CN107074752B - 苯亚甲基胍衍生物在治疗蛋白质构象紊乱方面的治疗用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通式(I)的化合物或其互变异构体和/或其药学上可接受的盐的新用途，其用于治疗与PPP1R15A通路相关并且与蛋白质错误折叠应激相关的疾病，尤其是与错误折叠蛋白质累积相关的疾病，选自Tau蛋白病变、共核蛋白病、多聚谷氨酰胺和多聚丙氨酸疾病、脑白质营养不良、囊胞性纤维症、多发性硬化、溶酶体储存障碍、淀粉样变病、炎症、代谢紊乱症、心血管疾病、骨质疏松症、神经系统创伤和局部缺血。

Description

苯亚甲基胍衍生物在治疗蛋白质构象紊乱方面的治疗用途
本发明涉及在治疗与蛋白质错误折叠应激有关的疾病方面有潜在的治疗应用的化合物，具体涉及在治疗与错误折叠蛋白质的积累有关的疾病的潜在的治疗应用的化合物。具体来说，本发明提供了能够对细胞毒性内质网(ER)应激表现出保护作用的化合物。
背景技术
化合物2-(2，6-二氯苯亚甲基)氨基胍，也称为胍那苄，是一种用作抗高血压药物的α-2型α激动剂。
Figure BDA0001201921520000011
胍那苄的不同衍生物已经被报道。例如，US 3,982,020(山德士公司)公开了取代的苯亚甲基肼类衍生物及其用途：作为降血糖-抗高血糖药物、抗肥胖药物和消炎药。US2004/0068017(博士伦公司) 公开了取代的苯亚甲基肼类衍生物能够增加眼部细胞里明胶酶A的活性。这些分子在治疗原发性开角型青光眼方面有应用。WO 2008/061647(源禾制药公司)公开了将N-(2-氯-3，4-二甲氧基苯亚甲基氨)胍用作VEGFR抑制剂，及其在治疗或预防在肿瘤的生长和/或炎症条件下有害血管形成的相关应用。WO 2005/031000(阿卡迪亚制药公司)公开了取代的苯亚甲基肼类衍生物，及其在治疗急性疼痛和慢性神经性疼痛中的用途。最后，EP1908464(法国国家科学研究中心CNRS)公开了胍那苄和氯胍那苄，及其在治疗包括亨廷顿氏病在内的多胶氨扩张相关疾病方面的用途。
最近有报道称胍那苄在许多其他领域的疾病方面治疗潜力。最近注意到胍那苄有抗朊病毒活性 (D·特里布亚尔-戈达尔等，2008年，《公共科学图书馆·综合3》，e1981)。有报道称胍那苄在保护细胞免于蛋白质错误折叠方面具有惊人宽广的活性，在细胞试验中显示突变亨廷顿蛋白的积累减弱 (WO 2008/041133)，并且保护保护细胞免于在Min6和1NS-1胰腺β细胞的内质网(ER)中容易发生胰岛素Akita突变体的错误折叠表达的致死作用(特萨伊特勒等，《科学》，2011年，332卷，1 期，第91-94页)。WO2014/138298和韦等(《自然通讯》2015年，6卷，第6532页，DOI： 10.1038/ncomms7532)公开了胍那苄蚂蚁及其在治疗脱髓鞘疾病例如多发性硬化方面的使用。
还有研究表明，当海拉细胞暴露于由N-糖基化衣霉素抑制剂诱导产生的其他细胞毒性ER-应激时，胍那苄能够以剂量依赖方式促进海拉细胞的存活率(特萨伊特勒等，《科学》，2011年)。细胞生存能力的定量评估显示，胍那苄以大约0.4μM的半数有效浓度使得ER应激下的海拉细胞的存活率加倍。α2-肾上腺素受体激动剂氯压定和α2-肾上腺素受体拮抗剂依法克生(efaroxan)都不能保护细胞免受细胞毒性ER应激的侵害，依法克生不会干扰胍那苄的保护作用(特萨伊特勒等，《科学》， 2011年)。这些观察表明，胍那苄保护细胞免于致命ER应激的作用机制与α2-肾上腺素受体无关。胍那苄通过连接到蛋白磷酸酶1的调节子单位，PPP1R15A(GADD34)，选择性地破坏翻译起始因子 2(eIF2α)的α子单元的应激诱导的脱磷酸作用，从而保护细胞免于遭受其他错误折叠蛋白质的致命累积。胍那苄通过可用的伴侣将应激下细胞的翻译速率设置为可控制的水平，从而恢复蛋白质体内稳态。有报道称胍那苄不连接到构建的PPP1R15B(CReP)，因此不抑制非应激下细胞的翻译(特萨伊特勒等，《科学》，2011年)。
不能通过安装足够的未折叠蛋白响应(UPR)来保持ER内的蛋白质内稳态，被认为是很多病理状况的驱动因素。因此，本文所描述的分子能抑制eIF2α磷酸酶对蛋白质合成的微调，可能对大量疾病引起的蛋白质错误折叠应激有治疗作用，尤其是对错误折叠蛋白质的积累有治疗作用。
本发明旨在提供基于胍那苄中心结构的替代化合物，所述化合物对治疗蛋白质错误折叠应激相关疾病、尤其是与错误折叠蛋白质积累有关的疾病具有潜在治疗应用。
发明概述
本发明的第一方面涉及通式(I)的化合物，或其药学可接受的盐，
Figure BDA0001201921520000021
其中：
R1是烷基、烷氧基、Cl、F或Br；
R2是H或F；
R3选自H和烷基；
R4选自H和C(O)R6；
R5是H；
或R4与R5连接形成五到六元饱和或不饱和杂环基团，所述杂环基团除了包含与R4和R5连接的 N原子外，还可选地包含1或2个杂原子，例如N，并且所述杂环基团被一个或多个R10基团任选取代；
R6选自R7、OR7和NR8R9；
R7、R8和R9各自独立地选自烷基、环烷基、芳烷基、环烯基、杂环基和芳基，且每个基团被一个或多个R10基团任选取代；
每个R10基团独立地选自卤素、OH、＝O、CN、COO-烷基、芳烷基、SO2-烷基、SO2-芳基、COOH、 CO-烷基、CO-芳基、NH2、NH-烷基、N-(烷基)2、CF3、烷基和烷氧基；
X和Z各自独立的是CR11，Y选自CR11和N；
R11是H、烷基或F；
所述通式(I)的化合物或其药学可接受的盐用于治疗蛋白质构象紊乱和/或与蛋白质错误折叠应激有关的疾病，尤其是与错误折叠蛋白质的累积有关的疾病。
本发明的第二方面涉及通式(I)的化合物，或其药学可接受的盐，
Figure BDA0001201921520000031
其中：
R1是烷基、烷氧基、Cl、F或Br；
R2是H或F；
R3选自H和烷基；
R4选自H和C(O)R6；
R5是H；
或R4与R5连接形成五到六元饱和或不饱和杂环基团，所述杂环基团除了包含与R4和R5连接的 N原子外，还可选地包含1或2个杂原子，例如N，并且所述杂环基团被一个或多个R10基团任选取代；
R6选自R7、OR7和NR8R9；
R7、R8和R9各自独立地选自烷基、环烷基、芳烷基、环烯基、杂环基和芳基，且每个基团被一个或多个R10基团任选取代；
每个R10基团独立地选自卤素、OH、＝O、CN、COO-烷基、芳烷基、SO2-烷基、SO2-芳基、COOH、 CO-烷基、CO-芳基、NH2、NH-烷基、N-(烷基)2、CF3、烷基和烷氧基；
X、Y和Z各自独立的是CR11；
R11是H、烷基或F；
所述通式(I)的化合物或其药学可接受的盐用于治疗蛋白质构象紊乱和/或与蛋白质错误折叠应激有关的疾病，尤其是与错误折叠蛋白质的累积有关的疾病。
本发明的第三方面涉及通式(I)的化合物，或其药学可接受的盐，
Figure BDA0001201921520000032
其中：
R1是Cl；
R2是H；
R3选自H和烷基；
R4选自H和C(O)R6；
R5是H；
或R4与R5连接形成五到六元饱和或不饱和杂环基团，所述杂环基团除了包含与R4和R5连接的N原子外，还可选地包含1或2个杂原子，例如N，并且所述杂环基团被一个或多个R10基团任选取代；
R6选自R7、OR7和NR8R9；
R7、R8和R9各自独立地选自烷基、环烷基、芳烷基、环烯基、杂环基和芳基，且每个基团被一个或多个R10基团任选取代；
每个R10基团独立地选自卤素、OH、＝O、CN、COO-烷基、芳烷基、SO2-烷基、SO2-芳基、COOH、 CO-烷基、CO-芳基、NH2、NH-烷基、N-(烷基)2、CF3、烷基和烷氧基；
X、Y和Z各自独立的是CR11；
R11是H、烷基或F；
所述通式(I)的化合物或其药学可接受的盐用于治疗蛋白质构象紊乱和/或与蛋白质错误折叠应激有关的疾病，尤其是与错误折叠的蛋白质的累积有关的疾病。
本发明的第四方面涉及通式(I)的化合物，或其药学可接受的盐，
Figure BDA0001201921520000041
其中：
R1是烷基、烷氧基、Cl、F或Br；
R2是H或F；
R3选自H和烷基；
R4选自H和C(O)R6；
R5是H；
或R4与R5连接形成五到六元饱和或不饱和杂环基团，所述杂环基团除了包含与R4和R5连接的 N原子外，还可选地包含1或2个杂原子，例如N，并且所述杂环基团被一个或多个R10基团任选取代；
R6选自R7、OR7和NR8R9；
R7、R8和R9各自独立地选自烷基、环烷基、芳烷基、环烯基、杂环基和芳基，且每个基团被一个或多个R10基团任选取代；
每个R10基团独立地选自卤素、OH、＝O、CN、COO-烷基、芳烷基、SO2-烷基、SO2-芳基、COOH、 CO-烷基、CO-芳基、NH2、NH-烷基、N-(烷基)2、CF3、烷基和烷氧基；
X和Z各自独立的是CR11，Y是N；
R11是H、烷基或F；
以前的研究表明为了使化合物表现出有用的药理活性，芳基必须至少双取代(例如，参见D·特里布亚尔-戈达尔等，《公共科学图书馆·综合3》，e1981(2008)和EP1908464A，CNRS)。然而，与以前的研究结果相反，本申请的申请人惊人地发现单取代的芳基衍生物也具有活性。
此外，相对于现有技术的化合物，例如胍那苄，上文定义的通式(I)的化合物有利地对肾上腺素α2A受体不表现出活性或表现出低活性。对于α-2肾上腺素活性的缺失使得这些化合物在治疗下列疾病方面有治疗作用：蛋白质构象紊乱和/或与蛋白质错误折叠应激有关的疾病，尤其是与错误折叠蛋白质的累积有关的疾病。α-2肾上腺素活性的缺失意味着可以以合适的剂量服用通式(I)的化合物来治疗上述疾病，而对血压没有任何明显的作用。
本发明的另一方面涉及药物组合物，包含上述通式(I)的化合物，与合适的药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体混合。
发明详述
如在此所使用的，术语“烷基”包括饱和直链和支链烷基基团。优选地，所述烷基基团是C1-20烷基基团，更优选地是C1-15，还优选地是C1-12烷基基团，还优选地是C1-6烷基基团，更优选地是 C1-3烷基基团。特别优选地烷基基团例如包括：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊烷基和己基。
如在此所使用的，术语“环烷基”指的是环状烷基基团。优选地，所述环烷基是C3-12环烷基基团。
如在此所使用的，术语“烯基”指的是包含一个或多个碳碳双键的基团，可以是支链的或无支链的。优选地，所述烯基是C2-20烯基基团，更优选地是C2-15烯基基团，还优选地是C2-12烯基基团，或优选地是C2-6烯基基团，更优选地是C2-3烯基基团。术语“环烯基”据此解释。
如在此所使用的，术语“芳基”指的是C6-12芳香基团。典型的例子包括苯基和萘基等。
如在此所使用的，术语“杂环”(在此也称为“杂环基(heterocyclyl)”和“杂环的(heterocyclic)”) 指的是4到12元杂环，优选地是包含一个或多个杂原子的4到12元饱和、不饱和或部分不饱和环状基团，所述杂原子选自N、O和S，并且所述环状基团其可选地进一步包含一个或多个CO基团。术语“杂环”包括下文定义的杂芳基和杂环烷基基团。
如在此所使用的，术语“杂芳基”指的是4到12元芳香烃，包括一个或多个杂原子。优选地，所述杂芳基基团是包含一个或多个杂原子N、O或S的4到12元环芳香基团。合适的杂芳基基团包括吡咯、吡唑、嘧啶、吡嗪、吡啶、喹啉、噻吩、1，2，3-三唑、1，2，4-三唑、噻唑、恶唑、异噻唑、异恶唑、咪唑、呋喃等等。
如在此所使用的，术语“杂环烷基”指的是包含一个或多个杂原子的4到12元环状脂肪基团，优选的杂环烷基基团包括哌啶基、吡咯烷基、哌嗪基、硫代吗啉基和吗啉基。更优选地，所述杂环烷基基团选自N-哌啶基、N-吡咯烷基、N-哌嗪基、N-硫代吗啉基和N-吗啉基。
如在此所使用的，术语“芳烷基”包括但不限于具有芳基和烷基两个官能团的基团。举例来说，该术语包括烷基基团的一个氢原子被芳基例如苯基取代的基团。典型的芳烷基基团包括苄基、苯乙基等等。
在一个优选实施例中，R1是Cl、Br、甲基或F，更优选地，R1是Cl。
在一个优选实施例中，R2是H。
在一个优选实施例中，Y是C R11。
在一个优选实施例中，Y是N。
在一个优选实施例中，R3和R4都是H。
在一个优选实施例中，R3是H，R4是C(O)R6。
在一个优选实施例中，R6是烷基或烷氧基，更优选地，R6是甲基或甲氧基。
在一个优选实施例中，R4与R5连接形成五到六元饱和或不饱和杂环基团，所述杂环基团除了包含与R4和R5连接的N原子外，还可选地包含1或2个杂原子，例如N，并且所述杂环基团被一个或多个R10基团任选取代。
在一个优选实施例中，所述化合物是通式(1a)的化合物，或其药学可接受盐，
Figure BDA0001201921520000061
其中，R1、R2、R3和R10同上文所定义的。
在一个特别优选的实施例中，通式(I)的化合物选自以下化合物：
Figure BDA0001201921520000062
Figure BDA0001201921520000071
及通式(I)的化合物在药学可接受盐。
在第一优选实施例中，通式(I)的化合物选自如上文所述的化合物1，即：1-{[(2-氯苯基)亚甲基]氨基}-胍，和化合物2，即：1-{[(2-氯苯基)亚甲基]氨基}-胍醋酸盐。
在第二优选实施例中，通式(I)的化合物选自如上文所述的化合物8。
在第三优选实施例中，通式(I)的化合物选自如上文所述的化合物6和化合物7。
治疗应用
通式(I)的化合物对于治疗蛋白质构象紊乱和/或与错误折叠和/或未折叠的蛋白质的积累有关的疾病具有潜在的治疗用途。尤其是，通式(I)的化合物对细胞毒性内质网(ER)应激和与年龄相关的疾病具有保护作用。
本发明的另一方面涉及上文定义的通式(I)的化合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗与蛋白质错误折叠应激有关的疾病，尤其是与错误折叠的蛋白质累积有关的疾病。
本发明的另一方面涉及上文定义的通式(I)的化合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗这样的疾病：该疾病的作用机制中涉及错误折叠和/或未折叠的蛋白质的累积(布朗等，2012年，《生理学前沿Frontiers in Physiology》3卷，Article 263)。
本发明的另一方面涉及上文定义的通式(I)的化合物在制备用于治疗蛋白质构象紊乱的药物中的用途。蛋白质构象紊乱指的是某些蛋白质结构不正常，从而破坏身体的细胞、组织和器官的功能的一类疾病。通常，蛋白质不能折叠成其正常构象，而是以这种错误折叠的和/或未折叠的状态存在，那么这些蛋白质在某种程度上变成有毒的(毒性的获得)，或者失去其正常功能，或其生物活性降低。蛋白质构象紊乱(proteopathies)，也称为蛋白质病(proteinopathies)、蛋白质构象疾病或蛋白质错误折叠疾病，包括许多疾病，例如：阿耳滋海默氏病、帕金森氏病、朊病毒病、2型糖尿病、淀粉样变性，以及许多各种不同的其他疾病(参见下文的非限制实施例)。
如在此所使用的，术语“蛋白质病(proteinopathies)、蛋白质构象紊乱(proteopathies)、蛋白质构象疾病、蛋白质错误折叠疾病、与蛋白质错误折叠应激有关的疾病、与错误折叠的蛋白质的累积有关的疾病、与细胞毒性ER应激有关的疾病、UPR相关的疾病具有同样的含义，指的是某些蛋白质结构不正常从而破坏细胞内稳态的疾病。
如在此所使用的，术语“错误折叠的蛋白质”和“未折叠的蛋白质”具有相同含义，指的是未能折叠成其正常构象的蛋白质。
如在此所使用的，术语“制备药物”包括将上述一种或多种化合物直接作为药物使用，还包括在进一步筛选活性试剂的方法中或在生产这种药物的任何阶段使用上述化合物。
本发明的另一方面涉及治疗患者以下疾病的方法：蛋白质构象紊乱、和/或与蛋白质错误折叠应激有关的疾病、和/或与细胞毒性ER应激有关的疾病、尤其是与错误折叠的蛋白质的累积有关的疾病，所述方法包括给上述患者服用治疗有效量的上文定义的通式(I)的化合物。
术语“方法”指的是用于完成给定任务的方式、方法、技术和步骤，包括但不限于那些已知的方式、方法、技术和步骤，或容易被化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的实践者从已知的方式、方法、技术和步骤发展而来的方式、方法、技术和步骤。
在本申请中，术语“治疗”包括消除、明显抑制、减慢或逆转疾病或机能失调的发展，明显地改善疾病或机能失调的临床症状，或明显地防止疾病或机能失调临床症状的出现。
如在此所使用的，术语“疾病”、“机能失调”、“症状”具有相同的含义。所述疾病与ER应激响应活性相关，和/或与蛋白质错误折叠应激有关，尤其与错误折叠的蛋白质的累积有关。
术语“治疗有效量”指的是会在一定程度上减轻被治疗的疾病或机能失调的一种或多种症状的被服用的化合物的量。
在另一个实施例中，本发明涉及上文定义的通式(I)的化合物用于治疗UPR疾病的用途。未折叠的蛋白质响应(UPR)是细胞防御系统抵抗错误折叠蛋白质的一个组成部分，其能够使内质网(ER) 内的折叠适应变化的条件。UPR被激活以响应内质网的内腔中未折叠或错误折叠的蛋白质的累积。在这种情况下，UPR有两个主要目的：(i)通过终止蛋白质的翻译恢复细胞的正常功能，(ii)激活信号通路使参与蛋白质折叠的分子伴侣的产量增加。如果没有在一定时间内实现这些目标，或者破坏时间延长，UPR会导致细胞凋亡。UPR的上游组分是ER-固有的跨膜蛋白IRE1、ATF6和PERK，它们感知折叠缺陷，从而以协调一致的方式重编蛋白质的转录和翻译，并且恢复蛋白质内稳态。激活的IRE1和PERK增加参与ER折叠的基因的转录，例如编码分子伴侣BiP和GRP94的那些基因。激活的PERK通过使Ser51上的翻译起始因子2(elF2α)的子单元磷酸化来减弱球蛋白的合成，同时促进转录因子ATF4的翻译。后者控制另一个转录因子CHOP的表达，反过来促进 PPP1R15A/GADD34的表达。PPP1R15A是终止UPR信号的负反馈环的效应器，会吸收蛋白质磷酸酶1(PP1c)的催化子单元，使得elF2α脱去磷酸，从而允许蛋白质合成从新开始。UPR失效对于很多病理状况是有利的，通过这种适应性响应的足够刺激可能纠正这些病理状况。应激诱导的elF2 α磷酸酶PPP1R5A-PP1的选择性抑制剂延迟elF2α的脱磷酸作用，因此，选择性地延迟应激细胞内的蛋白质合成，而不影响非应激细胞内蛋白质的合成。这延长了UPR的有益作用。蛋白质合成的短暂减少对应激细胞是有利的，因为减少合成的蛋白质的通量会增加分子伴侣的有效性，从而保护细胞免于错误折叠的应激(特萨伊特勒等，《科学》，2011年)。2种elF2α磷酸酶的非选择性抑制剂可能具有不理想的作用，这是因为持续的翻译抑制是有害的。事实上，PPP1R15A和PPP1R15B的同时基因消融会导致小鼠早期胚胎死亡，表明抑制这两种elF2α磷酸酶PPP1R15A-PP1和PPP1R15B-PP1在有机体内是有害的。相反的，PPP1R15A的基因消融对小鼠没有有害作用(哈丁等， 2009年，《美国国家科学院刊》，106卷，1832-1837页)。此外，预计PPP1R15A的特异性抑制剂在非应激细胞内是惰性的，这是因为在非应激下PPP1R15A是不表达的。因此，选择性PPP1R15A抑制剂被预测是安全的。当使用的剂量只导致磷酸酶的部分抑制时，两种elF2α磷酸酶的非选择性抑制剂对治疗蛋白质错误折叠疾病可能也是有用的。
可以通过合适的实验来测定抵抗ER应激的细胞保护作用。例如，在HeLa细胞内测定细胞保护作用，其中ER应激是通过添加包含衣霉素的媒介引起的，即同源核苷抗生素的混合物，其抑制 UDP-HexNAc：聚戊烯醇-P HexNAc-1-P族酶，用于诱导未折叠的蛋白质响应。经设定的时间后，使用标准的细胞活性试剂盒(例如，同仁化学研究所的细胞活性计数试剂盒-8)测定WST-8进入甲瓒的减少，来检测在抑制剂化合物存在或不存在的条件下的细胞活性。本领域技术人员可以使用其他四唑类化合物，例如，MTT、MTS、XTT。抵抗ER应激的细胞保护作用通过ER应激之后活细胞增加的百分比(相对于对照组)来体现。可以用其他细胞存活率实验，例如ATP发光实验。合适实验的进一步详细说明在附加的实施例中列出。
在一个优选实施例中，相对于对照组(例如，没有抑制剂化合物)，通式(I)的化合物能使UPR 的保护作用延长至少10％、至少20％，更优选地，至少30％，甚至更优选地，至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％，还优选地，至少90％.
通式(I)的化合物是PPP1R15A-PP1相互作用的抑制剂，并产生保护作用。优选地，这些化合物表现出保护作用，EC50小于10μM，更优选地，小于5μM，还优选地，小于1μM。优选的化合物应该没有α2肾上腺素活性。因此，在一个优选实施例中，在α-2-肾上腺素功能测试中，所述化合物没有表现活性。
通式(I)的某些化合物选择性地抑制PPP1R15A-PP1，从而延长UPR的保护作用，保护细胞免于蛋白质错误折叠应激。因此，本发明中描述的PPP1R15A-PP1的抑制剂对治疗下列疾病有治疗应用：与蛋白质错误折叠应激有关的疾病，尤其是与错误折叠蛋白质的累积和/或蛋白质构象紊乱有关的多种疾病。
在一个实施例中，通式(I)的化合物能够抑制PPP1R15A和PPP1R15B。在高度优选的实施例中，通式(I)的化合物能够选择性抑制PPP1R15A而非PPP1R15B。
在一个实施例中，本发明涉及上文定义的通式(I)的化合物，用于治疗与eIF2α磷酸化途径有关的疾病，该疾病的作用方式中涉及错误折叠的蛋白质的累积。优选地，所述疾病是PPP1R15A相关疾病。所述疾病的例子包括蛋白质错误折叠和/或蛋白质构象紊乱。
在另一个实施例中，本发明涉及上文定义的通式(I)的化合物，用于治疗以下疾病：由eIF2α磷酸化作用和/或PPP1R15A活性引起，与eIF2α磷酸化作用和/或PPP1R15A活性有关，或伴随有 eIF2α磷酸化作用和/或PPP1R15A活性的疾病，该疾病的作用方式中涉及错误折叠的蛋白质的积累。
如在此所使用的，“PPP1R15A相关疾病或机能失调”指的是以PPP1R15A活性异常为特征的疾病或机能失调，其作用方式中涉及错误折叠的蛋白质的累积。活性异常指的是：(i)正常情况下不表达PPP1R15A的细胞中出现PPP1R15A表达；(ii)增加的PPP1R15A表达；或，(iii)增加的PPP1R15A 活性。
在另一个实施例中，本发明涉及一种治疗疾病状态的哺乳动物的方法，所述方法通过PP1R15A 的抑制作用减轻疾病状态，该疾病状态的作用方式中涉及错误折叠蛋白质的累积，其中，所述方法包括给哺乳动物服用治疗有效量的上文定义的通式(I)的化合物。
在另一个实施例中，本发明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制剂或其其药学上可接受的盐，用于治疗与蛋白质错误折叠应激有关的疾病，尤其是与错误折叠的蛋白质的累积和/或UPR机能失调有关的疾病，其中，与胍那苄相比，所述化合物没有肾上腺素α2激动剂活性，或者肾上腺素α2激动剂活性降低。
在另一个实施例中，本发明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制剂或其其药学上可接受的盐，用于治疗与蛋白质错误折叠应激有关的疾病，尤其是与错误折叠的蛋白质的累积和/或UPR机能失调有关的疾病，其中，所述化合物对于表达PPP1R15B的非应激细胞，不抑制该细胞中的蛋白质翻译。
在另一个实施例中，本发明涉及一种治疗疾病的方法，所述疾病的特征在于错误折叠蛋白质的累积和ER应激响应活性，所述方法包括给病人服用治疗有效量的至少一种通式(I)的化合物，其中，所述化合物能够调节ER应激响应。
在另一个实施例中，本发明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制剂或其其药学上可接受的盐，用于治疗蛋白质构象紊乱和/或与蛋白质错误折叠应激有关的疾病，尤其是与错误折叠蛋白质的累积和/ 或UPR机能失调有关的疾病，其中，所述化合物对于PPP1R15A-PP1全磷酸酶具有选择性，而对于 PPP1R15B-PP1全磷酸酶没有活性或活性降低，其中，所述化合物的比例(对PPP1R15A-PP1全磷酸酶的活性/对PPP1R15B-PP1全磷酸酶的活性)至少等于或优于胍那苄的比例(对PPP1R15A-PP1 全磷酸酶的活性/对PPP1R15B-PP1全磷酸酶的活性)。
在另一个实施例中，本发明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制剂或其其药学上可接受的盐，用于治疗蛋白质构象紊乱和/或与蛋白质错误折叠应激有关的疾病，尤其是与错误折叠蛋白质的累积和/ 或UPR机能失调有关的疾病：
-其中，所述化合物对PPP1R15A-PP1全磷酸酶具有活性，但对PPP1R15B-PP1全磷酸酶没有活性或活性降低，以及；
-其中，所述化合物的比例(对PPP1R15A-PP1全磷酸酶的活性/对PPP1R15B-PP1全磷酸酶的活性)至少等于或优于胍那苄的比例(对PPP1R15A-PP1全磷酸酶的活性/对PPP1R15B-PP1全磷酸酶的活性)；以及
-其中，与胍那苄相比，所述化合物对肾上腺素α2激动剂活性没有活性或活性降低。
根据本发明，所述疾病或机能失调是：
(i)与ER应激响应活性有关；和/或
(ii)与蛋白质错误折叠应激有关，尤其与错误折叠和/或未折叠的蛋白质的累积有关；和/或
(iii)UPR疾病；和/或
(iv)PPP1R15A相关疾病；和/或
(v)蛋白质构象紊乱。
根据本发明，疾病的非限制性例子包括但不限于：
神经退行性疾病，例如：Tau蛋白病变(例如，阿耳滋海默氏病等)、共核蛋白病(例如，帕金森氏病等)、亨廷顿氏病和相关的多聚谷氨酰胺疾病、多聚丙氨酸疾病(例如，眼咽型肌肉萎缩等)、朊病毒病(也称为传染性海绵状脑病)、脱髓鞘疾病，例如：腓骨肌萎缩症牙病(也称为遗传性运动感觉性周围神经病)、脑白质营养不良、肌萎缩性(脊髓)侧索硬化(也称为运动神经元病和葛雷克氏症)、seipin蛋白病变(seipinopathies)和多发性硬化。
Tau蛋白病变的例子包括但不限于：阿耳滋海默氏病、进行性核上性麻痹、皮质基底核退化症、额颞叶退化症或额颞痴呆(FTD)(皮克氏病)。FTD是一种神经变性疾病，其特征在于：进行性神经元损失主要涉及额叶或颞叶；仅次于阿尔茨海默病(AD)的患病率，在年青痴呆症的病例中FTD占 20％。UPR参与Tau蛋白病变已得到充分地证实(参见斯托韦·肯恩(Stoveken)，2013年，《神经科学杂志》，33卷，36期，14285-14287页)。不受理论的约束，可以预料本发明的化合物是PPP1R15A 抑制剂，会改善Tau蛋白病变的临床表现。根据一个优选的实施例，本发明涉及通式(I)的抑制剂或其药学可接受的盐在治疗阿耳滋海默氏病中的用途。根据另一个优选的实施例，本发明涉及通式 (I)的抑制剂或其药学可接受的盐用于治疗选自下列疾病的一种疾病：额颞痴呆(FTD)、核上性麻痹和皮质基底核退化症，优选地，FTD。
共核蛋白病的例子包括但不限于：帕金森氏病、路易体痴呆、单纯性自主神经衰竭和多系统萎缩症。最近，科利亚等(《神经科学杂志》，2012年，32卷，10期，3306-3320页)证明eIF2α抑制剂通过抑制PPP1R15A调节的eIF2α的脱磷酸作用来增加eIF2α的磷酸化作用(博伊斯等，《科学》， 2005年，307卷，935-939页)，在α-共核蛋白病的两种动物模型中，明显地改善疾病的临床症状。不受理论的约束，可以预料本发明的化合物是PPP1R15A抑制剂，会改善α-共核蛋白病的临床表现。根据一个优选地实施例，本发明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制剂或其药学可接受的盐在治疗α- 共核蛋白病中的用途。根据一个优选的实施例，本发明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制剂或其药学可接受的盐用于在治疗帕金森氏病中的用途。
多聚谷氨酰胺疾病的例子包括但不限于：脊延髓肌萎缩症(或肯尼迪病)、亨廷顿氏病、丘脑底核萎缩、脊髓小脑共济失调1型、脊髓小脑共济失调2型、脊髓小脑共济失调3型(马查多-约瑟夫病)、脊髓小脑共济失调6型、脊髓小脑共济失调7型和脊髓小脑共济失调17型。在细胞测试中，胍那苄能够减弱亨廷顿蛋白突变体的累积(WO2008/041133)。由于亨廷顿蛋白突变体是细胞溶质的或细胞核的，因此这一发现是出乎意料的。但是，以前有证据表明突变的亨廷顿蛋白的代谢与ER 应激响应有关(Nishitoh等，2002年，《基因与生长》，16卷，1345-55页；卢梭等，2004年，《美国国家科学院院刊》，101卷，9648-53页；丁瓦尔德和林德奎斯特，2008年，《基因与生长》，22卷，3308-19 页)。胍那苄保护细胞免于细胞毒性ER应激以及减弱突变的亨廷顿蛋白的累积的发现进一步支持了这一观点，即可能存在ER应激响应影响突变亨廷顿蛋白的积累。但是，由于其降血压作用，胍那苄不能用于治疗人类蛋白质错误折叠疾病。相反的，本发明的胍那苄衍生物PPP1R15A抑制剂不具有α2肾上腺素活性，可以用于治疗多聚谷氨酰胺疾病，更具体地说，选自下列的疾病：亨廷顿氏病、脊延髓肌肉萎缩(或肯尼迪病)、丘脑底核萎缩、脊髓小脑共济失调1型、脊髓小脑共济失调2型、脊髓小脑共济失调3型(或马查多-约瑟夫病)、脊髓小脑共济失调6型、脊髓小脑共济失调7型和脊髓小脑共济失调17型。根据一个优选地实施例，本发明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制剂或其药学可接受的盐在治疗多聚谷氨酰胺疾病方面的用途。根据一个优选地实施例，本发明涉及通式(I) 的PPP1R15A抑制剂或其药学可接受的盐在治疗亨廷顿氏病方面的用途。
多聚丙氨酸疾病的例子包括：眼咽型肌肉萎缩，是由poly(A)里的聚丙氨酸束结合蛋白质核 1(PABPN1)引起的。Barbezier等(2011年，《欧洲分子生物学组织期刊》，3卷，35-49页)证明胍那苄能减少眼咽型肌萎缩症患者的蛋白质累积。根据一个优选地实施例，本发明涉及通式(I)的 PPP1R15A抑制剂或其药学可接受的盐在治疗多聚丙氨酸疾病方面的用途。根据一个优选地实施例，本发明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制剂或其药学可接受的盐在治疗眼咽型肌萎缩症方面的用途。
人类朊病毒疾病的例子包括但不限于：传统的克雅氏病、新变型克雅氏病(nvCJD，与牛海绵状脑病相关的人类疾病)、杰茨曼-斯脱司勒-史茵克综合征(
Figure BDA0001201921520000121
syndrome)、致命性家族性失眠症和库鲁病。胍那苄能减少朊病毒感染的小鼠的症状(D·特里布亚尔-戈达尔等，2008年，《公共科学图书馆·综合3》，e1981)。但是，由于其降血压作用，胍那苄不能用于治疗人类蛋白质错误折叠疾病。相反的，本发明的胍那苄衍生物PPP1R15A抑制剂不具有α2 肾上腺素活性，可以用于治疗朊病毒疾病。根据一个优选地实施例，本发明涉及通式(I)的PPP1R15A 抑制剂或其药学可接受的盐用于治疗选自下列的疾病：克雅氏病、新变型克雅氏病、杰茨曼-斯脱司勒-史茵克综合征(
Figure BDA0001201921520000122
syndrome)、致命性家族性失眠症和库鲁病。
脱髓鞘疾病的特征在于，中枢神经系统的少突胶质细胞或周围神经系统的雪旺细胞的损失。与脱髓鞘疾病相关的症状的特征在于，中枢神经系统或周围神经系统内有髓鞘的轴突的损失。髓鞘细胞的错误折叠的蛋白质的非限制实施例(包括少突胶质细胞和雪旺细胞)选自：CC1、髓鞘碱性蛋白(MBP)、半乳糖神经酰胺转移酶(CGT)、髓磷脂相关糖蛋白(MAG)、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白 (MOG)、少突细胞髓磷脂糖蛋白(OMG)、环核苷酸磷酸二酯酶(CNP)、髓鞘蛋白零(MPZ)、外周髓鞘蛋白22(PMP22)、连接蛋白32(Cx32)、蛋白质2(P2)、半乳糖脑苷脂(GalC)、硫苷脂和蛋白脂质蛋白(PLP)。对雪旺细胞来说，MPZ、PMP22、Cx32和P2是优选的错误折叠的蛋白质。对少突胶质细胞来说，PLP、MBP和MAG是优选的错误折叠的蛋白质。
在一些实施例中，脱髓鞘疾病选自腓骨肌萎缩症(CMT)。CMT指的是遗传神经疾病，其特征在于慢性运动和感觉神经病。不同类型的CMT疾病被识别为，例如：CMT1、CMT2、CMT4、CMTX 和德热里纳-索塔斯病。根据分子遗传学研究，CMT的子类型可进一步细分。例如，CMT1细分为 CMT1A、1B、1C、1D、1E和1F/2E。在基因编码的髓鞘蛋白零(P0)内由超过100种突变，单一跨膜蛋白是由引起腓骨肌萎缩症的神经系统疾病的髓鞘雪旺细胞产生的主要蛋白质(D·安东尼奥等， 2009年，《神经科学杂志》，87卷，3241-9页)。CHOP的基因消融，UPR内的促凋亡基因能恢复腓骨肌萎缩症小鼠的运动功能(彭努托等，2008年，《神经元》，57卷，393-405页)。细胞内的PPP1R15A 抑制剂几乎消除ER应激下细胞的CHOP表达的发现，表明PPP1R15A的基因或药学抑制剂应该减少腓骨肌萎缩症小鼠的运动运动功能障碍。最近，D·安东尼奥等(2013年，《实验医学杂志》，1-18 页)证明eIF2α抑制剂治疗的P0S63del小鼠，在转棒分析实验中几乎重新获得了正常的运动能力，并且伴随着形态和生理异常的恢复。对POS63del来说，ER蛋白内CMT相关的突变的累积不是唯一的，已经识别出ER内还存在至少五种其他P0突变体，并且引起UPR(彭努托等，2008年，《神经元》，57卷，393-405页；沙伯塔等，2012年，《大脑》，135卷，2032-2047页)。此外，由于PMP22 和Cx32内的突变，ER内的蛋白质错误折叠和错误折叠的蛋白质的累积已经被牵连到其他CMT神经病变的发病机制中(科尔比等，2000年，《疾病神经生物学》，7卷，561-573页；克列奥帕等， 2002年，《神经科学研究杂志》，68卷，522-534页；Yum等，2002年，《疾病神经生物学》，11卷， 43-52页)。但是，eIF2α抑制剂是有毒的，不能用于治疗人类患者，D·安东尼奥等(2013年，《实验医学杂志》，1-18页)。相反地，通式(I)的PPP1R15A抑制剂被预测是安全的，能被用于治疗 CMTs，优选CMT-1A和1B。根据一个优选地实施例，本发明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制剂或其药学可接受的盐用于治疗CMT，更优选地治疗CMT-1和德热里纳-索塔斯疾病。根据一个优选地实施例，本发明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制剂或其药学可接受的盐可以用于治疗与ER内错误折叠蛋白质累积相关的CMT。根据一个优选地实施例，本发明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制剂或其药学可接受的盐可以用于治疗CMT-1A。根据一个优选地实施例，本发明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制剂或其药学可接受的盐可以用于治疗CMT-1B。根据一个优选地实施例，本发明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制剂或其药学可接受的盐用于治疗CMT-1E。
在另一个实施例中，通式(I)的化合物用于治疗CMT，更优选地，用于治疗CMT-1，与下列至少一种化合物结合：D-山梨醇、巴氯芬、匹鲁卡品、环丙甲羟二羟吗啡酮、甲巯基咪唑、米非司酮、酮苯丙酸及其药学可接受的盐。根据另一个实施例，本发明涉及胍那苄或eIF2α抑制剂 (salubrinal)(即PPP1R15A抑制剂)或其药学可接受的盐，用于治疗CMT，优选CMT-1，与选自下列的至少一种化合物结合：D-山梨醇、巴氯芬、匹鲁卡品、环丙甲羟二羟吗啡酮、甲巯基咪唑、米非司酮、酮苯丙酸及其药学可接受的盐。所述化合物结合或分开服用，同时或按次序服用。
本发明涉及用于治疗神经退行性疾病，优选CMT，更优选CMT-1的组合物，所述组合物包含 PPP1R15A抑制剂，选自：通式(I)的化合物、胍那苄和eIF2α抑制剂或其药学上可接受的盐，还包含至少一种市售的化合物及其盐。所述组合物中化合物的剂量不应超过用于长期维持治疗或在3 期临床试验中证明是安全的通常规定的剂量范围；所述组合物中化合物最优选的剂量应是用于长期维持治疗的通常规定的剂量的1％到10％。
因此，本发明涉及用于治疗CMT，优选CMT-1，更优选CMT-1A的组合物，所述组合物包含 PPP1R15A抑制剂，选自：通式(I)的化合物、胍那苄和eIF2α抑制剂(salubrinal)或其药学上可接受的盐；还包含增加PMP22蛋白质表达的化合物，选自D-山梨醇、巴氯芬、匹鲁卡品、环丙甲羟二羟吗啡酮、甲巯基咪唑、米非司酮、酮苯丙酸及其药学可接受的盐。
在其他实施例中，脱髓鞘疾病选自包含脑白质营养不良在内的许多疾病。脑白质营养不良的例子包括但不限于：肾上腺脑白质营养不良(ALD)、亚历山大病、海绵状脑白质营养不良症、克拉伯病、异染性脑白质营养不良(MLD)、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(PMD)、儿童共济失调伴中枢神经系统髓鞘化低下(也称为白质消融性白质脑病)、CAMFAK综合征、雷夫叙姆病、科克因综合症、科纳普V综合征(Ver der Knapp Syndrome)、赵苇格氏症、格林-巴利综合征(GBS)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、多灶性运动神经病(MMN)和进行性核上性神经麻痹、进行性多灶性白质脑病 (PML)、脑脊髓炎、脑桥中央髓鞘溶解症(CPM)、抗-MAG疾病等。戈夫等(《神经元》，2002年， 36卷，585-596页)证明未折叠的蛋白质响应在PMD内被激活，并且表明这个途径是复制PLP1基因。
根据优选的实施例，本发明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制剂或其药学可接受的盐用于治疗脑白质营养不良，优选地，用于治疗佩利措伊斯-梅茨巴赫病(PMD)。
肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)称为运动神经元病和路格里克氏病。现在已经充分意识到蛋白质错误折叠在家族性和偶发性ALS上都起着核心作用(马图斯等，2013年，《细胞生物学杂志》， ID674751 http：//dx.doi.org/10.1155/2013/674751)。萨克塞纳等(《自然神经科学》，2009年，12卷， 627-636页)证明了eIF2α抑制剂能延长运动神经元病转基因小鼠模型G93A-SOD1的寿命。最近， Jiang等(《神经元》，2014年)证明在ALS病例的SOD1G93A小鼠模型中，胍那苄能延迟疾病症状的发作、延长寿命、改善运动能力并减少运动神经元的损失。达斯等人(2015年，《科学》，388 卷，239-242页)证明G93A SOD1突变的小鼠中，胍那苄衍生物能预防ALS的运动、形态和分子缺陷。根据一个优选地实施例，本发明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制剂或其药学可接受的盐用于治疗家族性和偶发性ALS。
Seipin蛋白病变的例子包括但不限于赛二氏先天性脂质营养不良2型(Berardinelli-Seip congenital lipodystrophy，BSCL2)相关运动疾病、先天性全身脂肪营养不良(CGL)、Silver综合征、远端型遗传性运动神经元病V型(dHMN-V))。人工培养的细胞中seipin蛋白突变体的表达，能激活未折叠蛋白响应(UPR)通路，并诱发ER应激介导的细胞死亡(伊托和铃木，2009年，《大脑》，132 卷，87-15页)。根据一个优选的实施例，本发明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制剂或其药学可接受的盐用于治疗seipin蛋白病变(seipinopathy)。
在另一个实施例中，其中提及的脱髓鞘疾病是多发性硬化症及相关疾病，例如，谢耳德氏病。根据一个优选的实施例，本发明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制剂或其药学可接受的盐用于治疗多发性硬化症。
囊胞性纤维症(CF)
诺尔雷(Norez)等(2008年，《欧洲药理学杂志》，592卷，33-40页)证明胍那苄能激活囊性纤维化气道上皮细胞内Ca2+依赖的氯电流。不受理论的约束，可以预料本发明的化合物，即胍那苄衍生物PPP1R15A抑制剂，会改善囊性纤维化疾病的表现。根据一个优选的实施例，本发明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制剂或其药学可接受的盐用于治疗囊胞性纤维症。
视网膜病变
最近出版的文章提供了UPR参与视网膜变性的发展过程的证据：遗传性视网膜色素变性，例如：视网膜纤毛运动障碍和视网膜色素变性、黄斑变性、早产儿视网膜病、光诱导视网膜变性、视网膜脱离、糖尿病视网膜病变和青光眼(审查：戈尔巴秋克和戈尔巴秋克，2013年，《分子视觉》，19卷， 1985-1998页；Jing等，《实验糖尿病研究》，2012年，2012卷，589589页)。
视网膜纤毛运动障碍是源自光感受器中初级纤毛的缺陷的一组罕见的遗传疾病，因此，包括色素性视网膜炎。有报道称由于蛋白质的累积，这种缺陷在光感受器的内部诱导ER应激，反过来诱导UPR(WO2013/124484)。在视网膜纤毛运动障碍中视网膜退化是最常见的特征，可以在任意一种独立的视网膜色素变性疾病中被观察到，例如：雷伯氏先天性黑内障或X-连锁视网膜色素变性，或者在综合症状中被观察到，如：巴尔得-别德尔综合征(BBS)、阿尔斯特伦综合症(ALMS)或亚瑟综合征。视网膜纤毛运动障碍选自：巴尔得-别德尔综合征、Senior-Loken综合征、朱伯特综合症、 Salidono-Mainzer综合症、Sensenbrenner综合症、Jeune综合症、Meckel-Gruber综合征、阿尔斯特伦综合症(ALMS)和MORM综合征。在一个优选的实施例中，通式(I)的化合物用于治疗视网膜病变，更优选地，用于治疗遗传性视网膜色素变性，例如：视网膜纤毛运动障碍和色素性视网膜炎、黄斑变性、早产儿视网膜病、光诱导视网膜变性、视网膜脱离、糖尿病视网膜病变和青光眼。
根据一个优选的实施例，本发明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制剂或其药学可接受的盐用于治疗色素性视网膜炎。根据另一个优选的实施例，本发明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制剂或其药学可接受的盐用于治疗雷伯氏(Leber’s)先天性黑内障。根据另一个优选的实施例，本发明涉及通式 (I)的PPP1R15A抑制剂或其药学可接受的盐用于治疗巴尔得-别德尔(Bardet-Biedl)综合征。根据另一个优选的实施例，本发明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制剂或其药学可接受的盐用于治疗阿尔斯特伦
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综合征。根据另一个优选的实施例，本发明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制剂或其药学可接受的盐用于治疗亚瑟(Husher)综合征。
在优选地实施例中，通式(I)的化合物与增加BIP蛋白表达和/或活性的化合物例如：丙戊酸或其衍生物、曲古抑菌素A、锂、1-(3，4-二羟基-苯基)-2-硫氰酸根-乙酮和塞那肽-4，联合使用，用于治疗视网膜病变，更优选地，用于治疗遗传性视网膜色素变性疾病，例如：视网膜纤毛运动障碍、色素性视网膜炎、黄斑变性、早产儿视网膜病、光诱导视网膜变性、视网膜脱离、糖尿病视网膜病变和青光眼。因此，本发明涉及一种组合物，所述组合物包含通式(I)的PPP1R15A抑制剂或其药学可接受的盐，和增加BIP蛋白表达和/或活性的化合物，优选丙戊酸，用于治疗多种遗传性视网膜色素变性疾病，例如：视网膜纤毛运动障碍、色素性视网膜炎、黄斑变性、早产儿视网膜病、光诱导视网膜变性、视网膜脱离、糖尿病视网膜病变和青光眼。
在优选地实施例中，通式(I)的化合物与基因治疗载体联合使用，用于治疗多种遗传性视网膜色素变性疾病，例如：视网膜纤毛运动障碍、色素性视网膜炎、黄斑变性、早产儿视网膜病、光诱导视网膜变性、视网膜脱离、糖尿病视网膜病变和青光眼。基因治疗载体的非限制性例子包括：慢病毒、腺病毒和腺相关载体(AAVs)；对眼部基因治疗来说，这些载体在提供对视网膜和视网膜色素上皮细胞感兴趣的基因方面是有效的。可以预测，在突变的错误折叠的蛋白质的累积有关的遗传性视网膜色素变性的眼部基因治疗中，在基因治疗载体表达正常蛋白质的同时，内质网中仍会存在蛋白质的累积。仍然需要使用PPP1R15A抑制剂减少细胞内蛋白质累积/载荷，优选地减少ER内的蛋白质累积/载荷。本发明还涉及包含PPP1R15A抑制剂与眼部基因治疗结合的组合物，所述PPP1R15A 抑制剂选自通式(I)的化合物、胍那苄和eIF2α抑制剂，或其其药学可接受的盐。
溶酶体贮积症；
溶酶体贮积症是由于溶酶体功能的缺陷引起的约50种罕见的遗传性代谢疾病。溶酶体功能障碍通常是缺乏脂肪、糖蛋白或所谓的黏多糖代谢所需的单一酶的结果。可以被通式(I)描述的PPP1R15A 抑制剂治疗的溶酶体贮积症在此包括但不限于：活化剂缺失/GM2神经节苷脂沉积症、α-甘露糖苷病、天冬氨酰葡萄糖胺尿症、胆固醇酯沉积病、胱氨酸病、溶酶体储积症(Danon disease)、法布里病、法勃氏病、尼曼-匹克病、岩藻糖苷贮积症、半乳糖涎酸贮积症、戈谢病(I、II、III型)、GM1 神经节苷脂贮积病(婴儿、婴儿晚期/青少年、成人/慢性)、I-细胞疾病、婴幼儿唾液酸贮积病(Infantile free sialicacid storagedisease)/ISSD、少年己糖苷酶缺乏症、克拉伯病(小儿发病，晚期发作)、溶酶体酸性脂酶缺乏症(早期发作/晚期发作)、异染性脑白质营养不良、黏多醣症(例如：粘脂质累积病III型/粘脂质累积病IIIA型、粘脂质累积病I型(MPS I)贺勒氏症、MPS I施艾氏症、MPS I贺勒-施艾氏综合症、MPS II亨特氏综合症、沙费利波综合征A型(MPS IIIA)、沙费利波综合征B型(MPS IIIB)、沙费利波综合征C型(MPS IIIC)、沙费利波综合征D型(MPS IIID)、莫尔奎A型/MPS IVA、莫尔奎B型/MPS IVB、MPSIX透明质酸酶缺乏症、MPS VI拉米氏症、MPS VII斯赖综合征、粘多糖病I(mucopolylipidosis I)/涎酸酵素缺乏症、粘脂沉积症IIIC、粘脂沉积症IV(多发性硫酸脂酶缺乏症、尼曼-皮克病(A、B、C型)、CLN6疾病(非典型小儿晚期、晚发性变异和青少年早期)、巴斯特鲁普氏综合征/青少年NCL/CLN3疾病、婴儿晚期芬兰变异CLN5(Finnish Variant late infantile CLN5)、Jansky-Bielschosky疾病/、婴儿晚期CLN2/TPPI疾病、库夫斯病/成人型NCL/CLN4疾病、北方癫痫型/婴儿晚期CLN8变异、婴儿型/婴儿CLN1/PPT疾病、β-甘露糖苷病、庞贝氏症/糖原贮积病II型、致密成骨不全症、山霍夫氏病/GM2神经节苷脂沉积症(成人期发病、婴儿期发病，青少年期发病)、Schindler疾病、Sall疾病、唾液酸贮积症、黑蒙性痴呆/GM2神经节苷脂贮积病以及沃尔曼(Wolman)病。根据另一个优选的实施例，本发明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制剂或其药学可接受的盐用于治疗溶酶体贮积症，溶酶体贮积症是由于缺乏用于代谢脂肪、糖蛋白或所谓的黏多糖所需的至少一种单一酶的结果，其中，所述酶在内质网(ER)是错误折叠的。根据一个优选的实施例，溶酶体贮积症是戈谢病。
淀粉样变病：
淀粉样变病是非特定术语，许多不同的疾病统称为淀粉样变性。淀粉样蛋白是二级结构改变的蛋白，引起蛋白质以特定形式折叠，即β-折叠结构。当正常溶解的蛋白质折叠形成淀粉样蛋白时，变得不可溶，在器官或组织中沉积和累积，破坏器官或组织的正常功能。根据淀粉样蛋白在哪个器官和器官的那个部分累积，不同类型的淀粉样变性具有不同的信号和症状。淀粉样变病的例子包括但不限于：AL、AH和ALH淀粉样变病(淀粉样蛋白分别来源于轻型、重型和重链和轻链抗体)、 AA淀粉样变病(淀粉样蛋白来源于血清A蛋白)，ATTR淀粉样变病(淀粉样蛋白来源于甲状腺素运载蛋白transthyrethin)、原发性系统性淀粉样变性、继发性系统性淀粉样变、老年全身性淀粉样变性、家族性淀粉样多发性神经病1、遗传性脑淀粉样血管病、透析相关性淀粉样变性、家族性淀粉样多发性神经病III型、芬兰遗传系统性淀粉样变(Finnish hereditary systemic amyloidosis)、心房淀粉样变(atrial amyloidosis)、遗传性非神经病系统性淀粉样变、注射-局限性淀粉样变(injection- localized amyloidosis)、遗传性肾淀粉样变和阿尔茨海默病等。根据另一个优选地实施例，淀粉样蛋白是β淀粉样蛋白(Aβ或Abeta)，本发明涉及通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制剂或其药学可接受的盐，用于治疗阿尔茨海默病。
根据另一个优选地实施例，所述淀粉样蛋白是HLA-B27(科尔伯特等，2009年，《朊病毒》，3(1) 卷，15-16页)，本发明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制剂或其药学可接受的盐，用于治疗脊柱-关节病，更优选地，强直性脊椎炎。
炎症
PPP1R15A代表一种控制炎症的有前景的靶点，其通过限制导致致病条件的炎症性因子和其他分泌分子介质的释放来控制炎症。在此描述的能通过通式(I)的PPP1R15A抑制剂治疗的，与炎症相关的疾病或症状的非限制性例子包括但不限于：肺部感染相关或非感染性炎症性疾病(例如：败血症、肺部感染、呼吸窘迫综合征、支气管肺发育不良等)；其他器官的感染相关或非感染性炎症性疾病，例如：结肠炎、溃疡性结肠炎、炎症性肠病、糖尿病性肾病、出血性休克、脊柱-关节病、胰腺炎、炎症诱导的癌症(例如，结肠炎或炎症性肠病患者的癌症发展)等等。
这些致病性炎症的例子包括：自身免疫性疾病、遗传性疾病、慢性疾病和传染性疾病，例如过敏症、哮喘、细胞介质症，包括移植物抗宿主疾病(GVHD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、败血症、全身炎症反应综合征(SIRS)(参见WO2011/061340)。优选地，感染性疾病选自流感病毒感染、天花病毒感染、疱疹病毒感染、严重急性呼吸道症候群(SARS)、基孔肯雅病毒感染、西尼罗河病毒感染、登革热病毒感染、日本脑炎病毒感染，黄热病病毒感染，和丙型肝炎病毒感染。
优选地，自身免疫性疾病选自：干燥
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综合症、全身性红斑狼疮、牛皮癣、疱疹样皮炎、白癜风、蕈样真菌病、过敏性接触皮炎、特异性皮炎、扁平苔癣、急性苔癣痘疹样糠疹(PLEVA)、关节炎和抗磷脂综合征。
根据另一个优选的实施例，本发明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制剂或其药学可接受的盐，用于治疗下列疾病：结肠炎、溃疡性结肠炎、炎症性肠病、胰腺炎和败血症。根据另一个优选的实施例，本发明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制剂或其药学可接受的盐用于治疗胰腺炎。根据另一个优选的实施例，本发明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制剂或其药学可接受的盐用于治疗败血症。
根据另一个优选的实施例，本发明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制剂或其药学可接受的盐用于治疗选脊柱-关节病，更优选地，强直性脊椎炎。
代谢/心血管疾病，例如，肥胖症(adiposity)、高血脂、家族性高胆固醇血症、肥胖症(obesity)、动脉粥样硬化、高血压、心脏病、心肌缺血性疾病、中风、心肌梗塞、经主动脉缩窄(trans-aortic constriction)、血管性中风和糖尿病剂相关疾病包括高血糖、葡萄糖耐量降低、高胰岛素血症(前驱糖尿病)、胰岛素过敏症I和II型糖尿病、胰岛素抵抗力和沃尔科特-拉里森综合征等。
在一个优选的实施例中，通式(I)的化合物用于治疗动脉粥样硬化。在另一个优选的实施例中，通式(I)的化合物用于治疗下列疾病：高血压、心脏病、心肌缺血性疾病、中风、心肌梗塞、经主动脉缩窄(trans-aortic constriction)或血管性中风。在一个优选的实施例中，通式(I)的化合物用于治疗心肌缺血。在一个优选的实施例中，通式(I)的化合物用于治疗下列疾病：高血糖症、葡萄糖耐量降低、高胰岛素血症(前驱糖尿病)、胰岛素过敏症I和II型糖尿病、胰岛素抵抗力和沃尔科特-拉里森综合征等。在一个优选的实施例中，通式(I)的化合物用于治疗前驱糖尿病或糖尿病，更优选地，II型糖尿病。
骨质疏松症
Yokota等(《BMC肌肉骨骼失调(BMC Musculoskeletal disorders)》，2013年，14卷，197页) 以及He等(Cellular Signaling，2013年，25卷，552-560页)证明eIF2α抑制剂(博伊斯等，2005 年)在小鼠模型中，有效地阻止骨质疏松症并刺激骨形成。但是，eIF2α抑制剂是有毒的，不能用于治疗人类患者。相反地，通式(I)的PPP1R15A抑制剂被预测是安全的，能用于治疗骨质疏松症。在一个优选的实施例中，通式(I)的化合物用于治疗骨质疏松症。
神经系统创伤
Ohri等(《疾病神经生物学》，2013年，58卷，29-37页)证明eIF2α抑制剂显著提高后肢运动，伴随着白质的改善和少突胶质细胞凋亡的减少，从而改善脊髓损伤后的功能恢复。
本发明通式(I)的PPP1R15A抑制剂被预测是安全的，在创伤性脊髓损伤后，对减少少突胶质细胞的损失是有用的，用于脊髓损伤的预防和/或治疗。在一个优选的实施例中，通式(I)的化合物用于脊髓损伤的预防和/或治疗。
局部缺血、脑缺血、睡眠呼吸暂停
本发明提供使用本发明通式(I)的PPP1R15A抑制剂来预防和/或治疗由于坏死或凋亡导致的细胞损伤或死亡引起的组织损伤。神经组织损伤的例子包括局部缺血和再灌注损伤，例如：脑缺血性中风和头部创伤。在一个优选的实施例中，通式(I)的化合物用于预防和/或治疗脑缺血，例如脑缺血性中风和头部创伤。
衰老
衰老与细胞、组织和器官的退化有关，导致疾病，例如癌症、心血管衰竭、肥胖、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝和神经退行性疾病，以及大多数测试的生理性能的下降。
在生物学中，衰老是老化的状态或过程。细胞衰老是独立的细胞在培养基中表现出有限的列分能力(即伦纳德·海福里克于1961年发现的海弗利克极限)，然而生物体衰老是生物体的老化。生物体衰老的特征在于对应激的响应能力下降，稳态失衡的增加和疾病风险的增加；具体来说，UPR 随年龄减少(奈杜等，2008年，《神经科学》，28卷，6539-48页)。因此，通过eIF2α磷酸酶的抑制剂延长UPR的有利响应会改善与年龄相关的疾病。因此，本发明通式(I)的PPP1R15A抑制剂被预测是安全的，可以用于预防和/或治疗与细胞的寿命或增值能力有关的疾病或技能失调，以及预防和/或治疗动物尤其是人类的由细胞衰老引起或加重的疾病或疾病情况。
根据一个具体的实施例，本发明涉及一种选自以下的化合物：
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用于治疗和/或预防下列一种或多种疾病：囊胞性纤维症、溶酶体贮积症、淀粉样变病、癌症、炎症，优选地，败血症、结肠炎和胰腺炎，代谢病、糖尿病、心血管疾病、骨质疏松症、中枢神经系统创伤、局部缺血、视网膜疾病、seipin蛋白病变(seipinopathies)、神经退行性疾病，优选地，阿耳茨海默氏病、帕金森氏症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、亨廷顿氏病、多聚谷氨酰胺和多聚丙氨酸疾病、腓骨肌萎缩症、脑白质营养不良和多发性硬化。
根据一个实施例，本发明涉及上述化合物1-11中的一种化合物，以及包含该化合物的药物组合物。
药物组合物
根据本发明的用途，在此描述的化合物或其生理上可接受的盐、酯类或其他生理上可接受的功能性衍生物，可以作为药物配方使用，所述药物配方包括所述化合物或其生理上可接受的盐、酯类或其他生理上可接受的功能性衍生物，以及一种或多种药学上可接受的载体，还可选地包含其他治疗和/或预防性成分。所述载体必须与配方的其他成分兼容并且对其接受者是无害的。在人类医学或兽医学中，所述药物组合物能用于人类和动物。
在此描述的用于不同形式的药物组合物的合适的赋形剂的例子可以参见韦德和PJ韦勒编辑的“药用辅料手册”，第二版，(1994)。
用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂在医药领域是众所周知的，例如，参见麦克出版有限公司出版的《雷氏药学大全》中的描述(A.R.热纳罗编辑，1985)。
合适的载体的例子包括：乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露醇、山梨醇等。合适的稀释剂的例子包括：乙醇、甘油和水。
根据预定服用方式和标准药学实践可以选择药物载体、赋形剂或稀释剂。除了载体、赋形剂或稀释剂之外，药物组合物还可包括合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、涂布剂、溶解剂、缓冲剂、调味剂、表面活性剂、增稠剂、防腐剂(包括抗氧化剂)等，以及能够使药物配方与接受者的血液等压的成分。
合适的粘合剂的例子包括：淀粉、明胶和天然糖，例如：葡萄糖、无水乳糖、自由流动的乳糖、β-乳糖、玉米甜味剂以及天然或合成胶，例如：阿拉伯树胶、黄芪胶或藻酸钠、羰甲基纤维素和聚乙二醇。
合适的润滑剂的例子包括：油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、醋酸钠、氯化钠等。
药物组合物中还可以包含防腐剂、稳定剂、染料和调味剂。防腐剂的例子包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯。也可以使用抗氧化剂和悬浮剂。
药物配方剂型包括适合用于口服、局部(包括皮肤、口腔、眼睛和舌下腺)、直肠或肠胃外(包括皮下的、皮内的、肌肉的和静脉内的)、鼻子、眼内和肺部给药，例如，通过吸入药剂。如果合适的话，药物配方可以离散剂量单元的形式存在，通过药学领域已知的任何一种方法制备。所有的方法都包括将活性化合物与液体载体或分离好的固体载体以及液固两种载体结合的步骤，如果需要的话，成型并生成成理想的药物制剂形式。
载体是固体的适合口服的药剂配方，最优选的存在形式是单位剂量配方，例如：丸剂、胶囊剂或片剂，每种形式包含预定量的活性化合物。片剂可通过压缩或成型制成，可任选使用一种或多种助剂。压制片剂可通过在压缩机器中压缩自由流动形式例如粉末或颗粒状的活性化合物来制备，任选地，所述活性化合物与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、脱模剂、表面活性剂或分散剂混合。模制片剂可使用惰性液体稀释剂通过对活性化合物成型来制备。片剂可选地是包覆的和不包覆的，如果是不包覆的，可选地，是刻痕的。胶囊是通过将活性化合物单独或与一种或多种助剂混合，填充到胶囊壳，然后以常规方式密封而制备。扁囊剂与胶囊类似，其中，活性化合物与任何一种助剂一起密封进米纸药袋中。活性化合物也可以配制成分散颗粒，例如，服用前可以悬浮在水中，或洒在食物上。颗粒制剂例如可以包装在小袋里。
适合口服的制剂中载体是液体的，可以溶液，或水溶液或非水溶液中的悬浮液，或水包油乳液形式存在。
适合口服的制剂中包括控释剂型，例如，对于片剂，其中活性化合物配制在合适的释放-控制基质中，或用合适的释放-控制膜包覆。这种制剂可能特别方便预防性使用。
载体是固体的适合直肠给药的药剂配方，最优选的存在形式是单位剂量栓剂。合适的载体包括可可脂和其他本领域重用的其他材料。所述栓剂可方便地通过将活性化合物和软化或熔化载体混合，随后在磨具中冷却、成型形成。
适合肠胃外给药的药剂配方包括无菌溶液或在水或含油的介质中的活性化合物的悬浮液。
本发明的药剂配方适合用于眼部给药，尤其适合用于眼内、玻璃体内、眼局部或眼周给药，更优选地，适合用于眼局部或眼周给药。
注射制剂可适用于弹丸注射或持续输注。这样的制剂方便地以单位剂量和多剂量的容器中存在，引入药剂配方后密封，直到需要时使用。可选地，活性化合物可以粉末形式存在，在使用之前与合适的介质，例如无菌的无热源的水一起构成药剂配方。
活性化合物也可配制为药性持久作用的制剂，通过肌肉注射或皮下注射，例如，皮下或肌肉注射给药。药性持久的制剂可包括，例如，合适的聚合物或疏水材料，或离子交换树脂。这些药性持久的作用的制剂特别方便预防性使用。
适合通过口腔前庭肺部给药的药剂配方是这样形式的微粒，其包含活性化合物，并且根据需求具有0.5-7微米的直径，在接受者的支气管树中释放。作为一种可能性，这种制剂是细粉末的形式，可以很方便地装于可刺破的胶囊中，例如适合用于吸入装置的明胶，或者制成自推进配方，其包括活性化合物、合适的液体或气体推进剂，以及可选地其他成分，例如表面活性剂话/或固体稀释剂。合适的液体推进剂包括丙烷和含氯氟烃，合适的气体推进剂包括二氧化碳。也可以采用自推进制剂，其中活性化合物以溶液或悬浮液的液滴的形式分配。
这种自推进制剂类似于本领域已知的制剂，可通过已知的步骤制备。适当地，可以将它们装于容器中，该容器具有手动操作或自动运行的阀，具有所需的喷雾特性；有利地，所述阀是仪表类型的，每次操作传送固定的体积，例如25-100微升。
作为另一种可能，活性化合物可以是溶液或悬浮液的形式，用于雾化器或气雾器，从而采用加速气流或超声搅拌产生跟细小的滴雾便于被吸入。
适合鼻腔黏膜给药的制剂包括通常类似于上文描述的肺部给药的制剂。在配药时，这种制剂应当根据要求具有10-200微米范围的粒径，从而使其保留在鼻腔中；视实际情况，这可以通过使用具有合适颗粒尺寸的粉末或选择合适的阀来实现。其他合适的制剂包括粒径范围在20-500微米的粗粉，当容器举近到鼻子时，通过鼻腔通道从容器中快速吸入粉末来给药，其他合适的制剂还包括滴鼻液，其包含0.2to 5％w/v的活性化合物，分散于在水或油溶液或悬浮液。
药学上可接受的载体对本领域技术人员来说是已知的，包括但不限于0.1M，优选0.05M的磷酸盐缓冲剂，或0.8％的盐水。此外，这些药学上可接受的载体可以是水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇和植物油，例如：橄榄油和注射有机酯，例如油酸乙酯。水溶性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。注射用药物的介质包括氯化钠溶液、格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油。也可以存在防腐剂和其他添加剂，例如，抗菌剂、抗氧剂、螯合剂、惰性气体等。
可以提供适合局部给药的制剂，例如凝胶、乳霜或油膏。这些制剂例如可用于创伤或溃疡，直接涂在创伤或溃疡表面，或者在支持介质上进行，例如绷带、纱布、网状织物或别的用于覆盖被治疗的地方的载体。
也可以提供液体或粉末制剂，直接喷涂或洒在待治疗的位置，例如创伤或溃疡。可选地，可以用药物制剂喷洒或喷撒载体，例如绷带、纱布、网状织物等，再将其覆盖到待治疗的地方。
根据本发明的另一个方面，提供了一种上文描述的药物组合物或兽药组合物的制备方法，所述方法包括将活性化合物与载体结合，例如，通过混合的方式。
通常，通过将活性成分与液体载体或分离好的固体载体以及液固两种载体进行均匀、密切地混合，来制备制剂，必要的话再成型成产品。本发明延伸到制备药物组合物的方法，包括使通式(I) 的化合物与医学上或兽医学上可接受的载体或介质混合或结合。
盐/酯类
本发明的化合物可以盐或酯类的形式存在，尤其是以药学上和兽医学上可接受的盐或酯类的形式存在。
本发明化合物的药学上和兽医学上可接受的盐包括合适的酸添加剂或碱盐。合适的药学上可接受的盐的综述可参见：Berge等，美国药学杂志，66卷，1-19页(1977)。盐例如为与强无机酸如矿物酸形成的，例如，与氢卤酸形成的盐：盐酸盐、氢溴酸盐和氢碘酸盐，与硫酸、磷酸形成的盐：硫酸盐、酸式硫酸盐、半硫酸盐、硫氰酸盐、过硫酸盐，和与磺酸形成的盐；所述盐还可以是与强有机羧酸形成的盐，这样的酸例如1-4个碳原子的取代或未取代(例如，通过卤素)的烷基羧酸，例如乙酸；与饱和或不饱和的二元羧酸形成的盐，这样的酸例如：草酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、反丁烯二酸、邻苯二甲酸或间苯二甲酸；与羟基羧酸形成的盐，这样的酸例如：抗坏血酸、乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；与胺基酸形成的盐，这样的酸例如：天冬氨酸或谷氨酸；与苯甲酸形成的盐；或与有机磺酸形成的盐，这样的酸例如取代或未可取代(例如，通过卤素)的(C1-C4)- 烷基-或芳基-磺酸，例如甲烷-或对甲苯-磺酸。药学上和兽医学上不可接受的盐作为中间体仍是有价值的。
优选的盐例如包括：乙酸盐、乙酸盐、乳酸盐、葡萄糖酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、泛酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、丁酸盐盐、双葡萄糖酸盐、环戊酸盐、葡庚糖酸盐、磷酸甘油盐、草酸酯盐、庚酸酯盐、己酸盐、富马酸盐、烟酸盐、棕榈酸盐、果胶盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、三甲基乙酸盐、丙酸酯、酒石酸盐、乳糖酸盐、特戊酸盐(pivolate)、樟脑酸盐、十一酸和琥珀酸、有机磺酸，例如：甲磺酸酯、乙磺酸酯、2-羟基乙磺酸盐、樟脑磺酸盐、2-萘基磺酸盐、苯基磺酸盐、对氯苯基磺酸盐和对甲苯基磺酸盐；和无机酸，例如：盐酸盐、氢溴酸盐，氢碘酸、硫酸盐、酸式硫酸盐、半硫酸盐、硫氰酸盐、过硫酸盐、磷酸和磺酸。根据优选地实施例，所述盐是醋酸盐。
根据被酯化的官能团，酯由有机酸或醇类/氢氧化物形成。有机酸包括羧酸，例如：1-12个碳原子的取代或未取代(例如，通过卤素)的烷基羧酸，例如乙酸；包括饱和或不饱和二元羧酸，例如：草酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、反丁烯二酸、邻苯二甲酸或间苯二甲酸；包括羟基羧酸，例如：抗坏血酸、乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；包括胺基酸，例如：天冬氨酸或谷氨酸；包括苯甲酸；或包括有机磺酸，例如取代或未取代(例如，通过卤素)的(C1-C4)-烷基-或芳基-磺酸，例如甲烷-或对甲苯-磺酸。合适的氢氧化物包括无机氢氧化物，例如：氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铝。醇类包括1-12个碳原子的取代或未取代(例如，通过卤素)烷基醇类。
对映异构体/互变异构体
上文讨论的本发明的各个方面中，在合适的情况下，本发明包括本发明的化合物的所有对映异构体、非对映异构体和互变异构体。本领域技术人员将识别具有光学特性(一个或多个手性碳原子) 或互变异构的特性的化合物。相应的对映异构体和/或互变异构体可通过本领域已知的方法分离/制备。对映异构体的特征在于其手性中心的绝对构型，并通过Cahn，Ingold和Prelog的R和S次序规则来描述。这些规定在本领域是众所周知的(例如，参见‘高等有机化学’，第三版，马奇·J，约翰·成利父子出版公司，纽约，1985年)。
因此，通式(I)的化合物也包括下面通式的互变异构体：
Figure BDA0001201921520000221
作为说明性的示例，例1的互变异构体是：
Figure BDA0001201921520000222
本发明的含有手性中心的化合物可用作外消旋的混合物，即富集对映体的混合物，或者，采用已知的技术分离外消旋混合物，从而单独使用每种对映体。
立体立体异构体和几何异构体
本发明的一些化合物可能存在立体异构体和/或几何异构体，例如，其具有一个或多个不对称和 /或几何中心，所以可能以两个或多个立体异构体和/或几何异构体的形式存在。本发明考虑了这些抑制剂的所有单独的异构体和几何异构体，及其混合物的用途。权利要求中的术语包括这些异构体形式，前提是所述异构体形式保持合适的功能活性(尽管不一定相同的程度)。
本发明还包括药剂的所有合适的同位素变体或其药学上可接受的盐。本发明药剂的的同位素变体或其药学上可接受的盐，定义为这样的物质：该物质中的一个原子被具有相同原子序数但不同原子质量的原子取代，该原子质量与自然界通常发现的原子质量不同。能被包含在本发明的药剂或其药学上可接受的盐中的同位素的例子包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，例如，分别是：2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18F和36Cl。本发明的药剂或其药学上可接受的盐的一些同位素，例如，那些放射性同位素，例如：3H和14C被包含在所述药剂或其药学上可接受的盐中，在药物和/或基质组织分布研究中是有用的。特别优选的同位素是氚，即3H，和碳-14，即14C，因为其易于制备，并且可被检测。此外，同位素替代物例如氘，即2H，可能提供一定的治疗优势，因为其具有更强的代谢稳定性，例如，体内半衰期增大或剂量要求减少，因此在某些情况下可能是更优选的。例如，本发明包括通式(I)的化合物中任何一个氢原子已被氘原子取代的化合物。本发明的药剂及其药学上可接受的盐的同位素改变，通常可以通过使用合适的试剂的适当的同位素改变的常规的步骤制备。
药物前体
本发明还包括以药物前体形式存在的本发明的化合物，例如，根据通式(I)在体内释放母体药物的共价键化合物。这些药物前体通常是本发明的化合物中一个或多个合适的基团被修饰，且被人或哺乳动物对象服用后这种修饰可能逆转。所述逆转通过自然存在于这些对象的酶来完成，尽管为了在体内完成这种逆转，也可能有另一种药剂与这种药物前体一起被服用。这些修饰体的例子包括酯类(例如，上文描述的任何一种酯类)，其中，所述逆转可能是酯酶等完成的。其他类似的系统是本领域技术人员已知的。
溶剂化物
本发明还包括本发明的化合物的溶剂化物形式。权利要求中的术语包括这些溶剂化物形式。
多晶型物
本发明还涉及以其不同结晶形式、多晶形式和含水形式存在的本发明的化合物。众所周知，在医药行业内，以这些形式的任何一种形式存在的化合物可通过稍微改变提纯方法来分离，或通过改变这些化合物的合成过程中使用的溶剂的分离形式。
给药
本发明的药物组合物可用于直肠、鼻部、支气管内、局部(包括口腔、舌下腺和眼部给药)、阴道或肠胃外(包括皮下的、肌肉的、静脉内的、动脉内和皮内的)、腹膜内或鞘内给药。优选的制剂是口服制剂。制剂可方便地以单位剂量形式存在，即以离散部分的形式存在，包含单位剂量或多个单位剂量或部分单位剂量。举例来看，制剂可以药片和缓释胶囊的形式存在，并可通过制药领域的任何一种已知方法来制备。
本发明的用于口服的制剂可以离散单元的形式存在，例如：胶囊剂、凝胶剂(gellules)、滴剂、扁囊剂、丸剂或片剂，各自包含预定量的活性成分；也可以是粉末或颗粒；也可以是溶液、乳剂或悬浮液，其中活性成分在水溶或非水溶液体中；也可以是水包油乳液或油包水乳液；也可以是大丸药等。优选地，这些组合物每剂量包含活性成分1-250mg，更优选10-100mg，更优选1-100mg。
用于口服的制剂(例如片剂和胶囊)，术语“可接受的载体”包括介质，例如普通的赋形剂，例如粘合剂，例如：糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄芪胶、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙甲纤维素、蔗糖和淀粉；还包括填料和载体，例如：玉米淀粉、明胶、乳糖、蔗糖、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、磷酸氢钙、氯化钠和褐藻酸；以及润滑剂，例如：硬脂酸镁、硬脂酸钠和其他金属硬脂酸、硬脂酸甘油硬脂酸、硅油、滑石蜡、油和硅胶。也可以使用调味剂，例如薄荷油、冬青油、樱桃香料等。可能需要添加着色剂以使药剂形式容易识别。片剂也可以通过本领域已知的方法包覆。
片剂可通过压制或模制来制备，可选地，使用一种或多种助剂。压制片剂可通过在合适的压缩机器中压缩自由流动形式例如粉末或颗粒状的活性成分来制备，所述活性成分可选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂混合。模印片剂可在合适的机器中制备，使用惰性液体稀释剂润湿粉末化合物得到混合物，然后对混合物进行塑造。片剂可选地是包覆的或刻痕的，以便制成的片剂能提供活性成分的缓慢的或可控的释放。
其他适合口服的制剂包括锭剂，其包括活性成分和调味基质，通常是蔗糖和阿拉伯胶，或黄芪胶；糖果锭剂，包括活性成分和惰性基质，例如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶；以及漱口剂，包含活性成分和合适的液体载体。
其他给药形式包括溶液或乳液，可被静脉注射、动脉注射、鞘内注射、皮下注射、皮内注射、腹腔内注射、眼内注射、局部注射、眼周注射或肌内注射，由无菌或消毒溶液制备。
本发明的药物组合物也可以是栓剂、阴道药栓、悬浮液、乳液、洗剂、药膏、乳膏、凝胶、喷雾剂、溶液或撒布粉的形式。
经皮给药的替代方式是使用皮肤贴剂。例如，活性成分可加入到由聚乙二醇或液体石蜡的乳液组成的乳膏中。活性成分也可以1-10％重量百分比的浓度加入药膏，所述药膏包括白蜡或白色软石蜡基质，以及可能需要的稳定剂和防腐剂。
剂量
本领域普通技术人员可以容易地确定本发明组合物的合适剂量给目标对象服用，这不需要过度的实验。通常，医生会确定对一个病人来说最合适的实际剂量，这要依据很多因素，包括使用的具体化合物的活性、代谢稳定性和化合物起作用时间的长短、年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、给药的形式和时间、分泌速率、联合给药、特定状况的严重程度以及个体正在接受的治疗。这里公开的剂量是一般情况的示例。当然也可以有个例，需要使用更高或更低的剂量范围，这些在本发明的范围之内。
根据本发明，可针对某个特定的症状或疾病服用有效量的通式(I)的化合物。当然，还可以根据化合物给药的方式进一步改变给药剂量。例如，为了实现对急性治疗的“有效量”，通式(I)的化合物优选肠胃外给药。对于加入到5％葡萄糖的水或生理盐水中的化合物，或使用合适赋形剂的类似制剂，静脉输注是最有效的，尽管肌肉注射也是有用的。通常，肠胃外剂量大约是0.01-100mg/kg；优选0.1-20mg/kg之间，以保持药物在血浆中的浓度保持在有效浓度的方式。化合物每天可服用一到四次，以达到每日总剂量大约为0.4-400mg/kg/天的水平。通过比较活性成分的血中浓度以及达到治疗效果所要求的浓度，本领域普通技术人员可以容易地确定本发明化合物治疗上有效的的精确用量，和这些化合物的最佳服用途径。
本发明的化合物也可以被病人口服，药物的服用浓度以实现本文所公开的一种或多种治疗作用为准。通常，包含所述化合物的药物组合物的口服剂量大约为0.1-50mg/kg之间，以与病人的症状符合的方式服用。优选地，口服剂量大约是0.1-20mg/kg。
根据本发明服用本发明的化合物时，未出现不可接受的毒理学效应。本发明的化合物可能具有良好的生物利用度，可通过几种生物检测之一来确定给定药理作用所需要的化合物的浓度。
联合用药
在一个特别优选的实施例中，本发明的一种或多种化合物与一种或多种其他活性剂联合服用，所述其他活性剂例如市售的现有药物。在这样的实施例中，本发明的化合物可以连续、同时或依次与一种或多种其他活性剂服用。
通常，药物结合使用时更有效。具体来说，为了避免主要毒性、作用机制及抗性机理的叠加，联合治疗是可取的。此外，以其最大耐受剂量和剂量之间最小时间间隔内服用大多数药物也是可取的。联合用药的主要优势在于通过生物化学相互作用可能促进附加的或可能的协同作用，也可以减少耐药性的出现。
通过研究测试的化合物和在特定疾病的治疗中已知有价值的或猜想有价值的药剂的抑制活性，可以得出有益的组合。这个过程也可用于确定药剂的服用顺序，即之前、同时或之后服用。这种顺序安排可能是这里确定的所有活性药剂的特征。
根据一个优选的实施例，本发明涉及一种药物组合物，包括：通式(I)的PPP1R15A抑制剂或其药学上可接受的盐，和增加BiP蛋白表达和/或活性的化合物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂(参见WO2013/124484)。优选地，增加BiP蛋白表达和/或活性的化合物选自：丙戊酸或其衍生物、曲古抑菌素A、锂、1-(3，4-二羟基-苯基)-2-硫氰酸根-乙酮和塞那肽-4。根据一个优选的实施例， BiP蛋白是丙戊酸或其衍生物，例如2-烯-丙戊酸。
根据一个优选的实施例，本发明涉及一种药物组合物，包括：通式(I)的PPP1R15A抑制剂或其药学上可接受的盐、增加BiP蛋白表达和/或活性的化合物和药学上可接受的载体和/或赋形剂，用于治疗与PPP1R15A通路有关和与蛋白质错误折叠应激有关的疾病，尤其是与错误折叠蛋白质的累积有关的疾病。优选地，所述疾病选自：Tau蛋白病变、共核蛋白病、多聚谷氨酰胺和多聚丙氨酸疾病、脑白质营养不良、腓骨肌萎缩症、seipin蛋白病变(seipinopathies)、囊胞性纤维症、多发性硬化、溶酶体贮积症、淀粉样变病、视网膜疾病、炎症、代谢紊乱、心血管疾病、骨质疏松症、神经系统创伤和局部缺血。
试验
本发明的另一方面涉及上文描述的化合物在试验中用于进一步识别能够抑制PPP1R15A-PP1的候选化合物。
优选地，所述试验是竞争结合试验。更优选地，所述竞争结合试验包括将本发明的化合物与 PPP1R15A-PP1和候选化合物接触，检测本发明的化合物与PPP1R15A-PP1之间相互作用的任何变化。
优选地，候选化合物通过本发明的化合物的常规SAR修饰而产生。这里使用的术语“常规SAR 修饰”指的是在本领域已知的通过化学衍生的方式改变给定化合物的标准方法。
因此，一方面，被识别出的化合物可以作为开发其他化合物的模型(例如，模板)。这种试验中所使用的化合物可游离在溶液中、附着在固体支持物上、生于细胞表面或位于细胞内。可以测定活性的消失或所述化合物和被测试的药剂之间的结合复合物的形成。
本发明的试验可以是筛选，涉及测试大量药剂。一方面，本发明的试验方法是高物料流通量筛选。
本发明还考虑使用竞争药物筛选试验，其中，能够与化合物结合的中和抗体，与用于结合到化合物的测试化合物进行特异性竞争。
另一种筛选技术提供高通量筛选(HTS)，筛选具有合适结合力的药剂，基于在WO84/03564 中详细描述的方法。
预计本发明的试验方法适合测试化合物的小范围和大范围筛选，也适合定量分析。
优选地，竞争结合试验包括在存在已知PPP1R15A-PP1基质的条件下，将本发明的化合物与 PPP1R15A-PP1接触，检测所述PPP1R15A-PP1与所述已知基质之间相互作用的任何变化。
本发明的另一方面提供检测配体与PPP1R15A-PP1结合的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)在存在已知基质的条件下，将配体与PPP1R15A-PP1接触；
(ii)检测PPP1R15A-PP1与所述已知基质之间相互作用的任何变化。
其中，所述配体是本发明的一种化合物。
本发明的一方面涉及一种方法，包括以下步骤：
(a)执行上文描述的试验方法；
(b)识别能够与配体结合域结合的一种或多种配体，以及
(c)制备一些所述一个或多个配体。
本发明的另一方面提供一种方法，包括以下步骤：
(a)执行上文描述的试验方法；
(b)识别能够与配体结合域结合的一种或多种配体，以及
(c)制备含有所述一种或多种配体的药物组合物。
本发明的另一方面提供一种方法，包括以下步骤：
(a)执行上文描述的试验方法；
(b)识别能够与配体结合域结合的一种或多种配体；
(c)修饰所述能够与配体结合域结合的一种或多种配体；
(d)执行上文描述的试验方法；
(e)可选地，制备含有所述一种或多种配体的药物组合物。
本发明还涉及通过上文描述的方法识别的配体。
本发明的另一方面还涉及一种药物组合物，包括通过上文描述的方法识别的配体。
本发明的另一方面还涉及上文描述的的方法识别的配体在制备药物组合物中的用途，该药物组合物用于治疗如上文定义的与错误折叠蛋白质的累积有关的的疾病。
上述方法可用于筛选能够作为PPP1R15A-PP1的抑制剂使用的配体。
通式(I)的化合物作为实验室工具和治疗药剂都是有用的。在实验室，本发明的一些化合物可以用于确认已知的或新发现的靶标在疾病状态的建立或发展中是否起到关键或至少明显的生物化学功能，这一过程通常被称为‘靶标确认’。
本发明进一步参照下列附图来描述，其中：
图1示出了本发明的化合物1保护Hela细胞免于ER应激的剂量依赖保护，其中ER应激是Hela 细胞暴露于衣霉素6小时来诱导的。
图2示出了本发明的化合物1对γ干扰素损伤的大鼠少突胶质细胞的剂量依赖保护。
图3示出了通过本发明的化合物2对鱼藤酮损伤的大鼠原代中脑神经元的剂量依赖保护。
图4示出了通过本发明的化合物2对β-淀粉样蛋白1-42损伤的大鼠原代皮层神经元的剂量依赖保护。
图5示出了化合物2在不同浓度和使用方法时对SOD1突变小鼠的ALS运动缺陷的预防能力。
IFB-B：口服化合物2.
BID：每天服用两次。
QD：每天服用一次。
图6示出了化合物2在不同浓度和使用方法时，对过度表达PMP-22的转基因(TG)大鼠的PMP-22 中的腓骨肌萎缩症1A型(CMT-1A)运动缺陷的预防能力。化合物2每天口服一次。
图7示出了化合物1在浓度为5μM时，预防人293T细胞中T181P突变DM20蛋白质累积的能力。
图8示出了化合物6预防细胞死亡的能力，其中该细胞死亡是与Min6细胞中表达的容易错误折叠的胰岛素Akita的累积有关的细胞死亡。
图9示出了化合物1和化合物6在不同浓度时，预防与错误折叠蛋白质的累积有关的Min6胰岛素瘤细胞死亡的能力，其中该错误折叠蛋白质是通过暴露于衣霉素6小时诱导的。
图10示出了化合物1和化合物6在不同浓度时，预防与错误折叠蛋白质的累积有关的INS1胰岛素瘤细胞死亡的能力，其中该错误折叠蛋白质是通过暴露于衣霉素6小时诱导的。
图11示出了化合物2防止BBS12-/-小鼠光受体细胞凋亡以使其保留感光功能的能力。视网膜电流图(ERG)中，以图表形式显示化合物2(2.5μM)与丙戊酸(0.2mM)联合使用或单独使用化合物2(2.5 μM)处理的BBS12-/-小鼠眼部，与介质(PBS)处理的小鼠眼部之间的百分比平均值的区别。
图12示出了化合物2减少BBS12-/-小鼠内质网中蛋白质载荷的能力。透射电镜观察(TEM)服用化合物2(2.5μM)和丙戊酸(VPA)(0.2mM)或PBS后BBS12-/-小鼠的光受体的内质网(ER)的响应。当仅注射PBS时(左图)，观察到ER潴泡的扩张，而联合使用化合物2和VPA进行一次玻璃体内注射后，能减少这种扩张(右图)。
图13示出了化合物1、6和8(浓度为25μM)，对于使用聚肌胞苷酸(poly I:C)进行脂转染的鼠胚胎成纤维细胞，防止其产生1型干扰素的能力。
图14示出了化合物2保护新生大鼠心肌细胞免于缺氧诱导的细胞凋亡的能力。该图示出了通过 FACS分析测定的凋亡细胞的百分比。在化合物2(n＝3)不存在(0μM)或以指定浓度存在的情况下，心肌细胞暴露于低氧(0.3％O2)条件36h。
本发明参照下列非限制性实施例来进一步描述。
实施例
1-材料和方法
化合物3是从Chembridge公司购买的，编号：5173161
化合物4是从ChemDiv公司购买的，编号：0589-0012
化合物5是从ChemDiv公司购买的，编号：1683-6502
1.1-根据本发明的化合物的制备
反应物和商业化合物是从Acros Organics和Sigma-Aldrich公司购买的。根据本发明的化合物可按照下面的通用反应过程制备：
通用反应过程A：
Figure BDA0001201921520000281
在25℃条件下，向苯甲醛(leq.)的乙醇(300ml)溶液中依次加入氨基胍盐酸盐(leq.)和醋酸钠 (leq.)。所得的反应混合物在80℃条件下加热反应约6小时。反应在薄层色谱监测下完成，二氯甲烷/甲醇(8/2)作为流动相。反应完成后，反应混合物冷却到25℃，倾倒入NaHCO3的饱和溶液(700ml)。真空过滤得到沉淀物，水洗(100ml)。所得固体材料用乙醚(2x25ml)研磨，真空干燥，得到预期的取代的氨基胍衍生物。
下面的化合物是根据通用反应过程A制备的：
化合物1：2-(2-氯苯亚甲基)氨基胍
按照通用反应过程A由2-氯苯甲醛(10g)制备，得到11.1g的预期化合物(产率：79.6％)。1H-NMR (DMSO-d6)：(ppm)5.66(s，2H)；6.05(s宽峰，2H)；7.27(m，2H)；7.40(m，1H)；8.14(dd，1H)；8.27(s，1H)； MS(ESI+)：m/z＝197.2[M+H]+。
化合物2：2-(2-氯苯亚甲基)氨基胍醋酸盐
在25℃条件下，向2-氯苯甲醛(30.0g)和氨基胍碳酸氢盐(29.0g)的甲醇(450ml)悬浮液中加入醋酸 (30ml)。在25℃条件下，反应混合物搅拌30分钟。反应在薄层色谱监测下完成，二氯甲烷/甲醇(8/2) 作为流动相。反应完成后，反应混合物冷却到25℃，真空浓缩。浓缩物悬浮在甲醇(250ml)中，过滤除去不溶杂质。所得滤液真空下浓缩，然后将上述过程(悬浮在甲醇中+过滤)重复3次。然后，所得固体材料用乙醚(3x100ml)研磨，真空干燥，得到46.0g的2-(2-氯苯亚甲基)氨基胍醋酸盐(产率：84.2％)。LC-MS：m/z＝197.2(M+H)。1H-NMR(DMSO-d6)：(ppm)1.81(s，3H)，7.12(m，4H)；7.34 (m，2H)；7.46(m，1H)；8.22(m，1H)；8.36(s，1H)；LC-MS：m/z＝197.2[M+H]+。
化合物6：2-[(3-氯吡啶-4-基)亚甲基]氨基胍
按照通用反应过程A由2-氯苯甲醛(0.5g)制备，得到0.16g的预期化合物(产率：23％)。1H-NMR (DMSO-d6))：(ppm)6.00(s宽峰，2H)；6.32(s宽峰，2H)；8.10(d，1H)；8.14(s，1H)；8.35(dd，1H)；8.52(s， 1H)；MS(ESI+)：m/z＝198.0[M+H]+。
化合物7：2-[(3-氯吡啶-4-基)亚甲基]氨基胍醋酸盐
在25℃条件下，向3-氯4-吡啶甲醛(2.0g)和氨基胍碳酸氢盐(2.12g)的甲醇(28ml)悬浮液中加入醋酸(2ml)。在70℃条件下，反应混合物搅拌约2小时。反应在薄层色谱监测下完成，二氯甲烷/甲醇(8/2)作为流动相。反应完成后，反应混合物冷却到25℃，真空浓缩。浓缩物悬浮在甲醇(250ml) 中，过滤除去不溶杂质。所得滤液真空下浓缩。然后，所得固体材料用甲醇：乙醚(9∶1)(4x50ml) 研磨，真空干燥，得到2.0g的2-[(3-氯吡啶-4-基)亚甲基]氨基胍醋酸盐(产率：55.1％)。1H-NMR (DMSO-d6)：(ppm)6.01(brs，2H)；6.48(m，4H)；8.12(d，1H)；8.16(s，1H)；8.38(dd，1H)；8.54(s，1H)； MS(ESI+)：m/z＝198.1[M+H]+。
化合物8：2-(2-氯-6-氟苯亚甲基)氨基胍醋酸盐
在25℃条件下，向2-6-氟苯甲醛(1.5g)和氨基胍碳酸氢盐(1.29g)的甲醇(22ml)悬浮液中加入醋酸(1.5ml)。在70℃条件下，反应混合物搅拌约1小时。反应在薄层色谱监测下完成，二氯甲烷/甲醇 (8/2)作为流动相。反应完成后，反应混合物冷却到25℃，真空浓缩。浓缩物悬浮在甲醇(250ml)中，过滤除去不溶杂质。所得滤液真空下浓缩。然后，所得固体材料用甲醇：乙醚(9∶1)(3x50ml)研磨，真空干燥，得到2.2g的2-(2-氯-6-氟苯亚甲基)氨基胍醋酸盐(产率：84.8％)。1H-NMR(DMSO-d6)： (ppm)1.89(s，3H)，6.13(s broad，4H)；7.24(m，1H)；7.33(m，2H)8.17(s，1H)；MS(ESI+)：m/z＝215.1 [M+H]+。
化合物9：2-(2-氯-4-甲基苯亚甲基)氨基胍
按照通用反应过程A由2-氯-4-甲基苯甲醛(0.2g)制备，得到255mg的预期化合物(产率：93.8％)。1H-NMR(DMSO-d6)：(ppm)2.29(s，3H)；5.60(s宽峰，2H)；6.00(s宽峰，2H)；7.10(d，2H)；7.27(s，1H)； 8.02(d，1H)；8.24(s，1H)；MS(ESI+)：m/z＝210.9[M+H]+。
化合物10：2-(2-氯-5-甲基苯亚甲基)氨基胍
按照通用反应过程A由2-氯-5-甲基苯甲醛(0.2g)制备，得到156mg的预期化合物(产率：57.4％)。1H-NMR(DMSO-d6 d6)：(ppm)2.30(s，3H)；5.64(s宽峰，2H)；6.06(s宽峰，2H)；7.07(d，2H)；7.27(d， 1H)；7.97(s，1H)；8.24(s，1H)；MS(ESI+)：m/z＝210.9[M+H]+。
化合物11：2-(2-氯-3-甲基苯亚甲基)氨基胍
按照通用反应过程A由2-氯-3-甲基苯甲醛(0.2g)制备，得到156mg的预期化合物(产率：57.4％)。1H-NMR(DMSO-d6)：(ppm)2.17(s，3H)；5.64(s宽峰，2H)；6.03(s宽峰，2H)；7.18(t，2H)；7.24(d，1H)； 7.99(s，1H)；8.37(s，1H)；MS(ESI+)：m/z＝210.9[M+H]+。
选择根据本发明选择的化合物列于下表1中：
Figure BDA0001201921520000291
Figure BDA0001201921520000301
Figure BDA0001201921520000311
在下面的一些实验中，也可使用这些化合物的盐。
1.2-哺乳动物细胞培养、构建和转染
在伊格尔极限必需培养基(EMEM)中培养HeLa细胞，该培养基中添加了谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸、青霉素和链霉素(Lonza公司)，还包含10％胎牛血清(FBS)(琼脂糖)。
在杜尔贝科改良伊格尔培养基(EMEM)中培养293T细胞，该培养基中添加了青霉素、链霉素、谷氨酰胺(Lonza公司)和10％胎牛血清(FBS)(琼脂糖)。
在EMEM培养基中培养Min6细胞，该培养基中添加了青霉素、链霉素、谷氨酰胺、丙酮酸钠、 50μMβ-巯基乙醇和10％胎牛血清(FBS)(琼脂糖)。
在RPMI培养基中培养INS1细胞，该培养基中添加了青霉素、链霉素、谷氨酰胺、丙酮酸钠(Lonza 公司)、50μMβ-ME和15％胎牛血清(FBS)(琼脂糖)。每个细胞系都维持在37℃，5％CO2气氛中。
PLP1、DM20和胰岛素的人开放阅读框(ORF)序列是从美国生命技术公司(英杰公司)获得的(分别是IOH41689、IOH5252和IOH7334)。通过
Figure BDA0001201921520000312
LR ClonaseTM II酶混合物(英杰公司) 构建克隆到pDEST26表达质粒(英杰公司)。ORF突变是使用定点突变试剂盒(QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit)(Stratagene公司)(对PLP1和DM20 ORFs来说是T181P突变，对胰岛素ORF来说是Akita(C96Y)突变)。
使用4D细胞核转染系统(AmaxaTM 4D-NucleofectorTM System)(Lonza公司)，或通过使用脂质体(美国生命技术公司)转染，来实施哺乳动物细胞中的基因表达。
1.3-免于ER应激的细胞保护作用
Tsaytler等(《科学》，2011年)对该试验进行了描述。
在37℃，5％CO2气氛中，在伊格尔极限必需培养基(EMEM)中培养HeLa细胞，该培养基中添加了谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸、青霉素和链霉素(Lonza公司)，还包含10％胎牛血清(FBS)。治疗前一天，将细胞以17,000细胞/mL的浓度铺于96孔板。通过添加5μg/mL的衣霉素(西格玛- 奥德里奇公司)和磷酸酶抑制剂(0.5-10μM)产生ER应激。6h后介质更换新鲜的介质，并通过添加磷酸酶抑制剂(0.5-10μM)维持细胞保护作用。衣霉素治疗48h或72h后，使用细胞计数试剂盒8(Sigma 公司)，按照供应商的建议，测定WST-8到甲瓒的减少来评估细胞存活率。
ER应激之后，通过与参考化合物胍那苄(Tsaytler等，《科学》，2011年)相比较来测定针对ER 应激的细胞保护作用：
-‘-’无细胞保护作用；
-‘+’低于胍那苄的细胞保护作用；
-‘++’与胍那苄的细胞保护作用相似；
表1总结了本发明的不同化合物与胍那苄相比在产生应激之后对细胞保护作用的结果，其中应激是通过暴露于衣霉素6h诱导产生的。
1.4-非应激细胞中翻译速度的评估
每个实验之前24h，HeLa细胞(100,000细胞/ml)铺于6孔板，然后不处理，或用化合物(50μM) 治疗2.5h、5h和9h。添加化合物30分钟前，培养基替换为无蛋氨酸DMEM培养基(英杰公司)。每个时间点前一小时，将50μM的
Figure BDA0001201921520000321
AHA(L型叠氮高丙氨酸L-azidohomoalanine)(英杰公司)添加到培养基中，从而标记新合成的蛋白质。每个时间点结束时，用冰PBS洗细胞，并通过胰蛋白酶分解剂(Lonza公司)得到蛋白质，然后细胞溶解于50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl) 缓冲液中，该缓冲液中含有1％SDS(Sigma公司)、蛋白酶个磷酸酶抑制剂(Sigma公司)。使用
Figure BDA0001201921520000322
蛋白质反应缓冲试剂盒(英杰公司)将蛋白质样品耦合到炔生物素(英杰公司)。样品在 70℃条件下变性10分钟，在ECL4-20％预制凝胶(通用电气医疗集团)上分离，并转移到硝酸纤维素膜(通用电气医疗集团)。使用链霉亲和素-HRP(Gentex公司)检测耦合到
Figure BDA0001201921520000323
AHA的炔生物素，其中
Figure BDA0001201921520000324
AHA插入到新和成的蛋白质。蛋白印迹试剂ECL Prime(通用电气医疗集团)孵化来完成显示，使用Fusion Solo 3S(凝胶成像仪)通过化学发光来读取结果。
1.5-应激细胞中翻译速度的评估
除了衣霉素(5μg/ml)与化合物一起添加之外，处理方法与非应激细胞中翻译的测定是一样的。
1.6-对肾上腺素α2A受体的GPCR功能测定(CellKey检测方法)
在内部表达人类α2A受体的CHO细胞上评估化合物的激动剂活性，并使用CellKey检测方法，通过测定其对阻抗调制的影响来测定其活性。
细胞接种到96孔板，6x104细胞/孔，在HBSS缓冲液(英杰公司)+具有0.1％BSA的20mM HEPES(英杰公司)中，开始实验前，允许在28℃条件下平衡60min。将板放置到系统中在28℃的温度下测量。使用综合流体系统将溶液同时添加到所有的96孔：HBSS(基础对照组)，100nM 参考激动剂(刺激对照组)，参考激动剂(EC50测定)或供试化合物。添加配体10分钟后检测生物电阻抗。标准的参考激动剂是肾上腺素，在每个实验中其在几个不同浓度下测试，得到浓度响应曲线，从该曲线图计算其ECs0值。
使用Hill软件分析供试化合物的剂量响应数据，对平均重复值产生的浓度响应曲线进行非线性回归分析，使用Hill方程曲线拟合。结果列在表1中，EC50＞33.3μM的化合物被认为不具有显著的α-2肾上腺素活性。
1.7-体外多发性硬化疾病模型：与神经元共培养的干扰素-γ损伤的大鼠少突胶质细胞
与神经元共培养的少突胶质细胞的培养
神经元/OPC的培养是按照杨等(2005年，《神经科学方法杂志》，149卷，1期，50-56页)之前描述的方法进行，具有改进。简单来说，移除17天大的大鼠胚胎(Wistar，Janvier实验室)的全脑(不带小脑)。在37℃条件下，用胰蛋白酶-EDTA(Pan Biotech公司)溶液处理全脑20min，其中胰蛋白酶-EDTA溶液的最终浓度为0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA。添加杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)和4.5g/L的葡萄糖来终止解离，其中DMEM中含有II级DNAseI(最终浓度为0.5mg /ml；Pan Biotech公司，批次：h140508)和10％胎牛血清(FCS；英杰公司，批号：41Q7218K)。通过10ml移液管的尖端吹吸3次以机械分离细胞。然后将细胞在4℃下以515g离心10分钟。弃去上清液，将滤饼重悬于特定的培养基中，该培养基组成如下：神经基质培养基(英杰公司，批号： 1636133)、2％B27补充液(英杰公司，批号：1660670)、2mmol/LL-谷氨酰胺(PanBiotech公司)、 2％PS溶液、1％FCS和10ng/ml血小板衍生生长因子(PDGF-AA，批号：H131205)。将细胞以20000 细胞/孔的密度接种在预涂覆了PLL(BD康宁公司，批号：6614022)和昆布氨酸(Sigma公司，批号：083M4034V)的96孔板中，在37℃，空气(95％)-CO2(5％)的气氛中，将板保持在加湿培养箱中。每2天用新鲜的培养基更换一半培养基。在第18天，在干扰素-γ(70U/ml，48H，R&D系统，批号：AAL2214081)施用前预培养供试化合物1小时。
供试化合物和干扰素-γ暴露
在培养的第18天，将供试化合物(4种浓度)溶于培养基中，然后在施用干扰素-γ(70U/ml， 48H)前，用与神经元共培养的少突胶质细胞进行预培养1小时。供试化合物培养孵化1小时后，在供试化合物存在的情况下，以70U/ml速度添加干扰素-γ，48H。然后，用冷乙醇(95％，Sigma 公司，批号：SZBD3080V)和乙酸(5％，Sigma公司，批号：SZBD1760V)溶液在-20℃下将细胞固定5分钟。用0.1％皂苷(Sigma公司，批号：BCBJ8417V)透化后，在室温下，使用小鼠产生的单克隆抗O4抗体(Sigma公司，批号：SLBF5997V)培养细胞2小时，其中该抗体以1/1000稀释于含有1％FCS，0.1％皂苷的PBS(PAN公司，批号：8410813)中。在室温下，该抗体用以1/400 稀释于含有1％FCS，0.1％皂苷的PBS中的Alexa Fluor 488山羊抗-小鼠IgG(Invitrogen，批号： 1664729)处理1小时来显示结果。
O4细胞总数的分析
对于每种条件，使用20x放大倍数的ImageXpress(分子器件)，每孔取30张照片。在相同的条件下拍摄所有图像。使用自定义模块编辑器(分子器件)自动进行O4细胞总数的分析。数据以控制条件的百分比表示(无中毒，无γ-干扰素＝100％)，从而表示γ-干扰素损伤。所有的值都表示为平均值+/-SEM(标准误差平均值)(每种条件n＝6孔)。
1.8-体外帕金森氏病模型：鱼藤酮损伤原代中脑大鼠神经元
中脑多巴胺能神经元的培养
大鼠多巴胺能神经元是按照Schinelli等人(1988年，《神经化学期刊》，50卷，1900-1907页) 和Visanji等人(2008年，《美国实验生物学联合会会刊》，22卷，7期，2488-2497页)所述方法培养。简单来说，在显微镜下切下从15日龄大鼠胚胎(Janvier实验室，法国)获得的中脑。除去胚胎中脑并置于含有2％青霉素-链霉素(PS，Pan Biotech公司，批号：1451013)和1％牛血清白蛋白(BSA， Pan Biotech公司，批次：h140603)的冰冷的莱博维茨媒介(L15，Pan Biotech公司，批次：9310614)。中脑弯曲的腹侧部分，即发育中的大脑中富含多巴胺能神经元的区域，用于细胞制备。
在37℃下，通过胰蛋白酶作用20min(胰蛋白酶0.05％，EDTA 0.02％，PanBiotech公司，批号：5890314)解离中脑。添加含有II级DNAse I(0.1mg/ml，PanBiotech公司，批号：H140508) 和10％胎牛血清(FCS，Gibco公司，批号：41Q7218K)的杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM PanBiotech公司，批号：1300714)来终止解离。然后通过10ml移液管进行3次吹吸使细胞机械分离。然后在+4℃下，将细胞在L15培养基中的BSA层(3.5％)上以180×g离心10min。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于特定的培养基中，该培养基由以下成分组成：神经基础培养基(英杰公司，批号： 1636133)，添加有B27(2％，英杰公司，批号：1660670)，L-谷氨酰胺(2mM，PanBiotech公司，批号：8150713)、2％的PS溶液、10ng/ml脑源性神经营养因子(BDNF，PanBiotech公司，批号： H140108)和1ng/ml胶质源性神经营养因子(GDNF，PanBiotech公司，批号：H130917)。使用台盼蓝排除试验在诺伊博尔式细胞计数器中计数存活细胞。将细胞以40000细胞/孔的密度接种在用聚 -L-赖氨酸(Corning Biocoat，批号：6614022)预涂的96孔板中，在37℃，5％CO2/95％空气气氛中，保持在潮湿的培养箱中。每2天用新鲜的培养基更换一半培养基。
在培养的第6天，除去培养基并加入新鲜的培养基，在对照培养基中，不用或用鱼藤酮(Sigma 公司，批号：021M2227V)以10nM稀释，每个条件评估3个孔。供试化合物溶于培养基中，然后在施用鱼藤酮前用中脑神经元预培养1h。
中毒24小时后，在室温下，pH＝7.3的条件下，用含有4％多聚甲醛(Sigma公司，批号： SLBF7274V)的PBS(Pan Biotech，Batch：4831114)溶液固定细胞20min。将细胞在PBS中再次洗涤两次，然后透化，并用含有0.1％皂苷(Sigma公司，批号：BCBJ8417V)和1％FCS的PBS溶液阻断非特异性位点15分钟。然后，用小鼠中产生的单克隆抗酪氨酸羟化酶抗体(TH，Sigma公司，批号：101M4796)在室温下培养细胞2h，其中该抗体以1/10 000稀释于含有1％FCS，0.1％皂苷的 PBS溶液中。在室温下，该抗体用以1/800稀释于含有1％FCS，0.1％皂苷的PBS中的Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠IgG(Invitrogen，批号：1664729)处理1h来显示结果。
TH阳性神经元总数的分析
用ImageXpress(美国分子器件)自动检测标记的培养物。对于每种条件，从3个孔中分析每孔 20个自动域(代表孔总表面的大约80％)。使用自定义模块编辑器(美国分子器件)自动分析TH 神经元的总数。数据以控制条件的百分比表示(无中毒，无鱼藤酮＝100％)，从而表示鱼藤酮损伤。每个培养物的所有值都表示为平均值+/-SEM(标准误差平均值)(每种条件n＝3孔)。
1.9-体外阿尔茨海默病模型：β-淀粉样蛋白1-42损伤的原代皮层大鼠神经元
大鼠皮层神经元的培养
大鼠皮层神经元是按照Singer等人(1999年，《神经科学期刊》，19卷，2455-2463页)和Callizot 等人(2013年，《神经科学研究杂志》，91卷，706-716页)所述方法培养。
怀孕的雌鼠(Wistar，Janvier实验室)在妊娠第15天通过颈椎脱臼被杀死。收集胎儿并立即置于含有2％青霉素(10,000U/ml)、链霉素(10mg/ml)溶液(PS；Pan Biotech公司，批号：1451013) 和1％牛血清白蛋白(BSA；Pan Biotech公司，批次：h140603)的冰冷的L15莱博维茨培养基(Pan Biotech公司，批号：9310614)中。在37℃下，用胰蛋白酶-EDTA(PanBiotech公司，批号：5890314) 溶液处理皮质20min，最终浓度为0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA。通过添加杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)和4.5g/升的葡萄糖(Pan Biotech公司，批号：1300714)来终止解离，其中DMEM含有II级DNAse I(最终浓度为0.5mg/ml；PanBiotech公司，批号：h140508)和10％胎牛血清(FCS；英杰公司，批次：41Q7218K)。通过10ml移液管的尖端吹吸3次以机械分离细胞。然后在4℃下将细胞以515g离心10min。弃去上清液，将滤饼重悬于特定的培养基中，所述培养基组成如下：具有 2％B27补充液(英杰公司，批号：1660670)的神经基质培养基(英杰公司，批号：1636133)、2mmol/L 的L-谷氨酰胺(PanBiotech公司，批量：8150713)、2％的PS溶液和10ng/ml脑源性神经营养因子 (BDNF；PanBiotech公司，批号：H140108)。使用台盼蓝排除试验在诺伊博尔式细胞计数器中计数存活细胞。将细胞以30000细胞/孔的密度接种在用聚-L-赖氨酸(Corning Biocoat，批号：6614022) 预涂的96孔板中，在37℃，空气(95％)-(5％)CO2气氛的培养箱中培养。每2天更换一次培养基。在培养11天后，用A-β溶液(见下文)使皮质神经元中毒。
供试化合物和β-淀粉样蛋白1-42暴露
按照Callizot等人2013年描述的方法制备β-淀粉样蛋白1-42。简单来说，将β-淀粉样蛋白1-42 肽(巴亨公司，批号：1014012)溶于上述特定的培养基中，不含血清，初始浓度为40μmol/L。在37℃下，在黑暗条件下搅拌该溶液3天，并在培养基中适当稀释至所用浓度后立即使用。
将供试化合物溶解在培养基中，然后在施用β-淀粉样蛋白1-42前，用原代皮层神经元预培养1 小时。在药物存在的条件下，将β-淀粉样蛋白1-42制剂加入在对照培养基，稀释至最终浓度为20μM (包括大约2μM的有毒低聚物，通过WB测量)。中毒24小时后，用冷的乙醇(95％，Sigma公司，批号：SZBD3080V)和乙酸(5％，Sigma公司，批号：SZBD1760V)溶液，在-20℃下将细胞固定 5分钟。用0.1％皂苷(Sigma公司，批号：BCBJ8417V)透化后，使用小鼠单克隆抗体抗微管相关蛋白2(MAP-2；Sigma公司，批号：063M4802)培养细胞2h，其中该抗体蛋白2以1/400稀释于含有1％胎牛血清(Invitrogen公司，批号：41Q7218K)和0.1％的皂苷的PBS(Pan biotech公司，批号：4831114)中。在室温下，该抗体用1/400稀释于含有1％胎牛血清和0.1％皂苷的PBS中的Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG(分子探针公司，批号：1572559)中处理1h来显示结果。
神经元总数的分析
用ImageXpress(美国分子器件)，以×20放大率自动检查标记的培养物。对于每种条件，从3 个孔中分析每孔30个自动域(代表孔总表面的大约80％)。使用自定义模块编辑器(美国分子器件) 自动分析神经元的总数。数据以控制条件的百分比表示(无中毒，无β-淀粉样蛋白1-42＝100％)，从而表示β-淀粉样蛋白1-42损伤。所有的值都表示为平均值+/-SEM(标准误差平均值)(每个培养的每种条件n＝3孔)。
1.10-小鼠体内的肌萎缩性侧索硬化(ALS)模型：SOD1-G93A转基因小鼠
表达突变人SOD1-G93A的转基因(TG)小鼠(杂合的TgN-SOD1-G93A-1粗糖；Gurney等(1994) 《科学》，264卷，1772-1775页)和5个野生型同窝出生的小鼠用于本实验。G93ASOD1小鼠是由德国查尔斯河(Charles River)公司繁殖的，使来自美国JAX实验室的半合子TG雄性小鼠与(品种 002726M；B6SJL TG SOD1 x G93A 1GUR/J，JAX)与WT雌性小鼠(品种10012，JAX)交配得到。将动物进行如下分组(雌性和雄性均匀分配到治疗组，即每个治疗组力求具有相等数量的雄性和雌性)：
转基因G93A SOD1小鼠
ο介质(Vehicle)QD(即每天一次)治疗的12只转基因G93A SOD1小鼠，从60日龄开始口服灌胃并持续到终点
ο化合物2(1.5mg/kg)BID(即每天两次)治疗的12只转基因G93A SOD1小鼠，从60日龄开始口服灌胃并持续到终点
ο化合物2(3mg/kg)QD治疗的12只转基因G93A SOD1小鼠，从60日龄开始口服灌胃并持续到终点
ο化合物2(3mg/kg)QD和利鲁唑(20mg/kg)联合使用治疗的12只转基因G93A SOD1小鼠，从60日龄开始口服灌胃并持续到终点
ο化合物2(10mg/kg)QD治疗的12转基因G93A SOD1小鼠，从60日龄开始口服灌胃并持续到终点
行为测试
在开始给药(基线，第60天)之前，以及给药第75、90、105和120天时进行转棒实验。将2-4天内出生的小鼠聚集在一起进行转棒试验。一天的环节包括在转棒装置(AccuScan仪器公司，美国哥伦比亚)上以4RPM进行5分钟的训练试验。30分钟后，对动物进行3次6分钟的连续加速试验，在360秒内速度从0变到40RPM，每次试验间隔至少30分钟。记录从杆上跌落的潜伏时间。移去360秒以上仍保持在杆上的小鼠，它们的时间记为360秒。
1.11-腓骨肌萎缩症1A型的体内模型：PMP-22过度表达的转基因大鼠
雄性PMP-22大鼠(Nave博士实验室，马克斯普朗克研究所的实验医学，德国哥廷根)和雌性斯普拉-道来氏大鼠(Elevage Janvier，法国)的交配获得CMT1A转基因大鼠。将动物饲养和维持在 Key-Obs(法国奥尔良)。动物程序严格遵守2010年9月22目的欧盟指令(2010/63/UE)。
将动物进行如下分组(本实验中仅包括雄性动物)：
ο载体QD治疗的8只转基因大鼠，从第5周龄开始口服灌胃并持续到终点
ο化合物2(1mg/kg)QD治疗的8只转基因大鼠，从第5周龄开始口服灌胃并持续到终点
ο化合物2(3mg/kg)QD治疗的8只转基因大鼠，从第5周龄开始口服灌胃并持续到终点
行为测试
以随机和盲方式测试动物，用于治疗和结果测量。行为实验和杆实验在Key-Obs设施进行和确认，由不清楚治疗的检查者进行。在治疗3周和5周后对CMT1A大鼠进行杆测试。杆测试评估了小鼠四个爪的肌肉力量和在固定杆上的平衡性能。将大鼠的四爪放置在木杆中间(直径：2.5cm；长度：50cm)。每次试验中，记录小鼠在杆上待的时间(跌落潜伏期)和跌落的次数。进行五次连续试验(最多60s)。
1.12-脑白质营养不良(PMD)的体外模型：在人细胞系中突变PLP1和DM20的过度表达
转染前一天，将293T细胞以300,000细胞/mL的浓度接种到板上，根据制造商的方法，使用脂质体2000，用PLP1和DM20突变体构转染293T细胞。转染后，细胞用分子处理或不处理。作为对照，用天然形式的蛋白质转染细胞。48h后，得到细胞溶解产物。通过蛋白质印迹法评估蛋白质积累。
1.13-2型糖尿病的体外模型：Min6和INS1细胞系
针对ER应激的细胞保护
在治疗前一天将细胞接种在96孔板中，Min6细胞系的密度为0.5×106个细胞/mL，INS1细胞系的密度为0.4×106个细胞/mL。
通过添加2.5μg/mL的衣霉素(西格玛奥德里奇集团)和磷酸酶抑制剂引发ER应激。
6小时后用新鲜培养基更换培养基，通过加入磷酸酶抑制剂维持细胞保护作用。
在衣霉素处理72小时后，使用细胞计数试剂盒-8(Sigma公司)按照供应商的建议方法，测量WST-8到甲臌中的减少来评估细胞存活率。
保护细胞免于容易出现胰岛素Akita错误折叠的积累
用胰岛素Akita突变结构核转染Min6细胞，并以300,000个细胞/mL的浓度接种在96孔板中， 24小时后，细胞用分子处理或不处理。作为对照，用非相关质粒核转染细胞。6天后，加入选择剂 (G418)。
处理9天后，使用细胞计数试剂盒-8(Sigma公司)按照供应商的建议方法，测量WST-8到甲臌中的减少来评估细胞存活率。
1.14-体外炎症/感染疾病模型：聚I:C诱导的小鼠胚胎成纤维细胞
实验方案
用聚I:C对小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)进行脂质体转染，并用两种浓度的本发明化合物(25 μM)处理6小时。培养6小时后，通过免疫印迹法(西方墨点法)监测eIF2α磷酸化(eIF2a-P) 和PPP1R15A(GADD34)的表达，同时通过ELISA在培养物的上清液中定量检测I型β-干扰素(IFN) 的产生。对照组(nt)和聚I:C/DMSO分别是阴性和阳性对照。
聚I:C(聚肌苷酸：聚胞苷酸或聚肌苷酸-聚胞苷酸钠盐)是用于模拟病毒感染的免疫刺激剂。在结构上，聚I:C类似于双链RNA，已知的是聚I:C与toll样受体3相互作用，该受体为B细胞和树突细胞的细胞内区室中表达的。
细胞培养
MEFs培养在DMEM、10％FCS(胎牛血清，Perbio公司)、100单位/ml的青霉素、100μg/ml 的链霉素、2mM谷氨酰胺、1×MEM非必需氨基酸和50μM 2-巯基乙醇中。用10μg/ml聚I:C(InvivoGen公司)和脂质体2000转染试剂(英杰公司)处理MEFs，处理时间依照指示。
免疫印迹
细胞溶解于1％的曲通X-100、50mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸、10mM NaCl、2.5mMMgCl2、2mM EDTA、10％的甘油并补充有完全微型蛋白酶抑制剂混合物片剂(瑞士罗氏)。使用BCA蛋白测定试剂盒(Pierce公司)进行蛋白定量测定。在免疫印迹和化学发光检测(化学发光底物，Pierce)之前，将25-50μg的曲通X-100可溶性材料装载在2％-12％梯度或8％的SDS-PAGE。识别GADD34(C-19) 的兔多克隆抗体来自圣克鲁斯生物技术，抗eIF2α[pS52]来自英杰公司。
酶联免疫吸附检测(Elisa)
使用鼠标干扰素β酶联免疫试剂盒(PBL干扰素源)，根据制造商的说明书，进行培养上清液中 IFN-β的定量测定。
1.15-体内视网膜纤毛运动障碍/视网膜色素变性的症状：BBS12基因敲除小鼠
基因敲除小鼠的产生和养动物饲
Bbs12-/-/J小鼠保持在C57BL/6遗传背景上(Mockel等人，2012年，《生物化学杂志》287卷， 37483-494页)。在控制湿度和温度的房间中饲喂和繁殖小鼠，12小时光照/黑暗循环，可以自由摄取常规食物和水。使用KAPA小鼠快速基因分型试剂盒((目录编号：KK7302，Kapa Biosystems公司，美国马萨诸塞州沃本)，通过聚合酶链反应(PCR)利用基因分型来鉴定Bbs12-/-/J全基因敲除小鼠。
玻璃体内注射用试剂
在无菌条件下制备用于玻璃体内注射的溶液。然后将1.25mM化合物2和100mM丙戊酸(VPA) 储备溶液稀释到PBS中，pH调到6，得到化合物2(2.5μM)+VPA(0.2mM)和化合物2(2.5μ M)的溶液。丙戊酸是购买的(目录编号：4543，西格玛奥瑞奇集团)。
玻璃体内注射
Bbs12-/-/J小鼠视网膜表型和机制已经被报道(Mockel等人，2012年)。在出生后14-16天，对小鼠进行玻璃体内注射。操作在外科显微镜下进行。用异氟烷麻醉小鼠。用0.3％阿托品滴眼剂(爱尔康公司)扩增小鼠的瞳孔。将连接到重复分液器(HamiltonBonaduzAG公司，瑞士博纳图斯)的 33号针从角膜缘插入玻璃体腔。通过显微镜监测针的位置。将1μl处理溶液注入小鼠的左眼，并向右眼注射pH6的1μlPBS作为对照。将具有玻璃体出血或视网膜损伤的小鼠从分析中排除。
视网膜电图
完成玻璃体内注射两周后，使用HMsERG系统(
Figure BDA0001201921520000381
美国密苏里州堪萨斯城)进行视网膜电图(ERGs)分析。将小鼠黑暗适应处理一夜，然后通过腹膜内注射托咪定(domitor)(7.6 μg/g体重)和氯胺酮(760μg/g体重)麻醉。如上文描述，小鼠瞳孔扩张。实验在暗红光(目录编号：R125IRR，飞利浦公司，法国雷讷市)中进行。根据制造商的说明(
Figure BDA0001201921520000382
美国密苏里州堪萨斯城)使用ERGs标准程序。简单来说，该方案包括在强度范围为0.1-25cd.s/m2的光子刺激后记录暗适应ERG(暗视视网膜电图)。通过ERG视图系统4.3(Xenotec，
Figure BDA0001201921520000383
美国密苏里州堪萨斯城)对ERG结果进行扩增和数字捕获。然后测量暗视反应的a波和b波。
透射电子显微镜
将样品浸入2.5％戊二醛和2.5％Para甲醛的二甲胂酸盐缓冲液(0.1M，pH 7.4)中来固定样品，并在4℃下在含有1％四氧化锇的0.1M二甲胂酸盐缓冲液中固定1小时，并通过一系列梯度的醇(50、 70、90、100％)和环氧丙烷每个浓度脱水30分钟。将样品包埋在EponTM812(西格玛奥德里奇集团，美国密苏里州圣路易)中。使用超薄切片机(伊利诺斯器械工程公司，德国韦茨拉尔组织学系统)以2μm切割半薄切片，并用甲苯胺蓝染色，并通过光学显微镜进行组织学分析。以70nm切割超薄切片并与乙酸双氧铀和柠檬酸铅对比，并在70kv下用莫尔加尼268D电子显微镜检查。通过 Mega View III照相机(软成像系统)数码捕获图像。
1.16-在培养的新生大鼠心肌细胞中低氧诱导的细胞凋亡
细胞培养
从1日龄Sprague Dawley大鼠(法国维耶)的心室获得新生大鼠心肌细胞的原代培养。大鼠安乐死，并切除其心脏。心脏切成小块(1-2mm3)，并使用新生大鼠心离解试剂盒和gentleMACSTM分离器(MiltenyiBiotec公司，德国)进行酶降解。解离后，过滤(70μm)匀浆物，得到单细胞悬浮液。分离的细胞被离心收集，并重新悬浮于含有10％马血清(HS)，5％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)。通过预涂肌细胞90min来丰富培养基，从而消耗非心肌细胞的数量。非附着的细胞以适当的细胞密度接种到6-或96-孔板。在37℃条件下，95％空气/5％CO2的氛围中，培养细胞24小时。然后，在正常或低氧(N2/CO2，95％/5％，0.3％O2)的培养室中培养前30分，用含有1％FBS和不同浓度的测试化合物的新鲜的DMEM培养基更换培养基。
用供试化合物治疗
纯化的新生大鼠心肌细胞以106细胞/2mL的浓度接种在96孔板中用于流式细胞仪实验。
24小时后，在0.1％的DMSO的培养基中用不同浓度的供试化合物处理心肌细胞。用培养基 (0.1％DMSO)处理阳性对照细胞。治疗开始三十分钟后，将细胞在低氧培养室(N2/CO2，95％/5％；的最终测得O2：0.3％)下培养36小时。
阴性对照细胞在含氧量正常的条件下，在37℃下，用培养基(1％FBS，0.1％DMSO)培养同样的时间。
凋亡细胞测量
在治疗期结束时，使用流式细胞仪测量凋亡细胞的数量。使用德国美天妮的膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(FITC)细胞凋亡检测试剂盒。细胞用PBS洗涤两次，并再悬浮于结合缓冲液中。根据制造商的说明，添加FITC-膜联蛋白V和碘化丙锭。在室温下混合物在黑暗中培养15分钟，然后通过 FACS扫描流式细胞仪检测细胞荧光。
2-结果
2.1-细胞保护作用和化合物选择性
使用本发明的所选择化合物进行的不同试验的结果下表1中示出。
例如，图1代表暴露于衣霉素中引起的应激后化合物1的细胞保护作用。
表1：
Figure BDA0001201921520000391
2.2-多发性硬化症
图2示出了本发明化合物1对干扰素-γ损伤的大鼠少突胶质细胞的剂量依赖性保护。
这些数据表明本发明的这些化合物是很有前途的有效治疗多发性硬化症的化合物。
2.3-帕金森氏症(PD)
图3示出了本发明的化合物2对鱼藤酮损伤的大鼠原代神经元的剂量依赖性保护。
这些数据表明本发明的这些化合物是很有前途的有效治疗共核蛋白病的化合物，尤其是治疗帕金森氏病。
2.4-阿尔茨海默氏病(AD)和淀粉样变性
图4示出了本发明的化合物2对β-淀粉样蛋白1-42损伤的大鼠原代皮层神经元的剂量依赖性保护。
这些数据表明本发明的这些化合物是很有前途的有效治疗淀粉样变性的化合物，尤其是治疗阿尔茨海默氏病。
2.5气肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)
图5表示用本发明化合物2治疗的转基因SOD1 G93A小鼠在第90天进行转棒试验的结果。
这些数据表明本发明的化合物，尤其是化合物1和2，能治疗转基因小鼠的运动功能障碍，是很有前途的有效治疗ALS的化合物。
2.6-腓骨肌萎缩症1A型(CMT-1A)
图6表示用本发明的化合物2治疗过度表达PMP22的转基因大鼠在第3周和第5周进行杆测试的结果。
这些数据表明本发明的化合物，尤其是化合物1和2，能治疗过度表达PMP22的转基因大鼠的运动功能障碍，是很有前途的有效治疗脱髓鞘疾病的化合物，如治疗CMT，尤其是治疗CMT1A和 CMT1B。
2.7-脑白质营养不良：佩利措伊斯-梅茨巴赫病(PMD)
已经有报道称PLP1和DM20蛋白质中T181P和L223P突变会引起佩利措伊斯-梅茨巴赫病的严重表型(Strautnieks等，1992年，《美国人类遗传学杂志》，51卷，4期，871-878页；Gow和Lazzarini 等，1996年，《自然遗传》，13卷，4期，422-428页)。
本发明的化合物1(5μM)能够预防在人293T细胞中表达的T181P突变DM20蛋白的积累(图 7)。
这些数据表明本发明的化合物，尤其是化合物1和2，是很有前途的有效治疗脱髓鞘疾病的化合物，如治疗脑白质营养不良，尤其是治疗PMD。
2.8-2型糖尿病
图8表示用本发明化合物6治疗Min6细胞中带有Akita突变的前胰岛素原的过度表达的结果。
不同浓度的化合物1和6能预防与错误折叠的蛋白质累积有关的Min6胰岛瘤细胞死亡(图9)，其中错误折叠蛋白质累积是通过暴露于衣霉素6小时诱导的。
不同浓度的化合物1和6能预防与错误折叠的蛋白质累积有关的INS1胰岛瘤细胞死亡(图10)，其中错误折叠蛋白质累积是由暴露于衣霉素6小时诱导的。
这些数据表明本发明的化合物是很有前途的有效治疗前驱糖尿病和糖尿病的化合物，优选治疗 2型前驱糖尿病和2型糖尿病。
2.9-视网膜纤毛运动障碍/巴尔得-别德尔综合征
化合物2能够保护感光细胞使其不凋亡，并保留光探测(图11)，从而减少BBS12-/-小鼠中内质网(图12)中的蛋白质载荷。这些结果表明，用化合物2和丙戊酸(VPA)联合治疗，或化合物 2独自治疗时，Bbs12-/-小鼠(图11)内ERG响应增加。图12是BBS12-/-小鼠光受体ER对指定给药治疗或基因型的响应的典型透射电镜图片。当单独注射PBS(左图)时观察到扩张现象，而化合物2(2.5μM)与VPA(丙戊酸)(0.2mM)结合使用进行一次玻璃体内注射后，能减小这种扩张。
这些数据表示本发明的化合物与增加BIP蛋白表达和/或活性的化合物例如丙戊酸一起使用，对于有效治疗视网膜纤毛运动障碍很有前途，例如治疗巴德-毕德氏综合症和色素性视网膜炎。
尽管没有测试，我们推测该治疗也可以有助于减少其他形式的细胞应激，例如光子应激。
2.10-与感染相关或非感染性炎性状况
MEFs对聚I:C的正常响应的特征在于PPP1R15A表达、PKR活化介导的eIF2α-P的增加(在时间上是可变的，与PPP1R15A表达水平相关)，以及I型干扰素的产生(范围500-700pg/ml)。敲除PPP1R15A-/-小鼠胚胎成纤维细胞不能响应聚I:C产生这种细胞因子。
本发明的化合物抑制PPP1R15A的效力是通过测量eIF2α的磷酸化作用的增加和PPP1R15A表达的减少来评估的，由于其自身的药物抑制PPP1R15A的表达减少，导致一般蛋白质合成的抑制作用和I型干扰素产生。
评估发现本发明的化合物在25μM时能有效增加eIF2α的磷酸化作用，减少PPP1R15A的表达，并防止I型干扰素的产生。例如，图13表示化合物1、6和8(25μM)预防聚I:C脂质体转染的鼠胚胎成纤维细胞生成I型IFN的能力。
这些数据表示本发明的化合物对于有效治疗与感染相关或非感染性炎性状况是很有前途的。
2.11-心肌缺血
本发明的化合物2保护培养的新生鼠心肌细胞使其不会出现因缺氧诱导的细胞凋亡(图14)。这些数据表示本发明的化合物对于有效治疗局部缺血是很有前途的，尤其是治疗心肌缺血。
本发明的各种修改和变化在不脱离本发明的范围和精神的情况下对本领域技术人员是显而易见的。尽管本发明已经结合具体的优选实施例进行描述，应该理解本发明要求保护的范围不能过于局限于这些具体实施例。实际上，用于实施本发明的所述方式的各种修改对相关领域技术人员来说是显而易见的，都在本发明的保护范围之内。

Claims (13)

1.通式(I)的化合物，或其药学可接受的盐，在制备用于治疗脑白质营养不良的药物中的用途；
Figure FDA0003071218290000011
其中:
R1是烷基、烷氧基、Cl、F或Br；
R2是H或F；
R3＝R4＝R5＝H；
R6选自R7、O R7和N R8 R9；
R7、R8和R9各自独立地选自烷基、环烷基、芳烷基、环烯基、杂环基和芳基，且每个基团被一个或多个R10基团任选取代；
每个R10基团独立地选自卤素、OH、＝O、CN、COO-烷基、芳烷基、SO2-烷基、SO2-芳基、COOH、CO-烷基、CO-芳基、NH2、NH-烷基、N-(烷基)2、CF3、烷基和烷氧基；
X和Z各自独立的是CH，Y选自CR11和N；
R11是H、烷基或F。
2.通式(I)的化合物，或其药学可接受的盐，在制备用于治疗脑白质营养不良的药物中的用途；
Figure FDA0003071218290000012
其中:
R1是烷基、Cl、F或Br；
R2是H或F；
R3＝R4＝R5＝H；
R6选自R7、O R7和N R8 R9；
R7、R8和R9各自独立地选自烷基、环烷基、芳烷基、环烯基、杂环基和芳基，且每个基团被一个或多个R10基团任选取代；
每个R10基团独立地选自卤素、OH、CN、COO-烷基、芳烷基、SO2-烷基、SO2-芳基、COOH、CO-烷基、CO-芳基、NH2、NH-烷基、N-(烷基)2、CF3、烷基和烷氧基；
X和Z各自独立的是CH，Y选自CR11和N；
R11是H。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中R1是Cl、Br、甲基或F。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其中R2是H。
5.根据权利要求1或2所述的用途，其中Y是CR11。
6.根据权利要求1或2所述的用途，其中R3和R4都是H。
7.根据权利要求1所述的用途，其中所述化合物或其药学可接受的盐选自以下：
Figure FDA0003071218290000021
Figure FDA0003071218290000031
或其药学可接受的盐。
8.根据权利要求2所述的用途，其中所述化合物或其药学可接受的盐选自以下：
Figure FDA0003071218290000041
或其药学上可接受的盐。
9.根据权利要求7所述的用途，其中所述化合物是化合物1或其药学可接受的盐。
10.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述脑白质营养不良是佩利措伊斯-梅茨巴赫病。
11.通式(I)的化合物，或其药学可接受的盐，与增加BIP蛋白表达和/或活性的化合物联合使用，在制备用于治疗视网膜疾病的药物中的用途，
Figure FDA0003071218290000051
其中:
R1是烷基、烷氧基、Cl、F或Br；
R2是H或F；
R3＝R4＝R5＝H；
R6选自R7、O R7和N R8 R9；
R7、R8和R9各自独立地选自烷基、环烷基、芳烷基、环烯基、杂环基和芳基，且每个基团被一个或多个R10基团任选取代；
每个R10基团独立地选自卤素、OH、＝O、CN、COO-烷基、芳烷基、SO2-烷基、SO2-芳基、COOH、CO-烷基、CO-芳基、NH2、NH-烷基、N-(烷基)2、CF3、烷基和烷氧基；
X和Z各自独立的是CH，Y选自CR11和N；
R11是H、烷基或F；
所述增加BIP蛋白表达和/或活性的化合物选自：丙戊酸或2-丙基-2-戊烯酸、曲古抑菌素A、锂、1-(3,4-二羟基-苯基)-2-硫氰酸根-乙酮和塞那肽-4，
所述视网膜疾病选自遗传性视网膜色素变性、色素性视网膜炎、黄斑变性、早产儿视网膜病、光诱导视网膜变性、视网膜脱离、糖尿病视网膜病变和青光眼。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述遗传性视网膜色素变性为视网膜纤毛运动障碍。
13.根据权利要求11所述的用途，其中通式(I)的化合物如权利要求1-7中任一项所定义。
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