KR102576447B1

KR102576447B1 - 열 안정성이 증대된 비타민 c-펩타이드 유도체 및 이를 포함하는 콜라겐 형성용, 미백용 및/또는 항산화용 조성물

Info

Publication number: KR102576447B1
Application number: KR1020220152009A
Authority: KR
Inventors: 박경용; 정기훈; 김지연; 김윤식; 조은경; 이성진
Original assignee: 주식회사 차메디텍
Priority date: 2022-11-14
Filing date: 2022-11-14
Publication date: 2023-09-08

Abstract

본 발명은 비타민 C-펩타이드 유도체 또는 이의 염 및 이를 포함하는 콜라겐 형성용, 미백용 및/또는 항산화용 화장료 및/또는 약학적 조성물에 관한 것으로, 열안정성이 우수한 특징을 가진다.

Description

열 안정성이 증대된 비타민 C-펩타이드 유도체 및 이를 포함하는 콜라겐 형성용, 미백용 및/또는 항산화용 조성물{Vitamin C-peptide derivatives with increased thermal stability and compositions for collagen formation, whitening, and/or antioxidant containing the same}

본 발명은 열 안정성이 증대된 비타민 C-펩타이드 유도체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비타민 C 유도체와 펩타이드 유도체가 결합된 형태로, 이를 포함하는 콜라겐 형성용, 미백용 및/또는 항산화용 화장료 및/또는 약학적 조성물에 관한 것이다.

비타민 C는 엘-아스코빅 산 (L-ascorbic acid)이라고 명명하기도 하며, 물에 용해되는 수용성 비타민이다. 이 비타민 C는 콜라겐 합성에 필요한 라이신 하이드록실레이즈 (lysine hydroxylases)에 대한 중요한 조효소 역할을 하며, 또한 멜라닌 형성에 관여를 하는 타이로신에이즈 (tyrosinase) 저해 및 우리 몸에서 형성하는 프리-라디칼을 제거해 주는 역할을 한다. 이와 같은 콜라겐 합성 촉진을 통한 주름 개선, 미백, 항산화 효과뿐만 아니라, 면역 증대, 철 이온 흡수 및 우리 몸에 필요한 담즙산을 형성하는 등의 여러 가지 역할을 한다. 이와 같은 기능으로 식품, 화장품 및 의약품으로 많이 응용되어 사용되고 있지만, 빛과 열 등의 여러 외부 환경에 의해서 쉽게 산화되고 분해되는 단점을 가지고 있다.

이와 같은 단점을 극복하기 위해, 비타민 C의 캡슐화, 나노화 같은 기술뿐만 아니라, 자체적인 비타민 C 유도체들의 개발이 많이 이루어지고 있다. 대표적인 비타민 C의 안정화 물질로써는 L-ascorbic acid-2-sulfate (AA-2S), L-ascorbic acid-2-phosphate (AA-2P), L-ascorbic acid-2-glucoside (AA-2G), 2-octadecyl ascorbic acid (CV-3611) 등이 개발되었지만, 상용화하기 비싸며, 용해도 및 생체 이용율이 낮은 단점들을 가지고 있다.

최근에는 비타민 C 또는 비타민 C 유도체 화합물에 링커 (linker)가 결합되어 있는 펩타이드 유도체를 결합시켜서, 비타민 C의 안정성과 효능을 증대시키는 연구가 보고되고 있다. 대한민국 특허 등록 10-2130701 (비타민 C가 결합된 펩타이드 유도체 및 이를 포함하는 조성물)에서는 비타민 C의 2번 위치에 석시노일 그룹이 펩타이드와 함께 결합되어, 콜라겐 형성을 촉진하였으며, 특허 등록 10-0691540 에서는 비타민 C의 2번 위치에 포스페이트 그룹이 결합되어 비타민 C의 안정성을 증대시켰으며, 5번 위치에 석시노일그룹이 펩타이드와 함께 결합되어, 콜라겐 효과를 증대시켰다. 또한, 대한민국 특허 등록 10-1969345에서는 비타민 C의 2번 위치에 포스페이트 유도체가 펩타이드의 C-말단과 결합되어 있고, 펩타이드의 N-말단에는 팔미노일 기가 결합되어 있어, 효능 및 피부 투과력을 증대시킨 연구가 보고 되었다. 그러나, 이와 같은 연구는 비타민 C-펩타이드 물질의 효능, 안정성 및 경제성 측면에서 문제가 대두되고 있다.

상기와 같은 배경 하에서, 본 발명자들은 비타민 C 유도체에 콜라겐 형성, 미백, 항산화 기능을 하는 인체 친화적인 펩타이드를 결합시킴으로써, 비타민 C-펩타이드 결합 소재의 낮은 독성과 열 안정성 및 3가지 효능 (콜라겐 형성, 미백, 항산화)에 대해서 평가를 하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 비타민 C 및/또는 비타민 C 유도체와 펩타이드를 포함하는 비타민 C-펩타이드 유도체 또는 이의 염을 제공한다.

본 발명은 비타민 C 유도체와 3종 내지 10종 (3종 내지 9종, 3종 내지 8종, 3종 내지 7종, 3종 내지 6종 또는 3종 내지 5종, 예컨대, 3종, 4종 또는 5종)의 아미노산을 포함하는 펩타이드를 포함하고,

상기 3종 내지 10종 (3종 내지 9종, 3종 내지 8종, 3종 내지 7종, 3종 내지 6종 또는 3종 내지 5종, 예컨대, 3종, 4종 또는 5종)의 아미노산은 γ-글루탐산 (γ-Glutamic acid; γ-Glu; γ-E), 글루탐산 (Glutamic acid; Glu; E), 아스파트산 (Aspartic acid; Asp; D), 글루타민 (Glutamine; Gln; Q), 아스파라긴 (Asparagine; Asn; N), 히스티딘 (Histidine; His; H), 라이신 (Lysine; Lys; K), 아르기닌 (Arginine; Arg; R), 세린 (Serine; Ser; S), 시스테인 (Cysteine; Cys; C), 베타-알라닌 (β-Alanine; β-Ala; β-A), 알라닌 (Alanine; Ala; A), 글라이신 (Glycine; Gly; G), 류신 (Leucine; Leu; L), 이소류신 (Isoleucine; Ile; I), 발린 (Valine; Val; V), 트레오닌 (Threonine; Thr; T), 메티오닌 (Methionine; Met; M), 프롤린 (Proline; Pro; P), 페닐알라닌 (Phenylalanine; Phe; F), 타이로신 (Tyrosine; Tyr; Y) 및 트립토판 (Tryptophan; Trp; W)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인,

비타민 C이 비해 열안정성이 개선된, 비타민 C-펩타이드 유도체 또는 이의 염을 제공한다.

본 발명은 상기 비타민 C-펩타이드 유도체 또는 이의 염을 포함하는 콜라겐 형성용, 미백용 및/또는 항산화용 화장료 및/또는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서는 상기 비타민 C-펩타이드 유도체 또는 이의 염의 비타민 C에 비해 열안정성이 개선된 것을 확인하였다.

이에, 일 예는 비타민 C 유도체와 3종 내지 10종 (3종 내지 9종, 3종 내지 8종, 3종 내지 7종, 3종 내지 6종 또는 3종 내지 5종, 예컨대, 3종, 4종 또는 5종)의 아미노산을 포함하는 펩타이드를 포함하고,

상기 비타민 C 유도체와 3종 내지 10종 (3종 내지 9종, 3종 내지 8종, 3종 내지 7종, 3종 내지 6종 또는 3종 내지 5종, 예컨대, 3종, 4종 또는 5종)의 아미노산을 포함하는 펩타이드는 링커 (linker)에 의해 결합된 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 링커는 숙시노일 (succinoyl), 글루타릴 (glutaryl), 8-아미노-3,6-디옥사옥타노일 (8-amino-3,6-dioxaoctanoyl) 및 6-아미노헥사노일 (6-aminohexanoyl)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 비타민 C 유도체는 하기 화학식 2의 구조를 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:

[화학식 2]

상기 비타민 C-펩타이드 유도체 또는 이의 염은 하기 화학식 3, 4 또는 5의 구조를 가질 수 있고:

[화학식 3]

상기 화학식 3에서,

X₁, X₂, 및 X₃는 각각 독립적으로 γ-글루탐산, 글루탐산, 아스파트산, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 라이신, 아르기닌, 세린, 시스테인, 베타 알라닌, 알라닌, 글라이신, 류신, 이소류신, 발린, 트레오닌, 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있고;

X₄ 및 X₅는 각각 독립적으로 존재하지 않거나(absent), 또는 γ-글루탐산, 글루탐산, 아스파트산, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 라이신, 아르기닌, 세린, 시스테인, 베타 알라닌, 알라닌, 글라이신, 류신, 이소류신, 발린, 트레오닌, 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있고;

Y는 숙시노일 (succinoyl), 글루타릴 (glutaryl), 8-아미노-3,6-디옥사옥타노일 (8-amino-3,6-dioxaoctanoyl) 및 6-아미노헥사노일 (6-aminohexanoyl)로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

구체적인 하나의 양태로서, 상기 화학식 3의 화합물은 하기 화학식 4 또는 5의 화합물일 수 있다.

[화학식 4]

[화학식 5]

상기 식에서 X₁, X₂, X₃ 및 X₄는 각각 독립적으로 γ-글루탐산, 글루탐산, 아스파트산, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 라이신, 아르기닌, 세린, 시스테인, 베타 알라닌, 알라닌, 글라이신, 류신, 이소류신, 발린, 트레오닌, 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있고;

상기 식에서 Y는 숙시노일 (succinoyl), 글루타릴 (glutaryl), 8-아미노-3,6-디옥사옥타노일 (8-amino-3,6-dioxaoctanoyl) 및 6-아미노헥사노일 (6-aminohexanoyl)로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

또는, 상기 화학식 3의 화합물은 하기 화학식 6의 구조를 갖는 화합물일 수 있다:

[화학식 6]

상기 식에서,

X₁, X₂, X₃, X₄ 및 X₅의 정의는 상기 화학식 3에서 정의된 바와 같다.

본 명세서에서 제공하는 비타민 C-펩타이드 유도체 또는 이의 염은 콜라겐 형성, 미백 및 항산화로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 효과가 있을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 상기 비타민 C-펩타이드 유도체 또는 이의 염을 포함하는, 콜라겐 형성용, 미백용 및/또는 항산화용 화장료 및/또는 약학적 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 명세서에서의 "비타민 C"는 L-아스코르브산 (L-ascorbic acid, Asc)이라고도 부르는 물질로, 거의 모든 과일과 채소에 들어있는 비타민의 중의 하나로, 비타민 C가 결핍되면 괴혈병이 일어날 수 있고, 강력한 환원제로 항산화 작용이 있고, 콜라젠 합성 효소와 생물의 에너지 대사과정에 관여하는 다양한 효소의 보조 효소이다. 비타민 C는 열에 약하기 때문에 약 70도 이상의 열을 가하면 비타민 C의 5각형 구조가 깨진다. 따라서 신선한 채소와 과일을 가열하지 않고 날것으로 먹어야 비타민 C를 파괴하지 않고 섭취할 수 있다.

본 명세서에서의 "유도체"는 화합물의 일부를 화학적으로 변화시켜서 얻어지는 유사한 화합물을 의미한다.

본 명세서에서의 "비타민 C-펩타이드 유도체"는 비타민 C와 펩타이드를 포함하는 유도체를 의미하고, 상기 비타민 C 및 펩타이드는 직/간접적으로 결합된 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서의 "염"은 양이온과 음이온이 정전기적 인력에 의해 결합하고 있는 물질인 염 중에서 생리학적으로 허용되는 염을 의미할 수 있고, 예컨대, 약학적으로 허용 가능한 염, 화장료에 허용 가능한 염, 및/또는 식품에 허용 가능한 염을 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 염은 금속염, 유기 염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 예에서, 상기 금속염은 알칼리 금속염 (나트륨염, 칼륨염 등), 알칼리 토금속염 (칼슘염, 마그네슘염, 바륨염 등), 알루미늄염 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고; 유기 염기와의 염은 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 시클로헥실아민, 디시클로헥실아민, N,N-디벤질에틸렌디아민 등과의 염 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며; 무기산과의 염은 염산, 브롬화 수소산, 질산, 황산, 인산 등과의 염 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일수 있고; 유기산과의 염은 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프탈산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레인산, 시트르산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등과의 염 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며; 염기성 아미노산과의 염은 아르기닌, 라이신, 오르니틴 등과의 염 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고; 산성 아미노산과의 염은 아스파르트산, 글루탐산 등과의 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 명세서에서 "열안정성"은 상대적으로 높은 온도에서 화학 구조 또는 물리 구조의 비가역 변화에 저항하는 능력을 의미하고, 예컨대, 열처리 등 상대적으로 높은 온도를 가했을 때, 본 명세서의 비타민 C의 파괴 및/또는 아미노산을 포함하는 펩타이드의 구조 변화에 대한 저항 정도를 의미한다.

본 명세서에서 "링커"는 비타민 C 유도체와 펩타이드를 간접적으로 연결해주는 역할을 하고, 전체적인 화합물의 물성에 영향을 끼칠 수 있다.

본 명세서에서 "콜라겐"은 흔히 교원질이라고 불리고, 대부분의 동물, 특히 포유동물에서 많이 발견되는 섬유 단백질로, 피부와 연골 등 체내의 모든 결합조직의 대부분을 차지하는 물질을 의미한다.

본 명세서에서 "미백" 또는 "피부 미백"은 피부에서의 색소침착을 예방, 개선, 완화, 및/또는 치료하는 모든 활성을 의미하는 것으로, 예컨대, 주근깨, 기미, 검버섯, 잡티 등의 예방, 개선, 완화, 및/또는 치료를 의미할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 "항산화" 효능은 세포 내 대사 또는 자외선의 영향으로 인한 산화적 스트레스에 따라 반응성이 높은 자유 라디칼 (free radical) 또는 활성 산소종 (reactive oxygen species; ROS)에 의한 세포의 산화를 억제하는 것을 포함하고, 자유 라디칼 또는 활성 산소종을 제거하여 이로 인한 세포의 손상이 감소되는 것을 포함하고, 산화를 방지 또는 억제하는 의미이며, 산화의 반대되는 개념이 "환원"으로 "환원력"은 항산화 측정의 척도가 될 수 있다.

본 명세서에서 "산화"란 산소와의 결합, 수소의 떨어져 나감, 산화수의 증가 (전자의 수가 줄어듦)의 경우를 의미하고, "환원"은 산소와의 분리, 수소와의 결합, 산화수의 감소 (전자의 수가 늘어남)의 경우를 의미하고, 한 원소가 산화하면 다른 원소는 환원되기 때문에 항상 동반되어 발생한다고 볼 수 있다.

본 명세서에서 제공하는 콜라겐 형성용, 미백용 및/또는 항산화용 화장료 및/또는 약학적 조성물은 상기 비타민 C-펩타이드 유도체 또는 이의 염을 0.01 내지 1,000 μM, 0.01 내지 500 μM, 0.01 내지 200 μM, 0.01 내지 150 μM, 0.01 내지 120 μM, 0.01 내지 110 μM, 0.01 내지 100 μM, 0.01 내지 50 μM, 0.01 내지 20 μM, 0.01 내지 15 μM, 0.01 내지 12 μM, 0.01 내지 10 μM, 0.01 내지 5 μM, 0.01 내지 2 μM, 0.01 내지 1 μM, 0.1 내지 1,000 μM, 0.1 내지 500 μM, 0.1 내지 200 μM, 0.1 내지 150 μM, 0.1 내지 120 μM, 0.1 내지 110 μM, 0.1 내지 100 μM, 0.1 내지 50 μM, 0.1 내지 20 μM, 0.1 내지 15 μM, 0.1 내지 12 μM, 0.1 내지 10 μM, 0.1 내지 5 μM, 0.1 내지 2 μM, 0.1 내지 1 μM, 0.5 내지 1,000 μM, 0.5 내지 500 μM, 0.5 내지 200 μM, 0.5 내지 150 μM, 0.5 내지 120 μM, 0.5 내지 110 μM, 0.5 내지 100 μM, 0.5 내지 50 μM, 0.5 내지 20 μM, 0.5 내지 15 μM, 0.5 내지 12 μM, 0.5 내지 10 μM, 0.5 내지 5 μM, 0.5 내지 2 μM, 0.5 내지 1 μM, 1 내지 1,000 μM, 1 내지 500 μM, 1 내지 200 μM, 1 내지 150 μM, 1 내지 120 μM, 1 내지 110 μM, 1 내지 100 μM, 1 내지 50 μM, 1 내지 20 μM, 1 내지 15 μM, 1 내지 12 μM, 1 내지 10 μM, 1 내지 5 μM, 1 내지 2 μM, 5 내지 1,000 μM, 5 내지 500 μM, 5 내지 200 μM, 5 내지 150 μM, 5 내지 120 μM, 5 내지 110 μM, 5 내지 100 μM, 5 내지 50 μM, 5 내지 20 μM, 5 내지 15 μM, 5 내지 12 μM, 5 내지 10 μM, 8 내지 1,000 μM, 8 내지 500 μM, 8 내지 200 μM, 8 내지 150 μM, 8 내지 120 μM, 8 내지 110 μM, 8 내지 100 μM, 8 내지 50 μM, 8 내지 20 μM, 8 내지 15 μM, 8 내지 12 μM, 8 내지 10 μM, 10 내지 1,000 μM, 10 내지 500 μM, 10 내지 200 μM, 10 내지 150 μM, 10 내지 120 μM, 10 내지 110 μM, 10 내지 100 μM, 10 내지 50 μM, 10 내지 20 μM, 10 내지 15 μM, 10 내지 12 μM, 50 내지 1,000 μM, 50 내지 500 μM, 50 내지 200 μM, 50 내지 150 μM, 50 내지 120 μM, 50 내지 110 μM, 50 내지 100 μM, 80 내지 1,000 μM, 80 내지 500 μM, 80 내지 200 μM, 80 내지 150 μM, 80 내지 120 μM, 80 내지 110 μM, 80 내지 100 μM, 100 내지 1,000 μM, 100 내지 500 μM, 100 내지 200 μM, 100 내지 150 μM, 100 내지 120 μM, 또는 100 내지 110 μM의 농도로 포함할 수 있고, 예컨대, 1, 10, 또는 100 μM의 농도로 포함할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 제공하는 비타민 C-펩타이드 유도체 또는 이의 염은 비타민 C에 펩타이드 유도체 또는 이의 염이 직/간접적으로 결합하여, 열안정성이 개선될 수 있고, 펩타이드 유도체 또는 이의 염이 직/간접적으로 결합되지 않은 비타민 C와 대비하여 열안정성이 개선된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 제공하는 비타민 C-펩타이드 유도체 또는 이의 염 및/또는 상기 비타민 C-펩타이드 유도체 또는 이의 염을 포함하는 콜라겐 형성용, 미백용 및/또는 항산화용 화장료 및/또는 약학적 조성물은 50℃ 온도의 열을 120시간 가할 경우 50℃ 열을 가하기 전에 비해 잔존량이 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 94% 이상, 96% 이상, 또는 98% 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 제공하는 비타민 C-펩타이드 유도체 또는 이의 염 및/또는 상기 비타민 C-펩타이드 유도체 또는 이의 염을 포함하는 콜라겐 형성용, 미백용 및/또는 항산화용 화장료 및/또는 약학적 조성물은 항산화 활성이 우수하여, 항산화제로 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 상기 항산화 활성은 ORAC (Oxygen radical absorbance capacity; 활성산소흡수능력) 방법을 통해 확인할 수 있고, 하기 수학식 1을 통해 확인할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

[수학식 1]

AUC = 1+ f1/f0+... fi/f0+...+ f60/f0 (f0는 0분, fi는 i분에서의 형광 값)

상기 비타민 C-펩타이드 유도체 또는 이의 염을 포함하는 콜라겐 형성용, 미백용 및/또는 항산화용 화장료 및/또는 약학적 조성물은 비타민 C-펩타이드 유도체 또는 이의 염을 1 μM의 농도로 포함하는 경우, 0 이상, 1 이상, 2 이상, 2.3 이상, 2.5 이상, 2.7 이상, 2.9 이상, 3.1 이상 또는 3.3 이상으로 측정될 수 있고, 10,000 이하, 1,000 이하, 또는 100 이하로 측정될 수 있고, 예컨대, 2.4, 2.5 또는 3.3으로 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 비타민 C-펩타이드 유도체 또는 이의 염을 포함하는 콜라겐 형성용, 미백용 및/또는 항산화용 화장료 및/또는 약학적 조성물은 비타민 C-펩타이드 유도체 또는 이의 염을 10 μM의 농도로 포함하는 경우, 0 이상, 5 이상, 10 이상, 15 이상, 16 이상, 17 이상, 18 이상, 19 이상 또는 19.5 이상으로 측정될 수 있고, 10,000 이하, 1,000 이하, 또는 100 이하로 측정될 수 있고, 예컨대, 16.2, 18.0 또는 19.6으로 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 비타민 C-펩타이드 유도체 또는 이의 염을 포함하는 콜라겐 형성용, 미백용 및/또는 항산화용 화장료 및/또는 약학적 조성물은 비타민 C-펩타이드 유도체 또는 이의 염을 100 μM의 농도로 포함하는 경우, 0 이상, 10 이상, 20 이상, 30 이상, 35 이상, 36 이상, 36.2 이상, 36.4 이상 또는 36.5 이상으로 측정될 수 있고, 10,000 이하, 1,000 이하, 또는 100 이하로 측정될 수 있고, 예컨대, 36.0, 36.4 또는 36.5로 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 비타민 C-펩타이드 유도체 또는 이의 염 및/또는 상기 비타민 C-펩타이드 유도체 또는 이의 염을 포함하는 콜라겐 형성용, 미백용 및/또는 항산화용 화장료 및/또는 약학적 조성물은 세포 독성이 없고, 이를 CCK-8 assay 방법을 이용하여 확인할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 비타민 C-펩타이드 유도체 또는 이의 염을 포함하는 콜라겐 형성용, 미백용 및/또는 항산화용 화장료 및/또는 약학적 조성물은 스킨, 화장수, 용액, 외용 연고, 크림, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 세정제, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제-함유 클렌징, 오일, 파운데이션, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취, 및 스프레이로 구성된 군에서 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상을 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 화장료 조성물의 제형에 따라 다양하다.

상기 화장료 조성물의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실리케이트, 폴리아미드 파우더 등이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로 플루오로 하이드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제 등이 이용될 수 있으며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일 등이 이용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 화장료 조성물에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다. 구체적으로, 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 비타민 C-펩타이드 유도체 또는 이의 염을 포함하는 콜라겐 형성용, 미백용 및/또는 항산화용 화장료 및/또는 약학적 조성물은 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트, 토끼 등의 설치류, 이외의 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말, 염소 등을 포함하는 포유류, 닭, 오리, 거위 등을 포함하는 조류, 뱀, 도마뱀, 거북, 악어 등을 포함하는 파충류, 양서류, 및 어류 등의 척추동물에서 선택된 투여 대상에 다양한 경로로 투여될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 2형 당뇨, 심근경색, 뇌졸증 및 비흑색종 피부암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 질환 치료 효과가 있을 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 약학적 조성물의 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 예컨대, 경구 투여, 또는 정맥, 근육, 피하, 또는 복강 주사, 또는 경피 투여 등의 비경구 투여의 경로로 투여될 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 또는 멸균 주사용액의 형태의 비경구 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 앞서 설명한 유효성분 이외에도, 일반적으로 투여방식과 표준 약제학적 관행 (Standard pharmaceutical practice)을 고려하여 선택된 약제학적 및/또는 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제, 및 희석제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 보조제와 혼합되어 투여될 수 있다. 예컨대, 상기 약제학적 및/또는 생리학적으로 허용되는 담체는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 약제학 분야에서 통상적으로 사용되는 모든 담체일 수 있다.

상기 약제학적 및/또는 생리학적으로 허용되는 희석제 및/또는 부형제는 약학적 조성물의 적절한 제제화에 통상적으로 사용되는 모든 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 윤할제, 계면활성제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

예컨대, 정제, 환제, 산제, 과립제, 또는 캡슐제 등의 경구투여를 위한 고형 제제의 경우, 상기 부형제는 이러한 고형 제제의 제제화를 위한 적어도 1종 이상의 물질, 예컨대, 전분, 칼슘카보네이트 (Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose), 락토오스 (Lactose), 젤라틴 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 이외에도, 마그네슘 스티레이트 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 또한, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등의 경구투여를 위한 액상제제의 제제화의 경우, 통상적으로 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 사용될 수 있고, 이외에, 통상적으로 사용되는 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 및/또는 보존제 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예컨대, 상기 약학적 조성물은 전분 또는 락토오즈를 함유하는 정제 형태로, 또는 적절한 부형제를 함유하는 캡슐 형태로, 또는 맛을 내거나 색을 띄게 하는 화학 약품을 함유하는 엘릭시르 또는 현탁제 형태로 경구, 구강내 또는 혀밑 투여될 수 있다. 이러한 액체 제제는 현탁제 (예를 들면, 메틸셀룰로오즈, 위텝솔 (Witepsol)과 같은 반합성 글리세라이드 또는 행인유 (Apricot kernel oil)와 PEG-6 에스테르의 혼합물 또는 PEG-8과 카프릴릭/카프릭 글리세라이드의 혼합물과 같은 글리세라이드 혼합물)와 같은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제와 함께 제형화 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 상기 약학적 조성물은 주사 형태로 제제화 될 수 있으며, 용제, 방부제, 안정화제, 수화제, 유화 촉진제, 현탁화제, 등장화제 및/또는 완충제 등의 약제학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물이 탈모방지 또는 발모촉진 효능을 나타내는 특성상 주사 형태로 제제화되어 투여되는 경우, 피하 주사일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 비타민 C-펩타이드 유도체 또는 이의 염 및/또는 상기 비타민 C-펩타이드 유도체 또는 이의 염을 포함하는 콜라겐 형성용, 미백용 및/또는 항산화용 화장료 및/또는 약학적 조성물에 관한 것으로, 열안정성이 우수한 효과가 있다.

도 1은 비타민 C 유도체인 2-O-[(3-aminopropyl)phosphinooxy]-L-ascorbic acid 및 비타민 C 유도체와 펩타이드 결합 화합물을 제조하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 비타민 C 유도체와 펩타이드 결합 화합물 제조 시 각 단계에서 화합물이 적절하게 제조되었는지 HPLC 측정을 통해 확인한 결과이다.
도 3은 비타민 C 유도체가 결합된 펩타이드 화합물의 세포 독성을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 인간 피부 섬유 아세포에 비타민 C 유도체가 결합된 펩타이드 화합물 첨가 시 하이드록시프롤린 생성양을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 마우스 멜라닌 생성세포에 비타민 C 유도체가 결합된 펩타이드 화합물를 첨가 시 타이로시나아제 생생 억제 효과를 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 마우스 멜라닌 생성세포에 비타민 C 유도체가 결합된 펩타이드 화합물를 첨가 시 멜라닌 생성 억제 효과를 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 비타민 C 유도체가 결합된 펩타이드 화합물의 항산화 효과를 ORAC (Oxygen radical absorbance capacity; 활성산소흡수능력) 방법을 이용하여 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 비타민 C 유도체가 결합된 펩타이드 화합물의 항산화 효과 지속력을 ORAC (Oxygen radical absorbance capacity; 활성산소흡수능력) 방법을 이용하여 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 비타민 C 유도체가 결합된 펩타이드 화합물의 50℃ 온도에서 시간에 따른 화합물의 잔존량을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 2-O-[(3-aminopropyl)phosphinooxy]-L-ascorbic acid의 합성

비타민 C 유도체인 2-O-[(3-aminopropyl)phosphinooxy]-L-ascorbic acid (이하, (III) 화합물)을 Bull. Korean Chem. Soc. 2003, 24(8), 1169 문헌을 참고하여 총 3가지 과정을 통해 합성하였고, 그 합성 과정을 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 첫 번째 반응은, 하기 화학식 1의 비타민 C 화합물과 용매인 acetone을 첨가하고 0℃로 냉각시킨 후에, acetyl chloride (1.1 당량)를 천천히 첨가한 후, 40℃ 온도에서 2시간 동안 반응을 하여, 비타민 C의 5, 6번 위치에 acetal 보호기를 도입한 (I) 화합물을 합성하였다.

[화학식 1]

두 번째 반응은, 비타민 C의 2번 위치에 phosphate 그룹을 도입하는 반응으로써, 상기 (I) 화합물과 triethylamine (2 당량)을 dichloromethane에 용해시키고, 0℃로 냉각시킨 후에 2-chloro-[1, 3, 2]oxazaphophinane 2-oxide (1.2 당량)을 천천히 첨가하였다. 0℃에서 1시간동안 교반을 하고, 실온에서는 24시간 동안 추가적인 교반 반응을 진행하였다. 반응 후 인산 용액을 첨가하고, 분별 깔대기를 이용하여, 유기층을 회수한 후, charcoal과 Na₂SO₄를 첨가하고 여과한 후, 유기 용액을 감압 하에서 농축시켜 (II) 화합물을 합성하였다.

세 번째 반응은, 가수 분해 반응으로써, 상기 (II) 화합물에 물을 첨가하고, 50℃ 온도 조건에서 3시간 동안 반응을 하여, (III) 화합물을 합성하였고, (III) 화합물은 하기 화학식 2를 갖는다.

[화학식 2]

상기 2-chloro-[1, 3, 2]oxazaphosphinane 2-oxide는 3-aminopropan-1-ol과 phosphorus oxychloride를 triethylamine의 조건 하에서 반응하여 합성하였다.

실시예 2. 비타민 C 유도체와 펩타이드 결합 화합물의 합성

비타민 C 유도체와 펩타이드 결합 화합물을 제조하기 위해, 2-Chloro trityl 레진 (치환율: 1.18 mmol/g)을 이용한 고체상 펩타이드 합성 방법 (Solid phase peptide synthesis; SPPS) (COIN, Irene; BEYERMANN, Michael; BIENERT, Michael. Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences. Nature protocols, 2007, 2(12), 3247-3256.에 기재되어 있는 프로토콜에 따라 실시)을 이용하여 펩타이드 결합 화합물을 합성하였고, 그 합성 과정을 도 1에 나타내었다.

구체적으로, 비타민 C 유도체-펩타이드 결합 화합물은 총 5단계로 합성이 되었다. 펩타이드 제조를 위해 Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH 및 Fmoc-Leu-OH 아미노산을 사용하여 상기 SPPS 합성 방법에 따라 하기 표 1의 아미노산 조합 (화합물 1 내지 9)의 resin을 제조하였다.

상기 제조된 resin 중 H₂N-K(Boc)T(tBu)T(tBu)K(Boc)S(tBu)-2-chloro trityl resin에 N-Hydroxybenzotriazole (HOBt) / Hexafluorophosphate Benzotriazole Tetramethyl Uronium (HBTU) / N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) (치환율 기준, 3 당량/3 당량/6 당량) 시약을 첨가하여, 6시간동안 반응을 시켜, 펩타이드 커플링 반응을 진행하였다. 6시간 반응 후, 다이클로로메탄을 용매로 하여, succinic anhydride/DIPEA (치환율 기준 2 당량/4 당량) 시약을 첨가하여, 16시간동안 반응하여 펩타이드의 N-말단에 succinoyl 그룹을 도입하였다.

상기 펩타이드의 N-말단에 succinoyl 그룹 도입된 HO₂C-Succinoyl-K(Boc)-T(tBu)-T(tBu)-K(Boc)-S(tBu)-2-chloro trityl resin에 HBTU/DIPEA (치환율 기준 2 당량/4 당량) 시약을 DMF에 녹여 첨가하고, 실온에서 30분동안 free activation을 하였다. 상기 실시예 1에서 합성된 (III) 화합물 (비타민 C 유도체)을 첨가하여, 16시간동안 반응하여, 비타민 C 유도체-펩타이드 결합 화합물인 (IV) 화합물을 합성하였다.

상기 (IV) 화합물의 전체 보호기 및 레진에서 펩타이드를 분리하기 위해, TFA:TIS:H₂O = 95:2.5:2.5 (v/v/v)의 cleavage cocktail 조건에서 3시간동안 반응시켰고, 펩타이드 여액을 과량의 ether에 첨가하여, 고체 상태의 최종 화합물인 (1) 화합물을 얻었다. 이 때, 각 step 합성 여부는 HPLC 분석을 이용하여, 확인하였고, 각 단계를 도 1에 나타내었다. 상기 제조된 표 1의 다른 아미노산 조합의 resin 각각을 사용하여 실질적으로 동일한 방법으로 총 9개의 화합물을 제조하였다.

분취 고성능 액체 크로마토그래피 (Prep. HPLC, Shimazu, Corp., 모델명: 10A)를 이용하여 비타민 C 유도체-펩타이드의 정제를 진행하였고, 펩타이드의 분자량 및 순도 확인은 액체크로마토그래피-질량분석기 (LC-Mass, Waters, Inc., 모델명: SQD2)와 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC, Shimazu, Corp., 모델명: 20A) 장비를 이용하여 확인하였고, 상기 과정을 통해 비타민 C 유도체가 링커 역할을 하는 succinoyl기를 통해 펩타이드와 결합되어 있는 형태로 합성된 화합물은 하기 화학식 6을 가지고, HPLC 측정 결과는 도 2, 화학식 6의 X의 정보와 측정 결과는 표 1에 나타내었다.

[화학식 6]

종류	X_1’	X_2’	X_3’	X_4’	X_5’	이론치 분자량	실험치 분자량
화합물 1	K	T	T	K	S	958.8	959.4
화합물 2	K	V	K	-	-	768.7	769.3
화합물 3	G	E	K	G	-	784.6	785.3
화합물 4	A	R	P	-	-	737.6	738.3
화합물 5	F	W	Y	-	-	909.7	910.2
화합물 6	K	P	V	-	-	737.6	738.2
화합물 7	Y	E	G	-	-	762.5	763.1
화합물 8	Y	H	L	-	-	826.7	827.2
화합물 9	Y	E	H	-	-	842.6	843.3

실시예 3. 비타민 C 유도체-펩타이드 결합 화합물의 인간 피부 섬유 아세포에서의 독성 확인 시험

인간 피부 섬유 아세포 (Human normal skin fibroblast, CCD-986sk)를 사용하여 상기 실시예 2에서 합성한 비타민 C 유도체가 결합된 펩타이드 화합물인 화합물 1 내지 9의 세포 독성 여부를 확인하였다. 인간 피부 섬유 아세포는 한국 세포주 은행 (Korea Cell Line Bank, No.21947)에서 구매를 했으며, 세포 배양액은 Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM, Gibco, USA)에 10% fetal bovine serum (FBS, Corning, USA), 10% penicillin (100 unit/mL)과 streptomycin (100 g/mL)을 첨가하여 사용하였다. 세포 배양 조건은 37℃, 95% 습도, 5% CO₂ incubator에서 진행하였으며, passage 21~22의 인간 피부 섬유 아세포를 실험에 사용하였다.

비타민 C 유도체가 결합된 펩타이드 화합물들을 처리하였을 때, 세포 독성 여부를 확인하기 위하여, 3차 증류수에 녹인 각각의 화합물 1 내지 9를 1, 10 또는 100μM의 농도로 상기 세포에 처리한 후에 72시간동안 배양하였다. CCK-8 assay 방법을 이용하여 cell의 viability를 측정하였으며, 그 결과는 하기 도 3 및 표 2에 나타내었다.

처리 물질	Cell viability (%)
처리 물질	1 μM	10 μM	100 μM
화합물 1	99.3	101.7	97.2
화합물 2	99.1	98.1	99.2
화합물 3	97.1	98.2	102.1
화합물 4	101.1	99.3	96.7
화합물 5	97.2	97.5	99.9
화합물 6	99.1	101.1	102.4
화합물 7	98.2	96.2	97.3
화합물 8	102.9	100.6	97.8
화합물 9	98.1	96.8	97.1

그 결과, 상기 화합물 1 내지 9는 모든 농도에서 인간 피부 섬유 아세포의 성장에 영향을 주지 않았기 때문에, 세포 독성이 없다는 것을 확인하였다.

실시예 4. 비타민 C 유도체-펩타이드 결합 화합물의 인간 피부 섬유 아세포에서의 하이드록시프롤린 합성 시험

인간 피부 섬유 아세포 (Human normal skin fibroblast, CCD-986sk)를 사용하여 상기 실시예 2에서 합성한 비타민 C 유도체가 결합된 펩타이드 화합물 처리에 따른 콜라겐 성분인 하이드록시프롤린 (hydroxyproline) 함량을 확인하였다.

구체적으로, 10,000 cell/well 농도로 인간 피부 섬유 아세포를 96-well plate에 100μl씩 분주하고, 37℃, 95% 습도, 5% CO₂ incubator에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 배지를 10% FBS를 포함하는 IMDM (Iscove Modified Dulbecco Media)으로 교환하고, 상기 실시예 2에서 합성한 비타민 C 유도체가 결합된 펩타이드 화합물을 각각 1μM, 10μM 또는 100μM 농도로 처리하고 72시간동안 배양하였다. 상기 화합물을 처리하지 않고 3차 증류수를 첨가한 것을 대조군 (control)으로 사용하였으며, 상기 화합물 대신 비타민 C를 1μM, 10μM 또는 100μM의 농도로 첨가한 것을 양성 대조군으로 사용하였다.

상기 세포를 72시간 동안 배양한 후 배양액을 채취하여 하이드록시프롤린의 양을 비색측정법 (Hydroxyproline Assay kit; Sigma-Aldrich 제조, #MAK357)을 통해 측정하였다. 대조군의 하이드록시프롤린 양을 기준으로 (100%)하여, 각각의 화합물을 처리한 시험군의 배양액 중의 총 하이드록시프롤린 양을 산출하였으며, 화합물 1, 2 및 3의 측정 결과를 표 3 및 도 4에 나타내었다.

처리 물질	Hydroxyproline의 양(%)
처리 물질	1 μM	10 μM	100 μM
비타민 C (대조군)	111.3	146.7	154.3
화합물 1	110.6	116.8	162.9
화합물 2	138.6	121.4	116.6
화합물 3	89.5	96.2	109.3

그 결과, 화합물 1은 양성대조군인 비타민 C의 하이드록시프롤린의 생성양을 비교한 결과, 유사하거나 고농도에서 화합물 1의 하이드록시프롤린의 생성양이 소량 증대하는 것을 확인하였다.

실시예 5. 비타민 C 유도체-펩타이드 결합 화합물의 마우스 멜라닌 생성 세포에서의 타이로시나아제 (Tyrosinase)의 활성 감소 시험

마우스 멜라닌 생성 세포 (B16F10)에 상기 실시예 2에서 합성한 비타민 C 유도체가 결합된 펩타이드 화합물을 각각 1, 10 또는 100μM의 농도로 처리한 후에, 타이로시나아제의 생성 억제 효과를 측정하였다.

구체적으로, 5 X 10³ 세포/well 농도로 B16F10 세포를 96 well plate에 100μl씩 분주하고, 37℃, 95% 습도, 5% CO₂ 조건에서 24시간동안 배양하였다. 상기 배양된 세포에 α-MSH (Melanocyte stimulating hormone) 200nM 및 상기 실시예 2에서 합성한 비타민 C 유도체가 결합된 펩타이드 화합물을 1, 10 또는 100 μM 농도로 처리한 후 72시간동안 재배양 하였다. 이 때, 대조군으로 펩타이드 화합물을 처리하지 않고 배양한 것을, 양성 대조군으로 펩타이드 화합물 대신 비타민 C 화합물을 1, 10 또는 100μM 농도로 처리하여 배양한 것을 준비하였고, 재배양된 마우스 멜라닌 생성 세포에서 생성된 타이로시나아제 생성 억제 효과는 Tyrosinase inhibitor screening kit (Biovision_#K575-100)를 사용하여 측정하였고, 화합물 4 내지 6을 처리하여 측정한 결과를 하기 표 4 및 도 5에 나타내었다.

처리물질		처리농도 (μM)	타이로시네이즈 저해율 (%)
대조군		-	100
α-MSH		0.2	132.1
α-MSH +	비타민 C	1	121.9
		10	105.6
		100	87.2
	화합물 4	1	120.9
		10	100.5
		100	91.3
	화합물 5	1	118.3
		10	104.5
		100	86.7
	화합물 6	1	120.4
		10	102.2
		100	85.4

그 결과, 상기 화합물 4 내지 6은 대조군인 비타민 C와 타이로시나아제 저해율을 비교한 결과, 유사한 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6. 비타민 C 유도체-펩타이드 결합 화합물의 마우스 멜라닌 생성 세포에서의 멜라닌 억제 효과 시험

마우스 멜라닌 생성 세포 (B16F10)에 상기 실시예 2에서 합성한 비타민 C 유도체가 결합된 펩타이드 화합물을 각각 1, 10 또는 100μM의 농도로 처리한 뒤 멜라닌 생성 억제 효과를 측정하였다.

구체적으로, 2 X 10⁴ 세포/well 농도로 B16F10 세포를 24 well plate에 1ml씩 분주하고, 37℃, 95% 습도, 5% CO₂ incubator 조건에서 24시간동안 배양하였다. 상기 세포를 24시간동안 배양한 후, α-MSH (Melanocyte stimulating hormone) 200nM 및 상기 실시예 2에서 합성한 비타민 C 유도체가 결합된 펩타이드 화합물을 1, 10 또는 100μM의 농도로 처리한 후 72시간동안 배양하였다. 대조군으로 펩타이드 화합물을 처리하지 않고 배양한 것을, 양성 대조군으로 펩타이드 화합물 대신 비타민 C 화합물을 1, 10 또는 100μM의 농도로 처리하여 배양한 것을 준비하였다.

상기 세포를 72시간 동안 배양한 후, B16F10 세포를 1.5 ml 마이크로 튜브에 넣은 다음, Trypsin EDTA 0.25% 용액 (Corning, USA)으로 수거한 후, PBS을 첨가하고, 원심 분리하여 세척하는 과정을 2회 진행하였다. 원심분리한 세포는 1N NaOH (10% DMSO) 500μl로 재부유한 후 80℃에서 1시간 동안 재배양을 하였다. 96-well plate에 배양액을 100μl씩 분주하고, 세포 내에서 생성된 멜라닌 색소의 흡광도를 405 nm에서 측정하였고, 화합물 4 내지 6을 처리하여 측정한 결과를 하기 표 5 및 도 6에 나타내었다.

처리물질		처리농도 (μM)	멜라닌 생성 저해율 (%)
대조군		-	100
α-MSH		0.2	132.4
α-MSH +	비타민 C	1	125.1
		10	96.8
		100	78.3
	화합물 4	1	119.4
		10	105.1
		100	88.9
	화합물 5	1	113.8
		10	97.4
		100	80.8
	화합물 6	1	115.1
		10	94.2
		100	75.2

그 결과, 상기 화합물 4 내지 6을 대조군인 비타민 C와 멜라닌 생성율을 비교한 결과, 유사한 저해율을 확인할 수 있었으며, 특히 화합물 6은 대조군보다 멜라닌 생성을 좀 더 억제하는 것을 확인하였다.

실시예 7. 비타민 C 유도체-펩타이드 결합 화합물의 항산화 효능 시험

상기 실시예 2에서 합성한 비타민 C 유도체가 결합된 펩타이드 화합물의 항산화 효능을 확인하기 위하여, ORAC (Oxygen radical absorbance capacity; 활성산소흡수능력) 방법을 이용하여, 항산화 능력을 확인하였다.

구체적으로, 75mM 인산 완충 용액 (pH 7.4)에 sodium fluorescein을 800nM 농도로 희석한 용액 125μl와 1, 10 또는 100μM 농도가 되도록 상기 실시예 2에서 합성한 펩타이드 화합물 25μl를 혼합하고, AAPH [75mM, 2,2′-Azobis(2- methylpropionamidine)dihydrochloride)] 50μL를 추가하여 혼합 용액을 만든 후, 37℃에서 60분동안 반응하면서, 1분마다 형광 분석 (excitation 485 nm, emission 528nm)을 진행하여 측정하였다. 이 때, 형광 감소 곡선의 아래 면적 (Area under the curve, AUC)은 하기 수학식 1로 계산하였고, 대조군으로는 상기 실시예 2에서 합성한 펩타이드 화합물을 혼합하지 않고 반응시킨 것을, 양성대조군으로는 펩타이드 화합물 대신 비타민 C를 혼합하여 반응시킨 것을 준비하였다.

[수학식 1]

시료의 산화 방지능은 펩타이드 화합물 또는 비타민을 첨가한 경우의 AUC 값에서 펩타이드 화합물을 첨가하지 않은 경우의 AUC값를 제한 순면적 (netAUC)으로 계산하였다. 화합물 7 내지 9를 측정한 결과를 하기 표 6 및 도 7에 나타내었다. 펩타이드 화합물을 10 또는 100uM 농도에서 60분동안 형광 분석 (excitation 485 nm, emission 528 nm)을 진행하여, 형광의 강도를 측정하였으며, 이를 통해, 화합물의 항산화 효과 지속력을 확인하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

처리 물질	netAUC
처리 물질	1 μM	10 μM	100 μM
Control	0	0	0
비타민 C (대조군)	0.9	5.5	22.9
화합물 7	2.5	16.2	36.5
화합물 8	3.3	19.6	36.4
화합물 9	2.4	18.0	36.0

그 결과. 화합물 7 내지 9는 양성대조군인 비타민 C보다 모든 농도에서 항산화 능력이 우수하고 항산화 효과 지속력이 더 우수한 것을 확인하였다.

실시예 8. 비타민 C 유도체-펩타이드 결합 화합물의 열 안정성 시험

상기 실시예 2에서 합성한 비타민 C 유도체가 결합된 펩타이드 화합물들의 열 안정성을 시험하기 위하여, 50℃의 온도에서, 시간별로 분해되지 않은 화합물의 양을 HPLC로 분석을 하여, 안정성 시험을 진행하였다.

구체적으로, 상기 펩타이드 화합물을 1mg/ml 농도로 PBS에 용해한 후에 2ml의 e-tube에 1.2 ml씩 분주하고, 50℃로 설정된 장소에 넣어 두고, 0, 1, 2, 4, 6, 24, 48, 120시간 지남에 따라서, 남아 있는 양을 HPLC로 분석을 하였으며, 이 때 분석 조건을 하기 표 7에 나타내었다. 양성대조군으로 펩타이드 화합물 대신 비타민 C를 PBS에 용해한 것을 준비하였다.

농도	1 mg / 1 ml	컬럼온도	35℃
주입량	5 ul	이동상 A	0.1% TFA in DW
분석방법	ACN 5-31% (0-13분)	이동상 B	0.1% TFA in CAN
파장	230 nm	컬럼	C18, 4.6X250 mm, 5 um, 300Å Vydac
유속	1 ml/분	컬럼	C18, 4.6X250 mm, 5 um, 300Å Vydac

HPLC로 분석한 후, peak를 적분하였고, 0시간일 때의 피크 면적을 100%로 기준을 설정하고 데이터를 분석하였으며, 화합물 1, 2, 6 및 8의 결과를 하기 표 8 및 도 9에 나타내었다.

시간 (h)	50℃온도에서 화합물의 잔존량 (%)
시간 (h)	비타민 C	화합물 1	화합물 2	화합물 6	화합물 8
0	100	100	100	100	100
1	98	100	100	100	100
2	97	100	100	100	100
4	95	100	100	100	100
6	94	100	100	99.5	100
24	86	99.7	97.9	98.4	99.9
96	69	98.9	97.3	97.1	97.8
120	40	98.7	93.8	94.4	93.9

그 결과, 상기 화합물 1, 2, 6 및 8은 양성대조군인 비타민 C보다 시간에 따른 잔존량 감소량이 매우 적어, 열 안정성이 높은 것을 확인하였다.

Claims

하기 화학식 3, 4 또는 5의 구조를 갖고,
[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

상기 화학식 3에서 X₁ 및 X₄는 라이신, X₂ 및 X₃은 트레오닌, X₅는 세린;
상기 화학식 4에서 X₁ 및 X₄는 글라이신, X₂는 글루탐산, X₃은 라이신; 또는
상기 화학식 5에서
(1) X₁ 및 X₃은 라이신, X₂는 발린
(2) X₁은 알라닌, X₂는 아르기닌, X₃은 프롤린,
(3) X₁은 페닐알라닌, X₂는 트립토판, X₃은 타이로신,
(4) X₁은 라이신, X₂는 프롤린, X₃은 발린,
(5) X₁은 타이로신, X₂는 글루탐산, X₃은 글라이신,
(6) X₁은 타이로신, X₂는 히스티딘, X₃은 류신, 또는
(7) X₁은 타이로신, X₂는 글루탐산, X₃은 히스티딘인 것으로,
상기 화학식 3 내지 5에서 Y는 숙시노일 (succinoyl), 글루타릴 (glutaryl), 8-아미노-3,6-디옥사옥타노일 (8-amino-3,6-dioxaoctanoyl) 및 6-아미노헥사노일 (6-aminohexanoyl)로 이루어진 군에서 선택된 것이고,
상기 화학식 3 내지 5에서 X₁의 N-말단이 Y와 연결되는 것이고,
비타민 C에 비해 열안정성이 개선된, 비타민 C-펩타이드 유도체 또는 이의 염.
삭제
삭제
하기 화학식 3, 4 또는 5의 구조를 갖고,
[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

상기 화학식 3에서 X₁ 및 X₄는 라이신, X₂ 및 X₃은 트레오닌, X₅는 세린이고,
상기 화학식 4에서 X₁ 및 X₄는 글라이신, X₂는 글루탐산, X₃은 라이신이고,
상기 화학식 5에서 X₁ 및 X₃은 라이신, X₂는 발린인 것으로,
상기 화학식 3 내지 5에서 Y는 숙시노일 (succinoyl), 글루타릴 (glutaryl), 8-아미노-3,6-디옥사옥타노일 (8-amino-3,6-dioxaoctanoyl) 및 6-아미노헥사노일 (6-aminohexanoyl)로 이루어진 군에서 선택된 것이고,
상기 화학식 3 내지 5에서 X₁의 N-말단이 Y와 연결되는, 비타민 C-펩타이드 유도체 또는 이의 염을 포함하는, 콜라겐 형성용 화장료 조성물.
삭제
제4항에 있어서, 상기 비타민 C-펩타이드 유도체 또는 이의 염을 0.01μM 내지 1,000μM의 농도로 포함하는, 콜라겐 형성용 화장료 조성물.
하기 화학식 5의 구조를 갖고,
[화학식 5]

상기 화학식 5에서
(1) X₁은 알라닌, X₂는 아르기닌, X₃은 프롤린,
(2) X₁은 페닐알라닌, X₂는 트립토판, X₃은 타이로신, 또는
(3) X₁은 라이신, X₂는 프롤린, X₃은 발린인 것으로,
상기 Y는 숙시노일 (succinoyl), 글루타릴 (glutaryl), 8-아미노-3,6-디옥사옥타노일 (8-amino-3,6-dioxaoctanoyl) 및 6-아미노헥사노일 (6-aminohexanoyl)로 이루어진 군에서 선택된 것이고,
상기 화학식 5에서 X₁의 N-말단이 Y와 연결되는 비타민 C-펩타이드 유도체 또는 이의 염을 포함하는, 미백용 화장료 조성물.
삭제
제7항에 있어서, 상기 비타민 C-펩타이드 유도체 또는 이의 염을 0.01μM 내지 1,000μM의 농도로 포함하는, 미백용 화장료 조성물.
하기 화학식 5의 구조를 갖고,
[화학식 5]

상기 화학식 5에서
(1) X₁은 알라닌, X₂는 아르기닌, X₃은 프롤린,
(2) X₁은 페닐알라닌, X₂는 트립토판, X₃은 타이로신, 또는
(3) X₁은 라이신, X₂는 프롤린, X₃은 발린인 것으로,
상기 Y는 숙시노일 (succinoyl), 글루타릴 (glutaryl), 8-아미노-3,6-디옥사옥타노일 (8-amino-3,6-dioxaoctanoyl) 및 6-아미노헥사노일 (6-aminohexanoyl)로 이루어진 군에서 선택된 것이고,
상기 화학식 5에서 X₁의 N-말단이 Y와 연결되는 비타민 C-펩타이드 유도체 또는 이의 염을 포함하는, 미백용 약학적 조성물.
삭제
삭제
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제10항에 있어서, 상기 비타민 C-펩타이드 유도체 또는 이의 염을 0.01μM 내지 1,000μM의 농도로 포함하는, 미백용 약학적 조성물.
하기 화학식 5의 구조를 갖고,
[화학식 5]

상기 화학식 5에서
(1) X₁은 타이로신, X₂는 글루탐산, X₃은 글라이신,
(2) X₁은 타이로신, X₂는 히스티딘, X₃은 류신, 또는
(3) X₁은 타이로신, X₂는 글루탐산, X₃은 히스티딘인 것으로,
상기 Y는 숙시노일 (succinoyl), 글루타릴 (glutaryl), 8-아미노-3,6-디옥사옥타노일 (8-amino-3,6-dioxaoctanoyl) 및 6-아미노헥사노일 (6-aminohexanoyl)로 이루어진 군에서 선택된 것이고,
상기 화학식 5에서 X₁의 N-말단이 Y와 연결되는 비타민 C-펩타이드 유도체 또는 이의 염을 포함하는, 항산화용 화장료 조성물.
삭제
삭제
제15항에 있어서, 상기 비타민 C-펩타이드 유도체 또는 이의 염을 0.01μM 내지 1,000μM의 농도로 포함하는, 항산화용 화장료 조성물.
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