 결정되면 피험자에게 암 면역요법을 적용하는 단계; 및

상대량을 임계치(무 효과 그룹 임계치)보다 높게 결정하는 단계;

를 포함하는 암을 지닌 피험자를 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 방법에 있어서 상대량은

CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율;

CD4⁺ T-세포 내에서 CCR7^-CD4⁺ T-세포 아집단의 비율;

CD4⁺ T-세포 내에서 CD45RA^-CD4⁺ T-세포 아집단의 비율;

CD4⁺ T-세포 내에서 CD45RO⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율;

CD4⁺ T-세포 내에서 CCR4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율;

CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율;

CD4⁺ T-세포 내에서 CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율;

CD4⁺ T-세포 내에서 CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율;

CD4⁺ T-세포 내에서 Foxp3⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율;

수지상 세포 내에서 HLA-DR⁺ 수지상 세포 아집단의 비율;

수지상 세포 내에서 CD80⁺ 수지상 세포 아집단의 비율;

수지상 세포 내에서 CD86⁺ 수지상 세포 아집단의 비율;

수지상 세포 내에서 PD-L1⁺ 수지상 세포 아집단의 비율;

CD8⁺ T-세포 내에서 CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 비율;

CD8⁺ T-세포 내에서 CD137⁺CD8⁺ T-세포 아집단의 비율; 및

CD62L^lowCD8⁺ T-세포 내에서 CD28⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 비율;

로 이루어진 군에서 선택된 것이다.

바람직하게는 상대량은

CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율;

CD4⁺ T-세포 내에서 CCR7^-CD4⁺ T-세포 아집단의 비율;

CD4⁺ T-세포 내에서 CD45RA^-CD4⁺ T-세포 아집단의 비율;

CD4⁺ T-세포 내에서 CD45RO⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율;

수지상 세포 내에서 HLA-DR⁺ 수지상 세포 아집단의 비율;

수지상 세포 내에서 CD80⁺ 수지상 세포 아집단의 비율;

수지상 세포 내에서 CD86⁺ 수지상 세포 아집단의 비율;

수지상 세포 내에서 PD-L1⁺ 수지상 세포 아집단의 비율;

CD8⁺ T-세포 내에서 CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 비율;

CD8⁺ T-세포 내에서 CD137⁺CD8⁺ T-세포 아집단의 비율; 및

CD62L^lowCD8⁺ T-세포 내에서 CD28⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 비율;로 이루어진 군에서 선택된 것이다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 피험자로부터 유래된 샘플의 CD4⁺ T-세포 내에서 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포의 비율을 결정하는 단계; CD4⁺ T-세포 내에서 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포의 비율이 임계치(무 효과 그룹 임계치)보다 낮으면 암 면역요법에 대한 반응과 관련하여 피험자가 무 효과 그룹의 일부가 아니라고 결정하는 단계; 및 피험자가 무 효과 그룹의 일부가 아니라고 결정되면 피험자에게 암 면역요법을 적용하는 단계;를 포함하는 암을 지니는 피험자를 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 암 면역요법에 대한 반응과 관련하여 무 효과 그룹의 일부가 아닌 것으로 결정된 피험자에게 암 면역요법을 적용하는 단계; 피험자로부터 유래된 샘플의 CD4⁺ T-세포 내에서 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포의 비율을 결정하는 단계; 및 CD4⁺ T-세포 내에서 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포의 비율이 임계치(무 효과 그룹 임계치)보다 낮으면 암 면역요법에 대한 반응과 관련하여 피험자가 무 효과 그룹의 일부가 아니라고 결정하는 단계;를 포함하는 암을 지니는 피험자를 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 실시형태는

(1) 항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 상대량; 항-종양 면역 반응에서 CD4⁺ T-세포에 의한 수지상 세포 자극과 관련있는 수상 세포 아집단의 상대량; 항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련있는 CD8⁺ T-세포 아집단의 상대량; 조절 T-세포 또는 조절 T-세포와 관련있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 및 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양;으로 이루어진 군에서 선택된 양 (X, Y)를 결정하는 단계:

(2) 암 면역요법에 대한 반응과 관련하여 피험자가 무 효과 그룹의 일부인지 여부를 결정하기 위해 무 효과 그룹의 임계치와 X의 Y에 대한 상대 값을 비교하는 단계; 및

(3) 피험자가 무 효과 그룹의 일부가 아니라고 결정되면 피험자에게 암 면역요법을 적용하는 단계;를 포함하는 암을 지니는 피험자를 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 실시형태는

(1) 항-종양 면역반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 상대량; 항-종양 면역반응에서 CD4⁺ T-세포에 의한 수지상 세포 자극과 관련 있는 수지상 세포 아집단의 상대량; 항-종양 면역반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD8⁺ T-세포 아집단의 상대량; 조절 T-세포 또는 조절 T-세포와 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 및 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양;으로 이루어진 군에서 선택된 양 (X, Y)를 결정하는 단계: 및

(2) 암 면역요법에 대한 반응과 관련하여 피험자가 무 효과 그룹의 일부인지 여부를 결정하기 위해 무 효과 그룹 임계치와 X의 Y에 대한 상대 값을 비교하는 단계;로 이루어진 암 면역요법에 대한 반응과 관련하여 무 효과 그룹의 일부가 아닌 것으로 결정된 피험자에게 암 면역요법을 적용하는 단계를 포함하는 암을 지닌 피험자를 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

예를 들면 상기 양 (X) 및 (Y)는 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; CCR7^-CD4⁺ T-세포 아집단의 양; LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RA^-CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RO⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; HLA-DR⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD80⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD86⁺ 수지상 세포 아집단의 양; PD-L1⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD137⁺CD8⁺ T-세포 아집단의 양; CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 양; CD28⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 양; Foxp3⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CCR4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 및 CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양;으로 이루어진 군에서 선택된 것이다.

예를 들면 본 발명의 방법은 항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 항-종양 면역 반응에서 CD4⁺ T-세포에 의한 수지상 세포 자극과 관련있는 수지상 세포 아집단의 양; 및 항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD8⁺ T-세포 아집단의 양;으로 이루어진 군에서 선택된 값을 (X)로 사용할 수 있다.

또한 본 발명의 방법은 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; CCR7^-CD4⁺ T-세포 아집단의 양; LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RA^-CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RO⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; HLA-DR⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD80⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD86⁺ 수지상 세포 아집단의 양; PD-L1⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 양; CD137⁺CD8⁺ T-세포 아집단의 양; 및 CD28⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 양;으로 이루어진 군에서 선택된 값을 (X)로 하여 변수 (X, Y)를 계산할 수 있다.

예를 들면 본 발명의 방법은 조절 T-세포 또는 조절 T-세포와 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 양을 (Y)로 하여 변수 (X, Y)를 계산할 수 있다.

또한 본 발명의 방법은 CCR4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 및 CD4⁺Foxp3⁺D25⁺ T-세포 아집단의 양;으로 이루어진 군에서 선택된 값을 (Y)로 하여 변수 (X, Y)를 계산할 수 있다 :

본 발명의 또 다른 실시형태는

항-종양 면역반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 항-종양 면역반응에서 CD4⁺ T-세포에 의한 수지상 세포 자극과 관련 있는 수지상 세포 아집단의 양; 항-종양 면역반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD8⁺ T-세포 아집단의 양; 조절 T-세포 또는 조절 T-세포와 관련 있는 CD4⁺T-세포 아집단의 양; 및 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양;으로 이루어진 군에서 선택된 양 (X, Y)를 결정하는 단계;

암 면역요법에 대한 반응과 관련하여 피험자가 무 효과 그룹의 일부인지 여부를 결정하기 위해 임계치(무 효과 그룹 임계치)와 X의 Y에 대한 상대 값을 비교하는 단계;

피험자가 무 효과 그룹의 일부가 아니라고 결정되고 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포의 비율, ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율, LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율, 또는 PD-1⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율이 임계치(효과그룹 임계치)보다 높은 경우 암 면역요법에 대한 반응과 관련하여 피험자가 효과그룹의 일부라고 결정하는 단계; 및

피험자가 효과그룹의 일부인 것으로 결정된 경우, 피험자에게 암 면역요법을 적용하는 단계;

로 이루어진 암을 지니는 피험자를 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 실시형태는

항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 항-종양 면역 반응에서 CD4⁺ T-세포에 의한 수지상 세포 자극과 관련 있는 수지상 세포 아집단의 양; 항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD8⁺ T-세포 아집단의 양; 조절 T-세포 또는 조절 T-세포와 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 및 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양;으로 이루어진 군에서 선택된 양 (X, Y)를 결정하는 단계;

피험자가 무 효과 그룹의 일부가 아니라고 결정되고 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포의 비율, ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율, LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율, 또는 PD-1⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율이 임계치(효과 그룹 임계치)보다 높은 경우 암 면역요법에 대한 반응과 관련하여 피험자가 효과 그룹의 일부라고 결정하는 단계;를 포함하는

암 면역요법에 대한 반응과 관련하여 무 효과 그룹의 일부가 아닌 것으로 결정된 피험자에게 암 면역요법을 적용하는 암을 지니는 피험자를 치료하는 방법을 제공한다.

예를 들면 본 발명의 방법은 항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 항-종양 면역 반응에서 CD4⁺ T-세포에 의한 수지상 세포 자극과 관련 있는 수지상 세포 아집단의 양; 및 항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD8⁺ T-세포 아집단의 양; 으로 이루어진 군에서 선택된 값을 (X)로 사용할 수 있다.

또한 본 발명의 방법은 CCR4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 및 CD4⁺Foxp3⁺D25⁺ T-세포 아집단의 양;으로 이루어진 군에서 선택된 값을 (Y)로 하여 변수 (X, Y)를 계산할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 (X, Y)를 사용하여 무 효과 그룹의 일부가 아닌 것으로 결정된 피험자 집단에서 반응 그룹(PR)과 안정 그룹(SD)을 식별하는 방법을 제공한다.

반응 그룹(PR)과 안정 그룹(SD)를 식별하는 방법은 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양을 (Z)로 하고

CD4⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 양; CD4⁺Foxp3⁺ T-세포 아집단의 양; CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 양; CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CCR4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 및 CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양;으로 이루어진 군에서 선택된 양을 (W)로 하여

변수 (Z, W)를 계산할 수 있으며 피험자가 반응 그룹(PR) 또는 안정 그룹(SD)의 일부인지 예측한다.

본 발명의 또 다른 측면은 CD4, CD25, CD62L, Foxp3 등으로부터 선택된 하나 이상의 세포 표면 마커를 검출하기 위한 작용제를 포함하는 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 키트를 제공하는 것이며 마커 조합은 다음 군에서 선택된 것이다.

* CD4 및 CD62L의 조합; * CD4, CD45RA, 및 CCR7의 조합; * CD4, CD45RO, 및 CCR7의 조합; * CD4, CD62L, 및 LAG-3의 조합; * CD4, CD62L, 및 ICOS의 조합; * CD4, CD62L, 및 CD25의 조합; * CD4, CD127, 및 CD25의 조합; * CD4, CD45RA, 및 Foxp3의 조합; * CD4, CD45RO, 및 Foxp3의 조합; * CD4, CD25, 및 Foxp3의 조합; * CD11c, CD141, 및 HLA-DR의 조합; * CD11c, CD141, 및 CD80의 조합; * CCD11c, CD123, 및 HLA-DR의 조합; * CD11c, CD123, 및 CD80의 조합; * CD8 및 CD62L의 조합; * CD8 및 CD137의 조합; 및 * CD28, CD62L 및 CD8의 조합이다.

바람직하게는 키트는 CD4 및 CD62L 각각을 검출하기 위한 작용제를 포함한다. 이러한 검출 작용제의 조합은 피험자의 T-세포 조성을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 키트는 피험자 내에서 본 명세서에 개시된 신규한 바이오마커로서 특정 T-세포 아집단의 비율을 측정하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 하나의 실시형태는 환자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 세포 표면 마커 검출용 작용제를 포함하는 키트이다. 본 발명자들은 피험자의 T-세포에 의해 발현된 이들 세포 표면 마커가 피험자의 암 면역요법에 대한 반응성과 관련이 있음을 발견하였다.

이러한 세포 표면 마커를 검출하는 작용제를 포함하는 키트는 상기 측면에서 암 면역요법에 대한 반응성을 예측하는데 유용하다는 것이 이해된다. 바람직하게는 키트는 CD4 및 CD62L을 검출하기 위한 작용제를 포함한다. 더욱 바람직하게는 키트는 CD4, CD25, CD62L 및 Foxp3를 검출하기 위한 작용제를 포함한다. 하나의 실시형태에서 검출 작용제는 항체이다. 바람직하게는 항체는 적절하게 표지된 마커의 검출을 용이하게 한다.

본 발명의 또 다른 측면은 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 피험자 내에서 암을 치료하기 위한 조성물이다.

본 발명의 하나의 실시형태는 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 피험자 내에서 암을 치료하기 위한 조성물로서 상기 피험자는 다음 군에서 선택된 상대량을 지닌다.

항-종양 면역반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 상대량; 항-종양 면역반응에서 CD4⁺ T-세포에 의한 수지상 세포 자극과 관련 있는 수지상 세포 아집단의 상대량; 및 항-종양 면역반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD8⁺ T-세포 아집단의 상대량;으로 이때 상대량은 임계치(무 효과 그룹 임계치)와 동일 또는 그 이상이다.

예를 들면 상대량은 전형적으로 다음 군에서 선택된 것이다.

CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CCR7^-CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내에서 LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내에서 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CCR4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 Foxp3⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; 수지상 세포 내에서 HLA-DR⁺ 수지상 세포 아집단의 비율; 수지상 세포 내에서 CD80⁺ 수지상 세포 아집단의 비율; 수지상 세포 내에서 CD86⁺ 수지상 세포 아집단의 비율; 수지상 세포 내에서 PD-L1⁺ 수지상 세포 아집단의 비율; CD8⁺ T-세포 내에서 CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 비율; CD8⁺ T-세포 내에서 CD137⁺CD8⁺ T-세포 아집단의 비율; 및 CD62L^lowCD8⁺ T-세포 내에서 CD28⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 비율;이다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 피험자 내에서 암을 치료하기 위한 조성물로서 상기 피험자는 임계치(무 효과 그룹 임계치)와 X의 Y에 대한 상대 값의 비교에 의해 선택될 수 있으며 피험자로부터 유래된 샘플 내의 양 (X, Y)는 다음과 같다:

항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 수지상 세포 아집단의 양; 항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD8⁺ T-세포 아집단의 양; 조절 T-세포 또는 조절 T-세포와 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 및 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양;이다.

양 (X, Y)는 전형적으로 다음 군에서 선택된 것이다.

CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; CCR7^-CD4⁺ T-세포 아집단의 양; LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RA^-CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RO⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; Foxp3⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; HLA-DR⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD80⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD86⁺ 수지상 세포 아집단의 양; PD-L1⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 양; CD137⁺CD8⁺ T-세포 아집단의 양; CD28⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 양;이다.

예를 들면 본 발명의 방법은 다음 군에서 선택된 값을 (X)로 하여 사용할 수 있다.

항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 항-종양 면역 반응에서 CD4⁺ T-세포에 의한 수지상 세포 자극과 관련 있는 수지상 세포 아집단의 양; 및 항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD8⁺ T-세포 아집단의 양;이다.

또한 본 발명의 방법은 다음 군에서 선택된 값을 (X)로 하여 변수 (X, Y)를 계산할 수 있다.

CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; CCR7^-CD4⁺ T-세포 아집단의 양; LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RA^-CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RO⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; HLA-DR⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD80⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD86⁺ 수지상 세포 아집단의 양; PD-L1⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 양; CD137⁺CD8⁺ T-세포 아집단의 양; 및 CD28⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 양;이다.

또한 본 발명의 방법은 다음 군에서 선택된 값을 (Y)로 하여 변수 (X, Y)를 계산할 수 있다.

CCR4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 및 CD4⁺Foxp3⁺D25⁺ T-세포 아집단의 양;이다.

예를 들면 본 발명의 방법은 X의 Y에 대한 상대 값과 임계치(무 효과 그룹 임계치)의 비교를 행하는 것으로, 이때 상기 방법은 CD4⁺CD62L^low T-세포의 양 (X)를 측정하는 단계와 CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺ T-세포의 양(Y)을 측정하는 단계를 포함하며 또한 피험자가 암 면역요법과 관련하여 무 효과 그룹의 일부가 아니라는 것을 예측하기 위한 지표로 사용할 수 있다.

조절 T-세포 또는 조절 T-세포와 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 양 또는 비율을 (Y)로서 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 피험자 내에서 암을 치료하기 위한 조성물에 있어서, 상기 피험자는 임계치(무 효과 그룹 임계치)와 다음 군에서 선택된 양 (X, Y)의 상대 값과의 비교에 의해 선택된 피험자임을 특징으로 한다.

항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 항-종양 면역 반응에서 CD4⁺ T-세포에 의한 수지상 세포 자극과 관련 있는 수지상 세포 아집단의 양; 항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD8⁺ T-세포 아집단의 양; 조절 T-세포 또는 조절 T-세포와 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 및 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 서브 집단의 양;이다.

또한 상기 양은 피험자로부터 유래된 샘플 내의 값이며 임계치(유효 그룹 임계치)와 동일 또는 그 이상인 CD4⁺ T-세포 내에서 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 비율 또는 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내에서 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율을 지닌다.

전형적으로 양 (X) 및 (Y)는 다음 군에서 선택된 것이다.

CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; CCR7^-CD4⁺ T-세포 아집단의 양; LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; CCR4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RA^-CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RO⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; Foxp3⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; HLA-DR⁺수지상 세포 아집단의 양; CD80⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD86⁺ 수지상 세포 아집단의 양; PD-L1⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 양; CD137⁺CD8⁺ T-세포 아집단의 양; 및 CD28⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 양;이다.

예를 들면 본 발명 조성물의 투여 표적은 다음 군에서 선택된 값을 (X)로 하여 변수 (X, Y)에 의해 특징지어지는 피험자일 수 있다.

또한 본 발명의 방법은 다음 군에서 선택된 값을 (X)로 하여 변수 (X, Y)를 계산하고 변수 (X, Y)에 의해 특징지어지는 피험자를 투여 표적으로 하는 방법이다.

CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; CCR7^-CD4⁺ T-세포 아집단의 양; LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RA^-CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RO⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; HLA-DR⁺수지상 세포 아집단의 양; CD80⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD86⁺ 수지상 세포 아집단의 양; PD-L1⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 양; CD137⁺CD8⁺ T-세포 아집단의 양; 및 CD28⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 양;이다.

예를 들면 본 발명의 조성의 경우 조절 T-세포 또는 조절 T-세포와 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 양을 (Y)로 하여 변수 (X, Y)를 계산할 수 있다.

또한 본 발명의 방법은 다음 군에서 선택된 값을 (Y)로 하여 변수 (X, Y)를 계산하고 변수 (X, Y)에 의해 특징지어지는 피험자를 투여 표적으로 하는 방법이다.

CCR4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 및 CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 양;이다.

예를 들면 암 면역요법과 관련하여 무 효과 그룹의 일부가 아닌 것으로 예측되는 피험자는 CD4⁺CD62L^low T-세포의 양 (X) 및 CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺ T-세포의 양 (Y)로부터 X의 Y에 대한 상대 값을 임계치(무 효과 그룹 임계치)와 비교함으로써 본 발명의 조성물을 투여하는 표적이 될 수 있다. 조절 T-세포 또는 조절 T-세포와 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 양 또는 비율을 (Y)로 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물은 임의의 다른 작용제와 조합하여 사용할 수 있다.

하나의 실시형태에서 조성물은 PD-1 저해제를 포함한다. PD-1 저해제의 예로는 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙과 같은 PD-L1과 PD-1 사이의 결합을 저해하는 항-PD-1 항체를 포함하는 PD-1 저해제를 포함한다. 또 다른 실시형태에서 조성물은 PD-L1 저해제를 포함한다. PD-L1 저해제의 예로는 두르발루맙, 아테졸리주맙 및 아벨루맙과 같은 PD-L1과 PD-1 사이의 결합을 저해하는 항-PD-L1 항체를 포함한다.

이러한 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 조성물은 본 발명의 바이오마커를 사용하여 선택된 피험자에게 투여될 때 특히 높은 가능성으로 치료 효과를 얻는 것으로 이해된다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 피험자의 암 면역요법에 대한 반응성을 개선하거나 유지하는 방법을 제공한다.

다음 군에서 선택된 세포가 암 면역요법에 대한 피험자의 반응에 중요한 것으로 선별되었다 :

CD62L^lowCD4⁺ T-세포; CCR7^-CD4⁺ T-세포; LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포; ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포; CCR4⁺CD25 +CD4⁺ T-세포; CD45RA^-CD4⁺ T-세포; CD45RO⁺CD4⁺ T-세포; CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포; CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포; CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포; Foxp3⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포; HLA-DR⁺ 수지상 세포; CD80⁺ 수지상 세포; CD86⁺ 수지상 세포; PD-L1⁺ 수지상 세포; CD62L^lowCD8⁺ T-세포; CD137⁺CD8⁺ T-세포; 및 CD28⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포;이다.

이러한 T-세포를 통해 피험자의 암 면역요법에 대한 반응성을 향상시키거나 유지할 수 있는 것으로 이해된다. 본 발명의 하나의 실시형태는 CD62L^lowCD4⁺ T-세포를 포함하는 조성물이다. CD62L^lowCD4⁺ T-세포 또는 이를 포함하는 조성물은 암을 치료 또는 예방하는데 유용하며 암 면역요법과 병용할 수 있다. 또 다른 실시형태에서 조성물은 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 등에 추가하여 CD62L^lowCD8⁺ T-세포를 포함할 수 있다.

본 발명의 하나의 실시형태는 암 면역요법이 효과적이지 않은 것으로 예상되는 피험자에게 다음 군에서 선택된 세포 또는 그의 조성물을 사용하여 효과적인 암 면역요법을 제공하는 방법이다.

CD62L^lowCD4⁺ T-세포; CCR7^-CD4⁺ T-세포; LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포; ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포; CCR4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포; CD45RA^-CD4⁺ T-세포; CD45RO⁺CD4⁺ T-세포; CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포; CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포; CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포; Foxp3⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포; HLA-DR⁺ 수지상 세포; CD80⁺ 수지상 세포; CD86⁺ 수지상 세포; PD-L1⁺ 수지상 세포; CD62L^lowCD8⁺ T-세포; CD137⁺CD8⁺ T-세포; 및 CD28⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포;이다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 예를 들면 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 또는 그의 조성물을 사용함으로써 암 면역요법의 효과를 유지시키는 방법을 제공한다.

말초 혈액의 CD62L^lowCD4⁺ T-세포가 암 면역요법(특히 항-PD-1 항체 요법 및/또는 항-PD-L1 항체 요법)에서 항-종양 면역 반응의 촉진제의 역할을 한다는 것을 규명한 본 발명자들의 연구 결과는 암 치료에 대해 새롭고 혁명적인 접근법을 제공하는 새로운 발명이다.

또한 본 발명자들은 다음 군에서 선택된 세포가 상기 개시된 CD62L^lowCD4⁺ T-세포의 경우와 같이 항-종양 면역 반응을 촉진함을 발명하였다.

CCR7^-CD4⁺ T-세포; LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포; ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포; CCR4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포; CD45RA^-CD4⁺ T-세포; CD45RO⁺CD4⁺ T-세포; CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포; CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포; CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포; Foxp3⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포; HLA-DR⁺ 수지상 세포; CD80⁺ 수지상 세포; CD86⁺ 수지상 세포; PD-L1⁺ 수지상 세포; CD62L^lowCD8⁺ T-세포; CD137⁺CD8⁺ T-세포; 및 CD28⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포;이다.

본 발명의 또 다른 실시형태에서 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 이외에 CD62L^lowCD8⁺ T-세포가 사용될 수 있다.

본 발명의 특정 실시형태는 CD62L^lowCD4⁺ T-세포를 정제하는 방법 또는 CD62L^lowCD4⁺ T-세포를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에 있어서 CD62L^lowCD4⁺ T-세포는 인간 유래 샘플로부터 분리된다. 특정 실시형태는 피험자에게 주입하기 위해 피험자로부터 분리된 CD62L^lowCD4⁺ T-세포를 제조하는 방법 및 상기 세포를 피험자에게 주입하는 방법을 제공한다.

본 발명의 하나의 실시형태는 조성물이 투여되는 피험자로부터의 CD62L^lowCD4⁺ T-세포를 포함하는 조성물이다. 본 발명의 또 다른 실시형태는 CD62L^lowCD8⁺ T-세포를 정제하는 방법 또는 CD62L^lowCD8⁺ T-세포를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

동일한 원리를 사용하여, 본 발명은 다음 군에서 선택된 세포를 유사한 방법으로 제조하는 것이다.

CD62L^lowCD4⁺ T-세포를 포함하는 조성물을 제조하는 방법은 인간 유래의 T-세포 집단으로부터 CD62L^lowCD4⁺ T-세포를 정제하는 단계를 포함할 수 있다. 정제는 T-세포 집단으로부터CD62L 고 발현 세포를 제거하는 단계를 포함할 수 있다(네거티브 셀렉션). 항체 및/또는 마그네틱 비드 및/또는 친화성 칼럼 등을 사용한 네거티브 셀렉션에 의한 CD62L^lowCD4⁺ T-세포의 정제가 바람직하다. 이는 항체 또는 마그네틱 비드와 같은 불순물이 사용되는 세포 상에 남아 있지 않기 때문이다. 본 발명은 또한 CD62L^lowCD8⁺ T-세포를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 하나의 실시형태는 CD62L^lowCD4⁺ T-세포를 정제하기 위해 CD62L에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 키트이다. CD62L에 특이적으로 결합하는 물질의 예로는 CD62L에 특이적인 항체가 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

(본 발명의 바이오마커)

본 발명의 바이오마커는 CD4⁺ T-세포, 수지상 세포 및/또는 CD8⁺ T-세포를 포함하는 전체 항-종양 면역 반응을 평가하기 위한 것으로 이해된다. 이러한 이유로 본 발명의 방법은 광범위한 암 및 종양에 대해 효과적이라고 여겨질 수 있다. 본 발명은 전체 항-종양 면역 반응을 평가하므로 본 발명은 PD-1/PD-L1에 대한 면역 체크포인트 저해제인 동시에 다른 면역 체크포인트에 작용하는 항암 요법제로도 효과적일 것으로 기대된다.

또한 본 발명은 CD62L^low 대신에 또는 추가하여 CCR7^-와 같은 이펙터 T-세포의 지표인 마커를 사용할 수 있다. 대안적으로 CD45RA^- 및/또는 CD45RO⁺를 사용할 수 있다. 예를 들면 CD4⁺ T-세포 내에서 CD45RA^-CD4⁺ T-세포 아집단의 비율 및/또는 CD4⁺ T-세포 내에서 CD45RO⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율을 사용할 수 있다. LAG3 및 ICOS의 발현이 CD62L^low와 유사한 방식으로 첨가 또는 치환하여 사용할 수 있음을 규명하였다. 유사하게 CCR4 발현이 CD62L^low와 유사한 방식으로 첨가 또는 치환하여 사용할 수 있음도 확인되었다.

실시예에서 사용된 CD4⁺ T-세포(CD62L^lowCD4⁺ T-세포)를 사용하는 대신에 또는 이에 추가하여 골수 수지상 세포(mDC) 및/또는 형질세포 수지상 세포(pDC) 집단 내에서 HLA-DR 및/또는 CD80 및/또는 CD86을 발현하는 세포의 수/비율 또한 지표로서 사용될 수 있다. 또한 수지상 세포상의 PD-L1은 본 발명의 마커로서 이용 가능한 것으로 이해된다.

또한 실시예에서 사용된 CD4⁺ T-세포(CD62L^lowCD4⁺ T-세포)를 사용하는 대신에 또는 이에 추가하여 CD8⁺ T-세포에서 4-1BB를 발현하는 세포의 수/비율 또한 지표로 사용될 수 있다.

(본 발명의 메커니즘)

이론에 구속되기를 바라지는 않으나 본 발명자들에 의해 제안된 국소 종양에서의 항-종양 면역 반응 현상을 도 21에 개략적으로 나타내었다. 도 21은 말초 혈액에서 관찰될 수 있는 세포, 즉 CD62L^lowCD4⁺ T-세포, 골수 수지상 세포(mDC), 형질세포 수지상 세포(pDC) 및 CD62L^lowCD8⁺ T-세포 및 이들 세포에서 발현되는 마커 분자, 즉 LAG-3, ICOS, HLA-DR, CD80 및 CD137을 포함한다. PD-L1은 수지상 세포에서 발현되고 PD-1은 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 및 CD62L^lowCD8⁺ T-세포에서 발현된다.

T-세포의 조성은 항-종양 면역 반응에서 중요하다고 여겨진다. 예를 들어 CD62L^lowCD4⁺ T-세포에 의한 수지상 세포의 자극이 중요하다. 불충분한 CD62L^lowCD4⁺ T-세포가 있으면(예를 들면 미성숙 T-세포에 대한 이펙터 T-세포 및 미성숙 T-세포의 균형), 면역 체크 포인트 저해제의 투여는 수지상 세포를 충분히 자극할 수 없다. 결과적으로 항-종양 면역 반응은 충분하지 않다.

이러한 이유로 CD4⁺ T-세포에서 CD62L^lowCD4⁺ T-세포의 비율은 면역 체크포인트 저해제로 인한 항-종양 효과를 예측하는 지표이다. CD62L과 마찬가지로, CD4⁺ T-세포에서의 CD45RA^-CRCR^- T-세포의 비율도 이펙터 T-세포와 미성숙 T-세포의 균형을 나타내므로 이러한 비율을 본 발명의 지표로 사용할 수 있다 .

수지상 세포는 HLA-DR을 통해 CD4⁺ T-세포에 의해 자극된다. 따라서 수지상 세포에서 HLA-DR⁺ 세포의 비율이 감소함에 따라 면역 체크포인트 저해제의 투여는 수지상 세포를 충분히 자극할 수 없다. 결과적으로 항-종양 면역 반응은 충분하지 않다. 이러한 이유로 수지상 세포에서 HLA-DR⁺ 세포의 비율은 면역 체크포인트 저해제로 인한 항-종양 효과를 예측하는 지표가 될 수 있다.

CD4⁺ T-세포에 의해 자극된 수지상 세포는 CD8⁺ T-세포를 자극하고 자극된 CD8⁺ T-세포는 궁극적으로 항-종양 활성을 나타낸다. CD8⁺ T-세포는 수지상 세포에서 발현되는 CD80/CD86 및 CD8⁺ T-세포 상의 CD137을 통해 수지상 세포에 의해 자극된다. 따라서 수지상 세포 내의 CD80⁺ 세포의 비율과 CD8⁺ T-세포 내의 CD137⁺ 세포의 비율은 면역 체크포인트 저해제로 인한 항-종양 효과를 예측하는 지표가 될 수 있다.

상기 개시된 메커니즘으로부터 밝혀진 바이오마커 이외에, CD4⁺ T-세포에서의 LAG-3, ICOS 및 CCR4가 실시예에 기재된 바와 같이 면역 체크포인트 저해제에 의한 항-종양 효과를 예측하기 위한 지표로 또한 밝혀졌다.

예를 들면 본 발명은 다음 항목을 제공하는 것이다.

(항목 1)

피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 상대량을 사용하는 방법에 있어서,

상기 피험자로부터 유래된 샘플 내에서 CD4⁺ T-세포 아집단의 상대량을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 상대량이 무 효과 그룹 임계치보다 더 높은 경우 피험자가 암 면역요법에 무 효과 그룹의 일부가 아닌 것을 나타냄을 특징으로 하는 방법.

(항목 2)

항목 1의 방법에 있어서, CD4⁺ T-세포 아집단의 상대량은

CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CCR7^-CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내에서 LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내에서 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CCR4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; 및 CD4⁺T-세포 내에서 Foxp3⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율;

로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.

(항목 3)

피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 피험자의 CD4⁺ T-세포 내의 CD62L^low T-세포의 비율을 사용하는 방법에 있어서,

상기 피험자로부터 유래된 샘플의 CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^low T-세포의 비율을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 비율이 무 효과 그룹 임계치보다 더 높은 경우 피험자가 암 면역요법에 무 효과 그룹의 일부가 아닌 것을 나타냄을 특징으로 하는 방법.

(항목 4)

피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 수지상 세포 아집단의 상대량을 사용하는 방법에 있어서,

상기 피험자로부터 유래된 샘플 내에서 수지상 세포 내의 수지상 세포 아집단의 비율을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 비율이 무 효과 그룹 임계치보다 더 높은 경우 피험자가 암 면역요법에 무 효과 그룹의 일부가 아닌 것을 나타냄을 특징으로 하는 방법.

(항목 5)

항목 4의 방법에 있어서, 상기 수지상 세포 아집단은 HLA-DR⁺ 수지상 세포 아집단; CD80⁺ 수지상 세포 아집단; CD86⁺ 수지상 세포 아집단; 및 PD-L1⁺ 수지상 세포 아집단;으로 이루어진 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법.

(항목 6)

피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD8⁺ T-세포 아집단의 상대량을 사용하는 방법에 있어서,

상기 피험자로부터 유래된 샘플의 CD8⁺ T-세포 내에서 CD8⁺ T-세포 아집단의 비율을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 비율이 무 효과 그룹 임계치보다 더 높은 경우 피험자가 암 면역요법에 무 효과 그룹의 일부가 아닌 것을 나타냄을 특징으로 하는 방법.

(항목 7)

항목 6의 방법에 있어서, 상기 CD8⁺ T-세포 아집단은 CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단, CD137⁺CD8⁺ T-세포 아집단 또는 CD28⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단임을 특징으로 하는 방법.

(항목 8)

항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 양;

항-종양 면역 반응에서 CD4⁺ T-세포에 의한 수지상 세포 자극과 관련 있는 수지상 세포 아집단의 양;

항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD8⁺ T-세포 아집단의 양;

조절 T-세포 또는 조절 T-세포와 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 및

ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양;

으로 이루어진 군에서 선택된 양 (X, Y)에 대한 상대 값을 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 사용하는 방법에 있어서,

상기 방법은

X를 측정하는 단계; 및 Y를 측정하는 단계;를 포함하며,

이때 상기 X의 Y에 대한 상대 값과 무 효과 그룹 임계치와의 비교를 통해 피험자가 암 면역요법에 대해 무 효과 그룹의 일부가 아니라는 것을 예측하기 위한 지표로 사용함을 특징으로 하는 방법.

(항목 9)

항목 8의 방법에 있어서, 상기 양 (X) 및 (Y)는 각각

CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; CCR7^-CD4⁺ T-세포 아집단의 양; LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; Foxp3⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; HLA-DR⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD80⁺수지상 세포 아집단의 양; CD86⁺ 수지상 세포 아집단의 양; PD-L1⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 양; CD137⁺CD8⁺ T-세포 아집단의 양; 및 CD28⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 양;으로 이루어진 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법.

(항목 10)

항목 8 또는 항목 9의 방법에 있어서, 상대 값은 X/Y임을 특징으로 하는 방법.

(항목 11)

항목 8 또는 항목 9의 방법에 있어서, 상대 값은 X²/Y임을 특징으로 하는 방법.

(항목 12)

항목 1 내지 항목 11 중 어느 한 항목의 방법에 있어서,

상기 방법은 무 효과 그룹은 아닌 것으로 나타난 피험자로부터의

CD4⁺ T-세포 내에서 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 비율; CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내에서 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내에서 LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율; 또는 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내에서 PD-1⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율;을 피험자의 암 면역요법에 대한 반응의 지표로서 추가로 사용하는 방법이고,

이때 무 효과 그룹 임계치보다 더 높은

CD4⁺ T-세포 내에서 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 비율; CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내에서 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내에서 LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율; 또는 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내에서 PD-1⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율;

은 피험자가 반응 그룹의 일부임을 나타냄을 특징으로 하는 방법.

(항목 13)

항목 1 내지 항목 12 중 어느 한 항목의 방법에 있어서, 상기 무 효과 그룹 임계치는 무 효과 그룹의 검출을 위한 민감도 및 특이도를 고려하여 결정되는 것임을 특징으로 하는 방법.

(항목 14)

항목 1 내지 항목 13 중 어느 한 항목의 방법에 있어서, 상기 무 효과 그룹 임계치는 무 효과 그룹 검출을 위한 민감도가 약 90%를 초과하도록 결정된 것임을 특징으로 하는 방법.

(항목 15)

항목 1 내지 항목 13 중 어느 한 항목의 방법에 있어서, 상기 무 효과 그룹 임계치는 무 효과 그룹 검출을 위한 특이도가 약 90%를 초과하도록 결정된 것임을 특징으로 하는 방법.

(항목 16)

항목 1 내지 항목 15 중 어느 한 항목의 방법에 있어서, 상기 샘플은 말초 혈액 샘플임을 특징으로 하는 방법.

(항목 17)

항목 1 내지 항목 15 중 어느 한 항목의 방법에 있어서, 암 면역요법은 면역 체크 포인트 저해제의 투여를 포함함을 특징으로 하는 방법.

(항목 18)

항목 17의 방법에 있어서, 면역 체크포인트 저해제는 PD-1 저해제 및 PD-L1 저해제로 이루어진 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법.

(항목 19)

항목 18의 방법에 있어서, PD-1 저해제는 PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용을 저해하는 항 PD-1 항체임을 특징으로 하는 방법.

(항목 20)

항목 18의 방법에 있어서, PD-L1 저해제는 PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용을 저해하는 항-PD-L1 항체임을 특징으로 하는 방법.

(항목 21)

항목 18의 방법에 있어서, PD-1 저해제 또는 PD-L1 저해제는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 두르발루맙, 아테졸리주맙 또는 아벨루맙을 포함함을 특징으로 하는 방법.

(항목 22)

(1) 항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 상대량; 항-종양 면역 반응에서 CD4⁺ T-세포에 의한 수지상 세포 자극과 관련 있는 수지상 세포 아집단의 상대량; 및 항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD8⁺ T-세포 아집단의 상대량;으로 이루어진 군에서 선택된 상대량을 결정하는 단계;

(2) 상대량이 무 효과 그룹 임계치보다 높으면 암 면역요법에 대한 반응과 관련하여 피험자가 무 효과 그룹의 일부가 아니라고 판정하는 단계; 및

(3) 피험자가 무 효과 그룹의 일부가 아니라고 판정되면 피험자에게 암 면역요법을 적용하는 단계;

를 포함하는 암을 지니는 피험자를 치료하는 방법.

(항목 23)

항목 22의 방법에 있어서, 상기 상대량은

CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CCR7^-CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내에서 LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내에서 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CCR4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CD45RA^-Foxp3 +CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 Foxp3⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; 수지상 세포 내에서 HLA-DR⁺ 수지상 세포 아집단의 비율; 수지상 세포 내에서 CD80⁺ 수지상 세포 아집단의 비율; 수지상 세포 내에서 CD86⁺ 수지상 세포 아집단의 비율; 수지상 세포 내에서 PD-L1⁺ 수지상 세포 아집단의 비율; CD8⁺ T-세포 내에서 CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 비율; CD8⁺ T-세포 내에서 CD137⁺CD8⁺ T-세포 아집단의 비율; 및 CD62L^lowCD8⁺ T-세포 내에서 CD28⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 비율;로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.

(항목 24)

항 종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 항 종양 면역 반응에서 CD4⁺ T-세포에 의한 수지상 세포 자극과 관련 있는 수지상 세포 아집단의 양; 항 종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD8⁺ T-세포 아집단의 양; 조절 T-세포 또는 조절 T-세포와 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 및 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양;

으로 이루어진 군에서 선택된 양 (X, Y)를 결정하는 단계;

암 면역요법에 대한 반응과 관련하여 피험자가 무 효과 그룹의 일부인지 여부를 판정하기 위해 무 효과 그룹 임계치와 X의 Y에 대한 상대 값을 비교하는 단계; 및

피험자가 무 효과 그룹의 일부가 아니라고 판정되면 피험자에게 암 면역요법을 적용하는 단계;

를 포함하는 암을 지니는 피험자를 치료하는 방법.

(항목 25)

항목 24의 방법에 있어서, 상기 양 (X) 및 (Y)는 각각

CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; CCR7^-CD4⁺ T-세포 아집단의 양; LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; Foxp3⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; HLA-DR⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD80⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD86⁺ 수지상 세포 아집단의 양; PD-L1⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 양; CD137⁺CD8⁺ T-세포 아집단의 양; 및 CD28⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 양;으로 이루어진 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법.

(항목 26)

항 종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 항 종양 면역 반응에서 CD4⁺ T-세포에 의한 수지상 세포 자극과 관련 있는 수지상 세포 아집단의 양; 항 종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD8⁺ T-세포 아집단의 양; 조절 T-세포 또는 조절 T-세포와 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 및 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양;으로 이루어진 군에서 선택된 양 (X, Y)를 결정하는 단계;

반응과 관련하여 피험자가 무 효과 그룹의 일부인지를 결정하기 위해 X의 Y에 대한 상대 값과 무 효과 그룹 임계치를 비교하는 단계;

피험자가 무 효과 그룹의 일부가 아니라고 결정되고 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 비율, ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율, LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율 또는 PD-1⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율이 반응 그룹 임계치보다 높은 것으로 결정되면 암 면역요법에 대한 반응과 관련하여 피험자가 반응 그룹의 일부인 것으로 판정하는 단계; 및

피험자가 반응 그룹의 일부인 것으로 판정된 경우 암 면역요법을 피험자에게 적용하는 단계;

를 포함하는 암을 지니는 피험자를 치료하는 방법.

(항목 27)

CD4 및 CD62L의 조합; CD4 및 CCR7의 조합; CD4, CD62L, 및 LAG-3의 조합; CD4, CD62L, 및 ICOS의 조합; CD4, CD62L, 및 CD25의 조합; CD4, CD127, 및 CD25의 조합; CD4, CD45RA, 및 Foxp3의 조합; CD4, CD25, 및 Foxp3의 조합; CD11c, CD141, 및 HLA-DR의 조합; CD11c, CD141, 및 CD80의 조합; CD11c, CD123, 및 HLA-DR의 조합; CD11c, CD123, 및 CD80의 조합; CD8 및 CD62L의 조합; CD8 및 CD137의 조합; 및 CD28, CD62L 및 CD8의 조합;

으로 이루어진 군에서 선택된 마커의 조합을 검출하기 위한 작용제를 포함하는 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 키트.

(항목 28)

항목 27의 키트에 있어서, CD4 및 CD62L를 검출하기 위한 작용제를 포함함을 특징으로 하는 키트.

(항목 29)

항목 27의 키트에 있어서, CD25, CD62L 및 Foxp3를 검출하기 위한 작용제를 포함함을 특징으로 하는 키트.

(항목 30)

항목 27 내지 항목 29 중 어느 한 항목의 키트에 있어서, 검출 작용제는 항체임을 특징으로 하는 키트.

(항목 31)

항 종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 상대량; 항 종양 면역 반응에서 CD4⁺ T-세포에 의한 수지상 세포 자극과 관련 있는 수지상 세포 아집단의 상대량; 및 항 종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD8⁺ T-세포 아집단의 상대량;

으로 이루어진 군에서 선택된 상대량을 지니는 피험자의 암을 치료하기 위한 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 조성물에 있어서,

상대량은 무 효과 그룹 임계치와 동일 또는 그 이상임을 특징으로 하는 조성물.

(항목 32)

항목 31의 조성물에 있어서, 상기 상대량은

CD4⁺ T-세포 내의 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내의 CCR7^-CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내의 LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내의 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내의 CCR4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내의 CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내의 CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내의 CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내의 Foxp3⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; 수지상 세포 내의 HLA-DR⁺ 수지상 세포 아집단의 비율; 수지상 세포 내의 CD80⁺ 수지상 세포 아집단의 비율; 수지상 세포 내의 CD86⁺ 수지상 세포 아집단의 비율; 수지상 세포 내의 PD-L1⁺ 수지상 세포 아집단의 비율; CD8⁺ T-세포 내의 CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 비율; CD8⁺ T-세포 내의 CD137⁺CD8⁺ T-세포 아집단의 비율; 및 CD62L^lowCD8⁺ T-세포 내의 CD28⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 비율;

으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.

(항목 33)

피험자의 암을 치료하기 위한 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 조성물에 있어서, 상기 피험자는

항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 수지상 세포 아집단의 양; 항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD8⁺ T-세포 아집단의 양; 조절 T-세포 또는 조절 T-세포와 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 및 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양;

으로 이루어진 군에서 선택된 양 (X, Y)의 상대 값과 무 효과 그룹 임계치를 비교하여 선별된 피험자임을 특징으로 하는 조성물.

(항목 34)

으로 이루어진 군에서 선택된 양 (X, Y)의 상대 값과 무 효과 그룹 임계치를 비교하여 선별된 피험자임을 특징으로 하고,

피험자로부터 유래된 샘플 내의

CD4 ⁺T-세포 내에서 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 비율; CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내에서 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내에서 LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율; 또는 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내에서 PD-1⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율;

은 반응 그룹 임계치보다 더 높은 것임을 특징으로 하는 조성물.

(항목 35)

항목 31 내지 항목 34 중 어느 한 항목의 조성물에 있어서, 면역 체크포인트 저해제는 PD-1 저해제 및 PD-L1 저해제로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.

(항목 36)

항목 35의 조성물에 있어서, PD-1 저해제는 PD-L1과 PD-1 사이의 상호작용을 저해하는 항-PD-1 항체임을 특징으로 하는 조성물.

(항목 37)

항목 35의 조성물에 있어서, PD-L1 저해제는 PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용을 저해하는 항-PD-L1 항체임을 특징으로 하는 조성물.

(항목 38)

항목 35의 조성물에 있어서, PD-1 저해제 또는 PD-L1 저해제는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 두르발루맙, 아테졸리주맙 또는 아벨루맙임을 특징으로 하는 조성물.

(항목 39)

CD62L^lowCD4⁺ T-세포; CCR7^-CD4⁺ T-세포; LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포; ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포; CCR4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포; CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포; CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포; CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포; Foxp3⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포; HLA-DR⁺ 수지상 세포; CD80⁺ 수지상 세포; CD86⁺ 수지상 세포; PD-L1⁺ 수지상 세포; CD62L^lowCD8⁺ T-세포; CD137⁺CD8⁺ T-세포; 및 CD28⁺CD62L^lowCD8 + T-세포;

로 이루어진 군에서 선택된 세포를 포함하는 암을 치료 또는 예방하기 위한 조성물.

(항목 40)

암 면역요법과 병용하여 사용하기 위한 항목 39의 조성물.

(항목 41)

항목 39의 조성물에 있어서, 상기 조성물은 면역 체크포인트 저해제와 병용 투여됨을 특징으로 하는 조성물.

(항목 42)

항목 41의 조성물에 있어서, 면역 체크포인트 저해제는 PD-1 저해제 및 PD-L1 저해제로 이루어진 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 조성물.

(항목 43)

항목 42의 조성물에 있어서, PD-1 저해제는 PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용을 저해하는 항-PD-1 항체임을 특징으로 하는 조성물.

(항목 44)

항목 42의 조성물에 있어서, PD-L1 저해제는 PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용을 저해하는 항-PD-L1 항체임을 특징으로 하는 조성물.

(항목 45)

항목 42의 조성물에 있어서, PD-1 저해제 또는 PD-L1 저해제는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 두르발루맙, 아테졸리주맙 또는 아벨루맙임을 특징으로 하는 조성물.

(항목 46)

항목 39 내지 항목 45 중 어느 한 항목의 조성물에 있어서, CD62L^lowCD8⁺ T-세포를 더욱 포함함을 특징으로 하는 조성물.

(항목 47)

암 면역요법이 효과적이지 않을 것으로 예상되는 피험자에게 암 면역요법을 효과적으로 수행하기 위한 항목 39 내지 항목 46 중 어느 한 항목에 따른 조성물.

(항목 48)

암 면역요법의 효과를 유지하기 위한 항목 39 내지 항목 47 중 어느 한 항목에 따른 조성물.

(항목 49)

항목 39 내지 항목 48 중 어느 한 항목의 조성물에 있어서, CD62L^lowCD4⁺ T-세포는 조성물이 투여되는 피험자의 것임을 특징으로 하는 조성물.

(항목 50)

CD62L^lowCD4⁺ T-세포를 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물의 제조 방법에 있어서, 인간 유래 T-세포 집단으로부터 CD62L^lowCD4⁺ T-세포를 정제하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 제조 방법.

(항목 51)

항목 50의 방법에 있어서, 상기 정제 단계는 T-세포 집단으로부터 CD62L 고발현 세포를 제거하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.

(항목 52)

CD62L^lowCD4⁺ T-세포를 정제하기 위해 CD62L에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 키트.

(항목 A1)

피험자의 CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^lowT-세포의 비율을 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 사용하는 방법에 있어서,

상기 피험자로부터 유래된 샘플의 CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^low T-세포의 비율을 결정하고, 무 효과 그룹 임계치보다 더 높은 비율은 피험자가 암 면역요법에 대해 무 효과 그룹의 일부가 아님을 나타냄을 특징으로 하는 방법.

(항목 A2)

피험자의 CD4⁺ T-세포에서 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포의 비율을 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 사용하는 방법에 있어서,

상기 피험자로부터 유래된 샘플의 CD4⁺ T-세포 내에서 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포의 비율을 결정하고, 무 효과 그룹 임계치보다 더 낮은 비율은 피험자가 암 면역요법에 대해 무 효과 그룹의 일부가 아님을 나타냄을 특징으로 하는 방법.

(항목 A3)

X를 측정하는 단계; 및 Y를 측정하는 단계;

를 포함하는 피험자의 CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺ T-세포의 양 (Y)에 대한 CD4⁺CD62L^low T-세포 양 (X)의 상대 값을 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 사용하는 방법에 있어서,

이때 상기 X의 Y에 대한 상대 값과 무 효과 그룹 임계치와의 비교는 피험자가 암 면역요법에 대해 무 효과 그룹의 일부가 아니라는 것을 예측하기 위한 지표로서 사용됨을 특징으로 하는 방법.

(항목 A4)

항목 A3의 방법에 있어서, 상대 값은 X/Y임을 특징으로 하는 방법.

(항목 A5)

항목 A3의 방법에 있어서, 상대 값은 X²/Y임을 특징으로 하는 방법.

(항목 A6)

항목 A1 내지 항목 A5 중 어느 한 항목의 방법에 있어서, 무 효과 그룹의 일부가 아닌 것으로 나타난 피험자의 CD4⁺ T-세포 내에서 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포의 비율을 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 추가로 사용하고,

무 효과 그룹 임계치보다 높은 CD4⁺ T-세포 내의 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포 비율은 피험자가 반응 그룹의 일부임을 나타냄을 특징으로 하는 방법.

(항목 A7)

항목 A1 내지 항목 A6 중 어느 한 항목의 방법에 있어서, 상기 무 효과 그룹 임계치는 무 효과 그룹의 검출을 위한 민감도 및 특이도를 고려하여 결정된 것임을 특징으로 하는 방법.

(항목 A8)

항목 A1 내지 항목 A7 중 어느 한 항목의 방법에 있어서, 상기 무 효과 그룹 임계치는 무 효과 그룹 검출을 위한 민감도가 약 90%를 초과하도록 결정된 것임을 특징으로 하는 방법.

(항목 A9)

항목 A1 내지 항목 A8 중 어느 한 항목의 방법에 있어서, 상기 무 효과 그룹 임계치는 무 효과 그룹 검출을 위한 특이도가 약 90%를 초과하도록 결정된 것임을 특징으로 하는 방법.

(항목 A10)

항목 A1 내지 항목 A8 중 어느 한 항목의 방법에 있어서, 상기 샘플은 말초 혈액 샘플임을 특징으로 하는 방법.

(항목 A11)

항목 A1 내지 항목 A10 중 어느 한 항목의 방법에 있어서, 암 면역요법은 면역 체크포인트 저해제의 투여를 포함함을 특징으로 하는 방법.

(항목 A12)

항목 A11의 방법에 있어서, 면역 체크포인트 저해제는 PD-1 저해제 및 PD-L1 저해제로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.

(항목 A13)

항목 A12의 방법에 있어서, PD-1 저해제는 PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용을 저해하는 항-PD-1 항체임을 특징으로 하는 방법.

(항목 A14)

항목 A12의 방법에 있어서, PD-L1 저해제는 PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용을 저해하는 항-PD-L1 항체임을 특징으로 하는 방법.

(항목 A15)

항목 A12의 방법에 있어서, PD-1 저해제 또는 PD-L1 저해제는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 두르발루맙, 아테졸리주맙 또는 아벨루맙을 포함함을 특징으로 하는 방법.

(항목 A16)

피험자로부터 유래된 샘플의 CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^low T-세포의 비율을 결정하는 단계;

CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^low T-세포의 비율이 무 효과 그룹 임계치보다 더 높으면 암 면역요법에 대한 반응과 관련하여 피험자가 무 효과 그룹의 일부가 아님을 결정하는 단계; 및

피험자가 무 효과 그룹의 일부가 아니라고 결정되면 피험자에게 암 면역요법을 적용하는 단계;

를 포함하는 암을 지닌 피험자를 치료하는 방법.

(항목 A17)

피험자로부터 유래된 샘플의 CD4⁺ T-세포 내에서 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포의 비율을 결정하는 단계;

CD4⁺ T-세포 내에서 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포의 비율이 무 효과 그룹 임계치보다 더 낮으면 암 면역요법에 대한 반응과 관련하여 피험자가 무 효과 그룹의 일부가 아님을 결정하는 단계; 및

를 포함하는 암을 지닌 피험자를 치료하는 방법.

(항목 A18)

CD4⁺CD62L^low T-세포의 양 (X)를 결정하는 단계;

CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺ T-세포의 양 (Y)를 결정하는 단계;

암 면역요법에 대한 반응과 관련하여 피험자가 무 효과 그룹의 일부인지 여부를 결정하기 위해 X의 Y에 대한 상대 값과 무 효과 그룹 임계치를 비교하는 단계; 및

를 포함하는 암을 지닌 피험자를 치료하는 방법.

(항목 A19)

CD4⁺CD62L^lowT-세포의 양 (X)를 결정하는 단계;

CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺ T-세포의 양 (Y)를 결정하는 단계;

피험자가 무 효과 그룹의 일부가 아닌 것으로 결정되고 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포의 비율이 반응 그룹 임계치보다 더 높을 경우 암 면역요법에 대한 반응과 관련하여 피험자가 반응 그룹의 일부임을 결정하는 단계; 및

피험자가 반응 그룹의 일부인 것으로 결정되면 피험자에게 암 면역요법을 적용하는 단계;

를 포함하는 암을 지닌 피험자를 치료하는 방법.

(항목 A20)

CD4, CD25, CD62L 및 Foxp3에서 선택된 하나 이상의 세포 표면 마커를 검출하기 위한 작용제를 포함하는 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 키트.

항목 A20의 키트에 있어서, CD4 및 CD62L의 검출을 위한 작용제를 포함하는 키트.

(항목 A22)

항목 A20 또는 A21의 키트에 있어서, CD4, CD25, CD62L, 및 Foxp3의 검출을 위한 작용제를 포함하는 키트.

(항목 A23)

항목 A20 내지 A22 중 어느 한 항목의 키트에 있어서, 검출 작용제는 항체임을 특징으로 하는 키트.

(항목 A24)

피험자의 암을 치료하기 위한 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 조성물에 있어서, 피험자는 피험자로부터 유래된 샘플의 CD4⁺ 세포 내에서 CD62L^low T-세포의 비율을 지니고, 이때 상기 비율은 무 효과 그룹 임계치와 동일 또는 그 이상임을 특징으로 하는 조성물.

(항목 A25)

피험자의 암을 치료하기 위한 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 조성물에 있어서, 피험자는 피험자로부터 유래된 샘플의 CD4⁺ 세포 내에서 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포의 비율을 지니고, 이때 상기 비율은 무 효과 그룹 임계치와 동일 또는 그 이하임을 특징으로 하는 조성물.

(항목 A26)

피험자의 암을 치료하기 위한 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 조성물에 있어서, 피험자는 피험자로부터 유래된 샘플 내에서 CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺ T-세포의 양 (Y)에 대한 피험자로부터 유래된 샘플 내에서 CD4⁺CD62L^low T-세포의 양 (X)의 상대 값과 무 효과 그룹의 임계치를 비교하여 선별된 피험자임을 특징으로 하는 조성물.

(항목 A27)

피험자의 암을 치료하기 위한 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 조성물에 있어서, 피험자는 피험자로부터 유래된 샘플 내에서 CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺ T-세포의 양 (Y)에 대한 피험자로부터 유래된 샘플 내에서 CD4⁺CD62L^low T-세포의 양 (X)의 상대 값과 무 효과 그룹의 임계치를 비교하여 선별된 피험자이고, 피험자로부터 유래된 샘플의 CD4⁺ T-세포 내에서 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 비율은 반응 그룹 임계치와 동일 또는 그 이상임을 특징으로 하는 조성물.

(항목 A28)

항목 A24 내지 A27 중 어느 한 항목의 조성물에 있어서, 면역 체크포인트 저해제는 PD-1 저해제 및 PD-L1 저해제로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.

(항목 A29)

항목 A28의 조성물에 있어서, PD-1 저해제는 PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용을 저해하는 항-PD-1 항체임을 특징으로 하는 조성물.

(항목 A30)

항목 A28의 조성물에 있어서, PD-L1 저해제는 PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용을 저해하는 항-PD-L1 항체임을 특징으로 하는 조성물.

(항목 A31)

항목 A28의 조성물에 있어서, PD-1 저해제 또는 PD-L1 저해제는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 두르발루맙, 아테졸리주맙 또는 아벨루맙을 포함함을 특징으로 하는 조성물.

(항목 A32)

CD62L^lowCD4⁺ T-세포를 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물.

(항목 A33)

암 면역요법과 병용하여 사용하기 위한 항목 A32의 조성물.

(항목 A34)

항목 A32의 조성물에 있어서, 상기 조성물은 면역 체크포인트 저해제와 병용 투여됨을 특징으로 하는 조성물.

(항목 A35)

항목 A34의 조성물에 있어서, 면역 체크포인트 저해제는 PD-1 저해제 및 PD-L1 저해제로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.

(항목 A36)

항목 A35의 조성물에 있어서, PD-1 저해제는 PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용을 저해하는 항-PD-1 항체임을 특징으로 하는 조성물.

(항목 A37)

항목 A35의 조성물에 있어서, PD-L1 저해제는 PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용을 저해하는 항-PD-L1 항체임을 특징으로 하는 조성물.

항목 A35의 조성물에 있어서, PD-1 저해제 또는 PD-L1 저해제는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 두르발루맙, 아테졸리주맙 또는 아벨루맙을 포함함을 특징으로 하는 조성물.

(항목 A39)

항목 A32 내지 A38 중 어느 한 항목의 조성물에 있어서, CD62L^lowCD8⁺ T-세포를 더욱 포함함을 특징으로 하는 조성물.

(항목 A40)

암 면역요법이 효과적이지 않을 것으로 예상되는 피험자에게 암 면역요법을 효과적으로 수행하기 위한 항목 A32 내지 A39 중 어느 한 항목에 따른 조성물.

(항목 A41)

암 면역요법의 효과를 유지하기 위한 항목 A32 내지 A39 중 어느 한 항목에 따른 조성물.

(항목 A42)

항목 A32 내지 A41 중 어느 한 항목의 조성물에 있어서, CD62L^lowCD4⁺ T-세포는 조성물이 투여되는 피험자의 것임을 특징으로 하는 조성물.

(항목 A43)

CD62L^lowCD4⁺ T-세포를 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물의 제조방법에 있어서, 인간 유래 T-세포 집단으로부터 CD62L^lowCD4⁺ T-세포를 정제하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 제조 방법.

(항목 A44)

항목 A43의 방법에 있어서, 상기 정제 단계는 T-세포 집단으로부터 CD62L 고 발현 세포를 제거하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.

(항목 A45)

도 1은 피험자로부터 수득된 말초 혈액 샘플 내의 T-세포 유세포 분석에 의한 분획화 결과를 나타내는 도면이다.
좌상 도면은 FSC와 SSC를 사용하여 2차원 분석을 통해 림프구 영역을 식별한 것이다. 우상 도면은 CD8 및 CD4 발현에 관한 분획을 나타내는 도면이다. 좌하 도면은 CD25⁺FoxP3⁺의 분획을 나타내는 도면이다. 우하 도면은 CD62L 발현 수준에 관한 히스토그램이다. CD62L 저 발현(CD62L^low) 세포는 이중 피크 분포에서 분획화 된다.
도 2는 실시예 1에서 치료 효과를 측정하는 과정을 나타내는 개략도이다.
도 3은 무 효과 그룹과 다른 그룹 사이의 세포 수 및 T-세포의 조성을 비교 한 도면이다.
패널 A(WBC)는 말초 혈액 백혈구(백혈구) 수를 비교한 것이다. 패널 B(Lym)는 림프구 수를 비교한 것이다. 패널 C는 CD4+ 세포의 백분율을 비교한 것이다. 패널 D는 CD8+ 세포의 백분율을 비교한 것이다. 이러한 변수들과 관련하여 무 효과 집단과 다른 집단 간에는 유의미한 차이가 발견되지 않았다.
도 4는 무 효과 그룹과 다른 그룹 간의 T-세포 조성을 비교한 도면이다.
패널 A는 CD8⁺ T-세포 내에서 CD62L 저 세포의 백분율을 비교한 것이다. 이는 PD 그룹에서 유의미하게 낮다. P=0.0138. 패널 B는 CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L 저 세포의 백분율을 비교한 것이다. CD8⁺ T-세포 내에서 CD62L^low 세포의 비율보다 PD 그룹에서 유의미한 감소가 관찰되었다. P=5.32×10^-7.
패널 C는 CD4⁺ T-세포 내에서 CD25⁺FoxP3⁺ 세포의 비율을 비교한 것이다. 이는 PD 그룹에서 유의미하게 높다. P=0.0132. 패널 D는 CD8⁺ T-세포 내에서 CD62L^low 세포의 백분율 및 CD⁺ T-세포 내에서 CD62L^low 세포 백분율에 대한 분산도이다. 일주일 간의 상관관계가 이 값들 사이에서 발견되었다.
패널 E는 CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^low 세포의 백분율 및 CD4⁺ T-세포에서 CD25⁺FoxP3⁺ 세포의 백분율에 대한 분산도이다. 이 값들 사이에는 상관관계가 없다. 그들이 각각 독립적으로 암 면역요법에 대한 반응성에 기여한다는 것으로 이해된다.
도 5는 PR⁺ SD 그룹을 PD 그룹과 구별하기 위한 CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^low 세포 백분율의 지표로서 성능을 나타낸 것이다. 우측 패널은 임계치 변경에 따른 민감도와 특이도를 플롯한 것이다. 플롯된 점 아래 영역의 면적은 0.974이다. 따라서 이것은 매우 좋은 마커로 이해된다.
도 6은 PR⁺ SD 그룹을 PD 그룹과 구별하기 위한 임계치를 변화시켰을 때 CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^low 세포 백분율의 민감도 및 특이도를 나타낸 것이다.
도 7은 PR⁺ SD 그룹을 PD 그룹과 구별하기 위한 CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^low 세포 백분율 (X)와 CD4⁺ T-세포 내에서 CD25⁺FoxP3⁺ 세포 백분율(Y)의 상대 값(X/Y)의 지표로서 성능을 나타낸 것이다. 우측 패널은 임계치 변경에 따른 민감도와 특이도를 플롯한 것이다. 플롯된 점 아래 영역의 면적은 0.961이다. 따라서 이것은 매우 좋은 마커로 이해된다.
도 8은 CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^low 세포 백분율 (X)와 CD4⁺ T-세포 내에서 CD25⁺FoxP3⁺ 세포 백분율(Y)의 X/Y를 상대 값으로 사용하는 경우, PR⁺ SD 그룹을 PD 그룹과 구별하기 위한 임계치를 변경시킴에 따라 민감도 및 특이도를 나타낸 것이다.
도 9는 PR⁺ SD 그룹을 PD 그룹과 구별하기 위한 CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^low 세포 백분율 (X)의 CD4⁺ T-세포 내에서 CD25⁺FoxP3⁺ 세포 백분율 (Y)에 대한 상대 값(X²/Y)의 지표로서 성능을 나타낸 것이다. 우측 패널은 임계치 변경에 따른 민감도와 특이도의 플롯을 나타낸다. 플롯 된 점 아래 영역의 면적은 1.0이며 이는 지표가 100%의 민감도 및 특이도로 판별하는 것을 가능하게 하는 매우 유리한 마커임을 나타낸다.
도 10은 CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^low 세포 백분율 (X)와 CD4⁺ T-세포 내에서 CD25⁺FoxP3⁺ 세포의 백분율 (Y)의 X²/Y를 상대 값으로 사용하는 경우, PR⁺ SD 그룹을 PD 그룹과 구별하기 위한 임계치를 변경시킴에 따라 민감도 및 특이도를 나타낸 것이다.
도 11은 PR 그룹을 SD 그룹과 구별하기 위한 CD4⁺ T-세포 내에서 CD25⁺FoxP3⁺ 세포 백분율의 지표로서 성능을 나타낸 것이다. 우측 패널은 임계치 변경에 따른 민감도와 특이도를 플롯한 것이다. 플롯된 점 아래 영역의 면적은 0.773이다.
도 12는 PR 그룹을 SD 그룹과 구별하기 위한 임계치를 변경시켰을 때 CD4⁺ T-세포 내에서 CD25⁺FoxP3⁺ 세포 백분율의 민감도 및 특이도를 나타낸 것이다.
도 13은 피험자의 암 면역요법에 대한 반응성을 개선 또는 유지하는 방법의 하나의 예를 나타내는 개략도이다.
도 14는 T-세포 주입된 마우스의 치료 효과와 (CD4⁺ T-세포 내의 CD62L^low 세포)/(CD4⁺ T-세포 내의 CD62L^highCD25⁺ 세포)의 비율을 나타낸 것이다. 수평축은 마우스에서 종양 접종 후 경과일수를 나타낸다. 라벨에 표시된 세포의 구성이 주입되었다. 수직축은 종양의 크기(mm)이다.
좌측 패널은 세포 주입된 마우스의 비장에서 (CD4⁺ T-세포 내의 CD62L^low 세포)/(CD4⁺ T-세포 내의 CD62L^highCD25⁺ 세포)의 비율을 화살표로 나타낸 시간에 측정한 것이다. 각각의 비율은 하부 열에 표시된 값을 지닌다. 우측 패널은 마우스의 비장에서 (CD4⁺ T-세포 내의 CD62L^low 세포)/(CD4⁺ T-세포 내의 CD62L^highCD25⁺ 세포)의 비율을 시간 경과에 따라 측정한 것이다. 값은 하부 열에 표시된 대로 변화되었다.
도 15는 상이한 인종 및 마우스의 CD62L 염색 패턴을 나타내는 도면이다.
패널 A는 백인 종양 백신을 유출하는 림프절을 이용한 FACS를 나타낸다. 림프구 영역을 게이트화시키고 CD62L을 관찰하였다. 패널 C는 일본인 피험자의 말초 혈액 유래 단핵구 세포로부터의 CD62L과 유사한 관찰이다. 패널 D는 마우스의 림프구에서 CD62L 염색 패턴을 나타낸다. 유사한 염색 패턴이 인종/생물종 전체에서 나타나는 것으로 이해된다. 이것은 이중 피크 분포를 지니며 형광 강도는 10²를 경계로 한다. 패널 B는 자기 비드를 지닌 패널 A의 피험자의 세포 그룹에서 CD62L^low 세포만을 분리한 후의 순도를 나타내는 FACS이다.
도 16은 골수 수지상 세포(mDC) 내의 CD80 세포의 비율(우상) 및 HLA-DR⁺ 세포의 비율(좌상)과 PD, SD 및 PR의 관계를 나타낸 그래프와 형질세포 수지상 세포(pDC) 내의 CD80 세포의 비율(우하) 및 HLA-DR⁺ 세포의 비율(좌하)과 PD, SD 및 PR의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 17은 골수 수지상 세포(mDC) 내의 CD80 세포의 비율(우상) 및 HLA-DR⁺ 세포의 비율(좌상)과 CD62L^lowCD4⁺ T-세포의 관계를 나타내는 그래프와 골수 수지상 세포(mDC) 내의 CD80 세포의 비율(우하) 및 HLA-DR⁺ 세포의 비율(좌하)과 X²/Y(즉 (CD62L^lowCD4⁺ T-세포의 양)²/(CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺ T-세포))의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 18은 골수 수지상 세포(mDC)에서의 CD80 세포의 비율(우상) 및 HLA-DR⁺ 세포의 비율(좌상)과 CD62L^lowCD8CD62L^low CD8⁺ T-세포에 대한 CD137⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포의 비율을 나타낸 것이다.
도 19는 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내에서 ICOS⁺ 세포의 비율(우측) 및 LAG3⁺ 세포의 비율(좌측)과 PD 및 PD+SD 사이의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 20은 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내에서 CXCR3⁺ 세포의 비율 (좌상), CCR4⁺ 세포의 비율(우상), CCR6⁺ 세포의 비율(좌하) 및 CXCR5⁺ 세포의 비율(우하)과 PD 및 PD+SD 사이의 관계를 나타내는 그래프이다. CCR4만이 마커로서 충분한 상관관계를 나타내었다(p = 0.0250).
도 21은 CD4⁺ T-세포 내의 CD25⁺Foxp3⁺CD4⁺ T-세포(좌상) 및 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내의 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포(우상)와 PR 및 SD 사이의 관계를 나타내는 그래프이다. 하부 패널은 CD4⁺ T-세포 내의 CD25⁺Foxp3⁺CD4⁺ T-세포의 비율 (W)과 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내의 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포의 비율 (Z)의 곱 W*Z를 사용하여 PR 그룹과 SD 그룹을 구별하기 위한 W*Z의 임계값을 변경하였을 때의 민감도 및 특이도를 나타낸 것이다.
도 22는 본 발명과 관련된 메커니즘을 나타내는 개략도이다.
도 23은 실시예에서 사용된 항체를 나타내는 표이다.
도 24는 반응 그룹의 결정을 위해 제시된 바이오마커를 단독으로 사용하는 경우의 로지스틱 회귀를 나타내는 도면이다.
도 25는 CD4⁺ T-세포 내에서 CD25⁺Foxp3⁺CD4⁺ T-세포의 비율 (W)와 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내에서 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포의 비율 (Z)의 조합으로 반응 그룹을 결정하기 위해 적합한 식을 도출하기 위한 로지스틱 회귀를 나타내는 도면이다.
도 26은 CD4⁺ T-세포 내에서 CD25⁺Foxp3⁺CD4⁺ T-세포의 비율 (W)와 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내에서 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포의 비율 (Z)와의 조합 식을 사용했을 때의 로지스틱 회귀에 의해 발견된 ROC 분석 결과를 나타내는 도면이다. 상기 반응식을 사용하여 반응 그룹을 개별 바이오마커와 비교하여 더욱 높은 정밀도로 결정될 수 있음이 입증되었다.
도 27은 CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^low세포의 비율 (X) 및 CD4⁺ T-세포 내에서 CD25⁺FoxP3⁺의 비율 (Y)의 조합 내에서 무 효과 그룹을 결정하기 위해 적합한 식을 도출하기 위한 로지스틱 회귀를 나타내는 도면이다.
도 28은 CD62L^low 및 CD62L^high의 임계치를 설정하는 방법의 하나의 예를 나타내는 도면이다.
도 29는 CD62L 저 발현(CD62L^low) 세포가 명확하게 분리되어 있는 CD62L 발현 수준에 관한 히스토그램이다.
도 30은 발견 및 검증 코호트에서의 치료 결과의 예측을 나타내는 도면이다.
(a) 발견 환자 코호트 내에서 예측 식의 값을 나타낸 것이다. 예측 식인 X²/Y는 CD4⁺ 세포의 전체 집단에서 CD62L^low 세포의 백분율 (X)와 CD25⁺FOXP3⁺ 세포의 백분율 (Y)를 기준으로 하였다.
(b) 발견 코호트(n=40)에서 무-반응자를 예측한 예측 식의 수신자 조작 특성 곡선을 나타낸 것이다. 예측식의 임계치(192)에서 민감도와 특이도 파라미터는 85.7%와 100% 이었다(P <0.0001).
(c) 예측 식의 임계치(192)를 기초로 무-반응자 또는 반응자라고 진단된 발견 코호트 환자의 무 진행 생존(PFS) 곡선을 나타낸 것이다.
(d) 발견 코호트의 전체 생존(OS) 곡선을 나타낸 것이다. (e) 환자의 검증 코호트 예측 식의 값을 나타낸 것이다. 이들 환자에서 말초 혈액 단핵 세포를 CT 검사 전에 검사하였다.
(f) 검증 코호트 환자의 PFS 곡선을 나타낸 것이다.
(g) 검증 코호트 환자의 OS 곡선을 나타낸 것이다. 패널 a 및 e에서 데이터는 평균의 평균±표준오차로 표시되며 기호는 개별 환자의 값을 나타낸다. 차이의 통계적 유의성은 Student 양측 t-검정(a, e) 또는 로그-순위 검정(b-d, f, g)에 의해 평가되었다.
도 31은 CD62L^lowCD8⁺ T-세포의 전체 집단에서의 CD28⁺ 세포의 백분율과 예측 식(X²/Y, 이때 X는 CD4⁺ T-세포 집단에서의 CD62L^low T-세포의 비율(%)이고 Y는 CD4⁺ T-세포 집단에서의 CD25⁺FOXP3⁺ T-세포의 비율(%)) 값 사이의 상관관계를 나타내는 도면이다(N = 12).
도 32는 상이한 치료 결과를 지닌 비소세포 폐암 환자 내에서 T-세포 아집단의 비율과 예측 식 값의 차이를 나타낸다. 니볼루맙 치료 후 첫 번째 종양 반응 평가 기간 동안 양호한 반응자(GR), 중간 반응자(IR) 및 비-반응자(NR)인 3개의 환자 부분 그룹(N= 81)의 말초혈액 샘플로부터 FACS(형광활성화세포분취) 결과를 나타낸 것이다.
d 내지 f는 CD62L^lowCD4⁺ 세포 및 CD62L^highCD4⁺ 세포의 전체 집단에서 PD-1⁺, LAG-3⁺ 및 ICOS⁺ 세포의 백분율을 각각 나타낸 것이다. 데이터는 평균의 평균±표준오차로 나타낸다. 심볼은 개별 환자로부터의 수치를 나타낸다. 차이의 통계적 유의성은 일원분산분석(ANOVA)과 후속사후분석(Benjamini, Krieger 및 Yekutieli의 2단계 승압 방법)에 의해 평가되었다.
도 33은 니볼루맙 치료에 대한 양호한 반응을 나타내는 유전자 발현을 나타내는 도면이다. 도 33a는 양호한 반응자(GR), 중간 반응자(IR) 및 비반응자(NR)로부터의 CD62L^highCD4⁺ 및 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 사이의 유전자 발현 데이터를 비교하여 수득된 특징이다.
도 33b에서, 상기 특징 중에서 항-종양 면역과 관련 있는 것으로 공지된 39개의 유전자 중에서 29개의 유전자 발현을 니볼루맙-처리 반응으로 나타낸 것이다. IR 및 NR에 비해 GR에서 상대적으로 높은 유전자 발현을 나타내며, NR에 비해 GR 및 IR에서 상대적으로 높은 유전자 발현을 나타내는 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내의 유전자 발현 정도를 나타내었다.
도 34a는 양호한, 중간 및 비 반응 환자에서 CD62L^lowCD4⁺ T-세포와 CD62L^highCD4⁺ T-세포 사이의 차별적인 발현을 나타내는 면역-관련 유전자를 나타낸 것이다. 상기 기재된 유전자는 세포 아집단의 구분을 위해 사용될 수 있을 것이다.
도 34b는 CD62L^lowCD4⁺ T-세포에서 니볼루맙에 대한 반응과 관련하여 차별적인 발현을 나타내는 53개의 유전자를 나타낸다. 상기 기재된 유전자는 CD62L^lowCD4⁺ T-세포에서의 발현을 조사함으로써 환자 그룹을 구별하는 마커로서 사용될 수 있다. GR: 양호한 반응자, IR: 중간 반응자 및 NR: 비반응자.
도 35는 (1) 대조군, (2) 항체군, (3) 항체+세포 군의 생존율 변화를 나타낸 도면이다.

본 발명은 필요에 따라 첨부된 도면을 참조하면서 예시적인 실시예를 사용하여 개시한다. 명세서 전체에 걸쳐 단수 표현은 달리 명시하지 않는 한 복수 형태로 그 개념을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한 본 명세서에 사용된 용어는 특별히 언급하지 않는 한 당업계에서 일반적으로 사용되는 의미로 이해되어야 한다.

따라서 달리 정의되지 않는 한 본 명세서에서 사용되는 모든 용어 및 과학적 기술 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야 당업자의 일반적인 이해와 동일한 의미를 갖는다. 모순이 있는 경우 본 명세서(정의 포함)가 우선한다.

(정의)

본 명세서에서 사용된 "바이오마커"는 정상적인 생물학적 프로세스, 병리학적 프로세스 또는 치료적 개입에 대한 약리학적 반응의 지표로서 객관적으로 측정되고 평가될 수 있는 특성을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 "암"은 고도로 비정형이고, 정상 세포보다 빠르게 팽창하며 주변 조직에 파괴적으로 침투하거나 전이될 수 있는 악성 종양 또는 이의 존재를 지칭한다. 본 발명에서 암은 고형암 및 조혈 종양을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 "암 면역요법"은 유기체의 면역 기전과 같은 생물학적 방어 기작을 이용하여 암을 치료하는 방법을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 "항-종양 면역 반응"은 살아있는 유기체에서 종양에 대한 임의의 면역 반응을 나타낸다.

본 명세서에서 사용된 "항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극"은 살아있는 유기체에서 종양에 대한 면역 반응시 발생하는 수지상 세포에 자극을 가하는 임의의 현상을 말한다. 그러한 자극은 항-종양 면역 반응을 유도하기 위한 직접적 또는 간접적인 요인일 수 있다. 하기에 국한되지는 않지만 전형적으로 항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극은 CD4⁺ T-세포(예를 들면 이펙터 T-세포)를 통해 적용되며 수지상 세포가 CD8⁺ T-세포를 자극하고 자극된 D8⁺ T-세포는 항-종양 효과를 발휘하였다.

본 명세서에서 사용된 "상관성"은 통계적으로 유의미한 상관관계를 지니는 두 가지 사안을 의미한다. 예를 들면 "A와 관련 있는 B의 상대량"은 A가 발생할 때 통계적으로 유의미한 영향(예를 들면 증가 또는 감소)을 받는 B의 상대량을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 "세포 아집단(subpopulation)"은 전체 세포 집단의 일부를 구성하는 세포 집단을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 세포와 관련된 용어 "상대량(relative amount)"은 "비율"과 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 일반적으로 용어 "상대량"과 "비율"은 특정 세포 집단(예를 들면 CD4⁺ 세포)을 구성하는 세포의 수에 대하여 주어진 세포 아집단(예를 들면 CD62L^lowCD4⁺ T-세포)을 구성하는 세포의 수를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 "민감도"는 피험자 집단 중에서 주어진 특성을 지니는 피험자를 선택하였을 때 피험자 집단 내에서 주어진 특성을 지니는 피험자의 총 수에 대해 선택된 표적 내에서 주어진 특성을 지니는 피험자 수의 비율을 의미한다. 즉 (선택된 표적 내에서 주어진 특성을 지니는 피험자의 수)/(피험자 집단 내에서 주어진 특성을 지니는 피험자의 총 수)이다.

본 명세서에서 사용된 "특이도"는 피험자 집단 중에서 주어진 특성을 지니는 피험자를 선택하였을 때 선택된 표적의 총 수에 대해 선택된 표적 내에서 주어진 특성을 지니는 피험자 수의 비율을 의미한다. 즉 (선택된 표적 내에서 주어진 특성을 지니는 피험자 수)/(선택된 표적의 총 수)이다.

본 명세서에서 사용된 "무 효과 그룹(ineffective group)"은 치료 시작 후 약 9주 까지의 초기 단계에서 암 치료를 받을 때의 치료 효과를 RECIST ver.1.1에 따라 결정할 때 진행성(PD, 진행성 질환)으로 결정된 피험자 그룹을 의미한다. 무 효과 그룹은 PD 그룹, 진행성 그룹 또는 NR(비반응자)라고도 칭하며 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다.

본 명세서에서 사용된 "부분 반응 그룹(partial response group)"은 암 치료를 받을 때의 치료 효과를 RECIST ver.1.1에 따라 결정할 때 부분 반응(PR, 부분 반응)으로 결정된 피험자 그룹을 의미한다. 부분 반응 그룹은 본PR 그룹으로도 칭하며 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다.

본 명세서에서 사용된 "안정 그룹(stable group)"은 치료 시작 후 약 9주 까지의 초기 단계에서 암 치료를 받을 때의 치료 효과를 RECIST ver.1.1에 따라 결정할 때 안정적(SD, 안정적 질환)으로 결정된 피험자 그룹을 의미한다. 또한 "안정 그룹"은 SD 그룹 또는 중간 그룹으로 불리며 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다. 또한 질병 통제 후 약 1년 후에 이 그룹을 IR(중간 반응자)이라고 부른다. 이 그룹의 대부분은 치료 시작 후 약 9주 후에 SD로 결정되기 때문에 "안정 그룹"은 IR(중간 반응자) 그룹과 같은 의미로 사용된다.

본 명세서에서 사용된 "완전 반응 그룹(complete response group)"은 암 치료를 받을 때의 치료 효과를 RECIST ver.1.1에 따라 결정할 때 완전 반응(CR, 완전 반응)으로 결정된 피험자 그룹을 의미한다. "완전 반응 그룹"은 CR 그룹으로도 칭하며 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다.

본 발명은 부분 반응 그룹(PR)과 완전 반응 그룹(CR)을 포함하는 피험자 집단과 부분 반응 그룹(PR)을 포함하지 않는 완전 반응 그룹(CR)을 포함하는 피험자 집단은 부분 반응 그룹(PR)과 동일한 방법으로 검출한다.

본 명세서에서 사용된 "반응 그룹(response group)"은 "부분 반응 그룹"과 "완전 반응 그룹"을 집합적으로 지칭할 때 사용된다. 이것은 "매우 효과적인 그룹"이라고 칭한다. 또한 치료 시작 후 1년 이상 장기간 질병 상태가 지속되는 그룹을 GR(앙호한 반응자)라고 칭한다. 그러나 이 그룹의 대부분은 치료 시작 9주 후에 "부분 반응 그룹" 또는 "완전 반응 그룹"으로 식별되기 때문에 "반응 그룹"도 GR(양호한 반응자) 그룹과 상호 교환적으로 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "상대 값"은 다른 값을 비교의 기준으로 사용하여 특정 값을 계산함으로써 수득된 값을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 "검출 작용제"는 관심있는 물질(예를 들면 세포 표면 마커 등)을 검출할 수 있는 모든 작용제를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 특정 세포 아집단의“양"은 특정 세포의 절대 수와 세포 집단 비율의 상대량을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 "임계치"는 특정 변수 값에 대해 결정되는 값을 말하며, 여기서 값은 변화하는 값이 임계치보다 크거나 작을 때 특정 의미를 부여한다. 임계치는 본 명세서에서 컷-오프 값이라고도 한다.

본 명세서에서 사용된 "무 효과 그룹 임계치"는 주어진 피험자 집단의 무 효과 그룹 및 안정 그룹 + 반응 그룹을 식별하는 데 사용되는 임계치를 나타낸다. 무 효과 그룹 임계치는 주어진 피험자 집단에서 무효과 그룹을 선택할 때 사전 결정된 민감도 및 특이도를 만족하도록 선택된다.

본 명세서에서 사용된 "반응 그룹 임계치"는 무효과 그룹 임계치를 사용하여 무효과 그룹이 제거되는 피험자들의 주어진 집단 또는 피험자들의 주어진 집단에서 안정 그룹 및 반응 그룹을 판별하는데 사용되는 임계치를 의미한다. 반응 임계치는 무효과 그룹 임계치를 사용하여 무효과 그룹이 제거되는 피험자들의 주어진 집단 또는 피험자들의 주어진 집단에서 반응 그룹을 선택할 때 사전 결정된 민감도 및 특이도를 만족하도록 선택된다.

본 명세서에서 수치를 한정하기 위해 사용되는 용어 "약"은 설명된 값이 최대±10% 범위의 값을 포함함을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 "유동세포계측법"은 액체 및 개별 물리적/화학적/생물학적 속성 내에 현탁된 세포, 개체 또는 기타 생물학적 입자의 수를 측정하는 기술을 의미한다.

(암 면역요법)

암 면역요법은 생물체의 생물학적 방어 메커니즘을 이용하여 암을 치료하는 방법이다. 암 면역요법은 암에 대한 면역 기능을 강화시키는 암 면역요법과 암의 면역 회피 기전을 저해하는 암 면역요법으로 크게 나눌 수 있다. 암 면역요법은 신체의 면역 기능을 활성화시키기 위한 능동적인 면역요법과 신체 내외부에서 활성화되거나 확장된 면역 기능을 지닌 면역 세포를 되돌리기 위한 수동적인 면역요법을 추가로 포함한다.

본 발명의 바이오마커는 CD4⁺ T-세포 면역의 전반적인 균형을 평가하여 전반적인 종양 면역 그 자체를 평가함으로써 모든 암 면역요법의 치료 효과가 광범위하게 예측될 수 있도록 한다.

암 면역요법의 예로는 비-특이적 면역 강화제, 사이토카인 요법, 암 백신 요법, 수지상 세포 요법, 양자 면역요법, 비-특이 림프구 요법, 암 항원 특이 T-세포 요법, 항체 요법, 면역 체크포인트 저해 요법 등을 들 수 있다. 본 명세서의 실시예는 본 발명의 바이오마커가 특히 면역 체크포인트 저해 요법의 치료 효과를 정확하게 예측함을 입증한다.

PD-1 저해제는 면역 체크포인트 저해제의 대표적인 예이다. PD-1 저해제의 예는 항-PD-1 항체인 니볼루맙(Opdivo^TM로 판매 됨) 및 펨브롤리주맙을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 바람직한 하나의 실시형태에서 니볼루맙이 선택될 수 있다.

임의의 요법에 의해 한정되는 것은 아니나 니볼루맙을 사용하는 치료가 바람직한 이유 중 하나는 실시예를 통해 본 발명의 바이오마커의 사용이 반응성 피험자 및 비-반응성 피험자를 명확하게 식별할 수 있음을 입증하였고, 특히 반응성 및 비-반응성을 특정 임계치로 명확하게 구별할 수 있음이 밝혀졌기 때문이다. 물론 본 발명의 바이오마커는 다른 PD-1 저해제에 동등하게 적용될 수 있다.

또한 본 발명은 PD-1 저해제와 동일한 정도로 PD-L1 저해제를 사용할 수 있다.

항-PD-1 항체는 PD-1 신호에 의한 T-세포 활성화의 저해를 해제함으로써 항암 효과를 달성하는 것으로 이해된다. 또한 항-PD-L1 항체는 PD-1 신호에 의한 T-세포 활성화의 저해를 해제함으로써 항암 효과를 달성하는 것으로 이해된다. T-세포 기능을 저해하는 PD-1의 메커니즘이 완전히 밝혀지지는 않았으나 PD-1(프로그램 된 사멸 1)과 PD-L1 또는 PD-L2 사이의 상호 작용은 티로신 포스파타제, SHP-1 또는 2를 PD-1의 세포질 도메인에 도입하여 T-세포 수용체 신호전달 단백질 ZAP70을 불활성화시켜 T-세포의 활성화를 저해하는 것이다 (Okazaki, T., Chikuma, S., Iwai, Y. 등: A rheostat for immune responses: the unique properties of PD-1 and their advantages for clinical application. Nat. Immunol., 14, 1212-1218 (2013)).

이것은 인근의 T-세포 수용체의 근위 신호 전달 키나아제를 탈인산화 시키는 ITSM 모티프로 불리는 부분에 SHP-1 또는 2의 충원에 의해 유발된 것으로 이해된다. 즉 "항원에 의해 자극받고 있음"이라는 메모리는 항원에 의해 자극된 T-세포에서 지워진다.

PD-1은 암 조직에 침투한 살해 T-세포 및 자연 살해 세포에서 높은 수준으로 발현된다. PD-1로부터의 PD-1 신호에 의해 매개되는 면역 반응은 종양 상의 PD-L1에 의해 약화되는 것으로 추정된다. PD-1 신호에 의해 매개되는 면역 반응은 PD-L1에 의해 약화되나, PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용 및/또는 항-PD-1 항체와의 상호작용에 의해 유도된 신호전달을 저해함으로써 항-종양 면역 반응을 강화시키는 효과가 나타난다.

면역 체크포인트 저해제의 또 다른 예로는 PD-L1 저해제(예를 들면 항-PD-L1 항체 아벨루맙, 두르발루맙 및 아테졸리주맙)가 있다.

PD-L1 저해제는 PD-1 및 PD-L1 사이의 상호작용 및/또는 항-종양 면역 반응을 유도하기 위한 상호작용에 의해 유도된 신호전달을 저해하기 위해 상기 PD-1 경로를 PD-L1 측 에 결합시켜 이를 저해한다. 임의의 요법에 의해 구속되기를 바라지 않으나 PD-1 경로를 저해하는 요법(예를 들면 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체)에 반응성이거나 비-반응성인 피험자는 실시예에서 입증된 결과를 고려하여 본 발명의 바이오마커를 사용함으로써 명백하게 식별될 수 있다.

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CTLA-4 저해제(예를 들면 항-CTLA-4 항체 이피리무맙(ipilimumab) 또는 트레멜리무맙(tremelimumab))는 면역 체크 포인트 저해제의 또 다른 예이다.

CTLA-4 저해제는 T-세포를 활성화시켜 항-종양 면역 반응을 유도한다. T-세포는 표면의 CD28과 CD80 또는 CD86의 상호작용에 의해 활성화된다. 그러나 표면 발현된 CTLA-4(세포독성 T-림프구-관련 항원 4)는 활성화된 T-세포에 대해서도 CD20보다 높은 친화성으로 CD80 또는 CD86과 우선적으로 상호작용하여 활성화를 억제하는 것으로 이해된다. CTLA-4 저해제는 CD20과 CD80 또는 CD86 사이의 상호작용의 저해를 방지하기 위해 CTLA-4를 저해함으로써 항-종양 면역 반응을 유도한다.

또 다른 실시형태에서 면역 체크포인트 저해제는 TIM-3 (T-세포 면역 글로불린 및 뮤신 함유 단백질-3), LAG-3(림프구 활성화 유전자-3), B7-H3, B7-H4, B7-H5(VISTA) 또는 TIGIT (Ig 및 ITIM 도메인을 지니는 T-세포 면역 수용체)와 같은 면역 체크포인트 단백질을 표적으로 한다.

전술한 면역 체크포인트가 자가 조직에 대한 면역 반응을 억제하지만 바이러스와 같은 항원이 생체 내에서 장시간 존재할 경우 T-세포내에 면역 체크포인트가 증가한다는 것이 이해된다. 종양 조직은 생체 내에서 장시간 동안 존재하는 항원이기 때문에 항-종양 면역 반응이 이러한 면역 체크포인트에 의해 회피된다는 것이 이해된다.

전술한 면역 체크포인트 저해제는 그러한 종양 기능을 무력화하여 항-종양 효과를 달성한다. 임의의 요법에 의해 구속되기를 바라지는 않지만, 본 발명의 바이오마커는 인간의 전체적인 항-종양 면역 반응의 균형을 평가함으로써 면역 체크포인트 저해제의 치료 효과를 정확하게 예측하기 위한 지표로서 사용될 수 있는 것으로 이해된다.

본 발명의 하나의 실시형태는 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 조성물을 제공한다. 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 조성물은 본 발명의 바이오마커를 이용한 평가에 의해 선별된 피험자에게 투여함으로써 높은 가능성으로 현저한 치료 효과를 얻을 수 있다.

본 발명의 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 조성물은 일반적으로 전신적으로 또는 국소적으로 경구 또는 비경구 형태로 투여된다.

투여량은 연령, 체중, 증상, 치료 효과, 투여 방법, 처리 시간 등에 따라 상이 하나 통상적으로 투여된다. 예를 들면 성인 1인 당 0.1mg 내지 100mg 범위의 용량으로 1일 1회 내지 수회 경구 투여된다. 또는 성인 1인 당 0.01mg 내지 30mg 범위의 용량으로 1일 1회 내지 수회 1시간 내지 24시간 범위에서 비경구 투여(바람직하게는 정맥 내로)된다. 물론 투여량은 다양한 조건에 따라 상이하기 때문에 상기 투여량보다 적은 양도 충분하거나 상기 범위를 초과하는 양이 요구될 수 있다.

투여를 위해 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 조성물은 경구 투여용 고체 제제 또는 액체 제제, 비경구 투여용 주사제, 도포제, 좌제와 같은 투여 형태를 지닌다. 경구 투여용 고체 제제로는 정제, 환제, 캡슐제, 분말제, 과립제 등을 들 수 있다. 캡슐제에는 경질 및 연질 캡슐이 포함된다.

본 발명의 조성물은 하나 이상의 활성 성분(예를 들면 면역 체크포인트 단백질에 대한 항체)을 포함하며 직접 사용되거나 통상적인 사용 방법에 따라 제형화 되는 부형제(락토스, 만니톨, 글루코스, 미세결정 셀룰로오스, 전분 등), 결합제(하이드록시프로필셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 메타규산알루민산 마그네슘 등), 붕해제(칼슘 셀룰로스 글리콜레이트 등), 윤활제(스테아린산 마그네슘 등), 안정화제, 용해제(글루탐산, 아스파트산 등) 등과 혼합될 수 있다. 또한 조성물은 필요에 따라 피복제(정제 당, 젤라틴, 하이드록시프로필셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 프탈레이트 등)로 피복하거나 2층 이상으로 피복하여도 좋다. 젤라틴과 같이 흡수될 수 있는 물질로 만들어진 캡슐도 포함된다.

본 발명의 조성물은 경구 투여를 위한 액상 제제로 제형화 되는 경우 약제학적으로 허용되는 수성 제제, 현탁제, 유제, 시럽제, 엘릭서제 등을 포함한다. 이러한 액상 제제 내에는 하나 이상의 활성 성분이 통상 사용되는 희석제(정제수, 에탄올 또는 이들의 혼합물 등)에 용해, 현탁 또는 유화된다. 또한 이러한 액상 제제는 습윤제, 현탁제, 유화제, 감미제, 향료, 향료, 방부제, 완충제 등을 함유할 수 있다.

비경구 투여를 위한 주사제의 예로는 용액, 현탁액, 에멀젼 및 고형 주사제가 포함되며, 이들은 사용시 용매 중에 용해 또는 현탁시켜 사용된다. 주사제는 하나 이상의 활성 성분을 용매에 용해, 현탁 또는 유화시킴으로써 사용된다. 사용되는 용매의 예는 주사제용 증류수, 식염수, 식물성 오일, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 에탄올과 같은 알코올 및 이들의 조합 등을 포함한다.

또한 이러한 주사제는 안정화제, 가용화제(글루탐산, 아스파르트산, 폴리소르 베이트 80^TM 등), 현탁화제, 유화제, 진통제, 완충제, 방부제 등을 포함할 수 있다. 그들은 최종 단계에서 멸균 또는 무균 조작에 의해 준비된다. 또한 동결 건조된 제품과 같은 무균 고형 제제를 제조 할 수 있으며 이를 사용 전에 멸균 또는 무균의 주사용 증류수 또는 다른 용매에 용해시킨다.

(암)

본 발명에 있어서 표적 암의 예로는 흑색종(악성 흑색종), 비소세포 폐암, 신장 세포암, 악성 림프종(호지킨 또는 비호지킨 림프종), 두경부암, 비뇨기암(방광암, 요로상피암 및 전립선암), 소세포 폐암, 흉선암, 위암, 식도암, 식도위암, 간암 (간세포암종, 간내 담관암), 일차성 뇌종양(교모세포종 및 일차 중추 신경계 림프종), 악성 흉막중피종, 부인과 암 (난소암, 자궁경부암 및 자궁암), 연조직 육종, 담도암, 다발성 골수종, 유방암, 대장암 등을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.

(바이오마커)

본 발명은 암 면역요법의 치료 효과를 예측하기 위한 신규한 바이오마커를 제공한다. 하나의 측면에서 피험자의 T-세포 조성은 암 면역요법의 치료 효과를 예측하기 위한 지표로서 사용된다.

하나의 실시형태에서, 응답 그룹 임계 값 이상인 피험자의 T- 세포 조성의 특정 지표는 피험자가 암 면역요법에 대한 반응 그룹의 일부임을 나타낸다. 또 다른 실시형태에서, 반응군 임계 값 또는 그 미만인 환자의 T- 세포 조성의 특정 지표는 환자가 암 면역요법에 대한 반응군의 일부임을 나타낸다.

또 다른 실시형태에서 무 효과 그룹 임계치 또는 그 이상인 피험자 T-세포 조성의 특정 지표는 피험자가 암 면역요법에 대해 무 효과 그룹의 일부임을 나타낸다. 또 다른 실시형태에서 무 효과 그룹 임계치 또는 그 미만인 피험자 T-세포 조성의 특정 지표는 피험자가 암 면역요법에 대해 무 효과 그룹의 일부임을 나타낸다.

당업자는 그러한 지표 각각에 대해 적절한 임계치를 결정할 수 있다. 당업자는 본 명세서에 개시된 임계치(무 효과 그룹 임계치 및/또는 반응 그룹 임계치)를 사용함으로써 표시된 민감도 및/또는 특이도에서 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측할 수 있다.

본 명세서에 개시된 지표의 경우 당업자는 기준 피험자 그룹의 암 면역요법의 효과를 측정한 결과로부터 원하는 민감도 및 특이도를 달성하는 임계치를 적절하게 결정할 수 있다. 본 명세서의 실시예에서 입증된 피험자 그룹은 기준 피험자 그룹으로 간주될 수 있다. 즉 당업자는 실시예에 개시된 실험 결과로부터 임계치를 결정하거나 본 발명을 실시할 때 기준 피험자 그룹의 결과로부터 새로운 임계치를 결정할 수 있다.

민감도(Sensitivity)는 피험자 집단 중에서 주어진 특성을 지니는 피험자를 선택할 때 피험자 집단 내에서 주어진 특성을 지니는 피험자 총 수에 대해 선택된 표적 내에서 주어진 특성을 지니는 피험자 수의 비율을 의미한다. 예를 들면 피험자 집단에서 주어진 특성을 지닌 모든 피험자를 선택할 때 민감도는 100%이다. 피험자 집단에서 주어진 특성을 지닌 피험자의 절반이 선택되면 민감도는 50%이다. 피험자 집단에서 주어진 특성을 지닌 피험자가 선택되지 않으면 민감도는 0%이다.

민감도는 예를 들면 (선택된 표적 중에서 주어진 특성을 지닌 피험자의 수) / (피험자 집단 내에서 주어진 특성을 지닌 피험자의 총 수)로 결정된다. 높은 민감도의 결정은 특정 상태를 지닌 피험자(예를 들면 암 면역요법과 관련하여 무 효과 그룹)를 찾는 것이 바람직할 때 그러한 피험자는 그러한 상태에 있다고 명확하게 결정될 수 있음을 의미한다.

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높은 민감도로 측정할 수 있는 본 발명의 바이오마커는 특정 요법과 관련하여 무 효과 그룹의 검출을 보장하는데 매우 유용하다. 이러한 목표에 따라 민감도가 높아지도록 임계치를 선택할 수도 있다.

특이도는 피험자 집단 중에서 주어진 특성을 지니는 피험자를 선택할 때 선택된 표적의 총 수에 대해 선택된 표적 내에서 주어진 특성을 지니는 피험자 수의 비율을 의미한다. 예를 들면 피험자 집단 중에서 선택된 모든 후보자가 주어진 특징을 지닐 때 특이도은 100%이다. 피험자 집단 중에서 선택된 후보자의 절반이 주어진 특성을 지닐 때 특이도는 50%이다. 주어진 특성을 지니는 피험자 집단 중에서 후보자가 선택되지 않으면 특이도는 0%이다.

특이도는 예를 들면 (선택된 표적 중에서 주어진 특성을 지니는 피험자의 수) / (선택된 표적의 총 수)로 결정된다. 높은 특이도의 결정은 특정 상태를 지니지 않은 피험자(예를 들면 암 면역요법과 관련하여 반응 그룹)를 그러한 상태(예를 들면 암 면역요법과 관련하여 반응 그룹)에 속하지 않는 것으로 부정확하게 결정할 확률이 낮은 것을 의미한다.

본 발명의 바이오마커는 높은 특이도를 지니는 결정을 가능하게 하며 예를 들면 특정 요법에 대한 반응 그룹을 치료를 중단하는 무 효과 그룹으로서 부정확하게 결정하는 것을 방지하기 위해 유용하다. 또한 이러한 목적에 따라 특이도가 높아지도록 임계치를 선택할 수도 있다.

예를 들면 지표의 증가가 암 면역요법의 효과와 관련이 있을 때 특정 임계치(무 효과 그룹 임계치) 이하의 지표를 지니는 무 효과 그룹의 일부로서 피험자를 식별하는 경우, 무 효과 그룹의 일부임에도 불구하고 무 효과 그룹이 아닌 것으로(즉 안정 그룹 또는 반응 그룹) 결정된 피험자는 높게 설정된 임계치에 의해 감소하고(특이도의 증가), 무 효과 그룹이 아님에도(즉 안정 그룹 또는 반응 그룹) 불구하고 무 효과 그룹의 일부인 것으로 결정된 피험자는 증가한다(특이도의 감소).

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대조적으로, 무 효과 그룹의 일부가 아님에도(즉 안정 그룹 또는 반응 그룹) 불구하고 무 효과 그룹의 일부인 것으로 결정된 피험자는 낮게 설정된 임계치에 의해 감소하고(특이도의 증가), 무 효과 그룹의 일부임에도 불구하고 무 효과 그룹의 일부가 아닌 것으로(즉 안정 그룹 또는 반응 그룹) 결정된 피험자는 증가한다(특이도의 감소).

본 발명의 바이오마커는 특이도 및/또는 민감도가 매우 높아지도록 임계치를 설정하여 사용할 수 있으므로 본 발명의 바이오마커는 암 면역요법치료 효과를 예측할 수 있는 전례 없는 유리한 마커로 사용될 수 있다. 또한 당업자라면 특이도 및 민감도 모두가 매우 높은 임계치의 범위 내에서 목적에 따라 임계치를 적절하게 설정할 수 있다. 임계치의 하나의 예로서 특정 값이 표시되는 경우에도 관심의 결정이 수행 될 수 있는 한 특정 값의 근접 값이 사용될 수 있음이 이해되어야 한다.

피험자의 CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^low T-세포의 비율은 예를 들면 무 효과 그룹을 선택하는 지표와 같이 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 사용될 수 있다. 본 발명자들은 무 효과 그룹 임계치보다 높은 CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^low T-세포의 비율이 그러한 경우에 피험자가 암 면역요법에 대해 무 효과 그룹의 일부가 아님을 매우 높은 정밀도로 예측할 수 있다는 것을 발견하였다.

CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^low T-세포의 비율에 대한 무 효과 그룹 임계치는 참고문헌에 기초하여 당업자에 의해 적절하게 결정되거나 도 6에 나타난 컷오프(Cutoff)가 무 효과 그룹 임계치로 사용될 수 있다. 비율이 하기에 퍼센트(%)로 표시될 수 있음을 주목해야 한다.

예를 들면 도 6의 결과에서 무 효과 그룹 임계치로 19.4를 사용하는 경우, CD4⁺ T-세포 내의 CD62L^low T-세포 비율을 바이오마커로서 사용하여 피험자가 92.9%의 민감도와 96.7%의 특이도를 지닌 무 효과 그룹의 일부인지 여부를 결정할 수 있음이 이해된다.

도 6의 결과에서 CD4⁺ T-세포 내의 CD62L^low T-세포 비율에 대한 무 효과 그룹 임계치로서 14.45 이하의 값(예를 들면 14.45, 13.8, 13.3, 12.3 또는 10.9)을 사용하는 경우, 100% 특이도를 지니는 바이오마커로서 무 효과 그룹을 비율로 예측할 수 있다.

CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^low T-세포의 비율에 대한 무 효과 그룹 임계치로서 22.55 이상의 값(예를 들면 23.1, 24.1, 24.8, 25.05, 25.45, 25.95, 27, 28.75 등)을 사용하는 경우, 무 효과 그룹은 100% 민감도를 지니는 바이오마커로서 비율에 의해 예측될 수 있다.

즉, CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^low T-세포의 비율로서 무 효과 그룹 임계치는 약 10 내지 약 30(%) 범위일 수 있다. 이러한 무 효과 그룹 임계치의 예는 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 및 30 (%)이다.

피험자의 CD4⁺ T-세포 내에서 Foxp3 +CD25 + T-세포의 비율은 또한 무 효과 그룹 임계치와 같이 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하는 지표로서 사용될 수 있다. 본 발명자들은 피험자로부터 유래된 샘플의 CD4⁺ T-세포 내에서 Foxp3 +CD25 + T-세포의 비율이 무 효과 그룹 임계치보다 낮은 경우 피험자가 암 면역요법과 관련하여 무 효과 그룹의 일부가 아님을 나타낸다는 것을 발견했다.

피험자의 CD4⁺ T-세포 내에서 Foxp3 +CD25 + T-세포의 비율에 대한 무 효과 그룹 임계치는 기준 피험자로부터 당업자에 의해 적절하게 결정될 수 있다. 이러한 무 효과 그룹 임계치는 약 2 내지 약 4 (%) 범위일 수 있다. 임계치의 예는 약 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9 또는 4.0 (%)이다.

본 명세서에 개시된 T-세포 조성물의 지표는 바람직한 경우에 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명자들은 다수의 지표가 독립적으로 반응성과의 상관관계를 나타내는 것을 발견 하였으므로 반응성의 지표로서 결합되어 사용되는 다수의 지표가 예측 정밀도를 더욱 향상시킬 수 있음이 이해된다.

2 이상의 지표가 반응성의 지표로 결합되면 여러 변수를 사용하는 식으로 표시되는 지표를 사용할 수 있다. 다수의 지?? (X¹, X², X³ ... Xⁿ)를 사용하는 경우 반응성 지표의 예로는

F = a₁X₁ ^b1 + a₂X₂ ^b2 + a₃X₃ ^b3 … + a_nX_n ^bn

F = X₁ ^c1*X₂ ^c2*X₃ ^c3 … *_n ^cn

을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 이때 a, b 및 c 각각은 임의의 실수이다.

이러한 식으로 계산된 지표의 크기로부터 반응성을 예측할 수 있다. 본 발명자에 의해 발견된 신규 지표에 대한 로지스틱 회귀 분석 또는 판별 분석에 의한 다변량 해석을 수행하는 것으로부터 계수를 결정하고 피험자의 암 면역요법에 대한 반응성의 지표로 사용 할 수 있다.

결합된 지표는 한정되지 않으나 본 발명자들은 항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 양, 항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 수지상 세포 아집단의 양, 항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD8⁺ T-세포 아집단의 양, 조절 T-세포 또는 조절 T-세포와 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 양, ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양과 같은 지표를 발견하였다. 서로 다른 메커니즘에 의해 반응성을 예측하는 지표를 결합하여 허위 상관관계가 아닌 반응성과의 강한 상관관계를 나타내는 지표로 사용할 수 있다.

예를 들면 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; CCR7^-CD4⁺ T-세포 아집단의 양; LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RA^-CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RO⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; HLA-DR⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD80⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD86⁺ 수지상 세포 아집단의 양; PD-L1⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 양; CD137⁺CD8⁺ T-세포 아집단의 양; CD28⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 양; CCR4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RA -Foxp3 +CD4 + T-세포 아집단의 양; 및CD4 +Foxp3 +CD25 + T-세포 아집단의 양; 으로 이루어진 군에서 선택된 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 지표와 같은 2개 이상의 지표가 조합되어 사용될 수 있다.

암 면역요법에 대한 반응성으로서 지표를 조합함으로써 암 면역요법과 관련하여 무 효과 그룹의 일부가 아님을 나타내는 것이 가능하다. 마찬가지로 암 면역요법에 대한 반응성으로서 지표를 조합함으로써 암 면역요법에 대한 반응과 관련하여 피험자가 반응 그룹의 일부인지를 결정할 수 있다.

일반적으로 반응성은 변수로서 본 명세서에 개시된 2 개의 지표 (X, Y)를 사용하여 식 F(X, Y)에 의해 예측될 수 있다. 경우에 따라 식은 X의 Y에 대한 상대 값이다.

X와 Y의 모든 함수 (F(X, Y))는 X의 Y에 대한 상대 값으로 사용될 수 있다. 특히 X가 반응성과 양의 상관관계가 있고 Y가 반응성과 음의 상관관계가 있는 것으로 이해되면, X에 대해 단조롭게 증가하고 Y에 대해 단조롭게 감소하는 X와 Y의 식 (F(X, Y))를 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 반응성을 나타내는 2 이상의 변수가 있는 경우 반응성을 나타내는 식은 반응성에 대한 각 변수의 기여도를 계산하여 로지스틱 회귀 분석 등에서 회귀적으로 구할 수 있다.

반응성을 나타내는 F(X, Y)의 예로는 다음을 들 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.

F = aX^r + bY^s

F = X^r * Y^s

a, b, r 및 s는 임의의 실수이다.

식을 단순화하기 위해 정수를 r 및 s로 사용할 수 있다. 일부 실시예에서 X의 Y에 대한 상대 값의 예로는 X/Y 및 X²/Y와 같은 Xⁿ/Y^m (n 및 m은 임의의 정수임)을 들 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.

X와 Y의 각 요소가 서로 다른 메커니즘에서 치료에 대한 반응성을 나타낼 때, 그러한 지표의 조합은 반응성의 예측을 보다 정확하게 할 수 있다. 본 발명자들에 의한 연구에 따르면 r 및 s가 -5 내지 5의 범위인 식을 사용하여 피험자의 암 면역요법에 대한 반응성을 정확하게 예측할 수 있음을 나타낸다.

하나의 실시형태에서 항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 T-세포의 양을 X로 사용하고 조절 T-세포 또는 조절 T-세포와 관련 있는 CD4⁺ T-세포 집단의 양을 Y로 사용하여 암 면역요법에 대해 피험자가 무 효과 그룹의 일부가 아닌 것으로 나타낼 수 있다. 이러한 경우에 -5 내지 5 범위의 r 및 s를 지니는 식을 사용하여 피험자의 암 면역요법에 대한 반응성을 정확하게 예측할 수 있음이 증명된다. 이러한 식의 예로는 X/Y, X²/Y, X³/Y, X⁴/Y, X⁵/Y, X/Y², X²/Y², X³/Y², X⁴/Y², X⁵/Y², X/Y³, X²/Y³, X³/Y³, X⁴/Y³, X⁵/Y³, X/Y⁴, X²/Y⁴, X³/Y⁴, X⁴/Y⁴, X⁵/Y⁴, X/Y⁵, X²/Y⁵, X³/Y⁵, X⁴/Y⁵, X⁵/Y⁵ 등이다.

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본 명세서의 실시예는 피험자의 CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^low T-세포의 양 (X)와 피험자의 CD4⁺ T-세포 내에서 Foxp3⁺+CD25⁺ T-세포의 양 (Y)의 조합에 대한 로지스틱 회귀에 의한 지표로서 F = X^2.475/Y를 나타낸다. 그러나 당업자는 유사한 분석에 의해 본 명세서에 개시된 지표들에 대해 상이한 조합 또는 상이한 식을 적절하게 도출할 수 있다.

회귀 분석에서 조합된 변수의 수 +1 보다 큰 샘플로부터의 결과를 사용하여 변수의 조합 식에서 계수를 계산할 수 있다. 회귀 분석에 의해 두 지표의 조합에 대한 식의 형태가 발견되면 회귀 분석은 적어도 4개 샘플의 결과를 사용하여 수행된다. 바람직하게는 회귀 분석은 20개 이상의 샘플의 결과를 사용하여 수행된다.보다 바람직하게는 회귀 분석은 30개 이상의 샘플의 결과를 사용하여 수행된다. 많은 수의 표본을 사용한 회귀 분석은 피험자의 반응성을 더 정확히 예측하는 지표의 조합을 보다 정확하게 찾을 수 있다는 점에서 유리할 수 있다.

하나의 실시형태에서 피험자의 CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^low T-세포의 양 (X) 와 CD4⁺ T-세포 내에서 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포의 양 (Y)가 조합된 지표로 무 효과 임계치로 사용될 수 있다. 예를 들면 X의 Y에 대한 상대 값이 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로서 사용될 수 있다.

예를 들면 본 발명은 다음 군에서 선택된 값을 (X)로 하여 변수 (X, Y)를 계산할 수 있다.

CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; CCR7^-CD4⁺ T-세포 아집단의 양; LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RA^-CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RO⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; HLA-DR⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD80⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD86⁺ 수지상 세포 아집단의 양; PD-L1⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 양; CD137⁺CD8⁺ T-세포 아집단의 양; 및 CD28⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 양; 이다.

본 발명의 방법은 조절 T-세포 아집단의 양 또는 조절 T-세포와 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 양을 (Y)로 하여 변수 (X, Y)를 계산할 수 있다.

CCR4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD62L^highCD25 +CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 및 CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 양; 이다.

또한 본 발명은 상기 (X, Y)를 사용하여 무효과 그룹의 일부가 아닌 것으로 결정된 피험자 집단에서 반응 그룹(PR) 및 안정 그룹(SD)을 확인하는 방법을 제공한다.

반응 그룹(PR)과 안정 그룹(SD)을 식별하는 방법은 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포의 양을 (Z)로 하고 다음 군에서 선택된 값을 (W)로 하여 변수 (Z, W)를 계산함으로써 피험자가 반응 그룹(PR) 또는 안정 그룹(SD)의 일부인지의 여부를 예측할 수 있다.

CD4⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 양; CD4⁺Foxp3⁺ T-세포 아집단의 양; CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 양; CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CCR4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 및 CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양;이다.

X의 Y에 대한 상대 값은 특별히 한정되지 않으나 X에 대해 단조롭게 증가하고 Y에 대해 단조롭게 감소하는 X 및 Y의 임의의 함수 (F(X, Y))가 사용될 수 있다. 예를 들면 식은

F(X, Y) =G(X)/H(Y); 또는

F(X, Y) =G(X)-H(Y)

가 될 수 있으며 이때 G(X) 및 H(Y) 각각 X 및 Y에 대해 단조롭게 증가하는 식이 될 수 있다.

예를 들면 G (X)는 X^R, log_RX, R^X 등일 수 있으며 여기서 R은 조건을 만족하는 임의의 실수이고 바람직하게는 양의 정수이다. 예를 들면 H (Y)는 Y^R, log_RY 또는 R^Y 등일 수 있으며 여기서 R은 조건을 만족하는 임의의 실수이고 바람직하게는 양의 정수이다. 이러한 형태에서, 예측의 정확성은 지표로서 X의 암 면역요법의 치료 효과에 대한 긍정적 예측을 Y의 암 면역요법에 대한 부정적 예측과 함께 사용함으로써 개선 될 수 있다.

X의 Y에 대한 상대 값의 예로는 X/Y와 X²/Y와 같은 Xⁿ/Y^m(n과 m은 양의 실수)을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. X와 Y의 각 요소가 서로 다른 메커니즘에서 치료에 대한 반응성을 나타낼 때 그러한 지표의 조합은 반응성의 예측을 보다 정확하게 할 수 있다.

Z 및 W를 사용하는 함수는 특별히 한정되지 않는다. Z 및 W의 임의의 함수 (J(Z, W))를 사용할 수 있다. 이러한 함수는

J (Z, W) = K (Z) * L (W); 또는

J (Z, W) = K (Z) + L (W)

가 될 수 있으며 이때 K(Z) 및 L(W)는 전형적으로 각각 Z 및 W에 대해 단조롭게 증가하는 함수일 수 있다.

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예를 들면 K(Z)는 Z^R, log_RZ, R^Z 등일 수 있으며, 여기서 R은 조건을 만족하는 임의의 실수이고 바람직하게는 양의 정수이다. 예를 들면 L(W)은 W^R, log_RW, R^W 등일 수 있으며, 여기서 R은 조건을 만족하는 임의의 실수이고 바람직하게는 양의 정수이다. J(Z, W)에 기초하여 무 효과 그룹에서 반응 그룹(PR) 및 안정 그룹(SD)의 결정 정확도가 향상될 수 있다.

Z의 W에 대한 상대 값의 예는 W⁵*Z와 같은 Zⁿ*W^m (여기서 n 및 m은 임의의 실수 임)을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 각 요소 Z 및 W가 서로 다른 메커니즘에서 치료에 대한 반응성을 나타낼 때 그러한 지표의 조합은 반응의 예측을 보다 정확하게 할 수 있다.

CD4⁺ T-세포 내의 CD62L^low T-세포의 양을 X로 하고 CD4⁺ T-세포에서 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포의 양을 Y라고 할 때, X/Y는 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하는 지표로 사용될 수 있다. 본 발명자들은 높은 X/Y를 지닌 피험자는 암 면역요법과 관련하여 무 효과 그룹의 일부가 아님을 발명하였다. 따라서 X/Y의 값은 무 효과 그룹 임계치로 사용될 수 있다.

X/Y에 대한 무 효과 그룹 임계치는 참고문헌에 기초하여 당업자에 의해 적절하게 결정되거나 도 8에 나타난 컷오프(Cutoff)가 무 효과 그룹 임계치로 사용될 수 있다.

또한 7.35를 X/Y의 무 효과 그룹 임계치로 사용하는 경우, X/Y를 피험자가 71.4%의 민감도와 100%의 특이도로 무 효과 그룹의 일부인지 여부를 판정하기 위한 바이오마커로서 사용하여 무 효과 그룹이 예측될 수 있다.

7.35 이하의 값(예를 들면 7.35, 6.83, 6.31, 5.64, 5.01 등)을 X/Y의 무 효과 그룹 임계치로 사용하는 경우, 특이도 100%의 바이오마커로서 무 효과 그룹을 예측할 수 있다.

9.305 이상의 값(예를 들면 9.895, 10.19, 11.71, 12.07, 12.32, 12.42 등)을 X/Y의 무 효과 그룹 임계치로 사용하는 경우, 민감도 100%의 바이오마커로서 무 효과 그룹을 예측할 수 있다.

즉 X/Y의 무 효과 그룹 임계치는 약 5 내지 약 13의 범위일 수 있다. X/Y의 무 효과 그룹 임계치의 예로는 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 및 13을 포함한다.

또한 X의 Y에 대한 상대 값으로서, X²/Y를 무 효과 그룹 임계치로 사용될 수 있으며 이것은 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하는 지표이다. 본 발명자들은 높은 X²/Y를 가진 피험자가 암 면역요법과 관련하여 무 효과 그룹의 일부일 가능성이 거의 없음을 나타내었다.

X²/Y에 대한 무 효과 그룹 임계치는 참고문헌에 기초하여 당업자에 의해 적절하게 결정되거나 도 10에 나타난 컷오프(Cutoff)가 무 효과 그룹 임계치로 사용될 수 있다.

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174.3을 X²/Y의 무 효과 그룹 임계치로 사용하는 경우, X²/Y를 피험자가 민감도 및 특이도 모두 100%로 무 효과 그룹의 일부인지 여부를 판정하기 위한 바이오마커로 사용하여 무 효과 그룹을 예측 할 수 있다.

X²/Y에 대한 무 효과 그룹 임계치의 다른 값으로 110.6, 118.2, 134.9, 151.6, 157.4, 174.3, 194.2, 202.3, 208.3 등을 사용할 수 있다.

즉 X²/Y에 대한 무 효과 그룹 임계치는 약 110 내지 약 210의 범위일 수 있다. X²/Y에 대한 무 효과 그룹 임계치의 예로는 약 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 및 210을 포함한다.

당업자는 적어도 본 명세서에 개시된 데이터로부터 적절한 임계치를 설정함으로써 X의 Y에 대한 다른 상대 값을 사용할 수 있다.

본 발명의 2 이상의 지표(바이오마커, BM)를 계산(예를 들면 곱셈)한 결과를 사용하여 PR과 SD를 구별하는 것(피험자가 반응 그룹의 일부인 것으로 나타냄)도 가능하다. 하나의 실시형태에서 제 1 바이오마커로서 "Z" 및 제 2 바이오마커로서 "W"를 지니는 Zⁿ*W^m(n 및 m은 양의 실수)의 값은 PR과 SD를 구별하는데 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

PR 및 SD를 구별하기 위해 3개 이상의 바이오마커를 계산(예를 들면 덧셈 및/또는 곱셈)한 결과를 사용할 수도 있다. 예를 들면 PR 그룹과 SD 그룹이 CD4⁺ T-세포 내의 CD25⁺Foxp3⁺ CD4⁺ T-세포의 비율 (W)와 CD4⁺ T-세포 내의 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포의 비율 (Z)의 곱셈 W*Z를 사용하여 구별될 때 W*Z 임계 값을1.816 로 하면 80%의 민감도와 89.5%의 특이도를 지닌 바이오마커로 사용할 수 있다는 것이 입증되었다(도 21의 중앙 하단). 대안적으로 Z*W⁵가 54.55%의 민감도와 100%의 특이도를 지닌 바이오마커로 사용될 수 있음이 입증되었다.

또한 Z 및 W의 임의의 함수 (J(Z, W))가 상기한 바와 같이 사용될 수 있다. 예를 들면 -5 내지 6의 r 및 s를 지닌 J = Z^r*W^s와 같은 공식을 사용하여 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 정확하게 예측할 수 있다. 이러한 공식의 예로는 Z*W, Z²*W, Z³*W, Z⁴*W, Z⁵*W, Z⁶*W, Z*W², Z²*W², Z³*W², Z⁴*W², Z⁵*W², Z⁶*W², Z*W³, Z²*W³, Z³*W³, Z⁴*W³, Z⁵*W³, Z⁶*W³, Z*W⁴, Z²*W⁴, Z³*W⁴, Z⁴*W⁴, Z⁵*W⁴, Z⁶*W⁴, Z*W⁵, Z²*W⁵, Z³*W⁵, Z⁴*W⁵, Z⁵*W⁵, Z⁶*W⁵, Z*W⁶, Z²*W⁶, Z³*W⁶, Z⁴*W⁶, Z⁵*W⁶, Z⁶*W⁶등을 들 수 있다.

본 명세서의 실시예는 로지스틱 회귀 등에 의해 CD4⁺ T-세포 내에서 CD25⁺Foxp3⁺ CD4⁺ T-세포의 비율 (W) 및 CD4⁺ T-세포 내에서 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포의 비율 (Z)을 결합한 Z*W⁵를 바람직한 예측 식으로 사용할 수 있음을 나타낸다(도 25 및 도 26). 한편 본 기술 분야의 당업자는 본 명세서에 개시된 지표에 대해 상이한 조합 또는 다른 식을 유사한 분석을 통해 적절히 도출할 수 있다.

또한 본 명세서는 무 효과 그룹의 일부가 아닌 것으로 결정된 피험자 집단 중에서 반응 그룹(완전 반응 + 부분 반응) 및 안정 그룹(중간 그룹)을 구별하는 데 사용될 수 있는 지표를 제공한다.

CD4⁺ T-세포 내에서 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포의 비율은 무 효과 그룹의 일부가 아닌 것으로 예측된 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하는 지표로 사용될 수 있다. 본 발명자들은 무 효과 그룹의 일부가 아닌 것으로 나타난 피험자 내의 CD4⁺ T-세포 내에서 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포의 비율이 높다는 것은 피험자가 암 면역요법에 대해 반응 그룹의 일부일 가능성이 높다는 것을 의미한다는 것을 발견하였다. CD4⁺Foxp3⁺ CD25⁺ T-세포는 면역억제 특성을 지니는 조절 T-세포이기 때문에 그러한 세포의 비율이 높은 피험자는 암 면역요법에 반응할 가능성이 높다.

CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내의 LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율 또는 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내의 PD-1⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율은 무 효과 그룹의 일부가 아닌 것으로 예측된 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 지표로 사용될 수 있다. 본 발명자들은 이들 세포 아집단이 반응 그룹(완전 반응 + 부분 반응) 및 안정 그룹(중간 그룹)을 구별하는 데 사용될 수 있음을 발견하였다.

본 발명의 방법은 예를 들면 X의 Y에 대한 상대 값과 임계치(무 효과 그룹 임계치)의 비교를 사용할 수 있으며 피험자가 암 면역요법에 대해 무 효과 그룹의 일부가 아님을 예측하기 위해 CD80⁺ 수지상 세포의 양 (X)를 측정하는 단계와 CD28⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포의 양 (Y)를 측정하는 단계를 포함한다.

본 명세서에 개시된 임의의 바이오마커를 임의의 무 효과 그룹 임계치와 결합하여 피험자가 무 효과 그룹의 일부가 아닌 것을 예측하는 것이 가능하다. 또한 그러한 지표에 대해 결정된 임계치를 무 효과 그룹 임계치로 사용하여 무 효과 그룹을 예측하고 피험자 집단(바람직하게는 무 효과 그룹이 배제된 피험자 집단)이 암 면역요법과 관련하여 반응 그룹의 일부임을 예측하기 위한 지표로서 CD4⁺ T-세포 내에서 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포의 비율에 대한 임계치를 반응 그룹 임계치로 사용하는 것이 가능하다.

대안적으로 무 효과 그룹의 일부가 아닌 것으로 결정된 피험자 집단에서 반응 그룹(PR) 및 안정 그룹(SD)을 식별하는 방법이 제공된다. 반응 그룹(PR) 및 안정 그룹(SD)을 식별하는 방법은 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양을 (Z)로 하고

CD4⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 양;

CD4⁺Foxp3⁺ T-세포 아집단의 양;

CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 양;

CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양;

CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양;

CCR4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양;

CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양;

으로 이루어진 군에서 선택된 양을 (W)로 하여 변수 (Z, W)를 계산함으로써 피험자가 반응 그룹(PR) 또는 안정 그룹(SD)의 일부인지를 예측할 수 있다.

CD4⁺ T-세포 내에서 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포의 비율에 대한 반응 그룹 임계치는 참고문헌에 기초하여 당업자에 의해 적절하게 결정되거나 도 12에 나타난 결과가 반응 그룹 임계치로 적절하게 선택될 수 있다. 비율이 하기에 퍼센트(%)로 표시될 수 있음을 주목해야 한다.

CD4⁺ T-세포 내에서 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포의 비율에 대한 반응 그룹 임계치로 2.05를 사용하는 경우, CD4⁺ T-세포 내에서 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포의 비율을 피험자가 반응 그룹의 일부인지 여부를 예측하기 위한 바이오마커로서 52.6%의 민감도 및 100%의 특이도로 사용할 수 있다.

CD4⁺ T-세포 내에서 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포의 비율에 대한 반응 그룹 임계치로 2.05 이하의 값(예를 들면 2.05, 1.895, 1.76, 1.7, 1.61 등)을 사용하는 경우, 이는 100%의 특이도를 지닌 바이오마커로서 반응 그룹을 예측하기 위해 사용될 수 있다.

CD4⁺ T-세포 내에서 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포의 비율에 대한 반응 그룹 임계치로 3.35 이상의 값(예를 들면 3.35, 3.63, 4.365 등)을 사용하는 경우, 이는 100%의 민감도를 지닌 바이오마커로서 반응 그룹을 예측하기 위해 사용될 수 있다.

즉 CD4⁺ T-세포 내에서 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포의 비율에 대한 반응 그룹 임계치는 약 1.6 내지 4.4%가 될 수 있다. CD4⁺ T-세포 내에서 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포의 비율에 대한 반응 그룹 임계치의 예로는 약 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3 및 4.4(%) 등이 있다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 상기 개시된 임의의 바이오마커(바람직하게는 바이오마커의 조합)로 선별된 대상에게 암 면역요법을 적용하는 방법을 제공한다. 하나의 실시형태는 면역 체크포인트 억제제를 상기 바이오마커가 본 명세서에 개시된 어느 하나의 임계치로 표시되는 상태에 있는 피험자에게 투여하는 방법을 제공한다.

(세포 분획화 / 분리)

T-세포의 분획화/분리용 샘플은 통상적인 방법을 사용하여 피험자로부터 적절하게 채취할 수 있다. 예를 들면 피험자의 말초 혈액, 골수, 종양 조직, 조혈 조직, 비장, 정상 조직, 림프 등으로부터 채취할 수 있다. 말초 혈액으로부터의 샘플 수집은 간단하고 비 침습적이기 때문에 유리할 수 있다.

피험자 샘플에서의 T-세포의 조성은 통상적인 방법을 사용하여 당업자에 의해 측정될 수 있다. 일반적으로 샘플에서 관심 있는 세포 아집단을 한정하는 마커(예를 들면 CD4)에 대해 양성인 세포의 수는 유동세포계측법 등을 사용하여 측정 될 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태는 CD4⁺ T-세포 내의 CD62L^low T-세포의 양 (X) 및/또는 CD4⁺ T-세포 내의 FoxP3⁺CD25⁺ T-세포의 양 (Y)을 측정하는 단계를 포함한다.

세포 집단 조성의 측정은 일반적으로 유동세포계측법을 사용하지만, 세포를 포함하는 샘플에 대한 항체 배열 또는 면역 염색법, 세포를 포함하는 샘플 내의 단백질 발현 분석(예를 들면 웨스턴 블롯, 질량분석법, HPLC 등) 및 세포를 포함하는 샘플 내의 mRNA 발현 분석(마이크로어레이 또는 차세대 염기서열분석) 등을 포함한다.

CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단 및 CD4⁺CD25⁺CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺ T-세포 아집단과 같은 개별 세포 아집단 내의 세포 수 측정을 위해, 측정은 모든 세포로부터 개별 아집단 이외의 세포를 실험적으로 제거함으로써 발견할 수 있다. 그것의 구현을 위한 키트가 존재한다.

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예를 들면 CD4⁺ 이펙터 메모리 T-세포 분리 키트인 휴먼(Militenyi Biotech 사)을 사용하는 경우 CD4 항체 또는 CD62L 항체를 사용하지 않고 말초 혈액에서 CD4⁺CD62L^low T-세포 아집단에 해당하는 세포를 분리할 수 있다. 이것은 전체 생존 세포 수를 측정 기록하고 이 키트를 사용하여 수득된 세포 수를 측정 기록함으로써 달성할 수 있다.

CD4⁺CD25⁺ 조절 T-세포 분리 키트인 휴먼(Militenyi Biotech 사)을 사용하는 경우, 항-FoxP3 항체를 사용하지 않고 CD4⁺CD25⁺CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺ T-세포 아집단에 해당하는 세포수를 구할 수 있다. FoxP3은 세포의 핵에 국소화되어 있기 때문에 핵에서 분자를 염색하는 단계를 제거하는 이점이 있다. 유사한 키트로서 CD4⁺CD25⁺CD127 dim/-조절 T-세포 분리 키트인 휴먼(Militenyi Biotech) 또는 CD25⁺CD49d- 조절 T-세포 분리 키트인 휴먼(Militenyi Biotech)을 선택할 수 있다.

항체는 사용될 필요가 없다. 개별 세포에서 발현되는 분자를 특이적으로 인식하고 결합할 수 있는 항체는 세포 표면 또는 세포 내부에서 발현되는 분자에 결합될 때 색상을 방출할 수 있도록 준비된다. 그 후 항체를 검출하여 색상을 방출하는 세포의 수를 측정한다. 세포 표면 또는 세포 내부에서 발현되는 분자는 단백질이기 때문에 단백질이 발현될 때 단백질을 암호화하는 mRNA 또한 세포 내에 형성된다.

이는 각각의 세포의 mRNA를 조사하여 관심 있는 단백질을 코딩하는 mRNA의 유무를 조사하면 충분히 가능하다. 것은 단일 세포 유전자 발현 분석, 즉 단일 세포 수준에서의 mRNA 분석에 의해 가능해진다. 단일 세포 유전자 발현 분석의 예는1) Quartz-Seq을 이용한 차세대 시퀀싱 방법; 2) Fluidigm C1 System 또는 ICELL8 Single-Cell System을 사용하여 세포를 분리하여 SMART-Seq v4로 세포를 분리하고 라이브러리를 준비하는 방법; 3) 세포 분리기로 세포를 분리하고 Ambion Single Cell-to-CT 키트를 사용하여 정량적 PCR로 세포를 측정하는 방법; 및 4) CyTOF SYSTEM (Helios) 등을 들 수 있다.

또한 혈액을 채취하고, 생세포를 계수하고, 셀 분류기 등으로 세포를 분리한다. 예를 들면, Ambion Single Cell-to-CT 키트는 분리된 개별 세포에 사용되어 정량적 PCR을 위한 장치로 특정 유전자의 발현 수준을 측정 할 수 있다. 그 결과를 토대로 각 세포를 CD62L^low CD4⁺ T-세포 아집단과 CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺ T-세포 아집단 중의 어느 하위 집단으로 분류하고 각각의 아집단에 속하는 세포의 수를 측정 조사한다. 이를 통해 숫자의 비율(x와 y의 비율)이 측정된다. 발현을 측정할 수 있는 유전자의 예로는 CD4,CD25, CTLA4, GITR, Foxp3, STAT5, FoxO1, FoxO3, IL-10, TGFβ, IL-35, SMAD2, SMAD3, SMAD4, CD62Llow, CD44, IL-7R (CD127), IL-15R, CCR7low, BLIMP1 등이 포함된다.

본 명세서의 실시예에 나타낸 바와 같이, CD62L^highCD4⁺ T-세포와 비교하여 CD62L^lowCD4⁺ T-세포에서 발현이 증가된 유전자는 AURAKA, CCL17, CD101, CD24, FOXF1, GZMA, GZMH, IL18RAP, IL21 , IL5RA, ND2, SMAD5, SMAD7 및 VEGFA (도 34a)등을 들 수 있다. 세포 아집단의 양 및/또는 비율은 이들 유전자의 발현을 측정함으로써 결정될 수 있으며 이로써 수득된 T-세포가 어느 T-세포 아집단에 속하는지를 결정할 수 있다.

본 명세서의 실시예에 나타낸 바와 같이, CD62L^lowCD4⁺ T-세포와 비교하여 CD62L^highCD4⁺ T-세포에서 발현이 증가된 유전자는 BACH2, CCL28, CCR7, CD27, CD28, CD62L, CSNK1D, FOXP1, FOXP3 , IGF1R, IL16, IL27RA, IL6R, LEF1, MAL 및 TCF7(도 34a)을 들 수 있다. 세포 아집단의 양 및/또는 비율은 이들 유전자의 발현을 측정함으로써 결정될 수 있으며 이로써 수득된 T-세포가 어느 T-세포 아집단에 속하는지를 결정할 수 있다.

본 발명에서 세포 아집단의 비율의 측정 또는 임계 값 과의 비교는 정의된 신호를 지닌 기준 시료를 사용할 수 있다. 주어진 아집단에 대응하는 형광 신호를 유도하기 위해 준비된 기준(예를 들면 형광 안료가 부착되는 입자)과 세포 아집단을 포함하는 샘플 간의 신호를 비교하여 샘플 내에 세포 아집단의 양과 비율을 기준과의 비교를 통해 측정할 수 있다. 미리 결정된 임계 값에 대응하는 형광 신호를 유도하기 위해 준비된 기준(예를 들면 형광 안료가 부착되는 입자)과 세포 집단을 포함하는 샘플 간의 신호를 또한 비교하여, 샘플내의 T-세포 조성에 있어서 본 발명의 마커의 존재 부재 등을 기준과 비교 하여 측정 할 수 있다.

본 발명에서 특정 마커가 high 고 발현 또는 low 저 발현으로 결정될 때, 당업자는 당 업계에서 통상적으로 사용되는 발현 강도에 대한 분류 기준을 사용할 수 있다. 예를 들면 PE 표지된 항-인간 CD62L 항체를 경계로 사용하는 경우, 10E2 신호에 상응하는 신호 강도를 사용하여 CD62L를 CD62L^low 및 CD62L^high로 분류하는 것이 가능하다.

하나의 실시형태에서, CD62L은 하기와 같은 high 고 발현 또는low 저 발현으로 판정될 수 있다. 항-CD62L 항체의 동일한 이소 타입의 음성 대조군으로서 사용되는 항체를 제조한다. 음성 대조군으로 사용되는 항체는 T-세포상의 항원을 인식(결합)하지 않지만 비특이적으로 흡착할 수 있다. 예를 들면 이소타입 컨트롤러는 판매되는 항체가 사용된다. 동일한 형광 라벨이 항-CD62L 항체 및 음성 대조군에 사용된다. 준비 후 각각의 형광 패턴이 중첩된다.

전형적인 패턴에서, 이소 타입 대조군은 낮은 수준의 형광을 지닌 부분에 피크를 갖는 반면, 항-CD62L 항체는 형광 수준이 높은 피크를 가지며, 형광 수준은 형광이 더 낮은 곳에서 서서히 감소한다(도 28). 도 28에서, 보라색 선은 음성 대조군의 염색 패턴이고, 밝은 파란색으로 채색된 선 아래 영역은 항-CD62L 항체의 염색 패턴이다. 이러한 두 패턴이 비교된다. 일부 영역은 음성 대조군과 동일한 형광 수준을 가지고 있지만, 음성 대조군의 전체 피크가 오른쪽으로 이동했다고 판단된다(= 염색된 곳). 일반적으로 거의 모든 세포가 항체에 의해 염색되었다고 판정된다.

또한 low 및 high 의 x-축(FL4-H)상의 경계의 결정이 이제 논의된다. 도면의 오른쪽은 low 와 high의 피크가 나뉘어 진다고 가정했을 때의 개략도이다. high 피크는 수평적으로 대칭인 것처럼 보이지만 low는 수평으로 대칭이라고 간주 할 수 없는 복합 피크를 지닌다. high 피크는 FL4-H 가 400 정도에 위치한다. high 피크의 최대량(= A)은 약 2,000이다. high 피크가 수평 대칭으로 간주되면 피크를 지닌 FL4-H에서 A 까지의 동일한 거리에 의해 분리되고 A에서 피크의 반대쪽에 있는 본래의 high의 최소량(= B)은 약 90 정도이다.

이 영역까지 low 피크와 중첩 되어야 한다. high 피크는 수평 대칭으로, 수평 대칭은 D 근처에서 소실된다. 즉 D 가 low 피크에 고유 최대 값 이라고 추측 할 수 있다. 즉 D 에 인접한 low 피크가 있음을 의미한다. 궁극적으로 high 및 low는 low의 최대값인 D의 중심에서 분할될 수 있고 B는 high의 최소값인 C이다. 이 값은 10E2에 상응한다. 다시 말해서 high의 범위는 C 에서 A까지 이고 low의 범위는 E 에서 C까지 이다. 피크와 각 범위에 의해 형성된 영역은 셀의 수에 상응한다. BD상의 C의 위치는 high low 피크의 크기의 비, 피크의 선명도 등에 따라 달라질 것이지만, C의 위치가 BD의 중심인 경우와의 차이는 작다고 생각된다.

도 29는 FACS 분석에 따른 CD62L의 히스토그램을 도시한다. CD62L low는 10E2를 경계로 매우 명확하게 분리 될 수 있음을 알 수 있다.

본 명세서에 사용되는 "유동 세포 계측법"은 액체 내에서 개별적인 물리적/화학적/생물학적 속성으로 현탁된 세포, 개체 또는 기타 생물학적 입자의 수를 측정하는 기술을 의미한다.

또한, 다양한 세포가 유동 세포 계측법을 사용하여 분석된다. 특히 혈액 세포의 분화는 유동 세포 계측법을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 분화의 결정은 연구 외에도 진단에 사용되기 시작한다.

유동 세포 분석법의 장점의 예로는 블리스트 세포가 차지하는 비율을 쉽게 측정 할 수 있는 것이다. 특이성과 민감도가 높고 이는 매우 재현 가능하다. 많은 수의 세포가 분석 될 수 있으며 필요한 시간도 짧은 것이다.

이 기술을 사용하는 장치를 "유동 세포 계측기"라고 한다. 유동 세포 계측기(flow cytometer)는 균질한 세포 현탁액에서 부유 물질(세포)의 광학 특성을 측정하는 장비이다. 세포는 액체 흐름 상에 레이저 광선의 초점을 통과한다. 세포가 통과 할 때, 전방 산란광, 측방 산란광 및 상이한 파장을 갖는 하나 이상의 형광 광선의 광학 특성이 초 당 500 내지 4000 세포에서 개별 세포에 대해 동시에 측정되어 세포 크기, 내부 구조 및 세포막, 세포질 또는 핵에 존재하는 핵산 또는 다양한 항원의 양과 같은 생물학적 특성을 신속하고 정확히 측정할 수 있다.

산란된 빛은 레이저가 세포에 닿았을 때 주변으로 산란되는 빛이다. 전방 산란(FSC)은 레이저 광축에 대하여 정면에서 검출된다. 산란 광 강도는 세포의 표면적에 비례한다. 즉 FSC 값이 비교적 큰 경우에는 셀이 크고, FSC 값이 작으면 셀이 작다는 것을 알 수 있다. 측면 산란(SSC)은 레이저 광축에 90°(수직)인 위치에서 감지된다. 산란 광 강도는 세포 내 구조 또는 세포 과립의 상태에 비례한다. 즉 SSC 값이 비교적 큰 경우 셀의 내부 구조가 복잡하고 SSC 값이 작으면 셀의 내부 구조가 간단하다는 것을 알 수 있다.

유동 세포 계측법의 결과는 전형적으로 FSC를 X 축으로 하고 SSC를 Y 축으로하여 도트 플롯으로 표현할 수 있다. 각 셀은 그래프에서 단일 점 (점)으로 표시된다. 그 위치는 FSC 및 SSC의 상대 값에 의해 결정된다. 왼쪽 아래에는 상대적으로 작은 크기와 간단한 내부 구조를 가진 림프구가 나타나고 오른쪽 상단에 큰 크기의 과립구와 내부의 과립구가 표시되고 크기가 크고 내부 구조가 간단한 단핵 세포 림프구와 과립구는 서로 분리 된 개체군으로 디스플레이 된다.

형광은 세포를 표지하는 형광 안료가 조사된 레이저 빔에 의해 여기되고 에너지를 방출 할 때 발생하는 빛을 의미한다. 유동 세포 계측기(예를 들면 제품명: Becton & Dickinson FACSCalibur)는 전형적으로 488nm 단일 파장 레이저 빔 및 635nm 단일 파장 레이저 빔을 조사한다. 세포 자체는 또한 약한 형광을 방출하는 특성을 가지고 있다(자가 형광). 그러나 실제로 형광을 이용하여 세포의 분자를 특이적으로 검출하고자하는 경우, 형광 안료를 미리 세포 또는 그 분자에 결합시키는 것이 필요하다. 예를 들면 FITC(Fluorescein isothiocyanate)는 488 nm의 여기 광을 흡수하며 주로 530 nm의 형광(녹색)을 방출한다. 미리 항체를 FITC로 표지하면 세포 표면의 항원량에 따라 달라지는 항체 양이 달라지므로 FITC의 형광 강도가 달라진다.

따라서 세포 표면에 존재하는 항원의 양을 추정할 수 있다. 예를 들면 사용될 수 있는 FACSCalibur 에는 4 개의 형광 검출기가 설치되어 있으며 서로 다른 형광 파장 영역을 감지할 수 있다. 서로 다른 파장의 빛을 방출하는 여러 개의 형광 안료가 준비되면 최대 4 개의 다른 항원을 동시에 감지할 수 있다. FITC 이외의 형광 색소로서 488 nm 단일 파장의 레이저 광선에 의해 PE(Phycoerythrin)가 주로 585 nm의 형광을 내고, PerCP(Peridinin chlorophyll protein)와 PE-Cy5(carbocyanin-5)는 주로 670 nm 형광을 발산한다. 635 nm 단일 파장 레이저 빔에 의해 여기 되는 형광 안료인 APC(알로 피코시아닌)는 주로 670 nm의 형광을 방출한다. 이러한 형광 안료는 다양한 항체와 결합되어 세포의 이중 또는 삼중 염색에 사용된다. T 림프구 표면에 발현되는 CD4, CD8, CD62L, CD25, Foxp3 분자 등은 특이적으로 반응하는 단일클론 항체로 검출할 수 있다.

엄밀히 말하면 세포를 분석하는 장비와 분석된 세포를 분류 할 수 있는 장비인 두 가지 유형의 유동 세포 계측기가 있다. 후자는 "FACS" 라고 한다. 본 명세서에 사용된 "FACS"는 형광 활성화된 세포 분류기의 약자이며, 레이저 빔을 이용하여 림프구와 같은 자유 세포의 표면 항원을 분석하거나 표면 항원 또는 그의 유사체의 존재 또는 부재를 통해 특정 세포를 분류하는 방법에 사용되는 장치를 말한다.

유동 세포 계측법의 결과는 히스토그램, 도트 플롯(dot plot) 등으로 표시될 수 있다.

본 명세서에서, "히스토그램" 은 유동 세포 계측기를 사용하여 형광 측정에서 X축 상의 각 파라미터의 광 신호 세기 및 Y축 상의 셀 카운트를 나타내는 그래프를 말한다. 그러한 형태로 총 1만개 이상의 세포를 계수할 수 있다.

본원에서 사용 된 "도트 플롯(dot plot)"은 X 및 Y축 상의 2가지 유형의 형광 안료의 형광 강도의 플롯을 나타낸다. 이중 또는 삼중 염색 분석에서 이것은 각각의 형광 세기가 X 또는 Y축 상에 위치되고 개별 세포가 2 차원 그래프상의 각 점에 대응하는 표시 방법을 사용하여 분석될 수 있다.

예를 들면 말초 혈액 또는 골수를 채취한 후, 용혈법 또는 비중 원심 분리법에 의해 적혈구를 제거한 후, 잔류물을 형광 표지 항체(주목 항원 항체 및 대조군 항체)와 반응시켜 유동 세포 계측법을 이용한 관찰용으로 충분히 세정한다. 검출된 산란광 또는 형광은 전기 신호로 변환되어 컴퓨터에 의해 분석된다. 결과는 FSC의 강도를 세포 크기 및 SSC의 강도를 세포 내 구조로 표시함으로써 림프구, 단핵 세포 및 과립구를 구별할 수 있다. 그 후 세포내의 항원 발현 양상을 조사하기 위해 필요할 때마다 관심 있는 세포 집단을 게이팅한다.

본 발명의 실시에 있어서, 당업자는 세포를 분별 또는 계수하기 위 나타낸 세포의 표면 마커를 적절히 확인할 수 있다. CD 항원은 국제 워크샵에서 합의된 항원의 생화학적 특성(특히 분자량)에 의해 클러스터로 분류(클러스터링) 되었다. 이를 CD 분류라고 한다. 특정 백혈구 분화 항원을 인식하는 많은 유형의 단일클론 항체는 단일 관례, 즉 CD 다음에 숫자, 즉 CD 번호(즉, CD1, CD2 등)인 것으로 명명된다.

본 명세서에서 사용되는 CD 마커를 포함하는 세포 표면 마커의 전형적인 예는 이하에 설명한다.

CD4 (6.2) : 항원 제시 세포에서 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합하고 T 림프구 항원 수용체 복합체의 보조 수용체로서 기능한다. CD4는 MHC 클래스 Ⅱ 제한된 헬퍼 T 림프구에서 발현된다.

CD8 (6.4) : α와 β 사슬의 S-S 결합을 가진 이량체 단백질이다. CD8은 항원 제시 세포상의 MHC 클래스 Ⅰ 분자에 결합하고 T 림프구 항원 수용체 복합체의 보조 수용체로서 기능한다. CD8은 MHC 클래스 Ⅰ 제한 킬러 T 림프구에서 발현된다.

CD25 : CD25는 저 친화도 인터루킨-2 수용체 α 쇄 (IL-2Rα)로도 알려져 있는 55 kDa 당 단백질이다. CD25는 활성화 T-세포, B 세포 및 대식세포 및 조절 T-세포로 작용하는 일부 비활성화 CD4⁺ T-세포 내에서도 발현된다. 따라서 CD25는 조절 T-세포에 대한 마커로 이용된다.

CD62L : CD62L (L- 셀렉틴)은 림프관에 특이적으로 존재하는 고 내피 세포(HEV)를 인식하고 호밍하기 위해 필요한 분자이다. 나이브 T-세포는 이 분자를 가지고 있어서 림프관 기관 및 항원 제시를 통한 순환을 준비한다. 나이브 T-세포는 림프관 기관에서 수상 돌기 세포가 나타내는 항원을 T-세포 수용체로 인식하고 이펙터 T-세포에 뇌관을 씌우는 것으로 인식하면 호밍 분자가 소실된다. 따라서 항원 인식에 의해 자극되고 복제되고 확장된 이펙터 T-세포는 CD62L^low표현형을 지닌다.

Foxp3 : Foxp3은 조절 T-세포(Treg)의 마스터 전사 인자, 즉 Tregs의 분화 상태의 모든 분화/기능 발현/유지에 필수적인 역할을 하는 전사 인자이다. 발현이 Treg에 거의 특이적이기 때문에, Foxp3는 Tregs 를 동정하기위한 마커 분자로 일반적으로 사용된다. Foxp3은 이펙터 사이토카인(IL-2, IFNγ, IL-4, IL-17 등)의 생성을 억제하면서 CD25 또는 CTLA4 발현을 증가시킨다.

PD-1은 T-세포 고갈 현상에 깊이 관련되어 있다. 간단히 말해서 이 현상은 다량 및 장기간 존재하는 항원에 대한 T-세포 반응이 감쇠되는 것이다. 비록 나이브 T-세포가 항원 제시 세포에 의한 프라이밍(priming)으로 인해 높은 이펙터 기능을 갖는 T-세포가 되더라도, T-세포는 연장된 기간 동안 항원 제시에 노출되면 PD-1 → LAG-3 → CD244와 면역 체크 포인트 분자가 발현하여 기능을 상실하고 궁극적으로 세포 사멸을 일으킨다. 암세포가 "다량" 및 "장시간 동안" 존재하기 때문에 이러한 시스템이 효과가 있음을 알 수 있다.

(CD62L^lowCD4⁺ T-세포 주입에 의한 암의 예방/치료 효과)

본 발명의 다른 실시형태는 특정 세포 또는 그 조성물의 주입에 의한 암 면역요법의 치료 효과를 개선 또는 유지/지속하는 방법이다.

CD62L^lowCD4⁺ T-세포는 암 면역요법의 피험자의 반응에서 중요하다는 것이 밝혀졌다. 이러한 T-세포의 사용은 피험자의 암 면역요법에 대한 반응성을 향상 시키거나 유지할 수 있는 것으로 이해된다. 본 발명의 하나의 실시형태는 CD62L^lowCD4⁺ T-세포를 포함하는 조성물이다. CD62L^lowCD4⁺ TT-세포 또는 이를 포함하는 조성물은 암 면역요법과 병용하는데 유용하다.

이론에 구속되기를 바라지는 않지만, PD-1 저해제 및/또는 PD-L1 저해제가 암 예방/치료의 충분한 효과를 얻지 못하는 환자에 대한 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 주입으로 인한 치료 효과는 다음과 같이 이해될 수 있다.

암세포 표면에 발현된 PD-L1이 T-세포 표면에 발현된 PD-1에 결합하면 T-세포에 의한 항 종양 효과가 억제된다(암세포에 의한 면역 회피 기전).항 PD-1 항체는 PD-L1과 PD-1 사이의 결합을 억제하고 암 세포에 의한 면역 회피 기전을 차단하여 T-세포에 의한 항 종양 효과를 발휘할 수 있는 항체 분자이다. 따라서, PD-1/PD-L1 결합의 저해에 의한 항 종양 효과는 주로 T-세포가 종양을 공격하는 이펙터 단계에서 발휘되는 반면, T-세포 프라이밍 단계에서의 효과는 낮다는 것이 이해된다. 즉, 이미 PD-1 또는 PD-L1 억제제가 T-세포 프라이밍 및 충분한 이펙터 T-세포가 없는 한 항 종양 효과를 발휘하는 것이 어렵다. 최대 항 종양 효과는 암 환자의 약 20 % 내지 30 %에서 항 PD-1 항체에 의해 발휘되지만, 항 PD-1 항체가 항 종양 효과를 발휘하는 데 필요한 T-세포 면역 상태 및 그러한 면역 상태를 평가하는 방법은 알려지지 않았다.

CD62L (L- 셀렉틴)은 림프구의 "호밍 수용체" 이다. CD62L은 미성숙 T-세포의 세포 표면에 발현되어 림프절로의 이동을 촉진한다. 림프절의 나이브 T-세포가 항원 제시 세포에 의해 항원 자극을 받게 되면, CD62L 발현 수준이 낮아지고 ( CD62L^low), CD4⁺ T-세포( 헬퍼 T-세포) 또는 CD8⁺ T-세포 (세포 독성 T-세포)로 분화된다. 본 발명자들은 CD62L^low T-세포가 암 항원이 알려지지 않고 암 항원 특이적 T-세포가 확인될 수 없는 상황 하에서 암 항원에 의해 프라이머 처리된 T-세포를 확인하는 방법으로서 매우 효과적이라는 것을 발견하였다. 마우스 모델에서 종양 부위 림프절과 분리된 CD62L^low T-세포는 암을 치료하기 위해 입양 될 수 있다.

이러한 방식으로 분리된 이펙터 T-세포의 사용은 CD62L^low CD4⁺ T-세포 (실시예 4 및 도 14)를 도입함으로써 보다 큰 항 종양 효과를 달성하였다. 이 실험에 사용된 종양 시스템을 포함한 대부분의 암 세포는 MHC 클래스 Ⅱ 항원을 발현하지 않는다. 따라서 CD62L^low CD4⁺ T-세포의 높은 항 종양 효과는 직접 세포 파괴 기능에 영향을 미치지 않고, 대신 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포의 기능이 전체 T-세포 면역을 조율하는 것으로 이해된다. 탁월한 항 종양 효과는 CD62L^low CD8⁺ T-세포를 CD62L^low CD4⁺ T-세포와 함께 사용될 때 또한 달성되었다(실시예 4 및 도 14).

본 발명자들은 모든 T-세포에서 CD62L^low CD4⁺ T-세포의 비율이 항 PD-1 항체의 항 종양 효과와 명확하게 상관된다는 것을 발견했다. 즉, CD62L^low CD4⁺ T-세포 를 포함하는 것이 필수적이며, 항-PD-1 항체로 항 종양 효과를 발휘하기 위해 항 종양 효과를 나타내는 T-세포이다.

또한 이론에 구속되기를 바라지는 않지만, 일반적으로 항 종양 효과를 발휘하기에 충분한 T-세포 면역이 준비되지만, CD62L^low CD4⁺ T-세포가 많이 존재하는 암 환자에서 PD-1/PD-L1의한 항원 인식 신호의 감쇠로 인해 면역이 회피된다는 것이 발견되었다. CD62L^low CD4⁺ T-세포는 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포를 활성화시켜 프라이밍 단계를 활성화시킨다.

또한, 감작된 CD8⁺ T-세포는 세포 독성 기능을 얻기 위해 이펙터 CD4⁺ T-세포에 의해 활성화된 국소 항원 제시 세포로부터 항원 제시를 받아야한다. 이와 관련하여 주로 작동기 상에서 항원 인식 신호의 감쇠를 회복시키는 PD-1 / PD-L1 결합 억제제는 작동기 CD4⁺ T-세포의 기능에 상보적임을 이해할 수 있다. 다량의 CD62L^low CD4⁺ T-세포를 함유하지 않는 환자에서 항 PD-1 항체로 면역 회피 기전이 차단되더라도 암 항원을 나타내야하는 항원 제시 세포 기능은 여전히 억제된다는 것이 이해된다. 세포가 불충분한 항 종양 효과를 초래한다.

상기와 관련하여, CD62L^low CD4⁺ T-세포의 투여는 낮은 CD62L^low CD4⁺ T-세포 수를 갖는 환자에서 항 PD-1 항체로 항 종양 효과를 발휘하여 항 종양을 유도하나 PD-1 항체와 함께 발휘되지 않음이 이해 될 수 있다.

(세포 함유 조성물의 제조 및 사용)

인간으로부터 유래된 T-세포 집단으로부터 CD62L^low CD4⁺ T-세포를 정제하는 것을 포함하는 단계로 CD62L^low CD4⁺ T-세포를 포함하는 조성물을 제조 할 수 있다. 정제는 T-세포 집단으로부터 CD62L 고 발현 세포를 제거하는 것을 포함할 수 있다(음성 선별). 항체 및/또는 자성 비드 등을 사용한 음성 선별에 의한 CD62L^low CD4⁺ T-세포의 정제가 바람직한데 이는 항체 또는 자성 비드는 사용되는 세포 상에 남아 있지 않기 때문이다.

본 발명의 하나의 실시형태는 CD62L^low CD4⁺ T-세포를 정제하기 위해 CD62L에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 키트이다. CD62L에 특이적으로 결합하는 물질의 예는 CD62L에 특이적인 항체를 포함 하나 이에 한정되지 않는다. 당업자는 본원에 개시된 방법, 예를 들어 유동 세포 계측법에 따라 본원에 개시된 특정 T-세포 하위 집단을 분리 및 확장시킬 수 있다. 한 실시형태에서 본원에 개시된 조성물은 CD62L^low CD4⁺ T-세포를 제공한다.

T 림프구는 공지된 기술에 따라 수집되고, 유동 세포 계측법 및/또는 면역 자기 선택과 같은 항체에 대한 친화성 결합과 같은 공지된 기술에 의해 농축되거나 고갈될 수 있다. 농축 및/또는 고갈 단계 후, 원하는 T 림프구의 시험관 내 증식은 공지된 기술 (Riddell 등의 미국 특허 제 6040177 호에 개시된 기술을 포함하지만 이에 한정되지는 않음) 또는 이의 변형예를 통해 당업자에게 명백히 실시할 수 있을 것이다.

예를 들어, 원하는 T-세포 집단 및 아집단은 시험관 내에서 배지에 최초 T 림프구 집단을 첨가 한 후, 피더 세포를 배지에 첨가함으로써 (예를 들어, 생성된 세포 집단이 증식하려는 최초의 집단내의 각각의 T-세포에 대해 적어도 약 5개, 10개, 20개, 40개 이상의 피더 세포를 포함하도록)를 배양하고 배양물을 인큐베이션시킨다.(예를 들어, T-세포의 수를 증가시키기에 충분한 시간 동안). 배양물은 전형적으로 T 림프구의 증식에 적합한 온도와 같은 조건 하에서 인큐베이션 시킬 수 있다. 인간 T 림프구의 성장을 위해 온도는 일반적으로 예를 들면 적어도 약 25 ℃ 바람직하게는 적어도 약 30 ℃, 보다 바람직하게는 약 37 ℃ 이다.

세포는 분리 및/또는 증식될 수 있고 필요에 따라 저장될 수 있으며 이후 본원에 개시된 방법 또는 당업계에 공지된 방법에 따라 대상에게 투여 될 수 있다.

본 발명의 세포를 포함하는 조성물에서 관심있는 세포(예컨대, CD62L^low CD4⁺ T-세포)의 양은 의도된 효과가 발휘되도록 당업자에 의해 적절하게 결정될 수 있으며, 예를 들면 인간 투여용으로 최소 2×10⁸, 바람직하게는 최소 6×10⁸, 보다 바람직하게는 최소 2×10⁹ 이다.

본원에 개시된 세포를 포함하는 조성물은 관심 세포(예를 들어, CD62L^low CD4⁺ T-세포) 이외에 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함 할 수 있다. 본 명세서에 사용 된 바와 같이, "약제학적으로 허용되는" 이란 정부 감독 당국에 의해 승인되거나 약전 또는 다른 일반적으로 인정되는 약전에 나열되어 동물 또는 보다 구체적으로 인간에 사용되는 것을 의미한다.

본원에 사용된 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 배양물, 주입용액, 관류 액, 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 의미한다. 본 발명의 세포를 포함하는 조성물은 세포를 주성분으로 하여 배양액, 주입액 또는 관류액 등을 세포에 바람직하게 유지할 수있다. 예를 들면 약제학 조성물이 정맥 내 투여되는 경우, 식염수 및 수성 덱스트로스가 바람직한 담체이다. 바람직하게는, 주사 가능한 용액의 액체 담체로서 식염수 수용액 및 덱스트로스 및 글리세롤 수용액이 사용된다. 약제가 경구 투여되는 경우, 물은 바람직한 담체이다. 부형제의 예로는 경질 무수 규산, 결정 셀룰로오스, 만니톨, 전분, 포도당, 락토오스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악질, 실리카겔, 스테아린산나트륨, 글리세릴모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 중질지방산트리글리세라이드, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유 60, 정제당, 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐피롤리돈, 폴리옥시에틸렌경화피마자유, 폴리비닐피롤리돈, 옥수수 전분, 무기염 등을 들 수 있다.

원하는 경우 조성물은 소량의 보습제 또는 유화제 또는 pH 완충제를 함유 할 수 있다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 서방형 제형 등의 형태일 수 있다. 조성물은 또한 전통적인 결합제 및 트리글리세리드와 같은 담체를 사용하여 좌약으로 제제화 될 수 있다. 경구 제제는 또한 의료용 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘스테아레이트, 사카린나트륨, 셀룰로스 또는 탄산마그네슘과 같은 표준 담체를 포함 할 수 있다. 적합한 담체의 예는 E. W. Martin, Remington 's Pharmaceutical Sciences (Mark Publishing Company, Easton, U.S.A)에 개시되어 있다. 이러한 조성물은 환자에게 투여하기에 적합한 형태로 제공되는 적절한 양의 담체와 함께 치료학적 유효량의 치료제, 바람직하게는 정제 형태로 치료제를 함유한다.제제는 투여 방식에 적합해야 한다. 제형은 예를 들어 계면활성제, 부형제, 착색제, 향료, 방부제, 안정제, 완충제, 용해제, 등장화제, 결합제, 붕해제, 윤활제, 흐름촉진제, 교정제 등을 추가로 포함할 수 있다.

(바람직한 실시형태)

하나의 실시형태에서 본 발명의 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 식의 변수(지표)는 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; CCR7^-CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RA^-CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RO⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; CCR4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD4⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 양; CD4⁺Foxp3⁺T-세포 아집단의 양; Foxp3⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; HLA-DR⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD80⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD86⁺ 수지상 세포 아집단의 양; PD-L1⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 양; CD137⁺CD8⁺ T-세포 아집단의 양; 및 CD28⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 양;으로 이루어진 군에서 선택된 것이다.

본 발명의 하나의 실시형태는 항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 상대량; 항-종양 면역 반응에서 CD4⁺ T-세포에 의한 수지상 세포 자극과 관련 있는 수지상 세포 아집단의 상대량; 항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD8⁺ T-세포 아집단의 상대량; 조절 T-세포와 관련 있는 CD4⁺ T-세포 또는 조절 T-세포의 상대량; 및 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 상대량;에서 선택된 양을 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 식의 변수(지표)로서 피험자의 함량으로 사용하는 방법이다.

하나의 실시형태에서 본 발명의 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 식의 변수(지표)는 CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CCR7^-CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CD45RA^-CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CD45RO⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내에서 LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내에서 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CCR4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CD4⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서CD4⁺Foxp3⁺T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 Foxp3⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; 수지상 세포 내에서 HLA-DR⁺ 수지상 세포 아집단의 비율; 수지상 세포 내에서 CD80⁺ 수지상 세포 아집단의 비율; 수지상 세포 내에서 CD86⁺ 수지상 세포 아집단의 비율; 수지상 세포 내에서 PD-L1⁺ 수지상 세포 아집단의 비율; CD8⁺ T-세포 내에서 CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 비율; CD8⁺ T-세포 내에서 CD137⁺CD8⁺ T-세포 아집단의 비율; 및 CD62L^lowCD8⁺ T-세포 내에서 CD28⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 비율;으로 이루어진 군에서 선택된 것이다.

본 발명의 하나의 실시형태는 항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 항-종양 면역 반응에서 CD4⁺ T-세포에 의한 수지상 세포 자극과 관련 있는 수지상 세포 아집단의 양; 항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD8⁺ T-세포 아집단의 양; 및 조절 T-세포와 관련 있는 CD4⁺ T-세포 또는 조절 T-세포의 양; 에서 선택된 양을 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 식의 변수(지표)로서 피험자의 함량으로 사용하는 방법으로 상기 함량이 임계치(무 효과 그룹 임계치)보다 높으면 암 면역요법과 관련하여 피험자가 무 효과 그룹의 일부가 아님을 나타내는 것이다.

하나의 실시형태에서 본 발명의 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 식의 변수(지표)는 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; LAG3⁺CD62L^low CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CCR7^-CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RA^-CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RO^-CD4⁺ T-세포 아집단의 양; HLA-DR⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD80⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD86⁺ 수지상 세포 아집단의 양; PD-L1⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 양; CD137⁺CD8⁺ T-세포 아집단의 양; CD28⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 양; CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺T-세포 아집단의 양; CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CCR4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양;으로 이루어진 군에서 선택된 것으로 상기 함량이 임계치(무 효과 그룹 임계치)보다 높으면 암 면역요법과 관련하여 피험자가 무 효과 그룹의 일부가 아님을 나타내는 것이다.

본 발명의 하나의 실시형태는 항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 상대량; 항-종양 면역 반응에서 CD4⁺ T-세포에 의한 수지상 세포 자극과 관련있는 수지상 세포 아집단의 상대량; 항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD8⁺ T-세포 아집단의 상대량; 및 조절 T-세포와 관련 있는 CD4⁺ T-세포 또는 조절 T-세포의 상대량; 에서 선택된 상대량을 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 식의 변수(지표)로서 피험자의 함량으로 사용하는 방법으로 상기 함량이 임계치(무 효과 그룹 임계치)보다 높으면 암 면역요법과 관련하여 피험자가 무 효과 그룹의 일부가 아님을 나타내는 것이다.

본 발명의 실시형태에서 본 발명의 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 식의 변수(지표)는 CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내에서 LAG3⁺CD62L^low CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CCR7^-CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CD45RA^-CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CD45RO^-CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; 수지상 세포 내에서 HLA-DR⁺ 수지상 세포 아집단의 비율; 수지상 세포 내에서 CD80⁺ 수지상 세포 아집단의 비율; 수지상 세포 내에서 CD86⁺ 수지상 세포 아집단의 비율; 수지상 세포 내에서 PD-L1⁺ 수지상 세포 아집단의 비율; CD8⁺ T-세포 내에서 CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 비율; CD8⁺ T-세포 내에서 CD137⁺CD8⁺ T-세포 아집단의 비율; CD62L^lowCD8⁺ T-세포 내에서 CD28⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CCR4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율;로 이루어진 군에서 선택된 것으로 상기 함량이 임계치(무 효과 그룹 임계치)보다 높으면 암 면역요법과 관련하여 피험자가 무 효과 그룹의 일부가 아님을 나타내는 것이다.

본 발명의 하나의 실시형태는 항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 항-종양 면역 반응에서 CD4⁺ T-세포에 의한 수지상 세포 자극과 관련 있는 수지상 세포 아집단의 양; 항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD8⁺ T-세포 아집단의 양; 및 조절 T-세포와 관련 있는 CD4⁺ T-세포 또는 조절 T-세포의 양;에서 선택된 양을 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 식 F(X,Y)의 변수(지표)로서 사용하는 방법으로 상기 식 F(X,Y)가 임계치(무 효과 그룹 임계치)보다 높으면 암 면역요법과 관련하여 피험자가 무 효과 그룹의 일부가 아님을 나타내는 것이다.

하나의 실시형태에서 본 발명의 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 식 F(X,Y)의 변수(지표) X 는 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; LAG3⁺CD62L^low CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CCR7^-CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RA^-CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RO^-CD4⁺ T-세포 아집단의 양; HLA-DR⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD80⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD86⁺ 수지상 세포 아집단의 양; PD-L1⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 양; CD137⁺CD8⁺ T-세포 아집단의 양; 및 CD28⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 양; 으로 이루어진 군에서 선택된 변수로 하여 식 F(X,Y)를 통해 계산 될 수 있다.

하나의 실시형태에서 본 발명의 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 식의 변수(지표) Y 는 CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺T-세포 아집단의 양; CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CCR4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 및 CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양;으로 이루어진 군에서 선택된 변수로 하여 식 F(X,Y)를 통해 계산될 수 있다. 식 F(X,Y)이 임계치(무 효과 그룹 임계치)보다 높으면 암 면역요법과 관련하여 피험자가 무 효과 그룹의 일부가 아님을 나타내는 것이다.

본 발명의 하나의 실시형태는 항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 상대량; 항-종양 면역 반응에서 CD4⁺ T-세포에 의한 수지상 세포 자극과 관련 있는 수지상 세포 아집단의 상대량; 항-종양 면역 반응에서 수지상 세포 자극과 관련 있는 CD8⁺ T-세포 아집단의 상대량; 및 조절 T-세포와 관련 있는 CD4⁺ T-세포 또는 조절 T-세포의 상대량; 에서 선택된 상대량을 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 식 F(X,Y)의 변수(지표)로서 사용하는 방법으로 상기 식 F(X,Y)가 임계치(무 효과 그룹 임계치)보다 높으면 암 면역요법과 관련하여 피험자가 무 효과 그룹의 일부가 아님을 나타내는 것이다.

하나의 실시형태에서 본 발명의 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 식 F(X,Y)의 변수(지표) X는 CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내에서 LAG3⁺CD62L^low CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CCR7^-CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서CD45RA^-CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CD45RO^-CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; 수지상 세포 내에서 HLA-DR⁺ 수지상 세포 아집단의 비율; 수지상 세포 내에서 CD80⁺ 수지상 세포 아집단의 비율; 수지상 세포 내에서 CD86⁺ 수지상 세포 아집단의 비율; 수지상 세포 내에서 PD-L1⁺ 수지상 세포 아집단의 비율; CD8⁺ T-세포 내에서 CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 비율; CD8⁺ T-세포 내에서 CD137⁺CD8⁺ T-세포 아집단의 비율; 및 CD62L^lowCD8⁺ T-세포 내에서 CD28⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 비율;로 이루어진 군에서 선택된 변수로 하여 식 F(X,Y)를 통해 계산될 수 있다.

하나의 실시형태에서 본 발명의 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 식 F(X,Y)의 변수(지표) Y는 CD4⁺ T-세포 내에서 CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CCR4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율;로 이루어진 군에서 선택된 변수로 하여 식 F(X,Y)를 통해 계산 될 수 있다. 식 F(X,Y)이 임계치(무 효과 그룹 임계치)보다 높으면 암 면역요법과 관련하여 피험자가 무 효과 그룹의 일부가 아님을 나타내는 것이다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 식 F(X,Y)이 임계치(무 효과 그룹 임계치)보다 높으면 암 면역요법과 관련하여 피험자가 무 효과 그룹의 일부가 아님을 나타내는 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하는 방법인 것이다. 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하는 변수(지표)로 하여 식 F(X,Y)를 통해 계산될 수 있다.

변수(지표) X는 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; LAG3⁺CD62L^low CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CCR7^-CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RA^-CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD80⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 양; CD137⁺CD8⁺ T-세포 아집단의 양; 및 CD28⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 양;으로 이루어진 군에서 선택된 변수로 하고,

변수(지표) Y는 CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺T-세포 아집단의 양; CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 및 CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양;으로 이루어진 군에서 선택된 변수로 한다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 식 F(X,Y)가 임계치(무 효과 그룹 임계치)보다 높으면 암 면역요법과 관련하여 피험자가 무 효과 그룹의 일부가 아님을 나타내는 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하는 방법인 것이다. 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하는 변수(지표)로 하여 식 F(X,Y)를 통해 계산 될 수 있다.

변수(지표) X는 CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내에서 LAG3⁺CD62L^low CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CCR7^-CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서CD45RA^-CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; 수지상 세포 내에서 CD80⁺ 수지상 세포 아집단의 비율; CD8⁺ T-세포 내에서 CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 비율; CD8⁺ T-세포 내에서 CD137⁺CD8⁺ T-세포 아집단의 비율; 및 CD62L^lowCD8⁺ T-세포 내에서 CD28⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 비율;로 이루어진 군에서 선택된 변수로 하고,

변수(지표) Y는 CD4⁺ T-세포 내에서 CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내에서 CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; 및 CD4⁺ T-세포 내에서 CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율;로 이루어진 군에서 선택된 변수로 한다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 환자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하는 방법으로서, 식 F(X, Y)가 임계치(무 효과 그룹 임계치)보다 높으면 피험자가 암 면역요법에 대해 무 효과 그룹의 일부가 아님을 나타낸다.

피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 식의 변수(지표)로서 CD62L lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; CCR7^-CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RA^-CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD80⁺ 수지상 세포 아집단의 양; CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 양; CD137⁺CD8⁺ T-세포 아집단의 양; 및 CD28⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 양;으로 이루어진 군에서 선택된 값을 (X)로 하고 CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 양; CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 및 CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양;으로 이루어진 군에서 선택된 양을 (Y)로 하여 식 F(X,Y)가 계산될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하는 방법으로서, 식 F(X, Y)가 임계치(무 효과 그룹 임계치)보다 높으면 피험자가 암 면역요법에 대해 무 효과 그룹의 일부가 아님을 나타낸다.

피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 식의 변수(지표)로서 CD4⁺ T-세포 내의 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내의 LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내의 CCR7^-CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내의 CD45RA^-CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; 수지상 세포내의 CD80⁺ 수지상 세포 아집단의 비율; CD8⁺ T-세포 내의 CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 비율; CD8⁺ T-세포 내의 CD137⁺CD8⁺ T-세포 아집단의 비율; 및 CD62L^lowCD8⁺ T-세포 내의 CD28⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단의 비율;로 이루어진 군에서 선택된 값을 (X)로 하고,

CD4⁺ T-세포 내의 CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내의 CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; 및 CD4⁺ T-세포 내의 CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율;로 이루어진 군에서 선택된 양을 (Y)로 하여 식 F(X,Y)가 계산될 수 있다.

X에 대해 단조롭게 증가하고 Y에 대해 단조롭게 감소하는 X 및 Y의 임의의 함수 (F(X, Y))가 상기한 식 F(X, Y)로서 사용될 수 있다. 반응성을 나타내는 식 F(X, Y)의 예에는 F = X^r * Y^s가 포함된다. 이때 r 및 s는 임의의 실수이다. X가 반응성과 양의 상관관계를 갖고 Y가 반응성과 음의 상관관계를 갖는 경우 r이 양수이고 s가 음수인 것이 바람직하다.

식을 단순화하기 위해 r 및 s에 정수를 사용할 수 있다. 예를 들면 F(X, Y)는 Xⁿ * Y^m으로 나타낼 수 있다. 여기서 n과 m은 임의의 정수이다. 본 발명자들의 연구는 -3 내지 3 범위의 r 및 s를 지니는 식을 사용하여 피험자의 암 면역요법에 대한 반응성이 정확하게 예측될 수 있음을 나타내었다. 바람직한 형태의 식의 예로는 X/Y, X²/Y, X*Y 등이 있다.

본 발명의 하나의 실시형태는 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 식의 변수(지표)로서 무 효과 그룹의 일부가 아닌 것으로 결정된 피험자 내의 조절 T-세포 또는 조절 T-세포와 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 양; ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; 및 PD-1⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; 에서 선택된 양을 사용하는 방법이며 이때 임계치(무 효과 그룹 임계치)보다 높은 지표 식은 피험자가 암 면역요법에 대해 반응 그룹의 일부임을 나타낸다.

하나의 실시형태에서 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 식의 변수(지표)는 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD4⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 양; CD4⁺Foxp3⁺ T-세포 아집단의 양 ;CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 양; CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CCR4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; 및 PD-1⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양;으로 이루어진 군에서 선택된다.

본 발명의 하나의 실시형태는 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 식의 변수(지표)로서 무 효과 그룹의 일부가 아닌 것으로 결정된 피험자 내의 조절 T-세포 또는 조절 T-세포와 관련있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 상대 양; ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 상대량; LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 상대량; PD-1⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 상대량; 에서 선택된 상대량을 사용하는 방법이며 이때 임계치(반응 그룹 임계치)보다 높은 지표 식은 피험자가 암 면역요법에 대해 반응 그룹의 일부 임을 나타낸다.

하나의 실시형태에서 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 식의 변수(지표)는 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내의 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내의 CD4⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내의 CD4⁺Foxp3⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내의 CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내의 CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내의 CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내의 CCR4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내의 CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내의 LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율; 및 CD4⁺ T-세포 내의 PD-1⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율;로 이루어진 군에서 선택된다.

본 발명의 하나의 실시형태는 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 식 J(W, Z)의 변수(지표)로서 무 효과 그룹의 일부가 아닌 것으로 결정된 피험자 내의 조절 T-세포 또는 조절 T-세포와 관련있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 및 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양; 에서 선택된 양 (W, Z)를 사용하는 방법이며 이때 식 J(W, Z)가 임계치(반응 그룹 임계치)보다 높으면 식 J(W, Z)는 피험자가 암 면역요법에 대해 반응 그룹의 일부임을 나타낸다.

하나의 실시형태에서 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 식 J(W, Z)의 변수(지표)로서 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양을 (Z)로 하고, CD4⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 양; CD4⁺Foxp3⁺ T-세포 아집단의 양; CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 양; CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양;CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CCR4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 및 CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양;으로 이루어진 군에서 선택된 값을 (W)로 하여 식 J(W, Z)가 계산될 수 있다.

식 J(W, Z)가 임계치(반응 그룹 임계치)보다 높으면 피험자가 암 면역요법에 대해 반응 그룹의 일부임을 나타낸다.

본 발명의 하나의 실시형태는 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 식 J(W, Z)의 변수(지표)로서 무 효과 그룹의 일부가 아닌 것으로 결정된 피험자 내의 조절 T-세포 또는 조절 T-세포와 관련 있는 CD4⁺ T-세포 아집단의 상대량; 및 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 상대량;에서 선택된 양 (Z, W)를 사용하는 방법이다.

이때 식 J(W, Z)가 임계치(무 효과 그룹 임계치)보다 높으면 피험자가 암 면역요법에 대해 반응 그룹의 일부임을 나타낸다.

하나의 실시형태에서 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 식 J(W, Z) 의 변수(지표)로서 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내의 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율을 (Z)로 하고 CD4⁺ T-세포 내의 CD4⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내의 CD4⁺Foxp3⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내의 CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내의 CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율;CD4⁺ T-세포 내의 CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내의 CCR4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내의 CCD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율;로 이루어진 군에서 선택된 값을 (W)로 하여 식 J(W, Z)가 계산될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 무 효과 그룹의 일부가 아닌 것으로 결정된 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하는 방법으로서, 임계치(반응 그룹 임계치)보다 높은 식 J(W, Z)는 피험자가 암 면역요법에 대해 반응 그룹의 일부임을 나타낸다.

피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 식 J(W, Z)의 변수(지표)로서 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양을 (Z)로 하고 CD4⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 양; CD4⁺Foxp3⁺ T-세포 아집단의 양; CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 양; CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 및 CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 으로 이루어진 군에서 선택된 값을 (W)로 하여 식 J(W, Z)가 계산될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 무 효과 그룹의 일부가 아닌 것으로 결정된 피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하는 방법으로서, 식 J(W, Z)가 임계치(반응 그룹 임계치)보다 높으면 피험자가 암 면역요법에 대해 반응 그룹의 일부임을 나타낸다.

피험자의 암 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 식 J(W, Z)의 변수(지표)로서 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 비율을 (Z)로 하고 CD4⁺ T-세포 내의 CD4⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내의 CD4⁺Foxp3⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내의 CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내의 CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율; CD4⁺ T-세포 내의 CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 비율;로 이루어진 군에서 선택된 값을 (W)로 하여 식 J(W, Z)가 계산될 수 있다.

Z에 대해 단조롭게 증가하고 W에 대해 단조롭게 증가하는 Z 및 W의 임의의 함수 J(Z, W)가 상기한 식 J(Z, W)로서 사용될 수 있다. 반응성을 나타내는 식 J(Z, W)의 예는 J = Z^r * W^s를 포함하며, 이때 r 및 s는 임의의 실수이다.

Z가 반응성과 양의 상관관계가 있고 W가 반응성과 음의 상관관계를 있으면 r은 양수이고 s는 음수인 것이 바람직하다. 식을 단순화하기 위해 r 및 s에 정수를 사용할 수 있다. 예를 들면 J(Z, W)는 Zⁿ * W^m으로 나타낼 수 있으며 이때 n 및 m은 임의의 정수이다.

본 발명자들의 연구에 따르면 피험자의 암 면역요법에 대한 반응성이 -5 내지 6 범위의 r 및 s를 지니는 식을 사용하여 정확하게 예측될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 상기 식의 바람직한 형태의 예로는 Z/W, Z²/W, Z*W, Z*W⁵ 등이 있다.

상기 개시된 방법을 포함하여 본 명세서에 개시된 방법은 암 면역요법에 대해 무 효과 그룹의 일부가 아닌 것으로 나타난 피험자 및/또는 반응 그룹의 일부인 것으로 나타난 피험자에게 암 면역요법을 적용하기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 임의의 암 면역요법이 사용될 수 있다.

하나의 실시형태는 상기 개시된 사항을 포함하여 본 명세서에 개시된 방법을 사용함으로써 암 면역요법에 대해 무 효과 그룹의 일부가 아닌 것으로 나타난 피험자 및/또는 반응 그룹의 일부인 것으로 나타난 피험자 내에서 암을 치료하기 위한 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 본 명세서에 개시된 임의의 활성 성분을 포함할 수 있으며, 본 명세서에 개시된 임의의 구성을 지닐 수 있다.

(일반적인 기술)

본 명세서에서 사용된 분자생물학적 접근법, 생화학적 접근법 및 미생물학적 접근법은 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 Sambrook J. 등, (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor and its 3rd Ed.(2001); Ausubel, F. M. (1987). Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Ausubel, F.M. (1989). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Innis, M. A. (1990). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Ausubel, F. M. (1992). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Ausubel, F. M. (1995). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Innis, M. A. 등, (1995). PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F. M. (1999). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates; Sninsky, J. J. 등, (1999). PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press; Bessatsu Jikken Igaku [Experimental Medicine, Supplemental Volume], Idenshi Donyu Oyobi Hatsugen Kaiseki Jikken Ho [Experimental Methods for Transgenesis & Expression Analysis], Yodosha, 1997 등이다. 상기 문헌의 관련 부분(전체 문서일 수 있음)은 본 명세서에 참고로 통합된다.

본 명세서에 사용된 "또는"은 문장에 열거된 사안 중 "적어도 하나 이상"이 적용될 수 있을 때 사용된다. 본 명세서에서 "2개의 값"의 “범위 내”와 같이 명시적으로 기술된 경우, 그 범위는 또한 2개의 값 자체를 포함한다.

본 명세서에 인용된 과학 문헌, 특허 및 특허 출원과 같은 참고 문헌은 각 문헌의 전체가 구체적으로 개시된 것과 동일한 정도로 참고로서 본 명세서에 포함된다.

이상, 본 발명을 이해를 용이하게 하기 위한 바람직한 실시예를 나타내며 설명하였다. 이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 설명한다. 전술한 개시사항 및 하기 실시예는 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니며 예시의 목적으로 제공된다. 따라서 본 발명의 범위는 본 명세서에 구체적으로 개시된 실시형태 및 실시예에 의해 한정되지 않으며 청구범위에 의해서만 한정된다.

(실시예)

본 발명은 하기 실시예에 의해 예시된다.

(1) [마커 발명의 실시 가능성을 나타내는 실시예]

실시예 1 : 항 PD-1 항체 및 T-세포 집단 조성물의 치료 효과

본 실시예는 말초 혈액을 이용한 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 및 Foxp3⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포의 분석이 항 PD-1 항체 치료의 치료 효과를 예측할 수 있음을 입증한다.

(2) [세포 주입 발명의 실시 가능성을 나타내는 실시예]

실시예 2 : CD62L^low 세포를 주입시키는 가상 실시예

실시예 3 : 경과 관찰

실시예는 환자의 항-종양 면역 반응이 T-세포 조성물과 관련 있음을 나타낸다. 즉, CD62L^low 세포의 증가는 항-PD-1 요법으로 종양을 감소시키는 환자에서 항-종양 면역 반응을 향상시킨다.

실시예 4 : 마우스로의 세포 주입

실시예는 마우스에 CD62L^lowCD4⁺ T-세포를 주입함으로써 CD62L^lowCD4⁺ T-세포의 백분율이 증가함을 나타낸다. CD62L^lowCD4⁺ T-세포와 Treg의 비율이 증가하면 마우스에서 항-종양 면역 반응이 향상된다.

실시예 5 : CD62L^low 세포의 분리/확장

실시예는 CD62L^low 세포를 성공적으로 분리시키고 팽창시킬 수 있음을 나타낸다.

(실시예 1 : 항 PD-1 항체 및 T-세포 집단 조성물의 치료 효과)

1-1. 목적

본 실시예의 목적은 말초 혈액을 이용한 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 및 Foxp3⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포의 분석이 항-PD-1 항체 치료의 치료적 효과를 예측할 수 있음을 입증하기 위한 것이다. 항-PD-1 항체와 T-세포 집단 조성물의 치료 효과 사이의 관계를 조사하였다.

1-2. 재료 및 방법

도 2에 나타난 프로토콜에 따라 비소세포 폐암 환자에서 니볼루맙 치료의 효과를 연구하였다.

이미 치료를 받은 비소세포 폐암 환자로부터 니볼루맙 처리 전날 말초혈액을 채집하였다.

니볼루맙 처리 시작 8주째의 효과를 측정하기 위해 CT를 시행하였다. 이 시점에서 부분 반응(PR), 안정(SD) 및 진행성(PD)이 결정되었다. 결정의 기준은 RECIST ver. 1.1을 따른다. 다음 표 1은 환자의 특성을 나타낸다.

피험자의 말초 혈액 T-세포 집단의 조성을 다음과 같이 분석하였다.

(1) 혈액 채취

단핵 세포 분리용 혈액 채취 튜브(상품명: BD Vacutainer^(R) CPT^TM, BD 일본)에 혈액 8ml를 채취하고, 실온에서 완만하게 전도시켜 혼합하였다.

(2) 원심 분리(비중 원심 분리에 의한 단핵 세포의 분리)

혈액 채취 후 BD Vacutainer^(R) CPT^TM를 1500 내지 1800 × g에서 15 분간 원심 분리하였다 (원심 분리기 명칭/제조자: Kubota).

(3) 채취

겔 장벽 위의 세포 층을 방해하지 않도록 하여 혈장 층을 약 절반 흡인하였다. 파스퇴르(Pasteur) 피펫을 사용하여 겔 장벽 위의 세포층을 채취하고 50 ml 튜브(팔콘 튜브 등)에 옮겼다. 10 % 우태아 혈청을 첨가한 인산염 완충 평형 염 용액(10 % FBS PBS)을 30ml 이상이 되도록 첨가하였다. 혼합물을 원심 분리(4 ℃, 400 내지 450 g × 5 분)하고 2회 세척하였다.

(4) 세포 카운트

1차 세척/원심분리가 완료된 후 10 % FBS (56℃에서 30분 동안 불활성화)가 첨가된 PBS 10ml를 가하여 세포를 재부유 시켰다. 원심분리 튜브 내의 세포 현탁액 50㎕를 취하여 0.1 % 트립판 블루 용액(50㎕) 및 세포 현탁액을 교반하였다. Improved Neubauer 혈구계산판에서 세포를 이용하여 세포수를 카운트하였다.

(5) 동결

두 번째 세척/원심 분리가 완료된 후, CELLBANKER ™ 2(타카라 바이오사)를 사용하였다. 세포를 5× 10⁵ ~ 5× 10⁶ /ml로 재현탁시키고, 2.0ml의 cryogenic 바이알 (Corning)에 이송시켰다. 처리 후 신속하게 세포를 -80℃의 deep freezer(Panasonic)에서 동결시켰다. 상기 처리 24시간 후 및 1주일 후, 세포를 액체질소(액상)로 이송시켰다.

(6) 배양

냉동된 세포를 RPMI 1640 배지(FBS 10 %)에서 1 내지 5× 10⁵ /ml로 조정하고 T-25 세포 배양 플라스크에서 37 ℃ 5% CO₂에서 24 내지 36 시간 동안 배양하였다.

(7) 세포 조정

세포 배양액을 15 ml 원심분리 튜브에서 채취하고 1500 rpm에서 10 분간 원심분리하여 세포를 원심분리 튜브의 바닥에서 채집하였다. 원심분리 후, 상등액을 제거 하였다. 세포 펠렛에 FACS 완충액을 10ml 첨가하여 피펫으로 세포를 재현탁 시켰다. 세포를 1500 rpm에서 10 분간 원심분리한 후, 상등액을 흡인하였다. 최종 세포 농도가 1.0× 10⁶ 세포/ml가 되도록 세포를 카운트하고 조정하였다. FACS 완충액 : 2 % FBS, 0.05 % PBS 내의 아자이드.

(8) 항체 반응

말초혈액 단핵 세포의 현탁액을 각각의 FACS 튜브에 0.5ml 투입하였다(각 튜브 당 5× 10⁵ 개의 세포가 존재함). 튜브를 원심분리기로 1500rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 세포 펠렛을 방치하고 상등액만 흡인 및 제거하였다.

* 튜브 1

FITC 표지된 항-인간 CD4 항체 (25 ㎍ / ml) 20 ㎕

PE 표지된 항-인간 CD62L 항체 (5 ㎍ / ml) 20 ㎕

PE-Cy5 표지된 항-인간 CD8 항체 (5㎍ / ml) 20 ㎕

항체 용액과 세포 현탁액을 교반 혼합하였다. 튜브를 4℃로 유지하였다. 30분 후, 각각의 튜브에 코마고메 피펫으로 FACS 완충액 1 ㎖를 첨가하고, 원심분리기로 1500 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 상등액을 흡인하고 제거하였다. 세포 펠렛만 남기고 상등액을 흡인한 각각의 튜브에 1% 파라포름알데히드를 0.5 ㎖ 가하여 세포를 현탁 시켰다.

* 튜브 2

FITC 표지된 항-인간 CD4 항체 (25 ㎍ / ml) 20 ㎕

PE-Cy5 표지된 항-인간 CD25 항체 (5㎍ / ml) 20 ㎕

항체 용액과 세포 현탁액을 교반 혼합하였다. 튜브를 4℃로 유지 였다. 30분 후, 각각의 튜브에 FACS 완충액 1ml를 첨가하고, 혼합물을 원심분리기로 1500rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 상등액을 흡인하고 제거하였다. 세포내 고정 및 투과 완충액 세트^TM(eBioscience)을 사용하여 PE 표지된 항-인간 FOXP3 항체(500 ㎍/ml) 3 ㎕로 세포질 염색을 수행하였다. 세포 펠렛만 남기고 상등액을 흡인한 각각의 튜브에 1% 파라포름알데히드를 0.5 ㎖ 가하여 세포를 현탁시켰다.

(9) 유세포분석기(상품명 : FACS Calibur^TM, BD Japan)에 의한 분석

샘플의 결정

튜브 1, 2의 형광을 측정하였다.

30,000개 세포에 대한 분석 데이터를 통합하였다.

분석

(단계 1)

튜브 1을 분석하고 FSC 또는 SSC를 사용한 2차원 분석을 사용하여 림프구 영역을 확인하였다. 림프구 영역에 게이팅 된 세포를 CD4⁺ 분획에 대해 추가 게이팅하여 CD62L의 히스토그램 플롯을 수득하였다(청색 영역의 세포 카운트)

(단계 2)

튜브 2를 분석하고 림프구 영역 및 CD4⁺ 영역에 게이트된 Foxp3 및 CD25에 의한 2차원 분석 데이터를 수득하였다(주황색 영역의 세포 수).

(단계 3) CD62L^lowCD4⁺/Foxp3⁺CD25⁺CD4⁺ 의 비율 계산

식 : 단계 1의 세포 수 / 단계 2의 세포 수

유동 세포 계측법에서 세포 분획에 대한 결과의 예를 도 1에 나타내었다. CD62L^low와 CD62L^high 사이의 마이크로어레이로 mRNA를 측정하였다. 본 실시예는 유동 세포 계측법을 사용하여 세포를 분별화 하였으나 다른 분리 방법 또한 사용될 수 있다.

(측정)

미리 결정된 값보다 낮으면 진행성 질환이 예상되며, 그 약은 효과적이지 않다. 미리 결정된 값보다 높으면 단계 4로 진행한다.

(단계 4)

식: 주황색 영역의 세포 수 / 단계 1의 R1 및 R2에 대한 세포 수 × 100 (%)

(판정)

미리 결정된 값보다 낮으면 안정적 질환(SD)로 예측된다.

미리 결정된 값보다 높으면 부분 반응(PR)으로 예측된다.

결과적인 T- 세포 집단 조성과 관찰된 치료 효과 사이의 관계에 대하여 통계 분석을 수행하였다.

1-3. 결과

하기 표 2에 환자에 대해 관찰된 치료적 효과를 나타내었다.

확인된 전체 및 부분 반응은 피험자의 고형암내의 반응 평가 기준 버전 1,1에 따라서 평가되었다.

이러한 실시예에서 관찰된 치료 효과의 비율은 체크메이트 017이라 불리는 제 3상 임상 시험에서 수득된 반응 비율과 거의 동일하다. 따라서 니볼루맙에 대한 반응에는 편향이 없다는 것으로 이해된다.

도 3에 나타난 바와 같이, PR+SD 그룹과 PD 그룹의 말초혈액 백혈구 수, 림프구 수, CD4⁺ 세포 백분율 또는 CD8⁺ 세포 백분율에는 유의미한 차이가 없다. 이 실시예의 피험자 집단은 완전 반응(CR) 그룹을 포함하지 않았다. CR 그룹이 존재한다면, CR 그룹은 본 발명의 PR 그룹의 일부로서 확인 될 것이다.

그 결과 CD8 세포 내에서 CD62^low 세포의 비율이 PD 그룹에서 유의미하게 낮았다(도 4A). 그러나 PR+SD 그룹과 PD 그룹의 비율은 넓은 범위에 걸쳐 중첩되고 유의성 검정에서 P=0.0138 이었다. 대조적으로, CD4⁺ 세포 내에서 CD62^low 세포의 비율은 PR+SD 그룹과 PD 그룹 사이에서 완전히 겹치지 않았다(도 4B).

한편, CD4⁺ 세포 내에서 조절 T-세포인 CD25⁺Foxp3⁺ 세포의 비율은 PD 그룹에서 유의미하게 높았다(도 4C). CD25⁺Foxp3⁺CD4⁺ 세포 분획이 조절 T-세포 분획으로 간주 될 수 있다는 것이 당업계의 합의이다.

또한, PD 그룹과 PR+SD 그룹 간의 차이를 지니는 3개의 T-세포 아집단 간의 상관 분석 결과를 도 4의 패널 D 및 E에 나타내었다. CD62L^lowCD8⁺의 백분율과 CD62L^lowCD4⁺의 백분율 간에는 강한 상관관계가 발견되었다(도 4D).

생물학적 중요성으로 CD8⁺ 이펙터 수는 CD4⁺ 이펙터에 의해 조절되는 것으로 제안된다. 이것은 바이오마커로서 그 중 하나만 사용하는 것이 바람직하다는 것을 나타낸다. 이펙터 측 바이오마커로서 매우 작은 p 값을 지니는 CD62L^lowCD4⁺의 백분율을 사용하는 것이 면역 체크포인트 억제제의 치료 효과를 예측하는데 매우 유용하다는 것이 입증되었다.

또한 조절 T-세포와 CD62L^lowCD4⁺의 비율 사이에는 상관관계가 발견되지 않았다. 이것은 각 세포 수가 다른 메커니즘에 의해 조절된다는 것을 나타낸다. 바이오마커로서 둘을 함께 사용함으로써 치료 효과를 예측하는 정밀도가 향상될 수 있는 것으로 이해된다.

도 5 내지 도 12는 바이오마커로서 사용될 수 있는 변수를 추가로 시험한 결과를 나타낸다.

큰 차이가 있는 CD62L^lowCD4⁺의 백분율만 사용하여도 임계치로 19.4 %를 사용하여 92.6 %의 민감도와 96.7 %의 특이도로 매우 우수한 결과가 수득되었다(도 5). 다양한 임계치에 대한 민감도와 특이도를 도 6에 나타내었다.

조절 T-세포의 상대 값과 CD62L^lowCD4⁺의 백분율을 이용한 예측의 정밀도를 조사하였다. 도 7은 X로서 CD62L^lowCD4⁺의 백분율을 사용하고 Y로서 CD25⁺Foxp3⁺CD4⁺의 백분율을 사용할 때 분자 및 분모로서 PD 그룹에서 상이하게 움직이는 두 인자 비율(X/Y)의 결과를 나타낸다.

이러한 지표의 사용으로 조절 T-세포가 현저히 증가하여 항-종양 효과가 더 이상 관찰되지 않는 환자를 명확히 구별 할 수 있는 것으로 이해된다. 도 8은 다양한 임계치에 대한 민감도와 특이도를 나타낸다. 임계치가 7.35 일 때 100 %의 특이도와 71.4 %의 민감도를 지닌 마커가 수득됨을 알 수 있다.

이들 인자의 조합을 사용하는 공식의 경우, N=40의 샘플에서의 결과로부터 로지스틱 회귀를 사용하여 적합한 공식을 조사하면서 치료 효과의 영향에 대한 이들 인자의 가중치를 고려하였다. 로지스틱 회귀 모델을 사용하여 계수를 찾아 X^2.475/Y의 공식을 유도하였다(도 27). 인접한 계수를 지니는 공식(X^2∼3/Y)을 사용함으로써 반응성을 정확하게 예측할 수 있는 것을 알 수 있다. 예를 들어, X²/Y 및 X³/Y와 같은 공식이 사용될 수 있음을 알 수 있다.

도 9 및 도 10은 CD62L^lowCD4⁺의 백분율을 제곱 한 결과이며, 특히 X의 Y에 대한 상대 값으로서 X²/Y를 사용하는 결과를 나타낸다. 이것은 100%의 민감도 및 특이도를 지니는 매우 양호한 바이오마커로서 활용될 수 있는 것으로 이해된다. 도 10은 다양한 임계치에 대한 민감도와 특이도를 나타낸다. 이것은 174.3의 임계치로 이 값을 사용할 때 100%의 민감도와 특이도를 지니는 매우 양호한 바이오마커로 활용될 수 있는 것으로 이해된다.

도 11은 PD 그룹을 결정한 후 PR 및 SD를 예측할 수 있는 바이오마커를 조사한 결과를 나타낸다. CD62L^lowCD4⁺의 비율이 아니라 CD25⁺Foxp3⁺CD4⁺ 세포의 비율에 차이가 있음을 예기치 않게 발견하였다. CD25⁺Foxp3⁺CD4⁺ 세포는 면역 억제 작용을 갖는 Treg이기 때문에, 항-종양 면역 반응이 더 큰 PR 그룹에서 CD25⁺Foxp3⁺CD4⁺의 비율이 더 높은 것은 예상치 못한 결과였다.

CD25⁺Foxp3⁺CD4⁺ 세포 비율의 임계치로 2.05%를 사용하여 52.8%의 민감도와 100%의 특이도로 PR 및 SD를 확인할 수 있었다(도 11). 도 12는 다양한 임계치에 대한 민감도와 특이도를 나타낸다.

또한 어떠한 이론에 구속되기를 바라지는 않으나 본 발명에서 암 면역요법의 임상 효과를 예측하는 메커니즘은 다음과 같이 이해될 수 있다.

* CD4⁺ T-세포는 MHC 클래스 Ⅰ 분자를 통해 수지상 세포에 지시를 전달하고 지시를 받은 수지상 세포는 MHC 클래스 Ⅱ 분자를 통해 CD8⁺ T-세포를 자극한다는 것으로 이해된다. 이들 CD4⁺ T- 세포는 이펙터 T-세포(예를 들면 CD62L^lowCD4⁺ T-세포) 및 조절 T-세포(예를 들면 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포)를 포함한다.

한편, 본 발명은 CD62L^lowCD4⁺ T-세포와 Foxp3⁺CD25⁺ T-세포의 균형을 평가하여 암 면역요법의 임상 효과를 예측한다. CD62L(L-셀렉틴)은 림프관에 특이적으로 존재하는 고 내피 세정맥(HEV)을 인식하고 호밍하기 위해 필요한 분자이다.

나이브 T-세포는 항원 제시 세포에 의해 자극되면 이펙터 T-세포에 의해 프라이밍 되어 CD62L 발현이 감소하기 때문에 호밍은 이펙터 T-세포에 의해 더 이상 수행되지 않는다. 나이브 T-세포의 이펙터 T-세포 프라이밍 마커의 예는 CD62L에서와 같이 CCR7을 포함한다. 프라이밍의 결과로 CCR7의 발현 수준이 감소한다. 따라서 CD62L^low 대신 CCR7을 사용할 수 있다.

예를 들면 CCR7^lowCD4⁺ T-세포 및/또는 CCR7^-CD4⁺ T-세포는 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 대신에 (또는 이에 추가하여) 사용될 수 있다. 이펙터 T-세포의 지표로서 사용될 수 있는 세포 아집단의 예로는 CD62L^lowCD4⁺ T- 세포 아집단, CCR7^-CD4⁺ T-세포 아집단, LAG-3⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단, ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단, CD45RA^-CD4⁺ T-세포 아집단, CD45RO⁺CD4⁺ T- 세포 아집단, HLA-DR⁺ 수지상 세포 아집단, CD80⁺ 수지상 세포 아집단, CD86⁺ 수지상 세포 아집단, PD-L1⁺ 수지상 세포 아집단, CD62L^lowCD8⁺ T-세포 아집단, CD137⁺CD8⁺ T-세포 아집단으로 이루어진 군에서 선택된 아집단을 포함 할 수 있다.

이러한 세포 아집단의 양(절대적인 양) 및/또는 비율(상대적인 양)은 이펙터 T-세포의 지표로서 상용화된다. 조절 T-세포의 지표로서 사용될 수 있는 세포 아집단의 예로는 CCR4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 양; 및 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양;으로 이루어진 군에서 선택된 세포 아집단을 포함하며 이에 한정되지는 않는다.

(실시예 2 : 암 면역요법의 치료 효과를 개선 또는 유지 및 지속

시키기 위한 세포 요법)

암 면역요법으로 치료를 시작하기 전에, CD62L^lowCD4⁺ T-세포가 피험자의 말초혈액 샘플로부터 분리되어 저장된다. 분리된 CD62L^lowCD4⁺ T-세포는 생체 내에서 팽창된다(도 13 내의 "생체 외 팽창"). 분리된 CD62L^lowCD4⁺ T- 세포는 동결되어 저장될 수 있다.

실시예 1 등에 기재된 방법에 의해 피험자가 무 효과 그룹의 일부가 아닌 것으로 결정된 경우에는, 니볼루맙과 같은 항-PD-1 항체를 사용한 요법과 같은 암 면역요법이 CD62L^lowCD4⁺ T-세포/CD25⁺Foxp3⁺CD4⁺ T-세포의 비율이 높을 때 도 13의 상부 도면에 나타난 바와 같이 적용된다. 치료 중, 피험자의 CD4⁺ T-세포 조성물은 실시예 1에 개시된 접근법에 의해 모니터링 된다.

이와 관련하여, 무 효과 그룹의 면역학적 조건에 도달하기 위해 피험자의 CD4⁺ T-세포 조성물에서 CD62L^lowCD4⁺ 백분율 / CD25⁺Foxp3⁺CD4⁺ 세포 백분율과 같은 지표가 낮아지면 생체 외로 확장된 CD62L^lowCD4⁺ T-세포를 암 면역요법의 효과를 유지하기 위해 원래의 면역 상태를 회복하기 위해서 주입될 수 있다.

저장/배양 비용은 CD62L^lowCD4⁺ T-세포만을 배양하고 주입함으로써 최소화 할 수 있다. 이것은 2주마다 항 PD-1 항체와 같은 면역 체크포인트 억제제만 계속 사용하는 것보다 경제적이다.

피험자의 CD4⁺ 세포 구성에서 CD62L^lowCD4⁺ 백분율/CD25⁺Foxp3⁺CD4⁺ 세포 백분율과 같은 낮은 지표를 갖고 무 효과 그룹의 일부로 결정되는 피험자(예를 들면 도 13의 하부 도면에서와 같이 CD62L^lowCD4⁺ T-세포/ CD25⁺Foxp3⁺CD4⁺ T-세포의 비율이 낮은 경우)에 피험자로부터 분리하여 생체 외부에서 증식시킨 CD62L^lowCD4⁺ T-세포를 주입하여 면역학적 항응고제 투여 후 니볼루맙과 같은 항 PD-1 항체로 암 면역요법을 시행한다. 암 면역요법의 항 종양 면역 반응은 항 PD-1 항체로 암 면역요법을 이용할 수 없었던 대상에서도 유도 될 수 있다.

(실시예 3: 후속 관찰)

7 명의 환자는 CD62L^lowCD4⁺ T-세포의 비율을 관찰하기 위해 추적 조사를 받았다. 말초혈액 단핵 세포를 4 마다 분석하였다.

결과를 하기 표 3에 나타내었다. 1 내지 7의 각각은 상이한 환자의 결과를 나타낸다.

니볼루맙 치료 시작 초기 환자 1에서 종양 축소가 관찰되었지만 일정 기간 동안 자궁 경관 림프절에서 종창이 있었다. PD가 의심되는 동안 8주 후 CT 평가에서 붓기가 감소되어 환자가 PR로 판정되었다. 종양 크기의 증가가 관찰되었을 때 CD62L^lowCD4⁺ T-세포의 비율은 감소했다. 종양이 다시 축소 할 때 CD62L^lowCD4⁺ T-세포의 비율이 다시 상승했다. 다른 모든 피험자는 치료 전부터 CD62L^lowCD4⁺ T-세포를 높은 비율로 유지하여 PR 또는 SD로 판정 하였다.

실시예 1의 발견과 더불어 CD62L^lowCD4⁺ T-세포의 백분율이 19.4 % 미만인 경우 피험자는 반응하지 않는 것으로 이해되지만, CD62L^lowCD4⁺ T-세포의 백분율이 다시 회복하였을 때 피험자는 반응하는 것으로 판단된다.

(실시예 4: 마우스로 세포 주입)

종양 모델 마우스에 2×10⁶ CD62L^lowCD4⁺/ 5×10⁶ CD62L^lowCD8⁺(도 14A "●"), 5×10⁶ CD62L^lowCD8⁺(도 14A "△"), 및 1×10⁶ CD62L^lowCD4⁺(도 14B "●")의 조성물을 지니는 세포를 주입하였다. 시간 경과에 따른 종양 크기의 발달이 관찰되었다.

종양 주입 후 13일에 비장에서 (CD4⁺ T-세포 내의 CD62L^low 세포 )/(CD4⁺ T-세포 내의 CD62L^highCD25⁺ 세포) 비율을 세포, 즉 2×10⁶ CD62L^lowCD4⁺/5× 10⁶ CD62L^lowCD8⁺(도 14A "●") 또는 5×10⁶ CD62L^lowCD8⁺(도 14A "△")를 주입한 그룹 및 세포를 주입하지 않은 그룹(도 14A "○")에서 측정하였다. 비장에서 1×10⁶ CD62L^lowCD4⁺ 세포(도 14B "●")를 주입한 그룹에서 CD4⁺ T-세포의 CD62L / CD62L^highCD25⁺ 세포의 비율은 시간이 지남에 따라 측정되었다.

말초 혈액의 T-세포 분석은 마우스 내에서 어려운 일이다. 대안으로 일반적인 비장 세포 분석이 사용된다. 마우스 비장에서 T-세포 분석은 인간의 PBMC와 동등한 것으로 간주된다. CD4⁺CD62L^highCD25⁺의 T-세포 분획은 조절 T-세포(Treg)를 포함하는 분획이다.

도 14는 결과를 나타낸다. 13 일째의 T-세포 분석에서, (CD4⁺ T-세포내의 CD62L^low세포)/(CD4⁺ T-세포내의 CD62L^highCD25⁺ 세포)의 비율은 2× 10⁶ CD62L^lowCD4⁺세포/ 5× 10⁶ CD62L^lowCD8⁺ 세포와 함께 주입한 군에서 10.6이었다. 5×10⁶ CD62L^lowCD8⁺ 세포를 주입한 군에서는 2.94 이었으며 세포를 주입하지 않은 군은 2.70이었다. CD62L^lowCD4⁺세포의 주입은 T-세포 조성물에서 CD62L^lowCD4⁺의 백분율을 증가시키는 것으로 이해된다. 또한 (CD4⁺ T-세포내의 CD62L^low세포)/( CD4⁺ T-세포내의 CD62L^highCD25⁺ 세포)의 높은 비율과 함께 2×10⁶ CD62L^lowCD4⁺세포/ 5×10⁶ CD62L^lowCD8⁺ 세포를 주입한 군에서 유의미한 종양 축소가 관찰되었다(도 14A "●").

상기 결과는 항-종양 효과가 CD62L^lowCD4⁺세포를 주입하거나 CD62L^lowCD4⁺세포와 CD62L^lowCD8⁺ 세포의 혼합물을 주입함으로써 달성된다는 것을 보여준다.

1×10⁶ CD62L^lowCD4⁺ 세포가 주입된 군에서는 CD4⁺ T-세포 내의 CD62L^low 세포/ CD4⁺ T-세포 내의 CD62L^highCD25⁺ 세포의 비율이 종양 축소가 멈춘 단계에서 세포 주입으로 인해 높아진다.(3.70 → 9.09). 그러나 (CD4⁺ T-세포 내의 CD62L^low 세포) / (CD4⁺ T-세포 내의 CD62L^highCD25⁺ 세포)의 비율은 종양이 다시 증가할 때 저하된다.(4.55). 이러한 결과는 종양 축소의 효과가 CD62L^highCD25⁺ 세포와 같은 CD62L 고 발현 세포에 의해서가 아니라 CD4⁺ T-세포 집단 내의 CD62L^low 세포에 의해 달성되는 것을 나타내며, 항-종양 효과를 달성하는 세포 함유 조성물로부터 CD62L 고 발현 세포를 제거하는 것이 바람직하다.

(실시예 5 : CD62L^low세포의 분리/증식)

CD62L 염색 패턴이 다른 인종 및 마우스에서 관찰되었다. 도 15는 그 결과를 나타낸다. 패널 A는 백인의 종양 백신을 누출하는 림프절을 사용하는 FACS를 나타낸다. 림프구 영역을 게이팅하면서 CD62L이 관찰되었다. C는 일본인 피험자의 말초 혈액 단핵구 유래 CD62L과 유사한 관찰이다. 패널 D는 마우스의 림프구에서 CD62L 염색 패턴을 나타낸다. 유사한 염색 패턴이 인종/생물종 전체에서 나타는 것으로 이해된다. 이것은 이중 피크 분포를 가지며 형광 강도는 10²를 경계로 한다.

.

패널 B는 자성 비드를 지닌 패널 A의 피험자 세포군에서 CD62L^low 세포만을 분리한 후 순도를 나타내는 FACS이다. 형광강도가 10²를 초과하는 세포 집단은 거의 완전히 고갈될 수 있었다. 세포를 분리한 후, 의사-TCR 자극을 가하고, 저농도의 IL-2 하에서 배양하였다. 세포 수를 1000배 이상으로 증가 시킬 수 있었다.

(실시예 6 : 수지상 세포 상에 발현된 마커의 활용)

6-1. 목 적

항-PD-1 항체의 치료 효과와 수지상 세포 상에 발현된 표지 사이의 관계를 조사하였다. 수지상 세포에 발현된 마커가 본 발명의 암 면역요법의 임상 효과를 예측하는데 이용 될 수 있는지를 조사하였다.

6-2. 재료 및 방법

재료 및 방법은 실시예 1과 동일하다. 도 23에 나타낸 항체를 사용하여 수지상 세포 상에 발현 된 HLA-DR 및 CD80/CD86을 검출하였다. 판정에 대한 접근법은 실시예 1과 동일하다.

6-3. 결과

도 16에 그 결과를 나타내었다. 골수 수지상 세포(mDC, CD141⁺CD11c⁺ 수지상 세포) 내의 및 형질세포 수지상세포(pDC, CD123⁺CD11c⁺ 수지상 세포) 내의 HLA-DR⁺ 세포의 비율 및 CD80 세포의 비율은 PD, SD 및 PR을 확인하는 우수한 지표이었다. pDC 내의 HLA-DR, pDC 내의 CD80, mDC 내의 HLA-DR 및 mDC 내의 CD80을 사용하여 PD 대 PR+SD를 결정할 때의 p 값은 각각 0.0008735, 0.002689351, 6.87852×10^-6 및 0.003033095이었으며 우수한 값이다. 도 17에 나타난 바와 같이 mDC 내의 이러한 마커들의 결과는 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 비율과 관련 있다.

이상의 결과로부터, 골수 수지상 세포 (mDC) 및/또는 형질세포 수지상 세포(pDC) 개체군에서 HLA-DR 및/또는 CD80 및/또는 CD86을 발현하는 세포의 수/비율은 지표로서 CD4⁺ T-세포(CD62L^lowCD4⁺ T-세포)를 사용하는 것 대신에 (또는 이에 추가하여) 지표로서 사용될 수 있다.

(실시예 7 : CD8⁺ T-세포 상에 발현된 마커의 활용)

7-1. 목 적

항 PD-1 항체의 치료 효과와 CD8⁺ T-세포 상에 발현된 마커 사이의 관계를 조사하였다. CD8⁺ T-세포에 발현된 마커가 본 발명에서의 암세포 면역 요법의 임상 효과를 예측하는데 이용될 수 있는지를 조사하였다.

7-2. 재료 및 방법

재료 및 방법은 실시예 1과 동일하다. 도 23에 나타낸 항체를 사용하여 CD8⁺ T-세포 상에 발현된 4-1BB(CD137)를 검출하였다. 판정에 대한 접근법은 실시예 1과 동일하다.

7-3. 결 과

도 18에 그 결과를 나타내었다. 골수 수지상 세포(mDC, CD141⁺CD11c⁺ 수지상 세포) 내의 HLA-DR⁺ 세포의 비율과 CD80 세포의 비율은 CD62L^lowCD8⁺ T-세포에서 발현된 4-1BB(CD137) 마커와 상관관계가 있었다. 실시예 6의 결과 에서와 같이 실시예 7의 결과는 CD62L^lowCD8⁺ T-세포에서 4-1BB 세포의 수/비율이 CD62L^lowCD4⁺ T-세포의 수/비율과 동일한 방법으로 본 발명 암 면역요법의 임상 효과를 예측하는데 활용될 수 있음을 나타낸다.

이론에 구속되기를 바라지는 않으나 (1) CD4⁺ T-세포는 MHC 클래스 Ⅰ 분자를 통해 수지상 세포에 지시를 전달하여 HLA-DR 및/또는 CD80 및/또는 CD86을 발현하는 수지상 세포를 증가시키고, (2) 지시를 받은 수지상 세포는 MHC 클래스 Ⅱ 분자를 통해 CD8⁺ T-세포를 자극함으로써 CD62L^lowCD137 (4-1BB)⁺CD8⁺ T-세포 및 HLA-DR 및/또는 CD80 및/또는 CD86을 발현하는 수지상 세포의 수/비율을 CD62L^lowCD4⁺ T-세포의 수/비율과 동일한 방법으로 본 발명 암 면역요법의 임상 효과를 예측하는 데 사용될 수 있다.

또한 이러한 일련의 항-종양 메커니즘의 고갈이 항-PD-1 항체와 항-PD-L1 항체로 인해 회복되는 반면에, T-세포 상의 PD-1 발현은 본 발명의효과 예측에 효과적이지 않다(데이터는 나타내지 않음). 이러한 결과의 관점에서 수지상 세포에 대한 PD-L1 발현은 본 발명 암 면역요법의 임상적 효과를 예측하는데 사용될 수 있음을 알 수 있다.

(실시예 8 : CD4⁺ T-세포 상에 발현된 다른 마커의 활용)

8-1. 목표

CD4⁺ T-세포 상에 발현된 CD62L 이외의 마커가 치료 효과를 예측하는데 이용될 수 있는지를 조사하였다.

8-2. 재료 및 방법

재료 및 방법은 실시예 1과 동일하다. 도 23에 나타난 항체가 CD4⁺ T-세포 상에 발현돠는 다양한 마커를 검출하기 위해 사용되었다. 결정에 대한 접근법은 실시예 1과 동일하다.

8-3. 결과

도 19 및 도 20에 그 결과를 나타내었다. CD4⁺ T-세포 상에 발현된 LAG3, ICOS 및 CCR4 각각은 CXCR3, CCR6 및 CXCR5와 비교하여 본 발명의 암 면역요법의 임상 효과를 예측하는데 더욱 효과적으로 사용될 수 있는 것으로 이해된다.

(실시예 9 : PR 및 SD를 구분하는 다른 마커)

9-1. 목 적

실시예 1은 CD25⁺Foxp3⁺CD4⁺ 세포의 백분율이 PR 및 SD를 구분하는 우수한 마커임을 입증하였다. PR 및 SD를 구분하기 위한 다른 마커를 조사하였다.

9-2. 재료 및 방법

재료 및 방법은 실시예 1과 동일하다. CD4⁺ T-세포 상에 발현되는 ICOS를 검출하기 위한 항체를 사용한 다음 마커들은 실시예 8에 사용된 항체들과 동일하였다. 판정에 대한 접근법은 실시예 1과 동일하다.

9-3. 결 과

도 21에 나타낸 결과로부터 명백한 바와 같이, CD4⁺ T-세포에서 발현 된 ICOS는 Foxp3⁺CD25⁺ 보다 우수한 마커인 것으로 밝혀졌다. 또한 CD4⁺ T-세포 내의 CD25⁺Foxp3⁺ CD4⁺ T-세포의 비율 (W)와 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내의 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포의 비율 (Z)를 곱하여 Z*W로서 사용하면 PR 군과 SD 군을 구별할 수 있다. 이것은 Z*W의 임계치가 1.816인 경우에 80%의 민감도 및 89.5 %의 특이도를 지닌 마커로서 사용할 수 있는 것으로 나타났다(도 21).

또한 이것은 본 발명의 2 이상의 W를 계산(예를 들면 곱하기)한 결과를 사용함으로써 PR 및 SD가 구별 가능함을 나타낸다. 하나의 비 제한적인 실시예는 Z*W 또는 Zⁿ*Wⁿ와 같은 변수 (Z, W)를 사용함으로써 PR과 SD를 구별 할 수 있으며 이때 n 및 m은 각각 양의 실수이고 (Z)는 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양이며, (W)는 CD4⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 양; CD4⁺Foxp3⁺ T-세포 아집단의 양; CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺ T-세포 아집단의 양; CD62L^highCD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CD45RA^-Foxp3⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; CCR4⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 및 CD127⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포 아집단의 양; 으로 이루어진 군에서 선택된 값이다.

또한, SD로부터 PR를 구별하기 위해 3개 이상의 바이오마커를 계산 (예를 들면 더하기 및 / 또는 곱하기)한 결과를 사용할 수도 있다.

지표에 대한 보다 상세한 공식을 도출하기 위해 CD4⁺ T-세포 내의 CD25⁺Foxp3⁺CD4⁺ T-세포의 비율 (W) 및 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 내의 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포의 비율 (Z)을 결합하는 식을 더욱 검토하기 위해 로지스틱 회귀를 수행하였다.

도 24 및 25에 나타난 바와 같이, J=Z*W⁵의 식은 N=32의 샘플에서의 결과로부터 도출되었다. PR 및 SD가 식 J=Z*W⁵를 사용하여 분리될 때, ROC 분석 결과 Z 및 W 각각에 비해 성능이 향상되었음이 나타났다(도 26). 또한 PR과 SD는 비슷한 형태의 다른 공식인 J=Z*W^4-6을 사용하여 성공적으로 구분될 수 있음을 알 수 있다.

CD4⁺ T-세포가 PD-1/PD-L1 차단 요법 NR을 예측하는데 중요하기 때문에, 본 발명자들은 CD4⁺ T-세포상의 PD-1 및 LAG-3 발현이 ICOS 발현에 추가하여 PR 그룹과 SD 그룹을 구별하는 마커일 수 있는지를 조사하였다. 활성화된 T-세포에서 발현되는 림프구-활성화 유전자 3(LAG-3) 단백질은 T-세포의 고갈을 유지하기 위해 PD-1과 상호 작용한다.

LAG-3는 MHC 클래스 Ⅱ 항원에 결합하고 항원 활성화 후 증식된 이펙터 T-세포 집단 크기를 조절한다(28-30 Hui, E., 등, T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science 355, 1428-1433 (2017); Baixeras, E., 등, Characterization of the lymphocyte activation gene 3-encoded protein. A new ligand for human leukocyte antigen class II antigens. J Exp Med 176, 327-337 (1992);Workman, C.J., 등, Lymphocyte activation gene-3 (CD223) regulates the size of the expanding T cell population following antigen activation in vivo. J Immunol 172, 5450-5455 (2004)).

따라서 발명자들은 게이트된 CD62L^high 및 CD62L^low CD4⁺ T-세포에서 PD-1, LAG-3 및 ICOS 발현을 조사하였다.

그 결과를 도32에 나타내었다. 이들 분자는 CD62L^low CD4⁺ T-세포에서 발현되었지만, CD62L^high CD4⁺ T-세포에서는 최소로 검출되었다(도 32d-e). 일원분산분석(ANOVA) 후 사후검정 결과는 IR(SD)이 GR(PR) 및 NR에 비해 전체 CD62L^low CD4⁺ T-세포군에서 PD-1⁺, LAG-3⁺ 및 ICOS⁺ 세포 백분율을 유의미하게 낮게 유지한다는 것을 나타내었다(도 32a-c). IR은 GR의 CD4⁺ T-세포 면역 상태와 구별되는 면역 상태를 지닌 것으로 나타난다. 따라서 이러한 세포 아집단의 양을 사용하여 SD와 PR을 구별하는 것이 가능하다.

본 실시예의 결과로부터, LAG-3⁺CD62L^low CD4⁺ T-세포 및 PD-1⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포 아집단의 양/비율이 ICOS⁺CD62L^lowCD4⁺ T-세포에 추가하여 PR 및 SD를 구별하는 마커로서 사용될 수 있는 것으로 이해된다.

(실시예 10) 생존 분석

10-1. 요약

예측 식[X²/Y, 이때 X는 CD4⁺ T-세포 집단 내의 CD62L^low T-세포의 비율(%) 및 Y는 CD4⁺ T-세포 집단 내의 CD25⁺FOXP3⁺ T-세포의 비율(%)]을 통한 치료 효과의 예측을 입증하기 위해, 생존 기간을 치료 결과(PD, SD, CR)가 이미 결정된 발견(discovery) 코호트(실시예 1의 피험자 환자 집단의 일부)에서 분석하였다. 또한 치료를 계속하는 41명의 환자로 구성된 독립적인 검증 코호트에서 예측식이 NR(PD)을 구별할 수 있는지 여부를 조사하기 위해 종양 반응성을 평가하기 전에 예측 식을 통해 분석하였다.

10-2. 재료 및 방법

발견 코호트 및 유효성 확인 코호트에 포함된 환자군의 특성은 하기 표와 같다. 각 환자에 대한 예측식 값은 실시예 1에서 설명된 절차에 따라 계산되었다.

10-3. 결과

발견 코호트 내의 개별 환자에 대한 예측 식[X²/Y, 이때 X는 CD4⁺ T-세포 집단 내의 CD62L^low T-세포의 비율(%) 및 Y는 CD4⁺ T-세포 집단 내의 CD25⁺FOXP3⁺ T-세포의 비율(%)]의 값을 도 30a에 나타내었다(P<0.0047, t=3.004, df=38). 발견 코호트 내에서 8주에서 NR을 검출하기 위한 예측 식 수신기작동특성(ROC) 분석을 도 30b에 나타내었다.

예측 식 임계치=192에서 민감도와 특이도는 각각 85.7 %와 100% 이었다. 반응자 유형(X²/Y ≥ 192) 및 NR 유형(X²/Y < 192)으로 진단된 환자의 니볼루맙 처리 전에 수득된 PBMC에 따른 무 진행 생존율(PFS)과 OS 곡선을 도 30c 및 도 30d에 나타내었다. 발견 코호트(임계치 = 192) 내에서 반응자및 NR 유형은 PFS와 OS 모두에서 유의미한 차이를 나타내었다(P <0.0001).

다음으로 본 발명자들은 발견 코호트로서 니볼루맙 치료 전에 말초 혈액을 수집한 41명의 연속적인 환자로 구성된 독립적인 검증 코호트에서 예측 식 임계치(X²/Y <192)가 NR을 구별할 수 있는지 여부를 조사하였으며 종양 반응 평가 전에 분석하였다. 도 30e에 나타난 바와 같이 반응 검증 코호트 환자 내에서 예측 식 값은 상당히 높았다(P = 0.00068, t = 3.693, df = 39).

NR 검증 코호트 환자 예측의 민감도와 특이도 값은 각각 임계치 <192에서 90.9 %와 89.5 % 이었다. 반응자 유형 PFS는 검증 코호트 환자 내에서 NR 유형보다 유의미하게 길어졌다(도 30f; P <0.0001). 추적 관찰 기간의 중앙값은 195일 이었으나 반응자 유형 환자의 경우 OS가 유의미하게 길어졌다(도 30g, P = 0.0022).

각 코호트에서 8주째의 객관적 반응은 다음과 같았다.

본 실시예에서의 결과는 본 명세서에 개시된 암 면역요법에 대한 반응성을 예측하는 방법이 전향적 연구에서도 암 면역요법에 대한 반응성을 정확하게 예측한다는 것을 나타내었다. 또한 암 면역요법에 대한 반응 예측은 환자의 전반적인 치료 반응(전체 생존(OS) 또는 무 진행 생존(PFS))의 직접 예측을 제공한다.

(실시예 11) 마커로서의 CD28⁺ 세포 아집단의 유용성

최근에 T-세포 수용체(TCR)가 아닌 CD28이 PD-1 의존 신호 억제의 주요 표적임이 입증되었다. 따라서 본 발명자들은 CD8⁺ T-세포의 총 집단 중 CD28⁺ 세포의 백분율이 예측 식 값과 관련 있는지를 조사하였다.

본 발명자들은 예측 식[X²/Y, 이때 (X)는 CD4⁺ T-세포 집단 내에서 CD62L^low T-세포의 비율(%) 및 (Y)는 CD4⁺ T-세포 집단 내에서 CD25⁺FOXP3⁺ T-세포의 비율(%)] 값이 CD62L^lowCD8⁺ T-세포의 총 집단 내의 CD28⁺ 세포의 비율과 관련 있음을 예측하였다(도 31). 이러한 실시예의 결과로부터 상기 예측 식 값 뿐만 아니라 CD62L^lowCD8⁺T-세포 집단 내의 CD28⁺CD62L^lowCD8⁺ T-세포 및/또는 CD28⁺ 세포의 비율이 암 면역 요법에 대한 반응성의 예측에 사용될 수 있는 것으로 이해된다.

(실시예 12) 각 그룹의 환자에서 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 유전자 발현

12-1. 요약

PBMC 유동 세포 계측법(FCM) 분석 결과 CD62L^lowCD4⁺ T-세포의 양과 질이 항종양 면역에 중요한 역할을 하며 PD-1 차단 치료 반응을 결정한다는 것이 밝혀졌다. 본 발명자들은 본 실시예에서 GR, IR 및 NR 환자 중 분자 수준에서 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 차이를 관찰하기 위해 마이크로어레이 분석을 수행하였다. 본 발명자들은 먼저 CD62L^highCD4⁺ 및 CD62L^lowCD4⁺ T-세포에서 유전자 발현 차이를 밝혀냈다. 그 다음 각 그룹 환자의 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 상의 차별적으로 발현된 유전자를 조사하였다.

2-2. 재료 및 방법

총 RNA는 각각의 반응자 유형 중 2 가지로부터 정제된 PBMCs의 CD62L^highCD4⁺ 및 CD62L^lowCD4⁺ T-세포로부터 TRIzol 시약 (Thermo Fisher Science, Waltham, MA)에 의해 분리되었다. cDNA 및 cRNA 합성 및 단일 가닥 cDNA (ssDNA) 표지 반응은 WT Plus Reagent Kit (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 수행되었다. 총 RNA(0.5 ㎍)를 cDNA로 역전사 시킨 후 cRNA로 합성하였다. ssDNA를 15 ㎍의 cRNA로부터 역전사 시킨 후 라벨링하였다. 1.8 ㎍의 표지된 ssDNA를 GeneChip Hybridization Oven 645에서 인간 (Thermo Fisher Scientific)에 대한 마이크로어레이 Clariom S 분석법으로 혼성화 시켰다. GCS3000 7G 시스템 (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 혼성화 된 배열을 스캔하였다. 유전자 발현 데이터의 접근 번호 ID는 GSE103157이다.

본 발명자는 2 세트의 유전자 발현 데이터로 부터 유전자 발현 시그니처를 분별하기 위해, 2 세트 유전자간의 발현의 차이를 다음과 같이 추정하였다. 먼저 발명자는 모든 값의 프로브에 대해 아웃 라이어 테스트를 수행 한 다음, 아웃 라이어를 제외한 프로브 값의 평균 및 분산을 사용하여 각 프로브에 대한 z- 스코어를 계산했다. 두 유전자 세트의 z- 스코어를 비교하기 위해 각각의 유전자 z- 스코어를 확률로 변형시킨 다음 두 세트 간의 유전자 확률의 차이 p^d를 계산했다.

[수학식 1]

상기식에서 a 와 b 두 세트의 유전자간의 k 번째 유전자를 비교하였다. 이 분석에서 본 발명자는

[수학식 2]

를 유전자 시그니쳐로 선택하였다.

12-3. 결과

이를 위해 본 발명자들은 먼저 CD62L^highCD4⁺ 및 CD62L^lowCD4⁺ T-세포에서 유전자 발현 차이를 규명하였다. CD62L^highCD4⁺ T-세포 및 CD62L^lowCD4⁺ T-세포는 별개의 유전자 발현 프로파일을 지닌다. (도 33a 및 도 34a). 이전 보고서와 일치하여 CC 케모카인 수용체 7 형 (CCR7), CD28 및 전사 인자 7 (TCF7) 유전자가 모든 GR, IR 및 NR 환자내의 CD62L^highCD4⁺ T-세포에서 높게 발현되었기 때문에 대부분의 CD62L^highCD4⁺ T-세포는 naive T-세포로 간주된다. 반면 약간의 CD62L^highCD4⁺ 및 CD62L^lowCD4⁺ T-세포는 높은 foxp3 발현 때문에 조절 T-세포로 간주된다.

그 후 본 발명자들은 GR 및 IR, GR 및 NR, IR 및 NR, GR + IR 및 NR, 및 GR 및 IR + NR (각각의 1884, 1826, 1410, 1167 및 1513 유전자)(합계 3484)로부터 세포간의 비교된 시그니처 내 유전자를 합병시켰다 (도 33b). 이들 중 T-세포 면역과 관련이 있다고 알려진 53 개의 유전자 중 30 개가 니볼루맙 치료에 반응하는 것으로 나타났다 (도 34b).

이는 C-X-C 케모카인 수용체 3 형 (CXCR3), 인터루킨-23 수용체 (IL23R), 인터루킨-13 수용체 서브 유니트 α-2 (IL13RA2), PD-1 리간드 2 (PDL2), CD80, C-형 렉틴 도메인 패밀리 2 멤버 A(CLEC2A), 인터루킨 7 (IL7), 형질 전환 성장 인자 베타 수용체 3 (TGFBR3) 및 히스톤 데아세틸라아제 9 (HDAC9)가 GR 및/또는 IR로부터 유래된 CD62L^lowCD4⁺ T-세포내에서 우선적으로 발현되었다.

본 실시예의 결과로부터 이해할 수 있는 바와 같이, CD62L^highCD4⁺ 및 CD62L^lowCD4⁺ T-세포간의 상이하게 발현되는 유전자의 발현을 조사함으로써 얻어진 세포가 속하는 세포 아집단을 결정할 수 있으므로 세포 아집단의 양 및/또는 비율을 측정 가능케 할 수 있다. 또한 환자 그룹의 구별은 CD62L^lowCD4⁺ T-세포상의 각각의 환자 그룹에서 상이한 발현 유전자의 발현을 조사함으로써 달성 될 수 있는 것으로 이해된다.

(실시예 13) 세포 이동 실험

종양 배수 림프절에서 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 준비

1.5 x 10⁶B16BL6 흑색종 세포(HBSS 내의)를 B6 마우스의 피하에 접종하였다. 사타구니 림프절을 9-10일 후에 채취하였다. 채취된 림프절로부터 CD4⁺ T-세포를 CD4⁺ T-세포 분리 키트 + LS 컬럼으로 분리하였다. CD62L^lowCD4⁺ T-세포를 CD62L 마이크로비드 (LS 컬럼)로 음성 선별하여 정제 하였다. 이 CD62L^lowCD4⁺ T-세포는 정맥 내 전달에 사용되었다.

종양 모델

HBSS 중의 3×10⁶ B16BL6 흑색종 세포를 복부 B6 마우스의 정중선에 피하 주사하였다. 마우스를 (1) 대조군 (N = 10), (2) 항체군 (N = 17) 및 (3) 항체 + 세포군 (N = 4)으로 나누었다. 대조군에는 아무런 치료를 하지 않았다.

항체 + 세포 군에 종양 세포를 접종 한 후, 종양 접종 후 4일 또는 5일째에 상기 CD62L^lowCD4⁺ T-세포 (1 × 10⁶)를 전달시키고 항 PD-1 항체 (RMP1-14 BioXcell 250μg)를 복강 내 투여하였다 (세포 투여일, 세포 투여 3일 후 및 6일 후에). 항체 군은 항 PD-1 항체 (RMP1-14 BioXcell 250 ㎍)를 복강 내 투여 하였다 (세포 투여 일, 세포 투여 3일 후 및 6일 후). 각 군에서 마우스의 생존율을 관찰하였다.

결과

항체 및/또는 T-세포의 투여 후 16 일째에 대조군의 모든 개체는 죽었고 항체 + 세포군의 생존율은 항체군의 생존율보다 50 % 높았다(도 35). 이러한 결과는 CD62L^lowCD4⁺ T-세포의 전달이 항 PD-1 항체의 효능을 향상시킬 수 있음을 나타낸 것이다.

항-PD-1 / PD-L1 항체는 거의 모든 진행성 암 치료를 위한 1차 치료제로 간주된다. 한편 후생 노동성은 고가의 약제비가 사회 보장비를 잠재적으로 증가시킬 수 있으므로 비용 효율성 증가율 즉 약물 효과 증가의 비율 증가를 증진시켜야 한다고 경고하였다.

본 발명에서 제공되는 바이오마커는 간단하고 저렴한 비용으로 정확한 방법으로 항-PD-1 / PD-L1 항체의 효과를 예측할 수 있기 때문에 의학적으로나 사회적으로 필수적인 것이다. 본 발명은 모든 암 및 종양에 대해 전 세계적으로 요구되는 것으로 매우 높은 시장 가치를 갖는 기술로 이해된다.

Claims

CD62L^lowCD4⁺ T-세포를 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 면역 체크포인트 억제제와 병용 투여함을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, Foxp3⁺CD25⁺CD4⁺ T-세포를 더욱 포함함을 특징으로 하는 조성물.
암 면역요법과 병용하기 위한 제 1항 또는 제 2항의 조성물.
삭제
제 1항에 있어서, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1 억제제, PD-L1 억제제 및 CTLA-4 억제제로 이루어진 군에서 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
제 5항에 있어서, PD-1 억제제는 PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용을 억제하는 항-PD-1 항체임을 특징으로 하는 조성물.
제 5항에 있어서, PD-L1 억제제는 PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용을 억제하는 항-PD-L1 항체임을 특징으로 하는 조성물.
제 5항에 있어서, PD-1 억제제 또는 PD-L1 억제제는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 두르발루맙, 아테졸리주맙 또는 아벨루맙을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, CD62L^lowCD8⁺ T-세포를 더욱 포함함을 특징으로 하는 조성물.
암 면역요법이 효과가 없을 것으로 예상되는 피험자에서 암 면역요법을 유효하게 하기 위한 제 1항 또는 제 2항의 조성물.
암 면역요법의 효과를 지속시키기 위한 제 1항 또는 제 2항의 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 세포는 조성물이 투여되는 피험자로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 조성물.
인간 유래 T-세포 집단으로부터 CD62L^lowCD4⁺ T-세포를 정제하는 단계를 포함하는, CD62L^lowCD4⁺ T-세포를 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물의 제조방법에 있어서, 상기 조성물은 면역 체크포인트 억제제와 병용 투여함을 특징으로 하는 방법.
제 13항에 있어서, 상기 정제는 T-세포 집단으로부터 CD62L 고발현 세포를 제거하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
인간 유래 T-세포 집단으로부터 CD62L^lowCD4⁺ T-세포를 정제시켜 CD62L^lowCD4⁺ T-세포를 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물을 제조하는 키트에 있어서,
상기 조성물은 면역 체크포인트 억제제와 병용 투여하고,
상기 키트는 CD62L에 특이적으로 결합하는 물질을 포함시켜 CD62L^lowCD4⁺ T-세포를 정제시킴을 특징으로 하는 키트.