KR102387615B1 - 단백질질환의 치료를 위한 벤질리덴구아니딘 유도체들의 신규한 치료적 용도 - Google Patents

단백질질환의 치료를 위한 벤질리덴구아니딘 유도체들의 신규한 치료적 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 타우병증(tauopathies), 퇴행성신경질환(synucleinopathies), 폴리글루타민 및 폴리알라닌병(polyglutamine and polyalanine diseases), 백질이영양증(leukodystrophies), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disorders), 아밀로이드증 질환(amyloidosis diseases), 염증(inflammation), 대사성 질환(metabolic disorders), 심혈관 질환(cardio-vascular disorders), 골다공증(osteoporosis), 신경계 트라우마(nervous system trauma), 허혈증(ischemia)의 그룹에서 선택되는, PPP1R15A 경로와 관계 있으며 단백질 미스폴딩 스트레스 및 특히 미스폴딩된 단백질의 축적과 관계있는 질환을 치료하는데 있어서, 화학식 (I)의 화합물, 또는 이들의 호변이성체 및/또는 약학적으로 허용 가능한 염의 신규한 용도에 관한 것이다:

Description

단백질질환의 치료를 위한 벤질리덴구아니딘 유도체들의 신규한 치료적 용도{ NOVEL THERAPEUTIC USES OF BENZYLIDENEGUANIDINE DERIVATIVES FOR THE TREATMENT OF PROTEOPATHIES }
본 발명은 단백질 미스폴딩 스트레스(protein misfolding stress) 및 특히 미스폴딩된 단백질들의 축적과 관련된 질환들을 치료하는데 있어서 잠재적 치료적 적용을 갖는 화합물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 세포독성 소포체(cytotoxic endoplasmic recticulum: ER) 스트레스에 대한 보호 효과를 나타낼 수 있는 화합물들을 제공한다.
구아나벤즈(guanabenz)로도 불리는 화합물 2-(2,6-디클로로벤질리덴)히드라진카르복스이미드아미드는 고혈압치료 약물로 사용되는 알파-2 타입의 알파 작용제(alpha agonist)이다.
Figure 112016125037009-pct00001
구아나벤즈(Guanabenz)
구아나벤즈의 다양한 유도체들이 또한 보고되었다. 예를 들어, US 3,982,020 (Sandoz, Inc.)에는 치환된 벤질리덴 히드라진 및 저혈당증-항고혈당 약제들, 비만증 치료제 및 소염제로서 이들의 용도가 개시되어 있다. US 2004/0068017 (Bausch & Lomb Inc.)에는 눈 세포(ocular cell)에서 젤라티나제 A의 활성을 증가시킬 수 있는 치환된 벤질리덴 히드라진이 개시되어 있다. 상기 분자들은 원발 개방각 녹내장(primary open angle glaucoma)의 치료에 적용을 갖는다. WO 2008/061647 (Acure Pharma AB)에는 VEGFR 억제제로서 N-(2-클로로-3,4-디메톡시벤질리덴아미노)구아니딘의 용도 및 종양 성장 및/또는 염증 병태 동안 치료 또는 원치않는 혈관 형성의 방지에서 이의 관련된 적용이 개시되어 있다. WO 2005/031000 (Acadia Pharmaceuticals, Inc.)에는 치환된 벤질리덴 히드라진, 및 격심한 통증 및 만성 신경병증성 통증을 치료에 있어 이들의 용도가 개시되어 있다. 최종적으로, EP1908464 (CNRS)에는 구아나벤즈 및 클로로구아나벤즈, 및 헌팅톤병을 포함하는 폴리글루타민 확장 관련 질환의 치료에서 이들의 용도가 개시되어 있다.
더 최근에는 구아나벤즈가 다수의 다른 분야에서 치료 가능성을 갖는다는 것이 보고되었다. 구아나벤즈가 안티-프리온 활성을 갖는다는 것이 최근 주목받았다 (D. Tribouillard-Tanvier et al., 2008 PLoS One 3, e1981). 단백질 미스폴딩에 대한 보호에 있어서 이의 활성은 놀랍게도 훨씬 더 광범위하며 세포-기반 분석에서의 돌연변이 헌팅틴(mutant Huntingtin)의 축적을 약화시키는 것 (WO 2008/041133)과 Min6 및 INS-1 췌장 베타-세포의 소포체(ER)에서 미스폴딩 프론(prone) 인슐린 아키타 돌연변이의 발현의 치사 효과로부터 보호하는 것 (Tsaytler et al., Science 2011 Vol. 332, 1 pp 91-94)을 포함하는 것이 보고되었다. WO2014/138298과 Way 등의 문헌 (2015 Nature Communications 6:6532 DOI: 10.1038/ncomms7532)에는 구아나벤즈 및 다발성경화증과 같은 탈수초성 질환(demyelinating disorder)의 치료에 있어서 이의 용도가 개시되어 있다.
구아나벤즈는 또한 투여량-의존 방식으로, N-글리코실화 억제제 튜니카마이신에 의해 유도되는 다른 세포독성 ER-스트레스에 노출된 헬라(Hela) 세포의 생존을 촉진하는 것으로 나타났다 (Tsaytler et al., Science 2011). 세포 생존능의 정량적 평가는 구아나벤즈가 ∼0.4 μM의 중간 유효 농도에 의해 ER 스트레스를 견뎌내는 세포의 수를 2배로 만드는 것으로 드러났다. α2-아드레날린성 수용체 작용제인 클로니딘(clonidine)뿐만 아니라, α2-아드레날린성 수용체 길항제인 에파록산(efaroxan)도 세포독성 ER 스트레스로부터 세포를 보호하지 못했으며, 에파록산은 구아나벤즈의 보호 효과를 간섭하지 않았다 (Tsaytler et al., Science 2011). 이러한 관찰들은 구아나벤즈가 α2-아드레날린성 수용체와는 독립적인 메카니즘에 의해 치명적인 ER 스트레스로부터 세포들을 구하는 것을 증명한다. 구아나벤즈는 단백질 포스파타제 1, PPP1R15A(GADD34)의 조절 서브유니트에 결합하고, 번역 개시 인자 2 (eIf2α)의 α 서브유니트의 스트레스-유도된 탈포스포릴화를 선택적으로 방해하여 미스폴딩된 단백질들의 다른 치명적인 축적으로부터 세포를 보호한다. 구아나벤즈는 이용 가능한 샤프론(chaperone)에 의해 관리 가능한 수준으로 스트레스를 받은 세포들의 번역율을 설정하고, 이에 의해 단백질 항상성을 회복시킨다. 구아나벤즈는 구성요소인 PPP1R15B (CReP)에 결합하지 않으며, 따라서 스트레스를 받지 않은 세포들의 번역은 억제하지 않는 것으로 보고되었다 (Tsaytler et al., Science 2011).
적당한 언폴딩 단백질 반응 (UPR)을 증가시켜 ER에서 단백질 항상성(proteostasis)을 유지하는 것의 실패는 많은 병리학적 병태에 대한 기여 인자로 인식된다. 따라서, 단백질 합성을 미세-조정하는 eIF2α 포스파타제를 억제하는, 여기에 기재되는 분자들은 단백질 미스폴딩 스트레스 및 특히 미스폴딩된 단백질들의 축적에 의해 야기된 수많은 질병에 대해 치료적 이점일 수 있다.
본 발명은 단백질 미스폴딩 스트레스와, 특히 미스폴딩된 단백질들의 축적과 관련된 질환을 치료하는데 있어 잠재적 치료적 적용을 갖는 구아나벤즈 코어 구조에 기반한 대안의 화합물을 제공하고자 한다.
본 발명의 제1 양상은 단백질질환 및/또는 단백질 미스폴딩 스트레스 및 특히 미스폴딩된 단백질들의 축적과 관련된 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 화학식(I)의 화합물, 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다:
Figure 112016125037009-pct00002
여기서,
R1은 알킬, O-알킬, Cl, F 또는 Br이고;
R2는 H 또는 F이며;
R3은 H 및 알킬로부터 선택되고;
R4는 H 및 C(O)R6으로부터 선택되며;
R5는 H이고;
또는, R4와 R5는 연결되어 R4와 R5에 결합되어 있는 N 원자 외에, N과 같은 헤테로원자를 1개 또는 2개 선택적으로 포함하며, 하나 이상의 R10 기로 선택적으로 치환되는, 5 내지 6원의 포화 또는 불포화 헤테로시클릭기를 형성하며;
R6은 R7, OR7 및 NR8R9로부터 선택되고;
R7, R8 및 R9는 각각 알킬, 시클로알킬, 아르알킬, 시클로알케닐, 헤테로시클릴 및 아릴로부터 독립적으로 선택되며, 이들 각각은 하나 이상의 R10 기로 선택적으로 치환되고;
각각의 R10은 할로겐, OH, =O, CN, COO-알킬, 아르알킬, SO2-알킬, SO2-아릴, COOH, CO-알킬, CO-아릴, NH2, NH-알킬, N(알킬)2, CF3, 알킬 및 알콕시로부터 독립적으로 선택되며;
X 및 Z는 각각 독립적으로 CR11이고, Y는 CR11 및 N으로부터 선택되며;
R11은 H, 알킬 또는 F이다.
본 발명의 제2 양상은 단백질질환 및/또는 단백질 미스폴딩 스트레스 및 특히 미스폴딩된 단백질들의 축적과 관련된 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 화학식(I)의 화합물, 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다:
Figure 112016125037009-pct00003
여기서,
R1은 알킬, O-알킬, Cl, F 또는 Br이고;
R2는 H 또는 F이며;
R3은 H 및 알킬로부터 선택되고;
R4는 H 및 C(O)R6으로부터 선택되며;
R5는 H이고;
또는, R4와 R5는 연결되어 R4와 R5에 결합되어 있는 N 원자 외에, N과 같은 헤테로원자를 1개 또는 2개 선택적으로 포함하며, 하나 이상의 R10 기로 선택적으로 치환되는, 5 내지 6원의 포화 또는 불포화 헤테로시클릭기를 형성하며;
R6은 R7, OR7 및 NR8R9로부터 선택되고;
R7, R8 및 R9는 각각 알킬, 시클로알킬, 아르알킬, 시클로알케닐, 헤테로시클릴 및 아릴로부터 독립적으로 선택되며, 이들 각각은 하나 이상의 R10 기로 선택적으로 치환되고;
각각의 R10은 할로겐, OH, =O, CN, COO-알킬, 아르알킬, SO2-알킬, SO2-아릴, COOH, CO-알킬, CO-아릴, NH2, NH-알킬, N(알킬)2, CF3, 알킬 및 알콕시로부터 독립적으로 선택되며;
X, Y 및 Z는 각각 독립적으로 CR11이고;
R11은 H, 알킬 또는 F이다.
본 발명의 제3 양상은 단백질질환 및/또는 단백질 미스폴딩 스트레스 및 특히 미스폴딩된 단백질들의 축적과 관련된 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 화학식(I)의 화합물, 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다:
Figure 112016125037009-pct00004
여기서,
R1은 Cl이고;
R2는 H이며;
R3은 H 및 알킬로부터 선택되고;
R4는 H 및 C(O)R6으로부터 선택되며;
R5는 H이고;
또는, R4와 R5는 연결되어 R4와 R5에 결합되어 있는 N 원자 외에, N과 같은 헤테로원자를 1개 또는 2개 선택적으로 포함하며, 하나 이상의 R10 기로 선택적으로 치환되는, 5 내지 6원의 포화 또는 불포화 헤테로시클릭기를 형성하며;
R6은 R7, OR7 및 NR8R9로부터 선택되고;
R7, R8 및 R9는 각각 알킬, 시클로알킬, 아르알킬, 시클로알케닐, 헤테로시클릴 및 아릴로부터 독립적으로 선택되며, 이들 각각은 하나 이상의 R10 기로 선택적으로 치환되고;
각각의 R10은 할로겐, OH, =O, CN, COO-알킬, 아르알킬, SO2-알킬, SO2-아릴, COOH, CO-알킬, CO-아릴, NH2, NH-알킬, N(알킬)2, CF3, 알킬 및 알콕시로부터 독립적으로 선택되며;
X, Y 및 Z는 각각 독립적으로 CR11이고;
R11은 H, 알킬 또는 F이다.
본 발명의 제4 양상은 화학식(I)의 화합물, 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다:
Figure 112016125037009-pct00005
여기서,
R1은 알킬, O-알킬, Cl, F 또는 Br이고;
R2는 H 또는 F이며;
R3은 H 및 알킬로부터 선택되고;
R4는 H 및 C(O)R6으로부터 선택되며;
R5는 H이고;
또는, R4와 R5는 연결되어 R4와 R5에 결합되어 있는 N 원자 외에, N과 같은 헤테로원자를 1개 또는 2개 선택적으로 포함하며, 하나 이상의 R10 기로 선택적으로 치환되는, 5 내지 6원의 포화 또는 불포화 헤테로시클릭기를 형성하며;
R6은 R7, OR7 및 NR8R9로부터 선택되고;
R7, R8 및 R9는 각각 알킬, 시클로알킬, 아르알킬, 시클로알케닐, 헤테로시클릴 및 아릴로부터 독립적으로 선택되며, 이들 각각은 하나 이상의 R10 기로 선택적으로 치환되고;
각각의 R10은 할로겐, OH, =O, CN, COO-알킬, 아르알킬, SO2-알킬, SO2-아릴, COOH, CO-알킬, CO-아릴, NH2, NH-알킬, N(알킬)2, CF3, 알킬 및 알콕시로부터 독립적으로 선택되며;
X 및 Z는 각각 독립적으로 CR11이고, Y는 N이며;
R11은 H, 알킬 또는 F이다.
이전의 연구들은 화합물들이 유용한 약리학적 활성을 나타내게 하기 위해서는 아릴기가 적어도 2-치환되어야 한다고 표명하였다 (예를 들어, Tribouillard-Tanvier et al., PLoS One 3, e1981 (2008) 및 EP 1908464A, CNRS 참조). 그러나, 이전의 연구들의 결과와는 반대로, 본 출원인은 놀랍게도 일-치환된 아릴 유도체(mono-substituted aryl derivatives)가 또한 활성이라는 것을 발견하였다.
더욱이, 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물들은 유리하게도, 구아나벤즈와 같은 종래의 화합물들에 비해 아드레날린성 α2A 수용체에 대한 활성이 없거나 낮은 활성을 나타낸다. 알파-2 아드레날린성 활성의 이러한 소실(loss)은 화합물들이 단백질질환 및/또는 미스폴딩 스트레스 및 특히 미스폴딩된 단백질들의 축적과 관련된 질환의 치료에 유용하게 한다. 알파-2 아드레날린성 활성의 부재는 화학식 (I)의 화합물이 혈압에 대해 어떠한 현저한 영향 없이, 전술한 질병들을 치료하는데 적합한 투여량으로 투여될 수 있음을 의미한다.
본 발명의 추가적인 양상은 적합한 약학적으로 허용 가능한 희석제, 부형제 또는 담체와 혼합된, 상기한 바와 같은 화학식 (I)의 화합물을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 하기 도면들을 참고로 하여 추가로 설명된다.
도 1은 튜니카마이신에 6시간 노출시킴으로써 유도되는 ER 스트레스로부터 본 발명의 화합물 1에 의한 Hela 세포의 투여량 의존적 보호(dose dependent protection)를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 화합물 1에 의한 인터페론-감마 손상을 받은 래트 올리고덴드로사이트의 투여량 의존적 보호를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 화합물 2에 의한 로테논(rotenone) 손상을 받은 1차 중뇌 래트 신경세포의 투여량 의존적 보호를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 화합물 2에 의한 아밀로이드-베타 1-42 손상을 받은 1차 피질 래트 신경세포의 투여량 의존적 보호를 나타낸다.
도 5는 상이한 농도와 요법(regimen)에서 화합물 2의, 돌연변이 SOD1 마우스에서 ALS의 운동 장애(motor defects)를 방지할 수 있는 능력을 나타낸다.
IFB-B: 화합물 2가 경구적으로 투여된다.
BID: 일일 2회 투여
QD: 일일 1회 투여
도 6은 상이한 농도와 요법에서 화합물 2의, PMP-22를 과다-발현시키는 형질전환(TG) 래트에서 PMP-22 중 CMT-1A의 운동 장애를 방지할 수 있는 능력을 나타낸다. 화합물 2는 일일 1회 경구 투여된다.
도 7은 5 마이크로M(microM)에서 화합물 1의, 인간 293T 세포에서 T181P 돌연변이된 DM20 단백질의 축적을 방지할 수 있는 능력을 나타낸다.
도 8은 Min6 세포에서 발현된 미스폴드 프론 인슐린 Akita의 축적과 관련있는 세포 사멸을 방지할 수 있는, 화합물 6의 능력을 나타낸다.
도 9는 튜니카마이신에 6시간 노출시킴으로써 유도되는 미스폴딩된 단백질의 축적과 관련있는 Min6 인슐린종 세포 사멸을 방지할 수 있는, 상이한 농도의 화합물 1과 화합물 6의 능력을 나타낸다.
도 10은 튜니카마이신에 6시간 노출시킴으로써 유도되는 미스폴딩된 단백질의 축적과 관련있는 INS1 인슐린종 세포 사멸을 방지할 수 있는, 상이한 농도의 화합물 1과 화합물 6의 능력을 나타낸다.
도 11은 BBS12-/- 마우스에서 세포자멸에 대해 광수용체를 보호할 수 있는 화합물 2의 능력을 나타내며 광 검출을 유지한다. 망막전위도 (Electroretinogram: ERG). 발프로산(VPA) (0.2 mM)과 함께 화합물 2(Cpd 2) (2.5 마이크로M)로 또는 화합물 2 (2.5 마이크로M) 단독으로 처리된 BBS12-/- 눈 대 비히클-처리된 눈 간에 상이한 퍼센트의 표로 만든 평균. 포지티브는 ERG 반응에서의 증가로 해석되고 네가티브는 ERG에서 감소로 해석되는데 PBS 처리된 눈과 비교한다. n = 그룹 당 10 내지 14 마리.
도 12는 BBS12-/- 마우스에서 소포체 중 단백질 부하량을 감소시킬 수 있는 화합물 2의 능력을 나타낸다. 투과 전자현미경(Transmission Electronic Microscopy: TEM). 발프로산(VPA) (0.2 mM)과 함께 화합물 2 (2.5 마이크로M) 또는 PBS를 투여하는 것에 대한 반응으로 BBS12-/- 광수용체의 소포체 (ER). PBS 만 주사할 때 ER 수조(cistema)의 확장(dilatation)(좌측)이 관찰되는 반면 VPA와 함께 화합물 2는 초자체-내로 1회 단일 주사 후 이런 확장을 감소시킬 수 있다 (우측).
도 13은 폴리 I:C로 리포좀 감염시킨(lipofected) 마우스의 배아 섬유아세포에 의한 타입-1 인터페론 생산을 방지할 수 있는, 화합물 1, 6 및 8 (25 마이크로M에서)의 능력을 나타낸다.
도 14는 저산소증-유도된 세포자멸에 대해 신생아 래트의 심장근육세포를 보호할 수 있는 화합물 2의 능력을 나타낸다. 그래프는 FACS 분석으로 측정한 세포자멸성 세포의 퍼센트를 나타낸다. 심장근육세포를 36시간 동안 화합물 2 부재(0 μM) 하에서 또는 표시된 농도의 존재하에서 저산소증 (0.3% O2)에 노출시켰다 (n=3).
여기서 사용된 것과 같이, 용어 "알킬"은 포화된 직쇄 및 측쇄 알킬기를 모두 포함한다. 바람직하게는, 알킬기가 C1-20 알킬기, 더욱 바람직하게는 C1-15, 더욱더 바람직하게는 C1-12 알킬기, 더욱더 바람직하게는 C1-6 알킬기, 더욱 바람직하게는 C1-3 알킬기이다. 특히 바람직한 알킬기로는, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 3급-부틸, 펜틸 및 헥실이 있다.
여기서 사용된 것과 같이, 용어 "시클로알킬"은 시클릭 알킬기를 언급한다. 바람직하게는, 시클로알킬기가 C3-12 시클로알킬기이다.
여기서 사용된 것과 같이, 용어 "알케닐"은 하나 이상의 탄소-탄소 이중결합을 함유하는 기를 언급하는 것으로, 이는 분지되거나 분지되지 않을 수 있다. 바람직하게는, 알케닐기가 C2-20 알케닐기, 더욱 바람직하게는, C2-15 알케닐기, 더욱 더 바람직하게는 C2-12 알케닐기, 또는 바람직하게는 C2-6 알케닐기, 더욱 바람직하게는 C2-3 알케닐기이다. 용어 "시클릭 알케닐"은 그에 따라 해석되어야 한다.
여기서 사용된 것과 같이, 용어 "아릴"은 C6-12 방향족기를 언급한다. 전형적인 예로는 페닐 및 나프틸 등이 있다.
여기서 사용된 것과 같이, 용어 "헤테로사이클" (여기서 "헤테로시클릴" 및 "헤테로시클릭"으로도 언급됨)은 4 내지 12원, 바람직하게는 4 내지 12원의 포화, 불포화 또는 부분적으로 불포화된 시클릭기로 N, O 및 S로부터 선택되는 헤테로원자를 1개 이상 함유하며, 이는 하나 이상의 CO기를 선택적으로 포함한다. 용어 "헤테로사이클"은 하기 정의되는 바와 같은 헤테로아릴기 및 헤테로시클로알킬기를 둘 다 포함한다.
여기서 사용된 것과 같이, 용어 "헤테로아릴"은 4 내지 12원의 방향족을 언급하는 것으로, 이는 하나 이상의 헤테로원자를 포함한다. 바람직하게는, 헤테로아릴기가 N, O 및 S로부터 선택되는 헤테로원자를 하나 이상 포함하는, 4 내지 12원의 방향족기이다. 적합한 헤테로아릴기로는 피롤, 피라졸, 피리미딘, 피라진, 피리딘, 퀴놀린, 티오펜, 1,2,3-트리아졸, 1,2,4-트리아졸, 티아졸, 옥사졸, 이소-티아졸, 이소-옥사졸, 이미다졸, 푸란 등이 있다.
여기서 사용된 것과 같이, 용어 "헤테로시클로알킬"은 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는, 4 내지 12원 시클릭 지방족기를 언급한다. 바람직한 헤테로시클로알킬기로는 피페리디닐, 피롤리디닐, 피페라지닐, 티오모르폴리닐 및 모르폴리닐이 있다. 더욱 바람직하게는, 헤테로시클로알킬기가 N-피페리디닐, N-피롤리디닐, N-피페라지닐, N-티오모르폴리닐 및 N-모르폴리닐로부터 선택된다.
여기서 사용된 것과 같이, 용어 "아르알킬"로는, 비제한적으로, 아릴 및 알킬 작용성을 모두 갖는 기를 포함한다. 일례로서, 상기 용어는 알킬기의 수소 원자 중 하나가 아릴기, 예를 들면, 페닐기로 대체된 기를 포함한다. 전형적인 아르알킬기로는 벤질, 펜에틸 등이 있다.
하나의 바람직한 양태로, R1이 Cl, Br, Me 또는 F, 더욱 바람직하게는 Cl이다.
하나의 바람직한 양태로, R2가 H이다.
하나의 바람직한 양태로, Y가 CR11이다.
다른 바람직한 양태로, Y가 N이다.
하나의 바람직한 양태로, R3 및 R4가 둘 다 H이다.
하나의 바람직한 양태로, R3이 H이고 R4가 C(O)R6이다.
하나의 바람직한 양태로, R6이 알킬 또는 알콕시, 더욱 바람직하게는, Me 또는 OMe이다.
하나의 바람직한 양태로, R4 및 R5가 연결되어, R4 및 R5에 결합되어 있는 N 원자 외에, N과 같은 헤테로원자를 1개 또는 2개 포함하며, 하나 이상의 R10기로 선택적으로 치환되는, 5 내지 6원의 포화 또는 불포화 헤테로시클릭기를 형성한다.
하나의 바람직한 양태로, 상기 화합물이 화학식 (Ia)의 화합물 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염이다:
Figure 112016125037009-pct00006
여기서,
R1, R2, R3 및 R10은 상기 정의된 바와 같다.
하나의 특히 바람직한 양태로, 화학식 (I)의 화합물이 다음 표 1의 화합물 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로부터 선택된다:
화합물 1
Figure 112016125037009-pct00007
화합물 2
Figure 112016125037009-pct00008
화합물 3
Figure 112016125037009-pct00009
화합물 4
Figure 112016125037009-pct00010
화합물 5
Figure 112016125037009-pct00011
화합물 6
Figure 112016125037009-pct00012
화합물 7
Figure 112016125037009-pct00013
화합물 8
Figure 112016125037009-pct00014
화합물 9
Figure 112016125037009-pct00015
화합물 10
Figure 112016125037009-pct00016
화합물 11
Figure 112016125037009-pct00017
제1의 바람직한 양태로, 화학식 (I)의 화합물이 상기 게시된 바와 같은 화합물 1, 즉, 1-[[(2-클로로페닐)메틸리덴]아미노]-구아니딘 및 화합물 2, 즉, 1-[[(2-클로로페닐)메틸리덴]아미노]-구아니딘 아세테이트로부터 선택된다.
제2의 바람직한 양태로, 화학식 (I)의 화합물이 상기 게시된 바와 같은 화합물 8로부터 선택된다.
제3의 바람직한 양태로, 화학식 (I)의 화합물이 상기 게시된 바와 같은 화합물 6 및 화합물 7로부터 선택된다.
치료적 적용(THERAPEUTIC APPLICATIONS)
화학식 (I)의 화합물들은 단백질질환 및/또는 미스폴딩되고/되거나 폴딩되지 않은 단백질의 축적과 관련한 질환을 치료하는데 있어서 잠재적인 치료적 적용을 갖는다. 특히, 화학식 (I)의 화합물은 세포독성 소포체(ER) 스트레스 및 노화 관련 질환들에 대한 보호 효과를 갖는다.
본 발명의 다른 양상은 단백질 미스폴딩 스트레스 및 특히 미스폴딩된 단백질의 축적과 관련한 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양상은 미스폴딩되고/되거나 폴딩되지 않은 단백질의 축적이 작용 방식에 관련되는 질병 (Brown et al, 2012, Frontiers in Physiology, 3, Article 263)을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양상은 단백질질환을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물의 용도에 관한 것이다. 상기 단백질질환은 특정 단백질이 구조적으로 비정상이 되고, 이에 의해 신체의 세포, 조직 및 기관의 기능이 방해되는 질병의 부류를 언급한다. 흔히, 단백질이 이들의 정상적인 구조로 폴딩되는데 실패하게되고, 이런 미스폴딩되고/되거나 폴딩되지 않은 상태의 단백질은 일부 방식에서 독성이 되거나 (독성 기능의 획득) 이들이 이들의 정상적인 기능을 소실할 수 있거나 이들이 감소된 생물학적 활성을 가질 수 있다. 단백질질환(proteinopathy), 단백질 구조 질환, 또는 단백질 미스폴딩 질환으로도 알려져 있는, 이런 단백질질환에는 알츠하이머병, 파킨슨병, 프리온 질환(prion disease), 제2형 당뇨병, 아밀로이드증(amyloidosis), 및 광범위한 기타 질환 (하기 비제한 예를 참조)과 같은 많은 질환이 포함된다.
여기서 사용되는 바와 같은 용어 "단백질질환(proteinopathy), 단백질질환(proteopathy), 단백질 구조 질환, 단백질 미스폴딩 질환, 단백질 미스폴딩 스트레스와 관련된 질환, 미스폴딩된 단백질의 축적과 관련된 질환, 세포독성 ER 스트레스와 관련된 질환, UPR 관련된 질환는 동일한 의미를 가지며 특정 단백질이 구조적으로 비정상이 되고 이에 의해 세포의 항상성이 방해받게 되는 질환을 언급한다.
여기서 사용되는 바와 같이 용어 "미스폴딩된 단백질" 및 "폴딩되지 않은 단백질"은 동일한 의미를 가지며 단백질이 이들의 정상적인 구조로 폴딩되는데 실패한 단백질을 언급한다.
여기서 사용되는 바와 같이 문구 "약제의 제조"는 추가 활성제들에 대한 스크리닝 프로그램(screening program)에서 또는 그와 같은 약제의 제조의 임의의 단계에서 이의 사용 이외에 약제로서 직접적으로 상기한 화합물들 중 하나 이상의 사용을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양상은 단백질 질환 및/또는 단백질 미스폴딩 스트레스 및/또는 세포독성 ER 스트레스 및 특히 미스폴딩된 단백질의 축적관 관련된 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서 이러한 질환을 치료하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물을 치료상 유효한 양으로 투여함을 특징으로 한다.
용어 "방법(method)"은 화학, 약리학, 생물학, 생화학 및 의학 분야의 전문가에 의해 알려진 방식들, 수단, 기술들 및 절차들로부터 알려져 있거나 용이하게 개발된 이들 방식, 수단, 기술들 및 절차들을 포함하지만 그들에 한정되지 않는, 주어진 임무를 수행하기 위한 방식, 수단, 기술들 및 절차를 언급한다.
여기에서, 용어 "치료(treating)"는 질병 또는 질환의 진행을 철폐하는 것, 실질적으로 억제하는 것, 느리게 하는 또는 역전시키는 것, 실질적으로 질병 또는 질환의 임상 징후들을 개선하는 것 또는 실질적으로 질병 또는 질환의 임상 징후들의 출현을 방지하는 것을 포함한다.
여기서 사용되는 바와 같이 용어 "질병", "질환", "병태"는 동일한 의미를 갖는다. 상기 질병은 ER 스트레스 반응 활성과 관련 있고/있거나 단백질 미스폴딩 스트레스 및 특히 미스폴딩된 단백질의 축적과 관련 있다.
용어 "치료상 유효한 양"은 치료되고 있는 질병 또는 질환의 징후들 중 하나 이상을 어느 정도까지 완화할, 투여되된 화합물의 양을 언급한다.
다른 양태로, 본 발명은 UPR 질환을 치료하는데 사용하기 위한 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물에 관한 것이다. 폴딩되지 않은 단백질 반응 (unfolded protein response: UPR)은 소포체(ER)에서의 폴딩을 변경 조건에 맞춘 미스폴딩된 단백질에 대한 세포의 방어 체계의 구성요소이다. UPR은 소포체의 내강에서 폴딩되지 않거나 미스폴딩된 단백질의 축적에 반응하여 활성화된다. 이러한 시나리오에서, UPR은 2개의 주요 목표: (i) 단백질 번역을 정지시켜 세포의 정상적인 기능을 회복시키는 것; 및 (ii) 단백질 폴딩과 관련된 분자 샤프론의 증가된 생성으로 이어지는 시그널화 경로를 활성화시키는 것을 갖는다. 만약 이러한 목적들이 특정 시간 프레임 내에서 달성되지 않거나, 분열(disruption)이 연장되면, UPR은 세포자멸을 목표로 하게 된다. UPR의 업스트림 성분(upstream component)은 협력 방식으로 전사 및 번역을 재프로그램하고 단백질항상성(proteostasis)을 복원하기 위하여 폴딩 결함들을 감지하는, ER-상주 경막 단백질들 IRE1, ATF6 및 PERK이다. 활성화된 IRE1 및 ATF6은 샤프론 BiP 및 GRP94를 코딩하는 것들과 같은, ER 폴딩에 관련된 유전자의 전사를 증가시킨다. 활성화된 PERK는 전사 인자 ATF4의 번역을 촉진하면서 Ser51 상의 번역 개시 인자 2(eIf2α)의 서브유니트를 포스포릴화하여 전체 단백질 합성을 약화시킨다. 후자는 또한 다른 전사 인자인 CHOP의 발현을 조절하는데, 이는 또한 PPP1R15A/GADD34의 발현을 촉진한다. UPR 시그널화를 종료하는 네가티브 피드백 루프(negative feedpack loop)의 작동체(effector)인 PPP1R15A는 eIf2α를 탈포스포릴화시키기 위하여 단백질 포스파타제 1의 촉매적 서브유니트 (PP1c)를 모집하여, 단백질 합성을 재개시킨다. UPR 실패는 이러한 적응 반응의 적절한 증대(boost)에 의해 보정될 수 있는 많은 병리학적 병태에 기여한다. 스트레스를 받아 유도된 eIf2α 포스파타제 PPP1R15A-PP1의 선택적 억제제는 eIf2α 탈포스포릴화를 지연시키고 결과적으로 스트레스를 받지 않은 세포에서는 단백질 합성에 영향을 주지 않으면서, 스트레스를 받은 세포에서는 단백질 합성을 선택적으로 지연시킨다. 이는 UPR의 유리한 효과를 연장시킨다. 단백질 합성의 일시적 감소는 스트레스를 받은 세포에 유리할 수 있는데 이는 합성된 단백질의 플럭스(flux)가 감소되며 샤프론의 이용가능성이 증가하고 따라서 미스폴딩 스트레스로부터 보호하기 때문이다 (Tsaytler et al., Science 2011). eIf2α 포스파타제의 비-선택적 억제제는 원치 않는 효과를 가질 수 있는데, 이는 영구적인 번역 억제가 해로울 수 있기 때문이다. 실제로, PPP1R15A 와 PPP1R15B 둘 다의 유전적 결실(genetic ablation)은 2개의 eIf2α 포스파타제 PPP1R15A-PP1 와 PPP1R15B-PP1의 억제가 유기체 배경에서 해롭다는 것을 나타내는 쥐의 초기 배아 치사율 (early embryonic lethality)을 발생하게 한다. 그와는 대조적으로, PPP1R15A의 유전적 결실은 쥐에서 유해한 결과가 없다 (Harding et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA, 106, 1832-1837). 게다가, PPP1R15A의 특이적인 억제제들이 스트레스를 받지 않은 세포에서 비활성일 것으로 예상되는데, 이는 PPP1R15A가 스트레스가 없을 때에는 발현되지 않기 때문이다. 따라서, 선택적인 PPP1R15A 억제제는 안전할 것으로 예상된다. 상기 2개의 eIf2α 포스파타제의 비-선택적 억제제들이 또한, 상기 포스파타제를 부분적으로만 억제하는 투여량으로 사용 시, 단백질 미스폴딩 질환을 치료하는데 유용할 수 있다.
ER 스트레스에 대한 세포보호작용(cytoprotection)은 절합한 분석법으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 세포보호작용은 ER 스트레스가 튜니카마이신, 효소의 UDP-HexNAc: 폴리프레놀-P HexNAc-1-P 족을 억제하고 폴딩되지 않은 단백질 반응을 유도하는데 사용되는 상동의 뉴클레오시드 항생제들의 혼합물을 함유하는 매질의 첨가에 의해 도출되는 HeLa 세포에서 측정될 수 있다. 세포 생존능은 표준 세포 생존능 키트 (예를 들면, Dojindo로부터의 Cell Viability Counting Kit-8)를 이용하여 포르마잔으로의 WST-8의 감소를 측정함으로써 설정된 시간 기간 후 억제제 화합물들의 존재 및 부재에서 검출될 수 있다. 당해 분야에서의 숙련가는 MTT, MTS, XTT와 같은 다른 부류의 테트라졸륨 화합물을 사용할 수 있다. ER 스트레스로부터의 세포보호작용은 ER 스트레스 후 생존 세포들의 퍼센트 증가 (대조군에 비해) 면에서 측정된다. 루미노게닉(luminogenic) ATP 분석법과 같은 대안적인 세포 생존능 분석법이 사용될 수 있다. 적합한 분석법의 추가적인 세부사항은 첨부되는 실시예 섹션에서 설명된다.
하나의 바람직한 양태로, 화학식 (I)의 화합물이 대조군 (즉, 억제제 화합물의 부재하)에 비해서 UPR의 보호 효과를 적어도 10%, 적어도 20%, 더욱 바람직하게는, 적어도 30%, 더욱더 바람직하게는, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 또한, 적어도 90%까지 연장시킬 수 있다.
화학식 (I)의 화합물은 보호 효과를 유도하는 PPP1R15A-PP1 상호작용의 억제제이다. 바람직하게는, 상기 화합물이 약 10 μM 미만, 더욱더 바람직하게는, 약 5 μM 미만, 더욱 바람직하게는 또한, 약 1 μM 미만의 EC50으로 보호 효과를 나타낸다. 상기 화합물은 바람직하게는 알파2 아드레날린성 활성이 없어야 한다. 따라서, 하나의 바람직한 양태로, 상기 화합물이 작용성 알파-2-아드레날린성 분석법에서 어떠한 활성도 나타내지 않는다.
화학식 (I)의 특정 화합물은 PPP1R15A-PP1을 선택적으로 억제하며, 따라서 UPR의 보호 효과를 연장시키고, 이에 따라 단백질 미스폴딩 스트레스로부터 세포를 구한다. 그러므로, 본 발명에 기재된 PPP1R15A-PP1의 억제제는 단백질 미스폴딩 스트레스 및 특히 미스폴딩된 단백질 축적과 관련된 다양한 질환 및/또는 단백질질환을 치료하는데 있어서 치료적 적용을 갖는다.
하나의 양태로, 화학식 (I)의 화합물이 PPP1R15A와 PPP1R15B를 억제할 수 있다. 더욱 바람직한 양태로, 화학식 (I)의 화합물이 PPP1R15B보다 PPP1R15A를 선택적으로 억제할 수 있다.
하나의 양태로, 본 발명은 미스폴딩된 단백질의 축적이 작용 방식에 관련되는 eIF2α 포스포릴화 경로와 관련한 질병을 치료하는데 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물에 관한 것이다. 그러한 질병의 예로는 단백질 미스폴딩 질환 및/또는 단백질질환이 있다.
다른 양태로, 본 발명은 eIF2α 포스포릴화 및/또는 PPP1R15A 활성에 의해 야기되고, 이와 관련 있거나 이를 수반하는 질환 (여기서 미스폴딩된 단백질의 축적이 작용 방식에 관여한다)을 치료하는데 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물에 관한 것이다.
여기서 사용되는 바와 같이, "PPP1R15A 관련 질병 또는 질환"은 미스폴딩된 단백질의 축적이 작용 방식에 관련되는, 비정상적인 PPP1R15A 활성으로 특징되는 질병 또는 질환을 언급한다. 비정상적인 활성이란 (i) PPP1R15A를 정상적으로 발현시키지 않는 세포에서의 PPP1R15A 발현; (ii) 증가된 PPP1R15A 발현; 또는 (iii) 증가된 PPP1R15A 활성을 언급한다.
다른 양태로, 본 발명은 미스폴딩된 단백질의 축적이 작용 방식에 관련되는, PP1R15A의 억제에 의해 완화되는 질병 상태를 갖는 포유동물을 치료하는 방법에 관한 것으로, 여기서 이 방법은 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물을 치료상 유효한 양으로 포유동물에게 투여함을 특징으로 한다.
다른 양태로, 본 발명은 단백질 미스폴딩 스트레스 및 특히 미스폴딩된 단백질의 축적과 관련한 질환 및/또는 UPR 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것으로, 여기서 상기 화합물은 구아나벤즈와 비교할 때 아드레날린성 알파 2 작용제 활성이 없거나 감소된 활성을 갖는다.
다른 양태로, 본 발명은 단백질 미스폴딩 스트레스 및 특히 미스폴딩된 단백질의 축적과 관련한 질환 및/또는 UPR 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것으로, 여기서 상기 화합물은 PPP1R15B를 발현하는, 스트레스를 받지 않은 세포에서 단백질 번역을 억제하지 않는다.
다른 양태로, 본 발명은 미스폴딩된 단백질의 축적과 함께 ER 스트레스 반응 활성으로 특징되는 질병을 치료하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 적어도 하나의 화학식 (I)의 화합물을 치료상 유효한 양으로 환자에게 투여함을 특징으로 하며 여기서 상기 화합물은 ER 스트레스 반응을 조절한다.
다른 양태로, 본 발명은 단백질질환 및/또는 단백질 미스폴딩 스트레스 및 특히 미스폴딩된 단백질의 축적과 관련한 질환 및/또는 UPR 질환을 치료하는데 사용하기 위한 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것으로, 여기서 상기 화합물은 PPP1R15A-PP1 홀로포스파타제에 대해 없거나 감소된 활성을 갖는, PPP1R15A-PP1 홀로포스파타제에 대한 선택성을 가지며, 여기서 상기 화합물에 대한 비율 (PPP1R15A-PP1 홀로포스파타제에 대한 활성/PPP1R15B-PP1에 대한 활성)이 구아나벤즈에 대한 비율 (PPP1R15A-PP1 홀로포스파타제에 대한 활성/PPP1R15B-PP1에 대한 활성)과 적어도 대등하거나 높다.
다른 양태로, 본 발명은 단백질 미스폴딩 스트레스 및 특히 미스폴딩된 단백질의 축적과 관련 있는 질환 및/또는 UPR 질환을 치료하는데 사용하기 위한 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것으로:
- 여기서, 상기 화합물은 PPP1R15A-PP1 홀로포스파타제에 대한 활성은 갖지만 PPP1R15B-PP1 홀로포스파타제에 대한 활성이 없거나 감소된 활성을 가지며;
- 여기서, 상기 화합물에 대한 비율 (PPP1R15A-PP1 홀로포스파타제에 대한 활성/PPP1R15B-PP1에 대한 활성)이 구아나벤즈에 대한 비율 (PPP1R15A-PP1 홀로포스파타제에 대한 활성/PPP1R15B-PP1에 대한 활성)과 적어도 대등하거나 높고;
- 여기서, 상기 화합물은 구아나벤즈와 비교할 때 아드레날린성 알파 2 작용제 활성이 없거나 감소된 활성을 갖는다.
본 발명에 따르는 질병 또는 질환은:
(i) ER 스트레스 반응 활성과 관련있고/있거나;
(ii) 단백질 미스폴딩 스트레스 및 특히 미스폴딩되고/되거나 폴딩되지 않은 단백질의 축적과 관련있고/있거나;
(iii) UPR 질환; 및/또는
(iv) PPP1R15A 관련 질병; 및/또는
(v) 단백질질환이다.
본 발명에 따르는 질병의 비제한적인 예로는 하기와 같은 것들이 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다:
신경퇴행성 질환( neurogenerative disease), 예로서 타우병증(tauopathy) (그중에서 예를 들면, 알쯔하이머병), 퇴행성신경질환(synucleinopathy) (그중에서 예를 들면, 파킨슨병), 헌팅톤병 및 관련한 폴리글루타민병, 폴리알라닌병 (예를 들면, 눈-인두 근이영양증), 프리온 질환 (전염성 해면모양 뇌병증으로도 불리워짐), 사르코 마리 투스병(Charcot-Marie Tooth disease)(유전성 운동 감각 신경병증으로도 불리워짐)과 같은 탈수소성 질환, 백질이영양증(leukodystrophy), 근위축성 측색 경화증(amyotrophic lateral sclerosis: ALS; 운동 신경 질환 및 루게릭병으로도 언급됨), 세이피노병증(seipinopathy) 및 다발성 경화증.
타우병증의 예로는, 비제한적으로, 알쯔하이머병, 진행성 핵상 마비(supranuclear palsy), 피질기저부 퇴행(corticobasal degeneration), 전두측두 엽성 퇴행(frontotemporal lobar degeneration) 또는 전두측두 치매( frontotemporal dementia: FTD) (피크병: Pick's disease)가 있다. FTD는 주로 전두 및/또는 측두엽이 관여하는 진행형 신경세포 상실로 특징되는 신경퇴행성 질환이며; 유병률에 있어서 알쯔하이머병(AD) 다음으로, FTD는 어린 시기에 개시된 치매의 20%에 달한다. 타우병증에서 UPR의 관련성은 잘 정리되어 있다 (참조: Stoveken 2013, The Journal of Neuroscience 33(36):14285-14287). 이론에 얽매이지 않고, PPP1R15A 억제제인 본 발명의 화합물이 타우병증의 질병 징후를 개선할 수 있을 것으로 예상된다. 바람직한 양태에 따라서, 본 발명은 알쯔하이머병의 치료에 사용하기 위한, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다. 다른 바람직한 양태에 따라서, 본 발명은 전두측두 치매 (FTD), 핵상 마비 및 피질기저부 퇴행 중에서 선택된 질병, 바람직하게는 FTD를 치료하는데 사용하기 위한, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
퇴행성신경질환의 예로는, 비제한적으로, 파킨슨병, 루이소체(Lewy body)를 갖는 치매, 순수한 자율신경실조증, 및 다계통 위축증이 있다. 최근에, Colla 등 (J. of Neuroscience 2012 Vol. 32 N°10 pp3306-3320)은 eIf2α의 PPP1R15A 매개된 탈포스포릴화(Boyce et al. 2005 Science Vol. 307 pp935-939)를 억제함으로써 eIf2 알파의 포스포릴화를 증가시키는 작은 분자인 살루브리날(Salubrinal)이 알파-퇴행성신경질환의 2개의 동물 모델에서 질병 징후를 크게 약화시킴을 증명하였다. 이론에 얽매이지 않고도, PPP1R15A 억제제인 본 발명의 화합물이 알파-신경퇴행성질환의 질병 징후를 개선할 수 있을 것으로 예상된다. 바람직한 양태에 따라서, 본 발명은 알파-신경퇴행성 질환의 치료에 사용하기 위한, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다. 바람직한 양태에 따라서, 본 발명은 파킨슨병의 치료에 사용하기 위한, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
폴리글루타민병의 예로는, 비제한적으로, 척수연수 근육 위축 (또는 케네디병(Kennedy disease)), 헌팅톤병(Huntington disease), 치상핵적핵담창구시상하핵 위축증(Dentatorubral-pallidoluysian atrophy), 척수소뇌성 실조증(Spinocerebellar ataxia) 타입 1, 척수소뇌성 실조증 타입 2, 척수소뇌성 실조증 타입 3 (또는 마차도-죠셉병(Machado-Joseph disease)), 척수소뇌성 실조증 타입 6, 척수소뇌성 실조증 타입 7 및 척수소뇌성 실조증 타입 17이 있다. 구아노벤즈는 세포-기반 분석법에서 돌연변이 헌팅틴(mutant Huntingtin)의 축적을 약화시킬 수 있다 (WO2008/041133). 이 발견은 돌연변이 헌팅틴이 세포용해성이거나 핵이기 때문에 예측되지 않는다. 그러나, 돌연변이 헌팅틴 대사작용이 먼저 ER 스트레스 반응과 연결된다는 증거가 있다 (Nishitoh et al., 2002, Genes Dev, 16, 1345-55; Rousseau et al., 2004, Proc Natl Acad Sci U S A, 101, 9648-53; Duennwald and Lindquist, 2008, Genes Dev, 22, 3308-19). 구아나벤즈가 세포독성 ER 스트레스로부터 세포를 보호하고 돌연변이 헌팅틴 축적을 감소시킨다는 발견은 돌연변이 헌팅틴 축적에 영향을 주는 ER 스트레스 반응의 양상일 수 있다는 생각을 추가로 뒷받침해 준다. 그러나, 구아나벤즈는 이의 혈압강하 활성 때문에 인간의 단백질 미스폴딩 질병의 치료에 유용하지 못하다. 대조적으로, 본 발명의 알파2 아드레날린성 활성이 없는 구아나벤즈 유도체인 PPP1R15A 억제제는 폴리글루타민병, 더욱 구체적으로는 헌팅톤병, 척수연수 근육 위축 (또는 케네디병), 치상핵적핵담창구시상하핵 위축증, 척수소뇌성 실조증 타입 1, 척수소뇌성 실조증 타입 2, 척수소뇌성 실조증 타입 3 (또는 마차도-죠셉병), 척수소뇌성 실조증 타입 6, 척수소뇌성 실조증 타입 7 및 척수소뇌성 실조증 타입 17의 그룹에서 선택되는 병을 치료하는데 유용할 수 있다. 바람직한 양태에 따라서, 본 발명은 폴리글루타민병을 치료하는데 사용하기 위한, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다. 바람직한 양태에 따라서, 본 발명은 헌팅톤병을 치료하는데 사용하기 위한, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
폴리알라닌병의 예로는 폴리(A) 결합 단백질 핵 1 (PABPN1)에서 폴리-알라닌 트랙에 의해 발생하는 눈-인두 근이영양증이 있다. Barbezier 등 (2011, EMBO Vol. 3 pp35-49)은 구아나벤즈가 눈인두 근위축증에서 응집(aggregation)을 감소시킨다는 것을 증명하였다. 바람직한 양태에 따라서, 본 발명은 폴리알라닌병을 치료하는데 사용하기 위한, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다. 바람직한 양태에 따라서, 본 발명은 눈인두 근위축증을 치료하는데 사용하기 위한, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
인간의 프리온 질환의 예로는, 비제한적으로, 전형적인 크로이츠펠트-야콥병(classic Creutzfeldt-Jakob disease), 새로운 변형 크로이츠펠트-야곱병 (nvCJD, 광우병과 관련된 인간 질환), 게르스트만-슈트로이슬러-샤인커병(Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome), 치명적 가족성 불면증(fatal familial insomnia) 및 쿠루병(kuru)이 있다. 구아나벤즈는 프리온 감염된 마우스의 증상을 감소시킨다 (D. Tribouillard-Tanvier et al., 2008 PLoS One 3, e1981). 그러나, 구아나벤즈는 이의 혈압강하 활성으로 인하여 인간 단백질 미스폴딩 질환의 치료에 유용하지 않다. 대조적으로, 본 발명의 알파2 아드레날린성 활성이 없는 구아나벤즈 유도체인 PPP1R15A 억제제는 프리온 질환을 치료하는데 유용할 수 있다. 바람직한 양태에 따라서, 본 발명은 크로이츠펠트-야콥병, 새로운 변형 크로이츠펠트-야곱병, 게르스트만-슈트로이슬러-샤인커병, 치명적 가족성 불면증 및 쿠루병의 그룹에서 선택된 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
탈수초성 질환(demyelination disorder)은 중추 신경계에서 올리고덴드로사이트(oligodendrocyte) 또는 말초 신경계에서 슈완 세포(Schwann cell)의 상실로 특징된다. 탈수초성 질환과 관련한 현상은 중추 신경계 또는 말초 신경계에서 유수축색(myelinated axon)의 감소로 특징된다. 수초화 세포 (올리고덴드로사이트 및 슈완 세포를 포함함)의 미스폴딩된 단백질의 비-제한적 예는 CC1, 수초 염기성 단백질 (MBP), 세라마이드 갈락토실트랜스퍼라제 (CGT), 수초 관련 당단백질 (MAG), 수초 올리고덴드로사이트 당단백질 (MOG), 올리고덴드로사이트-수초 당단백질 (OMG), 시클릭 뉴클레오티드 포스포디에스테라제 (CNP), 수초 단백질 제로 (MPZ), 말초 수초 단백질 22 (PMP22), 코넥신(Connexin) 32 (Cx32), 단백질 2 (P2), 갈락토세레브로사이드 (GalC), 술파타이드 및 단백지질 단백질 (PLP)의 군으로부터 선택된다. 슈완 세포의 경우 MPZ, PMP22, Cx32 및 P2가 바람직한 미스폴딩된 단백질이다. 올리고덴드로사이트의 경우 PLP, MBP, MAG가 바람직한 미스폴딩된 단백질이다.
특정 양태로, 탈수초성 질환이 사르코 마리 투스 (CMT) 질병으로 이루어진 군으로부터 선택된다. CMT는 만성 운동감각 다발성 신경병증으로 특징되는 유전성 신경병증 질환의 그룹을 언급한다. CMT1, CMT2, CMT4, CMTX 및 데제린-소타스병(Dejerine-Sottas disease)과 같은 다른 타입의 CMT가 확인되었다. CMT 서브타입은 주로 분자 유전적 발견을 기본으로 추가로 분류될 수 있다. 예를 들어, CMT1은 CMT1A, 1B, 1C, 1D, 1E, 1F/2E로 더 분류된다. 유전자 암호화 수초 단백질 제로 (P0)에서 100개의 돌연변이에 걸쳐, 슈완 세포를 수초화시켜 생산된 주요 단백질인 단일-통과 경막 단백질이 사르코 마리 투스 신경병증을 일으킨다 (D'Antonio et al., 2009, J Neurosci Res, 87, 3241-9). 돌연변이는 우세하게 유전되고 독성 기능 획득을 통하여 질병을 일으킨다 (D'Antonio et al., 2009, J Neurosci Res, 87, 3241-9). P0으로부터 세린 63의 결실 (P0S63del)은 인간에서 사르코-마리-투스 1B 신경병증 및 형질전환 마우스에서 유사한 탈수초성 신경병증을 일으킨다. 상기 돌연변이 단백질은 ER에서 축적되어 UPR을 유도한다 (D'Antonio et al., 2009, J Neurosci Res, 87, 3241-9). CHOP의 유전자 결실, UPR에서 전-세포사멸(pro-apoptotic) 유전자는 사르코 마리 투스 마우스에서 운동 기능을 복원시킨다 (Pennuto et al., 2008, Neuron, 57, 393-405). 세포에서 PPP1R15A 억제는 ER-스트레스를 받은 세포에서 CHOP 발현을 거의 파괴한다는 발견은 PPP1R15A의 유전자 또는 약리학적 억제가 사르코 마리 투스 마우스에서 운동 기능장애를 감소시켜야 한다는 것을 나타낸다. 최근에, D'Antonio 등 (2013 J.Exp. Med Vol. pp1-18)은 살루브리날로 치료한 P0S63del 마우스가 로타로드 분석에서 거의 정상적인 운동 능력을 되찾고 형태학적 및 전기생리학적 기형들의 회복(rescue)이 수반된다는 것을 증명하였다. ER 단백질에서 CMT-관련 돌연변이체의 축적은 P0S63del에 대해 독특한 것이 아니며; ER에서 유지되고 UPR을 끌어내는 적어도 5개의 다른 P0 돌연변이체가 식별되었다 (Pennuto et al., 2008 Neuron Vol.57 pp393-405; Saporta et al., 2012 Brain Vol.135 pp2032-2047). 또한, 단백질 미스폴딩과 ER에서의 미스폴딩된 단백질의 축적은 PMP22 및 Cx32에서의 돌연변이의 결과로서 다른 CMT 신경병증의 발병에 연루되어 있다 (Colby et al., 2000 Neurobiol.Disease Vol. 7 pp561-573; Kleopa et al., 2002 J. Neurosci. Res. Vol.68 pp522-534; Yum et al., 2002 Neurobiol. Dis. Vol. 11 pp43-52). 그러나, 살루브리날(Salubrinal)은 독성이 있고 인간 환자를 치료하는데 사용할 수 없다 (D'Antonio et al. 2013 J.Exp. Med Vol. pp1-18). 그에 반해, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제는 안전할 것으로 예상되며 CMT들, 바람직하게는 CMT-1A 및 1B의 치료에 있어서 유용할 수 있다. 바람직한 양태에 따라서, 본 발명은 CMT, 더욱 바람직하게는 CMT-1A 및 데자린-소타스병을 치료하는데 사용하기 위한, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다. 바람직한 양태에 따라서, 본 발명은 ER에서 미스폴딩된 단백질의 축적관 관련된 CMT를 치료하는데 사용하기 위한, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다. 바람직한 양태에 따라서, 본 발명은 CMT-1A를 치료하는데 사용하기 위한, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다. 바람직한 양태에 따라서, 본 발명은 CMT-1B를 치료하는데 사용하기 위한, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다. 바람직한 양태에 따라서, 본 발명은 CMT-1E를 치료하는데 사용하기 위한, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
다른 양태에 따라서, 화학식 (I)의 화합물을 D-솔비톨(Sorbitol), 바클로펜(baclofen), 필로카르핀(pilocarpine), 날트렉손(naltrexone), 메티마졸(methimazole), 미페프리스톤(mifepristone), 케토프로펜(ketoprofene) 및 이들의 염의 그룹에서 선택된 적어도 하나의 화합물과 함께, CMT를 치료하는데 사용, 더욱 바람직하게는 CMT-1을 치료하는데 사용하기 위함이다. 다른 양태에 따라서, 본 발명은 D-솔비톨, 바클로펜, 필로카르핀, 날트렉손, 메티마졸, 미페프리스톤, 케토프로펜 및 이들의 염의 그룹에서 선택된 적어도 하나의 화합물과 함께, CMT, 바람직하게는 CMT-1을 치료하는데 사용하기 위한 구아나벤즈 또는 살루브리날 (즉, PPP1R15A 억제제) 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다. 상기 화합물들은 그룹으로 또는 별도 투여, 동시에 또는 차례로 투여하기 위하여 조합한다.
본 발명은 신경퇴행성 질환, 바람직하게는 CMT, 더욱 바람직하게는 CMT-1의 치료에 사용하기 위한, 화학식 (I)의 화합물, 구아나벤즈 및 살루브리날 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염들의 그룹에서 선택된 PPP1R15A 억제제, 및 적어도 하나의 시판되는 화합물 및 이들의 염을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물 중 화합물의 용량은 장기간 유지 치료용으로 통상적으로 처방되거나 임상 3상 시험에서 안전한 것으로 증명된 투여량을 넘지 않는 투여량 범위 내에 있어야 하며; 조합물 중 화합물의 더욱 바람직한 용량은 장기간 유지 치료용으로 통상적으로 처방되는 것들의 1%에서 10% 이하에 해당하는 양에 상응하여야 한다.
따라서, 본 발명은 CMT, 바람직하게는 CMT-1, 더욱 바람직하게는 CMT-1A의 치료에 사용하기 위한, 화학식 (I)의 화합물, 구아나벤즈 및 살루브리날 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염들의 그룹에서 선택된 PPP1R15A 억제제, 및 D-솔비톨, 바클로펜, 필로카르핀, 날트렉손, 메티마졸, 미페프리스톤, 케토프로펜 및 이들의 염의 그룹에서 선택된, PMP22 단백질의 발현을 증가시키는 화합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
다른 양태로, 탈수초성 질환이 백질이영양증(leukodystrophy)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 백질이영양증의 예로는, 비제한적으로, 그 중에서도, 부신백질이영양증(adrenoleukodystrophy: ALD), 알렉산더병(Alexander disease), 카나반병(Canavan disease), 크라베병(Krabbe disease), 이염백질이영양증(Metachromatic Leukodystrophy: MLD), 펠리재우스-메르쯔바커병(Pelizaeus-Merzbacher disease: PMD), 아동기 저수초형성 운동실조(childhood ataxia with central nervous system hypomyelination; 배니싱 백질 질환으로도 알려져 있음), CAMFAK 증후군, Refsum 질병, Cockayne 증후군, 베르 데르 크납 증후군(Ver der Knapp Syndrome), 젤웨거 증후군(Zellweger Syndrome), 귈라인-바레 증후군(Guillain-Barre Syndrome: GBS), 만성 염증성 탈수초화 다발성신경병증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy: CIDP), 다초점성 운동신경병증(multifocal motor neuropathy: MMN) 및 진행성 핵상 마비(progressive supernuclear palsy), 진행성 다초점성 백질뇌병증(progressive Multifocal Leuko-encephalopathy: PML), 뇌척수염(Encephalomyelitis), 중추뇌교수초용해증(Central Pontine Myelolysis: CPM), 항-MAG병(Anti-MAG Disease)이 있다. Gow 등 (Neuron, 2002 Vol. 36, 585-596)은 폴딩되지 않은 단백질 반응이 PMD에서 활성화되고, 이 경로가 PLP1 유전자의 중복화(duplication)임을 보여준다는 것을 증명하였다.
바람직한 양태에 따라서, 본 발명은 백질이영양증, 바람직하게는 펠리재우스-메르쯔바커병(PMD)을 치료하는데 사용하기 위한, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
근위축성 측색 경화증(ALS)은 운동 신경 질환 및 루게릭병(Lou Gehrig's disease)으로 언급된다. 이제는 단백질 미스폴딩이 가족성 및 산발성 ALS에서 중심 역할을 한다는 것이 잘 인지되어 있다 (Matus et al. 2013 Int. J. Cell Biol. ID674751 http://dx.doi.org/10.1155/2013/674751). Saxena 등 (Nature Neuroscience 2009 Vol. 12 pp627-636)은 살루브리날이 운동 신경 질환의 G93A-SOD1 형질전환 마우스 모델의 수명을 연장한다는 것을 증명하였다. 더욱 최근에는, Jiang 등 (Neuroscience 2014)이 구아나벤즈가 ALS의 SOD1 G93A 마우스 모델에서 질병 증상의 개시를 지연시키고, 수명을 연장시키며, 운동 성능을 향상시키고 운동 신경 상실을 약화시킨다는 것을 증명하였다. Das 등 (2015 Science 388, 239-242)은 구아나벤즈 유도체가 돌연변이 G93A SOD1 마우스에서 ALS의 운동, 형태학적 및 분자 결함을 방지한다는 것을 증명하였다. 바람직한 양태에 따라서, 본 발명은 가족성 및 산발성 형태의 ALS를 치료하는데 사용하기 위한, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
세이피노병증(seipinopathy)의 예로는, 비제한적으로, 베라르디넬리-세이프 선천성 지방이영양증(Berardinelli-Seip congenital lipodystrophy) 타입 2 (BSCL2)-관련 운동 질환, 선천성 전신성 지방이영양증(congenital generalized lipodystrophy: CGL), 실버 증후군(Silver syndrome), 원위 유전성 운동 신경병증 (distal hereditary motor neuropathy) 타입 V (dHMN-V)가 있다. 배양된 세포에서 세이핀의 돌연변이 형태의 발현은 폴딩되지 않은 단백질 반응(UPR) 경로를 활성화시키고 ER 스트레스-매개된 세포 사멸을 유도한다 (Ito & Suzuki, 2009 Brain 132: 87-15). 바람직한 양태에 따라서, 본 발명은 세이피노병증을 치료하는데 사용하기 위한, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
다른 양태로, 그 안에서 언급된 탈수초화 질환은 다발성 경화증 및 쉴더씨병(Schilder's disease)과 같은 관련 질환이다. 바람직한 양태에 따라서, 본 발명은 다발성 경화증을 치료하는데 사용하기 위한, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
낭포성 섬유증(cystic fibrosis: CF)
Norez 등 (2008 Eur. J. Pharmacol. Vol. 592 pp33-40)은 구아나벤즈가 낭포성 섬유증 인간 기도 상피세포에서 Ca2 + 의존성 클로라이드 흐름을 활성화시킴을 증명하였다. 이론에 얽매이지 않고, 구아나벤즈 유도체인 PPP1R15A 억제제인 본 발명의 화합물은 낭포성 섬유증의 질병 징후를 완화시킬 것으로 예상된다. 바람직한 양태에 따라서, 본 발명은 낭포성 섬유증을 치료하는데 사용하기 위한, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
망막 질환(retinal disease)
최근 공개된 문헌은 UPR이 망막 변성: 유전된 망막 변성, 예로서 망막 섬모병증 및 망막색소병변증, 황반 변성, 미숙아망막증, 광 유도 망막 변성, 망막 박리, 당뇨성 망막병증 및 녹내장의 발달과 관련된 증거들을 제공했다 (참고를 위하여, Gorbatyuk et Gorbatyuk 2013 Molecular Vision Vol. 19 pp1985-1998　; Jing et al., 2012, Exp Diabetes Res, 2012, 589589).
망막 섬모병증은 광수용체의 원발 섬모들(primary cilium)의 결함으로부터 발생하여 망막 색소 변성증을 유도하는, 희귀한 유전자 질환들의 그룹이다. 이러한 결함은 광수용체의 내부 분절(inner segment)에서의 단백질 축적으로 인하여 ER 스트레스를 유발하고 결국에는 UPR을 유도하는 것으로 보고되었다 (WO2013/124484). 망막 변성은 고립된 망막 색소변성증, 예컨대 레베르 선천성 흑암시(Leber's congenital amaurosis) 또는 X-결합 망막 색소변성증에서, 또는 바르데트-비들 증후군(Bardet-Biedl Syndrome: BBS), 알스트룸 증후군(Alstrm syndrome: ALMS) 또는 어셔 증후군(Usher syndrome)과 같은 증후군 병태에서도 관찰될 수 있는 섬모병증에서 매우 일반적인 특징이다. 망막 섬모병증은 바르데트-비들 증후군(Bardet-Biedl syndrome), 시니어-로켄 증후군(Senior-Loken syndrome), 쥬베르트 증후군(Joubert syndrome), 살리도노-마인저 증후군(Salidono-Mainzer syndrome), 센센브레너 증후군(Sensenbrenner syndrome), 쥰 증후군(Jeune syndrome), 멕켈-그루더 증후군(Meckel-Gruder syndrome), 알스트룸 증후군(Alstrm syndrome), MORM 증후군으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 바람직한 양태로, 화학식 (I)의 화합물은 망막 질환, 더욱 바람직하게는 유전된 망막 변성, 예로서 망막 섬모병증 및 망막색소병변증, 황반 변성, 미숙아망막증, 광 유도 망막 변성, 망막 박리, 당뇨성 망막병증 및 녹내장을 치료하는데 사용하기 위함이다.
바람직한 양태에 따라서, 본 발명은 망막 색소변성증을 치료하는데 사용하기 위한, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다. 바람직한 양태에 따라서, 본 발명은 레베르 선천성 흑암시를 치료하는데 사용하기 위한, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다. 본 발명은 바르데트-비들 증후군을 치료하는데 사용하기 위한, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다. 본 발명은 알스트룸 증후군을 치료하는데 사용하기 위한, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다. 본 발명은 어셔 증후군을 치료하는데 사용하기 위한, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
바람직한 양태로, 화학식 (I)의 화합물은 BIP 단백질의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 화합물, 예로서 발프로산(Valproic acid) 또는 이의 유도체, 트리코스타틴(trichostatin) A, 리튬, 1-(3,4-디히드록시-페닐)-2-티오시아네이트-에타논 및 엑센딘(exendin)-4와 함께 망막 질환의 치료, 더욱 바람직하게는, 망막 섬모병증, 망막색소병변증, 황반 변성, 미숙아망막증, 광 유도 망막 변성, 망막 박리, 당뇨성 망막병증 및 녹내장과 같은 유전된 망막 변성의 그룹으로부터 선택된 질환을 치료하는데 사용하기 위함이다. 따라서, 본 발명은 망막 섬모병증, 망막색소병변증, 황반 변성, 미숙아망막증, 광 유도 망막 변성, 망막 박리, 당뇨성 망막병증 및 녹내장과 같은 유전된 망막 변성의 그룹으로부터 선택된 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염과 BIP 단백질의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 화합물, 바람직하게는 발프로산(Valproic acid)을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
바람직한 양태로, 화학식 (I)의 화합물은 유전자요법 벡터와 함께, 망막 질환의 치료, 더욱 바람직하게는 망막 섬모병증, 망막색소병변증, 황반 변성, 미숙아망막증, 광 유도 망막 변성, 망막 박리, 당뇨성 망막병증 및 녹내장과 같은 유전된 망막 변성의 그룹으로부터 선택된 질환을 치료하는데 사용하기 위함이다. 유전자요법 벡터의 비제한 예로는 렌티바이러스(lentivirus), 아데노바이러스(adenovirus), 및 아데노-관련 벡터(AAVs)가 있으며; 이들 벡터들은 눈의 유전자요법을 위하여 당해 유전자를 망막 및 망막 색소 상피로 운반하는데 효과적이다. 돌연변이되어 미스폴딩된 단백질의 축적과 관련된 유전된 망막 변성의 눈 유전자요법에서, 소포체에서의 단백질 축적은 정상 단백질이 유전자요법 벡터로부터 발현되면서 존재하는 상태로 유지될 것으로 예상된다. 세포, 바람직하게는 ER에서 단백질 축적/부하량을 PPP1R15A 억제제로 감소시킬 필요성이 남아있다. 본 발명은 또한 눈 유전자요법과 함께, 화학식 (I)의 화합물, 구아나벤즈 및 살루브리날 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염의 그룹에서 선택되는 PPP1R15A 억제제를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
리소좀 축적 질환(Lysosomal storage disease);
리소좀 축적 질환은 리소좀 기능에서의 결함으로부터 발생하는 대략 50 여종의 희귀한 유전된 대사성 질환의 그룹이다. 리소좀 이기능(lysosomal dysfunction)은 통상적으로 지질, 당단백질 또는 소위 뮤코폴리사카라이드(mucopolysaccharide)의 대사에 요구되는 단독 효소의 결핍의 결과이다. 여기에 기재된 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제에 의해 치료될 수 있는 리소좀 축적 질환의 예로 활성인자 결핍증(Activator Deficiency)/GM2 강글리오시드축적증(gangliosidosis), 알파-만노사이드축적증(alpha-mannosidosis), 아스파르틸글루코사민뇨(aspartylglucosaminuria), 콜레스테릴 에스테르 축적 질환(cholesteryl ester storage disease), 시스틴축적증(cystinosis), 다논병(Danon disease), 파브리병(Fabry disease), 파르베르병(Farber disease), 니이만-픽병(Niemann-Pick disease), 푸코사이드 축적증(fucosidosis), 갈락토시알리도시스(galactosialidosis), 고셔병(Gaucher disease) (타입 I, II, II), GM1 강글리오시드축적증 (영아, 후기 영아/청소년, 성인/만성), I-세포 질환/뮤코리피드증(Mucolipidosis), 영아의 유리 시알산축적증(Infantile free sialic acid storage disease)/ISSD, 청소년의 헥소사미니다제 A 결핍증(Juvenile hexosaminidase A deficiency), 크라베병(Krabbe disease) (영아 개시, 후기 개시), 리소좀 산 리파제(lysosomal acid lipase) 결핍증 (초기 개시/후기 개시), 이염성백질이영양증(metachromatic leukodystrophy), 점액성 다당류증 질환(mucopolysaccharidoses disorder)(예로서, 슈도-훌러 다발이상증(Pseudo-Hurler polydystrophy)/뮤코리피드증(mucolipidosis) IIIA, 점액성 다당류증 I (MPS I) 훌러 증후군(Hurler syndrome), MPS I 샤이 증후군(Scheie syndrome), MPS I 훌러-샤이 증후군(Hurler-Scheie syndrome), MPS II 헌터 증후군(Hunter syndrome), 산필리포 증후군(Sanfilippo syndrome) 타입 A (MPS IIIA), 산필리포 증후군 타입 B (MPS IIIB), 산필리포 증후군 타입 C (MPS IIIC), 산필리포 증후군 타입 D (MPS IIID), 모르퀴오(Morquio) 타입 A/MPS IVA, 모르퀴오 타입 B/MPS IVB, MPS IX 히알루로니다제(hyaluronidase) 결핍증, MPS VI 마로테옥스-라미(Maroteaux-Lamy), MPS VII 슬라이 증후군(Sly syndrome), 뮤코폴리리피도시스(mucopolylipidosis) I/시알리도시스(sialidosis), 뮤코리피드증(mucolipidosis) IIIC, 뮤코리피드증 타입 IV(다중 술파타제 결핍증(multiple sulfatase deficiency), 니이만-픽병(Niemann-Pick disease) (타입 A, B, C), CLN6 질환 (비정형 후기 영아기(atypical late infantile), 후기 개시 변종, 초기 청소년기), 바텐-스필마이어-보그트(Batten-Spielmeyer-Vogt)/청소년 NCL/CLN3 질환, 피니쉬 변종 후기 영아(Finnish Variant late infantile) CLN5, 잔스키-비엘쇼스키병(Jansky-Bielschosky disease)/후기 영아기 CLN2/TPP1 병, 쿠프스(Kufs)/성인- 개시 NCL/CLN4 병, 북극 공포증(Northern epilepsy)/변종 후기 영아기 CLN8, 산타부오리-할티아(Santavuori-Haltia)/영아 CLN1/PPT 병, 베타-만노시도시스(beta-mannosidosis), 폼페병(Pompe disease)/글리코겐 축적병 타입 II, 피크노디스토시스(pycnodysostosis), 샌드호프병(Sandhoff disease)/GM2 강글리오시드축적증(gangliosidosis) (성인 개시, 유아 개시, 청소년 개시), 쉰들러병(Schindler disease), 살병(Sall disease)/시알산축적병(sialic acid storage disease), 테이-삭스(Tay-Sachs)/GM2 강글리오시드축적증(gangliosidosis), 및 볼만병(Wolman disease)이 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 다른 바람직한 양태로, 본 발명은 지질, 당단백질 또는 소위 점액성다당류(muco-polysaccharide)의 대사에 필요한 적어도 하나의 단일 효소의 결필 결과이며 이 효소는 소포체(ER)에서 미스폴딩되는, 리소좀 축적 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다. 바람직한 양태에 따라서, 상기 리소좀 축적 질환이 고셔병(Gaucher disease)이다.
아밀로이드증 질환(Amyloidosis diseases):
아밀로이드증은 수많은 상이한 질병을 총괄하여 명명한 아밀로이드증을 언급하는 비-특이적 용어이다. 아밀로이드(amyloid)는 이의 2차 구조 변화가 단백질이 특징적인 형태, 베타-주름진(pleated) 시트로 폴딩되도록 하는 단백질이다. 정상적으로 가용성인 단백질이 폴딩되어 아밀로이드로 될 때, 이들은 불용성으로 되어, 기관 또는 조직에 침착되고 축적되어, 정상적인 기능을 방해한다. 다른 타입의 아밀로이드증은 아밀로이드 단백질이 응집하는 곳과 기관에 따라서 다른 징후(sign)와 증상을 갖는다. 아밀로이드증 질환의 예로는, 비제한적으로, 그 중에서도, AL, AH, ALH 아밀로이드증 (각각, 경쇄, 중쇄, 중쇄와 경쇄 항체), AA 아밀로이드증 (혈청 A 단백질로부터 유래된 아밀로이드), ATTR 아밀로이드증 (트랜스타이레틴(transthyretin)으로부터 유래된 아밀로이드), 1차 전신성 아밀로이드증(primary systemic amyloidosis), 2차 전신성 아밀로이드증(secondary systemic amyloidosis), 노인 전신성 아밀로이드증(senile systemic amyloidosis), 가족성 아밀로이드 다발신경병증(familial amyloid polyneuropathy) 1 , 유전성 대뇌 아밀로이드 맥관병증(hereditary cerebral amyloid angiopathy), 혈액투석(hemodialysis)-관련 아밀로이드증, 가족성 아밀로이드 다발신경병증(familial amyloid polyneuropathy) III, 피니쉬 유전성 전신성 아미로이드증(Finnish hereditary systemic amyloidosis), 심방 아밀로이드증(atrial amyloidosis), 유전성 비-신경병증 전신성 아미로이드증(hereditary non-neuropathic systemic amyloidosis), 주사-국소화된 아밀로이드증(injection-localized amyloidosis), 유전성 망막 아밀로이드증(hereditary renal amyloidosis) 및 알쯔하이머병(Alzheimer disease)이 있다. 다른 바람직한 양태에 따라서, 상기 아밀로이드가 아밀로이드 베타(Aβ 또는 A베타)이고 본 발명은 알쯔하이머병을 치료하는데 사용하기 위한, 화학식(I) 또는 (II)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
다른 바람직한 양태에 따라서, 상기 아밀로이드가 HLA-B27 (Colbert et al. 2009 Prion Vol.3 (1) pp15-16)이고 본 발명은 척추관절병증(spondyloarthropathy), 더욱 바람직하게는 강직성 척추염(ankylosing spondylitis)을 치료하는데 사용하기 위한, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
염증
PPP1R15A는 염증성 사이토킨 및 병원성 병태(pathogenic condition)로 이끄는 다른 분비된 분자 매개체의 방출을 차단함으로써 염증을 제어한다는 전도유망한 타겟(target)을 나타낸다. 여기에 기재된 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제로 치료될 수 있는, 이와 관련한 염증을 갖는 질병 또는 병태의 비-제한적 예에, 폐에서의 감염-관련 또는 비-감염성 염증성 병태 (즉, 패혈증, 폐 감염성, 호흡곤란 증후군(Respiratory Distress Syndrome), 기관지폐이형성증(bronchopulmonary dysplasia) 등); 다른 기관에서의 감염-관련 또는 비-감염성 염증성 병태, 예로서 대장염(colitis), 궤양성 대장염, 염증성 장 질환(Inflammatory Bowel Disease), 당뇨병성 신장병증(diabetic nephropathy), 출혈성 쇼크(hemorrhagic shock), 척추관절병증, 췌장염(pancreatitis); 염증-유도된 암 (즉, 대장염 또는 염증성 장질환 환자에서 암의 진행) 등이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
그러한 병원성 염증 병태의 예로 자가-면역질환, 유전성 질환, 만성 질환 및 감염성 질환, 예로서 알레르기, 천식, 이식편대숙주질환(graft versus host disease: GVHD)을 포함한 고사이토카인혈증(hypercytokinemia), 급성 호흡곤란 증후군(ARDS), 패혈증, 전신성 염증성 반응 증후군(SIRS)이 있다 (WO2011/061340 참조). 바람직하게는 감염성 질환이 인플루엔자 바이러스 감염, 두창 바이러스(smallpox virus) 감염, 헤르페스 바이러스 감염, 심각한 급성 호흡기 증후군(SARS), 치쿤군야바이러스(chikungunya virus) 감염, 웨스트 나일 바이러스(West Nile Virus) 감염, 뎅기 바이러스(dengue virus) 감염. 일본 뇌염 바이러스 감염, 황열 바이러스(yellow fever virus) 감염, 및 C형 간염 바이러스 감염으로부터 선택된다.
바람직하게는, 자가면역 질환이 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 전신홍반루프스(systemic lupus erythematosus), 건선(psoriasis), 포진형 피부염(dermatitis herpetiformis), 백반증(vitiligo), 균상 식육종(mycosis fungoides), 알레르기성 접촉성 피부염(allergic contact dermatitis), 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 편평태선(lichen planus), 급성 두창상 태선양 비강진(Pityriasis lichenoides et varioliforms acuta: PLEVA), 관절염(arthritis), 파국적 항인지질 항체 증후군(catastrophic antiphospholipid syndrome)으로부터 선택된다.
다른 바람직한 양태에 따라서, 본 발명은 대장염, 궤양성 대장염, 염증성 장질환, 췌장염, 패혈증의 그룹에서 선택된 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다. 다른 바람직한 양태에 따라서, 본 발명은 췌장염을 치료하는데 사용하기 위한, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다. 다른 바람직한 양태에 따라서, 본 발명은 패혈증을 치료하는데 사용하기 위한, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
다른 바람직한 양태에 따라서, 본 발명은 척추관절병증(spondyloarthropathy), 더욱 바람직하게는 강직성 척추염(ankylosing spondylitis)을 치료하는데 사용하기 위한, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
대사성 및/또는 심혈관 질환
지방과다증, 고지혈증, 가족성 고콜레스테롤혈증, 비만, 동맥경화증, 고혈압, 심장병, 심장 허혈증, 뇌졸증, 심근경색, 경대동맥 협착증(trans-aortic constriction), 혈관 뇌졸증(vascular stroke) 및 당뇨병과 관련 질병에는, 그 중에서도, 고혈당증, 손상된 글루코오스 내성, 고인슐린혈증(전-당뇨), 인슐린 과민증 I형 및 II형 당뇨병, 인슐린 저항성, 월코트-랠리슨 증후군(Wolcott-Rallison Syndrome)이 있다.
하나의 바람직한 양태로, 화학식 (I)의 화합물은 동맥경화증을 치료하는데 사용하기 위함이다. 두번째 바람직한 양태로, 화학식 (I)의 화합물은 고혈압, 심장병, 심장 허혈증, 뇌졸증, 심근경색, 경대동맥 협착증 또는 혈관 뇌졸증의 그룹에서 선택된 질병을 치료하는데 사용하기 위함이다. 하나의 바람직한 양태로, 화학식 (I)의 화합물은 심장 허혈증을 치료하는데 사용하기 위함이다. 다른 바람직한 양태로, 화학식 (I)의 화합물은 고혈당증, 손상된 글루코오스 내성, 고인슐린혈증(전-당뇨), 인슐린 과민증 타입 I 및 II 당뇨병, 인슐린 저항성, 월코트-랠리슨 증후군의 그룹에서 선택된 질병을 치료하는데 사용하기 위함이다. 다른 바람직한 양태로, 화학식 (I)의 화합물이 전-당뇨 또는 당뇨병, 더욱 바람직하게는 2형 당뇨병을 치료하는데 사용하기 위함이다.
골다공증:
Yokota 등 (BMC Musculoskeletal disorders 2013, 14, 197)과 He 등 (Cellular Signaling 2013, 25 552-560)은 살루브리날 (Salubrinal: Boyce et al. 2005)이 마우스 모델에서 골다공증을 효율적으로 차단하고 골형성을 자극한다는 것을 증명하였다. 그러나, 살루브리날은 독성이 있고 따라서 인간 환자를 치료하는데 사용될 수 없다. 이와는 대조적으로, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제는 안전하고 골다공증의 치료에 유용할 것으로 예상된다. 하나의 바람직한 양태로, 화학식 (I)의 화합물이 골다공증을 치료하는데 사용하기 위함이다.
신경계 트라우마 (nervous system trauma)
Ohri 등 (Neurobiology of disease, 2013 Vol. 58 pp29-37)은 살루브리날이 뒷다리 운동능력을 크게 개선시켰으며, 이는 개선된 백질 침윤(white matter sparing)과 감소된 올리고덴드로사이트 세포자멸에 상응하고, 따라서 척수 부상 후 기능 회복을 개선시킨다는 것을 증명하였다.
본 발명의 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제는 안전하고 트라우마성 척수 부상 후 올리고덴드로사이트 상실을 감소시키고 척수 부상의 예방 및/또는 치료적 처치에 유용할 수 있을 것으로 예측된다. 하나의 바람직한 양태로, 화학식 (I)의 화합물은 척수 부상의 예방적 및/또는 치료적 처치를 위함이다.
허헐증, 뇌허혈증, 수면무호흡증
본 발명은 괴사 또는 세포자멸로 인한 세포 손상 또는 사망을 초래하는 조직 손상을 방지하고/하거나 치료하기 위하여 본 발명의 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제를 사용하는 방법을 제공한다. 신경 조직 손상의 예에는 허혈증 및 재관류 부상, 예로서 뇌허혈성 뇌졸증 및 헤드(head) 트라우마가 있다. 하나의 바람직한 양태로, 화학식 (I)의 화합물이 뇌 허혈증, 예로서 뇌허혈성 뇌졸증 및 헤드 트라우마의 예방적 및/또는 치료적 처치를 위함이다.
노화
노화는 암, 심혈관 부전, 비만, 2형 당뇨병, 비-알콜성 지방간, 및 신경퇴행성 질환뿐만 아니라 신체 기능의 대부분의 측정치의 쇠퇴를 가져오는, 세포, 조직, 및 기관의 퇴화와 관계있다.
생물학에서, 노화(senescence)는 노화 상태 또는 노화 과정이다. 세포의 노화는 단리된 세포가 배양액에서 분화능력이 제한된 것으로 증명되는 현상인 한편 (the Hayflick Limit, discovered by Leonard Hayflick in 1961), 유기체의 노화rganismal senescence)는 유기체(생물)의 노화이다. 유기체 노화는 스트레스에 반응하는 능력의 쇠퇴, 항상성 불균형의 증가 및 질병 위험의 증가로 특징되며; 특히, UPR은 나이가 들어감에 따라 손상된다 (Naidoo et al., 2008, J Neurosci, 28, 6539-48). 따라서, eIf2α 포스파타제의 억제에 의해 UPR의 유익한 효과를 연장시키는 것은 노화-관련 질환을 완화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제는 안전하고 세포의 수명 또는 증식 능력과 관계있는 질환 또는 질병, 및 동물, 더욱 구체적으로는 인간에서 세포의 노화에 의해 유도되거나 악화되는 질환 또는 질환 병태를 방지하고/하거나 치료하는데 유용할 것으로 예상된다.
특정 양태에 따라서, 본 발명은 낭포성 섬유증, 리소좀 축적 질환, 아밀로이드증 질환, 암, 염증, 바람직하게는 패혈증, 대장염 및 췌장염, 대사성 질환, 당뇨병, 심혈관 질환, 골다공증, 중추신경계 트라우마, 허혈증, 망막 질환, 세이피노병증, 신경퇴행성 질환, 바람직하게는 알쯔하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측색 경화증, 헌팅톤병, 폴리글루타민, 및 폴리알라닌 질환, 사르코-마리-투스 질환, 백질이영양증 및 다발성 경화증의 그룹에서 선택되는 하나 이상의 질병을 치료 및/또는 방지하는데 사용하기 위한, 하기 표 2로부터 선택되는 화합물 중 하나에 관한 것이다:
Compound 1
Figure 112016125037009-pct00018
Compound 2
Figure 112016125037009-pct00019
Compound 3
Figure 112016125037009-pct00020
Compound 4
Figure 112016125037009-pct00021
Compound 5
Figure 112016125037009-pct00022
Compound 6
Figure 112016125037009-pct00023
Compound 7
Figure 112016125037009-pct00024
Compound 8
Figure 112016125037009-pct00025
Compound 9
Figure 112016125037009-pct00026
Compound 10
Figure 112016125037009-pct00027
Compound 11
Figure 112016125037009-pct00028
하나의 양태에 따라서, 본 발명은 또한, 상기 화합물 1 내지 11로부터 선택되는 화합물 하나뿐만 아니라 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
약학 조성물
본 발명에 따른 사용을 위하여, 여기에 기재된 화합물들 또는 이들의 생리학적으로 허용 가능한 염, 에스테르 또는 다른 생리학적으로 기능성인 유도체가 상기 화합물들 또는 이들의 생리학적으로 허용 가능한 염, 에스테르 또는 다른 생리학적으로 기능성인 유도체를, 이에 대해 약학적으로 허용 가능한 담체 하나 이상과 함께, 선택적으로 다른 치료적 및/또는 예방적 성분과 함께 포함하는 약학 제형으로 제공될 수 있다. 상기 담체(들)는 상기 제형 중의 다른 성분들과 화합성이고 이들의 수용체에 나쁘지 않아야 하는 면에서 허용 가능하여야 한다. 상기 약학 조성물은 인간 및 수의학에서 인간 또는 동물 사용을 위한 것일 수 있다.
여기에 기재된 약학 조성물의 다양한 상이한 형태에 대한 이와 같은 적합한 부형제들의 예를 문헌: "Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd Edition, (1994), Edited by A Wade and PJ Weller에서 발견할 수 있다.
치료적 용도를 위한 허용 가능한 담체들 또는 희석제들은 약학 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어, 문헌: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)에 기재되어 있다.
적합한 담체들의 예로는 락토오스, 전분, 글루코오스, 메틸 셀룰로오스, 망간 스테아레이트, 만니톨, 솔비톨 등이 있다. 적합한 희석제들의 예로는 에탄올, 글리세롤 및 물이 있다.
약학적 담체, 부형제 또는 희석제의 선택은 의도된 투여 경로 및 표준 약학 실무에 대해서 선택될 수 있다. 약학 조성물들은 담체, 부형제 또는 희석제로서, 또는 이들에 부가하여, 임의의 적합한 결합제(들), 윤활제(들), 현탁제(들), 코팅제(들), 가용화제(들), 완충제(들), 향미제(들), 표면활성제(들), 농후제(들), 방부제(들)(항-산화제 포함) 등, 및 의도된 수용체의 혈액과 등장성을 제형에 부여하기 위해 포함되는 물질들을 포함할 수 있다.
적합한 결합제들의 예로 전분, 젤라틴, 천연당, 예로서 글루코오스, 무수 락토오스, 자유-유동 락토오스, 베타-락토오스, 옥수수 감미료(corn-sweetner), 천연 및 합성 검(gum), 예로서 아카시아, 트라가탄트 또는 나트륨 알기네이트, 카르복시메틸 셀룰로오스 및 폴리에틸렌 글리콜이 있다.
적합한 윤화제들의 예로 나트륨 올레에이트, 나트륨 스테아레이트, 망간 스테아레이트, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 아세테이트, 염화나트륨 등이 있다.
방부제들, 안정화제들, 염료들 및 심지어 향미제들이 상기 약학 조성물에 제공될 수 있다. 방부제들의 예로 나트륨 벤조에이트, 소르브산 및 p-히드록시벤조산의 에스테르가 있다. 항산화제 및 현탁제들이 또한 사용될 수 있다.
약학적 제형들로는 경구, 국소 (피부, 구강, 눈 및 혀 밑을 포함), 직장 또는 비경구 (피하, 피부내, 근육내 및 정맥 주사 포함), 코, 안구내 및 예컨대 흡입에 의한 폐 투여에 적합한 것들이 있다. 제형은 적절한 곳에, 별개의 복용 단위로 편리하게 제공될 수 있고, 약학 분야에서 잘 알려진 방법들 중 어느 하나에 의해 제조될 수 있다. 모든 방법들은 활성 화합물을 액체 담체들 또는 미세하게 분할된고체 담체들 또는 이들 모두와 결합시키고, 이후, 필요에 따라, 제품을 원하는 제형으로 성형하는 단계를 포함한다.
담체가 고체인 경구 투여에 적합한 약학적 제형들은 가장 바람직하게는 미리 결정된 양의 활성 화합물을 각각 포함하는 단위 투여량 제형들, 예컨대 볼러스(boluse), 캡슐제 또는 정제로서 제공된다. 정제는 선택적으로 하나 이상의 부성분(accessory ingredient)과 함께 압축 또는 몰딩(moulding)하여 만들 수 있다. 압축된 정제들은 선택적으로 결합제, 윤활제, 불활성 희석제, 윤활제, 표면-활성제 또는 분산제와 혼합되는 자유-유동 형태, 예컨대 분말 또는 과립(granule)으로 활성 화합물들을 적합한 기계에서 압축하여 제조될 수 있다. 몰딩된 정제는 활성 화합물을 불활성 액체 희석제와 함께 몰딩하여 만들 수 있다. 정제들은 선택적으로 코팅될 수 있으며, 코팅되지 않을 경우, 선택적으로 번호를 매길 수 있다. 캡슐제는 활성 화합물을 단독으로 또는 하나 이상의 부성분과의 혼합물로 캡슐 외피에 충전하고, 이후 이들을 통상의 방법으로 밀봉하여 제조할 수 있다. 카제(cachet)는 부성분(들)과 함께 활성 화합물을 라이스 페이퍼 봉투에 밀봉되어 있는 캡슐제와 유사하다. 활성 화합물은 또한 분산성 과립제로 제형화될 수 있으며, 상기 분산성 과립제는 예를 들어 투여 전에 물에 현탁시킬 수 있거나 음식 위에 뿌릴 수 있다. 과립제는 예컨대 봉지(sachet)에 포장될 수 있다. 담체가 액체인 경구 투여에 적합한 제형들은 수성 또는 비-수성 액체중의 용액 또는 현탁액으로, 또는 수중유(oil-in-water) 액체 에멀젼으로 제공될 수 있다.
경구 투여용 제형들로는 방출 조절형 복용량 형태, 예를 들면, 활성 화합물이 적합한 방출-조절 매트릭스 중에 조제되거나, 적합한 방출-조절 필름으로 코팅되어 있는 정제가 있다. 그러한 제형들은 예방적 사용에 특히 편리할 수 있다.
담체가 고체인 직장 투여에 적합한 약학적 제형은 가장 바람직하게는 단위 투여량 좌제로 제공된다. 적합한 담체로는 코코아 버터 및 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 기타 물질들이 있다. 좌제는 활성 화합물을 연화되거나 용융된 담체(들)과 혼합한 다음 냉각시키고 몰드에서 성형하여 편리하게 만들 수 있다.
비경구 투여에 적합한 약학적 제형으로는 수성 또는 유성인 비히클 중의 멸균 용액들 또는 현탁액들이 있다.
본 발명의 약학적 제형은 안구 투여, 특히 눈 내, 초자체 내(intra-vitreal), 국소적 눈 또는 눈 주변의 투여, 더욱 바람직하게는 국소적 눈 또는 초자체 내 투여에 적합하다.
주사 가능한 제제는 볼러스 주사 또는 연속 주입용으로 개조될 수 있다. 그러한 제제는 사용에 필요할 때까지 제형의 도입 후 밀봉되는 단위 투여량 또는 다회 투여량 용기로 편리하게 제공된다. 대안으로, 활성 화합물을 사용 전 적합한 매질, 예컨대, 멸균, 피로겐이 없는 (pyrogen-free) 물과 같은 적합한 비히클과 구성되는 분말 형태로 될 수 있다.
활성 화합물은 또한 근육내 주사에 의해 또는 주입 (implantation), 예컨대, 피하 또는 근육내 주입에 의해 투여될 수 있는, 장기-지속식 데포(long-acting depot) 제제로 제형화될 수 있다. 데포 제제는 예를 들어, 적합한 폴리머성 또는 소수성 물질들, 또는 이온-교환 수지를 포함할 수 있다. 그러한 장기-지속식 제형은 예방적 사용에 특히 편리하다.
구강(buccal cavity)을 통한 폐 투여에 적합한 제형은 활성 화합물을 포함하고 바람직하게는 0.5 내지 0.7 마이크론 범위의 직경을 가지는 입자들이 수용체의 기관지 수상 구조에 전달하도록 제공된다. 하나의 가능성으로서, 그러한 제형은 편리하게는 흡입 기구에 사용하기 위한, 적합하게는, 예를 들어 젤라틴으로 만들어진 천공 가능한 캡슐로 또는 대안으로 활성 화합물, 적합한 액체 또는 가스 추진제(propellant) 및 선택적으로 다른 성분들, 예컨대 계면활성제 및/또는 고체 희석제를 포함하는 자가-프로펠링(self-propelling) 제형으로 제공될 수 있는 미세하게 분쇄된 분말의 형태로 된다. 적합한 액체 추진제로는 프로판 및 클로로플루오로카본이 있으며, 적합한 가스상 추진제로는 이산화탄소가 있다. 자가-프로펠링 제형이 또한 사용될 수 있으며, 여기서 활성 화합물은 용액 또는 현탁액의 액적의 형태로 분산되어 있다.
그러한 자가-프로펠링 제형은 당해 분야에 알려져 있는 것들과 유사하며 확립된 절차에 의해 제조될 수 있다. 적합하게는, 이들이 원하는 분무 특성들을 갖는 수동식으로-작동될 수 있거나 자동으로 기능하는 밸브가 제공되는 용기에 제공되고; 유리하게는 상기 밸브가 이의 각 작동시, 고정된 용량, 예컨대 25 내지 100 마이크로리터를 운반하는 계량형(metered type)이다.
추가의 가능성으로서, 활성 화합물이 아토마이저(atomizer) 또는 네뷸라이저(nebuliser)에 사용하기 위한 용액 또는 현탁액의 형태로 될 수 있으며, 이에 의해 가속된 기류(airstream) 또는 초음파 교반이 흡입을 위한 미세 액적 미스트를 생성하기 위해 사용된다.
코(nasal) 투여에 적합한 제형은 일반적으로 폐 투여용으로 상기 기재된 것들과 유사한 제제를 포함한다. 분산될 때 그러한 제형은 바람직하게는 비강에 유지될 수 있도록 하기 위하여 10 내지 200 마이크론 범위의 입자 직경을 가져야 하고; 이는 적절히, 적합한 입자 크기를 갖는 분말의 사용 또는 적절한 밸브의 선택에 의해 달성될 수 있다. 다른 적합한 제형들은 코에 아주 가깝게 유지되는 용기로부터 코의 구멍을 통한 신속한 흡입에 의한 투여를 위하여, 20 내지 500 마이크론 범위의 입자 직경을 갖는 거친 분말, 및 수성 또는 유성 용액 또는 현탁액 중에 활성 화합물을 0.2 내지 5% w/v 포함하는 점비액(nasal drop)을 포함한다.
약학적으로 허용 가능한 담체들은 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있으며, 0.1M, 바람직하게는 0.05M 인산염 완충액 또는 0.8% 염수를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 부가적으로, 그러한 약학적으로 허용 가능한 담체들은 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액, 및 에멀젼들일 수 있다. 비-수성 용매의 예로 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예컨대 올리브유, 및 주사 가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트가 있다. 수성 담체들로 염수와 완충된 매질을 포함하는, 물, 알코올성/수성 용액들, 에멀젼들 또는 현탁액들이 있다. 비경구 비히클로는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로오스(Ringer's dextrose), 덱스트로오스와 염화나트륨, 락테이드화된 링커 또는 불휘발성유(fixed oil)가 있다. 예를 들어, 항균제, 항산화제, 킬레이트화제, 불활성 가스 등과 같은, 방부제 및 기타 첨가제가 또한 존재할 수 있다.
국소 제형에 적합한 제형들은 예를 들어, 겔, 크림 또는 연고로 제공될 수 있다. 그러한 제제는 예컨대, 상처난 부위 또는 궤양의 표면에 직접 문지르거나 치료할 장소에 또는 그 위에 적용될 수 있는 밴드, 거즈, 메쉬 등과 같은 적합한 지지체 위에 담겨서, 상처난 부위 또는 궤양에 적용될 수 있다.
치료할 부위, 예를 들면 상처난 부위 또는 궤양에 직접 분무되거나 뿌려질 수 있는 액체 또는 분말 제형이 또한 제공될 수 있다. 대안으로, 밴드, 거즈, 메쉬 등과 같은 담체에 제형이 분무되거나 뿌려진 다음 치료할 부위에 적용될 수 있다.
본 발명의 추가 양상에 따라서, 상기 기재된 바와 같은 약학 또는 수의학 조성물의 제조 방법이 제공되며, 이 방법은 활성 화합물(들)을 예를 들면, 혼합에 의해 담체와 함께 회합(association)시키는 것을 포함한다. 일반적으로, 상기 제형들은 활성제를 액체 담체 또는 미세하게 분쇄된 고체 담체 또는 둘 다와 균질하고 친밀하게 회합시킨 다음, 필요할 경우, 제품을 성형시켜 제조된다.
본 발명은 화학식 (I)의 화합물을 약학적으로 또는 수의학적으로 허용 가능한 담체 또는 비히클과 결합(conjunction) 또는 회합(association)시키는 것을 포함하는 약학 조성물의 제조 방법으로 연장된다.
염/에스테르
본 발명의 화합물은 염 또는 에스테르, 특히 약학적으로 및 수의학적으로 허용 가능한 염 또는 에스테르로 존재할 수 있다.
본 발명의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은 이들의 적합한 산 부가 또는 염기 염을 포함한다. 적합한 약학적 염에 대한 리뷰는 하기 문헌에서 발견할 수 있다: Berge et al, J Pharm Sci, 66, 119 (1977). 예를 들면, 강한 무기산, 예컨대 미네랄산, 예를 들어 히드로할산(hydrohalic acid), 예로서 히드로클로라이드, 히드로브로마이드 및 히드로요오다이드, 황산, 인산 술페이트, 비술페이트, 헤미술페이트, 티오시아네이트, 퍼술페이트 및 술폰산; 강한 유기 카르복실산, 예컨대 비치환되거나 치환된 (예를 들어, 할로겐으로), 탄소수 1 내지 4의 알칸카르복실산, 예로서 아세트산; 포화되거나 불포화된 디카르복실산, 예컨대 옥살산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 프탈산 또는 테트라프탈산; 히드록시카르복실산, 예컨대 아스코르브산, 글리콜산, 락트산, 말산, 타르타르산 또는 시트르산; 아미노산, 예컨대 아스파르트산 또는 글루탐산; 벤조산; 또는 유기 술폰산, 예컨대 비치환되거나 치환된 (예를 들어, 할로겐으로) (C1-C4)-알킬- 또는 아릴-술폰산, 예로서 메탄- 또는 p-톨루엔 술폰산과 염이 형성된다. 약학적으로 또는 수의학적으로 허용 가능하지 않은 염도 중간체로서 가치가 있을 수 있다.
바람직한 염은 예를 들어, 아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 락테이트, 글루코네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 말레에이트, 말레이트, 판토테네이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스파르테이스, 벤조에이트, 부티레이트, 디글루코네이트, 시클로펜타네이트, 글루코헵타네이트, 글리세로포스페이트, 옥살레이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 푸마레이트, 니코티네이트, 팔모에이트, 펙티네이트, 3-페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로프리오네이트, 타르트레이트, 락토비오네이트, 피볼레이트, 캄포레이트, 운데카노에이트 및 숙시네이트, 유기 술폰산, 예로서 메탄술포네이트, 에탄술포네이트, 2-히드로시에탄 술포네이트, 캄포르술포네이트, 2-나프탈렌술포네이트, 벤젠술포네이트, p-클로로벤젠술포네이트 및 p-톨루엔술포네이트; 및 무기 산, 예로서 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 히드로요오다이드, 술페이트, 비술페이트, 헤미술페이트, 티오시아네이트, 퍼술페이트, 포스포르산 및 술폰산을 포함한다. 바람직한 양태에 따라서, 상기 염은 아세테이트이다.
에스테르는 에스테르화시킬 작용기에 따라서 유기산 또는 알코올/수산화물을 사용하여 형성시킨다. 유기산으로는 카르복실산, 예컨대 비치환되거나 치환된 (예를 들어 할로겐으로), 탄소수 1 내지 12의 알칸카르복실산, 예로서 아세트산; 포화 또는 불포화 디카르복실산, 예컨대 옥살산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 프탈산 또는 테트라프탈산; 히드록시카르복실산, 예컨대 아스코르브산, 글리콜산, 락트산, 말산, 타르타르산 또는 시트르산; 아미노산, 예컨대 아스파르트산 또는 글루탐산; 벤조산; 또는 유기 술폰산, 예컨대 비치환되거나 치환된 (예를 들면 할로겐으로) (C1-C4)-알킬- 또는 아릴-술폰산, 예로서 메탄- 또는 p-톨루엔 술폰산을 포함한다. 적합한 수산화물은 무기 수산화물, 예로서 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 수산화알루미늄을 포함한다. 알코올은 비치환되거나 치환될 수 있는 (예를 들면 할로겐으로), 탄소수 1 내지 12의 알칸알코올을 포함한다.
거울상이성체(enantiomer)/호변이성체(tautomer)
상기 논의된 본 발명의 모든 양상에서, 본 발명은 적절한 경우 본 발명의 화합물의 모든 거울상이성체, 부분입체이성체 및 호변이성체를 포함한다. 당해 분야의 숙련가는 광학적 특성들 (하나 이상의 키랄 탄소 원자들) 또는 호변이성체 특징을 갖는 화합물들을 인식할 것이다. 대응하는 거울상이성체 및/또는 호변이성체는 당해 분야에 알려져 있는 방법으로 단리/제조될 수 있다. 거울산이성체는 이들의 키랄 중심의 절대 배열로 특징되며 문헌: R- and S-sequencing rules of Cahn, Ingold and Prelog에 설명되어 있다. 이와 같은 관행들은 당해 분야에 잘 알려져 있다 (예를 들어, 문헌: 'Advanced Organic Chemistry', 3rd edition, ed. March, J., John Wiley and Sons, New York, 1985을 참조한다).
따라서, 화학식 (I)의 화합물은 하기 식을 갖는 호변이성체 형태를 포함한다:
Figure 112016125037009-pct00029
실례가 되는 예로서, 실시예 1의 호변이성체 형태는 하기와 같다:
Figure 112016125037009-pct00030
키랄 중심을 포함하는 본 발명의 화합물은 라세미 혼합물, 거울상이성체 풍부 혼합물로 사용될 수 있거나, 상기 라세미 혼합물은 잘 알려져 있는 기술을 사용하여 분리될 수 있으며 개개의 거울상이성체는 단독으로 사용될 수 있다.
입체 및 기하 이성체(stereo and geometric isomer)
본 발명의 화합물 중 일부는 입체이성체 및/또는 기하이성체로 존재할 수 있는데 - 예를 들면, 이들은 하나 이상의 비대칭 및/또는 기하학적 중심을 가질 수 있어 둘 이상의 입체이성체 및/또는 기하학적 형태로 존재할 수 있다. 본 발명은 억제제의 개개의 모든 입체이성체와 기하이성체, 및 이들의 혼합물의 사용을 고려한다. 청구항들에서 사용되는 용어들은 상기 형태들이 적절한 기능적 활성을 유지한다면 (반드시 동일한 정도로는 아니지만) 이들 형태를 포함한다.
본 발명은 또한 약제(agent) 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염의 모든 적합한 동위원소 변이체(isotopic variation)를 포함한다. 본 발명의 약제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염의 동위원소 변이체는 적어도 하나의 원자가 동일한 원자 번호를 갖지만 자연에서 통상적으로 발견되는 원자량과 다른 원자량을 갖는 원자로 대체된 것으로 정의된다. 약제 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염에 포함될 수 있는 동위원소들의 예에 수소, 탄소, 질소, 산소, 인, 황, 불소 및 염소의 동위원소들, 예로서, 각각, 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 17O, 18O, 31P, 32P, 35S, 18F 및 36Cl이 포함된다. 약제 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염들의 특정의 동위원소 변이체, 예를 들면, 3H 또는 14C와 같은 방사성활성 동위원소가 포함되어 있는 것들은 약물 및/또는 기질 조직 분포 연구(substrate tissue distribution study)에서 유용하다. 삼중, 즉, 3H, 및 탄소-14, 즉, 14C 동위원소들은 이들의 제조 및 검출가능성의 용이성 때문에 특히 바람직하다. 또한, 중수소, 즉, 2H와 같은 동위원소로 치환시킴으로써 더 큰 대사 안정성으로부터 발생하게 되는 특정의 치료적 장점, 예를 들면, 증가된 생체내 반감기 또는 감소된 복용량 요구조건을 제공할 수 있고 따라서 일부 상황에서 바람직할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 임의의 수소 원자가 중수소로 대체된 화학식 (I)의 화합물을 포함한다. 본 발명의 약제 및 본 발명의 이들의 약학적으로 허용 가능한 염들의 동위원소 변이체들은 일반적으로 적합한 시약의 적합한 동위원소 변이체를 사용하여 통상의 방법으로 제조될 수 있다.
전구약물(prodrug)
본 발명은 또한 전구약물 형태의 본 발명의 화합물들, 즉 생체 내에서 화학식 (I)에 따르는 활성 모체 약물을 방출하는 공유결합된 화합물들을 포함한다. 그러한 전구약물들은 일반적으로 하나 이상의 기가 변형되어 있는 본 발명의 화합물들이며 이때 상기 변형은 인간 또는 포유동물 대상에 투여시 역전(reverse)될 수 있다. 생체 내에서 역전을 수행하기 위하여 그러한 전구약물과 함께 제2의 약제를 투여할 수 있지만, 역전은 통상적으로, 그러한 대상에 자연적으로 존재하는 효소에 의해 수행된다. 그러한 변형(modification)의 예로 에스테르 (예를 들어, 상기 기재된 것들 중 임의의 하나)가 포함되며, 여기서 역전은 에스테라제 등에 의해 수행될 수 있다. 다른 그러한 시스템들이 당해 분야의 숙련가에에게 잘 알려져 있을 것이다.
용매화물(solvate)
본 발명은 또한 본 발명의 화합물의 용매화물 형태를 포함한다. 청구항에서 사용되는 상기 용어는 이러한 형태들을 포함한다.
다형태체(polymorph)
본 발명은 또한 다양한 결정 형태들, 다형체들(polymorphic form) 및 (무)수화물 형태의, 본 발명의 화합물에 관한 것이다. 화학적 화합물들이 그러한 화합물의 합성 제조에 사용되는 용매들로부터의 정제 및 또는 단리 형태의 방법을 약간 변화시켜 그와 같은 형태들 중 어느 하나로 단리될 수 있다는 것은 제약 산업 내에 잘 확립되어 있다.
투여
본 발명의 약학 조성물은 직장, 코, 기관지내, 국소 (구강, 혀 밑 및 눈으로의 투여, 특히 눈-내, 초자체-내, 눈의 국소부위 또는 눈 주변 투여 포함), 질 또는 비경구 (피하, 근육내, 정맥내, 동맥내 및 피내 포함), 복강내 또는 척추강 내 투여를 위하여 개조될 수 있다. 바람직하게는, 제형이 경구 투여되는 제형이다. 상기 제형은 단위 복용량 형태로, 즉, 단위 투여량, 또는 다수 또는 단위 투여량의 서브 단위를 포함하는 별개의 포션(portion)의 형태로 편리하게 제공될 수 있다. 예로서, 제형이 정제 및 서방출 캡슐의 형태일 수 있으며, 약학 분야에 잘 알려져 있는 임의의 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명에서 경구 투여용 제형은 미리 결정된 양의 활성 물질을 각각 포함하는 캡슐제, 젤룰(gellule), 드롭(drop), 카제, 알약 또는 정제와 같은 별개의 단위로; 분말 또는 과립으로; 수성 액체 또는 비-수성 액체 중 활성 물질의 용액, 에멀젼 또는 현탁액으로; 또는 수중유 액체 에멀젼 또는 유중수 액체 에멀젼으로; 또는 볼러스(bolus) 등으로 제공될 수 있다. 바람직하게는, 이들 조성물이 투여량 당 활성 성분을 1 내지 250 ㎎, 더욱 바람직하게는 10 내지 100 ㎎, 더욱 바람직하게는 1 내지 100 ㎎을 포함한다.
경구 투여용 조성물 (예를 들어, 정제 및 캡슐제)에 있어서, 용어 "허용 가능한 담체"는 퉁상의 부형제, 예컨대 결합제, 예로서 시럽, 아카시아, 젤라틴, 솔비톨, 트라가칸트, 폴리비닐피롤리돈(Povidone), 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 슈크로오스 및 전분; 충전제 및 담체들, 예컨대 옥수수 전분, 젤라틴, 락토오스, 슈크로오스, 미세결정 셀룰로오스, 카올린, 만니톨, 인산이칼슘, 염화나트륨 및 알긴산; 및 윤활제, 예로서 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 스테아레이트 및 기타 금속성 스테아레이트, 글리세롤 스테아레이트 스테아르산, 실리콘 플루이드, 탈크 왁스, 오일 및 콜로이드상 실리카와 같은 비히클들을 포함한다. 향미제, 예로서 페파민트, 워터그린 오일(oil of watergreen), 체리향 등이 또한 사용될 수 있다. 용이하게 식별할 수 있는 복용량 형태로 만들기 위하여 착색제를 첨가하는 것이 바람직할 수 있다. 정제는 또한 당해 분야에 잘 알려져 있는 방법으로 코팅시킬 수 있다.
정제는 압축 또는 몰딩에 의해, 선택적으로는 하나 이상의 부성분을 사용하여 만들어질 수 있다. 압축된 정제는 선택적으로 결합제, 윤활제, 불활성 희석제, 방부제, 표면-활성제 또는 분산제와 혼합된 자유 유동하는 형태, 예를 들면 분말 또는 과립으로 활성제를 적합한 기계에서 압축시켜 제조될 수 있다. 몰딩된 정제는 불활성 액체 희석제로 습윤시킨 분말화된 화합물의 혼합물을 적합한 기계에서 몰딩시켜 제조될 수 있다. 정제들은 선택적으로 코팅되거나 번호를 매길 수 있으며 활성제의 느린 방출 또는 조절된 방출을 제공하도록 제형화될 수 있다.
경구 투여에 적합한 다른 제형들로는 향미된 베이스, 통상적으로 슈크로오스와 아카시아 또는 트라가칸트에 활성제를 포함하는 로젠지(logenze); 젤라틴과 글리세린, 또는 슈크로오스와 아카시아와 같은 불활성 베이스 중에 활성제를 포함하는 파스틸(pastill); 및 적합한 액체 담체에 활성제를 포함하는 마우스워시(mouthwash)가 있다.
다른 투여형들로는 정맥내, 동맥내, 척추강내, 피하, 피내, 복강내, 눈-내, 국소, 눈-주변 또는 근육내로 주사할 수 있으며, 멸균 또는 멸균가능한 용액으로부터 제조되는 용액 또는 에멀젼을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 또한 좌제, 페사리(pessary), 현탁제, 에멀젼, 로션, 연고, 크림, 겔, 스프레이, 용액 또는 더스팅 분말의 형태로 될 수 있다.
경피 투여의 대안적 수단은 피부 패치를 사용하는 것이다. 예를 들어, 활성 성분을 폴리에틸렌 글리콜 또는 액체 파라핀의 수성 에멀젼으로 이루어진 크림에 포함시킬 수 있다. 활성 성분은 또한 백색 왁스 또는 백색 연성 파라핀 베이스로 이루어진 연고에, 1 내지 10 중량%의 농도로, 필요할 경우, 안정화제 및 방부제와 함께 포함될 수 있다.
복용량(dosage)
당해 분야의 숙련가는 과도한 실험없이 대상에게 투여하기 위한 본 조성물 중 하나의 적절한 투여량을 용이하게 결정할 수 있다. 전형적으로, 의사는 환자 개개인에 가장 적합할 실제 복용량을 결정할 것이며 사용되는 특정 화합물의 활성, 당해 화합물의 대사 안정성 및 작용 기간, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 식이(diet), 투여 방식 및 시간, 배설율, 약품 조합, 특정 상태의 심화도, 및 개인별 진행중인 요법(therapy)을 포함한 다양한 인자에 따를 것이다. 여기에 개시되는 복용량은 평균적인 경우의 예이다. 물론 더 높거나 더 낮은 복용량 범위가 이득이 되는 각각의 예가 있을 수 있으며, 그와 같은 것은 본 발명의 범주 내에 있다.
본 발명에 따라서, 화학식 (I)의 화합물의 유효량은 특정 상태 또는 질환을 타겟으로 하여 투여될 수 있다. 물론, 이러한 복용량은 또한 당해 화합물의 투여 타입에 따라서 변화될 수 있다. 예를 들어, 급성 요법에 대한 "유효량"을 성취하기 위해서는, 화학식 (I)의 화합물을 비경구 투여하는 것이 바람직하다. 근육내 볼러스 주사가 또한 유용할 수 있지만, 물 또는 보통의 염수 중 5% 덱스트로오스로 화합물의 정맥 주사, 또는 적합한 부형제와의 유사한 제형이 가장 효과적이다. 전형적으로, 비경구 투여량은 유효 농도로 혈장에서 약물의 농도를 유지하는 방식으로, 약 0.01 내지 약 100 ㎎/㎏; 바람직하게는 0.1 내지 20 ㎎/㎏일 수 있다. 화합물은 약 0.4 내지 약 400 ㎎/㎏/일의 일일 총 투여량을 성취하기 위한 수준으로 일일 1회 내지 4회 투여될 수 있다. 치료적으로 유효한 본 발명의 화합물의 정확한 양, 및 그러한 화합물이 최선으로 투여되는 경로는 활성제의 혈액 수준을 치료 효과를 갖는데 요구되는 농도와 비교함으로써 당해 분야의 숙련가에 의해 용이하게 결정된다.
본 발명의 화합물은 또한 약물의 농도가 여기에 개시된 치료 지표(indications) 중 하나 이상을 성취하는데 충분하도록 하는 방식으로 환자에게 경구적으로 투여될 수 있다. 전형적으로, 본 화합물을 포함하는 약학 조성물을 환자의 상태와 일치하는 방식으로 약 0.1 내지 약 50 ㎎/㎏의 경구 투여량으로 투여한다. 바람직하게는, 경구 투여량이 약 0.1 내지 약 20 ㎎/㎏일 수 있다.
허용될 수 없는 독물학적 효과들은 본 발명의 화합물을 본 발명에 따라서 투여할 때 예상되지 않는다. 양호한 생체 이용가능성을 가질 수 있는, 본 발명의 화합물은 주어진 약물학적 효과를 갖는데 필요한 화합물의 농도를 결정하기 위하여 수 개의 생물학적 분석법 중 하나로 시험될 수 있다.
조합(combination)
특히 바람직한 양태로, 본 발명의 화합물 하나 이상을 다른 활성제, 예를 들어, 시중에서 구입할 수 있는 현존 약물 하나 이상과 함께 투여한다. 그런 경우, 본 발명의 화합물은 하나 이상의 다른 활성제와 함께 연속해서, 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
일반적으로 약물은 함께 사용될 때 더욱 효과적이다. 특히, 조합 치료는 주요 독성들, 작용 메커니즘 및 내성(resistance) 메커니즘(들)의 중첩을 피하기 위해 바람직하다. 게다가, 대부분의 약물들은 이들의 최대 허용되는 투여량으로 그러한 투여량 간에 최소 시간 간격으로 투여하는 것이 또한 바람직하다. 약물을 조합하는 주요 장점은 생화학적 상호작용들을 통하여 부가적 또는 가능한 시너지 효과를 촉진할 수 있으며 또한 내성의 발생을 감소시킬 수 있다는 것이다.
유익한 조합은 특정 질환의 치료에서 가치가 있는 것으로 알려지거나 의심되는 약제로 시험 화합물의 억제 활성을 연구함으로써 제시될 수 있다. 이런 절차는 또한 약제의 투여 순서, 즉, 운반 전, 동시, 또는 운반 후를 결정하는데도 사용될 수 있다. 그러한 스케쥴링은 여기에서 확인된 모든 활성제의 특징일 수 있다.
바람직한 양태에 따라서, 본 발명은 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염과, 단백질 BiP의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제 (WO2013/124484 참조)를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 단백질 BiP의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 화합물이 발프로산 또는 이들의 유도체, 트리코스타틴 A, 리튬, 1-(3,4-디히드록시-페닐)-2-티오시아네이트-에탄온, 및 엑센딘-4로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 양태에 따라서, 단백질 BiP가 발프로산 또는 2-엔-발프로산과 같은 이들의 유도체이다.
바람직한 양태에 따라서, 본 발명은 PPP1R15A 경로와 관련 있으며 단백질 미스폴딩 스트레스 및 특히 미스폴딩된 단백질의 축적과 관련 있는 질환을 치료하기 위한, 화학식 (I)의 PPP1R15A 억제제 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염과, 단백질 BiP의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 질환이 타우병증, 퇴행성신경질환, 폴리글루타민 및 폴리알라닌 질환, 백질이영양증, 사르코-마리-투스 질환, 세이피노병증, 낭포성 섬유증, 다발성 경화증, 리소좀 축적 질환, 아밀로이드증 질환, 망막 질환, 염증, 대사 질환, 심혈관 질환, 골다공증, 신경계 트라우마, 허혈증의 그룹에서 선택된다.
분석법(assay)
본 발명의 추가 양상은 PPP1R15A-PP1을 억제할 수 있는 추가의 후보 화합물을 확인하기 위한 분석법에 상기 기재된 바와 같은 화합물을 사용하는 것에 관한 것이다.
바람직하게는, 이 분석법이 경쟁적 결합 분석법(competitive binding assay)이다. 더욱 바람직하게는, 경쟁적 결합 분석법이 본 발명의 화합물과 PPP1R15A-PP1 및 후보 화합물을 접촉시키고 본 발명에 따르는 화합물과 PPP1R15A-PP1 간의 상호반응에서 임의의 변화를 검출하는 것을 포함한다.
바람직하게는, 후보 화합물이 본 발명의 화합물의 통상의 SAR 변형에 의해 발생한다. 여기에서 사용되는 바와 같이, 용어 "통상의 SAR 변형"은 화학적 유도체화 방식에 의해 주어진 화합물을 변화시키기 위한, 당해 분야에 알려진 표준 방법을 언급한다.
따라서, 하나의 양상으로, 상기 확인된 화합물이 다른 화합물들을 개발하기 위한 모델 (예를 들면, 템플레이트(template))로 작용할 수 있다. 그러한 시험에 사용되는 화합물은 용액에서 자유로울 수 있거나, 고체 지지체에 고정될 수 있거나, 세포 표면 위에 실려있거나, 세포 내에 위치할 수 있다. 활성의 폐지(abolition) 또는 화합물과 시험할 약제 간의 결합 복합체의 형성을 측정할 수 있다.
본 발명의 분석법은 스크린일 수 있으며, 이에 의하여 다수의 약제들이 시험된다. 하나의 양상으로, 본 발명의 분석법이 고 처리율 스크린(high through-put screen)이다.
본 발명은 또한 화합물에 특이적으로 결합할 수 있는 무력화 항체(neutralising antibody)가 화합물로의 결합에서 시험 화합물과 경쟁하는 경쟁적 약물 스크리닝 분석법의 사용을 고려한다.
다른 스크리닝 기술은 물질에 대해 적합한 결합 친화성을 갖는 약제의 고 처리율 스크리닝 (HTS)을 제공하고 WO 84/03564에 상세하게 기재되어 있는 방법에 기초한다.
본 발명의 분석법들은 정량적 분석뿐만 아니라 시험 화합물들의 소 및 대규모 스크리닝 모두에 대해서 적합할 것으로 기대된다.
바람직하게는, 상기 경쟁적 결합 분석법이 본 발명의 화합물을 PPP1R15A-PP1과, PPP1R15A-PP1의 공지의 기질의 존재하에서 접촉시키는 단계 및 상기 PPP1R15A-PP1과 상기 공지의 기질 간의 상호반응에서의 임의의 변화를 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가 양상은 PPP1R15A-PP1에 대한 리간드의 결합을 검출하는 방법을 제공하며, 이 방법은:
(i) 리간드를 공지의 기질의 존재하에서 PPP1R15A-PP1과 접촉시키는 단계;
(ii) PPP1R15A-PP1과 상기 공지의 기질 간의 상호반응에서 임의의 변화를 검출하는 단계를 포함하며;
여기서 상기 리간드는 본 발명의 화합물이다.
본 발명의 하나의 양상은
(a) 상기 기재된 분석법을 수행하는 단계;
(b) 리간드 결합 도메인에 결합할 수 있는 리간드 하나 이상을 확인하는 단계; 및
(c) 상기 하나 이상의 리간드를 일정량 제조하는 단계를 포함하는 공정(process)에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 양상은
(a) 상기 기재된 분석법을 수행하는 단계;
(b) 리간드 결합 도메인에 결합할 수 있는 리간드 하나 이상을 확인하는 단계; 및
(c) 상기 하나 이상의 리간드를 포함하는 약학 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 공정(process)을 제공한다.
본 발명의 다른 양상은
(a) 상기 기재된 분석법을 수행하는 단계;
(b) 리간드 결합 도메인에 결합할 수 있는 리간드 하나 이상을 확인하는 단계;
(c) 상기 리간드 결합 도메인에 결합할 수 있는 리간드 하나 이상을 변형시키는 단계;
(d) 상기 기재된 분석법을 수행하는 단계;
(e) 선택적으로, 상기 하나 이상의 리간드를 포함하는 약학 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 공정(process)을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 기재된 방법에 의해 확인된 리간드에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 기재된 방법에 의해 확인된 리간드를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양상은 상기 정의된 바와 같은 미스폴딩된 단백질의 축적과 관련있는 질환의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물의 제조에 상기 기재된 방법에 의해 확인된 리간드를 사용하는 것에 관한 것이다.
상기 방법들을 사용하여 PPP1R15A-PP1의 억제제로서 유용한 리간드를 스크리닝할 수 있다.
화학식 (I)의 화합물은 실험 도구로서 및 치료제로서 모두 유용하다. 실험실에서 본 발명의 특정 화합물들은 알려지거나 새롭게 발견된 타겟이 질병 상태의 확립 또는 진행 중 임계 또는 적어도 유의적인 생화학적 기능에 기여하는지를 규명하는데 유용하고, 공정은 보통 '타겟 검증(target validation)'으로 언급된다.
본 발명은 하기와 같은 비-제한 실시예들을 참고로 하여 추가로 기재된다.
실시예
1 - 재료 & 방법
화합물 3은 Chembridge ref: 5173161로부터 구입하였음
화합물 4는 Chemdiv ref: 0589-0012로부터 구입하였음
화합물 5는 Chemdiv ref: 1683-6502로부터 구입하였음
1.1 - 본 발명에 따르는 화합물의 제조
반응물과 상업적 화합물은 Acros Organics, Sigma-Aldrich로부터 구입하였다. 본 발명에 따르는 화합물은 하기와 같은 일반적인 공정에 따라서 제조될 수 있다:
일반적인 공정 A:
Figure 112016125037009-pct00031
에탄올 (300 ml) 중 벤즈알데히드 (1 당량)의 용액에 아미노구아니딘 히드로클로라이드 (1 당량)과 나트륨 아세테이트 (1 당량)을 25℃에서 차례로 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 80℃에서 다음 ∼6시간 동안 가열하였다. 이동상으로 디클로로메탄/메탄올(8/2)을 사용하는 TLC 상에서 반응 완료를 모니터하였다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 25℃로 냉각시키고 NaHCO3 (700 ml)의 포화 용액에 덤핑시켰다. 생성된 침전물을 진공하에서 여과하고 물(100 ml)로 세척하였다. 생성된 고체 물질을 디에틸에테르 (2 x 25 ml)로 연마하고 진공하에서 건조시켜 목적하는 치환된 아미노구아니딘 유도체를 제공하였다.
다음 화합물들을 일반적인 공정 A에 따라서 제조하였다:
화합물 1: 2-(2-클로로벤질리덴)히드라진카르복스이미드아미드
2-클로로벤즈알데히드 (10 g)로부터 일반적인 공정 A에 따라 제조하여 11.1 g의 목적하는 화합물을 수득하였다 (수율: 79.6%). 1H-NMR (DMSO-d 6 ): δ (ppm) 5.66 (s, 2H); 6.05 (s 브로드, 2H); 7.27 (m, 2H); 7.40 (m, 1H); 8.14 (dd, 1H); 8.27 (s, 1H); MS (ESI+): m/z = 197.2 [M+H]+.
화합물 2: 2-(2-클로로벤질리덴)히드라진카르복스이미드아미드 아세테이트
메탄올 (450 ml) 중 2-클로로벤즈알데히드 (30.3 g)과 아미노구아니딘 비카르보네이트 (29.0 g)의 현탁액에 아세트산 (30 ml)을 25℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 70℃에서 30분간 교반시켰다. 이동상으로 디클로로메탄/메탄올(8/2)을 사용하는 TLC 상에서 반응 완료를 모니터하였다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 25℃로 냉각시키고 진공하에서 농축시켰다. 잔사를 메탄올 (250 ml)에 현탁시키고 불용성 물질을 여과시켜 제거하였다. 생성된 여액을 진공하에서 농축시키고 상기 언급한 공정 (메탄올 중 현탁 + 여과)을 3회 이상 반복하였다. 이후, 고체 물질을 디에틸 에테르 (3 x 100 ml)로 연마하고 진공하에서 건조시켜 46.0 g의 2-(2-클로로벤질리덴)히드라진카르복스이미드아미드 아세테이트 염을 수득하였다. (수율: 84.2%) LC-MS: m/z= 197.2 (M+H). 1H-NMR (DMSO-d 6 ): δ (ppm) 1.81 (s, 3H), 7.12 (m, 4H); 7.34 (m, 2H); 7.46 (m, 1H); 8.22 (m, 1H); 8.36 (s, 1H); LC-MS: m/z= 197.2 [M+H]+.
화합물 6: 2-[(3-클로로피리딘-4-일)메틸리덴]히드라진카르복스이미드아미드
2-클로로벤즈알데히드 (0.5 g)로부터 일반적인 공정 A에 따라 제조하여 0.16 g의 목적하는 화합물을 수득하였다 (수율: 23%). 1H-NMR (DMSO-d 6 ): δ (ppm) 6.00 (s 브로드, 2H); 6.32 (s 브로드, 2H); 8.10 (d, 1H); 8.14 (s, 1H); 8.35 (dd, 1H); 8.52 (s, 1H); MS (ESI+): m/z = 198.0 [M+H]+.
화합물 7: 2 -[(3- 클로로피리딘 -4-일) 메틸리덴 ] 히드라진카르복스이미드아미드 아세테이트
메탄올 (28 ml) 중 3-클로로이소니코틴알데히드 (2.0 g)과 아미노구아니딘 비카르보네이트 (2.12 g)의 현탁액에 아세트산 (2 ml)을 25℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 70℃에서 ∼2시간 동안 교반시켰다. 이동상으로 디클로로메탄/메탄올(8/2)을 사용하는 TLC 상에서 반응 완료를 모니터하였다. 반응 완료 후, 조(crude) 혼합물을 25℃로 냉각시키고 진공하에서 농축시켰다. 고체 물질을 메탄올:디에틸 에테르 (9:1)(4 x 50 ml)로 연마하고 진공하에서 건조시켜 2.0 g의 2-[(3-클로로피리딘-4-일)메틸리덴]히드라진카르복스이미드아미드 아세테이트 염을 수득하였다 (수율: 55.1%). 1H-NMR (DMSO-d 6 ): δ (ppm) 6.01 (brs, 2H); 6.48 (m, 4H); 8.12 (d, 1H); 8.16 (s, 1H); 8.38 (dd, 1H); 8.54 (s, 1H); MS (ESI+): m/z = 198.1 [M+H]+.
화합물 8: 2 -(2- 클로로 -6- 플루오로벤질리덴 ) 히드라진카르복스이미드아미드 아세테이트
메탄올 (22 ml) 중 2-클로로-6-플루오로벤즈알데히드 (1.5 g)과 아미노구아니딘 비카르보네이트 (1.29 g)의 현탁액에 아세트산 (1.5 ml)을 25℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 70℃에서 ∼1시간 동안 교반시켰다. 이동상으로 디클로로메탄/메탄올(8/2)을 사용하는 TLC 상에서 반응 완료를 모니터하였다. 반응 완료 후, 혼합물을 25℃로 냉각시키고 진공하에서 농축시켰다. 생성된 고체 물질을 메탄올:디에틸 에테르 (9:1)(3 x 50 ml)로 연마하고 진공하에서 건조시켜 2.2 g의 2-(2-클로로-6-플루오로벤질리덴)히드라진카르복스이미드아미드 아세테이트 염을 수득하였다 (수율: 84.8%). 1H-NMR (DMSO-d 6 ): δ (ppm) 1.89 (s, 3H), 6.13 (s 브로드, 4H); 7.24 (m, 1H); 7.33 (m, 2H) 8.17 (s, 1H); MS (ESI+): m/z = 215.1 [M+H]+.
화합물 9: 2-(2-클로로-4-메틸벤질리덴)히드라진카르복스이미드아미드
2-클로로-4-메틸벤즈알데히드 (0.2 g)으로부터 일반적인 공정 A에 따라서 제조하여 목적하는 화합물 255 mg을 수득하였다 (수율: 93.8%). 1H-NMR (DMSO-d 6 ): δ(ppm) 2.29 (s, 3H); 5.60 (s 브로드, 2H); 6.00 (s 브로드, 2H); 7.10 (d, 2H); 7.27 (s, 1H); 8.02 (d, 1H); 8.24 (s, 1H); MS (ESI+): m/z = 210.9 [M+H]+.
화합물 10: 2-(2-클로로-5-메틸벤질리덴)히드라진카르복스이미드아미드
2-클로로-5-메틸벤즈알데히드 (0.2 g)으로부터 일반적인 공정 A에 따라서 제조하여 목적하는 화합물 156 mg을 수득하였다 (수율: 57.4%). 1H-NMR (DMSO-d 6 ): δ(ppm) 2.30 (s, 3H); 5.64 (s 브로드, 2H); 6.06 (s 브로드, 2H); 7.07 (d, 2H); 7.27 (d, 1H); 7.97 (s, 1H); 8.24 (s, 1H); MS (ESI+): m/z = 210.9 [M+H]+.
화합물 11: 2-(2-클로로-3-메틸벤질리덴)히드라진카르복스이미드아미드
2-클로로-3-메틸벤즈알데히드 (0.2 g)으로부터 일반적인 공정 A에 따라서 제조하여 목적하는 화합물 226 mg을 수득하였다 (수율: 83.1%). 1H-NMR (DMSO-d 6 ): δ(ppm) 2.17 (s, 3H); 5.64 (s 브로드, 2H); 6.03 (s 브로드, 2H); 7.18 (t, 2H); 7.24 (d, 1H); 7.99 (s, 1H); 8.37 (s, 1H); MS (ESI+): m/z = 210.9 [M+H]+.
본 발명에 따르는 선택된 화합물이 하기 표 3에 기재되어 있다:
화합물 번호 구조 화학명
화합물 1
Figure 112016125037009-pct00032
 2-(2-클로로벤질리덴)히드라진카르복스이미드아미드
화합물 2
Figure 112016125037009-pct00033
 2-(2-클로로벤질리덴)히드라진카르복스이미드아미드 아세테이트
화합물 3
Figure 112016125037009-pct00034
 2-(2-브로모벤질리덴)히드라진카르복스이미드아미드
화합물 4
Figure 112016125037009-pct00035
 2-(2-메톡시벤질리덴)히드라진카르복스이미드아미드
화합물 5
Figure 112016125037009-pct00036
 3-{[(2-클로로벤질리덴)아미노]메틸l}-6-메틸-1,2,4-트리아진-5(4H)-온
화합물 6
Figure 112016125037009-pct00037
 2-[(3-클로로피리딘-4-일)메틸리딘]히드라진카르복스이미드아미드
화합물 7
Figure 112016125037009-pct00038
 2-[(3-클로로피리딘-4-일)메틸리덴]히드라진카르복스이미드아미드 아세테이트
화합물 8
Figure 112016125037009-pct00039
 2-(2-클로로-6-플루오로벤질리덴)히드라진카르복스이미드아미드 아세테이트
화합물 9
Figure 112016125037009-pct00040
 2-(2-클로로-4-메틸벤질리덴)히드라진카르복스이미드아미드
화합물 10
Figure 112016125037009-pct00041
 2-(2-클로로-5-메틸벤질리덴) 히드라진카르복스이미드아미드
화합물 11
Figure 112016125037009-pct00042
 2-(2-클로로-3-메틸벤질리덴)히드라진카르복스이미드아미드
하기 실험 중 일부에서, 이들 화합물의 염이 사용될 수 있다.
1.2 - 포유동물 세포 컬쳐(cell culture), 작제물 및 형질감염
HeLa 세포들을 글루타민, 나트륨 피루베이트, 비-필수 아미노산, 페니실린 및 스트렙토마이신 (Lonza)이 보충되어 있으며, 10% 태소혈청 (FBS)(Biowest)을 함유하는 이글 최소 필수 배지(Eagle's Minimum Essential Medium: EMEM)에서 배양시켰다. 293T 세포들을 페니실린, 스트렙토마이신, 글루타민 (Lonza) 및 10%의 태소혈청(FBS)(Biowest)이 보충된 듈베코의 개량된 이글 배지(Dubelcco's Modified Eagle's Media: DMEM)에서 배양시켰다.
Min6 세포들은 페니실린, 스트렙토마이신, 글루타민, 나트륨 피루베이트, 50 μM β-머캅토에탄올 및 15% 태소혈청 (FBS)(Biowest)이 보충된 DMEM에서 배양시켰다.
INS1 세포들은 페니실린, 스트렙토마이신, 글루타민, 나트륨 피루베이트(Lonza), 50 μM β-ME 및 10% 태소혈청 (FBS)(Biowest)이 보충된 RPMI에서 배양시켰다. 각 세포주는 5% CO2 대기 중 37℃에서 유지시켰다.
PLP1, DM20 및 인슐린에 대한 인간 개방 판독 프레임 (ORF) 서열들은 Life Technologies (Invitrogen) (각각 IOH41689, IOH5252 및 IOH7334)로부터 입수하였다. 발현 플라스미드 pDEST26 (Invitrogen)로의 작제물 복제는 Gateway® LR Clonase™ II Enzyme Mix (Invitrogen)에 의해 수행되었다. ORF 돌연변이는 QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) (PLP1과 DM20 ORFs의 경우, T181P 돌연변이, 인슐린 ORF의 경우 Akita (C96Y))를 사용하여 수행되었다.
포유동물 세포로의 유전자 발현은 Amaxa™ 4D-Nucleofector™ System (Lonza)을 사용한 핵형질감염(nucleofection)에 의해 또는 Lipofectamine (Life technologies)를 사용하는 형질감염에 의해 수행되었다.
1.3 - ER 스트레스로부터의 세포보호작용
이 분석법은 문헌: Tsaytler et al. (Science 2011)에 기재되어 있다.
HeLa 세포들을 37℃의 5% CO2 대기에서, 글루타민, 나트륨 피루베이트, 비-필수 아미노산, 페니실린 및 스트렙토마이신 (Lonza)이 보충되어 있으며, 10% 태소혈청 (FBS)을 함유하는 이글 최소 필수 배지(EMEM)에서 배양시켰다. 세포들을 96개 웰 플레이트에 17,000개 세포/mL의 밀도로 처리 전날 플레이팅시켰다. 포스파타제 억제제 (0.5-10 μM)와 함께 5 ㎍/mL 튜니카마이신 (Sigma-Aldrich)을 첨가함으로써 ER 스트레스를 끌어냈다. 6시간 후에 배지를 신선한 배지로 교체하고 세포보호작용은 포스파타제 억제제 (0.5-10 μM)를 첨가하여 유지시켰다. 세포 생존능은 튜니카마이신 처리 후 48시간 또는 72시간에, Cell Counting Kit-8 (Sigma)를 사용하여 공급자의 권고사항에 따라 WST-8의 포르마잔으로의 감소를 측정하여 평가하였다.
ER 스트레스로부터의 세포보호작용은 ER 스트레스 후 참고 화합물인 구아나벤즈 (Tsaytler et al., Science 2011)와 비교하여 세포보호 역가 효과 면에서 측정한다:
- '-' 세포보호 효과 없음;
- '+' 구아나벤즈와 비교하여 더 낮은 세포보호 효과;
- '++' 구아나벤즈와 비교하여 유사한 세포보호 효과.
표 4에는 튜니카마이신에 6시간 노출시킴으로써 유도되는 스트레스 후, 구아나벤즈와 비교하여, 본 발명의 다른 화합물들의 세포보호 효과의 결과가 요약되어 있다.
1.4 - 스트레스를 받지 않은 세포들에서 번역율의 평가
HeLa 세포들 (100,000개 세포/ml)을 각 실험 24시간 전에 6개-웰 플레이트에 플레이팅하고 처리하지 않고 남겨두거나 화합물 (50 μM)로 2.5, 5 및 9시간 동안 처리하였다. 화합물을 첨가하기 30분 전에 컬쳐 배지를 메티오닌이 없는 DMEM 배지 (Invitrogen)으로 대체하였다. 각 시점 1시간 전에, 50 μM의 Click-iT® AHA (L-아지도호모알라닌) (Invitrogen)를 컬쳐 배지에 첨가하여 새로 합성된 단백질이 표지화되도록 하였다. 각 시점의 끝에, 세포들을 빙냉 PBS로 세척하고 트립신 용해(Lonza)에 의해 하베스트한 다음, 1%의 SDS (Sigma)와 프로테아제 및 포스파타제 억제제 (Sigma)를 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액에 용해시켰다. 단백질 샘플들을 알킨 바이오틴 (Invitrogen)에 Click-iT® 단백질 반응 완충액 키트 (Invitrogen)를 사용하여 커플링시켰다. 샘플들을 70℃에서 10분간 변성시키고, ECL 4-20% 미리 캐스팅된 겔 (GE Healthcare) 상에 다시 용해시켜 니트로셀룰로오스 막 (GE Healthcare)로 옮겼다. 새로 합성된 단백질에 포함된, Click-iT® AHA에 커플링되어 있는 알킨 바이오틴을 스트렙트아비딘-HRP (Gentex)를 사용하여 검출하였다. ECL Prime (GE Healthcare)을 배양시켜 드러나도록 하여 Fusion Solo 3S(Vilber Lourmat)를 사용하여 화학발광에 의해 판독하였다.
1.5 - 스트레스를 받은 세포들에서의 번역율의 평가
스트레스를 받지 않은 세포들에서의 번역 측정에 대해서와 같이 처리들을 수행하였는데, 튜니카마이신 (5 ㎍/mL)을 화합물들과 함께 첨가하는 것이 예외였다.
1.6 - 아드레날린성 α2A 수용체에 대한 기능성 GPCR 분석법 ( CellKey 검출법)
화합물의 작용제 활성은 인간의 알파2A 수용체를 내생적으로 발현시키는 CHO 세포에서 평가하였으며 CellKey 검출법을 사용하여 임피던스 변조(impedance modulation)에 대한 이들의 효과를 측정하여 결정하였다.
실험을 시작하기 전에 세포들을 96개-웰 플레이트상에 6x104 개의 세포/웰의 밀도로, 0.1% BSA가 있는, HBSS 완충액 (Invitrogen) + 20 mM HEPES (Invtrogen)에 씨딩하여 28℃에서 60분간 평형화 되도록 하였다. 플레이트를 시스템 상에 놓고 28℃의 온도에서 측정하였다. 용액은 통합 유액 시스템: HBSS (기본 대조군), 100 nM의 참고 작용제 (자극된 대조군), 참고 작용제 (EC50 측정) 또는 시험 화합물을 사용하여 96개 웰 모두에 동시에 첨가하였다. 임피던스 측정은 리간드 첨가 후 10분간 모니터하였다. 표준 참고 작용제는 에피네프린으로, 이는 7개의 농도로 각 실험에서 시험하여 농도-반응 곡선을 발생시키고, 이로부터 이의 EC50 값을 계산한다.
시험 화합물로부터 투여량-반응 데이터는 Hill 공식 곡선 피팅법을 사용하여 평균 중복 값으로 발생된 농도-반응 곡선의 비-선형 회귀 분석법을 사용하여 Hill 소프트웨어로 분석하였다. 결과가 표 4에 제시되어 있으며, EC50 > 33.3 μM인 화합물은 유의적인 알파-2 아드레날린성 활성을 갖지 않는 것으로 간주된다.
1.7 - 시험관내 다발성 경화증 질환 모델: 신경세포와 함께 배양된 인터페론-감마 손상 받은 래트 올리고덴드로사이트
신경세포와 함께 배양된 올리고덴드로사이트의 컬쳐
신경세포/OPC를 이전에 문헌: Yang et al. (2005 J Neurosci Methods;149(1) pp50-6)에 기재된 바와 같이 변형시켜 배양하였다. 간략하면, 17-일령의 래트 배아로부터 수득한 전체 뇌 (소뇌 없이)(Wistar, Janvier labs)를 회수하였다. 상기 전 뇌를 20분간 37℃에서 트립신-EDTA (Pan Biotech) 용액으로 0.05% 트립신 및 0.02% EDTA의 최종 농도로 처리하였다. 4.5 g/리터의 글루코오스 (Pan Biotech)가 있으며, DNAse I 그레이드 II (최종 농도 0.5 mg/ml; Pan Biotech, Batch: H140508) 및 10% 태소 혈청 (FCS; Invitrogen, Batch: 41Q7218K)을 함유하는 듈베코의 개질된 이글 배지 (DMEM)를 첨가하여 분해를 중단시켰다. 10-ml 피펫의 팁을 통하여 3회 강제로 통과시켜 세포들을 기계적으로 분리시켰다. 이어서, 세포들을 515 g로 10분간 4℃에서 원심분리시켰다. 상등액을 버리고, 펠릿은 B27 보충물 (Invitrogen, Batch: 1660670)의 2% 용액, 2 mmol/리터의 L-글루타민 (Pan Biotech), 2%의 PS 용액, 및 1%의 FCS와 10 ng/ml의 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF-AA, Batch: H131205)가 있는 Neurobasal 배지 (Invitrogen, Batch: 1636133)로 구성되어 있는 확정된 컬쳐 배지에 다시 현탁시켰다. 세포들을 PLL (BD corning, Batch: 6614022)과 라미닌 (Sigma, Batch: 083M4034V)으로 미리 코팅시킨 96개-웰 플레이트 중의 웰 당 20,000개의 세포 밀도로 씨딩하였다. 이 플레이트를 37℃의 습화된 인큐베이터에, 공기 (95%)-CO2(5%) 대기 중에서 유지시켰다. 배지의 절반을 2일 마다 신선한 배지로 교환하였다. 18일째에, 인터페론-감마(70 U/ml, 48H, R&D system, Batch: AAL2214081) 적용하기 1시간 전에 시험 화합물을 미리-배양시켰다.
시험 화합물들과 인터페론-감마 노출
배양 18일째에, 시험 화합물 (4개의 농도)을 컬쳐 배지에 용해시킨 다음 신경세포와 함께 배양된 올리고덴드로사이트와 함께 인터페론-감마 (70 U/ml, 48H) 적용시키기 1시간 전에 미리 배양시켰다. 시험 화합물 배양한 지 1시간 후, 인터페론-감마를 70 U/ml 농도로 48시간 동안 여전히 시험 화합물의 존재하에서 첨가하였다. 이어서, 세포들을 에탄올 (95%, Sigma, Batch: SZBD3080V)과 아세트산 (5%, Sigma, Batch: SZBD1760V)의 차가운 용액으로 5분간 -20℃에서 고정시켰다. 0.1%의 사포닌 (Sigma, Batch: BCBJ8417V)으로 침투시킨 후, 세포들을 마우스에서 생산된 모노클로날 항-O4 항체 (Sigma, batch: SLBF5997V)와 함께 1% FCS, 0.1% 사포닌을 함유하는 PBS (PAN, Batch: 8410813) 중에 1/1000의 희석액으로 2시간 동안 실온에서 배양시켰다. 이 항체는 1% FCS, 0.1% 사포닌을 함유하는 PBS 중 1/400의 희석액으로, 1시간 동안 실온에서 Alexa Fluor 488 염소 항-마우스 IgG (Invitrogen, batch: 1664729)에 의해 드러난다.
O4 세포들의 총수의 분석
각 조건에 대해, ImageXpress (Molecular Device)를 사용하여 20배의 확대비로 웰 당 30개의 사진을 찍었다. 동일한 조건들에 대해서도 모든 영상들을 찍었다. O4 세포들의 총수의 분석은 Custom 모듈 에디터 (Molecular Device)에 의해 자동적으로 수행되었다. 데이터는 대조 조건들 (중독 없음, 인터페론-감마 없음 = 100%)의 퍼센트로 표시하여 인터페론-감마 손상을 표시하도록 하였다. 모든 값들은 평균 +/- SEM (표준오차)(n = 조건 당 6개의 웰)으로 표시하였다.
1.8 - 시험관내 파킨슨병 모델: 로테논 손상을 받은 1차 중뇌 래트 신경세포
중뇌 도파민성 신경세포의 컬쳐
래트의 도파민성 신경세포들을 문헌: Schinelli et al., (1988 J. Neurochem 50 pp1900-07) 및 Visanji et al., (2008 FASEB J. 22(7) pp2488-97)에 기재된 바와 같이 배양시켰다. 간략하면, 15일령의 래트 배아(15-day old rat embryos)(Janvier Labs, France)로부터 입수한 중뇌(midbrain)를 현미경 하에서 절제하였다. 배아의 중뇌를 회수하여 2%의 페니실린-스트렙토마이신 (PS, Pan Biotech, Batch: 1451013) 및 1%의 소 혈청 알부민 (BSA, Pan Biotech, Batch: h140603)을 함유하는 Leibovitz (L15, Pan Biotech, Batch: 9310614)의 빙냉 배지에 놓았다. 중뇌 플렉쳐(flexure)의 등쪽 부분, 도파민성 신경세포가 풍부한 발달중인 뇌의 영역을 세포 제조용으로 사용하였다.
중뇌는 20분간 37℃에서 트립신처리법 (Trypsin 0.05% EDTA 0.02%, PanBiotech, Batch: 5890314)에 의해 분리시켰다. DNAse I 그레이드 II (0.1 mg/ml; Pan Biotech, Batch: H140508) 및 10% 태소 혈청 (FCS; Invitrogen, Batch: 41Q7218K)를 함유하는 듈베코의 개질된 이글 배지 (DMEM, PanBiotech, Batch: 1300714)를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 이어서, 10ml 피펫의 팁을 통하여 3회 강제로 통과시켜 세포들을 기계적으로 분리시켰다. 이어서, 세포들을 L15 배지 중 BSA(3.5%)의 층 위에서 180 xg로 10분간 4℃에서 원심분리시켰다. 상등액을 버리고, 펠릿은 B27 (2%, Invitrogen, Batch: 1660670), L-글루타민 (2 mM, Pan Biotech) 및 2%의 PS 용액, 및 10 ng/ml의 뇌-유래 신경성장인자 (BDNF, PanBiotech, Batch: H140108) 및 1 ng/ml의 신경교-유래 신경성장인자 (GDNF, Pan Biotech, Batch: H130917)가 보충된 Neurobasal (Invitrogen, Batch: 1636133)로 구성되어 있는 확정된 컬쳐 배지에 다시 현탁시켰다. 생존 가능한 세포들을 트립판 블루 배제 시험을 사용하여 Neubauer 세포계산기에서 계수하였다. 폴리-L-라이신 (Corning Biocoat, Batch: 6614022)으로 미리 코팅시킨 96개-웰 플레이트 중에 웰 당 40,000개의 세포 밀도로 씨딩하고, 37℃의 습화된 인큐베이터에, 5% CO2/95% 공기 대기 중에서 유지시켰다. 배지의 절반을 2일 마다 신선한 배지로 교환하였다.
배양 6일 째에, 배지를 회수하고 로테논(rotenone; Sigma, Batch: 021M2227V)없이 또는 이와 함께, 대조군 배지에 희석된 10 nM로 신선한 배지를 가하고, 조건 당 3개의 웰을 평가하였다. 시험 화합물을 컬쳐 배지에 용해시킨 다음 로테논 적용 1시간 전에 중뇌 신경세포와 함께 미리-배양시켰다.
중독(intoxication)시킨 지 24시간 후, 세포들을 PBS(Pan Biotech, Batch: 4831114) 중 4% 파라포름알데히드 (Sigma, batch SLBF7274V)의 4% 용액, pH = 7.3으로 20분간 실온에서 고정시켰다. 세포를 PBS에서 다시 2회 세척한 다음, 침투시키고 비-특이적 부위는 0.1%의 사포닌 (Sigma, batch: BCBJ8417V)과 1% FCS를 함유하는 PBS 용액으로 15분간 실온에서 차단시켰다. 이어서, 세포들을 마우스에서 생산된 모노클로날 항-티로신 히드록실라제 항체 (Sigma, batch: 101M4796)와 함께 1% FCS, 0.1% 사포닌을 함유하는 PBS 중에 1/10,000의 희석액으로 2시간 동안 실온에서 배양시켰다. 이 항체는 1% FCS, 0.1% 사포닌을 함유하는 PBS 중 1/800의 희석액으로, 1시간 동안 실온에서 Alexa Fluor 488 염소 항-마우스 IgG (Molecular Probes, batch: 1531668)에 의해 드러난다.
TH 포지티브 신경세포의 총수의 분석
면역표지된 컬쳐들은 ImageXpress (Molecular device USA)에 의해 자동적으로 조사되었다. 각 조건에 대해, 3개의 웰로부터 웰 당 20개의 필드 (웰 전체 표면의 대략 80%를 나타냄)가 자동적으로 분석되었다. TH 신경세포의 총수는 Custom 모듈 에디터 (Molecular Device, USA)를 사용하여 자동적으로 분석되었다. 데이터는 대조 조건들 (중독 없음, 로테논 없음 = 100%)의 퍼센트로 표시하여 로테논 손상을 표시하도록 하였다. 모든 값들은 1개 컬쳐의 평균 +/- SEM (표준오차)(n = 컬쳐 당 조건 당 3개의 웰)으로 표시하였다.
1.9 - 시험관내 알쯔하이머병 모델: 아밀로이드-베타 1-42 손상 받은 1차 피질 래트 신경세포.
래트 피질 신경세포의 컬쳐
래트의 피질 신경세포들을 문헌: Singer et al., (1999 J. Neuroscience 19 pp2455-63) and Callizot et al., (2013 J.Neurosci. Res. 91 pp706-16)에 기재된 바와 같이 배양시켰다.
임신 15일 째에 임신한 암컷(Wistar; Janvier Labs)을 참수시켜 죽였다. 태아를 수거하여 2% 페니실린 (10,000 U/ml)과 스트렙토마이신 (10 mg/ml) 용액 (PS; Pan Biotech, Batch: 1451013) 및 1% 소혈청 알부민 (BSA; Pan Biotech, Batch: h140603)이 들어 있는 빙-냉 L15 Leibovitz 배지 (Pan Biotech, Batch: 9310614)에 즉시 놓았다. 피질을 20분간 37℃에서 트립신-EDTA (Pan Biotech, Batch: 5890314) 용액으로 0.05% 트립신 및 0.02% EDTA의 최종 농도로 처리하였다. 4.5 g/리터의 글루코오스 (Pan Biotech, batch: 1300714)가 있으며, DNAse I 그레이드 II (최종 농도 0.5 mg/ml; Pan Biotech, Batch: h140508) 및 10% 태소 혈청 (FCS; Invitrogen, Batch: 41Q7218K)을 함유하는 듈베코의 개질된 이글 배지 (DMEM)를 첨가하여 분해를 중단시켰다. 10-ml 피펫의 팁을 통하여 3회 강제로 통과시켜 세포들을 기계적으로 분리시켰다. 이어서, 세포들을 515 g로 10분간 4℃에서 원심분리시켰다. 상등액을 버리고, 펠릿은 B27 보충물 (Invitrogen, Batch: 1660670)의 2% 용액, 2 mmol/리터의 L-글루타민 (Pan Biotech, Batch: 8150713), 2%의 PS 용액, 및 10 ng/ml의 뇌 유래 신경성장 인자 (BDNF, Pan Biotech, Batch: H140108)가 있는 Neurobasal 배지 (Invitrogen, Batch: 1636133)로 구성되어 있는 확정된 컬쳐 배지에 다시 현탁시켰다. 생존 가능한 세포들을 트립판 블루 배제 시험을 사용하여 Neubauer 세포계산기에서 계수하였다. 세포들을 폴리-L-라이신 (Corning Biocoat, Batch: 6614022)으로 미리 코팅시킨 96개-웰 플레이트 중의 웰 당 30,000개의 세포 밀도로 씨딩하고, 37℃의 인큐베이터에, 공기(95%)- CO2(5%) 대기 중에서 배양시켰다. 배지는 2일마다 교환하였다. 피질 신경세포들을 배양 11일 후 A-베타 용액 (하기 참조)로 중독시켰다.
시험 화합물 및 아밀로이드-베타 1-42 노출
아밀로이드-베타 1-42 제조는 문헌: Callizot et al., 2013에 기재된 공정에 따라서 수행하였다. 간략하면, 아밀로이드-베타 1-42 펩타이드 (Bachem, Batch: 1014012)를 혈청이 없는, 상기 언급된 정의된 컬쳐 배지에, 40 μmol/리터의 초기 농도로 용해시켰다. 이 용액을 3일간 37℃의 암실에서 교반시키고 사용되는 농도로 컬쳐 배지에 적절하게 희석시킨 후 즉시 사용하였다.
시험 화합물을 컬쳐 배지에 용해시킨 다음 1차 피질 신경세포와 함께 아밀로이드-베타 1-42를 적용시키기 1시간 전에 미리 배양시켰다. 아밀로이드-베타 1-42 제제를 약물의 존재하에서 대조 배지에 희석시킨, 20 μM의 최종 농도 (WB로 측정한 독성 올리고머를 대략 2 μM 포함함)로 첨가하였다. 중독시킨 지 24시간 후, 세포들을 에탄올 (95%, Sigma, Batch: SZBD3080V)과 아세트산 (5%, Sigma, Batch: SZBD1760V)의 차가운 용액으로 5분간 -20℃에서 고정시켰다. 0.1%의 사포닌 (Sigma, Batch: BCBJ8417V)으로 침투시킨 후, 세포들을 마우스 모노클로날 항체 항 미세소관-결합-단백질 2 (MAP-2; Sigma, Batch: 063M4802)와 함께 1% 태소혈청 (Invitrogen, Batch: 41Q7218K)과 0.1% 사포닌을 함유하는 PBS (Pan biotech, Batch: 4831114) 중에 1/400의 희석액으로 2시간 동안 배양시켰다. 이 항체는 1% 태소혈청과 0.1%의 사포닌을 함유하는 PBS 중 1/400의 희석액으로, 1시간 동안 실온에서 Alexa Fluor 488 염소 항-마우스 IgG (Molecular probe, Batch: 1572559)에 의해 드러난다.
신경세포의 총수의 분석
면역표지된 컬쳐들은 20배의 확대비로 ImageXpress (Molecular device USA)에 의해 자동적으로 조사되었다. 각 조건에 대해, 3개의 웰로부터 웰 당 30개의 필드 (웰 전체 표면의 대략 80%를 나타냄)가 자동적으로 분석되었다. 신경세포의 총수는 Custom 모듈 에디터 (Molecular Device, USA)를 사용하여 자동적으로 분석되었다. 데이터는 대조 조건들 (중독 없음, 아밀로이드-베타 1-42 없음 = 100%)의 퍼센트로 표시하여 A-베타 1-42 손상을 표시하도록 하였다. 모든 값들은 평균 +/- SEM (표준오차)(n = 컬쳐 당 조건 당 3개의 웰)으로 표시하였다.
1.10 - 근위축성 측색 경화증( ALS )의 생체내 마우스 모델: SOD1 - G93A 형질전환 마우스
돌연변이된 인간 SOD1-G93A 형질전환(TG) 마우스를 발현시키는 형질전환 마우스 (이질접합 TgN-SOD1-G93A-1Gur; Gurney et al. (1994) Science 264, 1772-1775)와 5마리의 야생형 한배 새끼를 본 실험에 사용하였다. G93A SOD1 마우스는 반접합성 TG 수컷 (strain 002726M; B6SJL TG SOD1 x G93A 1GUR/J, JAX)과 JAX Laboratories USA로부터 얻은 WT 암컷 (strain 10012, JAX)을 교배시켜 Charles River Germany에 의해 사육되었다. 동물들은 다음과 같이 그룹으로 나누었다 (암컷과 수컷은 치료 그룹에 대등하게 분배, 즉, 각 치료 그룹이 동일한 수의 수컷과 암컷을 갖도록 노력하였다):
형질전환 G93A SOD1 마우스
·위관영양법(oral gavage)을 통하여 비히클 QD (즉, 일일 1회)로 처리된 12마리의 형질전환 G93A SOD1 마우스, 60일령에 시작하여 종점(end-point)까지 계속됨.
·위관영양법을 통하여 화합물 2 (1.5 mg/kg) BID (즉, 일일 2회)로 처리된 12마리의 형질전환 G93A SOD1 마우스, 60일령에 시작하여 종점까지 계속됨.
·위관영양법을 통하여 화합물 2 (3 mg/kg) QD로 처리된 12마리의 형질전환 G93A SOD1 마우스, 60일령에 시작하여 종점(end-point)까지 계속됨.
·위관영양법을 통하여 릴루졸 (riluzole; 20 mg/kg)과 함께 화합물 2 (3 mg/kg) QD로 처리된 12마리의 형질전환 G93A SOD1 마우스, 60일령에 시작하여 종점(end-point)까지 계속됨.
·위관영양법을 통하여 화합물 2 (10 mg/kg) QD로 처리된 12마리의 형질전환 G93A SOD1 마우스, 60일령에 시작하여 종점(end-point)까지 계속됨.
행동 시험
투여(dosing) 시작 (기준선, 60일) 전 및 대략 75일, 90일, 105일, 및 120일에 Rotarod 시험을 수행하였다. 로타로드 시험을 위하여 2 내지 4일 내에 태어난 마우스를 모았다. 1일 세션(session)은 로타로드 장치 (AccuScan Instruments, Columbus, USA) 위에서 4 RPM으로 5분간의 트레이닝 시행(training trial)을 포함한다. 30분 후, 360초에 걸쳐 속도를 0에서 40 RPM으로 변화시키면서 시행 간에 적어도 30분의 간격을 두고 6분간의 3회 연속 가속 시행에 대해 동물을 시험하였다. 로드로부터 떨어지기 까지의 레이턴시(latency)를 기록한다. 360초 이상 로드 위에 남아있는 마우스를 제거하고 이들의 시간은 360초로 점수를 매겼다.
1.11 - 사르코 -마리- 투스 1A 질병의 생체내 모델: PMP-22 과발현 형질전환 래트
수컷 PMP-22 래트 (Laboratory of Pr Nave, Max-Planck Institut fur experimentelle Medizin, Gottingen, Germany)와 암컷 Sprague-Dawley 래트 (Elevage Janvier, France)를 교배시켜 CMT1A 형질전환 래트를 얻었다. 동물들을 우리에 넣고 Key-Obs(Orleans, France)에 유지시켰다. 2010년 9월 22일의 EU Directive (2010/63/UE)를 엄격하게 고수하며 동물 절차를 수행하였다.
동물들을 다음과 같이 그룹으로 나누었다 (수컷 동물만 실험에 포함시켰다):
·위장관영양법을 통하여 비히클로 QD 처리한 8마리의 형질전환 래트, 5주령에 시작하여 종점까지 계속됨.
·위장관영양법을 통하여 화합물 2 (1 mg/kg)로 QD 처리한 8마리의 형질전환 래트, 5주령에 시작하여 종점까지 계속됨.
·위장관영양법을 통하여 화합물 2 (3 mg/kg)로 QD 처리한 8마리의 형질전환 래트, 5주령에 시작하여 종점까지 계속됨.
행동 시험
동물들을 처리 및 결과 측정을 위하여 무작위 맹검 방식(random and blind manner)으로 시험하였다. 행동 실험과 바(bar)의 판독을 수행하여 이 처리에 대해 알지 못하는 조사원에 의해 Key-Obs 장소에서 검증하였다. 처리한 지 3주 후 및 5주 후에 CMT1A 래트에 대해 바 시험(bar test)을 수행하였다. 바 시험은 고정된 로드 위에서 이의 4개의 발의 근육 강도와 평형 성능을 평가하는 것이다. 래트를 목재로 된 로드 (직경: 2.5 cm; 길이: 50 cm)의 중앙에 이의 발 4개가 놓이도록 한다. 각 시행에서 바 위에서 소요되는 시간 (떨어지기 까지의 레이턴시)과 떨어지는 수를 기록하였다. 5회 연속 시행을 수행하였다 (최대 60초).
1.12 - 백질이영양증(PMD)의 시험관내 모델: 인간 세포주에서 돌연변이된 PLP-1과 DM20의 과발현
형질감염 전 제1일에, 293T 세포들을 300,000개 세포/ml로 플레이팅하였다. 293T 세포들을 리포펙타민(Lipofectamine) 2000을 사용하여 제조업자의 절차에 따라서 PLP1과 DM20 돌연변이 작제물로 형질감염시켰다. 형질감염 후, 세포들을 분자들로 처리하거나 처리하지 않고 그대로 두었다. 대조군으로서, 세포들을 천연 형태(native form)의 단백질로 형질감염시켰다. 48시간 경과 후, 세포 용해물을 하베스트하였다. 단백질 축적량을 웨스턴-블롯(western-blot)으로 평가하였다.
1.13 - 2형 당뇨병의 시험관내 모델: Min6 및 INS1 세포주
ER 스트레스로부터 세포보호작용
세포들을 96개 웰 플레이트에 Min6 세포주의 경우 0.5.106개 세포/mL, INS1 세포주의 경우 0.4.106개 세포/mL의 밀도로 처리 전날 플레이팅하였다.
포스파타제 억제제와 함께 2.5 ㎍/mL 튜니카마이신 (Sigma Aldrich)을 첨가함으로써 ER 스트레스를 끌어냈다.
6시간 후에 배지를 신선한 배지로 교체하고 세포보호작용은 포스파타제 억제제를 첨가하여 유지시켰다.
세포 생존능은 튜니카마이신 처리 후 72시간에, Cell Counting Kit-8 (Sigma)을 사용하여 공급자의 권고사항에 따라 WST-8의 포르마잔으로의 감소를 측정하여 평가하였다.
미스폴딩된 프론 인슐린 아키타 의 축적으로부터 보호작용
Min6 세포들을 인슐린아키타 돌연변이 작제물로 핵형질감염시켜 96개 웰-플레이트에 300,000개 세포/mL로 씨딩하고 24시간 경과 후, 세포들을 분자로 처리하거나 처리하지 않고 그대로 두었다. 대조군으로서, 세포들을 비-관련 플라스미드로 핵형질감염시켰다. 6일 후, 선택제를 첨가하였다 (G418).
세포 생존능은 처리한 지 9일 후, Cell Counting Kit-8 (Sigma)을 사용하여 공급자의 권고사항에 따라 WST-8의 포르마잔으로의 감소를 측정하여 평가하였다.
1.14 - 시험관내 염증/감염 질환 모델: 폴리 I:C 유도된 마우스 배아 섬유아세포
실험 프로토콜
마우스 배아 섬유아세포들 (MEFs)을 폴리 I:C로 리포좀 감염시키고 2개 농도의 본 발명의 화합물 (25 μM)로 6시간 동안 처리하였다. 6시간의 배양 후, eIf2알파-포스포릴화 (eIf2a-P) 및 PPP1R15A (GADD34) 발현을 웨스턴 블로팅으로 모니터하는 한편, 타입-1 인터페론(IFN)-베타 생산량을 ELISA에 의해 컬쳐 상등액에서 정량하였다. 대조군 (nt)과 폴리 I:C/DMSO는 각각 네가티브 및 포지티브 대조군이다.
폴리 I:C (폴리이노신산:폴리시티딜산 또는 폴리이노신산-폴리시티딜산 나트륨 염)는 바이러스 감염증을 자극하기 위하여 사용되는 면역자극제이다. 이중사 RNA와 구조적으로 유사한 폴리 I:C는 B-세포 및 수지상 세포의 세포내 구획에서 발현되는 톨-유사 수용체 3과 상호반응하는 것으로 알려져 있다.
구아나벤즈 (25 μM)는 참고용 억제 화합물로 사용되었다.
세포 컬쳐
MEFs를 DMEM, 10% FCS (HyClone, Perbio), 100 units/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 2mM 글루타민, 1 x MEM 비-필수 아미노산 및 50 μM 2-머캅토에탄올 중에서 배양시켰다. MEFS를 표시된 시간 동안 리포펙타민 2000 (Invitrogen)과 함께 10 ㎍/ml의 폴리 I:C (InvivoGen)으로 처리하였다.
면역블로팅
세포들을 완전한 미니 프로테아제 억제제 칵테일 정제(Roche)가 보충된, 1% Triton X-100, 50 mM Hepes, 10 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2, 2 mM EDTA, 10% 글리세롤에 용해시켰다. 단백질 정량분석은 BCA 단백질 분석법 (Pierce)을 사용하여 수행하였다. 면역블로팅 및 화학발광 검출 (SuperSignal West Pico Chemi-luminescent Substrate, Pierce) 전에 25-50 ㎍의 Triton X-100-가용성 물질을 2%-12% 구배 또는 8% SDS-PAGE에 부하하였다. GADD34 (C-19)를 인식하는 토끼 폴리클로날 항체들은 Santa Cruz Biotechnology로부터 입수하였으며 항-eIF2알파[pS52]는 Invitrogen으로부터 입수하였다.
ELISA
컬쳐 상등액 중 IFN-베타 정량분석은 마우스 인터페론 베타 ELISA 키트 (PBL Interferon Source)를 사용하여 제조업자의 지침에 따라서 수행하였다.
1.15 - 생체내 망막 섬모병증 / 망막색소병변증 증상: BBBS12 녹아웃(knock-out) 마우스
녹아웃 마우스의 발생과 축산
Bbs12-/-/J 마우스를 C57BL/6 유전자 백그라운드 (Mockel et al., 2012 J. Biol. Chem. 287 pp37483-494)에 보호하였다. 마우스를 12시간의 명/암 사이클 상으로 습도- 및 온도-조절되는 실내에서 보호 사육하였는데 보통의 먹이(normal chow)와 물로의 접근은 자유롭게 하였다. Bbs12-/- 전체 녹-아웃 마우스는 KAPA 마우스 유전형질분석 키트 (Catalog #KK7302, Kapa Biosystems, Woburn, Massachusetts, USA)를 사용하여 폴리머라제 연쇄반응 (PCR)을 통한 유전형질분석에 의해 확인하였다.
초자체-내 주사용 시약
초자체내 주사용으로 사용되는 용액은 멸균 조건하에서 제조하였다. 이어서 1.25 mM의 화합물 2와 100 mM 발프로산 (VPA) 스톡 용액을 PBS, pH 6에 희석시켜 화합물 2 (2.5 μM) + VPA (0.2 mM)와 화합물 2 (2.5 μM) 용액을 수득하였다. 발프로산은 입수한 것이다 (Catalog # 4543, Sigma-Aldrich).
초자체-내 주사
Bbs12-/- 마우스 망막 표현형과 메커니즘은 공개되어 있다 (Mockel et al., 2012). 출생 후 14-16일째에 마우스에게 초자체 내로 주사하였다. 작업은 외과용 현미경하에서 수행되었다. 마우스를 이소플루란으로 마취시켰다. 마우스의 동공을 0.3% 아트로핀 점안액 (Alcon)으로 확장시켰다. 반복 디스펜서 (Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz, Switzerland)에 연결되어 있는 33-게이지 바늘을 연곽(limbus)으로부터 초자체강에 삽입하였다. 바늘의 위치는 현미경을 통하여 모니터하였다. 1 ㎕ 처리 용액을 마우스의 왼쪽 눈에 주사하고, 1 ㎕ PBS, pH 6은 대조군으로서 오른쪽 눈에 투여하였다. 초자체 출혈 또는 망막 손상이 있는 마우스는 분석에서 제외하였다.
망막전위도(Electroretinogram)
망막전위도(ERGs)는 HMsERG system (Ocuscience®, Kansas City, Missouri, USA)를 사용하여 초자체 내로 주사한 지 2주 후 수행하였다. 마우스를 밤새 암-적응시킨 다음 도미토르(domitor; 7.6 ㎍/g 체중)와 케타민(ketamine; 760 ㎍/g 체중)을 복강내로 주사하여 마취시켰다. 상기 기재된 바와 같이 동공을 확장시켰다. 이 실험은 딤 레드 라이트(dim red light; catalog # R125IRR, Philips, Suresnes, France)에서 수행되었다. ERGs 표준 절차는 제조업자의 프로토콜 (Ocuscience®, Kansas City, Missouri, USA)에 따라서 사용되었다. 간략하면, 이 프로토콜은 0.1 내지 25 cd.s/㎡ 범위의 강도로 광 자극시킨 후 암-적응된 ERG (암순응 ERG)를 기록하는 것이다. ERG 결과들을 ERG View 시스템 4.3 (Xenotec, Ocuscience®, Kansas City, Missouri, USA)에 의해 증폭시켜 디지털식으로 캡쳐하였다. 이후, 암순응 반응(scotopic response)의 a-파와 b-파를 측정하였다.
투과 전자현미경
카코딜레이트 완충액(Cacodylate buffer; 0.1M, pH 7.4) 중 2.5% 글루타르알데히드와 2.5% 파라포름알데히드에 담구어 샘플들을 고정시키고, 0.1M 카코딜레이트 완충액 중 1% 사산화오스뮴에 1시간 동안 4℃에서 후고정시키고 등급화된 알코올 (50, 70, 90, 100%)와 프로필렌 옥사이드를 통하여 각각 30분간 탈수시켰다. 샘플들을 Epon™ 812 (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri, USA)에 임베딩시켰다. 세미(semi)-얇은 섹션을 울트라-마이크로톰(ultra-microtome; Leica Ultracut UCT, Leica Biosystems, Wetzlar, Germany)을 사용하여 2 ㎛으로 절단하고 톨루이딘 블루로 염색하여 광학 현미경을 사용하여 조직학적으로 분석하였다. 초박(ultrathin) 섹션을 70 nm로 절단하고 우라닐 아세테이트와 시트르산납으로 대비시켜 70 kv에서 Morgagni 268D 전자 현미경으로 조사하였다. Mega View III 카메라 (Soft Imaging System)를 사용하여 화상을 디지털식으로 캡쳐하였다.
1.16 - 배양된 신생아 래트 심장근육세포에서의 저산소증-유도된 세포자멸
세포 컬쳐
신생아 래트 심장근육세포의 1차 컬쳐는 1-일령의 Sprague Dawley 래트 (Janvier, France)의 심실로부터 얻었다. 래트를 안락사시키고 이들의 심장을 절제하였다. 심장을 작은 조각 (1-2 ㎣)으로 절단하고 Neonatal Heart Dissociation Kit 래트와 gentleMACS™ Dissociator (MiltenyiBiotec, Germany)를 사용하여 효소적으로 분해시켰다. 분해 후, 균질물을 여과하여 (70 ㎛) 단일-세포 현탁액을 수득하였다. 단리된 세포들을 원심분리에 의해 수집하여 10% 말 혈청(HS), 5% 태소 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)에 다시 현탁시켰다. 비-근세포(myocyte)의 집단을 없애기 위하여 90분간 프리-플레이팅(pre-plating)시킴으로써 근세포가 풍부해지도록 하였다. 비-접착 세포들을 6개- 또는 96개-웰 플레이트에 적절한 세포 밀도로 플레이팅하였다. 세포들을 37℃의 95% 공기/5% CO2 중에서 24시간 동안 배양시켰다. 이어서, 정상 또는 저산소 (N2/CO2, 95%/5%; 0.3% O2) 컬쳐 챔버에서 배양시키기 30분 전에 컬쳐 배지를 1% FBS와 상이한 농도의 시험 화합물을 함유하는 신선한 DMEM으로 교환하였다.
시험 화합물로 처리
정제된 신생아 래트 심장근육세포를 유세포분석기(flow cytometry) 실험을 위하여 96개-웰 플레이트에 106개 세포/2 mL로 씨딩하였다.
24시간 후, 심장근육세포를 상이한 농도의 시험 화합물로 0.1% DMSO를 함유하는 컬쳐 배지에서 처리하였다. 포지티브 대조군 세포는 컬쳐 배지 (0.1% DMSO)로 처리하였다. 처리를 시작한 지 30분 후, 세포들을 저산소 컬쳐 챔버(N2/CO2, 95%/5%; 최종 측정된 O2: 0.3%)에서 36시간 동안 배양시켰다.
네가티브 대조군 세포는 37℃의 정상산소 조건에서 컬쳐 배지 (1% FBS, 0.1% DMSO)로 동일한 시간 기간 동안 처리하였다.
세포자멸 세포 측정
처리 기간의 끝에, 유세포분석을 수행하여 세포자멸 세포의 양을 측정하였다. Miltenyi로부터의 아넥신(Annexin) V-플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 세포자멸 검출 키트를 사용하였다. 세포들을 PBS로 2회 세척하여 결합 완충액에 다시 현탁시켰다. 제조업자의 프로토콜에 따라서 FITC-아넥신 V 및 요오드화프로피듐을 첨가하였다. 혼합물을 15분간 암실에 실온에서 배양시키고, 이후 세포의 형광을 FACS 스캔 유세포분석기로 측정하였다.
2 - 결과
2.1 - 세포보호작용 & 화합물 선택성
본 발명의 선택된 화합물에 대해 수행된 상이한 분석들의 결과들이 하기 표 4에 나타나 있다.
예를 들어, 도 1은 튜니카마이신에 노출시킴으로써 유도된 스트레스 후 화합물 1의 세포보호 효과를 나타낸다.
화합물 N° 구아나벤즈와 비교한, ER 스트레스로부터의 세포보호작용 스트레스를 받지 않은 세포에서 번역 억제 튜니카마이신 처리 후 번역 회복 기능성 아드레날린성 알파2 수용체 분석
1 ++ 효과 없음 연장 EC50 > 33.3μM
2 ++ 효과 없음 연장 EC50 > 33.3μM
3 ++ 효과 없음
4 +
5 +
6 + 효과 없음
7 ++ 효과 없음 EC50 > 33.3μM
8 ++ 효과 없음
9 -
10 +
11 +
2.2 - 다발성 경화증(Multiple Sclerosis)
도 2는 본 발명의 화합물 1에 의한 인터페론-감마 손상 받은 래트 올리고덴드로사이트의 투여량 의존적 보호를 나타내는 것이다.
이들 데이터는 본 발명의 화합물들이 다발성 경화증의 효과적인 치료의 조짐이 좋음을 보여준다.
2.3 - 파킨슨병(Parkinson's Disease: PD)
도 3은 본 발명의 화합물 2에 의한 로테논 손상 받은 1차 중뇌 래트 신경세포의 투여량 의존적 보호를 나타내는 것이다.
이들 데이터는 본 발명의 화합물들이 퇴행성신경질환, 더욱 구체적으로는 파킨슨병의 효과적인 치료의 조짐이 좋음을 보여준다.
2.4 - 알쯔하이머병(Alzheimer Disease: AD) & 아밀로이드증(Amyloidosis)
도 4는 본 발명의 화합물 2에 의한 아밀로이드-베타 1-42 손상 받은 1차 피질 래트 신경세포의 투여량 의존적 보호를 나타내는 것이다.
이들 데이터는 본 발명의 화합물들이 아밀로이드증, 더욱 구체적으로는 알쯔하이머병의 효과적인 치료의 조짐이 좋음을 보여준다.
2.5 - 근위축성 측색 경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis: ALS)
도 5는 본 발명의 화합물 2에 대한 90일째의 형질전환 SOD1 G93A 마우스에서 로타로드 시험 결과를 나타내는 것이다.
이들 데이터는 본 발명의 화합물, 구체적으로는 화합물 1과 2가 형질전환 마우스의 운동 장애(motor deficit)를 구하며 ALS의 효과적인 치료의 조짐이 좋음을 보여준다.
2.6 - 사르코-마리-투스 1A(Charcot-Marie-Tooth 1A: CMT-1A)
도 6은 본 발명의 화합물 2로 처리된, PMP22를 과발현시키는 3주째 및 5주째의 형질전환 래트에서의 바 시험(bar test)의 결과를 나타낸 것이다(떨어지기까지의 레이턴시: Fall latency).
이들 데이터는 본 발명의 화합물, 구체적으로 화합물 1과 2가 PMP22를 과발현시키는 형질전환 래트의 운동 장애를 구하며, CMT, 더욱 구체적으로는 CMT1A 및 CMT1B와 같은 탈수초성 질환의 효과적인 치료의 조짐이 좋음을 보여준다.
2.7 - 백질이영양증 ( Leukodystrophy ): 펠리재우스 - 메르쯔박커병 ( Pelizaeus -Merzbacher disease: PMD)
PLP1 및 DM20 단백질에서의 T181P 및 L223P 돌연변이는 펠리재우스-메르쯔바커병의 심각한 표현형을 유발하는 것으로 기술되어 있다 (Strautnieks et al. 1992, Am. J. Hum. Genet. 51 (4): 871-878; Gow and Lazzarini, 1996 Nat Genet. 13(4):422-8).
본 발명의 화합물 1 (5 마이크로M)은 인간 293T 세포에서 발현되는 T181P 돌연변이된 DM20 단백질이 축적되는 것을 방지할 수 있다 (도 7).
이들 데이터는 본 발명의 화합물, 구체적으로는 화합물 1 및 2가 백질이영양증과 같은 탈수소성 질환, 더욱 구체적으로는 PMD의 효과적인 치료의 조짐이 좋음을 보여준다.
2.8 - 2형 당뇨병
도 8은 본 발명의 화합물 6에 대한 Min6 세포에서 Akita 돌연변이를 포함하는 프리-프로-인슐린의 과발현(overexpression)의 결과를 나타낸 것이다.
상이한 농도의 화합물 1과 화합물 6은 튜니카마이신에 6시간 노출시킴으로써 유도된 미스폴딩된 단백질의 축적과 관련 있는 Min6 인슐린종 세포 사멸을 방지한다 (도 9).
상이한 농도의 화합물 1과 화합물 6은 튜니카마이신에 6시간 노출시킴으로써 유도된 미스폴딩된 단백질의 축적과 관련 있는 INS1 인슐린종 세포 사멸을 방지한다 (도 10).
이들 데이터는 본 발명의 화합물들이 전-당뇨병(pre-diabets) 및 당뇨병, 바람직하게는 2형 전-당뇨병 및 2형 당뇨병의 효과적인 치료의 조짐이 좋음을 보여준다.
2.9 - 망막 섬모병증/바르데트 비이들 증후군(Bardet Biedl syndrome)
화합물 2는 BBS12-/- 마우스에서 세포자멸로부터 광수용체를 보호할 수 있으며 광검출을 유지할 수 있고 (도 11) 소포체에서의 단백질 부하량을 감소시킬 수 있다 (도 12). 이러한 결과들은 Bbs12-/- 마우스에서 화합물 2와 발프로산(VPA) 조합물 또는 화합물 2만으로 처리하였을 때 증가된 ERG 반응을 보여준다 (도 11). 도 12는 표시된 투여 처리에 대한 반응으로 BBS12-/- 마우스의 광수용체의 ER 또는 유전형의 대표적인 투과된 전자현미경 사진을 보여준다. PBS만 주사되었을 때(왼쪽) 확장이 관찰되는 한편 VPA(발프로산)(0.2 mM)과의 조합으로 주사되는 화합물 2 (2.5 마이크로M는 )는 1회 단독 초자체-내로 주사 후 확장을 감소시킬 수 있다.
이들 데이터는 BIP 단백질의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 화합물, 예로서 발프로산과 함께 본 발명의 화합물들은 바르데트-비이들 증후군과 같은 망막 섬모병증 및 망막색소병변증의 효과적인 치료의 조짐이 좋음을 보여준다.
시험되진 않았으나, 본 발명자들은 이런 치료법이 광학적 스트레스(photonic stress)와 같은 다른 형태의 세포 스트레스를 감소시키는데 도움이 될 수 있을 것으로 가정하였다.
2.10 - 감염-관련 또는 비-감염성 염증 질환
폴리 I:C에 대한 MEFs의 정상적인 반응은 PPP1R15A 발현, PKR 활성화 및 타입-1 IFN 생산에 의해 매개되는 eIf2알파-P에서의 증가 (시간에 있어서 가변적이며 PPP1R15A 발현 수준과 관계 있음) (500 내지 700 pg/ml 범위)으로 특징 된다. 녹아웃 PPP1R15A-/-MEFs는 폴리 I:C에 대한 반응으로 이런 사이토킨을 생산하는데 사용할 수 없다.
본 발명 화합물의 PPP1R15A 억제 능력은 eIf2알파 포스포릴화의 증가, 자체적인 약리학적 억제로 일어나는 일반적인 단백질 합성 억제 및 타입-1 IFN생산에 기인한 PPP1R15A 발현의 감소량을 측정하여 평가하였다.
본 발명의 평가된 화합물들은 eIf2알파 포스포릴화를 증가시키고, PPP1R15A 발현을 감소시키며 타입-1 IFN 생산을 방지하는데 있어서 25 μM에서 효율적인 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 도 13은 폴리 I:C로 리포좀 형질감염시킨 마우스 배아 섬유아세포에 의한 타입-1 IFN 생산을 방지하는, 화합물 1, 6 및 8 (25 마이크로M에서)의 능력을 보여준다.
이들 데이터는 본 발명의 화합물들이 감염-관련 또는 비-감염성 염증 질환의 효과적인 치료의 조짐이 좋음을 보여준다.
2.11 - 심장 허혈증
본 발명의 화합물 2는 저산소증-유도된 세포자멸로부터 배양된 신생아 래트의 심장근육세포를 보호한다 (도 14). 이들 데이터는 본 발명의 화합물들이 허혈증, 구체적으로는 심장 허혈증의 효과적인 치료의 조짐이 좋음을 보여준다.
본 발명의 다양한 변경 및 변형들은 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않고 당해 기술 분야에서의 숙련가에게 자명하게 될 것이다. 본 발명이 특정의 바람직한 양태들과 관련하여 기재되었지만, 청구되는 바와 같은 본 발명은 그러한 특정 양태들로 과도하게 제한되지 않아야 하는 것으로 이해되어야 한다. 실제로, 관련 분야에서의 숙련가들에게 명백한, 본 발명을 실행하기 위한 기재된 방식들의 다양한 변경들도 본 발명에 의해 커버되도록 하고자 한다.

Claims (15)

  1. 패혈증, 전신성 염증성 반응 증후군(SIRS), 대장염, 궤양성 대장염, 염증성 장질환, 당뇨병성 신장병증, 출혈성 쇼크, 척추관절병증, 췌장염; 염증-유도된 암(inflammation-induced cancer); 낭포성 섬유증; 폴리글루타민병; 폴리알라닌병; 백질이영양증(leukodystrophies) 및 다발성 경화증(multiple sclerosis)의 그룹에서 선택되는 질환을 치료하는데 사용하기 위한 약학 조성물에 있어서,
    화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 호변이성체를 포함하며,
    Figure 112021089443724-pct00063


    여기서,
    R1은 알킬, O-알킬, Cl, F 또는 Br이고;
    R2는 H 또는 F이며;
    R3은 H 및 알킬로부터 선택되고;
    R4는 H 및 C(O)R6으로부터 선택되며;
    R5는 H이고;
    또는, R4와 R5는 연결되어 R4와 R5에 결합되어 있는 N 원자 외에, 헤테로원자를 1개 또는 2개 선택적으로 포함하며, 하나 이상의 R10 기로 선택적으로 치환되는, 5 내지 6원의 포화 또는 불포화 헤테로시클릭기를 형성하며;
    R6은 R7, OR7 및 NR8R9로부터 선택되고;
    R7, R8 및 R9는 각각 알킬, 시클로알킬, 아르알킬, 시클로알케닐, 헤테로시클릴 및 아릴로부터 독립적으로 선택되며, 이들 각각은 하나 이상의 R10 기로 선택적으로 치환되고;
    각각의 R10은 할로겐, OH, =O, CN, COO-알킬, 아르알킬, SO2-알킬, SO2-아릴, COOH, CO-알킬, CO-아릴, NH2, NH-알킬, N(알킬)2, CF3, 알킬 및 알콕시로부터 독립적으로 선택되며;
    X 및 Z는 각각 독립적으로 CR11이고, Y는 CR11 및 N으로부터 선택되며;
    R11은 H, 알킬 또는 F인,
    약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 약학 조성물은,
    백질이영양증 및 다발성 경화증 중에서 선택되는 질환을 치료하는데 사용하기 위한 것인, 약학 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, R1이 Cl, Br, Me, 또는 F인 약학 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, R2가 H인 약학 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, Y가 CR11인 약학 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, R3 및 R4가 둘 다 H인 약학 조성물.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, R3이 H이고 R4가 C(O)R6이며, R6은 Me 또는 OMe인 약학 조성물.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 화합물은 다음으로부터 선택되는 화합물 및 이의 호변이성체 또는 이의 허용 가능한 염인 약학 조성물:
    Figure 112021089443724-pct00065
    .
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 화합물은 다음으로부터 선택되는 화합물 및 이의 호변이성체 또는 이의 허용 가능한 염인, 약학 조성물:
    Figure 112021089443724-pct00066
    .
  10. 제8항에 있어서, 상기 화합물이 화합물 1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 약학 조성물.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 질환이 다발성 경화증인 약학 조성물.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 질환이 백질이영양증인 약학 조성물.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
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