KR102590009B1 - 식물 병원성 진균 제어용 신규 균주 스트렙토마이세스 콜리너스 Inha504 및 이의 용도 - Google Patents
식물 병원성 진균 제어용 신규 균주 스트렙토마이세스 콜리너스 Inha504 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 식물 병원성 진균 제어용 신규 균주 스트렙토마이세스 콜리너스(Streptomyces collinus) Inha504 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에서는 항진균 활성이 우수한 폴리엔 화합물을 생산하는 방선균을 유전체 검색기술로 선별한 후, NGS 기반으로 유전체를 해독하여 해당 생리활성물질의 특성을 분자수준에서 규명하고, 이들 유용 방선균 (혹은 방선균 유래 생리활성물질)을 생물농약으로 실용화하기 위한 배양공정 최적화를 수행하였다. 이에, 본 발명의 스트렙토마이세스 콜리너스(Streptomyces collinus) Inha504 균주는 식물 병원성 진균을 효과적으로 제어하므로 생물농약으로 유용하게 활용될 가능성이 있다.
Description
본 발명은 식물 병원성 진균 제어용 신규 균주 스트렙토마이세스 콜리너스(Streptomyces collinus) Inha504 및 이의 용도에 관한 것이다.
미생물 기반 친환경 생물농약의 필요성은 더 이상의 설명이 필요 없을 정도로 절실하다. 현재 생물농약으로는, 바실러스 (Bacillus) 기반의 살충제를 포함한 다양한 미생물 종이 사용되고 있으나, 농업용 작물에 대한 항진균 생물농약으로는 방선균, 특히 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 종이 다수를 차지하고 있다.
국내 생물농약 (일명 천연식물보호제) 등록현황 (2012년 12월말 현재)에 따르면, 방선균 기반의 생물 농약으로는 (주)케이아이비씨의 방선균 2종 (스트렙토마이세스 고시키엔시스 더블유와이이324 액제, 스트렙토마이세스 콜롬비엔시스 더블유와이이20 액제)이 등록되어 사용되고 있다.
국외에서는 더욱 활발하게 방선균 기반 생물농약이 사용되고 있으며, 특히 미국 노보자임의 Streptomyces lydicus WYEC108 (상품명 Actinovate)와 핀란드 Verdera의 Streptomyces K61 (상품명 Mycostop)은 방선균을 주성분으로 하고 있다. 중국의 경우에도 폴리엔계 켄디시신 및 나타마이신을 생산하는 방선균 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 생물농약으로 활용하여 작물의 진균 감염 및 진균 공생 해충을 친환경적으로 제어하고 있다.
본 발명의 목적은 식물병원성 진균에 대한 항진균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 콜리너스(Streptomyces collinus) Inha504 균주(KCTC14683BP) 및 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물병원성 진균 방제용 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 KCTC14683BP로 기탁되고, 식물병원성 진균에 대한 항진균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 콜리너스(Streptomyces collinus) Inha504 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물병원성 진균 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명은 식물 병원성 진균 제어용 신규 균주 스트렙토마이세스 콜리너스(Streptomyces collinus) Inha504 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에서는 항진균 활성이 우수한 폴리엔 화합물을 생산하는 방선균을 유전체 검색기술로 선별한 후, NGS 기반으로 유전체를 해독하여 해당 생리활성물질의 특성을 분자수준에서 규명하고, 이들 유용 방선균 (혹은 방선균 유래 생리활성물질)을 생물농약으로 실용화하기 위한 배양공정 최적화를 수행하였다. 이에, 본 발명의 스트렙토마이세스 콜리너스(Streptomyces collinus) Inha504 균주는 식물 병원성 진균을 효과적으로 제어하므로 생물농약으로 유용하게 활용될 가능성이 있다.
도 1은 방선균 배양액 샘플들의 항진균 활성을 확인한 결과이다.
도 2는 Streptomyces collinus Inha504 균주의 예상 폴리엔 화합물 생합성 유전자군을 나타낸다.
도 3은 Streptomyces collinus Inha504 균주가 생산할 것으로 예상되는 폴리엔 화합물 구조를 나타낸다.
도 4는 여러 가지 식물병원성 진균에 대한 Streptomyces collinus Inha504 균주의 항진균 활성 결과를 나타낸다.
도 2는 Streptomyces collinus Inha504 균주의 예상 폴리엔 화합물 생합성 유전자군을 나타낸다.
도 3은 Streptomyces collinus Inha504 균주가 생산할 것으로 예상되는 폴리엔 화합물 구조를 나타낸다.
도 4는 여러 가지 식물병원성 진균에 대한 Streptomyces collinus Inha504 균주의 항진균 활성 결과를 나타낸다.
본 발명은 KCTC14683BP로 기탁되고, 식물병원성 진균에 대한 항진균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 콜리너스(Streptomyces collinus) Inha504 균주를 제공한다.
바람직하게는, 상기 균주는 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 푸자리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 푸자리움 솔라니(Fusarium solani), 푸자리움 베르티실리오이드(Fusarium verticillioides), 푸자리움 세미텍툼(Fusarium semitectum), 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea) 및 커부라리아 루나타(Curvularia lunata)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 진균에 항진균 활성을 갖을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 균주는 서열번호 1로 표시되는 16S rRNA 염기서열 또는 서열번호 2로 표시되는 ropB 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 균주는 폴리엔 화합물을 생산할 수 있으며, 보다 바람직하게는, 상기 폴리엔 화합물은 하기 화학식 1로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[화학식 1]
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물병원성 진균 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어, 식물병원성 진균 방제용 조성물은 본 발명에 의한 균주를 유효량 함유하고 농화학적으로 허용 되는 담체를 포함한다. 본 발명에 의한 조성물은 당업계에 공지된 방식의 미생물 농약 제제화 방식에 따라, 예컨대 배양된 균체의 배양액, 동결건조 균체와 전분, 조단백질 및 암석분 등을 포함하도록 분말, 펠렛 또는 과립, 마이크로캡슐 등으로 제형화하여 그대로 사용할 수 있다. 상기 조성물은 표면 활성화제, 비활성 담체, 보존제, 습윤제, 공급 촉진제, 유인제, 캡슐화제, 결합제, 유화제, 염료, U.V. 보호제, 완충제 등 목적 병원균 및 작물에 따라 적용하기 용이한 다른 성분을 부가함으로 수득할 수 있다. 본 발명의 조성물은 적용하기 전에 적당한 양의 물 또는 다른 희석제로 희석을 하여 직접 적용하기에 적합한 형태 또는 농축액 또는 1차 조성물일 수 있다. 항진균성 농도는 특히 농축 또는 직접 사용하거나 하는 것은 특정 제제의 성질, 적용 식물의 종류, 재배 지역의 토양 및 기후 등에 따라 다양할 수 있음은 당업계에 명백히 이해될 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시에는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
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실험예
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하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 샘플 수집 및 분리
항진균 활성을 갖는 균주를 선별하기 위해 한국생명공학연구원의 김창진 박사님 연구실로부터 2419개의 방선균 배양액을 이용하여 진균에 대한 저해환 실험을 실시하였다. 그 중 2009년 보성의 유기농 녹차밭에서 동정한 Streptomyces collinus Inha504(AN090291) 균주를 분양받았다. 생물학적 특징으로는 Fusarium oxysporum (KCTC 46453), Candida albicans (ATCC 14053)에 대한 항진균 활성을 갖는 균주로 확인하였다.
2. 성장 조건 및 배지
Streptomyces collinus Inha504(AN090291) 균주는 M3 agar (soluble starch 20 g/L, agar 20 g/L, soytone 10 g/L, glucose 10 g/L, CaCO3 3 g/L, FeSO4·7H2O 0.2 g/L)에서 30℃, 7일간 고체 정치배양을 통해 전배양을 실시하고 GSS agar (soybean flour 25 g/L, glucose 20 g/L, soluble starch 10 g/L, yeast extract 4 g/L, NaCl 2 g/L, CaCO3 2 g/L, Beef extract 1 g/L, K2HPO4 0.25 g/L)에서 30℃, 7일간 고체 정치배양을 통해 생산배양을 실시한다. 식물병원성 7종[Fusarium oxysporum (KACC 40051), Fusarium solani (KACC 44891), Fusarium verticillioides (KCTC 16672). Fusarium semitectum (KCTC 6065), Botrytis cinerea (KACC 40574), Curvularia lunata (KACC 40861), Aspergillus niger (KCTC46204)]은 PDA (potato starch 4 g/L, glucose 2 g/L, agar 15 g/L)에서 30℃, 3~7일간 고체 정치배양을 한다. Candida albicans (ATCC 14053) 균주는 YM agar (yeast extraction 3 g/L, malt extraction 3 g/L, peptone 5 g/L, glucose 10 g/L, agar 20 g/L)에서 30℃, 220rpm, 12시간 동안 진탕 배양을 한다.
3. 플레이트 대면 분석을 통한 항진균 분석
고체 정치배양을 통해 생산배양을 실시한 GSS agar plate에서 지름 0.5cm의 원형 agar plug를 준비한다. 저해활성을 보고자 하는 곰팡이가 포함된 PDA agar plate을 준비하기 위해 고체 정치배양을 한 곰팡이의 포자를 2 cm × 2 cm 크기 정도로 긁어 1% 아가로스젤(agarose gel)과 섞어준 뒤 PDA agar plate 위를 덮도록 부어주고 30분간 굳게 둔다. 곰팡이가 포함된 PDA agar plate 위에 원형 agar plug를 적절한 위치에 올린 후 30℃, 3~7일간 고체 정치배양을 하면서 저해환을 관찰하고 이 크기를 기록한다.
4. 전체 게놈 서열분석 및 클러스터 예측
Streptomyces collinus Inha504(AN090291) 균주의 전체 염기서열은 PacBio RSII, Illumina platform and De novo assembly를 이용하여 한국 macrogen에 외주를 맡겨 분석하였다. 전체 염기서열 속 이차대사산물의 생합성 유전자 클러스터(biosynthetic gene cluster)는 antiSMASH bacterial version 5.0((https://antismash.secondarymetabolites.org/#!/start)을 이용하여 분석하였다.
5. 온실 조건하에서 식물 비료로서의 적용 가능성 평가
수원의 한국식물환경연구소에 용역의뢰 후 확인실험을 진행하였다(pot test).
가. 대상병해: 시들음병(Fusarium oxysporium, KACC40051)
나. 시험작물: 고추(독야청청), 토마토(슈퍼도태랑), 딸기(설향)
※ 대상병해 발생상황
농촌진흥청 국립농업과학원 농업생물부부터 대상 병원균인 시들음병균 (Fusarium oxysporium)을 분양받아 PDA(Potato Dextrose Agar) 배지에 배양하여 접종원을 준비하였으며, 모종에 접종하여 시들음병 발생을 유도하였다.
다. 처리내용 : 토양관주처리 - 희석한 배양액 1L/m2 (희석배수 500배), 처리 폿트 수 : 5개
라. 경종개요 : 재배양식 (시설재배, 폿트재배), 폿트크기 : 지름 6cm
마. 조사방법 및 판정기준 : 약효시험 (이병주수, 약제처리 7일 후 작물별 병발생 정도), 약해시험 (외관상 약해유무, 약제처리 3, 5, 7일 후 외관확인)
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실시예
1> 항진균 활성을 갖는
Streptomyces
collinus
Inha504(AN090291)
방선균
선별
KRIBB의 김창진 박사님 실험실로부터 방선균 배양액을 분주 받아 항진균 활성을 확인할 때 자주 사용되는 C. albicans와 식물병원성 진균인 F. oxysporum을 이용해 항진균 활성 비교실험을 진행하였다.
2419개의 샘플들 중 149개의 샘플에서 억제 영역(inhibition zone)을 보이며 항진균 활성을 확인하였다(도 1).
16s rRNA sequence, RNA polymerase B 등 특정 유전자의 서열 비교를 통해 신규 균주라고 판단되는 Streptomyces collinus Inha504(AN090291) 균주를 선별하였다.
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실시예
2>
Streptomyces
collinus
Inha504
(AN090291) 균주 전체 게놈 서열분석과 항진균 활성물질의 특성 분석
전체 게놈 서열분석을 통해 Streptomyces 계열의 신규 균주임을 확인하였다(표 1).
antiSMASH 프로그램을 이용하여, 총 36개의 영역에서 이차대사산물을 만드는 클러스터(cluster)를 찾아냈고, 34번째 영역에서 폴리엔 화합물(polyene compound)을 만들어내는 생합성 유전자군으로 예측되었다(도 2). 이는 기존에 알려진 나타마이신 클러스터(natamycin cluster)와 높은 유사성을 보였다(도 3).
<
실시예
3> 항진균 활성 확인
아래의 여러 가지 식물병원성 진균에 대한 항진균 활성을 확인한 결과, 확인한 모든 진균에서 활성을 확인하였다(도 4).
Fusarium oxysporum (KACC 40051), Fusarium solani (KACC 44891), Fusarium verticillioides (KCTC 16672). Fusarium semitectum (KCTC 6065), Botrytis cinerea (KACC 40574), Curvularia lunata (KACC 40861), Aspergillus niger (KCTC46204).
<
실시예
4> 미생물제제로서의 가능성 확인하기 위해 화분 수준에서 항진균 활성확인
한국식물환경연구소(수원)에 용역을 의뢰하고 진행하였다. 약효시험의 결과, 고추(50.1%), 딸기(53.9%), 토마토(63.6%)의 방제율이 확인되었다. 약해시험의 결과, Streptomyces collinus Inha504(AN090291)의 배양액이 식물에 해를 끼치지 않음을 확인하였다(표 2).
이상으로, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그것들의 등가물에 의해서 정의된다고 할 것이다.
<110> INHA-INDUSTRY PARTNERSHIP INSTITUTE
<120> Novel Streptomyces collinus Inha504 for controlling against plant
pathogenic fungi and use thereof
<130> ADP-2021-0518
<160> 2
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 1514
<212> RNA
<213> Streptomyces collinus Inha504
<400> 1
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<211> 3486
<212> DNA
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gaggaggacc gcttcgtcat cgcgcaggcc aacgccacgc tcaacgacga actgcggttc 1620
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gacgtcgact acatggacgt ctcgccgcgc cagatggtgt cggtcgcgac cgccatgatc 1740
ccgttcctcg agcacgacga cgccaaccgt gccctcatgg gcgcgaacat gatgcgccag 1800
gccgtgccgc tcatcaagtc cgaggcgccg ctcgtcggca ccggcatgga gtaccgctcc 1860
gcggtcgacg ccggcgacgt ggtcaaggcc gagaaggacg gtgtggtcca ggaggtctcc 1920
gcggactaca tcaccacggc gaacgacgac ggcacgtaca tcacgtaccg cctgcacaag 1980
ttctcccggt ccaaccaggg cacctcggtc aaccagaagg tcgtcgtcga cgagggcgac 2040
cggatcatca cgggccaggt gctcgcggac ggtccggcca ccgagaacgg cgagatggcc 2100
ctgggcaaga acctgctcgt ggcgttcatg ccgtgggagg gtcacaacta cgaggacgcg 2160
atcatcctgt cgcagcgcct cgtgcaggac gacgtcctct cctcgatcca catcgaggag 2220
cacgaggtcg acgcccgtga caccaagctg ggccccgagg agatcacccg ggacatcccg 2280
aacgtctccg aggaggtcct cgccgacctc gacgagcgcg gcatcatccg tatcggtgcc 2340
gaggtcgtcg ccggtgacat cctcgtcggc aaggtcacgc ccaagggtga gaccgagctg 2400
acaccggagg agcgcctgct gcgcgcgatc ttcggtgaga aggcccgtga ggtccgtgac 2460
acctccctga aggtgccgca cggcgagatc ggcaaggtca tcggcgtccg cgtcttcgac 2520
cgcgaggagg gcgacgagct gccgccgggc gtgaaccagc tggtccgcgt ctacgtcgcg 2580
cagaagcgca agatcaccga cggtgacaag ctcgccggcc gtcacggcaa caagggtgtc 2640
atctccaaga tcctgccgat cgaggacatg ccgttcctgg aggacggcac cccggtcgac 2700
atcatcctca acccgctggg tgtgccgtcc cgaatgaacc cgggacaggt cctggagatc 2760
cacctcggct ggctcgccag ccgtggctgg gacgtctccg gtctcgccga cgagtgggcg 2820
cagcgcctgc aggtcatcgg cgccgaccag gtcgacccgg gcacgaacgt cgcgaccccc 2880
gtcttcgacg gtgcgcgcga ggacgagctc gcgggtctgc tgcagcacac catcccgaac 2940
cgcgacggcg agcgcatggt gctcccgtcc ggcaaggcgc ggctgttcga cggccgcagc 3000
ggtgagccgt tcccggagcc gatctcggtc ggctacatgt acatcctgaa gctgcaccac 3060
ctggtcgacg acaagctgca cgcccgctcg accggtccgt actcgatgat cacccagcag 3120
ccgctgggtg gtaaggcgca gttcggtggc cagcggttcg gcgagatgga ggtgtgggcc 3180
ctcgaggcct acggcgccgc ctacgcgctg caggagctgc tgacgatcaa gtccgacgac 3240
gtgaccggcc gcgtgaaggt ctacgaggcc atcgtcaagg gcgagaacat ccccgagccc 3300
ggcatccccg agtccttcaa ggtgctcatc aaggagatgc agtcgctctg cctgaacgtg 3360
gaggtgctgt ccagcgacgg tatgtccatc gagatgcgcg acaccgacga ggacgtcttc 3420
cgcgctgcgg aggagctcgg tatcgacctg tcccggcgcg agccgagcag cgtcgaagag 3480
gtctga 3486
Claims (6)
- KCTC14683BP로 기탁되고, 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 푸자리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 푸자리움 솔라니(Fusarium solani), 푸자리움 베르티실리오이드(Fusarium verticillioides), 푸자리움 세미텍툼(Fusarium semitectum), 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea) 및 커부라리아 루나타(Curvularia lunata)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 진균에 대한 항진균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 콜리너스(Streptomyces collinus) Inha504 균주.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1로 표시되는 16S rRNA 염기서열 또는 서열번호 2로 표시되는 ropB 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 스트렙토마이세스 콜리너스(Streptomyces collinus) Inha504 균주.
- 제1항에 있어서, 상기 균주는 하기 화학식 1로 표시되는 폴리엔 화합물을 생산하는 것을 특징으로 하는 스트렙토마이세스 콜리너스(Streptomyces collinus) Inha504 균주.
[화학식 1]
- 삭제
- 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 푸자리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 푸자리움 솔라니(Fusarium solani), 푸자리움 베르티실리오이드(Fusarium verticillioides), 푸자리움 세미텍툼(Fusarium semitectum), 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea) 및 커부라리아 루나타(Curvularia lunata)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 진균 방제용 조성물.
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2021
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Journal de Mycologie Médicale, Vol.28, pp.462-468(2018.09.) |
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