KR102591467B1 - 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물을 포함하는 간 보호 또는 간 기능 개선용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물을 포함하는 간 손상 예방, 개선 또는 치료, 간 보호용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물은 독성이 없고, 산화적 스트레스로부터 간을 보호하며, AST(Aspartate aminotransferase) 또는　MDA(malondialdehyde)의 발현을 감소시킬 뿐만 아니라 간 세포의 세포자멸사(apoptosis) 또는 세포 괴사 (necrosis) 를 억제할 수 있으므로, 간의 손상을 예방 또는 치료하고, 간을 보호하기 위한 목적의 의약품, 식품, 건강기능 식품 등에 다양하게 활용될 수 있다.

Description

황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물을 포함하는 간 보호 또는 간 기능 개선용 조성물{Composition for hepatoprotective or improving liver function comprising Dendropanax morbifera Lev ferment extracts and Citrus grandis Osbeck ferment extracts}
본 발명은 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물을 포함하는, 간 보호 또는 간 기능 개선용 조성물 및 숙취해소 또는 숙취개선용 조성물에 관한 것이다.
간은 인간의 신체장기 중 생체 내 대사가 가장 활발하게 일어나는 장기로, 외부에서 들어온 생체 외 물질로부터 전신을 방어하는 기능을 수행하고 있다. 생체 내로 들어온 생체 외 물질은 일단 간을 통과하게 되므로 간은 영양소 이외에도 많은 독성물질에 노출될 가능성이 높아 손상될 확률도 매우 높다. 간은 재생능력이 우수한 장기로 약간의 손상이 있을 경우에는 충분히 정상으로 회복되지만, 손상이 지속될 경우에는 간 조직의 일부가 파괴되고 간 기능도 저하되는 등 정상 상태의 간으로 회복이 어려운 상태가 된다. 간 손상을 유발하는 원인으로 산화적 스트레스에 의한 ROS(reactive oxygen species)의 생성, 스트레스성 만성 피로, 알코올의 과다섭취, 바이러스 감염, 각종 약품과 같은 유해물질 등 다양한 인자가 알려져 있다. 이러한 간 손상이 만성화되면 그 원인에 상관없이 간 기능 부전, 간 섬유화, 간경화, 간암 등으로 진행된다.
현재, 일반적으로 이용되고 있는 간질환의 치료방법은 크게 식이요법과 약제요법으로 구분되며, 대부분의 경우에 이 두 가지 방법을 병용하고 있다. 간질환에 대한 약제요법에서는 간질환의 발병 원인 및 종류에 따라 다양한 작용기전을 갖는 약제들이 이용될 수 있는데, 예를 들면, 우루소데옥시콜린산 (ursodexoycholic acid), 실리마린 (silymarine), 바이페닐디메틸디카복실레이트 (biphenyldimethyldicarboxylate, DDB), 글루타티온 (glutathione), 오로트산 카르니틴 (carnitine orotate), 글리시르히진 (glycyrrhizin), 종합 비타민제 등과 같은 간세포 재생 촉진제 및 간 기능 보조제, 아시클로바 (acyclovir)와 같은 항바이러스제, 코티코스테로이드(corticosteroid), 6-머캅토퓨린 (6-mercaptopurine, 6-MP), 아자티오프린 (azathioprine) 등과 같은 면역억제제, D-페니실아민 (penicillamine)과 같은 섬유화 억제제 등의 약제가 일반적으로 사용되고 있다. 그러나 이들 약제들의 제한적인 간 보호 효과와 부작용 등에 의해 근본적인 간질환 치료에 어려움을 겪고 있다. 이에, 오늘날 생체 적합성이 우수하고, 부작용의 우려가 적은 천연물 유래 간질환 치료제에 대한 필요성이 있다.
황칠나무(Dendropanax morbifera)는 높이 15m에 달하고 어린 가지는 녹색이며 털이 없다. 잎은 어긋나고 달걀모양 또는 타원 형이다. 또한, 잎 가장자리가 밋밋하지만 어린 나무에서는 3~5개로 갈라지고 톱니가 있다. 꽃은 6월에 연한 황록 색으로 피고 양성화이며 산형꽃차례에 달린다. 꽃줄기는 길이 3~5cm이고 작은 꽃줄기는 길이 5~10mm이다. 꽃받침은 5개로 갈라지고 꽃잎과 수술은 5개씩이며 화반에 꿀샘이 있다. 암술머리는 5개로 갈라지고 핵과는 타원형 이며 10월에 흑색으로 성숙하고 암술대가 남아 있다. 나무껍질에 상처를 내면 노란 액체가 나오는데 이것을 '황칠'이라고 하며 가구의 도료로 사용하기도 한다. 최근 연구 결과에 따르면 황칠나무가 항암 콜라겐 합성 증진, 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 완화, 미백 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
당유자(Citrus grandis)는 쌍떡잎식물 쥐손이풀목 운향과에 속하는 귤나무로 제주 자생 감귤류의 일종이며 주로 식용 및 약용으로 이용되어 왔다. 최근 당유자 과육에서 항암 효과, 항산화 효과 및 항당뇨 효과 등이 보고되었고, 당유자 잎에서도 항암 효과가 있다고 보고되었다.
그러나 개별적인 기능을 갖는 상기 황칠 추출물 및 당유자 추출물을 혼합한 혼합 추출물이 어떤 활성을 나타낼 수 있는지에 대한 연구는 이루어지지 않았으며, 이들이 간 기능과 관련하여 어떤 활성을 나타내는지에 대해서 보고된 바 없다.
이에 본 발명자들은 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물을 포함하는 혼합물의 기능성에 대하여 연구하던 중 상기 혼합물이 산화적 간세포 손상 및 간세포 사멸로부터 간세포를 보호하고, 간세포의 증식을 유도할 수 있으며, 숙취 해소 및 개선 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물을 포함하는, 간 보호 또는 간 기능 개선용 조성물 및 숙취해소 또는 숙취개선용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물을 포함하는, 간 보호 또는 간 기능 개선용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물을 포함하는, 간 보호 또는 간 기능 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물을 포함하는, 간 보호 또는 간 기능 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물을 포함하는, 간 보호 또는 간 기능 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물을 포함하는, 간질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물을 포함하는, 숙취해소 또는 숙취개선용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 황칠 및 당유자에 추출 용매를 가하여 황칠 추출물 및 당유자 추출물을 제조하는 단계; 및 상기 황칠 추출물 및 당유자 추출물에 효모 (Saccharomyces cerevisiae) 를 접종 및 발효하여 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물을 제조하는 단계; 를 포함하는, 간 보호 또는 간 기능 개선용 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 황칠 및 당유자에 추출 용매를 가하여 황칠 추출물 및 당유자 추출물을 제조하는 단계; 및 상기 황칠 추출물 및 당유자 추출물에 효모 (Saccharomyces cerevisiae) 를 접종 및 발효하여 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물을 제조하는 단계; 를 포함하는, 숙취해소 또는 숙취개선용 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물은 독성이 없고, 산화적 스트레스로부터 간을 보호하며, ALT (Alanine aminotransferase), AST(Aspartate aminotransferase) 또는　MDA(malondialdehyde)의 발현 또는 활성을 감소시킬 뿐만 아니라 간 세포의 세포자멸사(apoptosis) 또는 세포 괴사 (necrosis) 를 억제할 수 있다. 또한 숙취 유발 후 간에서 알코올 및 아세트알데하이드를 분해하는 효소의 발현을 증진시킬 수 있으므로 알코올에 의한 간의 손상을 예방 또는 치료할 수 있다. 따라서 본 발명의 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물은 간을 보호하고, 간 기능을 개선하며, 숙취 해소 또는 개선을 위한 목적의 의약품, 식품, 건강기능식품, 의약외품 등에 다양하게 활용될 수 있다.
도 1은 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물 처리에 따른 간세포 독성 및 증식 을 MTT 어세이를 통해 확인하여 평균 ± 표준편차로 나타낸 도이다 (G1: Normal control, G2: 황칠 발효추출물 500 μg/ml + 당유자 발효추출물 100 μg/mL, G3: 황칠 발효추출물 500 μg/ml + 당유자 발효추출물 500 μg/mL, G4: 황칠 발효추출물 500 μg/ml + 당유자 발효추출물 1000 μg/mL, G5: 황칠 발효추출물 100 μg/ml + 당유자 발효추출물 100 μg/mL, G6: 황칠 발효추출물 100 μg/ml + 당유자 발효추출물 500 μg/mL, G7: 황칠 발효추출물 100 μg/ml + 당유자 발효추출물 1000 μg/mL).
도 2는 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물 처리 및 산화적 스트레스 처리에 따른 세포 증식능을 MTT 어세이를 통해 확인하여 평균 ± 표준편차로 나타낸 도이다(G1: Normal control, G2: Vehicle, G3: 황칠 발효추출물 500 μg/ml + 당유자 발효추출물 100 μg/mL, G4: 황칠 발효추출물 500 μg/ml + 당유자 발효추출물 500 μg/mL, G5: 황칠 발효추출물 500 μg/ml + 당유자 발효추출물 1000 μg/mL, G6: 황칠 발효추출물 100 μg/ml + 당유자 발효추출물 100 μg/mL, G7: 황칠 발효추출물 100 μg/ml + 당유자 발효추출물 500 μg/mL, G8: 황칠 발효추출물 100 μg/ml + 당유자 발효추출물 1000 μg/mL).
도 3은 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물 처리 및 산화적 스트레스 처리에 따른 AST(Aspartate aminotransferase) 발현 변화를 평균 ± 표준편차로 나타낸 도이다(G1: Normal control, G2: Vehicle, G3: 황칠 발효추출물 500 μg/ml + 당유자 발효추출물 100 μg/mL, G4: 황칠 발효추출물 500 μg/ml + 당유자 발효추출물 500 μg/mL, G5: 황칠 발효추출물 500 μg/ml + 당유자 발효추출물 1000 μg/mL, G6: 황칠 발효추출물 100 μg/ml + 당유자 발효추출물 100 μg/mL, G7: 황칠 발효추출물 100 μg/ml + 당유자 발효추출물 500 μg/mL, G8: 황칠 발효추출물 100 μg/ml + 당유자 발효추출물 1000 μg/mL).
도 4는 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물 처리 및 산화적 스트레스 처리에 따른 MDA(malondialdehyde)의 발현 변화를 평균 ± 표준편차로 나타낸 도이다(G1: Normal control, G2: Vehicle, G3: 황칠 발효추출물 500 μg/ml + 당유자 발효추출물 100 μg/mL, G4: 황칠 발효추출물 500 μg/ml + 당유자 발효추출물 500 μg/mL, G5: 황칠 발효추출물 500 μg/ml + 당유자 발효추출물 1000 μg/mL, G6: 황칠 발효추출물 100 μg/ml + 당유자 발효추출물 100 μg/mL, G7: 황칠 발효추출물 100 μg/ml + 당유자 발효추출물 500 μg/mL, G8: 황칠 발효추출물 100 μg/ml + 당유자 발효추출물 1000 μg/mL).
도 5는 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물 처리 및 산화적 스트레스 처리에 따른 초기 및 후기 세포 자멸사(apoptosis) 및 세포 괴사(necrosis) 의 변화를 평균 ± 표준편차로 나타낸 도이다(G1: Normal control, G2: Vehicle, G3: 황칠 발효추출물 500 μg/ml + 당유자 발효추출물 100 μg/mL, G4: 황칠 발효추출물 500 μg/ml + 당유자 발효추출물 500 μg/mL, G5: 황칠 발효추출물 500 μg/ml + 당유자 발효추출물 1000 μg/mL, G6: 황칠 발효추출물 100 μg/ml + 당유자 발효추출물 100 μg/mL, G7: 황칠 발효추출물 100 μg/ml + 당유자 발효추출물 500 μg/mL, G8: 황칠 발효추출물 100 μg/ml + 당유자 발효추출물 1000 μg/mL).
도 6은 알코올로 숙취를 유발한 랫트에서 혈액생화학적 분석을 통해 ALT의 발현 변화를 확인하고 평균 ± 표준편차로 나타낸 도이다(G1: Normal control, G2: 유발 대조군, G3: 양성 대조군, G4: 황칠 발효추출물 및 당유자 발효추출물 125mg/kg 투여군, G5: 황칠 발효추출물 및 당유자 발효추출물 250mg/kg 투여군, G6: 황칠 발효추출물 및 당유자 발효추출물 500mg/kg 투여군).
도 7은 알코올로 숙취를 유발한 랫트에서 혈액생화학적 분석을 통해 AST의 발현 변화를 확인하고 평균 ± 표준편차로 나타낸 도이다(G1: Normal control, G2: 유발 대조군, G3: 양성 대조군, G4: 황칠 발효추출물 및 당유자 발효추출물 125mg/kg 투여군, G5: 황칠 발효추출물 및 당유자 발효추출물 250mg/kg 투여군, G6: 황칠 발효추출물 및 당유자 발효추출물 500mg/kg 투여군).
도 8은 알코올로 숙취를 유발한 랫트에서 ADH 및 ALDH 활성도를 ELISA 분석을 통해 확인한 결과를 평균 ± 표준편차로 나타낸 도이다(G1: Normal control, G2: 유발 대조군, G3: 양성 대조군, G4: 황칠 발효추출물 및 당유자 발효추출물 125mg/kg 투여군, G5: 황칠 발효추출물 및 당유자 발효추출물 250mg/kg 투여군, G6: 황칠 발효추출물 및 당유자 발효추출물 500mg/kg 투여군).
본 발명은 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물을 포함하는, 간 보호 또는 간 기능 개선용 조성물, 건강기능식품 조성물, 식품 조성물, 의약외품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물은 산화적 스트레스 및 알코올에 의한 손상으로부터 간을 효과적으로 보호하고 간의 기능을 개선할 수 있다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명에 있어서, "황칠" 은 황칠나무(Dendropanax morbifera)의 황칠 나무의 잎과 줄기를 의미할 수 있다.
본 발명에 있어서, "당유자(Citrus grandis Osbec)"는 귤 속의 재배식물로, 포멜로(C. maxima) 재배종이다. 상기 당유자 발효 추출물은 원료 식물인 당유자의 전초, 뿌리, 잎 줄기, 과육, 과피 등 다양한 부위로부터 추출 또는 분획될 수 있으며, 바람직하게는 당유자의 과피 부위를 발효시켜 추출한 것일 수 있다.
“추출물”은 적절한 용매를 이용하여 황칠 및 당유자 발효물로부터 추출한 것이며, 예를 들어 황칠 및 당유자 발효물의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함한다. 또한, 상기 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.
본 발명의 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물은 통상적인 추출 방법에 의해 얻을 수 있고 또는 시판되는 것을 구입하여 사용할 수도 있다.
본 발명에 있어, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이의 혼합 용매로 추출한 추출물일 수 있고, 바람직하게는 물을 이용하여 이용하여 추출된 추출물, 더욱 바람직하게는 물을 용매로 하여 고온 가압 추출된 추출물일 수 있다.
본 발명에 있어, "발효"란 미생물을 이용하여 유용한 산물을 생성하는 과정으로, 본 발명의 발효 추출물은 효모 (Saccharomyces cerevisiae) 를 접종하여 1 내지 5일 동안 발효를 수행하여 제조된 것일 수 있다. 보다 구체저으로 본 발명의 일 구현예에서는 제조된 황칠 및 당유자의 추출물에 Saccharomyces cerevisiae(KCCM 35053) 를 접종하여 발효를 수행하였으며, 상기 발효는 전체 추출물 조성물에 대하여 1 내지 5%(w/v), 바람직하게는 2 내지 4 %(w/v)로 Saccharomyces cerevisiae(KCCM 35053) 를 접종하여 25 내지 40℃에서 1 내지 5일간 발효를 수행할 수 있다.
본 발명에 있어, 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물은, 황칠 및 당유자를 추출한 추출물을 발효시킨 것일 수 있고, 황칠 및 당유자를 발효시킨 후, 발효물을 추출한 것일 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함되는 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물은 이들 각각의 성분을 발효 추출하여 혼합하거나, 성분을 혼합한 후 이들을 함께 발효 및 추출하여 제조될 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 구현예에서는 황칠 및 당유자를 혼합하여 열수 추출물을 수득하고, 이에 효모를 접종하여 발효단계를 수행하여 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물을 제조하였다.
본 발명에 있어서, 상기 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물은 목적하는 간 보호, 간 손상 예방, 치료, 개선, 간 질환 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것이라면 적절한 혼합비로 본 발명의 조성물에 제한없이 포함될 수 있으나, 바람직하게는 1:0.01내지 1:5 (w/v) 비율로 포함될 수 있고, 더욱 바람직하게는 1:0.1 내지 1:5 (w/v), 1:0.2 내지 1:3 (w/v) 비율로 포함될 수 있다. 황칠 발효 추출물 대비 당유자 발효 추출물이 상기 범위를 넘어서 다량 포함되는 경우, 황칠 발효 추출물에 의한 간 보호, 치료 효과가 희석될 수 있다.
바람직하게 본 발명 조성물에 상기 황칠 발효 추출물은 200 내지 700 μg/ml 로 포함될 수 있고, 더욱 바람직하게는 300 내지 600 μg/ml, 더더욱 바람직하게는 400 내지 600μg/ml 포함될 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 구현예에서는 황칠 발효 추출물을 500 μg/ml로 포함하면서, 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물을 1:0.1 내지 1:5 (w/v), 1:0.2 내지 1:3 (w/v) 비율로 혼합하여 사용하는 경우 현저히 우수한 간 보호, 치료 효과를 나타냄을 확인하였다.
본 발명의 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물은 다양한 간 손상으로부터 간을 보호, 치료할 수 있고, 간의 기능을 개선할 수 있다. 본 발명에 있어서 간 손상은 간이 수행하는 여러 가지 기능 중 한 가지 이상의 기능에 문제가 생겨 정상적으로 대사를 수행할 수 없는 다양한 상태를 의미할 수 있다. 보다 구체적으로 상기 간 손상은 산화스트레스 또는 알코올에 의한 간 손상일 수 있다.
ALT(Alanine aminotransferase)는 간세포 안에서 아미노산 생성에 관여하는 효소로, 간세포가 손상될 경우 혈관 내로 방출되어 혈중 수치가 증가 한다. AST(Aspartate aminotransferase)도 간 세포 손상 시 배양액으로 유리되어 나오는 효소이다. MDA(malondialdehyde)는 간세포 내에서 산화 스트레스 자극에 의해서 생성되는 자유 라디칼이 불포화 지방산과 직접적 및 간접적으로 지질과산화반응을 일으켜 생성되는 성분이다. 이들은 DNA 에 손상을 주어 세포 독성을 유도하고 세포 사멸을 유도할 수 있다. 따라서 ALT, AST 및 MDA의 발현 또는 활성 변화를 통해 간 세포 손상에 대한 보호 활성을 확인할 수 있고, 본 발명의 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물은 ALT(Alanine aminotransferase), AST(Aspartate aminotransferase) 및/또는　MDA(malondialdehyde)의 활성 또는 발현 감소, 생성 저해를 유도할 수 있음을 확인하였다.
또한 본 발명의 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물은 산화적 스트레스에 의해 유도되는 간 세포의 세포자멸사(apoptosis) 또는 세포 괴사 (necrosis)를 억제하여, 간을 보호할 수 있고, 나아가 간세포의 증식을 유도할 수 있다.
상기와 같은 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물은 간 보호 또는 간 기능 개선 효과가 있으므로, 간 보호 또는 간 기능 개선용 건강기능식품 조성물, 식품 조성물, 의약외품 조성물과 같은 다양한 목적의 조성물로 제공될 수 있다.
또한 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물은 간질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 제공될 수 있다.
상기 간질환은 산화적 스트레스에 의한 간 손상 또는 알코올성 간질환일 수 있고, 바람직하게는 상기 알코올성 간질환은 알코올성 간염, 알코올성 지방간 또는 알코올성 간경화일 수 있고, 상기 산화적 스트레스에 의한 간 손상은 간기능 손상, 간염, 간독성, 지방간, 간경변, 간허혈, 알코올성 간 질환, 간 위축증 및 간암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명에서 용어, "예방"이란, 본 발명에 따른 간 질환 또는 간 손상의 예방 또는 치료용 조성물을 개체에 투여하여 간 질환 또는 간 손상의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명에서 용어, "치료"란, 본 발명에 따른 조성물을 간 질환 또는 간 손상 발병 의심 개체에 투여하여 간 질환 또는 간 손상의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명에서 용어, "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명에서 용어, "개체"란, 간 질환 또는 간 손상이 발병되었거나 발병할 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 외에 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 이밖에 다른 약학적 활성 성분이나 활성 혼합물을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 패치제, 피복제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 조성물에 포함 될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose) 또는 락토오스 (Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (Witepsol), 마크로골, 트윈 (Tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 경피, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향료 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다.
또한 본 발명의 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물이 간 보호 또는 간 기능 개선용도의 건강기능식품 조성물, 식품 조성물 또는 의약외품 조성물로 제공될 수 있다.
건강기능식품으로 사용되는 경우, 질환까지 진행되기 이전에 간을 보호하기 위한 예방적인 목적으로 사용될 수 있고, 구체적으로 산화적 스트레스로 인한 간손상, 알코올에 의한 간 손상으로부터 간을 보호하는 것일 수 있다. 또한 상기 간 보호는 다양한 자극원에 의해 유발되는 간의 손상을 막고, 간 세포 증식을 촉진하는 것을 의미할 수 있다.
상기 건강기능식품 또는 식품 조성물로 사용되는 경우, 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물은 단독 또는 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 포함할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 총 중량에 대하여 15 중량부 이하, 10 중량부 이하, 1중량 내지 15중량부, 1중량 내지 10중량부, 1중량 내지 5중량부, 또는 0.1중량 내지 15중량부의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다. 상기 식품 조성물은 예를 들어, 우유, 요플레 등의 식품 소재, 식음료, 기능성 식품으로 이용될 수 있다. 상기 식품 조성물은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
상기 식품 조성물은 또한 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제, 또는 그 조합을 함유할 수 있다. 상기 식품 조성물은 또한, 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육, 또는 그 조합을 함유할 수 있다. 이러한 첨가제는 조성물 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.
또한 본 발명의 용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미하며, 일 구체예로 내복용 제제를 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것이 아니며,　의약외품의 제제화 방법, 용량, 이용방법, 구성성분 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있다.
그 외 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물에 관한 설명은 앞서 설명한 바와 같다.
또한 본 발명의 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물은 특히 알코올성 간 손상으로부터 간을 보호하고, 간에서의 알코올 분해를 촉진할 수 있으므로, 숙취해소 또는 숙취개선용 조성물로 제공될 수 있다.
본 발명의 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물은 알코올 섭취 시 나타나는 혈 중 ALT, AST 를 감소시켜 간 보호 기능을 가질 뿐만 아니라, 알코올 분해를 위한 ADH 및 ALDH 효소의 활성을 증가시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 조성물은 간 기능 개선의 일례로　술을 마신 후에 나타나는 두통, 설사, 식욕부진, 오심, 구토, 오한, 식은땀 등을 억제 또는 감소시키며, 인식능력 저하 및 운동능력 저하로부터 신체를 회복시키며, 혈액학적, 호르몬적 정상 상태를 유지시키는 숙취의 개선 또는　해소 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 '해소'는 본 발명에 따른 숙취해소　또는 개선용 조성물의 섭취로　숙취의 증상을 감소 또는 소멸시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서 사용되는 용어 '개선'은 본 발명에 따른 숙취해소　또는 개선용 조성물의 섭취로 증상이 호전되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
또한 본 발명은 황칠 및 당유자에 추출 용매를 가하여 황칠 추출물 및 당유자 추출물을 제조하는 단계; 및 상기 황칠 추출물 및 당유자 추출물에 효모 (Saccharomyces cerevisiae) 를 접종 및 발효하여 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물을 제조하는 단계; 를 포함하는, 간 보호 또는 간 기능 개선용 조성물의 제조방법을 제공한다.
상기 조성물은 약학적, 건강기능식품, 식품, 의약외품, 사료 또는 수의학적 조성물일 수 있다.
또한 본 발명은 황칠 및 당유자에 추출 용매를 가하여 황칠 추출물 및 당유자 추출물을 제조하는 단계; 및 상기 황칠 추출물 및 당유자 추출물에 효모 (Saccharomyces cerevisiae) 를 접종 및 발효하여 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물을 제조하는 단계; 를 포함하는, 숙취해소 또는 숙취개선용 조성물의 제조방법을 제공한다.
상기 제조방법에 있어서, 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실험 재료
본 발명에 사용된 당유자 발효 추출물 및 황칠 발효 추출물은 ㈜우리아이들플러스에서 제조한 것을 사용하였다. 보다 구체적으로 당유자의 과피와 황칠 나무의 잎 및 줄기를 섞은 후 세척하고, 이들은 건조한 뒤 믹서기를 사용하여 분쇄하였다. 분쇄물에 물을 첨가하고 오토클레이브에서 15분간 121℃에서 고온가압 추출을 수행하였다. 이 후 추출물을 여과하여 열수 추출물을 수득하였다. YBM 액체 배지에 Saccharomyces cerevisiae(KCCM 35053) 를 접종하고 37℃에서 140rpm 으로 20시간 동안 진탕배양하여, 효모 전 배양액을 제조하였다. 수득한 열수 추출물에 상기 Saccharomyces cerevisiae(KCCM 35053) 전 배양액을 전체 조성물에 대하여 2% (w/v)가 되도록 접종한 후 37℃에서 3일간, 50rpm 으로 발효를 수행하였다. 발효물을 원심분리하고 상등액을 여과하여 당유자 발효 추출물 및 황칠 발효 추출물을 제조하였다. 당유자 발효 추출물 및 황칠 발효 추출물은 100mg/ml 의 고농도 stock 용액을 만든 뒤 배양배지를 이용하여 농도를 희석하여 사용하였다.
간 세포 보호 효과를 확인하기 위해 HepG2 (ATCC, HB-8065TM) 를 온도 37℃, 습도 95 %, CO2 5 %로 설정된 조건에서 배양하여 사용하였다. 세포 배양 배지는 DMEM 배지에 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 배지를 이용하였다. 세포 배양 동안 75 cm2 flask 및 10 cm2 cell culture plate를 사용하였고, 세포의 밀도는 2.5 X 106 cells/75T Flask 및 1.5 X 106 cells/10 cm2 cell culture plate로 정하여 배양하였다. 배지는 2일 및 3일에 1회 신선한 배지로 교환하였다. 세포를 현미경으로 관찰하여 70% 이상 증식했을 때 0.25 % (w/v) Trypsin, 0.53 mM EDTA solution (3 mL) 를 처리하여 분리하고 1000rpm 으로 5분간 원심분리하여 수득하였다.
간 세포 독성을 유발하기 위한 산화 스트레스 유발 물질은 tert-Butyl Hydroperoxide (이하, tBHP)를 Sigma-aldrich에서 구입하여 이용하였다.
실험 결과에 대하여 자료의 정규성을 가정하였고, 모수적인 다중비교 (parametric multiple comparison procedures)를 이용하여 분석하였다. 모수적 일원분산분석 (One-way ANOVA) 결과가 유의하였을 경우, Dunnett’s multiple comparison test를 이용하여 사후검정을 실시하였다. 통계학적 분석은 Prism 7.04 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)을 이용하여 실시하였으며, p값이 0.05 미만일 경우, 통계학적으로 유의한 것으로 판정하였다.
실시예 1. 세포 독성 확인 (MTT 어세이)
당유자 발효 추출물 및 황칠 발효 추출물의 간세포에 대한 독성을 확인하기 위하여 처리 농도를 달리하여 MTT 어세이를 수행하였다. 실험에 사용된 처리 농도에 따른 실험군을 하기 표 1에 나타내었다.
군 처리농도 세포수 (cells)
G1 Normal control - 1 X 104
G2 황칠 발효 추출물 +
당유자 발효 추출물		 황칠 (500 μg/mL)+ 당유자 (100 μg/mL)
G3 황칠 (500 μg/mL)+ 당유자 (500 μg/mL)
G4 황칠 (500 μg/mL)+ 당유자 (1000 μg/mL)
G5 황칠 (100 μg/mL)+ 당유자 (100 μg/mL)
G6 황칠 (100 μg/mL)+ 당유자 (500 μg/mL)
G7 황칠 (100 μg/mL)+ 당유자 (1000 μg/mL)
정상 대조군으로는 미처리 대조군을 이용하였으며, HepG2 (ATCC, HB-8065TM) 세포를 96 well plate에 1 X 104 cells/well의 농도로 세포를 seeding한 뒤, 37℃ CO2 세포 배양기 안에서 24 시간 동안 안정화 및 배양하였다. 세포의 형태를 육안으로 판별하여 이상 여부를 확인한 뒤, 실험에 사용하였다. 각 well에 있는 완전 배지(complete media)를 제거한 뒤, serum free media를 이용하여 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물을 표 1에 지정된 농도로 배지를 이용하여 희석한 후, 각 well에 처리하였다. 처리 시 세포에 주는 영향을 최소화하기 위하여, 각 well 벽면에 실험 물질을 흐르듯이 처리하였다. 처리 24 시간 뒤 세포배양액 및 실험물질을 모두 제거한 뒤, 세포 증식 및 세포 독성을 확인하다.
도 1에 나타낸 바와 같이, MTT 어세이 결과, 정상 대조군 대비 G2 내지 G7 실험군 모두에서 세포 증식률이 유의하게 증가하는 것을 확인하였으며, 모든 실험군이 간세포에 독성을 나타내지 않음을 확인하였다.
실시예 2. 산화스트레스에 의한 세포 증식능 변화 확인 (MTT 어세이)
실시예 1을 통해 표 1에서 설정된 모든 실험군에서 세포 독성이 나타나지 않음을 확인하고, 이후 동일한 농도를 실험에 이용하였다. 산화스트레스 유발 물질로 tBHP 250μM 를 이용하고, 실험군 처리에 의한 세포 증식 효과를 확인하였다. 본 실시예에 사용된 실험군을 표 2에 나타내었다.
군 유발물질
(tBHP 250μM)		 처리물질 처리농도 세포수 (cells)
G1 - - - 1 X 104
또는

1 X 106
G2 O - -
G3 O 황칠 발효추출물 +
당유자 발효추출물		 황칠 (500 μg/mL)+ 당유자 (100 μg/mL)
G4 O 황칠 (500 μg/mL)+ 당유자 (500 μg/mL)
G5 O 황칠 (500 μg/mL)+ 당유자 (1000 μg/mL)
G6 O 황칠 (100 μg/mL)+ 당유자 (100 μg/mL)
G7 O 황칠 (100 μg/mL)+ 당유자 (500 μg/mL)
G8 O 황칠 (100 μg/mL)+ 당유자 (1000 μg/mL)
G1은 미처리 대조군, G2 군은 산화스트레스 유발물질로 tBHP 250 μM 를 처리한 대조군이며, G3 내지 G8은 본 발명의 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물을 함께 처리한 실험군이다.
96 well plate에 배양된 세포에 상기 표 2에 따라 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물을 처리 후, 37℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 이 후 실험 물질을 제거한 후, tBHP 250 μM을 5 시간 동안 처리하여 세포에 산화 스트레스를 유발하고, MTT assay를 수행하였다.
구체적으로 배양 24시간 이후, 실험 물질과 함께 처리한 세포 배양 배지를 모두 제거한 뒤, Serum free media을 이용하여 조심스럽게 워싱하였다. 워싱 후 serum free Basal Medium을 제거한 뒤, Serum Free Media + 10 % Thiazolyl Blue Tetrazolium Blue (5 mg/mL) 혼합액을 각 well에 동량 (100 μL)으로 처리하였다. 5 % CO2, 37℃ 배양기 안에서 120 분간 배양을 수행하였다. 상층액을 조심스럽게 제거한 후, DMSO-ultra pure glade를 처리하였다. micro plate reader기의 550 ~ 570 nm의 파장을 이용하여 흡광도를 측정하였다(BioTek, Epoch2). MTT 어세이를 통해 확인한 본 발명 혼합 추출물의 산화스트레스로 인한 세포 독성 억제 효과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 정상대조군 (G1) 대비 vehicle (G2) 및 모든 실험군 (G3 ~ G8)에서 세포 증식률이 유의하게 감소하였으나 (p<0.001), vehicle (G2) 대비 실험군 G3, G4, G5, G7 및 G8에서 세포 증식률이 유의하게 증가하였다 (p<0.05/p<0.001). 이러한 결과를 통해 황칠 발효추출물 및 당유자 발효추출물의 혼합 처리가 tBHP 처리로 유발된 산화스트레스에 대한 세포 사멸로부터 간세포를 보호하는 것을 확인하였다.
실시예 3. AST 어세이를 통한 간세포 보호 효과 확인
간 손상 지표인 AST의 함량을 확인하기 위하여, HepG2 세포에 표 2와 같은 실험군을 처리하였다. 6 well plate에 1 X 106 cells/well의 농도로 세포를 seeding한 뒤, 37 ℃ CO2 세포 배양기 안에서 24 시간 동안 안정화 및 배양하였다. 세포의 형태를 육안으로 판별하여 이상 여부를 확인한 뒤, 실험에 사용하였다. 표 2와 같은 실험물질 처리 24 시간 뒤, 실험물질을 제거하고 250 μM의 tBHP 세포에 270 분 동안 처리하여 세포에 산화 스트레스를 유발하고 배양을 실시하였다. 세포 배양액을 회수한 뒤, 세포를 회수하였다. 이후 회수한 세포 배양액과 세포를 이용하여 AST를 분석하였고, 그 결과를 표 3 및 도 3 에 나타내었다.
*** A significant difference at p<0.001 level compared to the G1 (Control)
### A significant difference at p<0.001 level compared to the G2 (Vehicle)
도 3 에 나타낸 바와 같이, AST의 발현의 경우 정상대조군 (G1) 대비 vehicle 군 (G2) 및 실험군 G6, G7 및 G8에서 유의하게 증가하였으나(p<0.001), 모든 실험군 (G3 ~ G8)에서 vehicle 군 (G2) 대비 증가된 AST 발현이 다시 유의하게 감소하였다 (p<0.001).
상기와 같은 결과를 통해, 황칠 발효추출물 및 당유자 발효추출물 혼합처리가 tBHP로 유발된 산화적 간세포 손상에 의한 AST 발현을 효과적으로 낮출 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. MDA 어세이를 통한 간세포 보호 효과 확인
간 손상 지표인 MDA의 함량을 확인하기 위하여, HepG2 세포에 표 2와 같은 실험군을 처리하였다. 6 well plate에 1 X 106 cells/well의 농도로 세포를 seeding한 뒤, 37 ℃ CO2 세포 배양기 안에서 24 시간 동안 안정화 및 배양하였다. 세포의 형태를 육안으로 판별하여 이상 여부를 확인한 뒤, 실험에 사용하였다. 표 2와 같은 실험물질 처리 24 시간 뒤, 실험물질을 제거하고 250 μM의 tBHP 세포에 270 분 동안 처리하여 세포에 산화 스트레스를 유발하고 배양을 실시하였다. 세포 배양액을 회수한 뒤, 세포를 회수하였다. 이후 MDA assay kit를 이용하여 분석하였으며, 그 결과를 표 4 및 도 4에 나타내었다.
* A significant difference at p<0.05 level compared to the G1 (Control)
### A significant difference at p<0.001 level compared to the G2 (Vehicle)
표 4 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 세포 내 MDA의 발현의 경우 정상대조군 (G1) 대비 vehicle 군 (G2) 및 실험군 G8에서 MDA의 발현이 유의하게 증가하였으나(p<0.05/p<0.001), 모든 실험군 (G3 ~ G8)에서 vehicle 군 (G2) 대비 MDA의 발현이 유의하게 감소하였다 (p<0.001). 상기 결과를 통해 황칠 발효추출물 및 당유자 발효추출물의 혼합처리가 tBHP로 유발된 산화적 간세포 손상에 의한 세포 내의 MDA의 발현을 억제하는데 효과적인 것을 확인하였다.
실시예 5. 산화 스트레스에 의한 세포 사멸 억제 효과 확인
본 발명의 혼합 추출물이 산화 스트레스로 유발되는 세포 사멸로부터 간 세포를 보호할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 산화 스트레스를 유발한 세포에서 세포 자멸사 (apoptosis) 및 세포 괴사(necrosis)를 확인하였다. 구체적으로 6 well plate에 1 X 106 cells/well의 농도로 세포를 seeding한 뒤, 37 ℃ CO2 세포 배양기 안에서 24 시간 동안 안정화 및 배양하였다. 세포의 형태를 육안으로 판별하여 이상 여부를 확인한 뒤, 실험에 사용하였다.
세포의 세포자멸사를 확인하기 위하여 HepG2 세포에 표 2와 같은 조성의 실험 물질을 처리하였다. 실험물질 처리 24 시간 뒤, 실험 물질을 제거하고 250 μM의 tBHP 세포에 처리하여 산화 스트레스를 유발한 후, 5 시간 동안 배양을 실시하였다. 이후 trypsin을 이용하여 세포를 회수하였다. 회수한 세포를 Annexin V apoptosis detection Kit (ThermoFisher, V13241)를 이용하여 염색한 뒤, 유세포 분석기 (Agilent, Novocyte 3000)를 통해 분석을 실시하였다. Annexin V 및 PI staining을 통하여 본 발명 혼합 추출물의 세포 사멸 억제 효과를 확인한 결과를 표 5 및 도 5에 나타내었다.
***/* A significant difference at p<0.001/p<0.05 level compared to the G1 (Control)
###/##/# A significant difference at p<0.001/p<0.01/p<0.05 level compared to the G2 (Vehicle)
표 5 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 세포의 초기 세포 자멸사(early apoptosis) 및 후기 세포 자멸사 (Late apoptosis) 모두 정상 대조군 (G1) 대비 vehicle 군 (G2) 에서 유의하게 증가하였으나, 이러한 증가는 황칠 발효추출물 및 당유자 발효추출물을 처리한 G3 내지 G5 에서 G2 대비 특히 현저하게 감소하였다. 세포 괴사(Necrosis) 역시 정상대조군 (G1) 대비 vehicle 군 (G2) 에서 현저하게 증가하였으나, 모든 실험군 G3 ~ G8에서 G2 군 대비 유의하게 감소하였다.
상기와 같은 실험 결과를 통해, 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물의 혼합 처리가 tBHP 로 유발된 산화적 간세포 손상 및 간세포 사멸로부터 간세포를 보호하고, 간세포의 증식을 유도할 수 있음을 확인하였다.
실시예 6. 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물의 숙취 해소 효과 확인
황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물이 산화 스트레스로부터 간을 보호하는 효과 외에 간에서의 숙취 해소 증진 효과를 갖는지 확인하기 위하여, Sprague-Dawley Rat를 이용한 숙취 해소 효력 실험을 수행하였다.
6.1 실험 방법 및 재료
숙취해소 실험에 사용한 Sprague-Dawley Rat 는 7주령의 수컷 60마리를 이용하였다. 상기 랫트를 온도 23±3℃, 상대습도 55±15%, 환기횟수 10∼20 회/hr, 조명시간 12 시간 (오전 8 시 점등∼오후 8 시 소등) 및 조도 150∼300 Lux로 설정한 주식회사 노터스 제 3 동물사육구역에서 자유식이 및 급수 조건으로 사육하였다. 숙취해소 양성 대조군으로는 시판 중인 숙취해소제인 '여명808'을 구입하여 이용하였다. 실험군은 하기와 같이 설정하였고 각 실험군의 동물들의 체중은 최대한 균일하게 분포되도록 설정하였다. 시험물질 투여 전 16시간 이상 절식을 실시하였고, 실험 종료 시까지 사료는 제공하지 않았다. 본 실험의 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물은 황칠 (500 μg/mL)+ 당유자 (100 μg/mL) 를 이용하여 제조한 발효 추출물을 이용하였다.
군 성별 동물수 (마리) 동물번호 Ethanol
투여여부		 시험물질 투여량
(mg/kg)		 투여액량
(mL/kg)
G1 M 10 1-10 N D.W - 10
G2 M 10 11-20 Y D.W - 10
G3 M 10 21-30 Y 여명 - 2
G4 M 10 31-40 Y 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물 125 10
G5 M 10 41-50 Y 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물 250 10
G6 M 10 51-60 Y 황칠 발효 추출물 및당유자 발효 추출물 500 10
G1: 정상대조군, G2: 유발대조군, G3: 양성대조군
숙취 유발을 위해 40%(v/v) 에탄올을 3g/kg으로 랫트에 경구투여하였고, 실험물질인 숙취해소제는 숙취 유발 1시간 전 및 숙취 유발 3시간 후 총 2회 경구 투여하였다. 각 실험군의 체중은 시험물질 투여 개시 직전 (-1), 숙취 유발 직후 (0), 숙취 유발 후 3 및 5 시간째에 전자저울을 이용하여 총 4회 측정하였다. 모든 개체에서 체중은 실험 기간 동안 통계학적으로 유의한 차이를 보이지 않았다.
모든 결과는 평균± 표준편차로 표기하였다. 통계학적 분석은 Prism 7.04 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)을 이용하여 실시하였으며, p값이 0.05 미만일 경우, 통계학적으로 유의한 것으로 판정하였다.
6.2 혈액생화학 분석 결과
시험물질 투여 개시 직전 (-1), 숙취 유발 직후 (0), 숙취 유발 후 3 및 5 시간째에 경정맥을 통해 채혈을 실시하였고, 예정된 시간에 전혈 약 0.5 mL을 채혈하여 clot activator가 들어있는 vacutainer tube에 주입하고 약 15 분간 실온에 방치하여 응고시킨 후, 3,000 rpm으로 10 분간 원심분리 하여 혈청을 분리한 뒤, 동물번호 및 채혈시간이 표시된 튜브에 보관하였다. 혈청은 분석 전까지 -70 ℃ 이하로 설정되어 있는 초저온냉동고에 보관하였다. 혈액 생화학 분석기 (7180 Hitachi, Japan)를 이용하여 혈청에서 ALT (Alanine aminotransferase) 및 AST (Aspartate aminotransferase)를 분석하였다. 숙취 유발 5시간 후에는 개복하여 후대 정맥에서 채혈을 실시하였고, 복대동맥 및 후대정맥을 절단하여 방혈/치사 시켰다. 채혈한 혈액은 혈청을 분리하고 혈액생화학적 검사를 수행하였다. 혈액 생화학 검사 결과를 표 7, 표 8, 도 6 및 도 7에 나타내었다.
표 7 및 도 6 에서 모든 결과는 평균± 표준편차로 나타냈고, 에탄올 투여 시점을 0시간으로 설정하였다. 표 7 및 도 6에 나타낸 바와 같이, ALT (Alanine transaminase) 분석 결과, 숙취 유발 직후에 유발대조군 (G2)의 ALT 수준은 정상대조군 (G1) 대비 유의하게 높았으며 (p<0.01 또는 p<0.05), 시험물질 500 mg/kg 투여군 (G6)의 ALT 수준은 G2 대비 유의하게 낮았다 (p<0.05). 숙취 유발 후 3 시간째에 G2의 ALT 수준은 G1 대비 유의하게 높았으며, 양성대조군 (G3), G5 및 G6의 ALT 수준은 G2 대비 유의하게 낮았다 (p<0.05). 숙취 유발 후 5 시간째에 G2의 ALT 수준은 G1 대비 유의하게 높았으며 (p<0.01), G3 및 G6의 ALT 수준은 G2 대비 유의하게 낮았다 (p<0.05).
표 8 및 도 7에 나타낸 바와 같이, AST (Aspartate transaminase) 분석 결과, 숙취 유발 직후 모든 숙취 유발군 (G2-G6)의 AST 수준은 G1 대비 유의하게 높았다. 숙취 유발 후 3 시간째에 G2 의 AST 수준은 G1 대비 유의하게 높았으며, G3 및 G6의 AST 수준은 G2 대비 유의하게 낮은 것을 확인하였다.
6.3 ADH 및 ALDH 활성도 ELISA 분석 결과
숙취 유발 후 5 시간째에 부검을 실시하였다. 동물을 흡입마취 하고, 마취가 확인되면 개복하여 후대정맥에서 채혈을 실시한 뒤, 복대동맥 및 후대정맥을 절단하여 방혈/치사 시켰다. 간을 적출한 후, 좌엽을 분리하여 ADH (alcohol dehydrogenase), ALDH (aldehyde dehydrogenases) 활성도를 상용화된 ELISA kit을 이용하여 측정하였다. 각 실험군에서 ADH 및 ALDH 활성도 측정 결과를 표 9 및 도 8에 나타내었다.
표 9 및 도 8 에 나타낸 바와 같이, 간 조직 내 ADH 분석 결과, G2의 ADH 수준은 G1 대비 유의하게 낮았으며 (p<0.001), G3, G4, G5 및 G6의 ADH 수준은 G2 대비 유의하게 높았다 (p<0.01 또는 p<0.05). 또한 간 조직내 ALDH 분석 결과, G4 내지 G6의 ALDH 수준은 G2 와 비교하여 모두 증가하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물의 투여가 에탄올 분해를 위해 필요한 ADH 및 아세트알데하이드 분해를 위해 필요한 ALDH 수준의 증가를 유도하여 숙취 해소를 유도할 수 있음을 보여주는 결과이다.
상기와 같은 결과를 종합하면, 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물이 AST 및 ALT 를 낮추고, 알코올 분해에 도움이 되는 효소인 ADH 및 ALDH의 발현 증진을 유도할 수 있어, 간 보호 및 숙취해소에 효과적임을 확인하였다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (17)

  1. 황칠 발효 추출물 400 내지 700μg/ml 및 당유자 발효 추출물을 포함하고,
    상기 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물은 1:0.2 내지 1:3 (w/v) 비율로 포함되는 것인, 간 보호 또는 간 기능 개선용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이의 혼합 용매로 추출한 추출물인, 간 보호 또는 간 기능 개선용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 발효 추출물은 효모를 접종하여 1 내지 5일 동안 발효된 것인, 간 보호 또는 간 기능 개선용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물은 1:0.2 (w/v) 비율로 포함되는 것인, 간 보호 또는 간 기능 개선용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 황칠 발효 추출물은 500μg/ml로 포함되는 것인, 간 보호 또는 간 기능 개선용 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물은 산화스트레스 또는 알코올에 의한 간 손상으로부터 간을 보호하는 것인, 간 보호 또는 간 기능 개선용 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물은 간에서 ALT (Alanine aminotransferase), AST(Aspartate aminotransferase) 또는　MDA(malondialdehyde)의 활성 또는 발현을 감소시키는 것인, 간 보호 또는 간 기능 개선용 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물은 산화적 스트레스에 의해 유도되는 간 세포의 세포자멸사(apoptosis) 또는 세포 괴사 (necrosis) 를 억제하는 것인, 간 보호 또는 간 기능 개선용 조성물.
  9. 황칠 발효 추출물 400 내지 700μg/ml 및 당유자 발효 추출물을 포함하고,
    상기 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물은 1:0.2 내지 1:3 (w/v) 비율로 포함되는 것인, 간 보호 또는 간 기능 개선용 건강기능식품 조성물.
  10. 황칠 발효 추출물 400 내지 700μg/ml 및 당유자 발효 추출물을 포함하고, 상기 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물은 1:0.2 내지 1:3 (w/v) 비율로 포함되는 것인, 간 보호 또는 간 기능 개선용 식품 조성물.
  11. 황칠 발효 추출물 400 내지 700μg/ml 및 당유자 발효 추출물을 포함하고,
    상기 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물은 1:0.2 내지 1:3 (w/v) 비율로 포함되는 것인, 간 보호 또는 간 기능 개선용 의약외품 조성물.
  12. 황칠 발효 추출물 400 내지 700μg/ml 및 당유자 발효 추출물을 포함하고, 상기 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물은 1:0.2 내지 1:3 (w/v) 비율로 포함되는 것인, 산화적 스트레스에 의한 간 손상 또는 알코올성 간질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. 삭제
  14. 제12항에 있어서, 상기 알코올성 간질환은 알코올성 간염, 알코올성 지방간 또는 알코올성 간경화인, 약학적 조성물.
  15. 황칠 발효 추출물 400 내지 700μg/ml 및 당유자 발효 추출물을 포함하고,
    상기 황칠 발효 추출물 및 당유자 발효 추출물은 1:0.2 내지 1:3 (w/v) 비율로 포함되는 것인, 숙취해소 또는 숙취개선용 조성물.
  16. 삭제
  17. 삭제
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