KR102602998B1

KR102602998B1 - 억제제 및 이의 사용

Info

Publication number: KR102602998B1
Application number: KR1020177032404A
Authority: KR
Inventors: 앤 베르톨로티; 인드라지트 다스; 아그니에슈카 크지조지아크; 애드리안 루소; 킴 슈나이더; 안나 구드니 시귀르다르도티르
Original assignee: 유나이티드 킹덤 리서치 앤드 이노베이션
Priority date: 2015-04-08
Filing date: 2016-04-08
Publication date: 2023-11-15
Also published as: US11154519B2; US11337941B2; US11331286B2; AU2016246099B2; US20200197337A1; US20180111896A1; CA2982033A1; CN107709291B; HK1250929A1; IL254928B; IL254928A0; KR102572217B1; US20200297668A1; JP2018517668A; BR112017021507B1; CN107820518B; AU2016246099A1; SG11201708246TA; KR20180009740A; ES2886571T3

Abstract

본 발명은 PPP1R15A 및 PPP1R15B의 억제제 및 이의 치료에서의 사용, 특히 PPP1R15A 및 PPP1R15B의 억제에 의해 완화되는 질환 상태의 치료에서의, 예를 들어 오폴딩된 단백질 또는 단백질 항상성 장애의 축적과 관련된 장애의 치료에 대한 이의 사용에 관한 것이다. 본 발명의 화합물은 R^1a, R^3a, R^5a, X^a 및 Y^a가 본원에서 정의된 바와 같은 화학식 IA의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다.

(IA)

Description

억제제 및 이의 사용

본 발명은 PPP1R15A 및 PPP1R15B의 억제제 및 이의 치료에서의 사용에 관한 것이다.

단백질의 가역적인 인산화는 세포 및 유기체 기능의 거의 모든 측면을 제어하여 키나아제 및 포스파타제의 길항 작용을 통해 세포가 갑작스러운 변화에 적응하도록 한다. 결과적으로, 표적 인산화는 광범위한 치료 기회를 제공하며, 3000 개가 넘는 승인된 실험용 약품을 사용하는 오늘날의 제약 연구에서 가장 널리 사용되는 약물 표적으로 키나아제가 생겨났다. 그러나, 포스파타제를 표적으로 하는 것은 원칙적으로 키나아제만큼 흥미로워야 하지만, 포스파타제의 치료 가능성은 간과되어왔다. 대부분의 단백질 인산화는 세린 및 트레오닌에서 일어나며 선택적 세린 / 트레오닌 탈인산화는 수백 개의 다양한 조절 서브 유닛 중 하나와 결합된 소수의 촉매 서브 유닛 중 하나로부터 조립된 수백 가지의 이량체 또는 삼량체 올리고 효소에 의해 수행된다(Heroes et al. FEBS Journal, 280, 584-595, 2012). 따라서, PP1c와 같은 홀로효소(holoenzyme)의 촉매 성분의 억제는 수백 개의 포스파타제의 억제를 초래하고 독성이다. 선택성은 약물 발달을 위한 중요한 특성이기 때문에, 촉매 인산 가수 분해 효소의 난잡함은 그들로 하여금 논쟁의 여지가 없다는 평판을 얻게했다.

eIF2α의 α 서브유닛의 인산화는 다양한 스트레스에 대한 방어의 첫 번째 라인이며 이로 인해 부분적으로 중복되는 신호 전달 경로의 핵심 요소인 폴딩되지 않은 단백질 반응 (Unfolded Protein Response , UPR)과 통합적인 스트레스 대응 (Integrated Stress Response , ISR)이다. eIF2α 인산화를 역전시키기 위해, 포유류 세포는 2 개의 eIF2α 포스파타제를 갖는다. eIF2α 포스파타제는 약 200 개의 다른 포스파타제와 함께 촉매 서브 유닛 PP1c를 공유하는 PPP1R15A (Novoa 등, The Journal of Cell Biology, 153, 1345-1355, 2001) , 스트레스 유도성 단백질 또는 구성성으로 발현되는 PPP1R15B (Jousse 등, The Journal of Cell Biology, 163, 767-775, 2003) 이량체 홀로효소이다.

최근, 세린 / 트레오닌 포스파타제를 선택적으로 억제하는 가능성이 입증되었다. WO2014108520 (Medical Research Council)에 게재된 Guanabenz (Tsaytler et al., Science, 332, 91-94, 2011; Tsaytler and Bertolotti, FEBS Journal, 280, 766-770, 2012) 및 이의 유도체 중 일부는 세린 / 트레오닌 단백질 인산 가수 분해 효소 1의 스트레스 - 유도 조절 서브 유닛 인 PPP1R15A / GADD34를 선택적으로 억제하는 것으로 밝혀졌고, 오폴딩된 단백질 스트레스와 관련된 질병 치료제로 제안되었다.

PPP1R15A 억제는 PPP1R15A와 PP1로 구성된 스트레스-유도 eIF2α 포스파타제를 선택적으로 저해하는 반면, 고도의 관련성을 지닌 포스파타제 인 PPP1R15B-PP1은 억제한다. PPP1R15A 억제는 스트레스가 가해진 세포에서 eIF2α 인산화를 연장시키고 스트레스를 받은 세포에서 번역(translation) 감소를 연장시킨다. 결과적으로, 번역이 감소될 때 새로 합성된 단백질의 폴딩을 돕는 데에 일반적으로 관여하는 샤페론이 이용 가능하기 때문에 스트레스가 가해진 세포에서 샤페론 가용성이 증가한다. 이는 단백질 폴딩을 선호하고 단백질 항상성의 결점으로부터 세포를 구한다. 따라서, 원칙적으로 PPP1R15A 억제제는 단백질 오폴딩 스트레스를 포함하는 포유 동물의 질병을 치료할 수 있다. 포유 동물에서 PPP1R15A의 억제는 PPP1R15A / GADD34 녹아웃 마우스가 야생형 마우스와 크게 구분할 수 없으므로 PPP1R15A의 억제가 안전하다고 예측되기 때문에 흥미로운 치료 잠재력을 가진다(Marciniak et al., Genes & Development, 18, 3066-3077, 2004). 그러나 PPP1R15A 억제제로 치료할 수 있는 치료 적응증의 수는 PPP1R15A가 발현되는 곳과 PPP1R15A가 질병 모드 활성인 곳으로 제한되는 것으로 예측된다. 따라서 PPP1R15A의 저해는 강력하고 안전 할 수 있지만 PPP1R15A를 포함하는 질병으로 제한될 것이다.

PPP1R15A 억제와 관련된 제한 사항과 관계없이, 샤프론 가용성을 높이기 위해 미세 조정 번역(fine tuning translation)을 통해 단백질 항상성을 복원하는 접근법은 이론적으로 강력하고 직설적이며 오폴딩된 단백질을 포함하는 광범위한 질환의 교정에 적용 가능하다. 상술한 바와 같이, PPP1R15A 억제제의 사용은 PPP1R15A가 발현되는 곳과 PPP1R15A가 질병 모드 활성인 곳으로 제한 될 것이다. 이는 심각한 한계를 나타낸다. 따라서 광범위한 치료 잠재력을 갖는 대안적인 접근법이 필요하며, 본 발명은 이를 제공하고자 한다.

PPP1R15A 및 PPP1R15B를 억제하는 화합물은 PPP1R15A를 선택적으로 억제하는 화합물보다 넓은 범위의 질환을 치료하는데 유리하게 사용될 수 있다.

첫번째 측면에서, 본 발명은 화학식 IA의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:

(IA)

여기서:

X^a 은 N 또는 CR^2a이고;

Y^a는 N 또는 CR^4a이고;

R^1a은 H, F, Cl 또는 Br이고;

R^2a, R^3a, R^4a, R^5a 은 각각 독립적으로 H, F 또는 Cl이고;

하기의 단서가 있고:

X^a 및 Y^a가 CR^2a 및 CR^4a를 각각 나타내고 R^2a 및 R^4a가 모두 H 인 경우:

R^3a 및 R^5a가 모두 H를 나타내는 경우, R^1a는 F, Cl 또는 Br가 아니며;

R^1a가 Cl이고 R^2a가 H 인 경우, R^5a는 F 또는 Cl이 아니며;

R^1a가 Cl이고 R^5a가 H 인 경우, R^3a는 F가 아니며;

R^1a 및 R^5a가 모두 H이거나 R^1a가 Cl이고 R^5a가 H 인 경우, R^3a는 Cl이 아니며;

R^1a, R^3a 및 R^5a는 모두 H는 아니며;

R^3a가 H이고 R^5a가 F 인 경우, R^1a는 Cl이 아니고;

X^a가 CH를 나타내고, Y^a가 CR^4a를 나타내고, 여기서 R^4a가 Cl일 때:

R^1a 및 R^5a는 둘 다 Cl은 아니며;

R^1a 및 R^5a가 Cl 인 경우, R^3a는 Cl이 아니며;

X^a가 CR^2a이고 Y^a가 CR^4a이고 R^2a 및 R^4a가 모두 Cl 인 경우, R^1a, R^3a 및 R^5a는 모두 H는 아니다.

일 구현예에 있어서, X^a 가 CR^2a 이고, Y^a 가 CR^4a이고 여기서 R^2a 및 R^4a 는 각각 독립적으로 H, F 또는 Cl을 나타낸다.

일 구현예에 있어서, R^1a, R^2a, R^3a, R^4a 및 R^5a 중 3개는 Cl 또는 F를 나타내고, R^1a, R^2a, R^3a, R^4a 및 R^5a 중 2개는 H를 나타내고, 여기서 선택적으로 R^1a, R^2a, R^3a, R^4a 및 R^5a 중 하나 이상은 F이다.

일 구현예에 있어서, R^1a, R^2a, R^3a, R^4a 및 R^5a 중 3개는 Cl을 나타내고, R^1a, R^2a, R^3a, R^4a 및 R^5a 중 2개는 H이다.

일 구현예에 있어서, R^3a는 Cl 또는 F이고, R^1a, R^2a, R^4a 및 R^5a는 H, F 및 Cl로부터 독립적으로 선택되고, 여기서, R^1a, R^2a, R^4a 및 R^5a 중 2 개는 F 및 Cl로부터 선택되고, R^1a, R^2a, R^4a 및 R^5a 중 2개는 H이다.

일 구현예에 있어서, R^5a 는 H이다.

일 구현예에 있어서, 상기 화학식 IA의 화합물은 E-이성질체 형태이다.

본 발명의 두번째 측면은 PPP1R15A 및 PPP1R15B의 억제에 의해 완화되는 질환 상태의 치료에서의 사용을 위한 화학식 IB의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것이다:

(IB)

여기서,

X^b 는 N 또는 CR^2b이고;

Y^b 는 N 또는 CR^4b이고;

R^1b 는 H, F, Cl 또는 Br이고;

R^2b, R^3b, R^4b, R^5b 는 각각 독립적으로 H, F 또는 Cl를 나타내고;

하기의 단서가 있고:

X^b 및 Y^b 가 모두 N을 나타낼 때, R^1b 및 R^3b 는 모두 Cl이고;

X^b 가 CR^2b 이고, R^2b 가 Cl일 때, R^1b 은 Br이 아니고;

R^3b 및 R^4b 가 모두 H일 때, R^1b 및 R^2b 는 모두 Cl이 아니고;

X^b가 CR^2b이고, R^2b 및 R^3b가 모두 H 인 경우, Y^b가 CR^4b이고 R^4b가 F 일 때 R^1b는 Cl이 아니며;

X^b가 CR^2b이고 Y^b가 CR^4b 일 때, R^1b, R^2b, R^3b, R^4b 및 R^5b는 모두 H가 아니며;

X^b가 CR^2b이고 Y^b가 CR^4b 이고 R^2b, R^3b, R^4b 및 R^5b가 H 인 경우, R^1b는 Cl이 아니며;

X^b가 CR^2b이고 Y^b가 CR^4b 이고 R^2b, R^3b,및 R^4b가 H 인 경우, R^5b 가 F 일 때, R^1b는 Cl이 아니다.

일 구현예에 있어서, X^b 가 CR^2b 를 나타내고 Y^b 가 CR^4b를 나타내고, 여기서 R^2b 및 R^4b 는 각각 독립적으로 H, F 또는 Cl을 나타낸다.

일 구현예에 있어서, R^1b, R^2b, R^3b, R^4b 및 R^5b 중 3개는 Cl이고, R^1b, R^2b, R^3b, R^4b 및 R^5b 중 2개는 H이다.

일 구현예에 있어서, R^1b, R^2b, R^3b, R^4b 및 R^5b 중 3개는 Cl 또는 F이고, R^1b, R^2b, R^3b, R^4b 및 R^5b 중 2개는 H를 나타내고, 여기서 선택적으로 R^1b, R^2b, R^3b, R^4b 및 R^5b 중 하나 이상은 F이다.

일 구현예에 있어서, R^3b 는 Cl 또는 F이고, R^1b, R^2b, R^4b 및 R^5b 는 독립적으로 H, F 및 Cl로부터 선택되고, 여기서 R^1b, R^2b, R^4b 및 R^5b 중 3개는 F 및 Cl로부터 선택되고, R^1b, R^2b, R^4b 및 R^5b 중 1개는 H이다.

일 구현예에 있어서, R^5a 는 H이다.

일 구현예에 있어서, 상기 화학식 IB의 화합물은 E-이성질체 형태이다.

본 발명의 다른 측면은 치료에의 사용을 위한 화학식 IA의 화합물에 관한 것이다.

본 발명의 다른 측면은 PPP1R15A 및 PPP1R15B의 억제로 인해 완화되는 질환 상태 치료에서의 사용을 위한 화학식 IA 또는 화학식 IB 화합물에 관한 것이다.

본 발명의 다른 측면은 PPP1R15A 및 PPP1R15B의 억제로 인해 완화되는 질환 상태 치료를 위한 약물의 제조에서의 화학식 IA 또는 화학식 IB 화합물의 사용에 관한 것이다.

본 발명의 다른 측면은 화학식 IA 또는 화학식 IB 화합물의 치료학적으로 유효한 양을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는 PPP1R15A 및 PPP1R15B의 억제로 인해 완화되는 질환 상태 치료방법에 관한 것이다.

일 구현예에 있어서, 상기 PPP1R15A 및 PPP1R15B의 억제로 인해 완화되는 질환 상태는 오폴딩된 단백질 또는 단백질 항상성 장애의 축적과 관련된 장애이다.

다른 구현예에 있어서, 상기 질환은 헌팅턴병, 파킨슨병, 타우병증, 단백질 이동(protein trafficking) 질환 또는 미엘린 장애이다.

또 다른 구현예에 있어서, 상기 질환 어느 폴리글루타민 장애이다.

다른 구현예에 있어서, 상기 질환은 샤페론 HSJ1에 돌연변이를 가지는 원위유전운동신경병증(Distal hereditary motor neuropathy)이다.

본 발명의 다른 측면은 적합한 약학적으로 허용가능한 희석제, 부형제 또는 담체와 혼합된 상기 기술한 화학식 IA 또는 화학식 IB 화합물을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 특정 실시예는 하기 도면을 참조하여 예로서만 기술될 것이다:
도 1은 실시예 1의 R15B 억제제의 R15A-PP1 보다 R15B-PP1에 대한 선택적 결합을 나타낸다(선택적 R15B 억제제 (실시예 1의 화합물)의 R15B-PP1에 대한 선택적 결합).
도 2는 선택적 R15B 억제제(실시예 1의 화합물)는 스트레스가 없을 때, 세포에서 eIF2α의 일시적인 인산화를 유도하고 세포에서 R15A의 발현을 유도하는 것을 보여준다.
도 3은 선택적 R15B 억제제 (실시예 1의 화합물)는 세포를 스트레스로부터 보호한다는 것을 보여준다.
도 4는 스트레스에 따른 elF2α 인산화에 대한 선택적 R15B 억제제의 효과를 보여준다. 상기 실시예 1의 화합물은 R15A 가 아직 발현되지 않은 시기에서 스트레스에 따른 eIF2 α 인산화를 연장시킨다(선택적 R15B 억제제는 스트레스 회복 동안 eIF2α 인산화를 연장시킨다).
도 5는 광범위한 조직 분포를 나타내는 실시예 1의 화합물의 조직 분포를 나타낸다(경구 투여(2 mg / kg) 1 시간 후 마우스에서의 실시예 1의 조직 분포).
도 6은 실시예 1의 화합물(10 mg/kg)을 사용한 마우스의 마우스에 치료가 비독성임을 나타낸다.
도 7 은 실시예 1의 화합물 (10 mg / kg)을 투여한 마우스가 Guanabenz의 부작용을 일으키지 않는다는 것을 보여준다(실시예 1의 화합물로 마우스를 처리 한 결과, Guanabenz의 부작용은 발생하지 않았다. 마우스를 Guanabenz(10mg / kg) 또는 실시예 1의 화합물로 경구 투여하고, 투여 후 30 분 동안 그들의 활성을 평가 하였다).
도 8 은 실시예 1의 화합물로 처리한 후의 포유 동물에서의 R15A의 유도를 나타낸다.
도 9 는 포유류에서 질환 예방에 있어 실시예 1의 R15B 억제제의 효과를 보여준다. 도 8에서 사용된 예는 마우스 모델 HD82Gln을 사용하는 헌팅턴병이다(Schilling et al., Hum. Mol. Genet., 8, 387-407, 1999). WT: wild-type mice. Tg: HD82Gln.
도 10 은 배양된 척추 신경절 (dorsal root ganglia, DRG)에서 빨간색 (막대 모양)의 미엘린 마디 사이를 보여주고 운반체 또는 실시예 1의 화합물로 치료한 표시된 유전자형의 푸른색 핵 (구형 모양)을 나타낸다. PMP22 돌연변이 마우스에서 미엘린 마디 사이는 더 짧다. 실시예 1의 화합물로 치료하면 돌연변이 DRG에서 미엘린 마디 사이의 길이가 증가되어 미엘린 형성이 개선됨이 드러났다(실시예 I의 화합물은 신경 병증성 마우스로부터 외식 세포 배양에서 미엘린 형성을 개선한다).
도 11 은 실시예 1의 화합물로 치료한 후 비만 마우스 db/db 동물 (조건 당 n = 5)의 혈당 수치를 나타낸다(실시예 1의 화합물은 대사 장애를 감소시킨다).
도 12는 선택적인 R15A 억제제 (제 1 컬럼 - guanabenz (GBZ)), 선택적인 R15B 억제제 (제 2 칼럼 - 화합물 16 (TST3)), GBZ 및 TST3 (제 3 칼럼)의 조합 및 R15A / B 억제제 (제 4 칼럼 - 화합물 10)을 나타낸다. 상기 도면은 선택적 R15A 억제제가 스트레스를 받지 않은 세포에서 단백질 합성을 억제하지 않는다는 것을 보여준다.
선택적 R15B 억제제는 스트레스를 받지 않은 세포에서 일시적으로 단백질 합성을 억제한다. R15A 및 R15B 억제제를 조합하면 단백질 합성이 지속적으로 억제된다. 마찬가지로, R15A / B 억제제는 단백질 합성을 지속적으로 억제한다. Y 축은 단백질 합성의 상대적 비율을 보여준다. X 축은 시약 (10 μM)을 첨가 한 후의 시간을 시간 (h)으로 나타낸다(단백질 합성 속도 모니터링는 R15A, R15B 및 R15A / B 억제제를 구별한다).
도 13은 R15A / B 억제제 (20μM에서 화합물 10)가 ATF4의 발현을 유도하여 화합물이 목표 효과임을 확인하는 면역 블롯(immunoblot)를 보여준다. 배양중인 세포에 화합물을 첨가한 후 시간을 ATF4 면역 블롯 (0, 2, 5, 7.5 시간) 아래에 나타내었다.

(IA)

여기서:

X^a 은 N 또는 CR^2a이고;

Y^a는 N 또는 CR^4a이고;

R^1a은 H, F, Cl 또는 Br이고;

R^2a, R^3a, R^4a, R^5a 은 각각 독립적으로 H, F 또는 Cl이고;

하기의 단서가 있고:

R^1a가 Cl이고 R^2a가 H 인 경우, R^5a는 F 또는 Cl이 아니며;

R^1a가 Cl이고 R^5a가 H 인 경우, R^3a는 F가 아니며;

R^1a, R^3a 및 R^5a는 모두 H는 아니며;

R^3a가 H이고 R^5a가 F 인 경우, R^1a는 Cl이 아니고;

X^a가 CH를 나타내고, Y^a가 CR^4a를 나타내고, 상기 R^4a가 Cl일 때:

R^1a 및 R^5a 는 모두 Cl이 아니고;

R^1a 및 R^5a 는 모두 Cl일 경우 R^3a 는 Cl이 아니고;

X^a가 CR^2a이고 Y^a가 CR^4a이고 R^2a 및 R^4a가 모두 Cl일 때, R^1a, R^3a 및 R^5a는 모두 H가 아니다.

일 구현예에 있어서, R^1a 는 F, Cl 또는 Br이다.

또 다른 구현예에 있어서, R^3a 는 F 또는 Cl이다.

또 다른 구현예에 있어서, R^5a 는 H이다.

일 구현예에 있어서, X^a 가 CR^2a 을 나타내고, Y^a 가 CR^4a을 나타낼 때, R^1a, R^2a, R^3a, R^4a 및 R^5a 중 2개는 Cl을 나타낸다.

일 구현예에 있어서, X^a 가 CR^2a 을 나타내고, Y^a 가 CR^4a을 나타낼 때, R^1a, R^2a, R^3a, R^4a 및 R^5a 중 하나는 Cl을 나타내고 R^1a, R^2a, R^3a, R^4a 및 R^5a 중 하나는 F를 나타낸다.

일 구현예에 있어서, X^a 가 CR^2a 을 나타내고, Y^a 가 CR^4a을 나타낼 때, R^1a, R^2a, R^3a, R^4a 및 R^5a 중 하나는 Cl을 나타내고, R^1a, R^2a, R^3a, R^4a 및 R^5a 중 하나는 Br을 나타낸다.

일 구현예에 있어서, R^1a 및 R^3a 는 모두 Cl이다.

일 구현예에 있어서, X^a 가 CR^2a 을 나타내고, Y^a 가 CR^4a을 나타낼 때, R^1a, R^2a, R^3a, R^4a 및 R^5a 중 3개는 Cl이고, R^1a, R^2a, R^3a, R^4a 및 R^5a 중 두개는 H이다.

일 구현예에 있어서, X^a 가 CR^2a 을 나타내고, Y^a 가 CR^4a을 나타낼 때, R^1a, R^2a, R^3a, R^4a 및 R^5a 중 2개는 Cl이고, , R^1a, R^2a, R^3a, R^4a 및 R^5a 중 1개는 F이고, , R^1a, R^2a, R^3a, R^4a 및 R^5a 중 2개는 H이다.

일 구현예에 있어서, X^a 가 CR^2a 을 나타내고, Y^a 가 CR^4a을 나타낼 때, R^1a, R^2a, R^3a, R^4a 및 R^5a 중 2개는 F이고, R^1a, R^2a, R^3a, R^4a 및 R^5a 중 1개는 Cl 이고, R^1a, R^2a, R^3a, R^4a 및 R^5a 중 2개는 H이다.

일 구현예에 있어서, R^1a, R^2a, R^3a, R^4a 및 R^5a 중 3개는 Cl 또는 F이고, R^1a, R^2a, R^3a, R^4a 및 R^5a 중 2개는 H이고, 선택적으로 여기서 R^1a, R^2a, R^3a, R^4a 및 R^5a 중 하나 이상은 F이다.

일 구현예에 있어서, X^a 가 CR^2a 을 나타내고, Y^a 가 CR^4a을 나타낼 때, R^3a 는 Cl 또는 F이고, R^1a, R^2a, R^4a 및 R^5a 중 2개는 F 및 Cl로부터 선택되고, R^1a, R^2a, R^4a 및 R^5a 중 2개는 H이다.

일 구현예에 있어서, X^a 가 N를 나타낼 때, R^1a 및 R^3a 는 모두 Cl을 나타낸다.

일 구현예에 있어서,

X^a는 CR^2a이고;

Y^a는 CR^4a이고;

R^1a 는 H, F, Cl 또는 Br이고;

R^2a, R^3a 및 R^4a 는 각각 독립적으로 H, F 또는 Cl을 나타내고;

R^5a는 H를 나타내고;

하기의 단서가 있고:

X^a 및 Y^a 가 CH를 나타낼 때:

R^1a가 Cl이고 R^2a가 H 인 경우, R^5a는 F 또는 Cl이 아니며;

R^1a가 Cl이고 R^5a가 H 인 경우, R3a는 F가 아니며;

R^1a, R^3a 및 R^5a는 모두 H는 아니며;

R^3a가 H이고 R^5a가 F 인 경우 R^1a는 Cl이 아니고;

X^a가 CH를 나타내고, Y^a가 CR^4a를 나타내고, R^4a가 Cl일 때:

R^1a 및 R^5a는 둘 다 Cl은 아니며;

R^1a 및 R^5a가 Cl 인 경우, R^3a는 Cl이 아니며;

(IB)

여기서,

X^b 는 N 또는 CR^2b이고;

Y^b 는 N 또는 CR^4b이고;

R^1b 는 H, F, Cl 또는 Br이고;

하기의 단서가 있고:

X^b 및 Y^b 가 모두 N을 나타낼 때, R^1b 및 R^3b 는 모두 Cl이고;

X^b 가 CR^2b 이고, R^2b 가 Cl일 때, R^1b 은 Br이 아니고;

R^3b 및 R^4b 가 모두 H일 때, R^1b 및 R^2b 는 모두 Cl이 아니고;

X^b가 CR^2b이고 Y^b가 CR^4b 이고 R^2b, R^3b,및 R^4b가 H 인 경우, R^5b 가 F 일 때, R^1b는 Cl이 아니고;

X^b가 CR^2b이고 여기서 R^2b가 Cl이고 Y^b가 CR^4b이고 여기서 R^4b가 H일 경우, R^3b, R^4b 및 R^5b가 H일 때 또는 R^3b 및 R^4b가 H이고, R^5b가 Cl일 때, R^1b는 Cl이 아니다.

일 구현예에 있어서, X^a가 CR^2a이고 Y^a가 CR^4a이다. 대안적인 구현예에 있어서, X^b 및 Y^b 는 모두 N이다. 대안적인 구현예에 있어서, X^b 는 N을 나타내고 Y^b 는 CR^4b을 나타낸다.

상기 화학식 IB의 화합물은 R15A 및 R15B 억제제이다.

일 구현예에 있어서, R^1b 는 F, Cl 또는 Br을 나타낸다.

또 다른 구현예에 있어서, R^3b 는 F 또는 Cl을 나타낸다.

또 다른 구현예에 있어서, R^5b 는 H이다.

일 구현예에 있어서, X^b 가 CR^2b 를 나타내고 Y^b 가 CR^4b를 나타낼 때, R^1b, R^2b, R^3b, R^4b 및 R^5b 중 2개는 Cl를 나타낸다.

일 구현예에 있어서, X^b 가 CR^2b 를 나타내고 Y^b 가 CR^4b를 나타낼 때, R^1b, R^2b, R^3b, R^4b 및 R^5b 중 1개는 Cl을 나타내고 R^1b, R^2b, R^3b, R^4b 및 R^5b 중 1개는 F를 나타낸다.

일 구현예에 있어서, R^1b 및 R^3b 는 모두 Cl이다.

일 구현예에 있어서, X^b 가 CR^2b 를 나타내고 Y^b 가 CR^4b를 나타낼 때, R^1b, R^2b, R^3b, R^4b 및 R^5b 중 3개는 Cl을 나타낸다.

일 구현예에 있어서, X^b 가 CR^2b 를 나타내고 Y^b 가 CR^4b를 나타낼 때, R^1b, R^2b, R^3b, R^4b 및 R^5b 중 2개는 Cl을 나타내고 R^1b, R^2b, R^3b, R^4b 및 R^5b 중 1개는 F를 나타낸다.

일 구현예에 있어서, X^b 가 CR^2b 를 나타내고 Y^b 가 CR^4b를 나타낼 때, R^1b, R^2b, R^3b, R^4b 및 R^5b 중 2개는 F을 나타내고 R^1b, R^2b, R^3b, R^4b 및 R^5b 중 1개는 Cl를 나타낸다.

일 구현예에 있어서, R^1a, R^2a, R^3a, R^4a 및 R^5a 는 Cl 또는 F이고, R^1a, R^2a, R^3a, R^4a 및 R^5a 중 2개는 H를 나타내고, 선택적으로 여기서 R^1a, R^2a, R^3a, R^4a 및 R^5a 중 하나 이상은 F이다.

일 구현예에 있어서, X^b 이 N을 나타낼 때, R^1b 및 R^3b 는 모두 Cl을 나타낸다.

일 구현예에 있어서,

X^b 는 CR^2a이고;

Y^b 는 CR^4a이고;

R^1b 는 H, F, Cl 또는 Br이고;

R^2b, R^3b 및 R^4b 는 각각 독립적으로 H, F 또는 Cl을 나타내고;

R^5b 는 H이고;

하기의 단서가 있고:

X^b 및 Y^b 가 모두 N을 나타낼 때, R^1b 및 R^3b 는 모두 Cl이고;

X^b 가 CR^2b 이고, R^2b 가 Cl일 때, R^1b 은 Br이 아니고;

R^3b 및 R^4b 가 모두 H일 때, R^1b 및 R^2b 는 모두 Cl이 아니고;

X^b가 CR^2b이고 when X^b is CR^2b wherein R^2b is Cl and Y^b is CR^4b wherein R^4b is H, R^1b is not Cl when R^3b, R^4b and R^5b are H, or when R^3b and R^4b are H and R^5b is Cl.

상기 용어 "PPP1R15A"는 용어 "R15A"와 상호 교환 가능하며, 용어 "PPP1R15B"는 용어 "R15B"와 상호 교환적으로 사용된다. PPP1R15A 및 PPP1R15B의 억제제는 전체적으로 "R15A / B", "R15AB"또는 "AB"로 지칭 될 수있다.

본원에 기재된 화합물은 하기를 포함한다 :

화합물 1
화합물 2
화합물 3
화합물 4
화합물 5
화합물 6
화합물 7
화합물 8
화합물 9
화합물 10
화합물 11
화합물 12
화합물 13
화합물 14
화합물 15
화합물 16
화합물 17
화합물 18
화합물 20
화합물 21
화합물 22
화합물 23
화합물 24
화합물 25
화합물 26
화합물 27
화합물 29
화합물 30
화합물 31
화합물 32
화합물 33
화합물 34

상기 나열된 화합물의 E-이성질체 형태가 특히 바람직하다 :

화합물 1(E)	(E)-2-((4-클로로페닐)메틸렌)히드라진-1-카복시미드아미드
화합물 2 (E)	(E)-2-((2,4-디클로로피리미딘-5-일)메틸렌)히드라진-1-카복시미드아미드
화합물 3 (E)	(E)-2-(3,4,5-트리클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
화합물 4 (E)	(E)-2-(2,4,5-트리클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
화합물 5 (E)	(E)-2-(3,5-디클로로-4-플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
화합물 6 (E)	(E)-2-(2,3,4-트리클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
화합물 7 (E)	(E)-2-(2,4-디클로로-5-플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
화합물 8 (E)	(E)-2-(4-클로로-3-플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
화합물 9 (E)	(E)-2-(2-브로모-3-클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
화합물 10 (E)	(E)-2-(2,3,5-트리클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
화합물 11 (E)	(E)-2-(3,4-디클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
화합물 12 (E)	(E)-2-(2,4-디클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
화합물 13 (E)	(E)-2-(2,4-디클로로-3-플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
화합물 14 (E)	(E)-2-(2,3-디클로로-4-플루오로벤질리덴)히드라진-1- 카복시미드아미드
화합물 15 (E)	(E)-2-(3-클로로-4-플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
화합물 16 (E) (실시예 1)	(E)-2-(2,3-디클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
화합물 17 (E)	(E)-2-(2-플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
화합물 18 (E)	(E)-2-(4,5-디클로로-2-플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
화합물 20 (E)	(E)-2-(2-클로로-5-플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
화합물 21 (E)	(E)-2-((2-클로로피리딘-3-일)메틸렌)히드라진-1-카복시미드아미드
화합물 22 (E)	(E)-2-((2,6-디클로로피리딘-3-일)메틸렌)히드라진-1-카복시미드아미드
화합물 23 (E)	(E)-2-(3-플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
화합물 24 (E)	(E)-2-(3-클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
화합물 25 (E)	(E)-2-(2-클로로-3-플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
화합물 26 (E)	(E)-2-(2,5-디클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
화합물 27 (E)	(E)-2-(2-클로로-3,4-디플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
화합물 29 (E)	(E)-2-(2-클로로-3,5-디플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
화합물 30 (E)	(E)-2-(3-클로로-2-플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
화합물 31 (E)	(E)-2-(2,3,6-트리클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
화합물 32 (E)	(E)-2-(2-클로로-4,5-디플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
화합물 33 (E)	(E)-2-벤질리덴히드라진-1-카복시미드아미드
화합물 34 (E)	(E)-2-(3,5-디클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

신규한 화학식 IA의 화합물은 하기를 포함한다:

화합물 2: 2-((2,4-디클로로피리미딘-5-일)메틸렌)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 3: 2-(3,4,5-트리클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 4: 2-(2,4,5-트리클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 5: 2-(3,5-디클로로-4-플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 6: 2-(2,3,4-트리클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 7: 2-(2,4-디클로로-5-플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 9: 2-(2-브로모-3-클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 13: 2-(2,4-디클로로-3-플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 14: 2-(2,3-디클로로-4-플루오로벤질리덴)히드라진-1- 카복시미드아미드

화합물 18: 2-(4,5-디클로로-2-플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 20: 2-(2-클로로-5-플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 22: 2-((2,6-디클로로피리딘-3-일)메틸렌)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 25: 2-(2-클로로-3-플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 27: 2-(2-클로로-3,4-디플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 29: 2-(2-클로로-3,5-디플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 32: 2-(2-클로로-4,5-디플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

신규한 화학식 IA의 화합물은 하기 E-이성질체 형태로부터 선택될 수 있다:

화합물 2(E): (E)-2-((2,4-디클로로피리미딘-5-일)메틸렌)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 3(E): (E)-2-(3,4,5-트리클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 4(E): (E)-2-(2,4,5-트리클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 5(E): (E)-2-(3,5-디클로로-4-플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 6(E): (E)-2-(2,3,4-트리클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 7(E): (E)-2-(2,4-디클로로-5-플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 8(E): (E)-2-(4-클로로-3-플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 9(E): (E)-2-(2-브로모-3-클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 10(E): (E)-2-(2,3,5-트리클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 11(E): (E)-2-(3,4-디클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 13(E): (E)-2-(2,4-디클로로-3-플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 14(E): (E)-2-(2,3-디클로로-4-플루오로벤질리덴)히드라진-1- 카복시미드아미드

화합물 15(E): (E)-2-(3-클로로-4-플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 16(E): (E)-2-(2,3-디클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 18(E): (E)-2-(4,5-디클로로-2-플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 20(E): (E)-2-(2-클로로-5-플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 21(E): (E)-2-((2-클로로피리딘-3-일)메틸렌)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 22(E): (E)-2-((2,6-디클로로피리딘-3-일)메틸렌)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 23(E): (E)-2-(3-플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 24(E): (E)-2-(3-클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 25(E): (E)-2-(2-클로로-3-플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 26(E): (E)-2-(2,5-디클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 27(E): (E)-2-(2-클로로-3,4-디플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 29(E): (E)-2-(2-클로로-3,5-디플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 30(E): (E)-2-(3-클로로-2-플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 31(E): (E)-2-(2,3,6-트리클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 32(E): (E)-2-(2-클로로-4,5-디플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 34(E): (E)-2-(3,5-디클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

바람직한 구현예에서, 상기 화학식 IA의 화합물은 화합물 3, 즉 2-(3,4,5-트리클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드, 및 화합물 4, 즉 2-(2,4,5-트리클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드로부터 선택되고, 특히 상기 화학식 IA의 화합물은 (E)-2-(3,4,5-트리클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드 및 (E)-2-(2,4,5-트리클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드로부터 선택된다.

일 구현예에 있어서, 상기 화학식 IA의 화합물은 (E)-2-(3,4,5-트리클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드이다.

또 다른 구현예에서, 상기 화학식 IA의 화합물은 (E)-2-(2,4,5-트리클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드이다.

화학식 IB의 화합물은 하기로부터 선택될 수 있다:

화합물 1(E): (E)-2-((4-클로로페닐)메틸렌)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 12(E): (E)-2-(2,4-디클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

화합물 17(E): (E)-2-(2-플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

바람직한 구현예에서, 상기 화학식 IB의 화합물은 화합물 3, 즉 (E)-2-(3,4,5-트리클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드, 및 화합물 4, 즉 (E)-2-(2,4,5-트리클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드로부터 선택된다.

일 구현예에 있어서, 상기 화학식 IB의 화합물은 (E)-2-(3,4,5-트리클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드이다.

또 다른 구현예에 있어서, 상기 화학식 IB의 화합물은 (E)-2-(2,4,5-트리클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드이다.

일 구현예에 있어서, 상기 화학식 IB의 화합물은 PPP1R15A 및 PPP1R15B를 억제한다. PPP1R15A 및 PPP1R15B의 억제는 결합(binding) 분석으로부터 결정할 수 있다. 예를들어, 결합은 K_D 값을 얻기 위해 SPR (surface plasmon resonance)을 사용하여 분석될 수 있다.

PPP1R15A 및 PPP1R15B 억제제는 R15A와 R15B 사이의 K_D 값의 차이가 약 3 배 이하인 화합물로 정의 될 수 있다. 특히, R15A와 R15B 사이의 K_D 값의 차이는 약 2 배 이하이다.

예를들어, 하나의 표적에 대한 다른 표적에 대한 친화력(affinity)은 약 3 배 미만, 특히 약 2 배 미만이다. “선택적 억제제”는 R15A와 R15B 사이의 K_D 값의 차이가 3 배 이상, 더욱 바람직하게는 10 또는 20 배인 화합물로 정의 될 수 있다.

세포에서, 상기 화학식 IB의 화합물은 단백질 합성을 억제한다. Guanabenz와 달리, 스트레스 받지 않은 세포에서 단백질 합성을 억제하지 않는 R15A 억제제 (Tsaytler et al., Science, 332, 91-94, 2011), 또는 단백질 합성을 일시적으로 억제하는 R15B 억제제, 상기 R15A 및 R15B 억제제의 조합은 단백질 합성의 지속적인 억제로 이어진다(도 12). 마찬가지로, R15A 및 R15B의 억제제 (화합물 10)는 단백질 합성을 지속적으로 억제한다(도 12). ATF4는 R15A 및 R15B의 억제제에 의해 유도되어, 상기 화합물이 목표물에 있음을 확인한다 (도 13).

본원은 PPP1R15B 선택적 억제제로서 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염의 용도를 개시한다:

(I)

여기서

X는 N 또는 CR²이고;

Y는 N 또는 CR⁴이고;

R¹, R², R³ 및 R⁴ 은 독립적으로 H, Cl 또는 F이고;

하기의 단서가 있고:

X^a가 CR^2a이고 Y^a가 CR^4a일 때, 상기 화학식 (I)의 화합물은 적어도 일 치환(mono-substituted)되고;

R³ 이 Cl일 때, R² 은 Cl이 아니고;

R¹ 및 R⁴ 모두 Cl일 때, R² 는 Cl이 아니고;

상기 화학식 (I)의 화합물이 이 치환(di-substituted)될 때, X는 CR²이고, Y는 CR⁴이고 R¹ 는 Cl이고, R³ 은 Cl이 아니고;

R⁴ 이 Cl이고 화학식 (I)의 화합물이 이 치환(di-substituted)될 때, R² 는 Cl이 아니고;

R¹ 이 F일 때, R² 는 Cl이 아니고;

X 또는 Y가 N이고 상기 화학식 (I)의 화합물이 일 치환(mono-substituted)될 때, R¹ 은 Cl이 아니고;

X 이 CR²이고 Y 이 CR⁴ 이고 상기 화학식 (I)의 화합물이 일 치환(mono-substituted)될 때, R¹ 은 F 또는 Cl이 아니다.

상기 PPP1R15B 선택적 억제제, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 하기로부터 선택될 수 있다:

실시예 1 (화합물 16 (E))	(E)-2-(2,3-디클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
실시예 2	(E)-2-(2-클로로-4-플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드

염 및 에스터

본원에 기재된 상기 화합물은 염 또는 에스테르, 특히 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르로서 존재할 수 있다.

본원에 기재된 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은 이의 적절한 산 부가 염 또는 염기 염을 포함한다. 적합한 약학적 염의 검토는 Berge et al., J Pharm Sci, 66, 1-19 (1977)에 기재되어있다. 약학적으로 또는 수의학적으로 허용되지 않는 염은 중간체로서 여전히 가치가 있을 수 있다.

에스터는 에스터화되는 작용기에 따라 유기산 또는 알콜/하이드록사이드를 사용하여 형성된다.

거울상 이성질체/ 호변이성질체

앞서 논의된 본 발명의 모든 측면에서, 본 발명은 적절한 경우 본 발명의 화합물의 모든 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 및 호변이성질체를 포함한다. 당업자는 광학 특성 (하나 이상의 키랄 탄소 원자) 또는 호변이성질적 특성을 갖는 화합물을 인식할 것이다.

상응하는 거울상 이성질체 및 / 또는 호변이성질체는 당해 분야에 공지된 방법에 의해 분리 / 제조 될 수 있다. 거울상 이성질체는 키랄 중심의 절대적 배열을 특징으로 하며 Cahn, Ingold 및 Prelog의 R 및 S 시퀀싱 규칙에 의해 기술된다. 이러한 관습은 당 업계에 잘 알려져있다 (e.g. see 'Advanced Organic Chemistry', 3rd edition, ed. March, J., John Wiley and Sons, New York, 1985).

입체 및 기하 이성질체

본 발명의 화합물 중 일부는 입체 이성질체 및 / 또는 기하 이성질체 - 예를 들어, 이들은 하나 이상의 비대칭 및 / 또는 기하학 중심을 가질 수 있고, 따라서 2 개 이상의 입체 이성질체 및 / 또는 기하학적 형태로 존재할 수 있다. 본 발명은 상기 억제제의 모든 개별 입체 이성질체 및 기하 이성질체, 및 이들의 혼합물의 용도를 고려한다. 청구 범위에서 사용 된 용어는 상기 형식이 적절한 기능적 활동을 유지하는 한 (반드시 같은 정도로는 아닐지라도) 이들 형태를 포함한다.

본 발명은 또한 상기 물질(agent) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 모든 적합한 동위 원소 변형을 포함한다. 본 발명의 물질 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 동위 원소적 변형은 적어도 하나의 원자가 동일한 원자 번호를 가지지만 보통 자연적으로 발견되는 원자 질량과 상이한 원자 질량을 가지는 원자로 대체되는 것으로 정의된다. 상기 물질 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 혼입될 수 있는 동위 원소의 예로는 각각 ²H, ³H, ¹³C, ¹⁴C, ¹⁵N, ¹⁷O, ¹⁸O, ³¹P, ³²P, ³⁵S, ¹⁸F 및 ³⁶Cl와 같은 수소, 탄소, 질소, 산소, 인, 황, 불소 및 염소의 동위원소가 포함된다. 특히 상기 물질 및 이의 약학적으로 허용가능한 염의 동위 원소적 변화는 예를 들어, ³H 또는 ¹⁴C와 같은 방사성 동위 원소가 혼입 된 것들은 약물 및 / 또는 기질 조직 분포 연구에 유용하다. 삼중체, 즉 ³H 및 탄소 -14, 즉 ¹⁴C 동위 원소가 제조 및 검출 용이성 때문에 특히 바람직하다. 또한, 중수소, 즉 ²H와 같은 동위 원소로의 치환은 보다 큰 대사 안정성, 예를 들어, 생체 내 반감기의 증가 또는 투여 요구량 감소로 인해 특정 치료 이점을 제공 할 수 있으며, 따라서 일부 상황에서는 바람직 할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 임의의 수소 원자가 중수소 원자로 치환된 화학식 I의 화합물을 포함한다. 본 발명의 물질 및 이의 약학적으로 허용가능한 염의 동위 원소 변형은 일반적으로 적합한 시약의 적절한 동위 원소 변형을 사용하는 통상적인 절차에 의해 제조 될 수 있다.

프로드러그

본 발명은 프로드러그 형태의 본 발명의 화합물, 즉 생체 내에서 예시된 화합물 중 임의의 것에 따라 활성 모 약물을 방출하는 공유 결합된 화합물을 추가로 포함한다. 이러한 프로드러그는 일반적으로 인간 또는 포유 동물 대상에 투여시 변형이 복귀될 수 있도록 하나 이상의 적절한 그룹이 변형된 본 발명의 화합물이다. 생체 내 복귀를 수행하기 위해 제 2 약물이 프로드러그와 함께 투여 될 수는 있지만, 복귀은 일반적으로 그러한 대상에 자연적으로 존재하는 효소에 의해 수행된다. 그러한 변형의 예는 에스터라제 등으로 수행 될 수 있는 에스터(앞서 기술 된 것 중 임의의 것)를 포함한다. 다른 이러한 시스템은 당업자에게 잘 알려져있다.

용매화물

본 발명은 또한 본 발명의 화합물의 용매화물 형태를 포함한다. 청구 범위에서 사용 된 용어는 이러한 형태를 포함한다.

다형체 (Polymorphs)

본 발명은 또한 다양한 결정성 형태, 다형체 형태 및 (무)수화 형태의 본 발명의 화합물에 관한 것이다. 제약 산업 내에서 화학 물질은 그러한 화합물의 합성 준비에 사용된 용매의 정제 또는 분리 방법을 약간 변경함으로써 그러한 형태로 분리될 수 있다는 것은 잘 알려져있다.

치료학적 적용(THERAPEUTIC APPLICATIONS)

본원에 기술된 화합물은 다양한 질환 및 장애를 치료 및 예방하는데 있어 잠재적 치료 적용을 갖는다.

본 발명의 한 측면은 치료에 사용하기 위한 화학식 IA의 화합물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 화합물의 치료학적으로 유효한 양을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 오폴딩된 단백질 또는 단백질 항상성 섭동의 축적과 관련된 장애를 가지는 대상을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 화합물의 치료학적으로 유효한 양을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 PPP1R15A 및 PPP1R15B의 억제로 인해 완화되는 질환 상태를 가지는 대상을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 측면은 본 발명의 화합물의 치료학적으로 유효한 양을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 오폴딩된 단백질 또는 단백질 항상성 섭동의 축적과 관련된 장애의 예방 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 화합물의 치료학적으로 유효한 양을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 PPP1R15A 및 PPP1R15B의 억제로 인해 완화되는 질환 상태를 예방하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 측면은 오폴딩된 단백질 또는 단백질 항상성 섭동의 축적과 관련된 장애의 치료 또는 예방에서의 사용을 위한 화학식 IA 및 화학식 IB의 화합물에 관한 것이다.

본 발명의 다른 측면은 오폴딩된 단백질 또는 단백질 항상성 섭동의 축적과 관련된 장애의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에서의 화학식 IA 또는 화학식 IB 화합물의 사용에 관한 것이다.

본 발명의 다른 측면은 PPP1R15A 및 PPP1R15B의 억제로 인해 완화되는 질환 상태의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에서의 화학식 IA 또는 화학식 IB 화합물의 사용에 관한 것이다.

PPP1R15A 및 PPP1R15B 관련 질환은 PPP1R15A 및 PPP1R15B를 억제함으로써 개선될 수 있는 질환이다. 상기는 헌팅턴병(Huntington's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 운동 실조증(ataxias) 및 기타 폴리글루타민 장애(other polyglutamine disorders), 망막변성증(retinal degeneration), 녹내장(glaucoma), 근위축성 측삭경화증 (amyotrophic lateral sclerosis , ALS) 및 프라이온병(prion diseases); 미세 소관 관련 단백질 타우의 응집과 관련된 장애(disorders associated with aggregation of the microtubule-associated protein tau)와 같은 오폴딩된 단백질(misfolded proteins) 또는 단백질 항상성 (protein homeostasis , proteostasis)의 섭동의 축적과 관련된 장애를 포함하고, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis),파킨슨증 치매 복합체(parkinsonism-dementia complex), 호은성의 입자 질병(argyrophilic grain disease), 만성외상성뇌병증(chronic traumatic encephalopathy), 피질기저핵변성(corticobasal degeneration), 석회화를 동반하는 광범위 신경섬유 농축체(diffuse neurofibrillary tangles with calcification , DNTC), 다운 증후군(Down's syndrome), 가족형영국형치매 (familial British dementia, FBD), 가족형덴마크형치매 (familial Danish dementia, FDD), 전두측두엽 치매(frontotemporal dementia), 염색체 17번 연관 파킨슨증후군(parkinsonism linked to chromosome 17, FTDP-17), 전두측두엽변성(frontotemporal lobar degeneration, FTLD), 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커 증후군(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease), 과들루프 파킨슨증후군(Gaudeloupean parkinsonism), 근긴장성이영양증(myotonic dystrophy), 뇌에 철 침착을 가진 신경변성 (neurodegeneration with brain iron accumulation), C형 니만피크병(Niemann-Pick disease type C), 신경원섬유 매듭을 동반하는 비-과메이니언 운동뉴론질환(Non-Guamanian motor neuron disease with neurofibrillary tangles), 피크병(Pick's disease), 뇌염후 파킨슨증상(Postencephalitic parkinsonism), 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 맥관병증(Prion protein cerebral amyloid angiopathy), 진행성 피질하 신경교종(Progressive subcortical gliosis), 진행성 핵상 마비(Progressive supranuclear palsy), SLC9A6-관련 지적 장애 (SLC9A6-related mental retardation), 아급성 경화성 범뇌염(Subacute sclerosing panencephalitis), 신경원섬유 매듭-우세 치매(tangle-only dementia), 및 구형 글리알 함유물을 동반하는 백질 타우병증 (white matter tauopathy with globular glial includsions); 다발성 경화증(multiple sclerosis), 펠리제우스-메르츠바하병(Pelizaeus-Merzbacher disease), VWM 병(vanishing white matter disease), 급성 횡단성 척수염(acute disseminated encephalomyelitis), 뇌실주위백질연화증(periventricular leukomalacia), 뇌실 주위 백질손상(periventricular white matter injury), 척수매독(Tabes Dorsalis), 데빅병(Devic's disease), 시신경염(optic neuritis), 진행성 다초점 백색질 뇌증(progressive multifocal leukoencephalopathy), 횡단척수염(transverse myelitis), 만성염증탈수초다발신경병증 (chronic inflammatory demyelinating polyneuropathyl), anti-MAG 말초신경병증(anti-MAG peripheral neuropathy), 부신백질이영양증(adrenoleukodystrophy), 부신척수신경병증(adrenomyeloneuropathy), 확산 백질 손상(diffuse white matter injury), 길랭-바레 증후군(Guillain-Barre Syndrome), 중심성 뇌교 수초용해(central pontine myelinolysis), 백질이영양증과 같은 유전성 탈수초성 질환(inherited demyelinating diseases such as leukodystrophy), 및 샤리코-마리-투스병(Charcot Marie Tooth disease)과 같은 미엘린 장애(myelin disorders); 낭포성섬유증(cystic fibrosis), 선천성 갑상선 기능 저하증(congenital hypothyroid goieter), 가족형 신경하수체 당뇨병(familial neurohypophyseal diabetes), 불완전골생성증을 포함하는 프로콜라겐 생합성 장애(procollagen biosynthesis disorders including osteogenesis imperfect), 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia), 알파 1 항트립신 결핍증(alpha-1 antitrypsin deficiencies), 리소좀 장애(lysomal disorder), 망막색소변성증(retinis pigmentosa (RP)), 및 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease)과 같은 소포체(endoplasmic reticulum (ER))에서 제조된 어느 단백질의 오폴딩 또는 이동 결함에 의해 유발되는 질환; 당뇨병(diabetes), 울콧랠리슨 증후군(Wolcott-Rallison syndrome), 비만(obesity), 인슐린 저항성(insulin resistance), 고지혈증(hyperlipidemia), 지방간(fatty liver disease) 및 죽상동맥경화증(atherosclerosis)과 같은 대사 질환(metabolic diseases); 암(cancer); 노화(aging); 염증(inflammation); 및 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis),제1형 당뇨병(type-1 diabetes) 및 백반증(vitiligo)을 포함하는 다른 장애; 를 포함한다.

하나의 바람직한 구현예에 있어서, 본원에 기술 된 화합물은 병리학 적 UPR 또는 ISR과 관련된 장애 및 / 또는 단백질 항상성의 결함을 치료하는데 사용하기 위한 것이다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "방법(method)"이라는 용어는 주어진 작업을 수행하기 위한 방법, 수단, 기술 및 절차를 말하며, 화학적, 약리학 적, 생물학적, 생화학 적 및 의학적 분야에 종사하는 사람들이 알고있는 방법, 수단, 기술 및 절차로 알려져 있거나 쉽게 개발된 방법, 수단, 기법 및 절차를 포함하되 이에 국한되지는 않는다.

용어 "치료학적으로 유효한 양(therapeutically effective amount) "는 치료되는 장애의 질환의 증상 중 하나 이상의 증상을 어느 정도 완화시키는 투여되는 화합물의 양을 지칭한다.

본원에서, "치료하는(treating)"이란 용어는 질환 또는 장애의 진행을 억제, 실질적으로 억제, 지연 또는 복귀시키고, 질환 또는 장애의 임상 증상을 실질적으로 개선하고, 또는 질환 또는 장애의 임상 증상의 출현을 예방하는 것을 포함한다.

"약물의 제조(manufacture of a medicament)"라는 문구는 추가적인 활성제의 스크리닝 프로그램에서의 또는 상기 약물의 제조의 임의의 단계에서의 용도 이외에 상기 한 화합물을 약물로서 직접적으로 포함한다.

잠재적인 단백질 또는 펩타이드 오폴딩 및/또는 작용 방식에서의 응집과 관련된 질환(Diseases with potential protein or peptide misfolding and/or aggregation in their mode of action)

질병을 일으키는 단백질은 일생동안 나타나지만 퇴행성 질환은 대부분 늦게 발병한다. 이는 다른 질병을 일으키는 단백질이 시간이 지남에 따라 점차 해로워진다는 것을 의미한다. 오폴딩된 단백질이 별개의 퇴행성 질환을 일으키는 것이 현재는 잘 입증되어 있지만, 왜 축적되는지는 크게 불분명하다. 세포는 정상적으로 단백질이 제대로 접히도록(폴딩되도록) 노력하며 실제로 모든 세포는 수십년 동안 잠재적으로 해로운 단백질을 매우 효과적으로 처리하는 강력하고 정교한 단백질 품질 관리 시스템을 갖추고 있다. 그러나 단백질 품질 관리 메커니즘은 나이가 들어감에 따라 점차적으로 실패하는 것으로 보이는데, 오폴딩된 단백질이 축적되어 세포 및 유기체에 치명적인 결과를 초래한다. 이러한 오폴딩 / 응집된 단백질 또는 펩타이드는 세포 안팎에 존재할 수 있으며 어느 위치에서나 발견 될 수 있다. 원칙적으로 오폴딩 단백질에 대한 자연 세포 방어를 증가 시키면 오폴딩 / 응집 경향이 있는 단백질이 병리학에 존재하는 다양한 단백질 오폴딩 질환에서 병리학을 감소시키는 일반적인 접근법을 나타내야 한다. 본 발명은 이러한 접근법을 기술하고 포유 동물에서 그의 안전성 및 효능을 입증한다.

알츠하이머 병 (AD), 파킨슨 병 (PD), 헌팅턴 병 (HD), 운동 실조증 및 기타 폴리 글루타민 장애, 타우병증뿐만 아니라 망막의 퇴화(retinal degeneration), 녹내장(glaucoma), 근위축성 측삭경화증 (amyotrophic lateral sclerosis , ALS) 및 프라이온병(prion diseases)과 같은 신경 퇴행성 질환은 파괴적이며 고령화 인구의 증가하는 개인에게 영향을 미친다. 이러한 질병은 임상적으로 다양하지만 공통된 메커니즘을 공유한다. 이들은 비정상적인 모양의 특정 단백질의 축적으로 인해 뇌의 선택적 영역에서 특정 신경 세포의 진행성 기능 장애 및 사멸에 의해 유발된다. 오폴딩되어 있거나 응집되기 쉬운 단백질은 Aβ42, α-synuclein, TAU, TDP-43, TLS / FUS, SOD1, Huntingtin 및 폴리글루타민 증폭을 포함한 기타 단백질, 프리온 및 C9ORF72의 번역 산물을 포함 하나 이에 국한되지 않는다.

본 출원인은 실시예 1의 화합물이 PPP1R15B-PP1을 선택적으로 저해하여 마우스의 단백질 오폴딩 질환을 교정함을 입증 하였다. 따라서, 본원에 기술된 PPP1R15B의 억제제는 오폴딩된 단백질이 관여하는 다양한 질환의 치료에, 특히 오폴딩된 단백질의 축적과 함께 치료적 적용을 갖는다. 화학식 IB의 화합물과 같은 PPP1R15A 및 PPP1R15B의 억제제는 또한 오폴딩된 단백질이 관련된 질환의 치료에 응용될 것으로 기대된다.

본 발명은 폴리글루타민 장애의 치료에 관한 것이다.

헌팅턴병은 관련이 없는 단백질에서 글루타민으로 번역된 CAG 코돈의 확장을 특징으로하는 더 넓은 범위의 질환인 "폴리글루타민 장애"에 속한다. 헌팅턴병은 Huntingtin 을 코딩하는 유전자의 확장에 의해 유발된다. 척수구근위축증(Spinal and Bulbar Muscular Atrophy, SBMA), Dentalorubral-pallidoluysian 위축(Dentalorubral-pallidoluysian atrophy) 및 척추소뇌실조증 (Spinocerebellar ataxias)는 각각 Androgen 수용체, Atrophin 1, Ataxin 1, 2, 3, α 전압 의존성 칼슘 채널 서브유닛(α-voltage dependent calcium channel subunit) 및 TBP를 암호화하는 유전자의 확장에 의해 발생한다. CAG 증폭은 폴리글루타민으로 번역되어 영향을 받은 단백질의 응집을 일으킨다. 따라서, 이들과 같은 폴리 글루타민 장애의 예방 및 / 또는 치료는 본 발명의 범위 내에 있다.

예로서, 본 출원인은 실시예 1의 화합물이 포유 동물에서 헌팅턴병을 개선 시킨다는 것을 보여 주었다. 따라서, 이론에 얽매이지 않고서, PPP1R15B의 억제제는 알츠하이머 병 (AD), 파킨슨 병 (PD), 헌팅턴 병 (HD), 운동 실조증 및 기타 폴리 글루타민 장애 뿐만 아니라, 망막의 퇴화(retinal degeneration), 녹내장(glaucoma), 근위축성 측삭경화증 (amyotrophic lateral sclerosis , ALS), 타우병증 및 프라이온병(prion diseases) 을 비롯한 여러 질병을 치료할 수 있다. 화학식 IB의 화합물과 같은 PPP1R15A 및 PPP1R15B의 억제제는 동일한 효과를 가질 것으로 기대된다.

상기 질환은 현재 알려진 단백질 오폴딩/응집을 포함하는 질환 및 상기 기술된 질환을 포함하고, 새로운 단백질이나 미래의 새로운 질병에도 적용될 수 있습니다.

바람직한 구현예에서, 본 발명은 단백질 항상성 질환의 치료를 제공한다.

또 다른 구현예에 있어서, 본원에 기재된 화합물은 오폴딩된 단백질의 축적이 작용 방식에 관여하는 질환의 치료에 사용하기 위한 것이다.

다른 구현예에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 알츠하이머 병 (AD), 파킨슨 병 (PD), 헌팅턴 병 (HD), 운동 실조증 및 기타 폴리 글루타민 장애, 망막의 퇴화(retinal degeneration), 녹내장(glaucoma), 근위축성 측삭경화증 (amyotrophic lateral sclerosis , ALS), 타우병증 또는 프라이온병(prion diseases)이다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 화합물은 헌팅턴병의 치료를 위한 것이다.

다른 특정 구현예에서, 본원에 기재된 화합물은 파킨슨병의 치료를 위한 것이다.

일 구현예에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 미세 소관과 연관된 단백질 타우의 응집과 관련된 것이다.

본 출원인은 실시예 1의 화합물이 PPP1R15B-PP1을 선택적으로 저해하여 마우스의 단백질 오폴딩 질환을 교정함을 입증하였다. PPP1R15B 억제제는 또한 같은 메커니즘에 의해 유발된 질병의 진행을 방지하거나 막기 위해 유용할 수 있다 : 오폴딩 단백질의 축적. 화학식 IB의 화합물과 같은 PPP1R15A 및 PPP1R15B의 억제제 또한 이러한 적용을 가질 것으로 기대된다.

상기 질환의 예는 알츠하이머병(Alzheimer’s disease), 근위축성 측삭경화증 및 파킨슨증 치매 복합체(amyotrophic lateral sclerosis and parkinsonism-dementia complex), 호은성의 입자 질병(argyrophilic grain disease), 만성외상성뇌병증(chronic traumatic encephalopathy), 피질기저핵변성(corticobasal degeneration), 석회화를 동반하는 광범위 신경섬유 농축체 (diffuse neurofibrillary tangles with calcification , DNTC), 다운 증후군(Down’s syndrome), 가족형영국형치매 (familial British dementia, FBD), 가족형덴마크형치매 (familial Danish dementia, FDD), 염색체 17번 연관 파킨슨증후근의 전두측두엽치매(frontotemporal dementia and parkinsonism linked to chromosome 17, FTDP-17), 전두측두엽치매 (frontotemporal lobar degeneration , FTLD), 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커 증후군(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease), 과들루프 파킨슨병(Gaudeloupean parkinsonism), 근긴장성이영양증(myotonic dystrophy), 뇌에 철 침착을 가진 신경변성 (neurodegeneration with brain iron accumulation), C형 니만피크병(Niemann-Pick disease type C), 신경원섬유 매듭을 동반하는 비-과메이니언 운동뉴론질환(Non-Guamanian motor neuron disease with neurofibrillary tangles), 피크 병(Pick's disease), 뇌염후 파킨슨증상(Postencephalitic parkinsonism), 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 맥관병증(Prion protein cerebral amyloid angiopathy), 진행성 피질하 신경교종(Progressive subcortical gliosis), 진행성 핵상 마비(Progressive supranuclear palsy), SLC9A6-관련 지적 장애 (SLC9A6-related mental retardation), 아급성 경화성 범뇌염(Subacute sclerosing panencephalitis), 신경원섬유 매듭-우세 치매(tangle-only dementia), 및 구형 글리알 함유물을 동반하는 백질 타우병증 (white matter tauopathy with globular glial includsions)을 포함한다.

일 구현예에 있어서, 상기 질환은 미엘린 장애이다.

미엘린은 중추 신경계와 말초 신경계(central and peripheral nervous system)의 풍부한 단백질입니다. 미엘린은 두 가지 세포 유형, 즉, 중추 신경계의 희돌기교세포(oligodendrocytes)와 말초 신경계의 Schwann 세포에 의해 생성됩니다. 미엘린은 축삭 돌기(axon)를 따라 전기 자극의 전도 속도를 보장하고 축삭돌기로부터 전류가 소산되는 것을 방지하기 위해 축삭 주위에 시스(sheath)를 형성한다. 미엘린 기능은 신경계에 필수적이다.

미엘린 장애는 전 세계적으로 250 만 명이 넘는 사람들에게 영향을 미치며 미엘린의 손상과 관련된 질환으로 정의된다. 미엘린 장애는 운동 장애(motor impairments), 감각 장애(sensory impairments), 인지 기능 장애(cognitive dysfunction), 정서 장애(emotional disturbances) 및 조정 장애(impaired coordination)를 비롯한 다양한 증상에 의해 나타난다.

많은 종류의 탈수초성 장애(demyelinating disorders)가 있으며, 가장 흔한 것은 다발성 경화증 (multiple sclerosis (MS))이다. 다발성 경화증은 뇌와 척수에 영향을 미치는 자가 면역 질환으로 뇌에서 탈수초(demyelination)를 초래합니다. MS 이외에, 탈수초성 장애는 펠리제우스-메르츠바하병(Pelizaeus-Merzbacher disease), VWM 병(vanishing white matter disease), 급성 횡단성 척수염(acute disseminated encephalomyelitis), 뇌실주위백질연화증(periventricular leukomalacia), 뇌실 주위 백질손상(periventricular white matter injury), 척수매독(Tabes Dorsalis), 데빅병(Devic’s disease), 시신경염(optic neuritis), 진행성 다초점 백색질 뇌증(progressive multifocal leukoencephalopathy), 횡단척수염(transverse myelitis), 만성염증탈수초다발신경병증 (chronic inflammatory demyelinating polyneuropathyl), anti-MAG 말초신경병증(anti-MAG peripheral neuropathy), 부신백질이영양증(adrenoleukodystrophy), 부신척수신경병증(adrenomyeloneuropathy), 확산 백질 손상(diffuse white matter injury), 길랭-바레 증후군(Guillain-Barre Syndrome), 중심성 뇌교 수초용해(central pontine myelinolysis), 백질이영양증과 같은 유전성 탈수초성 질환(inherited demyelinating diseases such as leukodystrophy), 및 샤리코-마리-투스병(Charcot Marie Tooth disease(CMT))를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

CMT 질환은 많은 유전자의 돌연변이에 의해 야기되는 미엘린 신경 병증의 그룹이다. 말초 성 미엘린 단백질인 PMP22의 돌연변이가 CMT의 가장 흔한 원인이다. PMP22 (Trembler-J)에서의 돌연변이는 PMP22의 오폴딩을 일으키며 말초 신경계의 미엘린 결함으로 인하여 인간의 CMT와 유사한 마우스의 질병을 일으킨다. 본 출원인은 실시예 1의 화합물이 신경 병증성 마우스(neuropathic mice)로부터의 체외 이식편에서 미엘린형성을 개선시킬 수 있음을 입증하였다. 본 출원인은 신경 병증성 마우스로부터의 체외 이식편에서의 수초 형성 개선이 포유류에서의 효능을 예측함을 입증 하였다 (Das et al. Science, 2015). 따라서, 실시예 1의 화합물은 메커니즘이 유사하고 eIF2α 경로를 포함한다는 것이 공지된 포유류 및 기타 미엘린 장애에서 CMT를 치료하는데 유용할 것이며((Lin and Popko, Nat. Neurosci., 12, 379-385, 2009)), 화학식 (I)의 화합물과 같은 PPP1R15A 및 PPP1R15B의 억제제 또한 CMT 치료에 유용할 것이다.

일 구현예에 있어서, 본원에 기재된 화합물은 미엘린 장애의 치료에 사용하기 위한 것이다.

또 다른 구현예에 있어서, 본원에 기재된 화합물은 샤리코-마리-투스병의 치료에 사용하기 위한 것이다.

다른 구현예에 있어서, 본원에 기재된 화합물은 중추 신경계의 미엘린 장애, 예를 들어 다발성 경화증의 치료에 사용하기 위한 것이다. CMT와 MS의 메커니즘은 미엘린 생성 세포 (MS의 CMT와 oligodendrecytes의 Schwann 세포)의 고갈과 유사하며 eIF2α-RRR1R15A 경로의 병리학적 신호 전달을 포함하는 것으로 알려져있다 (Lin and Popko, Nat.Neurosci., 12 , 379-385, 2009). 본 출원인은 실시예 1이 수초병(myelinopathy)에 효과적이고 중추 신경계 및 말초 신경계 모두에서 실시예 1의 화합물의 생체 이용률을 입증 했으므로(도 5), PPP1R15B 억제제 및 PPP1R15A 및 PPARγ 억제제 화학식 IB의 화합물과 같은 PPP1R15B는 다발성 경화증의 치료에 유용할 것이다.

일 구현예에 있어서, 질환은 단백질의 돌연변이로 인해 발생하는 질환으로, 오폴딩되고 잘못된 위치(mislocalisation) 또는 이동 결함(trafficking defects) 을 일으킨다.

본 출원인은 실시예 1의 화합물이 소포체 (endoplasmic reticulum, ER)에서 합성된 하나의 오폴드된 단백질 PMP22에 의해 야기된 결함을 구제할 수 있음을 입증 하였다. PPP1R15B의 억제제 및 PPP1R15A 및 PPP1R15B의 억제제의 작용 기작(폴딩을 증가시키기위한 번역 감소)으로 인하여, ER에서 제조된 임의의 단백질의 오폴딩 또는 이동 결함으로 인한 질환의 치료에도 유용할 것이며, 막관통성 또는 분비된 단백질을 포함한다.

상기 질환의 예로는 막관통성 단백질의 폴딩을 손상시키는 돌연변이로 인한 낭포성섬유증(cystic fibrosis caused by mutations impairing folding of the transmembrane protein(CFTR)); 호르몬 티로 글로불린의 잘못된 폴딩 및/또는 트래 피킹 결함으로 인해 티로글로불린 결핍이있는 (congenital hypothyroid goieter), 과민 반응과 순환하는 아르기닌 바소프레신의 부재로 인한 위장 장애로 인한 가족형 신경하수체 당뇨병(familial neurohypophyseal diabetes)(이는 또한 유전적으로 유전되는 신생아 요붕증의 일부 형태를 포함 할 수도 있음); 불완전골생성증을 포함하는 프로콜라겐 생합성 장애(procollagen biosynthesis disorders including osteogenesis imperfect)와 같으나 이에 제한되는 것은 아닌 콜라겐을 폴딩하고, 조립하고, 합성하지 못함으로써 질병이 유발되는 프로콜라겐생합성 장애 불완전골생성증을 포함하는 프로콜라겐 생합성 장애(procollagen biosynthesis disorders including osteogenesis imperfect); 보다 일반적으로, 단백질 오폴딩/합성의 부족 또는 잘못된 위치(mislocalization)가 세포외기질로부터 단백질의 결함과 관련된 성장판 장애와 같이 활성 모드인 결합 조직의 모든 유전적 질병; LDL 수용체의 돌연변이에 의한 분자 결함으로 인해 합성이 부족하거나, 세포 내 전달이 변형되거나, 비정상적인 기능을 나타내는 고콜레스테롤혈증; 알파 1 항트립신의 오폴딩으로 인한 알파 1 항트립신 결핍증(alpha-1 antitrypsin deficiencies); Gaucher병 및 Niemann-Pick 병 및 Anderson-Fabry병과 같은 리소좀 기능에 관련된 단백질의 잘못 접힘으로 인한 리소좀 장애(lysomal disorder); 로돕신 단백질의 오폴딩 (misfolding)으로 인한 유전적 망막 변성의 가장 흔한 형태이며, 이들의 ER 보유 및 결과적인 ER 스트레스 및 세포 사멸으로 인한 망막색소변성증(retinis pigmentosa (RP)), 및 ER 스트레스와 관련된 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease)을 포함한다.

동일한 이유로, PPP1R15B의 억제제 또는 PPP1R15A 및 PPP1R15B의 억제제, 예컨대 화학식 IB의 화합물은 병리학적 UPR 및/또는 막통과 단백질의 결함과 관련된 다음의 장애를 치료하는데 사용될 수있다(Lin and Popko, Nat. Neurosci., 12, 379-385, 2009). 이러한 장애는 막 단백질지방 단백질 (membrane proteolipid protein, PLP) 유전자 변이와 연관된 펠리제우스-메르츠바하병(Pelizaeus-Merzbacher disease) 및 흔한 미엘린장애인 다발성 경화증뿐만 아니라 VWM 병(vanishing white matter disease)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.

일 구현예에 있어서, 본원에 기재된 화합물은 단백질의 오폴딩(misfolding) 및 잘못된 위치(mislocalisation) 또는 이동 결함(trafficking defects)을 유발하는 단백질에서의 돌연변이로부터 발생하는 질환의 치료에 사용하기 위한 것이다.

또 다른 구현예에서, 단백질의 오폴딩 및 잘못된 위치 또는 이동 결함을 유발하는 단백질의 돌연변이로부터 발생하는 질병은 낭포성섬유증(cystic fibrosis), 선천성 갑상선 기능 저하증(congenital hypothyroid goieter), 가족형 신경하수체 당뇨병(familial neurohypophyseal diabetes), 불완전골생성증과 같은 프로콜라겐 생합성 장애, 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia), 알파 1 항트립신 결핍증(alpha-1 antitrypsin deficiencies), Gaucher 병, Niemann-Pick 병 및 Anderson-Fabry 병과 같은 리소좀 장애(lysomal disorder), 망막색소변성증(retinis pigmentosa (RP)), 및 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease)으로부터 선택된다.

일 구현예에 있어서, 상기 질환 대사 질환이다.

당뇨병, 비만, 인슐린 저항성, 고지 혈증, 지방간 질환 및 병리학적 EG 스트레스와 관련된 죽상동맥경화증과 같은 대사성 질환은 UPR의 약리학적 조절제가 치료 효과를 가질수 있다고 알려져있다 (Cao and Kaufman, 2012, Curr Biol, vol. 22 (16)). 그러나, 이전에 PPP1R15B 억제제가 사용 가능하지 않았고 PPP1R15B 저해가 해로운 것으로 예측되었으며, 또한 포스파타제(phosphatases) 를 억제하는 것이 어렵기 때문에 PPP1R15B가 대사성 질환의 치료 표적이 될 수 있는지 여부는 불분명하다.

본 발명자들은 실시예 1의 화합물이 포유 동물에서 대사 장애를 개선시킬 수 있음을 입증 하였다(도 11). 따라서, PPP1R15B 억제제는 당뇨병, 비만, 지방간 질환 및 죽상 동맥 경화증과 같은 대사 장애를 치료하는데 유용할 것이다. 또한, 화학식 (I)의 화합물과 같은 PPP1R15A 및 PPP1R15B의 억제제는 또한 대사 장애를 치료하는데 유용할 것으로 기대된다.

일 구현예에 있어서, 본원에 기재된 화합물은 대사 장애의 치료에 사용하기 위한 것이다.

바람직한 구현예에서, 상기 대사 장애는 당뇨병, 비만, 지방간 질환 및 죽상 동맥 경화증으로부터 선택된다.

PPP1R15B 선택적 억제제는 또한 그들의 작용 메카니즘에서 UPR을 포함하는 류마티스성 관절염, 당뇨병, 울콧랠리슨 증후군, 염증성 장 질환 및 백반증을 비롯한 다른 질환의 치료에 유용하다(Cao and Kaufman, 2012, Curr Biol, vol. 22 (16)). PPP1R15A 및 PPP1R15B 억제제, 예를 들어 화학식 I의 화합물은 또한 이러한 장애의 치료에 유용할 것으로 기대된다.

암

일 구현예에 있어서, 본원에 기재된 화합물은 암 치료에 사용하기 위한 것이다.

암 세포는 높은 신진 대사 요건을 가지고 있으며, 이들의 증식은 효율적인 단백질 합성에 달려 있다. 번역 개시는 단백질의 항상성, 분화, 증식 및 악성 변형을 조절하는데 결정적인 역할을 한다. 번역 개시의 증가는 암 개시에 기여하고, 역으로 번역 개시를 감소시키는 것은 종양 성장을 감소시킬 수있다(Donze et al., 1995, EMBO J, 14, 3828- 34; Pervin et al., 2008, Cancer Res, 68, 4862-74; Chen et al., 2011 , Nat Chem Biol, 7, 610-6). 이론에 얽매이지 않고도, PPP1R15A 및 PPP1R15B를 억제하면 종양 세포의 번역이 감소되어 종양 성장을 감소시킬 수 있다고 믿어진다.

노화

단백질 합성 감소가 수명을 연장 시킨다는 것을 보여주는 많은 문헌이 있다(Tavernarakis, 2008, Trends Cell Biol, 18 (5), 228-235). 따라서, PPP1R15A 및 PPP1R15B를 억제함으로써 단백질 합성을 감소시키는 것이 수명을 연장시킬 것으로 예측하는 것은 합리적이다.

염증

Salubrinal은 eIF2α 인산화의 유도제이며 알려지지 않은 메커니즘으로 R15A 및 R15B 포스 파타제를 억제한다고 여겨진다. Salubrinal은 염증을 억제하는 것으로 밝혀졌다 (Hamamura et al., 2015, Cellular Signaling, 27 (4), 828-835). 그러나 Salubrinal은 독성 문제로 인하여 인간에게 사용될 수 없다. 여기에 공개 된 R15A / B 억제제가 염증과 관련된 질병의 잠재적인 치료법이 될 것으로 예상하는 것이 합리적이다.

관절염(arthritis), 궤양성 대장염(ulcerative colitis) 및 염증성 장 질환, 염증과 관련된 감염, 섬유증, 염증과 관련된 신경 퇴행성 질환 또는 광범위하게 염증과 관련된 모든 인간 질병이 염증과 관련된 질병 예시로의 비 한정적인 세트이다.

특히, 염증과 관련된 질환은 류마티스성 관절염; 다발성 경화증; 주로 궤양 성 대장염과 크론 병과 같은 두 가지 증상을 설명하기 위해 사용되는 염증성 장 질환 (IBD); 당뇨병; 루푸스 신염(lupus nephritis); 자가 면역 내이 병 (autoimmune inner ear disease, AIED); 낭포성 섬유증; 그레이브스 병(Graves disease); 심근염(myocarditis); 자가 면역 간염(autoimmune hepatitis); 알츠하이머 병; 파킨슨 병; 경피증(scleroderma); 담낭 질환(Gall Bladder Disease); 하시모토 갑상선염(Hashimoto's Thyroiditis); 갑상선 효소 및 단백질에 대한 항체에 의해 유발되는 장에서 비롯된 자가 면역 반응; 종종 예방 접종과 같은 외부 스트레스 요인에 대한 자기 면역 반응에 의해 유발되는 Guillain-Barre자가 면역 공격; 백혈병(leukemia); 천식(asthma); 을 포함한다.

항바이러스제( Anit -Viral Agents)

본원에 기재된 화합물은 항 바이러스제로서 사용될 수 있다. 단백질 합성은 바이러스 복제에 필요하다. AB 억제제가 단백질 합성을 억제한다는 것을 보여 주면 바이러스 복제를 차단하고 인간의 전염병 예방에 유용할 것으로 예상하는 것이 합리적이다. 실제로, 예로서, eIF2α 인산화의 유도제인 살부리날(salubrinal)이 Herpex simplex virus 의 복제를 차단한다는 것이 이전에 밝혀졌다(Boyce, M., et al. (2005) Science 307 (5711), 935-939). 그러나 Salubrinal은 독성 문제로 인하여 인간에게 사용될 수 없다. 따라서, 본원에 개시된 R15A / B 억제제는 다른 번역 저해제보다 치료학적 이점을 가질 수 있다.

본 출원인은 PPP1R15B 억제제가 헌팅턴 병을 예방할 수 있음을 보여 주었다. PPP1R15B는 지속적으로 발현되므로 더 광범위하게 적용 할 수있는 질병 표적이다. 짧은 펄스에 의해서만 표적이 억제되는 투여량으로 투여된 AB 억제제가 (대부분은 아니지만) 대부분의 단백질 오폴딩 질환을 예방할 것으로 예상하는 것이 합리적이다.

약학적 조성물

본 발명의 다른 측면에 따르면 임의의 약학적으로 허용가능한 담체(carrier), 보조제(adjuvant) 또는 소포(vehicle)과 조합된 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 화합물을 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.

본 발명의 문맥에서 "약학적 조성물"이란 용어는 활성제 및 추가로 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물을 의미한다.

적합한 약?F거으로 허용가능한 부형제는 당업자에게 공지되어 있으며, 일반적으로 동물에게 본 발명의 화합물을 투여하기에 적합한 수용 가능한 조성물, 물질, 담체, 희석제 또는 소포를 포함한다.

일 구현예에 있어서, 동물은 포유류이다. 또 다른 구현예에 있어서 상기 포유류는 인간이다.

약학적 제제는 경구, 국소(진피, 협측, 안구 및 설하 포함) 직장 또는 비경구(피하, 피부 내, 근육 내 및 정맥내 포함), 비강 내, 안구 내 및 폐 투여, 예를 들어 흡입에 적합한 것들을 포함한다. 제제는 경우에 따라 별개의 투약 단위로 편리하게 제공될 수 있고 약학 분야에 잘 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수있다.

투여량은 환자의 필요 조건, 치료되는 상태의 중증도 및 사용되는 활성 성분의 특성에 따라 변할 수 있다. 유효량의 결정은 과도한 부담없이 숙련된 자의 소관 내에 있다. 인간을 비롯한 포유류에 투여하기위한 적합한 투여 형태는 전형적으로 체중 1 kg 당 100 mg 이하의 범위이거나, 예를 들어 0.1 mg / kg, 10 mg / kg, 20 mg / kg, 30 mg / kg 일 수있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 활성 화합물(들)을 담체와 함께, 예를 들어 혼합물에 가하는 것을 포함하는, 전술한 바와 같은 약학적 조성물의 제조 방법이 제공된다.

일반적으로, 제제는 활성제를 액체 담체 또는 미세하게 분할된 고체 담체 또는 둘 모두와 균일하고 친밀하게 결합시킨 후, 필요하다면 생성물을 성형함으로써 제조된다. 본 발명은 본원에 개시된 화합물을 약학적으로 허용가능한 담체 또는 소포와 함께 또는 결합시켜 포함하는 약학적 조성물의 제조 방법까지 확장된다. 모든 방법은 활성 화합물을 액체 담체 또는 미세하게 분할된 고체 담체 또는 둘 다와 결합시키고, 필요하다면 생성물을 목적하는 제형으로 성형하는 단계를 포함한다.

조합

특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 하나 이상의 화합물은 하나 이상의 다른 활성제, 예를 들어 시장에서 입수 가능한 기존 약물과 조합하여 투여된다. 이러한 경우에, 본 발명의 억제제는 하나 이상의 다른 활성제와 연속적으로, 동시에 또는 순차적으로 투여 될 수있다.

R15A 억제제인 화합물을 R15B 억제제인 화합물과 결합시키는 것은 R15A 및 R15B 모두를 억제하는 화합물과 동일한 유리한 특성을 가져온다. 따라서, 본 발명의 한 측면은 R15A 억제제 화합물 및 R15B 억제제 화합물의 조합물을 제공한다. 조합은 PPP1R15A 및 PPP1R15B의 억제에 의해 완화된 질병 상태, 예를 들어 오폴딩된 단백질 또는 단백질 항상성 장애의 축적과 관련된 장애의 치료에 유용하다. 상기 조합물은 알려진 R15A 억제제인 guanabenz 및 R15B 억제제인 (E)-2-(2,3-디클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드 (화합물 16)일 수있다.

일반적으로 약물을 병용하는 것이 효과적이다. 특히, 주요 독성, 작용 메카니즘 및 저항 기전의 중첩을 피하기 위해 병용 요법이 바람직하다. 또한, 대부분의 약물을 그러한 용량 사이의 최소 시간 간격으로 최대 허용 용량으로 투여하는 것이 바람직하다. 약물 조합의 주요 이점은 생화학적 상호 작용을 통해 추가적인 또는 가능한 상승 효과를 촉진할 수 있으며 저항의 출현을 감소시킬 수 있다는 것이다.

실시예

본 발명에 따른 화합물의 제조

본 발명에 따른 화합물은 E 이성질체 형태와 관련하여 다음 절차에 따라 제조될 수 있다. 이러한 방법으로부터, 당업자는 다른 이성질체 형태 또는 라세미체가 어떻게 수득 될 수 있는지 알 것이다.

화합물 1 - (E)-2-((4- 클로로페닐 )메틸렌)히드라진-1- 카복시미드아미드

합성 스킴 (Synthetic Scheme):

실험 세부정보:

계산:

	화합물(Chemicals )	양(Quantity)	M.W .	몰(Mole)	몰비율 (Mole ratio)
1	4-클로로벤즈알데히드	0.060g	140.57	0.00042	1.00
2	아미노구아니딘 하이드로클로라이드	0.047g	110.55	0.00042	1.00
3	소듐아세테이트	0.034g	82.03	0.00042	1.00
4	에탄올	1ml

절차:

4-클로로벤즈알데히드 (0.060g, 0.00042mol)의 에탄올 (1ml)용액에 연속적으로 아미노구아니딘 하이드로클로라이드 (0.047g, 0.00042mol) 및 소듐아세테이트 (0.034g, 0.00042mol)를 25⁰C에서 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 80⁰C에서 6시간 가열시켰다. 반응 완결은 디클로로메탄/메탄올(8/2)를 사용한 TLC 이동상으로 모니터하였다. 반응 종결 후, 상기 반응 혼합물을 25⁰C에서 냉각하고 포화 NaHCO₃ (10ml) 용액을 부었다. 반응 침전물을 진공하에 여과하고, 물 (5ml)로 세척하였다. 상기 고체 물질을 디에틸 에테르(2 x 2 ml)로 연마하고 진공하에 건조하여 목적 화합물 (0.040g, 47.8% 수율)을 얻었다.

화합물 2 - (E)-2-((2,4- 디클로로피리미딘 -5-일)메틸렌)히드라진-1- 카복시미드아미드

반응 스킴 (Reaction Scheme):

실험 세부정보:

화합물-14 (0.1 g, 0.56 mmol)의 메탄올(2 mL) 용액에 아미노 구아니딘 하이드로클로라이드 (0.50 g, 0.45 mmol)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 65-70 °C에서 2시간 교반시켰다. 상기 반응이 TLC에서 80% 변환됨을 나타내었다. 반응 혼합물을 감압농축하여 미정제 물질을 얻어 이를 에틸 아세테이트 (30 mL)로 교반하여 고체 물질을 얻었으며 상기 고체물질을 필터하고, 진공하에 건조하였다. 얻어진 고체 물질을 Prep HPLC로 정제하여 목적 화합물을 노란색 고체로 얻었다(0.028 g, 27.12%).

화합물 3 - (E)-2-(3,4,5- 트리클로로벤질리덴 )히드라진-1- 카복시미드아미드

합성 스킴 (Synthetic Scheme):

실험 세부정보:

계산:

	화합물	양	M.W .	몰	몰 미율
1	3,4,5-트리클로로벤즈알데히드	0.040g	207.92	0.00019	1.00
2	아미노구아니딘 하이드로클로라이드	0.021g	110.55	0.00019	1.00
3	소듐아세테이트	0.015g	82.03	0.00019	1.00
4	에탄올	1ml

절차:

3,4,5-트리클로로벤즈알데히드 (0.040g, 0.00019mol)의 에탄올 (1ml) 용액에 연속적으로 아미노 구아니딘 하이드로클로라이드 (0.021g, 0.00019mol) 및 소듐아세테이트 (0.015g, 0.00019mol)를 25⁰C에서 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 80⁰C에서 6시간 가열시켰다. 반응 완결은 디클로로메탄/메탄올(8/2)를 사용한 TLC 이동상으로 모니터하였다. 반응 종결 후, 상기 반응 혼합물을 25⁰C에서 냉각하고 포화 NaHCO₃(10ml) 용액을 부었다. 반응 침전물을 진공하에 여과하고, 물 (5ml)로 세척하였다. 상기 고체 물질을 디에틸 에테르(2 x 2 ml)로 연마하고 진공하에 건조하여 목적 화합물을 얻었다(0.036g, 70.88% 수율). ¹H-NMR (DMSO-d₆): (ppm) 7.96 (s, 2H); 7.89 (s, 1H); 6.20 (brs, 2H); 5.69 (brs, 2H); MS (ESI+): m/z = 265.1 [M+H]+

화합물 4 - (E)-2-(2,4,5- 트리클로로벤질리덴 )히드라진-1- 카복시미드아미드

합성 스킴 (Synthetic Scheme):

실험 세부정보:

1,2,4- 트리클로로 -5- 아이오도벤젠 [중간체- 1]의 합성

계산:

	화합물	양	M.W .	몰	몰 비율
1	2,4,5-트리클로로아닐린	4.00g	194.94	0.02051	1.00
2	NaNO₂	1.41g	69	0.02051	1.00
3	KI	3.74g	166	0.02251	1.10
4	Na₂S₂O₃.5H₂O	1.50g	248.1	0.00610	0.30
5	아세틱 애시드	80ml
6	Conc. HCl	4ml
7	D.M.Water	4.8ml

절차:

2,4,5-트리클로로아닐린 (4.00g, 0.02051mol)의 아세틱 애시드 (80ml) 현탁액을 35⁰C에서 혼합물이 맑아질때까지 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 25⁰C에서 냉각하였다. Conc. HCl (4ml)을 상기 반응 혼합물에 25⁰C에서 첨가하고, 같은 온도에서 30 분간 교반시켰다. 이후, NaNO₂ (1.41g, 0.02051mol) 의 D.M. water (4.8ml) 용액에 상기 반응 혼합물을 25⁰C에서 첨가하고, 같은 온도에서 30분간 교반시켰다. 비용해성물질을 필터하여 제거하고, 아세틱 애시드 (3 x 15ml)로 세척하였다. KI (3.74g, 0.02251mol)를 깨끗한 여액에 25⁰C에서 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 25⁰C에서 30분간 교반시켰다. 이후, Na₂S₂O₃.5H₂O (1.50g, 0.00610)를 상기 반응 혼합물에 첨가하고, 25⁰C에서 추가적으로 30분간 더 교반시켰다. 최종 비용해성 물질을 필터로 제거하고, 아세틱 애시드 (3 x 10ml)로 세척하였다. 합친 깨끗한 여액을 건조기로 증발시켜 중간체-1 (5g, 79.6% 수율)를 얻었으며, 별도의 절차 없이 다음 단계에 사용하였다.

tert -부틸 (E)-3-(2,4,5- 트리클로로페닐 ) 아크릴레이트 [중간체- 2]의 합성

계산:

	화합물	양	M.W .	몰	몰비율
1	중간체-1	5.00g	305.82	0.01634	1.00
2	Tert 부틸 아크릴레이트	8.30g	128.1	0.06539	4.00
3	트리부틸아민	9.00g	185.3	0.04904	3.00
4	트리페닐포스핀	0.42g	262.2	0.00162	0.10
5	팔라듐(II)아세테이트	0.73g	224.0	0.00325	0.20
6	DMF	30ml

절차:

중간체-1 (5.00g, 0.01634mol)의 DMF (30ml)용액에 연속적으로 Tert 부틸 아크릴레이트 (8.30g, 0.06539mol), 트리부틸아민 (9.00g, 0.04904mol), 트리페닐포스핀 (0.42g, 0.00162mol) 및 팔라듐(II)아세테이트 (0.73g, 0.00325mol)를 25⁰C에서 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 80⁰C에서 3시간 가열하였다. 반응 완결은 n-헥산/에틸 아세테이트 (9/1) 를 사용한 TLC 이동상으로 모니터하였다. 반응 종결 후 상기 반응 혼합물을 25⁰C에서 냉각시켰다. 반응 혼합물을 건조하기 위하여 증발시켰다. 상기 반응 잔여물을 D.M. water (200ml)에 현탁시키고 에틸 아세테이트 (3 x 250ml)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 소금물(100ml)로 세척하고, Na₂SO₄ 로 건조하여 진공하에 농축하여 목적 중간체- 2 (3.3g, 65.96% 수율)를 얻었으며, 추가적인 절차 없이 다음 단계에 사용하였다.

2,4,5- 트리클로로벤즈알데히드 [중간체- 3]의 제조

계산:

	화합물	양	M.W .	몰	몰비율
1	중간체-2	0.25g	306	0.00081	1.00
2	디메틸 설파이드	0.32ml
3	DCM	30ml
4	메탄올	20ml

절차:

중간체-2 (0.25g, 0.00081mol)를 메탄올: 디클로로메탄 (2:3) (50ml)의 혼합에 담고, 상기 반응 혼합물을 드라이아이스/아세톤 베스를 사용하여 -78⁰C까지 냉각시켰다. -78⁰C 에서 반응물이 파란색으로 될 때 까지 오존 가스로 반응 혼합물을 퍼징하였다. 이후, -78⁰C 디메틸 설파이드 (0.32ml)를 첨가한 후, 산소 가스로 -78⁰C 에서 10분간 퍼징하였다. 상기 반응 혼합물을 상온에서 1-분간 교반시키고, 따뜻해지도록 놔두었다. 반응 완결은 n-헥산/에틸 아세테이트 (9/1) 를 사용한 TLC 이동상으로 모니터하였다. 반응 종결 후, 상기 반응 혼합물을 건조하기 위하여 증발시켰다. 반응 잔여물을 D.M. water (50ml)에 현탁시키고 디에틸 에테르(3 x 20ml)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 Na₂SO₄ 로 건조하여 진공하에 농축하여 목적 중간체-3 (0.25g, quantitative)를 얻었으며, 추가적인 절차 없이 다음 단계에 사용하였다.

(E)-2-(2,4,5- 트리클로로벤질리덴 )히드라진-1- 카복시미드아미드의 제조

계산:

	화합물	양	M.W .	몰	몰비율
1	중간체-3	0.040g	207.92	0.00019	1.00
2	아미노구아니딘 하이드로클로라이드	0.021g	110.55	0.00019	1.00
3	소듐아세테이트	0.015g	82.03	0.00019	1.00
4	에탄올	1ml

절차:

중간체-3 (0.040g, 0.00019mol)의 에탄올 (1ml) 용액에 연속적으로 아미노 구아니딘 하이드로클로라이드 (0.021g, 0.00019mol) 및 소듐아세테이트 (0.015g, 0.00019mol)를 25⁰C에서 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 80⁰C에서 6시간 가열시켰다. 반응 완결은 디클로로메탄/메탄올(8/2)를 사용한 TLC 이동상으로 모니터하였다. 반응 종결 후, 상기 반응 혼합물을 25⁰C에서 냉각하고 포화 NaHCO₃ (10ml) 용액을 부었다. 반응 침전물을 진공하에 여과하고, 물 (5ml)로 세척하였다. 상기 고체 물질을 디에틸 에테르(2 x 2 ml)로 연마하고 진공하에 건조하여 목적 화합물을 얻었다(0.04g, 78.76% 수율). ¹H-NMR (DMSO-d ₆): (ppm) 8.43 (s, 1H); 8.12 (s, 1H); 7.77 (s, 1H); 6.33 (brs, 2H); 5.83 (brs, 2H); MS (ESI+): m/z =265.17 [M+H]⁺

화합물 5 - (E)-2-(3,5- 디클로로 -4- 플루오로벤질리덴 )히드라진-1- 카복시미드아미드

합성 스킴 (Synthetic Scheme):

실험 세부정보:

3,5-클로로-4-플루오로벤즈알데히드 (0.1 g, 0.52 mmol)의 메탄올(2 mL)용액에 아미노 구아니딘 하이드로클로라이드 (0.048 g, 0.43 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 65-70 °C에서 2시간 교반시켰다. 상기 반응이 TLC에서 80% 변환됨을 나타내었다. 반응 혼합물을 감압농축하여 미정제 물질을 얻어 이를 에틸 아세테이트 (30 mL)로 교반하여 고체 물질을 얻었으며 상기 고체물질을 필터하고, 진공하에 건조하였다. 얻어진 고체 물질을 Prep HPLC로 정제하여 목적 화합물을 노란색 고체로 얻었다 (0.056 g, 54.24%).

화합물 6 - (E)-2-(2,3,4- 트리클로로벤질리덴 )히드라진-1- 카복시미드아미드

합성 스킴 (Synthetic Scheme):

실험 세부정보:

계산:

화합물	양	Mol . Wt	몰	몰 비율
중간체 1	0.1 g	209.5	0.00047	1
중간체 2	0.052 g	110.5	0.00047	1
NaOAc	0.039 g	82.03	0.00047	1
에탄올	1 mL	-	-	10 V

절차:

중간체 1 (0.1 g, 0.00047 mol) 및 중간체 2 (0.052 g, 0.00047 mol)의 에탄올 (1 mL) 용액에 NaOAc (0.039 g, 0.00047mol)를 첨가하고 80⁰C에서 4시간 가열하였다. 반응 진행은 20 % MeOH의 DCM를 사용한 TLC 이동상으로 모니터하였다. NaHCO₃ (5 mL)의 냉각 용액을 반응 혼합물에 첨가하고 10분간 교반시켰다. 침전물을 필터하고, 물 (2 X 10 mL)을 통과시켜 세척하고, 감압하에 건조하고 이를 분석하여 순수한 목적 화합물을 얻었다(0.097g, 76.98% 수율).

화합물 7 - (E)-2-(2,4- 디클로로 -5- 플루오로벤질리덴 )히드라진-1- 카복시미드아미드

합성 스킴 (Synthetic Scheme):

실험 세부정보:

2,4-디클로로-5-플루오로벤즈알데히드 (0.1 g, 0.52 mmol)의 메탄올(2 mL)에 아미노 구아니딘 하이드로클로라이드 (0.046 g, 0.42 mmol)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 65-70 °C에서 2시간 교반시켰다. 반응혼합물을 냉각시키고 메탄올을 감압농축하여 미정제 화합물을 얻은 후, 이를 에틸 아세테이트 (30 mL)로 결정화 하여 고체 물질을 얻었다. 상기 얻어진 고체 물질을 Prep HPLC로 정제하여 목적 화합물을 흰색 고체로 얻었다(0.1 g, 96.86%).

화합물 8 - (E)-2-(4- 클로로 -3- 플루오로벤질리덴 )히드라진-1- 카복시미드아미드

합성 스킴 (Synthetic Scheme):

실험 세부정보:

4-클로로-3-플루오로벤즈알데히드 (0.1 g, 0.63 mmol)의 메탄올(2 mL) 용액에 아미노 구아니딘 하이드로클로라이드 (0.056 g, 0.51 mmol)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 65-70 °C에서 2시간 교반시켰다. 상기 반응이 TLC에서 90% 변환됨을 나타내었다. 반응 혼합물을 감압농축하여 미정제 물질을 얻어 이를 에틸 아세테이트 (30 mL)로 교반하여 고체 물질을 얻었으며 상기 고체물질을 필터하고, 진공하에 건조하였다. 얻어진 고체 물질을 실리카겔(100-200) 컬럼 크로마토그래피(8% MeOH / DCM)로 정제하여 목적 화합물을 흰색 고체로 얻었다(0.059 g, 54.48%).

화합물 9 - (E)-2-(2- 브로모 -3- 클로로벤질리덴 )히드라진-1- 카복시미드아미드

합성 스킴 (Synthetic Scheme):

실험 세부정보:

2-브로모-3-클로로벤즈알데히드 (0.63 mmol)의 메탄올(2 mL)에 아미노 구아니딘 하이드로클로라이드 (0.79 mmol)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 65-70 °C에서 2시간 교반시켰다. 상기 반응이 TLC에서 90% 변환됨을 나타내었다. 반응 혼합물을 감압농축하여 미정제 물질을 얻어 이를 에틸 아세테이트 (30 mL)로 교반하여 고체 물질을 얻었으며 상기 고체물질을 필터하고, 진공하에 건조하였다. 얻어진 고체 물질을 실리카겔(100-200) 컬럼 크로마토그래피(8.5% MeOH / DCM)로 정제하여 목적 화합물을 얻었다.

화합물 10 - (E)-2-(2,3,5- 트리클로로벤질리덴 )히드라진-1- 카복시미드아미드

합성 스킴 (Synthetic Scheme):

실험 세부정보:

계산:

	화합물	양	M.W .	몰	몰비율
1	2,3,5-트리클로로벤즈알데히드	0.040g	207.92	0.00019	1.00
2	아미노구아니딘 하이드로클로라이드	0.021g	110.55	0.00019	1.00
3	소듐아세테이트	0.015g	82.03	0.00019	1.00
4	에탄올	1ml

절차:

2,3,5-트리클로로벤즈알데히드 (0.040g, 0.00019mol)의 에탄올 (1ml)에 연속적으로 아미노 구아니딘 하이드로클로라이드 (0.021g, 0.00019mol) 및 소듐아세테이트 (0.015g, 0.00019mol)를 25⁰C에서 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 80⁰C에서 6시간 가열시켰다. 반응 완결은 디클로로메탄/메탄올(8/2)를 사용한 TLC 이동상으로 모니터하였다. 반응 종결 후, 상기 반응 혼합물을 25⁰C에서 냉각하고 포화 NaHCO₃ (10ml) 용액을 부었다. 반응 침전물을 진공하에 여과하고, 물 (5ml)로 세척하였다. 상기 고체 물질을 디에틸 에테르(2 x 2 ml)로 연마하고 진공하에 건조하여 목적 화합물을 얻었다 (0.036g, 70.88% 수율).

화합물 11 - (E)-2-(3,4- 디클로로벤질리덴 )히드라진-1- 카복시미드아미드

합성 스킴 (Synthetic Scheme):

실험 세부정보:

계산:

	화합물	양	M.W .	몰	몰비율
1	3,4-디클로로벤즈알데히드	0.030g	173.96	0.00017	1.00
2	아미노구아니딘 하이드로클로라이드	0.019g	110.55	0.00017	1.00
3	소듐아세테이트	0.014g	82.03	0.00017	1.00
4	에탄올	1ml

절차:

3,4-디클로로벤즈알데히드 (0.030g, 0.00017mol)의 에탄올 (1ml)에 연속적으로 아미노 구아니딘 하이드로클로라이드 (0.019g, 0.00017mol) 및 소듐아세테이트 (0.014g, 0.00017mol) 를 25⁰C에서 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 80⁰C에서 6시간 가열시켰다. 반응 완결은 디클로로메탄/메탄올(8/2)를 사용한 TLC 이동상으로 모니터하였다. 반응 종결 후, 상기 반응 혼합물을 25⁰C에서 냉각하고 포화 NaHCO₃ (10ml) 용액을 부었다. 반응 침전물을 진공하에 여과하고, 물 (5ml)로 세척하였다. 상기 고체 물질을 디에틸 에테르(2 x 2 ml)로 연마하고 진공하에 건조하여 목적 화합물을 얻었다 (0.035g, 88.2% 수율).

화합물 12 - (E)-2-(2,4- 디클로로벤질리덴 )히드라진-1- 카복시미드아미드

하기 화합물 12의 합성은 Nguyen et al., 2014, 5 (10), 1075-1082에 개시되어 있다.

합성 스킴 (Synthetic Scheme):

절차:

3,5-디클로로벤즈알데히드(1.0 mmol, 175mg) 및 염 아미노구아니딘 하이드로클로라이드 (1.0 mmol, 110mg)의 EtOH (2 ml)을 12시간동안 환류교반하였다. 상온에서 냉각 후, 상기 최종 화합물을 필터 후 침전물로서 수득하였다. 상기 목적 화합물은 흰색 파우더로 얻어졌다 (210mg, 79%).

화합물 13 - (E)-2-(2,4- 디클로로 -3- 플루오로벤질리덴 )히드라진-1- 카복시미드아미드

합성 스킴 (Synthetic Scheme):

실험 세부정보:

계산:

화합물	양	Mol . Wt	몰	몰비율
중간체 1	0.1 g	193.03	0.00051	1
중간체 2	0.057 g	110.5	0.00051	1
NaOAc	0.042 g	82.03	0.00051	1
에탄올	1 mL	-	-	10 V

절차:

중간체 1 (0.1 g, 0.00051 mol) 및 중간체 2 (0.057 g, 0.00051 mol)의 에탄올 (1 mL) 용액에 NaOAc (0.042 g, 0.00051 mol) 를 첨가하고 80⁰C에서 4시간 가열하였다. 반응 진행은 20 % MeOH의 DCM를 사용한 TLC 이동상으로 모니터하였다. NaHCO₃(5 mL)의 냉각 용액을 반응 혼합물에 첨가하고 10분간 교반시켰다. 침전물을 필터하고, 물 (2 X 10 mL)을 통과시켜 세척하고, 감압하에 건조하고 이를 분석하여 순수한 목적 화합물을 얻었다 (0.05g; 38.75% 수율).

화합물 14 - (E)-2-(2,3- 디클로로 -4- 플루오로벤질리덴 )히드라진-1- 카복시미드아미드

합성 스킴 (Synthetic Scheme):

실험 세부정보:

계산:

화합물	양	Mol . Wt	몰	몰비율
중간체 1	0.05 g	193	0.00025	1
중간체 2	0.028 g	110.5	0.00025	1
NaOAc	0.021 g	82.03	0.00025	1
에탄올	0.5 mL	-	-	10 V

절차:

중간체 1 (0.05 g, 0.00025 mol) 및 중간체 2 (0.028 g, 0.00025 mol)의 에탄올(0.5 mL) 용액에 NaOAc (0.021 g, 0.00025 mol) 를 첨가하고 80⁰C에서 4시간 가열하였다. 반응 진행은 20 % MeOH의 DCM를 사용한 TLC 이동상으로 모니터하였다. NaHCO₃(2.5 mL)의 냉각 용액을 반응 혼합물에 첨가하고 10분간 교반시켰다. 침전물을 필터하고, 물 (2 X 5 mL)을 통과시켜 세척하고, 감압하에 건조하고 이를 분석하여 순수한 목적 화합물을 얻었다 (0.043g, 67.18% 수율).

화합물 15 - (E)-2-(3- 클로로 -4- 플루오로벤질리덴 )히드라진-1- 카복시미드아미드

합성 스킴 (Synthetic Scheme):

실험 세부정보:

3-클로로-4-플루오로벤즈알데히드 (0.1 g, 0.63 mmol)의 메탄올(2 mL)에 아미노 구아니딘 하이드로클로라이드 (0.087 g, 0.79 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 감압농축하여 미정제 물질을 얻어 이를 에틸 아세테이트 (30 mL)로 교반하여 고체 물질을 얻었으며 상기 고체물질을 필터하고, 진공하에 건조하였다. 얻어진 고체 물질을 실리카겔(100-200) 컬럼 크로마토그래피(8% MeOH / DCM)로 정제하여 목적 화합물을 흰색 고체로 얻었다(0.053 g, 39.15%).

화합물 16 - (E)-2-(2,3- 디클로로벤질리덴 )히드라진-1- 카복시미드아미드

합성 스킴 (Synthetic Scheme):

절차:

2,3-디클로로벤즈알데히드 (1e.)의 에탄올 (300ml)에 연속적으로 아미노 구아니딘 하이드로클로라이드 (1eq.) 및 소듐아세테이트 (1eq.)를 25°C에서 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 80⁰C에서 6시간 가열시켰다. 반응 완결은 디클로로메탄/메탄올(8/2)를 사용한 TLC 이동상으로 모니터하였다. 반응 종결 후, 상기 반응 혼합물을 25⁰C에서 냉각하고 포화 NaHCO₃ (700ml) 용액을 부었다. 반응 침전물을 진공하에 여과하고, 물 (100ml)로 세척하였다. 상기 고체 물질을 디에틸 에테르(2 x 25 ml)로 연마하고 진공하에 건조하여 목적 화합물을 얻었다 (85% 수율), considering mono acetate salt) LC-MS: m/z= 231.23 (M+H). ¹H-NMR (DMSO-d ₆): (ppm) 11.85 (brs, 1H); 8.35 (s, 1H); 8.19-8.21 (dd, 1H); 7.56-7.59 (dd, 1H); 7.32-7.36 (t, 1H); 7.04 (brs, 4H); 1.84 (s, 3H); MS (ESI+): m/z = 231.23 [M+H]⁺

화합물 17 - (E)-2-(2- 플루오로벤질리덴 )히드라진-1- 카복시미드아미드

합성 스킴 (Synthetic Scheme):

절차:

2-플루오로벤즈알데히드 (1eq.)의 에탄올 (300ml) 용액에 연속적으로 아미노구아니딘 하이드로클로라이드 (1eq.) 및 소듐아세테이트 (1eq.) 를 25°C에서 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 80⁰C에서 6시간 가열시켰다. 반응 완결은 디클로로메탄/메탄올(8/2)를 사용한 TLC 이동상으로 모니터하였다. 반응 종결 후, 상기 반응 혼합물을 25⁰C에서 냉각하고 포화 NaHCO₃ (700ml) 용액을 부었다. 반응 침전물을 진공하에 여과하고, 물 (100ml)로 세척하였다. 상기 고체 물질을 디에틸 에테르(2 x 25 ml)로 연마하고 진공하에 건조하여 목적 화합물을 얻었다.

화합물 18 - (E)-2-(4,5- 디클로로 -2- 플루오로벤질리덴 )히드라진-1- 카복시미드아미드

합성 스킴 (Synthetic Scheme):

실험 세부정보:

단계-1:

알루미늄 클로라이드 (3.22 g, 24.24 mmol)를 카본테트라클로라이드(20 mL)에 0 °C에서 현탁시키고, 상기 현탁액을 점진적으로 가열하였다. 1,2-디클로로-4-플루오로벤젠 (2.0 g, 12.12 mmol)을 환류하에 2시간동안 적하첨가하고 상기 혼합물을 0.5시간 추가적으로 환류하에 가열하였다. 용액을 상온에서 냉각시킨 후, 혼합물을 조심스럽게 얼음물에 부었다. 유기층을 물, 5% NaHCO₃ 용액으로 세척한 후, 물로 세척하였다. 유기층을 MgSO₄ 로 건조하고, 감압 농축하여 미정제 중간체를 얻었다. 상기 미정제 중간체를 95% 설퓨릭 애시드에 현탁시키고, 상기 현탁액을 50 °C에서 7시간 교반시켰다. 상기 용액을 얼음물에 붓고, 생성된 미정제 결정을 필터하여 수집하였다. 상기 결정(crystals)을 1N NaOH 용액에 용해시키고, 상기 용액을 에틸 아세테이트로 세척하였다. 수용액층을 6N HCl 용액으로 중성화 하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 상기 추출물을 소금무로 세척하고, 무수 MgSO₄로 건조하여 감압 농축하였다. 따라서, 상기 미정제 결정은 필터하여 수집하여 얻었다(0.35 g).

단계-2:

T-3의 Int-2(0.35 g, 1.67 mmol)의 THF (10 mL)용액을 보란 메틸설파이드 복합체 (2.51 mmol)로 0-5 °C에서 처리하였다. 상기 혼합물을 상온까지 방치하고, 상온에서 14시간 교반시킨 후, sat. NaHCO₃ 용액 및 메탄올(2 mL)로 퀀칭하였다. 상기 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 10% HCl 및 포화 NaHCO₃ 용액으로 세척, MgSO₄ 로 건조하고 농축하여 목적 화합물을 흰색 고체로 얻었다(0.275 g).

단계-3:

T-3의 Int-3 (0.275 g, 1.41 mmol)의 DCM 용액(ice-cold)에 데스마틴 퍼아이오디난(Dess Martin periodinane) (0.896 g, 2.11 mmol)을 첨가하고 30분간 교반시켰다. 반응 혼합물을 sat. NaHCO₃ 용액으로 퀀칭하고, 30분간 교반시켰다. 유기층을 분리하고 물로 세척하고, MgSO₄ 로 건조 한 후, 농축하여 T-3의 Int-4 를 얻었다(0.17 g).

단계-4:

화합물-3 (0.15 g, 0.77 mmol)의 메탄올(3 mL)에 아미노 구아니딘 하이드로클로라이드 (0.069 g, 0.62 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 65-70 °C에서 2시간 교반시켰다. 상기 반응이 TLC에서 80% 변환됨을 나타내었다. 반응 혼합물을 감압농축하여 미정제 물질을 얻어 이를 에틸 아세테이트 (30 mL)로 교반하여 고체 물질을 얻었으며 상기 고체물질을 필터하고, 진공하에 건조하였다. 얻어진 고체 물질을 Prep HPLC로 정제하여 목적 화합물을 흰색 고체로 얻었다(0.085 g, 82.33%).

화합물 20 - (E)-2-(2- 클로로 -5- 플루오로벤질리덴 )히드라진-1- 카복시미드아미드

합성 스킴 (Synthetic Scheme):

실험 세부정보:

계산:

화합물	양	Mol . Wt	몰	몰비율
중간체 1	0.1 g	158.6	0.00063	1
중간체 2	0.069 g	110.5	0.00063	1
NaOAc	0.051 g	82.03	0.00063	1
에탄올	1 mL	-	-	10 V

절차:

중간체 1 (0.1 g, 0.00063 mol) 및 중간체 2 (0.069 g, 0.00063 mol)의 에탄올 (1 mL) 용액에 NaOAc (0.051 g, 0.00063mol)를 첨가하고 80⁰C에서 4시간 가열하였다. 반응 진행은 20 % MeOH의 DCM를 사용한 TLC 이동상으로 모니터하였다. NaHCO₃ (5 mL)의 냉각 용액을 반응 혼합물에 첨가하고 10분간 교반시켰다. 침전물을 필터하고, 물 (2 X 10 mL)을 통과시켜 세척하고, 감압하에 건조하고 이를 분석하여 순수한 목적 화합물을 얻었다 (0.086 g, 63.07% 수율).

화합물 22 - (E)-2-((2,6- 디클로로피리딘 -3-일)메틸렌)히드라진-1- 카복시미드아미드

반응 스킴 (Reaction Scheme):

실험 세부정보:

2,6-디클로로니코틴알데히드 (0.1 g, 0.57 mmol)의 메탄올(2 mL) 용액에 아미노 구아니딘 하이드로클로라이드 (0.079 g, 0.71 mmol)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 65-70 °C에서 2시간 교반시켰다. 상기 반응이 TLC에서 80% 변환됨을 나타내었다. 반응 혼합물을 감압농축하여 미정제 물질을 얻어 이를 에틸 아세테이트 (30 mL)로 교반하여 고체 물질을 얻었으며 상기 고체물질을 필터하고, 진공하에 건조하였다. 얻어진 고체 물질을 실리카겔(100-200) 컬럼 크로마토그래피(5% MeOH / DCM)로 정제하여 목적 화합물을 노란색 고체로 얻었다 (0.040 g, 30.99%).

화합물 23 - (E)-2-(3- 플루오로벤질리덴 )히드라진-1- 카복시미드아미드

합성 스킴 (Synthetic Scheme):

실험 세부정보:

3-플루오로벤즈알데히드 (0.1 g, 0.81 mmol)의 메탄올(2 mL)용액에 아미노 구아니딘 하이드로클로라이드 (0.047 g, 0.43 mmol) 를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 65-70 °C에서 2시간 교반시켰다. 상기 반응이 TLC에서 90% 변환됨을 나타내었다. 반응 혼합물을 감압농축하여 미정제 물질을 얻어 이를 에틸 아세테이트 (30 mL)로 교반하여 고체 물질을 얻었으며 상기 고체물질을 필터하고, 진공하에 건조하였다. 얻어진 고체 물질을 실리카겔(100-200) 컬럼 크로마토그래피(6.5% MeOH / DCM)로 정제하여 목적 화합물을 흰색 고체로 얻었다(0.069 g, 66.83%).

화합물 24 - (E)-2-(3- 클로로벤질리덴 )히드라진-1- 카복시미드아미드

합성 스킴 (Synthetic Scheme):

실험 세부정보:

계산:

	화합물	양	M.W .	몰	몰비율
1	3-클로로벤즈알데히드	0.050g	140.57	0.00035	1.00
2	아미노구아니딘 하이드로클로라이드	0.039g	110.55	0.00035	1.00
3	소듐아세테이트	0.028g	82.03	0.00035	1.00
4	에탄올	1ml

절차:

3-클로로벤즈알데히드 (0.050g, 0.00035mol)의 에탄올 (1ml)용액에 연속적으로 아미노구아니딘 하이드로클로라이드 (0.039g, 0.00035mol) 및 소듐아세테이트 (0.028g, 0.00035mol)를 25⁰C에서 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 80⁰C에서 6시간 가열시켰다. 반응 완결은 디클로로메탄/메탄올(8/2)를 사용한 TLC 이동상으로 모니터하였다. 반응 종결 후, 상기 반응 혼합물을 25⁰C에서 냉각하고 포화 NaHCO₃ (10ml) 용액을 부었다. 반응 침전물을 진공하에 여과하고, 물 (5ml)로 세척하였다. 상기 고체 물질을 디에틸 에테르(2 x 2 ml)로 연마하고 진공하에 건조하여 목적 화합물을 얻었다(0.035g, 50.19% 수율).

화합물 25 - (E)-2-(3- 클로로 -2- 플루오로벤질리덴 )히드라진-1- 카복시미드아미드

합성 스킴 (Synthetic Scheme):

실험 세부정보:

2-클로로-3-플루오로벤즈알데히드 (0.1 g, 0.63 mmol)의 메탄올(2 mL)용액에 아미노 구아니딘 하이드로클로라이드 (0.087g, 0.79 mmol) 를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 65-70 °C에서 2시간 교반시켰다. 상기 반응이 TLC에서 90% 변환됨을 나타내었다. 반응 혼합물을 감압농축하여 미정제 물질을 얻어 이를 에틸 아세테이트 (30 mL)로 교반하여 고체 물질을 얻었으며 상기 고체물질을 필터하고, 진공하에 건조하였다. 얻어진 고체 물질을 실리카겔(100-200) 컬럼 크로마토그래피(8.5% MeOH / DCM)로 정제하여 목적 화합물을 흰색 고체로 얻었다(0.088 g, 68.19%).

화합물 26 - (E)-2-(2,5- 디클로로벤질리덴 )히드라진-1- 카복시미드아미드

합성 스킴 (Synthetic Scheme):

실험 세부정보:

계산:

	화합물	양	M.W .	몰	몰비율
1	2,5-디클로로벤즈알데히드	0.045g	173.96	0.00025	1.00
2	아미노구아니딘 하이드로클로라이드	0.028g	110.55	0.00025	1.00
3	소듐아세테이트	0.020g	82.03	0.00025	1.00
4	에탄올	1ml

절차:

2,5-디클로로벤즈알데히드 (0.045g, 0.00025mol)의 에탄올 (1ml)에 연속적으로 아미노 구아니딘 하이드로클로라이드 (0.028g, 0.00025mol) 및 소듐아세테이트 (0.020g, 0.00025mol)를 25⁰C에서 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 80⁰C에서 6시간 가열시켰다. 반응 완결은 디클로로메탄/메탄올(8/2)를 사용한 TLC 이동상으로 모니터하였다. 반응 종결 후, 상기 반응 혼합물을 25⁰C에서 냉각하고 포화 NaHCO₃ (10ml) 용액을 부었다. 반응 침전물을 진공하에 여과하고, 물 (5ml)로 세척하였다. 상기 고체 물질을 디에틸 에테르(2 x 2 ml)로 연마하고 진공하에 건조하여 목적 화합물을 얻었다(0.039g, 65.55% 수율).

화합물 27 - (E)-2-(2- 클로로 -3,4- 디플루오로벤질리덴 )히드라진-1- 카복시미드아미드

합성 스킴 (Synthetic Scheme):

실험 세부정보:

계산:

화합물	양	Mol . Wt	몰	몰비율
중간체 1	0.04 g	176.55	0.00022	1
중간체 2	0.025 g	110.5	0.00022	1
NaOAc	0.018 g	82.03	0.00022	1
에탄올	0.4 mL	-	-	10 V

절차:

중간체 1 (0.04 g, 0.00022 mol) 및 중간체 2 (0.025 g, 0.00022 mol)의 에탄올 (0.4 mL) 용액에 NaOAc (0.018 g, 0.00022 mol)를 첨가하고 80⁰C에서 4시간 가열하였다. 반응 진행은 20 % MeOH의 DCM를 사용한 TLC 이동상으로 모니터하였다. NaHCO₃(2.5 mL)의 냉각 용액을 반응 혼합물에 첨가하고 10분간 교반시켰다. 침전물을 필터하고, 물 (2 X 5 mL)을 통과시켜 세척하고, 감압하에 건조하고 이를 분석하여 순수한 목적 화합물을 얻었다 (0.063g, 95.43% 수율).

화합물 29 - (E)-2-(2- 클로로 -3,5- 디플루오로벤질리덴 )히드라진-1- 카복시미드아미드

합성 스킴 (Synthetic Scheme):

실험 세부정보:

계산:

화합물	양	Mol . Wt	몰	몰비율
중간체 1	0.06 g	176.55	0.00033	1
중간체 2	0.037 g	110.5	0.00033	1
NaOAc	0.027 g	82.03	0.00033	1
에탄올	0.6 mL	-	-	10 V

절차:

중간체 1 (0.06 g, 0.00033 mol) 및 중간체 2 (0.037 g, 0.00033 mol)의 에탄올 (0.6 mL) 용액에 NaOAc (0.027 g, 0.00033 mol)를 첨가하고 80⁰C에서 4시간 가열하였다. 반응 진행은 20 % MeOH의 DCM를 사용한 TLC 이동상으로 모니터하였다. NaHCO₃(2.7 mL)의 냉각 용액을 반응 혼합물에 첨가하고 10분간 교반시켰다. 침전물을 필터하고, 물 (2 X 2.7 mL)을 통과시켜 세척하고, 감압하에 건조하고 이를 분석하여 순수한 목적 화합물을 얻었다(0.04g, 50.63% 수율).

화합물 30 - (E)-2-(3- 클로로 -2- 플루오로벤질리덴 )히드라진-1- 카복시미드아미드

합성 스킴 (Synthetic Scheme):

실험 세부정보:

3-클로로-2-플루오로벤즈알데히드 (0.1 g, 0.63 mmol)의 메탄올(2 mL)용액에 아미노 구아니딘 하이드로클로라이드 (0.087g, 0.79 mmol)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 65-70 °C에서 2시간 교반시켰다. 상기 반응이 TLC에서 90% 변환됨을 나타내었다. 반응 혼합물을 감압농축하여 미정제 물질을 얻어 이를 에틸 아세테이트 (30 mL)로 교반하여 고체 물질을 얻었으며 상기 고체물질을 필터하고, 진공하에 건조하였다. 얻어진 고체 물질을 실리카겔(100-200) 컬럼 크로마토그래피(8.5% MeOH / DCM)로 정제하여 목적 화합물을 얻었다

화합물 31 - (E)-2-(2,3,6- 트리클로로벤질리덴 )히드라진-1- 카복시미드아미드

합성 스킴 (Synthetic Scheme):

실험 세부정보:

2,3,6-트리클로로벤즈알데히드 (0.040g, 0.00019mol)의 에탄올 (1ml)용액에 연속적으로 아미노 구아니딘 하이드로클로라이드 (0.021g, 0.00019mol) 및 소듐아세테이트 (0.015g, 0.00019mol) 를 25⁰C에서 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 80⁰C에서 6시간 가열시켰다. 반응 완결은 디클로로메탄/메탄올(8/2)를 사용한 TLC 이동상으로 모니터하였다. 반응 종결 후, 상기 반응 혼합물을 25⁰C에서 냉각하고 포화 NaHCO₃(10ml) 용액을 부었다. 반응 침전물을 진공하에 여과하고, 물 (5ml)로 세척하였다. 상기 고체 물질을 디에틸 에테르(2 x 2 ml)로 연마하고 진공하에 건조하여 목적 화합물을 얻었다

화합물 32 - (E)-2-(2- 클로로 -4,5- 디플루오로벤질리덴 )히드라진-1- 카복시미드아미드

합성 스킴 (Synthetic Scheme):

실험 세부정보:

계산:

화합물	양	Mol . Wt	몰	몰비율
중간체 1	0.1 g	176.55	0.00056	1
중간체 2	0.062 g	110.5	0.00056	1
NaOAc	0.046 g	82.03	0.00056	1
에탄올	1 mL	-	-	10 V

절차:

중간체 1 (0.1 g, 0.00056 mol) 및 중간체 2 (0.062 g, 0.00056 mol)의 에탄올 (1 mL) 용액에 NaOAc (0.046 g, 0.00056 mol)를 첨가하고 80⁰C에서 4시간 가열하였다. 반응 진행은 20 % MeOH의 DCM를 사용한 TLC 이동상으로 모니터하였다. NaHCO₃(5 mL)의 냉각 용액을 반응 혼합물에 첨가하고 10분간 교반시켰다. 침전물을 필터하고, 물 (2 X 10 mL)을 통과시켜 세척하고, 감압하에 건조하고 이를 분석하여 순수한 목적 화합물을 얻었다 (0.117g, 89.31% 수율).

화합물 34 - (E)-2-(3,5- 디클로로벤질리덴 )히드라진-1- 카복시미드아미드

합성 스킴 (Synthetic Scheme):

실험 세부정보:

계산:

	화합물	양	M.W .	몰	몰비율
1	3,5-디클로로벤즈알데히드	0.030g	173.96	0.00017	1.00
2	아미노구아니딘 하이드로클로라이드	0.019g	110.55	0.00017	1.00
3	소듐아세테이트	0.013g	82.03	0.00017	1.00
4	에탄올	1ml

절차:

3,5-디클로로벤즈알데히드 (0.030g, 0.00017mol)의 에탄올 (1ml)에 연속적으로 아미노 구아니딘 하이드로클로라이드 (0.019g, 0.00017mol) 및 소듐아세테이트 (0.013g, 0.00017mol) 를 25⁰C에서 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 80⁰C에서 6시간 가열시켰다. 반응 완결은 디클로로메탄/메탄올(8/2)를 사용한 TLC 이동상으로 모니터하였다. 반응 종결 후, 상기 반응 혼합물을 25⁰C에서 냉각하고 포화 NaHCO₃ (10ml) 용액을 부었다. 반응 침전물을 진공하에 여과하고, 물 (5ml)로 세척하였다. 상기 고체 물질을 디에틸 에테르(2 x 2 ml)로 연마하고 진공하에 건조하여 목적 화합물을 얻었다(0.038g, 95.8% 수율).

일반적인 제조절차 A:

벤즈알데히드 (1eq.)의 에탄올 (300ml)에 연속적으로 아미노구아니딘 (1eq.) 및 소듐아세테이트 (1eq.) 를 25⁰C에서 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 80⁰C에서 6시간 가열시켰다. 반응 완결은 디클로로메탄/메탄올(8/2)를 사용한 TLC 이동상으로 모니터하였다. 반응 종결 후, 상기 반응 혼합물을 25⁰C에서 냉각하고 포화 NaHCO₃ (700ml) 용액을 부었다. 반응 침전물을 진공하에 여과하고, 물 (100ml)로 세척하였다. 상기 고체 물질을 디에틸 에테르(2 x 25 ml)로 연마하고 진공하에 건조하여 목적하는 치환된 아미노구아니딘 유도체를 얻었다.

하기 화합물은 상기 일반적인 제조절차 A에 따라 제조되었다:

실시예 1 (화합물 16(E)): (E)-2-(2,3- 디클로로벤질리덴 )히드라진-1- 카복시미드아미드

일반적인 제조절차 A에 따라 2,3-디클로로벤즈알데히드로부터 85% 수율로 제조되었다 (considering mono acetate salt) LC-MS: m/z= 231.23 (M+H). ¹H-NMR (DMSO-d ₆): (ppm) 11.85 (brs, 1H); 8.35 (s, 1H); 8.19-8.21 (dd, 1H); 7.56-7.59 (dd, 1H); 7.32-7.36 (t, 1H); 7.04 (brs, 4H); 1.84 (s, 3H); MS (ESI+): m/z = 231.23 [M+H]⁺

실시예 2: (E)-2-(2- 클로로 -4- 플루오로벤질리덴 )히드라진-1- 카복시미드아미드

일반적인 제조절차 A에 따라 2- 클로로-4-플루오로벤즈알데히드로부터 67% 수율로 제조되었다. ¹H-NMR (DMSO-d ₆ ): d (ppm) 5.80 (brs, 2H); 5.84 (brs, 2H); 7.19-7.34 (m, 4H); 8.16 (s, 1H); MS (ESI+): m/z = 215.1 [M+H]⁺

실시예 A의 실험방법(protocol) 및 분석은 PPP1R15B 저해와 관련하여 수행되었다. 그러나, 본원에 기술된 방법은 PPP1R15A 및 PPP1R15B 억제제를 동정 / 분석하는데 동일하게 적용 가능하다는 것을 이해할 것이다.

실시예 A

표면 플라스몬 공명에 의한 단백질 발현, 정제 및 분석(protein expression, purification and analysis by surface plasmon resonance)

단백질 발현 및 정제

PPP1R15A³²⁵ ^-636 및 PPP1R15B³⁴⁰ ^-698 은 다음과 같이 발현시키고 정제하였다: PPP1R15A의 아미노산 325-636 및 PPP1R15B의 아미노산 340-698을 코딩하는 cDNA를 His-표지하고 pMAL-c5x에 클로닝하였다. 재조합 PPP1R15A/B를 BL21-Gold 세포에서 발현시키고 HisTrap HP 컬럼 (GE Healthcare)에서 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)로 정제한 후 MBPTrap HP 컬럼 (GE Healthcare)으로 정제 하였다.

SimplyBlue SafeStain (Life Technologies)으로 염색된 BOLT SDS-PAGE 4-12 % Bis-Tris 겔 (Life Technologies)에서 단백질을 분석하였다. 인간 PP1γ를 코딩하는 cDNA를 배큘로 바이러스(baculovirus) 전달 벡터 pDW464에 클로닝하여 바이오틴 수용체 펩티드 (BAP)를 첨가하였다. 벡터는 또한 BAP-태깅된 단백질이 Spodoptere frugiperda (Sf9) 곤충 세포에서 생체 내에서 바이오티닐화 될 수 있도록 대장균 바이오틴 홀로 효소 합성 효소 (BirA)를 암호화한다(Duffy et al., Anal. Biochem., 262, 122-128, 1998). Bac-to-Bac 배큘로사이러스 발현 시스템 (Life Technologies)을 사용하여 재조합 바크미드 DNA를 생성하고 Sf9 곤충 세포를 사용하여 바이러스 주를 증폭시켰다. 배양물을 1,200g에서 15 분간 원심 분리하여 수확하고, 세포 펠렛을 용해 재현탁시켰다. 완충액 (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.2% Triton, 5% Glycerol, 1 PiC tablet (Roche) per 50 ml and 0.2 mM PMSF))로 세척 한 후 완만하게 초음파 처리 하였다. 단백질은 먼저 5 ml HiTrap Q HP 칼럼 (GE Healthcare)에 이어 HiLoad 16/600 Superdex 200 칼럼 (GE Healthcare)에서 정제되었다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏에 의해 확인된 양성 분획을 모으고 ~ 1μM로 농축시키고 -80 ℃에서 저장 하였다.

SA 센서 칩상의 바이오틴 -PP1 포획(Capture of biotin-PP1 on the SA Sensor Chip)

모든 실험에 Biacore T200 (GE Healthcare) 시스템을 사용했으며 바이오칩 화 된 PP1은 Sensor Chip SA (GE Healthcare, 카탈로그 번호 BR-1005-31)를 사용하여 포획하였다. 스트렙타비딘 코팅된 표면을 50 mM NaOH 및 1M NaCl 용액으로 1 분간 주사하여 활성화시켰다. 비오틴-PP1을 러닝 완충액 (50 mM Tris pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.1 mM EGTA, 1 mM MnCl2, 0.05 % Tween 20)으로 희석하고 약 300 nM 농도로 스트렙타비딘 코팅된 표면에 100 초 동안 또는 ~ 7000 RU에 해당하는 비오틴 -PP1의 고정화 수준에 도달할 때까지 주사한다. SA 센서 칩 표면 중 하나가 기준으로 사용되도록 공극 고정을 수행하였다.

Biotin-PP1 표면을 이용한 eIF2α 홀로 포스파타제 복합체에 대한 작은 분자의 정상 상태 결합 상수 결정(Determining steady-state binding constants of small molecules to eIF2α holophosphatase complexes using the biotin-PP1 surface)

사소한 편차로 모든 바인딩 실험에서 동일한 절차와 조건이 사용되었다. 작은 분자는 100 % DMSO에 50 mM 저장 용액으로 저장되었다. 결합 상수를 결정하기 전에, 12 또는 8 농도의 화합물의 연속 희석액을 96 웰 플레이트의 런닝 완충액에서 제조하였다. 각각의 화합물 희석 시리즈 전에, 조절 서브 유닛인 R15A 또는 R15B를 런닝 버퍼에서 15μM로 희석하고 바이오틴 -PP1 표면 상에 포획하여 센서칩 표면 상에 홀로 포스파타제 복합체를 형성시켰다. 그런 다음 표면을 재생하지 않고 칩 희석 시리즈를 칩 표면에 주입했다. 센서그램을 Biacore T200 평가 소프트웨어를 사용하여 분석하고 결합 상수를 정상 상태 모델에 따라 결정했다. 동력학 실험은 상이한 농도의 화합물 및 각각의 평형 결합 수준을 이용하여 수행된다. 이러한 평형 반응 레벨 (Req)은 농도에 대해 플롯되고, 정상 상태 친 화성 상수를 결정할 수있는 글로벌 피트 (global fit)를 사용하여 맞춰진다. 즉, 50 % 포화시의 농도는 KD이다(Frostell-Karlsson et al., J. Med. Chem., 43, 1986-1992, 2000).

포유류 세포 배양(Mammalian cell culture)

HeLa 세포는 5 % 및 10 % 태아 소 혈청 (FBS)을 함유하는 페니실린, 스트렙토마이신으로 보충된 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Media, DMEM)에서 각각 배양 하였다. MEF 세포를 페니실린, 스트렙토 마이신, 글루타민, 55μM β- 머캅토에탄올, 1X 비필수 아미노산 (Sigma-Adrich) 및 10 % FBS가 보충 된 DMEM에서 배양 하였다. 표시된 경우, 세포를 2.5 μg / ml 투니카마이신, 1 mM DTT (Sigma-Adrich) 및 지시된 농도로 지시 된 시약으로 처리 하였다.

면역블랏을 통한 단백질 분석(protein analyses by immunoblots )

면역 블랏의 경우 HeLa 세포 (80,000 세포 / ml)를 각 실험 24 시간 전에 12- 웰 플레이트에 도말하였다. 지시된 처리 직후, 세포를 75㎕의 Laemmli 완충액에서 용해시키고, 95 ℃에서 5 분간 끓여서 초음파 처리하였다. 단백질은 다음 항체들: phospho-eIf2α [pS52] 및 PPP1R15A / GADD34 (10449-1-AP)를 사용하여 기술된 바와 같이 분리되고 분석되었다(Tsaytler et al., Science, 332, 91-94, 2011) 1/1000 희석) 및 ATF4 (Sc-200 Santa Cruz).

세포 생존 능력의 평가(Assessment of cell viability)

세포를 처리 전 24 시간 동안 15,000 (HeLa) 또는 12,000 세포 / ml (MEFs)의 밀도로 24- 웰 플레이트에 도말하였다. ER stress는 2.5 μg / ml 투니카마이신(tunicamycin)(Sigma-Aldrich)이 함유된 신선한 배지를 첨가하여 유도하였다. 실시예 1의 화합물을 DMSO에 용해시키고 지시된 대로 첨가 하였다. DMSO는 모의 처리로 사용되었다. 세포 생존력은 Cell viability Counting Kit-8 (Dojindo)를 사용하여 투니카마이신 처리 48 시간 후에 공급자의 권고에 따라 WST-8 [2- (2- 메톡시 -4- 니트로페닐) -3- (4-니트로페닐) -5- (2,4-디설포페닐) -2H- 테트라 졸륨]을 포르마잔(formazan)로 환원을 측정하여 평가하였다.

화합물의 독성은 Cell viability Counting Kit-8 (Dojindo) 또는 Phase contrast와 IncuCyte ™ Cytotox Green Reagent를 동시에 사용하는 Incucyte (Essenbioscience)를 사용하여 평가하였다.

동물 연구(Animal studies)

모든 동물 관리 및 절차는 현지 윤리적 승인을받은 연구 동물 사용법 (1986 년 영국 동물 과학 절차법)에 따라 수행되었다.

체중에 대한 실시예 1의 화합물의 효과를 연구하기 위해, C3H / B6 마우스를 실시예 1의 화합물로 1 일 1 회 경구 투여하고 마우스 중량을 2 주 동안 매일 기록 하였다.

질병 표현형을 개선 시키는데 있어서 실시예 1의 화합물의 효능을 평가하기 위하여, 28 일된 트랜스제닉 마우스 또는 한배 새끼(littermate) 대조군을 실시예 1의 화합물 (2 mg / kg) 또는 소포(vehicle)로 매일 4 주 동안 경구 투여 하였다. 질환 진행은 치료하는 동안 마우스를 가중하고 처리 4 주 후에 운동 능력을 평가하여 평가했다.

실시예 1의 화합물이 Guanabenz의 부작용을 갖는지 여부를 평가하기 위해, 마우스(n> 3)를 10mg / kg의 화합물 또는 Guanabenz로 경구 투여 하였다. 이들의 활동은 투약 후 30 분 동안 모니터링 되었다. Guanabenz처리 된 마우스는 투여하지 않은 마우스와 같이 활성 인 실시예 1의 화합물로 처리된 마우스와 달리, Guanabenz의 저혈압 활성으로 인해 투여 후 30 분 동안 움직이지 않았다.

8 주 된 HD-N171-82Q 마우스와 이의 야생형 한배 새끼(littermate) 동물을 정적 로터에서 1 분간, 그리고 일정 속도 (4 rpm)에서 1 분 동안 처음으로 습관화하게 했다. 습관화를 반복했다. 테스트 세션은 중간에 15 분 간격으로 4 번의 시도로 구성되었다. 각 실험에 대해 5 마리의 마우스를 가속 로터 (4 ~ 40rpm)에 놓고 낙하 대기 시간을 기록하고 개별 동물의 최대 한계를 300 초로 설정했다.

대사 장애의 치료를 위해, 1 일 1 회 1mg / kg의 실시예 1 화합물을 3 주간 처리하여 Db / db 동물 (n=5 조건 당)을 처리 하였다. 혈당 수치는 9시에서 10시 사이의 혈당 측정기 (DSI)로 측정되었다. 데이터는 평균 +/- S.e.m이다.

정량적 RT- PCR (Quantitative RT- PCR )

Trizol (Life Technologies)에서 두뇌의 RNA를 추출했다. RNA 농도는 NANODROP1000 분광 광도계(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 측정하였고, 1 μg을 SuperScript 역전사 효소 (Life Technologies)를 사용하여 cDNA로 역전사하였다. 프라이머 GAPDH (f) : ACCACAGTCCATGCCATCAC, GAPDH (r) : TCCACCACCCTGTTGCTGTA, PPP1R15A (f) : CCTCCTGAAACTTGGGGACT; 및 PPP1R15A (r) : GCTGTGATGTGGGATAAGCG를 이용한 정량적 PCR은 Corbett Rotor-Gene 버전 6000에서 SYBR® Select Master Mix (Ref 4472908, 응용 생물 시스템)를 사용하여 수행되었다. 각 유전자의 발현을 하우스 키핑 유전자 GAPDH에 대해 정상화시키고, Paffl 방정식을 사용하여 계산된 배변이로서 나타내었다.

DRG 배양( DRG cultures)

야생형 또는 Pmp22Tr-J (PMP22mutant) (Henry et al., Neuropathol. Exp. Neurol., 42, 688-706, 1983) 배아로부터 13.5에서 또는 발달 (E13.5) 해부된 배근신경절 (Dorsal root ganglia, DRG)은 4 g/l 글루코스, 2 mM L-글루타민, 2% B27 보조제 및 50 ng/ml 신경 성장 인자(neuronal growth factor (NGF))로 보충된 신경 섬유 배지에서 콜라겐 코팅된 커버 슬립에서 7일간 배양하였다.

Schwann 세포를 분화시키고 미엘린형성(myelination)을 유도하기 위해 배양된 DRG를 C- 배지(4g / l 글루코스, 2mM L- 글루타민, 10 % FCS, 50ng / ml NGF가 보충된 MEM 배지)에서 유지시켰다. C-배지를 격일로 매일 50 μg/ml 아스코르빅 산 ± 5nM 실시예 1 화합물으로 교체하고 Schwann 세포에 의한 수초화를 위해 14 일 동안 배양 하였다. 배양된 DRG를 4 % 파라 포름 알데하이드에 고정시키고 MBP (Rat Myelin 염기성 단백질, 1/250 희석, ab73498)로 면역 염색시켰다.

마우스에 대한 참조는 Pubmed ID: 631386이다.

생화학적 분석(Biochemical Assay)

분석 1: 선택적 PPP1R15B 억제제는 PPP1R15B -PP1에 선택적으로 결합한다 (도 1)

표면 플라스몬 공명(SPR)은 PPP1R15A / B-PP1 포스파타제 복합체에 대한 화합물의 결합 친화력을 측정하기 위해 사용되었다. Biotin acceptor peptide (BAP)는 PP1γ의 N- 말단에 융합되어 Sf9 곤충 세포에서 BAP- 태그 단백질의 바이오틴화를 가능하게한다. 정제 후, BAP-PP1γ 단백질은 스트렙타비딘 (streptavidin) 센서칩 (SA-chip, GE healthcare)상에서 ~ 5.000 RU의 반응 수준으로 포획되었다. 제어된 바이오티닐화를 사용하면 센서칩 표면에 방향을 맞추어 균일하게 고정화 할 수 있다. PP1γ를 사용하여 PPP1R15A / B를 포획하고 스트렙타비딘 칩 표면에 홀로 포스파타제 복합체를 형성시켰다. 이 복합체는 화합물의 결합을 시험하는데 사용될 수 있다. 10 μM PPP1R15A / B 단백질 농도를 사용하여 80 초 주사 동안 홀로 포스포파타제 복합체를 형성시켰다. PPP1R15A / B가 포획된 후, 홀로 포스파타제에 대한 화합물의 결합을 측정하는 화합물의 농도 시리즈가 칩 표면에 주입된다. 농도 시리즈 (8 또는 12 농도)가 완료된 후 표면은 3M NaCl로 재생되고 R15A / B를 다시 포획하여 다른 화합물 농도 시리즈의 결합을 측정하는 새로운 홀로 포스파타제 복합체를 형성 할 수 있다. 농도의 함수로서 평형 결합 수준을 분석하면 상호 작용 친화도 또는 정상 상태의 결합 친화성 (K_D)이 얻어진다.

도 1은 실시예 1의 화합물에 대한 K_D 값을 나타낸다. PPP1R15B-PP1에 대한 0.035 μM의 K_D 및 PPP1R15A-PP1에 대한 1 μM은 실시예 1의 화합물이 PP1R15B-PP1 복합체에 선택적으로 결합하지만, 상기 결합이 PPP1R15A-PP1 복합체에 비해 상당히 적음을 나타낸다.

분석 2: 선택적 PPP1R15B 억제제는 스트레스가 없을 때 세포에서 eIF2α의 일시적인 인산화를 유도한다(도 2A 및 B)

재조합 단백질을 이용한 시험관 내(in vitro) 결합 분석을 사용하여 실시예 1의 화합물의 선택성을 나타내었다. 그러나, PPP1R15B에 결합하는 선택적 화합물을 스크리닝하기 위해 결합 분석을 사용할 수 있지만, 화합물의 특성은 반드시 결합 분석에 의해 예측되는 것은 아니다. 따라서, 화합물이 PPP1R15B 기능을 억제하는지 여부를 평가하기위한 다른 분석이 필요하다.

인간 세포를 PPP1R15B 억제제로 처리하고 eIF2α 인산화를 시간에 걸쳐 모니터링 하였다. 본 발명자들은 스트레스가 없을 때 (세포가 PPP1R15A를 발현하지 않는 조건 하에서) 실시예 1의 화합물로 세포를 처리하면 eIF2α 인산화가 유도됨을 발견하였다. 이는 실시예 1의 화합물을 첨가한 후 1 내지 7.5 시간에 나타났다. 그러나, 실시예 1의 화합물을 첨가한 후 10 시간에, eIF2α 인산화는 기저 수준으로 되돌아 갔다. 이것은 이 시점에서 활성 eIF2α 포스파타제가 있음을 시사했다. 실제로, 본 발명자들은 PPP1R15A가 실시예 1 (분석 3 참조)의 화합물을 첨가한 후반의 시점에서 유도됨을 발견 하였다. eIF2α 인산화의 일시적인 유도는 화합물이 세포에서 PPP1R15B의 선택적 억제제임을 입증한다. 또한, 이는 실시예 1의 화합물이 PPP1R15A를 보충한다는 것을 입증한다. 이 분석은 다른 선택적 PPP1R15B 억제제를 확인하는 데 도움이 될 수 있다.

분석 3: 선택적 PPP1R15B 억제제는 세포에서 PPP1R15A의 발현을 유도한다(도 2A 및 B)

세포와 유기체에는 일반적으로 결핍을 보완하는 메커니즘이 있다. 따라서, 본 발명자들은 세포가 PPP1R15A를 유도함으로써 PPP1R15B 억제를 보상할지 여부를 고려하였다. PPP1R15B 녹아웃 마우스의 간에서 PPP1R15A 수준이 증가한다는 것이 이전에 보고되었다 (Harding et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 106, 1832-1837, 2009). 이 보상 반응이 간에 특이적이거나 세포 또는 다른 조직에서 일어날 수 있는지 여부는 알려지지 않았다. 또한,이 연구에 앞서, PPP1R15B가 PPP1R15B의 약리학 적 억제시 PPP1R15B의 선택적 억제제가 아니기 때문에 PPP1R15A 유도가 관찰 될 수 있는지 여부는 알려지지 않았다.

도 2B는 실시예 1의 화합물로 처리된 세포가 PPP1R15A를 유도하는 것을 설명한다. 이러한 특징, PPP1R15A의 유도는 PPP1R15B 억제제를 보유할 세포에서 PPP1R15A 발현을 유도하는 화합물이 PPP1R15B 억제제를 스크리닝하는 방법으로 사용될 수있다. 예를 들어, 리포터 유전자에 융합된 PPP1R15A 유전자 또는 프로모터를 사용하는 분석법을 디자인하고 PPP1R15A를 유도하는 화합물을 동정하기 위해 HTS 스크린으로 전개할 수있다.

분석 4: 선택적 PPP1R15B 억제제는 스트레스로부터 세포를 보호한다(도 3)

도 3은 선택적 PPP1R15B 억제제가 스트레스로부터 세포를 보호한다는 것을 보여준다. 세포는 실시예 1의 화합물 0.2-5mM의 존재하에 투니카마이신 (2.5㎍ / ml)으로 스트레스를 받는다. 세포 생존력은 처리 3 일 후에 측정 하였다.

실시예 1의 억제제는 투니카마이신에 의해 유발된 세포 독성 스트레스로부터 세포를 보호한다. ER 스트레스에 대한 세포 보호는 적절한 분석법으로 측정할 수 있다. 이 예에서, 세포 보호(cytoprotection)는 N-glycosylation을 차단하는 약물인 투니카마이신을 함유한 배지를 첨가하여 ER 스트레스가 유발된 HeLa 세포에서 측정하였으며, 단백질 폴딩을 방지하고 언폴드된 단백질 반응을 유도한다. 이어서, 도진도 (Dojindo)의 표준 세포 생존성 키트 세포 생존능 측정 키트-8(standard cell viability kit Cell Viability Counting Kit-8)을 사용하여 WST-8의 포르마잔으로 환원을 측정함으로써, 설정된 시간 후에 실시예 1의 화합물의 존재 및 부재하에 세포 생존능을 검출 하였다. ER 스트레스로부터의 세포 보호는 ER 스트레스 후 (대조군과 비교하여) 생존 세포에서의 증가율의 관점에서 측정되었다.

분석 5: 선택적 PPP1R15B 억제제는 스트레스 회복 동안 eIF2α 인산화를 연장시킨다 (도 4)

본 발명자들은 PPP1R15B 억제제가 스트레스 후에 eIF2α 인산화를 연장시켜야 한다고 추론했다. 이 활tjd을 밝히기 위해서는 PPP1R15A가 발현되지 않는 조건을 탐색하여 혼란을 주는 결과를 피하는 것이 중요하다. 본 발명자들은 DTT에 의한 응력 유도의 신속한 운동 및 가역성을 이용하고(Bertolotti et al., Nat. Cell. Biol., 2, 326-332, 2000; Jousse et al., 2003) 1 mM DTT 및 세척액으로 30 분 처리 한 후 세포에서 eIF2α 인산화를 모니터링 하였다. 본 발명자들은 DTT- 세척 후 통상적으로 발생하는 eIF2α 인산화의 감소가 지연되고 이는 PPP1R15A의 실질적인 유도 이전에 일어난다는 것을 발견 하였다. 따라서 본원에 기술된 것과 같은 스트레스 - 회복 패러다임의 초기 단계에서 eIF2α 탈인산화(dephosphorylation)의 동역학에 대한 신중한 모니터링은 다른 PPP1R15B 억제제를 확인하는데 사용될 수있다.

마우스에서 실시예 1의 화합물은 양호한 조직 분포를 가진다(도 5)

실시예 1의 화합물의 경구 투여 후 다른 시간에서의 마우스 조직 (혈장, 뇌, 척수, 췌장, 간)의 분석은 PPP1R15B 억제제가 광범위한 조직 분포를 가지며 따라서 다른 기관에 영양을 미치는 다양한 질환 및 장애의 치료에 적용될 수 있음을 설명한다.

실시예 1의 화합물로 처리한 마우스는 마우스에게 비독성이다 (도 6)

마우스를 실시예 1로 처리하고 임의의 임상 징후를 검출하기 위해 면밀히 관찰 하였다. 실시예 1의 화합물의 1 일 1 회 10 mg / mg으로 2 주간 처리 한 마우스는 위약으로 처리 한 마우스와 구별이 불가능하며 마우스는 정상적으로 체중이 증가 하였다 (도 6). 이것은 PPP1R15B 저해가 유독하지 않음을 입증한다. 이 연구 이전에 PPP1R15B 억제제는 치료 가능성이 없으므로 너무나 해롭다는 것은 놀랍고 예기치 않은 사실은 놀랍고 예기치 않은 것이 었다.

실시예 1의 화합물을 사용한 마우스의 치료는 Guanabenz에 의한 부작용을 유발하지 않는다 (도 7)

사람의 경우, Guanabenz 의 아드레날린 작용제 활성은 과다 복용시 졸음과 혼수 상태를 포함한 부작용이있다(A.H. Hall, Ann Intern Med 102, 787-788, 1985). 이러한 부작용으로 인해 Guanabenz는 더 이상 인간에게 사용되지 않는다. Guanabenz 유도체는 Guanabenz의 부작용이 있으며 알파 -2 아드레날린 활성(alpha-2 adrenergic activity)과 관련이 있을 것으로 예상된다. Guanabenz의 α-2 아드레날린성 수용체(alpha-2 adrenergic receptor)에 대한 구조-활성 관계(structure-activity relationship)는 이용 가능하지 않지만, 놀랍게도 본원 발명자는 실시예 1이 Guanabenz와 구조적으로 매우 유사한 반면 부작용은 없다는 것을 발견했다.

분석 6: 실시예 1의 화합물로 처리한 후 포유 동물에서 PPP1R15A의 유도(도 8)

PPP1R15A 유도는 실시예 1의 화합물의 지시된 투여량으로 처리된 마우스의 뇌로부터 추출한 총 mRNA에 대한 qPCR에 의해 평가하였다. 세포에서 볼수 있는 것과 유사하게, 마우스는 실시예 1의 화합물로 처리한 후 PPP1R15A가 유도되었고, 이 유도는 용량 의존적 인 것으로 밝혀졌다. PPP1R15A 유도가 eIF2α를 탈인산화시킴으로써, 실시예 1의 화합물에 의한 PPP1R15B 억제로 인한 eIF2α 인산화가 일시적이라는 것을 설명한다. 이것은 eIF2α의 지속적인 인산화가 위험하기 때문에 중요하다. PPP1R15B 억제제에 의한 생체 내 PPP1R15A의 유도는 전임상 또는 임상 연구에서 포유류에서 PPP1R15B 억제제의 효능 및 효력을 평가하는데 사용될 수있는 약력학적 매개 변수이다.

실시예 1의 화합물은 포유 동물에서 질환을 예방한다 (도 9)

PPP1R15B의 억제에 의한 폴딩 증가는 매우 광범위한 인간 병리학에 이익을 줄 가능성이있다. 이를 시험하기 위해, 발명자들은 오폴딩 단백질, 돌연변이인 Huntingtin의 축적에 의해 야기된 단백질 항상성 질환인 헌팅턴 병(Huntington 's disease, HD)을 조사 하였다. 돌연변이 Huntingtin이 UPR을 유도한다는보고가있다 (Duhnwald and Lindquist, Gene & Development, 22, 3308-3319, 2008, Nishitoh et al., Genes & Development, 16, 1345-1355, 2002). 그러나, 헌팅턴 병 모델에서 PPP1R15A를 검출하지 못한 발명자는 PPP1R15A가 HD에 대한 치료 표적이 아니라고 제안했다. HD는 현재까지 치료법이 없기 때문에, 발명자들은 PPP1R15B 억제에 의해 HD가 예방 될 수 있는지 여부를 시험하였다. 본 발명자들은 2mg / kg의 실시예 1의 화합물을 사용한 HD 마우스의 치료가 운동 수행 손상을 방지한다는 것을 발견했다(도 9). 이것은 PPP1R15B가 유효한 치료 표적이고 따라서 PPP1R15B 억제가 질환의 치료 및 예방에 유용함을 입증한다.

본원에 설명된 것처럼 PPP1R15B 억제로 질병을 예방하거나 개선할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 마우스 모델 또는 인간을 허용가능한 용량의 억제제로 치료할 수 있다. 생체 내 표적 억제를 증명하기 위해, PPP1R15B 경로의 마커를 모니터링하여 약력학 마커로 사용할 수 있다. 이러한 마커는 여기에 표시된 PPP1R15A(도 8) 또는 UPR 또는 ISR 마커 (eIF2α 인산화, CHOP, ATF4를 포함하되 이에 국한되지 않음)와 같은 기타 경로상의 표적이 될 수 있다. 실시예 1의 화합물과 함께 나타난 바와 같이, PPP1R15B 억제제는 그것이 안전하고 PPP1R15B에 대한 화합물의 선택성에 의해 결정되는 한, 치료에 유용할 것이다.

신경병증 마우스의 체외 이식편에서의 미엘린형성 ( Myelination )(도 10).

CMT는 여러 유전자의 돌연변이에 의해 야기되는 미엘린 신경병증(myelin neuropathies)의 한 그룹이다. 말초성 미엘린 단백질인 PMP22의 돌연변이가 CMT의 가장 흔한 원인이다. PMP22 (Trembler-J)에서의 돌연변이는 말초 신경계에서 미엘린의 결함으로 인하여 PMP22의 오폴딩 및 인간의 CMT와 유사한 마우스의 질환을 유발한다. PMP22 돌연변이 마우스로부터의 이식편은 인간의 질병에서 관찰되는 심각한 수초형성부전증(hypomyelination)의 개요를 말한다. 본 발명자들은 PMP22 돌연변이 마우스로부터의 후근 신경절 배양 (dorsal root ganglia culture, DRG) 치료가 미엘린형성을 개선시키는 것을 발견했다. 돌연변이 마우스의 DRG 배양물은 화합물의 치료 효능을 예측하는 유용한 모델이라는 것이 이전에 밝혀졌다. 따라서, 본원의 데이터는 실시예 1의 화합물이 CMT 질환과 같은 PMP22의 돌연변이 또는 과잉 생산에 의해 유발된 질환을 치료하는데 유용할 것이라는 것을 입증한다. 실시예 1의 화합물은 또한 다른 미엘린 장애의 치료에 유용할 것이다.

대사성 질환에서 PPP1R15B 효능의 평가 (도 11)

당뇨병, 비만, 지방간 질환 및 죽상동맥 경화증과 같은 대사성 질환이 병리학적 ER 스트레스 관련되어 있으며 UPR의 약리학적 조절제가 치료 효과가 있을 수 있다고 알려져있다. 이 연구 이전에 이용 가능한 PPP1R15B 억제제가 없었기 때문에, PPP1R15B가 대사성 질환에서 치료 표적이 될 수 있는지 여부는 불분명했다. 본 발명자들은 이러한 가능성을 시험하고, 비만 마우스를 실시예 1의 화합물로 처리하면 이들 포유 동물에서 병적으로 고혈당이 감소됨을 발견하였다 (도 11). 이는 실시예 1의 화합물을 사용한 치료가 대사 장애를 개선시킬 수 있음을 입증한다.

하나의 질병 모델에서 실시예 1의 화합물로 치료하는 것이 유익하다는 것을 보여 주면, 본 발명의 화합물은 당뇨병, 비만, 지방간 질환 및 죽상 동맥 경화증과 같은 다른 포유 동물 대사 장애에 유익할 것이라는 것이 명백하다.

실시예 B

단백질 발현 및 정제

MBP-R15A³²⁵ ^-636-His 및 MBP-R15B³⁴⁰ ^-698-His를 전술한 바와 같이 발현시키고 정제하였다 (Das et al. Science, 2015). 인간 PP1γ를 코딩하는 cDNA를 배큘로 바이러스(baculovirus) 전달 벡터 pDW464에 클로닝하여 N- 말단 바이오틴 수용체 펩티드 (BAP)를 첨가하였다. 이 벡터는 또한 BAP-태깅된 단백질이 Spodoptere frugiperda (Sf9) 곤충 세포에서 생체 내에서 바이오티닐화 (bio-PP1c) 될 수 있도록 대장균 바이오틴 홀로 효소 합성 효소 (BirA)를 암호화한다(Duffy et al., Anal. Biochem., 262, 122-128, 1998). Bac-to-Bac 배큘로사이러스 발현 시스템 (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 재조합 bacmid DNA를 생성하고 Sf9 곤충 세포를 사용하여 바이러스 주를 증폭시켰다. 이 단백질은 Insect-Xpress 배지(Lonza)에서 Sf9 곤충 세포를 사용하여 생산되었다. bio-PP1c는 HiTrap Q HP 칼럼 (GE Healthcare)에서 음이온 교환 크로마토그래피로 정제한 후 겔 여과(HiLoad 16/600 Superdex 200 column, GE Healthcare)로 정제 하였다. 단백질을 BOLT SDS-PAGE 4-12 % Bis InstantBlue (Expedeon)로 염색된 트리스 겔 (Thermo Fisher Scientific)으로 분석하고, 바이오시닐화된 PP1의 존재는 Pierce High Sensitivity Streptavidin-HRP 항체 (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 확인되었다. 상기 부분적으로 순수한 단백질을 생성하고, 스트렙 타비딘(SPR 칩 상)에 대한 바이오틴의 높은 친화성 및 특이성 때문에 후기 단계에서 완전한 정제가 이루어진다.

표면 플라스몬 공명 (Surface Plasmon Resonance, SPR )

SA 센서 칩상의 bio- GBZ 또는 bio- PP1c 포획(Capture of bio- GBZ or bio-PP1c on the SA Sensor Chip)

Biacore T200 (GE Healthcare) 시스템을 모든 실험에 사용하고 바이오티닐화 GBZ (bio-GBZ) {Tsaytler : 2011ji} 또는 bio-PP1을 센서칩 SA (GE Healthcare)에서 포획하였다. 스트렙타비 딘 코팅된 표면은 10 ㎕ / min의 유속으로 3 회 50 mM NaOH 및 1M NaCl의 용액으로 1 분 주사하여 활성화시켰다. bio-GBZ 또는 bio-PP1c를 러닝 완충액 (50 mM Tris pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.1 mM EGTA, 0.05 % Tween 20, 0.1 % DMSO)로 희석하고 약 300 nM 농도로 10 μl / min의 속도로 스트렙타비딘 코팅 표면에 직접 부착하여 ~ 200 및 6000 RU에 해당하는 bio-GBZ 또는 bio-PP1c의 고정 수준에 도달할 때까지 주사한다. SA 센서 칩 표면 중 하나가 기준으로 사용되도록 공극 고정을 수행하였다.

bio- PP1c 표면을 이용한 R15홀로 포스파타제 복합체에 대한 작은 분자의 정상 상태 결합 상수 결정 (Determining steady-state binding constants of small molecules to R15 holophosphatase complexes using the bio- PP1c surface)

작은 분자는 100 % DMSO에 50 mM 저장 용액으로 저장되었다. 결합 상수를 결정하기 전에, 화합물의 12 또는 8 농도의 에테르 연속 희석액을 96 웰 플레이트의 런닝 완충액에서 제조하였다. 각 화합물 희석 시리즈에 앞서 MBP-R15A³²⁵ ^-636-His 또는 MBP-R15B³⁴⁰ ^-698-His의 조절 서브유닛을 러닝 버퍼에서 10 μM으로 희석하고 30 μl/min 의 유속으로 1분간 침지시켜 센서 칩 표면에 홀로 포스파타제 복합체를 형성시키기 위하여 bio-PP1c 표면에 포획하였다. 1 분의 안정화 기간을 거쳐 비특이적 결합을 제거하였다. 그런 다음, 표면을 재생하지 않고, 화합물 희석 시리즈를 30 μl/min 의 유속으로 1 분 동안 칩의 표면 상에 주입한 다음, 2 분의 해리 시간을 가하였다. 각 희석 시리즈 후에 표면은 90 초 동안 3M NaCl을 사용하여 재생되었다. 재생 후, SPR 반응은 일반적으로 기저 수준으로 돌아 왔고 bio-PP1c 표면은 다음 화합물 희석 시리즈에 대한 준비가 되었다. 샘플 사이의 DMSO 농도의 작은 편차를 보정 할 수 있도록 0.06에서 8 % DMSO 범위의 8 가지 용매 샘플을 50 번째 사이클마다 주입하였다. 플로우 세포(flow cell) 온도는 10 °C였다.

데이터 분석

센서그램(Sensorgrams)은 Biacore T200 평가 소프트웨어를 사용하여 분석되었으며 결합 상수는 정상 상태 모델(steady-state model)을 기준으로 결정되었다. 동력학 실험은 상이한 농도의 화합물 및 각각의 평형 결합 수준을 이용하여 수행된다. 이러한 평형 반응 레벨(equilibrium response levels (R_eq))은 농도에 대해 플롯되고, 정상 상태 친화성 상수를 결정할 수 있는 글로벌 피트 (global fit)를 사용하여 맞춰지며 즉, 50 % 포화시의 농도는 K_D이다. K_D 값은 표 1에 나와있다.

ER 스트레스에 대한 세포보호의 측정(Measurement of Cytoprotection against ER stress)

HeLa 세포 (40,000 cells/ml)를 96- 웰 플레이트에 플레이팅하고, 250 ng / ml의 투니카마이신 존재하에 72 시간 동안 지시된 바와 같이 상이한 농도 (0 내지 20 μM)의 화합물로 처리하였다. 세포 사멸을 모니터하기 위하여 CellTox 녹색 염료 (Promega)의 1/2000 희석액을 배지에 첨가하였다. 세포의 성장은 시간이 지남에 따라 모니터링되었고 사진은 IncuCyte Zoom 시스템으로 2 시간마다 촬영하고 IncuCyte ZOOM 소프트웨어 (Essen BioScience)로 분석했다. 표 1은 투니카마이신에 의한 세포 독성 스트레스로부터 세포를 보호하는 화합물의 능력을 나타낸다. ER 스트레스에 대한 세포 보호는 적절한 분석법으로 측정 할 수 있다. 이 예에서, 세포 보호(cytoprotection)는 N-glycosylation을 차단하는 약물인 투니카마이신을 함유한 배지를 첨가하여 ER 스트레스가 유발된 HeLa 세포에서 측정하였으며, 단백질 폴딩을 방지하고 언폴드된 단백질 반응을 유도한다. 이어서, 시간 경과에 따른 세포 성장을 모니터링함으로써 설정된 시간 후에 표 1에 열거된 화합물의 존재 및 부재하에 세포 생존능을 검출하였다. ER 스트레스로부터의 세포 보호는 ER 스트레스 후 (대조군과 비교하여) 생존 세포에서의 증가율의 관점에서 측정되었다.

EC50

EC50은 세포 사멸에 대한 용량 반응 실험으로부터 추론되었다. IncuCyte의 데이터는 Prism에서 플롯되고 분석되었습니다. "세포 사멸의 %(% of cell death)"는 각 데이터 포인트이다. 각각의 농도에 대해 세포 사멸 vs 시간의 %가 있으며, 곡선 아래의 면적을 취하여 로그 상수에 대하여 기록한다=> EC50 (analysis in Prism).

번역 속도 평가(Assessment of translation rates)

세포 (90,000 cells/ml)는 12- 웰 플레이트에 도금하여 표시된대로 처리하고 37 ℃에서 10 분 100 μCi/ml 35S-메티오닌(Hartmann Analytic)으로 표지하고 ice-cold PBS로 세척하고 120 μl Laemmli 완충액에 용해시켰다. 용해물을 95 ℃에서 5 분간 끓여서 4-12 %의 Bolt Bis-Tris Plus Gel (Thermo Fisher Scientific)에서 초음파 처리하고 분석하였다. 겔을 InstantBlue (Expedeon)로 염색하고 phosphorimaging으로 분석하고 ImageJ를 사용하여 정량화 하였다.

상술한 바와 같이 번역 속도를 모니터링함으로써 R15A, R15B 및 R15A / B 억제제의 활동을 다음과 같이 정의 할 수 있다(도 12 참조). R15A 억제제는 스트레스를 받지 않은 세포에서 번역에 영향을 주지 않지만 스트레스에 따른 번역 감쇠를 연장시킨다. 선택적 R15B 억제제는 R15A가 R15B의 억제를 보상하기 때문에 단백질 합성을 일시적으로 약화시킨다. R15A / B 억제제는 단백질 합성을 지속적으로 억제한다.

번역은 많은 수준에서 억제될 수 있다. R15A 및 B 억제제가 타겟에 있도록 하기 위해, 본 발명자는 화합물로 처리된 세포에서 ATF4의 수준을 모니터링한다. R15A / B 억제제는 지속적으로 eIF2α 인산화를 유도하고 eIF2α 인산화는 ATF4 번역 결과를 유도한다. 본 발명자는 여기서 A / B 억제제가 실제로 ATF4를 유도하여 세포내 표적 결합을 확인한다는 것을 보여준다.

화합물 (E)	R15A	R15B	PP1	R15A 또는 R15B에 대한 선택적 결합 (SPR에 근거한)	Tm으로부터의 세포 보호 ( GNB와 비교)	→ 에서의 최고치[μM]	세포 사멸에 대한 효과	→ EC50 [μM]	번역에 대한 효과	→ 억제
1	8.32 ± 0.14	7.33 ± 1.79	6.28	R15AB	0%	--	Yes	4.9		R15A/B
2	46.45 ± 18.28	9.222	--	R15B	0%	--	Yes	7.709		R15B
3	4.49 ± 1.47	0.149	10.32	R15AB	52%	2.5	Yes	9.166	지속	R15A/B
4	0.457 ± 0.13	0.022 ± 0.02	331.6	R15AB	80%	20	No	--	지속/ 일시적	R15A/B
5	8.45 ± 0.41	2.67　± 0.40	30.59	R15AB	48%	5	Yes	9.458		R15A/B
6	5.427 ± 1.10	9.094 ± 1.37	--	R15AB	61%	2.5	Yes	9.653	지속	R15A/B
7	10.20 ± 2.57	4.336 ± 2.35	12.98	R15AB	46%	5	Yes	11.5		R15AB
8	6.37 ± 1.03	11.34	10.59 ± 3.82	R15AB	0%	--	Yes	11.68		R15AB
9	13.6 ± 0.8	39.6 ± 5.9	14.7 ± 1.4	R15A	67%	5	Yes	11.98		Off target
10	0.391 ± 0.14	0.440 ± 0.09		R15AB	85%	0.625	Yes	12.52	지속	R15A/B
11	16.2 ± 2.1	13.38 ± 0.47		R15AB	34%	5	Yes	12.7		R15AB
12	7.24 ± 0.5	11.7 ± 0.3	30.7 ± 1.5	R15AB	51%	5	Yes	15.13	지속	R15A/B
13	4.624 ± 0.59	6.684 ± 2.343	--	R15AB	73%	5	Yes	15.48	지속	R15AB
14	5.446 ± 1.48	5.434 ± 1.26	--	R15AB	100%	2.5	Yes	18.4	지속	R15A/B
15	11.17	7.681 ± 2.18	6.143 ± 0.28	R15AB	46%	10	Yes	19.5		R15A/B
16	1.05 ± 0.013	0.035 ± 0.02	--	R15B	92%	2.5	Yes	20.76	일시적	R15B
17	13.0 ± 0.5	18.1 ± 1.8	12.0 ± 0.8	R15AB	66%	20	No	--	(No)	(R15A/B)
18	10.20 ± 1.62	4.850 ± 0.14	10.17 ± 0.14	R15AB	54%	2.5	Yes	23.8		R15A/B
20	5.666 ± 0.72	5.173 ± 0.69	--	R15AB	88%	5	Yes	37.83		R15AB
21	0.832	0.537	(--)	R15AB	41%	20	No	--	일시적	R15B
22	7.622	12.35	--	R15AB	48%	20	No	--		R15AB
23	1.424	1.048 ± 0.32	--	R15AB	53%	20	No	--		R15AB
24	18.13 ± 7.57	18.67	6.267	R15AB	62%	20	No	--		R15AB
25	6.18 ± 3.31	9.223 ± 0.19	3.65	R15AB	54%	20	No	--
26	23.1 ± 0.9	30.0 ± 2.3		R15AB	57%	10	No	--		R15AB
27	10.56		--		57%	10	No	--		R15AB
29	7.873 ± 1.48	4.057	--	R15AB	62%	10	No	--		R15AB
30	5.15 ± 1.7	12.3 ± 0.6	12.8 ± 0.08	R15AB	85%	10	No	--	No	R15A/B
31	11.1 ± 1.6	14.3 ± 0.7	12.6 ± 1.4	R15AB	99%	10	No	--	No	R15A
32	4.818 ± 0.26	17.28	--		100%	5	No	--	지속	R15A/B
34	17.2 ± 1.9	31.3 ± 2.0		R15AB	57%	5	No	--		R15AB
GBZ + 16					100%	1.25	Yes	12.6	지속	R15A/B

Claims

화학식 IA의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:

(IA)
여기서:
X^a는 CR^2a이고;
Y^a는 CR^4a이고;
R^1a, R^2a, R^3a, R^4a, 및 R^5a 은 각각 독립적으로 H, F 또는 Cl이고;
상기 R^1a, R^2a, R^3a, R^4a, 및 R^5a 중에서 2개는 Cl이며, R^1a, R^2a, R^3a, R^4a, 및 R^5a 중에서 1개는 F이고, R^1a, R^2a, R^3a, R^4a, 및 R^5a 중에서 나머지는 H; 또는
상기 R^1a, R^2a, R^3a, R^4a, 및 R^5a 중에서 2개는 F이며, R^1a, R^2a, R^3a, R^4a, 및 R^5a 중에서 1개는 Cl이고, R^1a, R^2a, R^3a, R^4a, 및 R^5a 중에서 나머지는 H; 또는
하기로부터 선택되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
2-(3,4,5-트리클로로벤질리덴)히드라진-1-카르복시미드아미드;
2-(2,4,5-트리클로로벤질리덴)히드라진-1-카르복시미드아미드;
2-(2,3,4-트리클로로벤질리덴)히드라진-1-카르복시미드아미드.
제1항에 있어서,
상기 R^1a 및 R^3a는 모두 Cl인,
화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
제1항에 있어서,
상기 R^1a는 Cl 또는 F인,
화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
삭제
삭제
삭제
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 화합물은 E-이성질체 형태인,
화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
제1항에 있어서,
상기 화합물은 하기로부터 선택되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
(E)-2-(3,4,5-트리클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
(E)-2-(2,4,5-트리클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
(E)-2-(3,5-디클로로-4-플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
(E)-2-(2,3,4-트리클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
(E)-2-(2,4-디클로로-5-플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
(E)-2-(2,4-디클로로-3-플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
(E)-2-(2,3-디클로로-4-플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
(E)-2-(4,5-디클로로-2-플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
(E)-2-(2-클로로-3,4-디플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
(E)-2-(2-클로로-3,5-디플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드
(E)-2-(2-클로로-4,5-디플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드.
제8항에 있어서,
상기 화합물은 (E)-2-(3,4,5-트리클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
제8항에 있어서,
상기 화합물은 (E)-2-(2,3,4-트리클로로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
제8항에 있어서,
상기 화합물은 (E)-2-(2,3-디클로로-4-플루오로벤질리덴)히드라진-1-카복시미드아미드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
화학식 IA의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 질환의 치료를 위한 약학적 조성물:

(IA)
여기서,
X^a는 CR^2a이고;
Y^a는 CR^4a이고;
R^1a, R^2a, 및 R^4a은 각각 독립적으로 H, F 또는 Cl이고;
상기 R^1a, R^2a, 및 R^4a중에서 2개는 F 또는 Cl이며, R^1a, R^2a, 및 R^4a중에서 1개는 H이고, R^3a는 F 또는 Cl이고;
R^5a는 H이고,
상기 질환은 다음 중에서 선택된다:
헌팅턴병(Huntington's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 운동 실조증(ataxias), 망막변성증(retinal degeneration), 녹내장(glaucoma), 근위축성 측삭경화증 (amyotrophic lateral sclerosis, ALS) 및 프라이온병(prion diseases);
파킨슨증 치매 복합체(parkinsonism-dementia complex), 호은성의 입자 질병(argyrophilic grain disease), 만성외상성뇌병증(chronic traumatic encephalopathy), 피질기저핵변성(corticobasal degeneration), 다운 증후군(Down's syndrome), 가족형영국형치매 (familial British dementia, FBD), 가족형덴마크형치매(familial Danish dementia, FDD), 전두측두엽 치매(frontotemporal dementia), 염색체 17번 연관 파킨슨증후군(parkinsonism linked to chromosome 17, FTDP-17), 전두측두엽변성(frontotemporal lobar degeneration , FTLD), 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커 증후군(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease), 과들루프 파킨슨증후군(Gaudeloupean parkinsonism), 근긴장성이영양증(myotonic dystrophy), 뇌에 철 침착을 가진 신경변성 (neurodegeneration with brain iron accumulation), C형 니만피크병(Niemann-Pick disease type C), 신경원섬유 매듭을 동반하는 비-과메이니언 운동뉴론질환(Non-Guamanian motor neuron disease with neurofibrillary tangles), 피크병(Pick's disease), 뇌염후 파킨슨증후군(Postencephalitic parkinsonism), 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 맥관병증(Prion protein cerebral amyloid angiopathy), 진행성 피질하 신경교종(Progressive subcortical gliosis), 진행성 핵상 마비(Progressive supranuclear palsy), SLC9A6-관련 지적 장애(SLC9A6-related mental retardation), 아급성 경화성 범뇌염(Subacute sclerosing panencephalitis), 신경원섬유 매듭-우세 치매(tangle-only dementia), 및 구형 글리알 함유물을 동반하는 백질 타우병증(white matter tauopathy with globular glial includsions) 중에서 선택되는 미세소관 관련 단백질 타우의 응집과 관련된 장애(disorders associated with aggregation of the microtubule-associated protein tau);
다발성 경화증(multiple sclerosis), 펠리제우스-메르츠바하병(Pelizaeus-Merzbacher disease), VWM 병(vanishing white matter disease), 급성 횡단성 척수염(acute disseminated encephalomyelitis), 뇌실주위백질연화증(periventricular leukomalacia), 뇌실주위백질손상(periventricular white matter injury), 척수매독(Tabes Dorsalis), 데빅병(Devic's disease), 시신경염(optic neuritis), 진행성 다초점 백색질 뇌증(progressive multifocal leukoencephalopathy), 횡단척수염(transverse myelitis), 만성염증탈수초다발신경병증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathyl), anti-MAG 말초신경병증(anti-MAG peripheral neuropathy), 부신백질이영양증(adrenoleukodystrophy), 부신척수신경병증(adrenomyeloneuropathy), 확산 백질 손상(diffuse white matter injury), 길랭-바레 증후군(Guillain-Barre Syndrome), 중심성 뇌교 수초용해(central pontine myelinolysis), 백질이영양증(leukodystrophy), 유전성 탈수초성 질환(inherited demyelinating diseases), 및 샤리코-마리-투스병(Charcot Marie Tooth disease) 중에서 선택되는 미엘린 장애(myelin disorders);
낭포성섬유증(cystic fibrosis), 선천성 갑상선 기능 저하증(congenital hypothyroid goieter), 가족형 신경하수체 당뇨병(familial neurohypophyseal diabetes), 불완전골생성증(osteogenesis imperfect), 프로콜라겐 생합성 장애(procollagen biosynthesis disorders), 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia), 알파 1 항트립신 결핍증(alpha-1 antitrypsin deficiencies), 리소좀 장애(lysomal disorder), 망막색소변성증(retinis pigmentosa (RP)), 및 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease) 중에서 선택되는 소포체(endoplasmic reticulum (ER))에서 제조된 단백질의 오폴딩 또는 이동 결함에 의해 유발되는 질환;
당뇨병(diabetes), 울콧랠리슨 증후군(Wolcott-Rallison syndrome), 비만(obesity), 인슐린 저항성(insulin resistance), 고지혈증(hyperlipidemia), 지방간(fatty liver disease) 및 죽상동맥경화증(atherosclerosis) 중에서 선택되는 대사 질환(metabolic diseases);
암(cancer);
류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 제1형 당뇨병(type-1 diabetes) 및 백반증(vitiligo) 중에서 선택되는 다른 장애.
제19항에 있어서,
상기 질환은 PPP1R15A(Protein Phosphatase 1 Regulatory Subunit 15A) 및 PPP1R15B(Protein Phosphatase 1 Regulatory Subunit 15B)와 관련된 질환인, 약학적 조성물.
제19항에 있어서,
상기 질환은 오폴딩된 단백질의 축적 또는 단백질 항상성 장애와 관련된 질환인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제19항에 있어서,
상기 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 및 타우병증으로부터 선택되는 질환인, 약학적 조성물.
삭제
삭제
삭제