KR102596871B1 - 신생혈관생성 활성을 지니는 펩타이드 조성물, 이를 이용한 약학 조성물 및 이를 이용한 화장품 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신생혈관생성 활성을 지니는 펩타이드 조성물, 이를 이용한 약학 조성물 및 이를 이용한 화장품 조성물에 관한 것으로, 비스파틴의 천연 리간드인 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드(nicotinamide mononucleotide)와 수소 결합을 형성하는 펩타이드이며, 상기 펩타이드는 신생혈관생성 활성도가 높아 신생혈관생성 활성을 증가시키는 약학 조성물 및 화장품 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 신생혈관생성 활성을 지니는 펩타이드 조성물은, 류신(L)-글루탐산(E)-티로신(Y)-라이신(K)-류신(L)-히스티딘(H)-아스파트산(D)-페닐알라닌(F)-글라이신(G)-티로신(Y)으로 구성되는 제1펩타이드; 또는 글루탐산(E)-티로신(Y)-라이신(K)-류신(L)-히스티딘(H)-아스파트산(D)-페닐알라닌(F)-글라이신(G)-티로신(Y)-아르지닌(R)-글라이신(G)-발린(V)으로 구성되는 제2펩타이드;를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다. 상기 제1펩타이드 및 제2펩타이드는 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드(nicotinamide mononucleotide)와 수소 결합을 형성하며, 상기 제1펩타이드 및 제2펩타이드는 상기 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드(nicotinamide mononucleotide)의 활성 부위 아미노산인 GLY384, ARG196 및 ARG311에 결합을 형성하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 신생혈관생성 활성을 지니는 펩타이드 조성물은, 류신(L)-글루탐산(E)-티로신(Y)-라이신(K)-류신(L)-히스티딘(H)-아스파트산(D)-페닐알라닌(F)-글라이신(G)-티로신(Y)으로 구성되는 제1펩타이드; 또는 글루탐산(E)-티로신(Y)-라이신(K)-류신(L)-히스티딘(H)-아스파트산(D)-페닐알라닌(F)-글라이신(G)-티로신(Y)-아르지닌(R)-글라이신(G)-발린(V)으로 구성되는 제2펩타이드;를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다. 상기 제1펩타이드 및 제2펩타이드는 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드(nicotinamide mononucleotide)와 수소 결합을 형성하며, 상기 제1펩타이드 및 제2펩타이드는 상기 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드(nicotinamide mononucleotide)의 활성 부위 아미노산인 GLY384, ARG196 및 ARG311에 결합을 형성하는 것을 특징으로 한다.
Description
본 발명은 신생혈관생성 활성을 지니는 펩타이드 조성물, 이를 이용한 약학 조성물 및 이를 이용한 화장품 조성물에 관한 것으로, 비스파틴의 활성부위를 기반으로 하는 펩타이드 조성물을 포함하며, 상기 펩타이드는 신생혈관생성 활성도가 높아 신생혈관생성 활성을 증가시키는 약학 조성물 및 화장품 조성물로 사용될 수 있다.
혈관계의 형성은 우리 몸에서 혈관이 형성되는 과정을 의미하는 혈관 형성(vasculogenesis)과 기존의 혈관(맥관)으로부터 혈관이 새로 생기는 것을 의미하는 신생혈관생성(angiogenesis)으로 분류할 수 있다. 신생혈관생성은 종양의 성장과 전이 과정에 혈액을 공급하기 위한 필수적인 과정으로 알려져 있지만, 배아성성, 조직 복구 및 기관 재생과 같은 다양한 정상적 생리적 현상에서도 필수적인 과정이다(Hoeben 등, 2004), 특히 창상 치유와 조직 회복과 같은 피부 재생 (Tonnesen 등, 2000; Li 등, 2003)이나 난포발달과 수정란 착상과 같은 생리적 현상에도 매우 중요한 역할을 한다(Geva와 Jaffe, 2000; Devesa와 Caicedo, 2019; Billhaq 등, 2020).
피부는 노화 혹은 물리적 자극 및 화상 등의 외상에 대한 노출이 용이하여 피부가 손상되기 쉽다. 현재 피부 노화와 손상의 치료로 거상술, 미세지방이식술, 레이저 및 자기혈 피부 재생술, 줄기세포배양 이식 등 다양한 시술이 사용되고 있으나, 아직까지 근본적인 치료의 방법이 확립되지 못하고 있다. 또한, 지방세포유래 줄기세포를 이용한 치료 전략이 적용되고 있으니 (Gaur 등, 2017, Cho 등, 2018; Huayllani 등, 2020), 지방세포의 침습적인 채취와 배양 공간 및 시간 등의 어려움으로 임상에서 일반적으로 사용되는데 많은 어려움이 있다.
이에 최근 들어 일부 양성류 및 설치류, 나아가 사람의 배아기에서 보이는 피부 재생의 현상에 착안하여 창상 치유 과정에 관여하는 성장인자들의 상호 작용을 고려한 피부노화 및 피부 손상에 대한 피부 재생 기반의 치료 전략이 대두되면서 (Moore 등, 2018; Stoica 등, 2020), 피부 재생에 있어서 신생혈관생성의 중요성이 부각되고 있다 (Lu 등, 2021). 이와 같이 신생혈관생성은 피부재생에 있어서 매우 중요한 역할을 수행한다.
천연 펩타이드 서열의 대부분은 그들의 수용체에 작용제로 작용하기 때문에 작용적 활성도를 지닌 디자인된 저분자 펩타이드 서열을 찾고자 할 경우 천연 펩타이드를 시작점으로 고려한다. 단백질-펩타이드 도킹 시뮬레이션 기술은 컴퓨터 프로그램 기반의 약물 디자인 (computer-aided drug design, CADD) 기술의 하나로, 천연 리간드와 동일하거나 유사하게 작용하여 수용체에 결합하였을 때 최소한 비슷한 생물학적 효능을 발생할 수 있는 저분자 펩타이드를 도출하는데 매우 유용하게 적용되고 있다 (Lee 등, 2015).
신생혈관생성의 대표적 조절인자로 vascular endothelial growth factor (VEGF)와 비스타틴 (visfatin)이 알려져 있다. 비스파틴은 분자량 55kDa으로 원래 B-임파구 세포의 전구체의 성장을 촉진하는 pre-B cell colony enhancing factor로 알려졌으나 (Samal 등, 1994), 지방세포, 대식세포, 양막상피세포 등 다양한 세포에서 분비되는 adipokines의 일종으로 알려지고 있다 (Ognjanovic 등, 2001; Fukuhara 등, 2005; Curat 등, 2006). 본 연구팀을 비롯한 많은 발명들은 비스파틴이 VEGF의 발현을 촉진할 뿐 아니라, 비스파틴 그 자체로도 신생혈관생성을 촉진함이 보고되고 있다 (Adya 등, 2008l; Xiao 등, 2009; Bae 등, 2009, Choi 등, 2012 ).
그러나 비스파틴은 분자량이 커서 그 자체로는 피부재생이나 신생 혈관 생성 증진 목적의 치료제로 개발하기에는 많은 제한점을 지닌다. 이에 반해 저분자 펩타이드는 높은 생리활성, 높은 특이성, 안정성 그리고 구조와 분자의 다양성 등의 장점을 가지고 있어서 최근 의약품 시장에서 펩타이드의 유용성 및 시장성이 확대되고 있는 추세이다 (Fosgerau & Hoffmann, 2015). 따라서 신생혈관생성 촉진 효능의 저분자 단백질 또는 펩타이드가 개발된다면, 피부 노화와 손상의 예방 및 치료제로서의 개발 가능성과 임상적 유용성은 더욱 커질 것으로 기대되고 된다.
그러므로 본 발명은 컴퓨터 기반 신약 디자인(computer-aided drug design)의 단백질-펩타이드 도킹 시뮬레이션 기술을 이용하여 비스파틴의 활성 부위를 기반으로 하는 신생혈관생성 촉진 효능의 펩타이드를 개발하고자 한다.
(1) Adya R, Tan BK, Punn A, Chen J, Randeva HS. Visfatin induces human endothelial VEGF and MMP-2/9 production via MAPK and PI3K/Akt signalling pathways: novel insights into visfatin-induced angiogenesis. Cardiovasc Res 2008;78:356-65.
(2) Bae YH, Bae MK, Kim SR, Lee JH, Wee HJ, Bae SK. Upregulation of fibroblast growth factor-2 by visfatin that promotes endothelial angiogenesis. Biochem Biophys Res Commun 2009;379:206-11.
(3) Billhaq DH, Lee SH, Lee S. The potential function of endometrial-secreted factors for endometrium remodeling during the estrous cycle.Anim Sci J 2020;91:e13333.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하기 위해서 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 55k Da의 비스파틴이 큰 분자량으로 인해 치료제로 개발하는 데 제한이 있으므로, 단백질-도킹 컴퓨터 시뮬레이션 기술을 이용하여 비스파틴 활성 부위 기반의 신생혈관생성 효능을 가지는 펩타이드를 개발하는 것이다.
발명이 해결하고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 펩타이드 기반의 신생혈관생성 효능 물질을 개발하기 위해 상기의 문제의 해결을 위해 컴퓨터 기반 신약 디자인(computer-aided drug design)의 단백질-펩타이드 도킹 시뮬레이션 기술을 활용하였다.
본 발명에 따른 신생혈관생성 활성을 지니는 펩타이드 조성물은,
류신(L)-글루탐산(E)-티로신(Y)-라이신(K)-류신(L)-히스티딘(H)-아스파트산(D)-페닐알라닌(F)-글라이신(G)-티로신(Y)으로 구성되는 제1펩타이드; 또는
글루탐산(E)-티로신(Y)-라이신(K)-류신(L)-히스티딘(H)-아스파트산(D)-페닐알라닌(F)-글라이신(G)-티로신(Y)-아르지닌(R)-글라이신(G)-발린(V)으로 구성되는 제2펩타이드;를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.
상기 제1펩타이드 및 제2펩타이드는 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드(nicotinamide mononucleotide)와 수소 결합을 형성하며,
상기 제1펩타이드 및 제2펩타이드는 상기 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드(nicotinamide mononucleotide)의 활성 부위 아미노산인 GLY384, ARG196 및 ARG311에 결합을 형성하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 신생혈관생성 활성용 약학 조성물은,
류신(L)-글루탐산(E)-티로신(Y)-라이신(K)-류신(L)-히스티딘(H)-아스파트산(D)-페닐알라닌(F)-글라이신(G)-티로신(Y)으로 구성되는 제1펩타이드; 또는
글루탐산(E)-티로신(Y)-라이신(K)-류신(L)-히스티딘(H)-아스파트산(D)-페닐알라닌(F)-글라이신(G)-티로신(Y)-아르지닌(R)-글라이신(G)-발린(V)으로 구성되는 제2펩타이드;를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 신생혈관생성 활성용 화장품 조성물은,
류신(L)-글루탐산(E)-티로신(Y)-라이신(K)-류신(L)-히스티딘(H)-아스파트산(D)-페닐알라닌(F)-글라이신(G)-티로신(Y)으로 구성되는 제1펩타이드; 또는
글루탐산(E)-티로신(Y)-라이신(K)-류신(L)-히스티딘(H)-아스파트산(D)-페닐알라닌(F)-글라이신(G)-티로신(Y)-아르지닌(R)-글라이신(G)-발린(V)으로 구성되는 제2펩타이드;를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.
상기 과제의 해결 수단에 의해, 본 발명은 비스파틴과 같이 큰 분자량으로 인해 치료제로 개발하는 데 제한이 있는 문제점을 해결하기 위한 것으로, 컴퓨터 기반 신약 디자인(computer-aided drug design)의 단백질-펩타이드 도킹 시뮬레이션 기술에 의해 비스파틴의 활성 부위를 기반으로 하는 신생혈관생성 효능을 가지는 펩타이드를 개발할 수 있다.
이러한 펩타이드는 비스파틴과 동일하거나 우수한 신생혈관생성 촉진 효능을 가질 수 있다.
도 1은 본 발명인 비스파틴 유래 신생혈관생성 활성을 지니는 펩타이드 조성물의 염기서열로, 파란색과 빨간색은 비스파틴의 B-도메인에 속하는 염기서열이고, 6개의 빨간색으로 표시된 염기서열은 핫스팟(hotspots)이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드(NMN)가 비스파틴의 활성 부위에 도킹된 포즈로, NMN은 스틱으로 그려지고 비스파틴 활성 부위는 공과 스틱으로 표현되며, 파란색의 끊어진 선은 H 결합 교호작용을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드(NMN)가 제1펩타이드의 활성 부위에 도킹 포즈로, NMN은 스틱으로 그려지고 비스파틴 활성 부위는 공과 스틱으로 표현되며, 파란색의 끊어진 선은 H 결합 교호작용을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드(NMN)가 제2펩타이드의 활성 부위에 도킹 포즈로, NMN은 스틱으로 그려지고 비스파틴 활성 부위는 공과 스틱으로 표현되며, 파란색의 끊어진 선은 H 결합 교호작용을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 제1펩타이드 및 제2펩타이드가 HUVECs 세포에 미치는 세포독성 효과를 나타낸 것이으로, 세포 생존 가능성은 MTT 분석을 사용하여 제1펩타이드 및 제2펩타이드 처리 후 24시간 후에 추정되고, 데이터는 평균값으로 표시되며, 도면 내 Vis는 비스파틴을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 제1펩타이드 및 제2펩타이드의 세포 침입 효과로, (A)는 대표 이미지이고, (B)는 24시간 세포침입 그래프이다. HUVECs(2×104)를 비스타틴 펩타이드와 함께 혈청 프리 배지 100 μL에 트랜스웰의 상단 구획에 시드하고 전체 배지를 하단 측면에 추가했다. 24시간 후, 광학 현미경 (40×)에 의해 단일 필터에서 전체 세포 수를 세는 것으로 세포 침투를 결정했다. 데이터는 세 가지 독립적인 실험의 평균값±SD로 표시되었다. ***P<0.0001 (vs con).)
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 제1펩타이드 및 제2펩타이드가 세포 이동에 미치는 영향을 나타낸 것으로, (A)는 대표 이미지이고, (B)는 18시간 세포 이동 그래프이다. HUVECs (2×105/well)는 24웰 판에 도금되어 밤새 배양되었다. 그런 다음 P200 피펫 팁을 사용하여 세포를 긁고 제1펩타이드 및 제2펩타이드를 포함하거나 포함하지 않고 배지에서 추가로 배양했다. 세포들은 18시간 동안 이동하도록 허용되었다. 이동 패턴은 위상 대비 현미경(×40)을 사용하여 관찰되었다. 데이터는 세 가지 독립적인 실험의 평균값±SD로 표시되었다. ***P<0.0001 (vs con).)
도 8은 본 발명의 일실시예에 따라 Matrigel 분석에서 튜브 형성에 대한 제1펩타이드 및 제2펩타이드의 영향을 나타낸 것으로, (A)는 대표 튜브 형성 이미지이고, (B)는 혈관신생 개략도 이미지이고, (C)는 브런스 수이고, (D)는 총 가지 수 HUVECs(20,000개 세포/웰)는 이전에 중합된 마트리겔 층에 시드(seed)를 뿌렸고 제1펩타이드 및 제2펩타이드를 포함하거나 포함하지 않고 처리되었다. Matrigel 배양액은 37℃에서 배양하였으며, 4시간 후 위상조영 현미경(×40)을 이용하여 세포형태의 변화를 포착하였다. 각각의 샘플은 중복으로 분석되었고, 독립적인 실험은 3번 반복되었다. *P<0.05, **P,0.01, ***P<0.001(vs con).)
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드(NMN)가 비스파틴의 활성 부위에 도킹된 포즈로, NMN은 스틱으로 그려지고 비스파틴 활성 부위는 공과 스틱으로 표현되며, 파란색의 끊어진 선은 H 결합 교호작용을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드(NMN)가 제1펩타이드의 활성 부위에 도킹 포즈로, NMN은 스틱으로 그려지고 비스파틴 활성 부위는 공과 스틱으로 표현되며, 파란색의 끊어진 선은 H 결합 교호작용을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드(NMN)가 제2펩타이드의 활성 부위에 도킹 포즈로, NMN은 스틱으로 그려지고 비스파틴 활성 부위는 공과 스틱으로 표현되며, 파란색의 끊어진 선은 H 결합 교호작용을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 제1펩타이드 및 제2펩타이드가 HUVECs 세포에 미치는 세포독성 효과를 나타낸 것이으로, 세포 생존 가능성은 MTT 분석을 사용하여 제1펩타이드 및 제2펩타이드 처리 후 24시간 후에 추정되고, 데이터는 평균값으로 표시되며, 도면 내 Vis는 비스파틴을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 제1펩타이드 및 제2펩타이드의 세포 침입 효과로, (A)는 대표 이미지이고, (B)는 24시간 세포침입 그래프이다. HUVECs(2×104)를 비스타틴 펩타이드와 함께 혈청 프리 배지 100 μL에 트랜스웰의 상단 구획에 시드하고 전체 배지를 하단 측면에 추가했다. 24시간 후, 광학 현미경 (40×)에 의해 단일 필터에서 전체 세포 수를 세는 것으로 세포 침투를 결정했다. 데이터는 세 가지 독립적인 실험의 평균값±SD로 표시되었다. ***P<0.0001 (vs con).)
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 제1펩타이드 및 제2펩타이드가 세포 이동에 미치는 영향을 나타낸 것으로, (A)는 대표 이미지이고, (B)는 18시간 세포 이동 그래프이다. HUVECs (2×105/well)는 24웰 판에 도금되어 밤새 배양되었다. 그런 다음 P200 피펫 팁을 사용하여 세포를 긁고 제1펩타이드 및 제2펩타이드를 포함하거나 포함하지 않고 배지에서 추가로 배양했다. 세포들은 18시간 동안 이동하도록 허용되었다. 이동 패턴은 위상 대비 현미경(×40)을 사용하여 관찰되었다. 데이터는 세 가지 독립적인 실험의 평균값±SD로 표시되었다. ***P<0.0001 (vs con).)
도 8은 본 발명의 일실시예에 따라 Matrigel 분석에서 튜브 형성에 대한 제1펩타이드 및 제2펩타이드의 영향을 나타낸 것으로, (A)는 대표 튜브 형성 이미지이고, (B)는 혈관신생 개략도 이미지이고, (C)는 브런스 수이고, (D)는 총 가지 수 HUVECs(20,000개 세포/웰)는 이전에 중합된 마트리겔 층에 시드(seed)를 뿌렸고 제1펩타이드 및 제2펩타이드를 포함하거나 포함하지 않고 처리되었다. Matrigel 배양액은 37℃에서 배양하였으며, 4시간 후 위상조영 현미경(×40)을 이용하여 세포형태의 변화를 포착하였다. 각각의 샘플은 중복으로 분석되었고, 독립적인 실험은 3번 반복되었다. *P<0.05, **P,0.01, ***P<0.001(vs con).)
본 명세서에서 사용되는 용어에 대해 간략히 설명하고, 본 발명에 대해 구체적으로 설명하기로 한다.
본 발명에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
명세서 전체에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.
아래에서는 첨부한 도면을 참고하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
본 발명에 대한 해결하고자 하는 과제, 과제의 해결 수단, 발명의 효과를 포함한 구체적인 사항들은 다음에 기재할 실시 예 및 도면들에 포함되어 있다. 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시 예들을 참조하면 명확해질 것이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.
신생혈관생성은 피부재생 기능에 있어서 매우 중요한 역할을 수행한다. 비스파틴은 지방에서 분비되는 55kDa의 사이토카인으로 신생혈관생성 조절자인 vascular endothelial growth factor (VEGF)의 발현을 촉진시킬 뿐 아니라, 자체로도 신생혈관생성 촉진 기능을 가진다. 그러나 비스파틴 그 자체는 분자량이 커서 치료 약제로 개발하는데 제한이 많다. 따라서 본 발명은 computer-aided drug design의 단백질-펩타이드 도킹 시뮬레이션 방법을 통해 비스파틴 활성 부위 기반의 신생혈관생성 효능의 펩타이드를 개발하고자 한다.
본 발명은 비스파틴과 유사하거나 우수한 효능을 지닌 비스파틴 기반의 펩타이드를 생성하기 위해 비스파틴의 활성부위가 있는 B-도메인 (181-390 잔기)을 중첩 (overlapping) 기술을 이용하여 작은 펩타이드로 잘라냈다. 잘라낸 펩타이드를 두 개의 단백질-펩타이드 도킹 프로그램 (HADDOCK, GalaxyPEPDOCK)에 의해 비스파틴과 친화력이 가장 높은 펩타이드를 생성하였다. 그 가운데 친화력이 가장 높은 2개의 펩타이드에 대해 인간 탯줄 정맥 내피 세포를 이용하여 세포 독성 검사 후, 세포 이동성, 전이성 및 혈관 형성 등의 신생혈관생성 활성도를 조사하였다.
그 결과로, B-도메인을 중첩 기술로 아미노산 서열 길이 6에 중첩 아미노산 수 3 (데이터 세트-1), 아미노산 서열 길이 7에 중첩 아미노산 수 2 (데이터 세트-2), 아미노산 서열 길이 9에 중첩 아미노산 수 3 (데이터 세트-3)을 기준으로 잘랐을 때, 데이터 세트-1에서 38개, 데이터 세터-2에서 42개, 데이터 세트-3에서 34개 펩타이드 등 총 114개의 잘려진 펩타이드를 얻었다. 이들 114개 펩타이드로부터 도킹 프로그램을 통해 친화력이 높은 9개의 펩타이드 (10-15개의 아미노산 잔기)를 도출하였으며, 그 중 친화력이 가장 높은 2개의 펩타이드는 MTT 검사에서 세포독성을 보이지 않았으며, 비스파틴 그 자체나 양성대조군 fibroblast growth factor (FGF) 보다 우수한 세포 이동성, 세포 전이성 및 혈관 형성의 신생혈관생성 활성도를 보였다
이러한 결과들은 단백질-펩타이드 도킹 시뮬레이션을 통해 얻어진 펩타이드가 비스파틴 보다 더 효율적인 신생혈관생성 효능을 가지고 있음을 보여주고 있다. 또한 이러한 결과들은 단백질-펩타이드 도킹 시뮬레이션이 고분자 단백질로부터 동일 효능 이상의 저분자 펩타이드를 생성하는데 매우 효과적임을 시사한다.
본 발명에 따른 신생혈관생성 활성을 지니는 펩타이드 조성물은 제1펩타이드 또는 제2펩타이드를 유효성분으로 함유한다.
상기 제1펩타이드는 류신(L)-글루탐산(E)-티로신(Y)-라이신(K)-류신(L)-히스티딘(H)-아스파트산(D)-페닐알라닌(F)-글라이신(G)-티로신(Y)으로, 10개의 아미노산 잔기로 구성된다.
상기 제2펩타이드는 글루탐산(E)-티로신(Y)-라이신(K)-류신(L)-히스티딘(H)-아스파트산(D)-페닐알라닌(F)-글라이신(G)-티로신(Y)-아르지닌(R)-글라이신(G)-발린(V)으로, 12개의 아미노산 잔기로 구성된다.
상기 제1펩타이드 및 제2펩타이드는 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드(nicotinamide mononucleotide)와 수소 결합을 형성하며, 상기 제1펩타이드 및 제2펩타이드는 상기 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드(nicotinamide mononucleotide)의 활성 부위 아미노산인 GLY384, ARG196 및 ARG311에 결합을 형성하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 신생혈관생성 활성용 약학 조성물은, 상기 신생혈관생성 활성을 지니는 펩타이드 조성물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 신생혈관생성 활성용 약학 조성물은 제1펩타이드 또는 제2펩타이드를 유효성분으로 포함한다.
상기 제1펩타이드는 류신(L)-글루탐산(E)-티로신(Y)-라이신(K)-류신(L)-히스티딘(H)-아스파트산(D)-페닐알라닌(F)-글라이신(G)-티로신(Y)으로, 10개의 아미노산 잔기로 구성된다.
상기 제2펩타이드는 글루탐산(E)-티로신(Y)-라이신(K)-류신(L)-히스티딘(H)-아스파트산(D)-페닐알라닌(F)-글라이신(G)-티로신(Y)-아르지닌(R)-글라이신(G)-발린(V)으로, 12개의 아미노산 잔기로 구성된다.
상기 제1펩타이드 및 제2펩타이드는 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드(nicotinamide mononucleotide)와 수소 결합을 형성하며, 상기 제1펩타이드 및 제2펩타이드는 상기 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드(nicotinamide mononucleotide)의 활성 부위 아미노산인 GLY384, ARG196 및 ARG311에 결합을 형성하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 약학 조성물은 이미 사용되고 있는 항히스타민제, 소염진통제, 항암제 및 항생제 등의 약제와 함께 제제화하거나 병용하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 조성물에 포 함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리 톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀 룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형 제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이 러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외 에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유 제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들 면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로 제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 주사용 조성물과 혼합하여 포유동물의 혈관신생을 유도하고자 하는 부위에 주사 형태 로 투여할 수 있고, 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하며, 상기 약학 조성물은 멸균되거나 방부제, 안정화제, 습윤제, 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제와 같은 보조제 또는 기 타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.5mg/kg 내지 10mg/kg으로 투여할 수 있으며, 반감기에 따라 일일 수회 내지 일주일에 1회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 따른 신생혈관생성 활성용 화장품 조성물은, 상기 신생혈관생성 활성을 지니는 펩타이드 조성물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 신생혈관생성 활성용 화장품 조성물은 제1펩타이드 또는 제2펩타이드를 유효성분으로 포함한다.
상기 제1펩타이드는 류신(L)-글루탐산(E)-티로신(Y)-라이신(K)-류신(L)-히스티딘(H)-아스파트산(D)-페닐알라닌(F)-글라이신(G)-티로신(Y)으로, 10개의 아미노산 잔기로 구성된다.
상기 제2펩타이드는 글루탐산(E)-티로신(Y)-라이신(K)-류신(L)-히스티딘(H)-아스파트산(D)-페닐알라닌(F)-글라이신(G)-티로신(Y)-아르지닌(R)-글라이신(G)-발린(V)으로, 12개의 아미노산 잔기로 구성된다.
상기 제1펩타이드 및 제2펩타이드는 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드(nicotinamide mononucleotide)와 수소 결합을 형성하며, 상기 제1펩타이드 및 제2펩타이드는 상기 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드(nicotinamide mononucleotide)의 활성 부위 아미노산인 GLY384, ARG196 및 ARG311에 결합을 형성하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 조성물들은, 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유할 수도 있으며, 예를 들어 물성 개선을 위하여 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제, 보습제, 점증제, 무기염류, 유화제, 합성 고분자 물질 등의 첨가제를 더 포함할 수도 있을 뿐만 아니라, 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당 및 해초 엑기스 등의 보조 성분을 더 포함할 수도 있다. 상기 성분들은 제형 또는 사용 목적에 따라서 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 그 첨가량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 선택될 수 있지만, 조성물 총중량에 대하여 0.01~5 중량%, 바람직하게는 0.01∼3 중량%일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 조성물의 제형 역시 용액, 유화물, 점성형 혼합물, 타블렛, 분말 등의 다양한 형태일 수 있으며, 이는 단순 음용, 주사 투여, 스프레이 방식 또는 스퀴즈 방식 등의 다양한 방법으로 투여될 수 있다.
아미노산 서열분석을 거친 후, 본 발명에 따른 펩타이드는 그의 아미노산 서열이 표 2에 나타나는 서열번호 1 내지 2와 같다는 것을 확인했다.
| 서열번호 | 펩타이드 서열 |
| 서열번호 1 | L-E-Y-K-L-H-D-F-G-Y |
| 서열번호 2 | E-Y-K-L-H-D-F-G-Y-R-G-V |
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 본 발명의 목적, 특징, 장점은 이하의 실시예를 통하여 쉽게 이해될 것이다. 본 발명은 여기서 설명하는 실시예에 한정되지 않고, 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 여기서 소개되는 실시예는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 따라서 이하의 실시예에 의해 본 발명이 제한되어서는 안 된다.
실시예 1 : 재료 및 방법
1-1) 펩타이드 라이브러리의 구성
비스파틴의 아미노산 서열에서 중요한 핫스팟 또는 활성 지점을 결정하기 위해 다음과 같은 시스템 접근을 진행하였다. 비스파틴의 3차원 구조 분석을 통해 활성 부위가 B-도메인 (181-390 잔기)에 있음을 확인하고 (Kim 등, 2006; Zhang 등, 2011), 중첨 기술을 이용하여 아미노산 서열의 길이 (6개, 7개, 9개)와 중첩된 아미노산 개수 (각각 3개, 2개, 3개)를 기준으로 구형의 B-도메인을 작은 크기의 펩타이드로 잘랐다. 잘라낸 펩타이드 서열의 3차원-구조를 PEPstrMOD 웹 서버 (Kaur 등, 2007; Singh, 등, 2015)를 이용하여 확인한 다음, B-도메인의 핫스팟 또는 활성지점을 동정하고 비스파틴 유래 천연 펩타이드 서열을 디자인하기 위해 비스파틴 단백질의 3차원 구조를 고려한 “구조-기반의 분자 도킹” 시뮬레이션 분석을 수행하였다.
1-2) 분자 도킹 시뮬레이션 분석
비스파틴의 3차원 구조 (PDB ID 2G95)는 RCSB 단백질 데이터 뱅크로부터 확보하고 (http://www.rcsb.org), 알려진 비스파틴의 활성부위의 아미노산이 TYR18, PHE193, TYR195, ARG196, GLY197, ASP219, HIS247, ARG311, ARG313, GLY353, ASP354임을 확인하였다 (Kim 등, 2006). 그런 다음 HADDOCK (Dominguez 등, 2003)와 GalaxyPepDock (Lee 등, 2015)의 2개의 단백질-펩타이드 도킹 시뮬레이션 프로그램을 이용하여 비스파틴과 가장 친화력이 높은 펩타이드를 동정하였다.
1-3) 펩타이드의 합성
도킹 시뮬레이션에 의해 도출된 친화력인 가장 높은 2개의 펩타이드는 ㈜ GL 바이오켐 (상하이, 중국)에 의뢰하여 다음과 같은 합성 펩타이드를 제공받아 신생혈관생성 활성도에 사용하였다. 합성 펩타이드는 질량분석기 (mass spectrometry)와 HPLC에 의해 보증된 순도 95% 이상으로 제작되어 건조 분말로 공급받았으며, DMSO에서 1 mg/mL 농도로 재구성한 후, -20°C에서 보관하여 사용하였다.
1-4) 인간 탯줄 정맥 내피 세포 (human vascular endothelial cells, HUVECs)의 배양
HUVECs (PromoCell, Heidelberg, Germany)를 2% FBS(fetal bovine serum)이 함유된 Supplement Mix (PromoCell)가 첨가된 EBM(endothelial basal medium)-2 배지에서 배양하였다. Supplement Mix는 5 ng/mL epidermal growth factor (EGF), 10 ng/mL basic fibroblast growth factor (bFGF), 20 ng/mL insulin-like growth factor (IGF), 0.5 ng/mL VEGF, 1 ug/mL ascorbic acid, 22.5 ug/mL heparin과 0.2 ug/mL hydrocortisone으로 구성되어 있다. 일부 실험에서는 세포를 Supplement Mix가 첨가된 EBM 배지에서 배양하였으며, 모든 실험에서 계대배양 2와 7 사이의 세포를 사용하였다. 세포는 37°C, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다.
1-5) MTT 세포 독성 검사
HUVECs 세포를 96-well 배양 용기 (SPL, Korea)에 10,000개의 세포를 접종하고 37°C, 5% CO2 배양기에서 비스파틴 (1000ng/ml)과 도킹 시뮬레이션에서 얻은 친화력이 가장 높은 펩타이드를 각각 첨가한 EBM-2 배지로 밤샘 (overnight) 배양하였다. MTT 시약 (Sigma-Aldrich)을 최종 농도가 0.5 mg/ml 되도록 각 well에 첨가하였다. 4시간 후 배지를 제거하고 세포에 형성된 formazan 크리스탈을 DMSO (dimethyl sulfoxide)로 용해하여 Synergy HTX Multi-Mode Reader (BIO-TEK, Vermont, U.S.A)를 이용하여 540 nm 파장에서 formazan 용액의 흡광도를 측정하였다. 각 시료당 3회 반복 실험하였다.
1-6) 트랜스웰 이용한 세포의 전이성 평가
세포의 전이 능력은 24-well의 트랜스웰 시스템을 이용하여 결정하였다. 트랜스웰의 상부 면을 1 mg/mL Matrigel로 웰당 10 μL로 코팅하고 비스파틴-유래 펩타이드가 첨가된 100μL의 혈청이 없는 EBM-2 배지에 HUVECs 세포를 2×104 농도를 트랜스웰의 상부 구획에 분주한 다음, 하부 면까지 배지로 가득 채웠다. 세포를 37°C, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양한 후, 메탄올로 고정하고, hematoxylin과 eosin으로 염색하였다. 막의 상층부 면 위의 세포는 면봉으로 닦아서 제거한 다음, 세포의 전이성을 40 배율의 광학현미경에 의해 단일 필터 안에 있는 전체 세포 수를 계수함으로써 결정하였다. 각 시료는 두 번 반복하여 진행하였으며, 각 실험 당 세 번 반복하였다.
1-7) 세포 이동성 (cell migration) 측정
HUVECs 세포를 24-well 배양 용기 (SPL, 대한민국)에 2×105개 접종하고, EBM 배지를 이용하여 37°C, 5% CO2 배양기에서 밤새 배양한 후, P200 피펫을 이용하여 세포를 긁어서 상처를 유도하였다. 그런 다음, 세포를 1% FBS와 비스파틴-유래 펩타이드를 첨가한 EBM-2 배지에서 세포의 이동이 일어날 수 있도록 18시간 동안 추가 배양하였다. 세포 이동성 패턴은 위상차 현미경으로 관찰하고 사진 촬영하였다. 상처의 직경은 16-24시간 째 사진 촬영하였으며, 상처의 봉합은 40배율의 광학현미경에 의해 관찰하고 사진 촬영하였다. 세포 이동성은 기준선을 넘어 이동한 세포의 수를 세어 정량화하였다.
1-8) 혈관형성능 분석
HUVECs 세포 (20,000 세포/well)를 앞서 중합된 Matrigel 위에 분주하고, 비스파틴-유래 펩타이드를 첨가한 후, 37°C, 5% CO2 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 그런 다음 세포 모양의 변화를 40배 배율의 위상차현미경으로 관찰하면서 사진 촬영하였다. 각 시료는 두 번 반복하여 진행하였으며, 각 실험 당 세 번 반복하였다. 신생혈관생성은 신생혈관생성 분석기 (Bethesda, MD, USA)를 이용하여 ImageJ 소프트웨어로서 분석하였다.
1-9) 통계
모든 분석 자료는 평균±표준편차(SD)로 나타내었으며, 실험 결과는 prism 9 (graphpad)를 이용하여 t-test와 ANOVA-two way에 의해 P<0.05 수준에서 통계처리 하였다.
실시예 2 : 중첩 기술에 의한 펩타이드 라이브러리 구성
비스파틴 서열 내의 핫스팟 또는 활성지점을 찾아 비스파틴과 유사하거나 우수한 생물학적 효과를 지닌 비스파틴-기반의 펩타이드 서열을 얻기 위해 첫 번째 과정으로, 도 1에 나타난 바와 같이, 비스파틴의 B-도메인 (잔기 181-390)을 중첩 (overlapping) 기술을 이용하여 아미노산 서열 길이 6에 중첩 아미노산 수 3 (데이터 세트-1), 아미노산 서열 길이 7에 중첩 아미노산 수 2 (데이터 세트-2), 아미노산 서열 길이 9에 중첩 아미노산 수 3 (데이터 세트-3)을 기준으로 잘랐다. 그 결과 데이터 세트-1에서 38개 펩타이드, 데이터 세터-2에서 42개 펩타이드, 데이터 세트-3에서 34개 펩타이드 등 총 114개의 잘려진 펩타이드를 얻었다.
실시예 3 : 도킹 시뮬레이션에 의한 저분자 펩타이드의 도출
잘라 낸 114개 펩타이드와 비스파틴과의 결합 친화력을 계산하기 위해 HADDOCK와 GalaxyPepDock의 2개의 단백질-펩타이드 도킹 시뮬레이션 프로그램을 사용하였다. HADDOCK 점수는 RCSB 단백질 데이터 뱅크로 확인한 비스파틴 활성 부위와 펩타이드 아미노산 서열의 적합도 점수를 보여주며, GalaxyPepDock 점수는 테이터베이스 내 구축된 리간드와 수용체와의 상호 작용 점수를 바탕으로 펩타이드와 비스파틴간의 상호작용 점수를 보여주는 것이다. 이와 같은 2개의 도킹 시뮬레이션 프로그램을 통해 친화력이 높은 점수를 보이는 27개의 펩타이드를 얻었으며, 그 중에서 데이터 세트-3의 아미노산 서열 길이 9와 중첩된 아미노산 3개를 가지는 펩타이드가 보다 높은 친화력 점수를 보였다. 따라서 아미노산 서열 길이 9를 표준으로 하여 도 1의 붉은 색으로 표시된 비스파틴 B-도메인 내의 6 개의 핫스팟 “LEYKLHDFGYRGVSSQ”, “GIALIKKYYGTKDPV”, “IYACEKIWGEDLRH”, “HSTITAWGK DHEKDAF”, “KFPVSENSKGYKLLPPY”, “GMKQKKWSIENVSFG”을 재구성하여 다른 아미노산 서열 길이를 가지는 76개의 펩타이드를 생성하였다.
상기 76개 펩타이드 중 비스파틴과 친화력이 가장 높은 펩타이드를 도출하기 위해 HADDOCK와 GalaxyPepDock의 도킹 시뮬레이션을 한 번 더 수행하여, 표 2에 나타난 바와 같이, 최종적으로 9개의 펩타이드를 도출하였다. 비스파틴과 이들 9개 펩타이드와의 상호작용은 비스파틴의 천연 리간드인 nicotinamide mononucleotide (NMN)와의 상호작용이 유사한지를 확인하기 위해 NMN과 비스파틴의 활성 부위와의 상호작용에 대해 도킹 시뮬레이션을 수행하였다.
| Peptides | HADDOCK Score | GalaxyPepDock Score | |
| 1 2 3 4 5 6 7 8 9 |
LEYKLHDFGY (10AA) EYKLHDFGYRGV (12AA) ALIKKYYGTKDPV (13AA) STITAWGKDHEKDAF (15AA) ACEKIWGEDLRH (12AA) CEKIWGEDLRH (11AA) EKIWGEDLRH (10AA) GMKQKKWSIENVSF (14AA) ENSKGYKLLPPY (12AA) |
-106.0 +/- 2.0 -105.9 +/- 3.5 -111.2 +/- 2.9 -124.3 +/- 6.5 -85.5 +/- 5.5 -93.6 +/- 4.2 -71.6 +/- 2.0 -97.8+/- 4.3 -82.7 +/- 2.9 |
16.0 17.0 10.0 1.0 0.0 0.0 0.0 15.0 18.0 |
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, NMN은 활성 부위 아미노산인 GLY384(2.52 Å의H-bond length, H-BL), ARG196 (H-BL 2.63 Å, H-BL 2.56 Å) 및 ARG311 (H-BL 2.63Å)와 수소 결합을 형성하면서 촉매 작용에서 중요한 역할을 하고 있음을 확인할 수 있으며, 9개 펩타이드와 비스파틴과의 상호작용은 NMN과 비스타틴과의 상호작용과 유사하였다. 이러한 결과는 9개의 펩타이드가 비스파틴의 작용제로서 잠재력이 있음을 시사한다.
도 3 및 도 4는 9개의 펩타이드 중 친화력이 가장 높은 제1펩타이드 (LEYKLHDFGY, 10개 아미노산)과 제2펩타이드 (EYKLHDFGY RGV, 12개 아미노산)의 비스파틴 활성 부위와의 분자적 상호작용을 보여주고 있다.
실시예 4 : 비스파틴-유도 펩타이드의 세포 독성 효과
비스파틴과 친화력이 가장 높은 2개의 펩타이드 (제1펩타이드 및 제2펩타이드)가 HUVECVs 세포 생존성에 미치는 효과를 조사하기 위해, 각 펩타이드를 0.1 μM, 0.5 μM, 1.0 μM, 2.0 μM 농도로 MTT 측정을 수행하였다. 각 펩타이드를 첨가한 후 밤새 배양하였을 때, 도 5에 나타난 바와 같이, 2개의 펩타이드는 처리 농도에 관계없이 세포 생존성에 전혀 영향을 미치지 않았다. 이러한 결과들은 비스파틴-유래 펩타이드가 0.1 μM ~ 2.0 μM 농도에서는 세포 독성이 없음을 시사한다.
실시예 5 : 비스파틴-유도 펩타이드의 신생혈관생성 활성도에 미치는 효과
비스파틴 활성부위와 친화력이 가장 높은 제1펩타이드 및 제2펩타이드의 신생혈관생성 활성도를 조사하기 위해, 세포 전이성, 세포 이동성 및 Matrigel 상에서의 혈관형성능을 조사하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, 비스파틴-유래 펩타이드 처리 시 2개의 펩타이드 모두 대조군에 비해 세포의 전이성을 증가시켰으며, 특히 제1펩타이드에서는 0.5μM 농도, 제2펩타이드에서는 2.0 μM 농도에서 대조군이나 비스파틴 처리군에서 비해 세포의 전이성을 약 2배 이상 증가시켰다. 펩타이드의 이러한 전이성 증가는 양성대조군으로 사용한 bGFG보다도 높은 수준을 보였다.
도 7에 나타난 바와 같이, 세포의 이동성 또한 2개의 펩타이드 처리에 의해 증가되었으며, 0.5 μM의 제1펩타이드과 2.0 μM의 제2펩타이드에서는 세포 이동성이 대조군에 비해 약 2배 이상 증가되었다.
Matrigel 상에서의 혈관형성능은 모세혈관과 같은 혈관의 생성을 mesh 형성과 master junction 형성의 2가지 요인으로 평가하는데, mesh 수는 양성대조군으로 사용한 bFGF와 비스파틴에 의해 유의한 차이가 없었으나, 0.5μM 농도의 제1펩타이드와 제2펩타이드에 의해서는 유의하게 증가하였다 (각각 P<0.01, P<0.001). 도 8에 나타난 바와 같이, 이에 반해 master junction 수는 bFGF와 비스파틴은 물론 제2펩타이드의 2.0 μM 농도를 제외하고는 제1펩타이드와 제2펩타이드 모두에서 유의하게 증가하였다.
상기 과제의 해결 수단에 의해, 본 발명은 지방에서 분비되는 55kDa의 사이토카인인 비스파틴의 큰 분자량으로 인해 치료제로 개발하는 데 제한이 있는 문제점을 해결하기 위한 것으로, 비스파틴 활성 부위 기반의 신생혈관생성 효능을 가지는 펩타이드를 개발할 수 있다.
비스파틴의 활성 부위를 기반으로 하는 비스파틴과 동일하거나 우수한 신생혈관생성 촉진 효능을 가지는 펩타이드를 개발할 수 있다.
이와 같이, 상술한 본 발명의 기술적 구성은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자가 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해되어야 하고, 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타나며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (5)
- 류신(L)-글루탐산(E)-티로신(Y)-라이신(K)-류신(L)-히스티딘(H)-아스파트산(D)-페닐알라닌(F)-글라이신(G)-티로신(Y)(서열번호 1); 또는
글루탐산(E)-티로신(Y)-라이신(K)-류신(L)-히스티딘(H)-아스파트산(D)-페닐알라닌(F)-글라이신(G)-티로신(Y)-아르지닌(R)-글라이신(G)-발린(V)(서열번호 2);의 아미노산 서열로 이루어진, 신생혈관생성 활성을 지니는 펩타이드.
- 제 1항에 있어서,
상기 서열번호 1의 펩타이드 및 서열번호 2의 펩타이드는 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드(nicotinamide mononucleotide)와 수소 결합을 형성하는 것을 특징으로 하는 신생혈관생성 활성을 지니는 펩타이드.
- 제 1항에 있어서,
상기 서열번호 1의 펩타이드 및 서열번호 2의 펩타이드는 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드(nicotinamide mononucleotide)의 활성 부위 아미노산인 GLY384, ARG196 및 ARG311에 결합을 형성하는 것을 특징으로 하는 신생혈관생성 활성을 지니는 펩타이드. - 삭제
- 삭제
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Patent Citations (1)
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