CN113896768A - 抗菌肽以及它们的美容组合物或药用组合物和用途 - Google Patents

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Abstract

通式R1‑Val‑Lys‑X1‑Trp‑Lys‑Lys‑Trp‑Trp‑Arg‑Lys‑Trp‑X2‑Lys‑X3‑X4‑R2的抗菌肽、其立体异构体、立体异构体的混合物、或其美容上可接受的盐、或其药学上可接受的盐、或它们的美容组合物或药用组合物、以及其在制备抑菌和/或杀菌的美容组合物或药物组合物中的用途。

Description

抗菌肽以及它们的美容组合物或药用组合物和用途
技术领域
本发明涉及一种抗菌肽、以及含有这些抗菌肽的美容组合物或药用组合物及其用途。
背景技术
自从青霉素被发现并应用于临床，许多曾经严重危害人类生命健康的感染性疾病因抗生素的使用而得到了有效的控制，各种各样的抗生素已经成为很多疾病的治疗中必不可少的药物，给人类生命健康带来了极大的好处。然而，随着传统抗生素的滥用，致病菌逐渐出现了耐药性，人类生命健康又面临着超级细菌感染的严重威胁。
为应对超级细菌引起的感染，开发新型抗菌药物至关重要。抗菌肽由此引起了研究人员的广泛关注。抗菌肽是生物体经诱导产生的一类具有广谱抗菌活性和免疫调节活性，能够抵抗外界病原体感染的多肽类物质，其广泛存在于昆虫、两栖动物、鸟类、鱼类、哺乳动物、植物及人体内。大多数抗菌肽是阳离子抗菌肽，序列中含有多个赖氨酸和精氨酸。抗菌肽的阳离子性和疏水性与带负电荷的微生物胞膜发生相互作用，引起膜通透性改变，或在细菌细胞膜上形成跨膜的孔洞，最后导致细菌内容物外泄而死亡。因此，抗菌肽具有快速杀菌和广谱的抗菌活性，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、多重耐药细菌、真菌、寄生虫、包膜病毒和肿瘤细胞均有作用，且不易诱导耐药菌株的产生。由此可见，抗菌肽是一类有望替代传统抗生素、具有巨大发展潜力的新型抗菌药物。
然而，天然的抗菌肽应用于临床尚有很多不尽如人意之处，如稳定性差、溶血性高等，因此有必要通过计算机辅助药物设计手段，人工设计合成抗菌肽，开发稳定、低毒、高效的广谱抗菌药物，以有效地解决致病菌耐药性问题。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的发明人通过计算机辅助药物设计手段，设计优化筛选得到了一系列稳定、高效、低毒、广谱抗菌肽。
因此，本发明要解决的技术问题是提供一种抗菌活性高，溶血性低的广谱抗菌肽、其立体异构体、立体异构体的混合物、或其美容上可接受的盐、或其药学上可接受的盐。此外，本发明还提供了一种含有这些肽的美容组合物或药用组合物。这些肽、含有这些肽的美容组合物或药用组合物可用于抑制细菌和/或真菌、杀灭细菌和/或真菌。
鉴于此，本发明提供一种通式(I)所示的抗菌肽，或其立体异构体、或立体异构体的混合物、或其美容上可接受的盐、或其药学上可接受的盐，
R1-Val-Lys-X1-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-X2-Lys-X3-X4-R2(I)
通式(I)中，
X1和X2彼此独立地选自：-Arg-、-Lys-、-His-或-Gly-；
X3选自：-Trp-、-Val-、-Asn-或-Gln-；
X4选自：-Trp-、-Val-或-Met-；
R1选自：H或R3-CO-，其中R3选自：取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烯基；
R2选自：-NR4R5或-OR4，其中R4和R5彼此独立地选自：H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烯基；
基团R1和R2对应地结合至这些肽序列的氨基末端(N-末端)和羧基末端(C-末端)。
所述烷基是指具有1-24个碳原子(可选具有1-16个碳原子；可选具有1-14个碳原子；可选具有1-12个碳原子；可选具有1、2、3、4、5、或6个的碳原子)的饱和脂肪族直链或支链的烷基；可选选自：甲基、乙基、异丙基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、2-乙基己基、2-甲基丁基、或5-甲基己基；
所述烯基是指具有2-24个碳原子(可选具有2-16个碳原子；可选具有2-14个碳原子；可选具有2-12个碳原子；可选具有2、3、4、5、或6个碳原子)的直链或支链烯基；所述烯基具有一个或多个碳-碳双键，可选具有1、2或3个共轭或非共轭的碳-碳双键；所述烯基是通过一个单键而结合至分子的其余部分；可选选自：乙烯基、油烯基、或亚油烯基；
可选地，所述“取代的烷基”、“取代的烯基”中的取代基选自C1-C4烷基；羟基；C1-C4烷氧基；氨基；C1-C4氨基烷基；C1-C4羰氧基；C1-C4氧基羰基；卤素(如氟、氯、溴、以及碘)；氰基；硝基；叠氮化物；C1-C4烷基磺酰基；硫醇；C1-C4烷硫基；C6-C30芳氧基如苯氧基；-NRb(C＝NRb)NRbRc，其中Rb和Rc是独立地选自：H、C1-C4烷基、C2-C4烯基、C2-C4炔基、C3-C10环烷基、C6-C18芳基、C7-C17芳烷基、具有三至十元的杂环基、或氨基的保护基。
可选地，R1选自：H、乙酰基、叔-丁酰基、己酰基、2-甲基己酰基、辛酰基、癸酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基、油酰基或亚油酰基；
可选地，R1选自H、乙酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基或棕榈酰基；
可选地，R1是H、乙酰基或棕榈酰基。
可选地，R4、R5彼此独立地选自：H、甲基、乙基、己基、十二烷基或十六烷基；
可选地，R4是H并且R5选自：H、甲基、乙基、己基、十二烷基或十六烷基；
可选地，R2是-OH或-NH2。
通式(I)所示的抗菌肽，或其立体异构体、或立体异构体的混合物、或其美容上可接受的盐、或其药学上可接受的盐，选自下列肽(1)-(19)：
(1)H-Val-Lys-Arg-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Arg-Lys-Trp-Trp-OH；
(2)H-Val-Lys-Arg-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Arg-Lys-Trp-Trp-NH2；
(3)H-Val-Lys-Arg-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Lys-Lys-Trp-Val-OH；
(4)H-Val-Lys-Arg-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Lys-Lys-Trp-Val-NH2；
(5)Ac-Val-Lys-Arg-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Lys-Lys-Trp-Val-OH；
(6)Ac-Val-Lys-Arg-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Lys-Lys-Trp-Val-NH2；
(7)Palm-Val-Lys-Arg-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Lys-Lys-Trp-Val-OH；
(8)Palm-Val-Lys-Arg-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Lys-Lys-Trp-Val-NH2；
(9)H-Val-Lys-Lys-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-His-Lys-Val-Met-OH；
(10)H-Val-Lys-Lys-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-His-Lys-Val-Met-NH2；
(11)H-Val-Lys-His-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Gly-Lys-Asn-Val-OH；
(12)H-Val-Lys-His-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Gly-Lys-Asn-Val-NH2；
(13)H-Val-Lys-Gly-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Gly-Lys-Gln-Val-OH；
(14)H-Val-Lys-Gly-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Gly-Lys-Gln-Val-NH2；
(15)H-Val-Lys-Gly-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Gly-Lys-Gln-Val-OH；
(16)H-Val-Lys-Gly-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Gly-Lys-Gln-Val-NH2；
(17)H-Val-Lys-Arg-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Lys-Lys-Trp-Met-NH2；
(18)H-Val-Lys-Lys-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Lys-Lys-Trp-Val-NH2；
(19)H-Val-Lys-Gly-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Gly-Lys-Asn-Trp-NH2。
本发明的这些肽可以作为立体异构体或立体异构体的混合物存在；例如，包含它们的这些氨基酸可以具有L-、D-的构型、或彼此独立地是外消旋的。因此，有可能获得同分异构混合物以及外消旋混合物或非对映混合物、或纯的非对映异构体或对映异构体，这取决于不对称碳的数量和存在什么同分异构体或同分异构混合物。本发明的这些肽的优选的结构是纯的同分异构体，即，对映异构体或非对映异构体。
例如，当指出X1可以是-Arg-时，应理解X1选自-L-Arg-、-D-Arg-或两者的混合物，是外消旋的或非外消旋的。以同样的方式，当说明X2可以是-Lys-时，应理解它可以是-L-Lys-、-D-Lys-、或两者的混合物，是外消旋的或非外消旋的。在本文件中描述的制备方法使本领域的普通技术人员能够通过选择具有正确构型的氨基酸来获得本发明的肽的每种立体异构体。
术语“美容上可接受的盐或药学上可接受的盐”指被认可的在动物，并且更确切地说在人类中使用的一种盐，包括通式(I)所示的抗菌肽的金属盐，所述金属包括，但不局限于：锂、钠、钾、钙、镁、锰、铜、锌或铝等；包括通式(I)所示的抗菌肽与无机酸或有机酸形成的盐，所述有机酸包括，但不局限于：乙酸、柠檬酸、乳酸、丙二酸、马来酸、酒石酸、延胡索酸、苯甲酸、天冬氨酸、谷氨酸、琥珀酸、油酸、三氟乙酸、草酸、扑酸(pamoate)或葡萄糖酸等；所述无机酸包括，但不局限于：盐酸、硫酸、硼酸或碳酸。
本发明通式(I)所示的抗菌肽、或其立体异构体或其美容上可接受的盐、或其药学上可接受的盐的合成可以根据现有技术中已知的常规方法来进行，例如固相合成法、液相合成法或固相与液相结合的方法，还可以通过以产生所希望的序列为目标的生物技术方法、或通过具有动物、真菌、或植物来源的蛋白质的控制水解来制备。
例如，一种获得通式(I)所示的抗菌肽的方法包括以下步骤：
-将具有受保护的N-末端和自由的C-末端的氨基酸与具有自由的N-末端和受保护的或与固体载体结合的C-末端的氨基酸偶联；
-消除保护N-末端的基团；
-重复该偶联顺序和消除保护N-末端的基团，直到获得所希望的肽序列；
-消除保护C-末端的基团或从该固体载体裂解。
优选地，C-末端与一种固体载体结合并且该方法是在固相上进行，包括将具有受保护的N-末端和自由的C-末端的氨基酸与具有自由的N-末端和与一种聚合物载体结合的C-末端的氨基酸偶联；消除保护N-末端的基团；并且重复此顺序所需要的次数以便因此获得具有所希望的长度的肽，接着从最初的聚合物载体裂解所合成的肽。
在整个合成中这些氨基酸的侧链的官能团用临时或永久的保护基团保持充分地保护，并且可以与从该聚合物载体裂解肽的过程同时地或正交地脱保护。
可选地，固相合成可以通过将二肽或三肽偶联到聚合物支持体上或偶联到先前与聚合物支持体结合的二肽或氨基酸上的汇集策略(convergent strategy)来进行。
该方法可以包括如下另外的步骤：使用本领域已知的标准条件和方法对N-末端和C-末端脱保护和/或以非确定的次序从聚合物支持体裂解肽，随后可以修饰所述末端的官能团。可以对与聚合物支持体结合的通式(I)的肽进行N-末端和C-末端的任选的修饰，或在肽已从聚合物支持体裂解后进行N-末端和C-末端的任选的修饰。
本发明的另一方面，提供一种美容或药用组合物，包括有效量的通式(I)所示的抗菌肽，或其立体异构体、或立体异构体的混合物、或其美容上可接受的盐、或其药学上可接受的盐，以及至少一种赋形剂和任选的美容上或药学上可接受的佐剂；
可选地，所述佐剂选自：胶原合成刺激剂、调节PGC-1α合成的剂、调节PPARγ的活性的剂、增加或减少脂肪细胞的甘油三酸酯含量的剂、刺激或延迟脂肪细胞分化的剂、脂解剂或刺激脂肪分解的剂、溶脂剂、生脂剂、乙酰胆碱受体聚集的抑制剂、抑制肌肉收缩的剂、抗胆碱能试剂、弹性蛋白酶抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、黑色素合成刺激或抑制剂、增白剂或脱色剂、促色素沉着剂、自晒黑剂、抗老化剂、NO-合酶抑制剂、5α-还原酶抑制剂、赖氨酰羟化酶和/或脯氨酰羟化酶的抑制剂、抗氧化剂、自由基清除剂和/或抗大气污染的剂、活性羰基类物质清除剂、抗糖化剂、抗组胺剂、抗病毒剂、抗寄生虫剂、乳化剂、润肤剂、有机溶剂、液体推进剂、皮肤调理剂、保湿剂、保留水分的物质、α羟基酸、β羟基酸、增湿剂、表皮水解酶、维生素、氨基酸、蛋白质、色素或着色剂、染料、生物聚合物、胶凝聚合物、增稠剂、表面活性剂、软化剂、粘合剂、防腐剂、抗皱剂、能够减少或治疗下眼袋的剂、去角质剂、角质剥离剂、角质层分离剂、抗微生物剂、抗真菌剂、抑真菌剂、灭菌剂、抑菌剂、刺激真皮或表皮大分子的合成和/或能够抑制或预防它们的降解的剂、刺激弹性蛋白合成的剂、刺激核心蛋白聚糖合成的剂、刺激层粘连蛋白合成的剂、刺激防御素合成的剂、刺激伴侣蛋白合成的剂、刺激cAMP合成的剂、热休克蛋白、刺激HSP70合成的剂、刺激热休克蛋白合成的剂、刺激透明质酸合成的剂、刺激纤连蛋白合成的剂、刺激去乙酰化酶合成的剂、刺激脂质和角质层组分的合成的剂、神经酰胺、脂肪酸、抑制胶原降解的剂、抑制弹性蛋白降解的剂、抑制丝氨酸蛋白酶的剂、刺激成纤维细胞增殖的剂、刺激角质形成细胞增殖的剂、刺激脂肪细胞增殖的剂、刺激黑色素细胞增殖的剂、刺激角质形成细胞分化的剂、抑制乙酰胆碱酯酶的剂、皮肤松弛剂、刺激糖胺聚糖合成的剂、抗角化过度剂、粉刺溶解剂、抗银屑病剂、抗皮炎剂、抗湿疹剂、DNA修复剂、DNA防护剂、稳定剂、止痒剂、用于治疗和/或护理敏感性皮肤的剂、固化剂、紧致剂、重构剂、抗拉伸纹剂、粘合剂、调节皮脂产生的剂、止汗剂、刺激愈合的剂、协助愈合的剂、刺激再上皮化的剂、协助再上皮化的剂、细胞因子生长因子、镇静剂、抗炎剂、麻醉剂、作用于毛细血管循环和/或微循环的剂、刺激血管生成的剂、抑制血管渗透性的剂、静脉紧张剂、作用于细胞代谢的剂、用于改善真皮-表皮接合的剂、诱导毛发生长的剂、毛发生长抑制或延缓剂、香料、螯合剂、植物提取物、精油、海洋提取物、得自生物发酵过程的剂、无机盐、细胞提取物、防晒剂、以及有效抗A和/或B紫外线的有机或无机光防护剂或其混合物。
可选地，所述美容或药用组合物的制剂选自：霜剂、油、奶、香膏、泡沫、洗剂、凝胶、擦剂、浆液、皂、洗发精、润发乳、血清、软膏、摩丝、润发油、粉末、杆剂、笔剂、喷雾剂、气溶胶、胶囊剂、片剂、颗粒剂、口香糖、溶液、混悬液、乳剂、糖浆剂、酏剂、多糖薄膜、胶冻或明胶；
可选地，所述胶囊剂包括：软胶囊剂、硬胶囊剂，可选为明胶胶囊剂；
可选地，所述片剂包括：糖衣片剂。
本发明的肽根据它们的序列的性质或N-末端和/或C-末端中的任何可能的修饰，在水中具有可变的溶解度。因此本发明的肽可以通过水溶液掺入组合物中，且不溶于水的那些可溶解于美容上或药学上可接受的常规溶剂中，所述溶剂例如并且不限于乙醇、丙醇、异丙醇、丙二醇、甘油、丁二醇或聚乙二醇或其任何组合。
待施用的美容上或药学上有效量的本发明的肽以及它们的剂量将依赖于许多因素，包括年龄、患者的状态、病症或疾病的严重性、施用的途径和频率以及待使用的肽的具体性质。
“美容上或药学上有效量”意指无毒性的但足以提供希望的效果的本发明的一种或多种肽的量。在本发明的美容组合物或药用组合物中以获得希望的效果的美容上或药学上有效的浓度使用本发明的肽；在一个优选形式中，相对于组合物的总重量，在0.00000001％(按重量计)和20％(按重量计)之间，优选在0.000001％(按重量计)和15％(按重量计)之间、更优选在0.0001％(按重量计)和10％(按重量计)之间，并且甚至更优选在0.0001％(按重量计)和5％(按重量计)之间。
本发明的另一方面，提供一种美容上或药学上可接受的递送系统或缓释系统，以便实现有效成分的更好渗透和/或改进它的药物代谢动力学和药效动力学特性，其包含有效量的通式(I)所示的抗菌肽，或其立体异构体、或立体异构体的混合物，或其美容上可接受的盐、或其药学上可接受的盐，或上述的美容或药用组合物。
术语“递送系统”是指与本发明的肽一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体，它们选自：水、油或表面活性剂、包括石油来源、动物来源、植物来源、或合成来源的那些，例如并且不限于花生油、大豆油、矿物油、芝麻油、蓖麻油、聚山梨醇酯、脱水山梨糖醇酯、醚硫酸酯、硫酸酯、甜菜碱、葡萄糖苷、麦芽糖苷、脂肪醇、壬苯醇醚、泊洛沙姆、聚氧乙烯、聚乙二醇、右旋糖、甘油、毛地黄皂苷和类似物。本领域的普通技术人员已知在可以给予本发明的肽的不同递送系统中可以使用的稀释剂。
术语“缓释”以常规含义使用，指提供化合物在一段时间内逐渐释放的化合物的递送系统，且优选地但不是必须地，在整个时间段内具有相对恒定的化合物释放水平。
递送系统或缓释系统的实例是脂质体、油质体、非离子型表面活性剂脂质体囊泡、醇质体、毫米胶囊、微米胶囊、纳米胶囊、纳米结构的脂质载体、海绵状物、环糊精、类脂囊泡、胶束、毫米球、微米球、纳米球、脂质球、微米乳液、纳米乳液、毫米粒子、微米粒子或纳米粒子。优选的递送系统或缓释系统是脂质体和微米乳液，更优选具有反胶束的内部结构的油包水型微米乳液。
缓释系统可以通过现有技术中已知的方法来制备，并且可以例如通过以下方式来给予：通过局部或经皮给药，包括粘附贴剂、非粘附贴剂、封闭贴剂、以及微电子贴剂；或通过全身给药例如并且不局限于，口服或胃肠外途径，包括鼻、直肠、皮下植入或注射、或直接植入或注射至特定身体部位中，并且优选地应该释放相对恒定量的本发明的这些肽。在该缓释系统中包含的肽的量将取决于例如该组合物将被给予的部位、本发明的肽的释放动力学和持续时间、以及有待治疗和/或护理的病状、病症和/或疾病的性质。
本发明的另一方面，提供一种通式(I)所示的抗菌肽，或其立体异构体、或立体异构体的混合物、或其美容上可接受的盐、或其药学上可接受的盐，或上述的美容或药用组合物，或上述的美容上或药学上可接受的递送系统或缓释系统在制备抑菌和/或杀菌的美容组合物或药物组合物中的用途。
可选地，所述抑菌是抑制细菌和/或真菌，所述杀菌是杀灭细菌和/或真菌。
本发明的另一方面，提供一种通式(I)所示的抗菌肽，或其立体异构体、或立体异构体的混合物、或其美容上可接受的盐、或其药学上可接受的盐，或上述的美容或药用组合物，或上述的美容上或药学上可接受的递送系统或缓释系统在制备抗菌祛痘的美容组合物或药物组合物中的用途。
本发明的另一个方面，提供一种用于抑菌和/或杀菌的方法，该方法包括给予美容上或药学上有效量的上述通式(I)所示的抗菌肽，或其立体异构体、或立体异构体的混合物、或其美容上可接受的盐、或其药学上可接受的盐，或上述的美容或药用组合物。
抑菌是抑制细菌和/或真菌，杀菌是杀灭细菌和/或真菌。
含有本发明的上述通式(I)所示的抗菌肽，或其立体异构体、或立体异构体的混合物、或其美容上可接受的盐、或其药学上可接受的盐，或上述的美容或药用组合物可以被施用至皮肤和/或粘膜、或根据需要被口服地或胃肠外给予以便治疗和/或护理一种病况、病症和/或疾病。
施用或给药频率可以变化很大，这取决于每个受试者的需要，其中建议的施用或给药范围从每月1次至每天10次，优选从每周1次至每天4次，更优选从每周3次至每天3次，甚至更优选每天1次或2次。
在本说明书中，用于氨基酸的缩写遵循IUPAC-IUB生化命名委员会(IUPAC-IUBCommission of Biochemical Nomenclature)在欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.1984,138:9-37)中所指定的规则。
因此，例如，Gly表示NH2-CH2-COOH，Gly-表示NH2-CH2-CO-，-Gly表示-NH-CH2-COOH，并且-Gly-表示-NH-CH2-CO-。因此，表示肽键的连字符消除了当位于该符号的右侧时的氨基酸(在此用常规非离子化形式来表示)1-羧基中的OH，并且消除了当位于该符号的左侧时的氨基酸2-氨基中的H；两种修饰可以应用于同一个符号(见表1)。
表1氨基酸残基的结构以及它们的单字母和三字母缩写符号
Figure BDA0003331958680000081
Figure BDA0003331958680000091
缩写“Ac-”在本发明中用来表示乙酰基(CH3-CO-)，并且缩写“Palm-”用来表示棕榈酰基(CH3-(CH2)14-CO-)。
本发明相对于现有技术所取得的有益效果包括：
1、本发明所述的抗菌肽通过人工设计得到，对枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌具有广谱高效的抑菌及杀菌效果，且对红细胞影响小，溶血活性低，安全性高。
2、本发明所述抗菌肽能够在制备抑菌和/或杀菌的美容组合物或药用组合物中应用。
附图说明
图1是测试样品溶血率趋势图
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例及附图对发明作详细的说明，然而，应当理解的是，这些实施例及附图仅用作说明目的，并且不旨在限制本发明的范围。
缩写
用于氨基酸的缩写遵循IUPAC-IUB的生物化学命名委员会在Eur J.Biochem.(1984)138：9-37和J.Chem(1989)264：633-673中指定的规则。
Wang Resin：王树脂；DMF：N,N-二甲基甲酰胺；DCM：二氯甲烷；DIC：二异丙基碳二亚胺；Ac2O：乙酸酐；DIPEA：二异丙基乙胺；Fmoc：9-芴基甲氧羰基；piperidine：哌啶；HOBt：1-羟基苯并三氮唑；TFA：三氟乙酸；TIS：三异丙基硅烷；Ac：乙酰基；Palm：棕榈酰基；Val：缬氨酸；Lys：赖氨酸；Arg：精氨酸；His：组氨酸；Gly：甘氨酸；Trp：色氨酸；Asn：天冬酰胺；Gln：谷氨酰胺；Met：甲硫氨酸；Boc：叔丁氧基羰基；Pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基；Trt：三苯甲基(triphenylmethyl)或三苯甲基(Trityl)；Amide Resin：一种多肽合成用的起始树脂；Fmoc-linker：4-[(2,4-二甲氧基苯基)(Fmoc-氨基)甲基]苯氧乙酸。
实施例1
Fmoc-Val-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Ly s(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Val-Wang Resin的制备。
1.1树脂的溶胀
称取Wang Resin35g(49.7mmol)于2L固相合成反应柱中。加入DMF 100ml完全浸没树脂后通入氮气，开启氮气搅拌鼓泡，5min，后抽干溶剂5min。继续加入DMF 100ml，完全浸没树脂后通入氮气，30min，树脂完全溶胀，抽干溶剂。再加入DMF 100ml，完全浸没树脂后通入氮气，开启氮气搅拌鼓泡，抽干溶剂5min，溶胀结束。
1.2脱Fmoc
溶胀后的树脂用500ml 20％piperidine/DMF脱Fmoc二次，第一次反应5min，第二次反应8min，抽干溶剂3min。用DMF洗涤树脂7～8次，抽走溶剂。
1.3投料反应
称取30.36g的Fmoc-Val-OH(89.46mmol；1.8当量)，14.51g的HOBt加入干燥500ml圆底磨口烧瓶中。加入DMF使其溶解，放入±5℃度冰箱冷藏10min。加入20.78ml DIC活化10min，避免水汽。将活化后的氨基酸加入脱Fmoc保护后的树脂中反应2h，控制反应温度在25℃～35℃，抽走反应液。用DMF洗涤树脂，每次用量100ml，树脂和溶剂均匀混合后计时搅拌2min，抽干溶剂。用DMF洗涤树脂多次，直至抽滤出的溶剂澄清透明。
对N-末端Fmoc基团进行脱保护，并且在存在10.09g HOBt和14.46ml DIC的情况下，使用DMF作为溶剂，将活化后的32.78g Fmoc-Trp(Boc)-OH(62.25mmol；2.5当量)偶联至肽基树脂上，持续反应2h。然后洗涤这些树脂并且重复Fmoc基团的脱保护处理以便偶联下一个氨基酸。在每次偶联中，在存在10.09g HOBt和14.46ml DIC的情况下，使用DMF作为溶剂，顺序地偶联29.17g的Fmoc-Lys(Boc)-OH(62.25mmol；2.5当量)；29.17g的Fmoc-Lys(Boc)-OH(62.25mmol；2.5当量)；32.78g的Fmoc-Trp(Boc)-OH(62.25mmol；2.5当量)；29.17g的Fmoc-Lys(Boc)-OH(62.25mmol；2.5当量)；40.39g的Fmoc-Arg(Pbf)-OH(62.25mmol；2.5当量)；32.78g的Fmoc-Trp(Boc)-OH(62.25mmol；2.5当量)。
对N-末端Fmoc基团进行脱保护，并且在存在12.11g HOBt和17.35ml DIC的情况下，使用DMF作为溶剂，将活化后的39.34g Fmoc-Trp(Boc)-OH(74.7mmol；3当量)偶联至肽基树脂上，持续反应2h。然后洗涤这些树脂并且重复Fmoc基团的脱保护处理以便偶联下一个氨基酸。在每次偶联中，在存在12.11g HOBt和17.35ml DIC的情况下，使用DMF作为溶剂，顺序地偶联35.00g的Fmoc-Lys(Boc)-OH(74.7mmol；3当量)；35.00g的Fmoc-Lys(Boc)-OH(74.7mmol；3当量)；39.34g的Fmoc-Trp(Boc)-OH(74.7mmol；3当量)；48.46g的Fmoc-Arg(Pbf)-OH(74.7mmol；3当量)；35.00g的Fmoc-Lys(Boc)-OH(74.7mmol；3当量)；25.35g的Fmoc-Val-OH(74.7mmol；3当量)。
在该合成之后，用DMF洗涤树脂，每次用量100ml，树脂和溶剂均匀混合后计时搅拌2min，抽干溶剂。用DMF洗涤树脂多次，直至抽滤出的溶剂澄清透明。
实施例2
Fmoc-Val-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Ly s(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Val-Linker-AmideResin的制备。
2.1Fmoc-Linker-Amide Resin的制备
称取Amide Resin树脂15g于固相合成反应柱中。100ml DMF洗涤树脂一次，500mlDMF溶胀树脂30min，抽走溶剂。500ml DMF洗涤树脂3次。
称取21.5g的Fmoc-linker、6.5g的HOBt加入干燥的圆底磨口烧瓶中。加50ml DMF溶解后，置于±5℃冰箱冷藏10min。取出烧瓶，加入9.2g的DIC，活化10min，避免水汽。将活化后的Fmoc-linker加入溶胀后的树脂中反应2h，抽走反应液。用400ml DMF洗涤树脂3次，每次2min。
加入9.5ml醋酸、3.6ml DIPEA密封3h后，用500ml DMF洗涤树脂4次，500ml DCM洗涤树脂2次。抽走溶剂。
检测树脂替代度为0.38，计算合成规模为7.7mmol。
2.2脱Fmoc
Fmoc-Linker-Amide Resin用500ml 20％piperidine/DMF脱Fmoc二次，第一次反应5min，第二次反应8min，抽干溶剂3min。500ml DMF洗涤树脂4次，500ml DCM洗涤树脂2次。抽走溶剂。
2.3投料反应
称取6.53g的Fmoc-Val-OH(19.25mmol；2.5当量)，3.12g的HOBt加入干燥圆底磨口烧瓶中。加入100ml DMF使其溶解，置于±5℃冰箱冷藏10min。取出烧瓶，加入4.47ml DIC活化10min，避免水汽。将活化后的氨基酸加入脱保护后树脂中反应2h，抽走反应液。用500mlDMF洗涤树脂2次，每次2min，400ml DCM洗涤树脂2次，抽走溶剂。
对N-末端Fmoc基团进行脱保护，并且在存在3.12g HOBt和4.47ml DIC的情况下，使用DMF作为溶剂，将活化后的10.14g的Fmoc-Trp(Boc)-OH(19.25mmol；2.5当量)偶联至肽基树脂上，持续反应2h。然后洗涤这些树脂并且重复Fmoc基团的脱保护处理以便偶联下一个氨基酸。在每次偶联中，在存在3.12g HOBt和4.47ml DIC的情况下，使用DMF作为溶剂，顺序地偶联9.02g的Fmoc-Lys(Boc)-OH(19.25mmol；2.5当量)；9.02g的Fmoc-Lys(Boc)-OH(19.25mmol；2.5当量)；10.14g的Fmoc-Trp(Boc)-OH(19.25mmol；2.5当量)；9.02g的Fmoc-Lys(Boc)-OH(19.25mmol；2.5当量)；12.49g的Fmoc-Arg(Pbf)-OH(19.25mmol；2.5当量)；10.14g的Fmoc-Trp(Boc)-OH(19.25mmol；2.5当量)。
对N-末端Fmoc基团进行脱保护，并且在存在3.75g HOBt和5.37ml DIC的情况下，使用DMF作为溶剂，将活化后的12.16g Fmoc-Trp(Boc)-OH(23.1mmol；3当量)偶联至肽基树脂上，持续反应2h。然后洗涤这些树脂并且重复Fmoc基团的脱保护处理以便偶联下一个氨基酸。在每次偶联中，在存在3.75g HOBt和5.37ml DIC的情况下，使用DMF作为溶剂，顺序地偶联10.82g的Fmoc-Lys(Boc)-OH(23.1mmol；3当量)；10.82g的Fmoc-Lys(Boc)-OH(23.1mmol；3当量)；12.16g的Fmoc-Trp(Boc)-OH(23.1mmol；3当量)；14.99g的Fmoc-Arg(Pbf)-OH(23.1mmol；3当量)；10.82g的Fmoc-Lys(Boc)-OH(23.1mmol；3当量)；7.84g的Fmoc-Val-OH(23.1mmol；3当量)。
在该合成之后，用600ml DMF洗涤树脂4次，每次2min，500ml DCM洗涤树脂2次，抽走溶剂。
实施例3
去除N-末端Fmoc保护基团。
将在实施例1和实施例2中所获得的这些肽基树脂的N-末端Fmoc基团脱保护，用500ml20％piperidine/DMF脱Fmoc二次，第一次反应5min，第二次反应8min，抽干溶剂3min。用600ml DMF洗涤树脂4次，每次2min，500ml DCM洗涤树脂2次，抽走溶剂。
实施例4
将R1乙酰基基团引入至实施例3中所获得的肽基树脂上。
在存在25当量DIPEA的情况下、使用5ml的DMF作为溶剂，用25当量的Ac2O处理1mmol的实施例3中所获得的肽基树脂。允许它们反应30min，在此之后用600ml DMF洗涤树脂4次，每次2min，500ml DCM洗涤树脂2次，抽走溶剂。
实施例5
将R1棕榈酰基基团引入至实施例3中所获得的肽基树脂上。
在存在1.53g的HOBt和1.54ml的DIC的情况下，将预先溶解于1ml DMF中的2.56g的棕榈酸添加至1mmol的实施例3中所获得的肽基树脂上。允许它们反应15h，在此之后用600ml DMF洗涤树脂4次，每次2min，500ml DCM洗涤树脂2次，抽走溶剂。
实施例6
将实施例3、4、以及5中所获得的肽基树脂从聚合物支撑体上裂解。
用700ml DCM收缩实施例3、4以及5中所获得的肽基树脂，开启搅拌，开启氮气，计时3min，真空抽干3min。
用700ml甲醇收缩实施例3、4以及5中所获得的肽基树脂，开启搅拌，开启氮气，计时5min，真空抽干3min。
再次加入甲醇700ml收缩实施例3、4以及5中所获得的肽基树脂，开启搅拌，开启氮气计时5min，真空抽干30min。
称取1g所获得的干燥的实施例3、4、以及5的肽基树脂，用10ml的裂解液(TFA：TIS：H2O＝95：2.5：2.5)处理，持续2h。用沙芯漏斗抽滤，1ml三氟乙酸洗涤树脂，将滤液缓慢滴加到冰冻的350ml异丙醚中，有固体析出，离心后用乙醚洗涤4次。在真空下干燥最终的沉淀物。
实施例7
采用高效液相色谱仪进行制备纯化。
先用水溶解实施例6中所获得的粗肽，用氨水调节pH值到8，用孔径为0.45μm滤膜过滤。
纯化制备条件：
流动相A：纯乙腈；流动相B：0.1％醋酸水溶液；
检测波长：215nm；
色谱柱：C18色谱柱；
洗脱梯度：
第一次纯化梯度：
时间(min) 流速(ml/min) 流动相A％ 流动相B％
0 40 10 90
50 40 60 40
51 40 10 90
60 40 10 90
第二次纯化梯度：
Figure BDA0003331958680000141
Figure BDA0003331958680000151
将过滤后的样品进样纯化，收集馏分，浓缩冻干，得到以下纯度超过95％的肽：
1、H-Val-Lys-Arg-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Lys-Lys-Trp-Val-OH，即肽(3)；
2、H-Val-Lys-Arg-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Lys-Lys-Trp-Val-NH2，即肽(4)；
3、Ac-Val-Lys-Arg-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Lys-Lys-Trp-Val-OH，即肽(5)；
4、Ac-Val-Lys-Arg-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Lys-Lys-Trp-Val-NH2，即肽(6)；
5、Palm-Val-Lys-Arg-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Lys-Lys-Trp-Val-OH，即肽(7)；
6、Palm-Val-Lys-Arg-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Lys-Lys-Trp-Val-NH2，即肽(8)。
本发明通式(I)中的其他化合物可以通过类似的方法制备。
所获得的这些肽通过ESI-MS测定其分子量，部分化合物的测试结果见下表2。
表2质谱法测定分子量
编号 序列 分子量质谱分析结果
(4) H-VKRWKKWWRKWKKWV-NH<sub>2</sub> 2227.53
(17) H-VKRWKKWWRKWKKWM-NH<sub>2</sub> 2258.91
(18) H-VKKWKKWWRKWKKWV-NH<sub>2</sub> 2198.95
(19) H-VKGWKKWWRKWGKNW-NH<sub>2</sub> 2071.79
实施例8最低抑菌浓度MIC的测定
8.1试剂与材料
蛋白胨(Oxoid)、酵母提取物(Oxoid)、NaCl(Macklin)、PBS(Gibco)、双蒸水。
8.2仪器
超纯水仪(美国Millipore公司)、小型高速离心机(德国Eppendorf公司)、涡漩仪(美国SCILOGEX公司)、电热恒温培养箱(美国SHEL LAB公司)、十万分之一分析天平(德国Sartorius公司)、多功能微孔板检测仪(瑞士Tecan公司)、生物安全柜(中国Haier公司)、高压灭菌锅(上海博迅公司)、台式冷冻恒温振荡器(苏州培英公司)。
8.3试验菌种
白色念珠菌标准株ATCC 10231、大肠杆菌标准株ATCC 25922、枯草芽孢杆菌标准株CMCC 63501、金黄色葡萄球菌标准株ATCC 25923(以上均由南方医科大学药学院提供)。
8.4待测样品
待测样品信息见下表3。
表3待测样品信息
样品编号 序列 性状 纯度
肽(4) H-VKRWKKWWRKWKKWV-NH<sub>2</sub> 白色粉末 97.152％
参比肽 H-VKRWKKWRWKWKKWV-NH<sub>2</sub> 白色粉末 97.913％
8.5测试方法
8.5.1培养基的制备
LB培养基的制备配方如表4所示：
表4LB培养基配方表
试剂 LB液体培养基
蛋白胨/g 10
酵母提取物/g 5
NaCl/g 10
双蒸水/mL 1000
双蒸水溶解后，121℃高压灭菌15min。
8.5.2实验分组
实验设置调零组(调整测试样品以及培养基溶液本身颜色的误差)、测试样品组、空白对照组，具体浓度梯度(终浓度)如表5所示：
表5测试样品浓度梯度表
Figure BDA0003331958680000161
Figure BDA0003331958680000171
注：①μM表示1L培养基含有测试样品的物质的量(μmol)。
②每个浓度设立6个实验复孔。
8.5.3供试菌的复苏、培养、传代及给药
a.供试菌复苏传代培养
将供试菌菌种于-80℃冰箱取出，溶解至室温后，加入LB液态培养基，置于恒温振荡器培养18h，传至第三代，在生长对数期内测量其600nm的吸光度值，稀释供试菌菌液浓度为5×108CFU/mL，备用。
b.抗菌肽溶液配制及加样
采用倍比稀释法，按下表6配制不同浓度的含肽培养基，96孔板里每孔加100μL含药培养基，将各供试菌按照国家标准1％加入，96孔板每孔加100μL菌悬液。其中，调零孔不加入菌液，仅加入100μL培养基和100μL 500μM浓度的含肽培养基。
表6抗菌肽MIC测定加样表
Figure BDA0003331958680000172
8.5.4MIC检测
加药完成后将96孔板放置在培养箱(37℃)中培养24h，肉眼观察培养基，澄清的孔所对应的最低浓度即为MIC，并进行吸光度检测，OD600nm无变化的孔对应最低浓度为MIC，实验重复3次。
8.6测试结果
抗菌肽测试样品对枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制作用见下表7。
表7抗菌肽测试样品对各供试菌的抑制作用
Figure BDA0003331958680000181
注：/表示高浓度时，测试样品对供试菌无明显抑制作用。
结果显示，肽(4)(H-VKRWKKWWRKWKKWV-NH2)对枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌四种供试菌均产生抑制作用，且MIC均为37.5μM。参比肽(H-VKRWKKWRWKWKKWV-NH2)对枯草芽孢杆菌的MIC为37.5μM，对白色念珠菌和大肠杆菌的MIC均为62.5μM，对金黄色葡萄球菌无明显抑制作用。
参比肽与本发明的肽(4)的不同之处在于序列中第8、第9个氨基酸残基不同，参比肽序列为Arg8、Trp9，肽(4)序列为Trp8、Arg9，而从MIC测定的结果可知，相比于参比肽，肽(4)具有更广谱且更强的抑菌活性，对常见的几种革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌均具有较强的抑制作用，由此可知，本发明的抗菌肽相对于现有技术取得了预料不到的技术效果。
同理可测得本发明通式(Ⅰ)的其他肽对枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的MIC。
实施例9最低杀菌浓度MBC的测定
9.1试剂与材料
蛋白胨(Oxoid)、酵母提取物(Oxoid)、NaCl(Macklin)、PBS(Gibco)、琼脂(Coolaber)、双蒸水。
9.2仪器
超纯水仪(美国Millipore公司)、小型高速离心机(德国Eppendorf公司)、涡漩仪(美国SCILOGEX公司)、电热恒温培养箱(美国SHEL LAB公司)、十万分之一分析天平(德国Sartorius公司)、多功能微孔板检测仪(瑞士Tecan公司)、生物安全柜(中国Haier公司)、高压灭菌锅(上海博迅公司)、台式冷冻恒温振荡器(苏州培英公司)。
9.3试验菌种
白色念珠菌标准株ATCC 10231、大肠杆菌标准株ATCC 25922、枯草芽孢杆菌标准株CMCC 63501、金黄色葡萄球菌标准株ATCC 25923(以上均由南方医科大学药学院提供)。
9.4待测样品
待测样品信息见下表8。
表8待测样品信息
样品编号 序列 性状 纯度
参比肽 H-VKRWKKWRWKWKKWV-NH<sub>2</sub> 白色粉末 97.913％
肽(4) H-VKRWKKWWRKWKKWV-NH<sub>2</sub> 白色粉末 97.152％
肽(17) H-VKRWKKWWRKWKKWM-NH<sub>2</sub> 白色粉末 98.451％
肽(18) H-VKKWKKWWRKWKKWV-NH<sub>2</sub> 白色粉末 98.248％
肽(19) H-VKGWKKWWRKWGKNW-NH<sub>2</sub> 白色粉末 98.139％
9.5测试方法
9.5.1培养基的制备
LB培养基的制备配方如表9所示：
表9 LB培养基配方表
试剂 LB固体培养基
蛋白胨/g 10
酵母提取物/g 5
NaCl/g 10
琼脂/g 15
双蒸水/mL 1000
双蒸水溶解后，121℃高压灭菌15min。
9.5.2接种及培养
a.LB平板制备
LB固态培养基高压灭菌后，冷却至45℃左右，倒至培养皿中，20mL/皿，待其凝固后备用。
b.接种供试菌
随机选取参比肽、肽(4)、肽(17)、肽(18)、肽(19)各组MIC及其邻近浓度的孔各3个，每个孔吸取50μL悬液接种至培养皿中，用涂布器均匀涂布后倒置于培养箱中(37℃)培养24h。
9.5.3MBC检测
培养24h后，平板中菌落数少于5个则判定为合格，对应的样品浓度为该抗菌肽的MBC。
9.6测试结果
抗菌肽测试样品对枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的杀菌作用见下表10。
表10抗菌肽测试样品对各供试菌的杀灭作用
Figure BDA0003331958680000201
注：/表示高浓度时，测试样品对供试菌无明显杀菌作用。
结果显示，相对于参比肽，肽(4)、肽(17)、肽(18)、肽(19)对枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均具有不同程度的杀灭作用，其中肽(4)具有更广谱的杀菌效果，对枯草芽孢杆菌、白色念珠菌以及金黄色葡萄球菌均有杀灭作用；肽(17)、肽(18)对枯草芽孢杆菌的杀灭作用最强，MBC均为37.5μM；肽(17)对大肠杆菌的杀灭作用最强，MBC为50μM。
实施例10测定对痤疮丙酸杆菌的最低抑菌浓度MIC
10.1试剂与材料
脑心浸萃液态培养基、双蒸水。
10.2仪器
超纯水仪(美国Millipore公司)、小型高速离心机(德国Eppendorf公司)、涡漩仪(美国SCILOGEX公司)、电热恒温培养箱(美国SHEL LAB公司)、十万分之一分析天平(德国Sartorius公司)、多功能微孔板检测仪(瑞士Tecan公司)、生物安全柜(中国Haier公司)、高压灭菌锅(上海博迅公司)、台式冷冻恒温振荡器(苏州培英公司)。
10.3试验菌种
痤疮丙酸杆菌标准株ATCC6919(由南方医科大学药学院提供)。
10.4待测样品
肽(4)、参比肽、肉豆蔻酰六肽-23。
10.5测试方法
10.5.1培养基的制备
称取37g脑心浸萃液态培养基溶于1L双蒸水，121℃高压灭菌15min。
10.5.2实验分组
实验设置调零组(调整测试样品以及培养基溶液本身颜色的误差)、测试样品组、空白对照组，具体浓度梯度(终浓度)如表11所示：
表11测试样品浓度梯度表
Figure BDA0003331958680000211
注：①μM表示1L培养基含有测试样品的物质的量(μmol)。
②每个浓度设立6个实验复孔。
10.5.3供试菌的复苏、培养、传代及给药
a.供试菌复苏传代培养
将供试菌菌种于-80℃冰箱取出，溶解至室温后，加入脑心浸萃液态培养基，置于恒温振荡器培养18h，传至第三代，在生长对数期内测量其600nm的吸光度值，稀释供试菌菌液浓度为5×108CFU/mL，备用。
b.待测样品溶液配制及加样
采用倍比稀释法，按下表12配制不同浓度的含肽培养基，96孔板里每孔加100μL含药培养基，将各供试菌按照国家标准1％加入，96孔板每孔加100μL菌悬液。其中，调零孔不加入菌液，仅加入100μL培养基和100μL 500μM浓度的含肽培养基。
表12待测样品MIC测定加样表
Figure BDA0003331958680000221
10.5.4MIC检测
加药完成后将96孔板放置在培养箱(37℃)中培养24h，肉眼观察培养基，澄清的孔所对应的最低浓度即为MIC，并进行吸光度检测，OD600nm无变化的孔对应最低浓度为MIC，实验重复3次。
10.6测试结果
待测样品对痤疮丙酸杆菌的抑制作用见下表13。
表13待测样品对痤疮丙酸杆菌的抑制作用
Figure BDA0003331958680000222
注：/表示在250μM时，测试样品对供试菌无明显抑制作用。
结果显示，本发明的肽(4)对痤疮丙酸杆菌具有良好的抑制作用，MIC为100μM，优于参比肽对痤疮丙酸杆菌的抑制作用。
肉豆蔻酰六肽-23是Symrise的市售产品
Figure BDA0003331958680000231
380中添加的活性成分，具有抗菌抗痤疮粉刺活性，对引起痤疮的痤疮丙酸杆菌具有良好的抑制作用。通过比较试验结果可知，肉豆蔻酰六肽-23在250μM时，对痤疮丙酸杆菌无明显抑制作用。
由此可知，本发明的肽(4)具有比参比肽、肉豆蔻酰六肽-23更优的抑制痤疮丙酸杆菌的作用。
实施例11测定对痤疮丙酸杆菌的最低杀菌浓度MBC
11.1试剂与材料
脑心浸萃液态培养基、双蒸水、琼脂。
11.2仪器
超纯水仪(美国Millipore公司)、小型高速离心机(德国Eppendorf公司)、涡漩仪(美国SCILOGEX公司)、电热恒温培养箱(美国SHEL LAB公司)、十万分之一分析天平(德国Sartorius公司)、多功能微孔板检测仪(瑞士Tecan公司)、生物安全柜(中国Haier公司)、高压灭菌锅(上海博迅公司)、台式冷冻恒温振荡器(苏州培英公司)。
11.3试验菌种
痤疮丙酸杆菌标准株ATCC6919(由南方医科大学药学院提供)。
11.4待测样品
肽(4)、参比肽、肉豆蔻酰六肽-23。
11.5测试方法
11.5.1培养基的制备
称取37g脑心浸萃液态培养基溶于1L双蒸水，再加入1.5％琼脂，121℃高压灭菌15min。
11.5.2接种及培养
a.LB平板制备
脑心浸萃固态培养基高压灭菌后，冷却至45℃左右，倒至培养皿中，20mL/皿，待其凝固后备用。
b.接种供试菌
选取肽(4)、参比肽、肉豆蔻酰六肽-23各组MIC及其邻近浓度的孔各3个，每个孔吸取50μL悬液接种至培养皿中，用涂布器均匀涂布后倒置于培养箱中(37℃)培养24h。
11.5.3MBC检测
培养24h后，平板中菌落数少于5个则判定为合格，对应的样品浓度为该待测样品的MBC。
11.6测试结果
待测样品对痤疮丙酸杆菌的杀菌作用见下表14。
表14待测样品对痤疮丙酸杆菌的杀灭作用
Figure BDA0003331958680000241
注：/表示高浓度时，测试样品对供试菌无明显杀菌作用。
结果显示，本发明的肽(4)对痤疮丙酸杆菌具有较好的杀灭作用，MBC为250μM，而参比肽、肉豆蔻酰六肽-23在250μM时，对痤疮丙酸杆菌没有杀灭作用。
实施例12溶血活性试验
12.1试剂与材料
磷酸盐缓冲液(PBS)(Gibco)、绵羊红细胞(源叶生物)、十二烷基硫酸钠(SDS)。
12.2仪器
超净工作台(苏州净化)、小型高速离心机(德国Eppendorf公司)、酶标仪(美国MD)。
12.3待测样品
肽(4)、肉豆蔻酰六肽-23。
12.4测试方法
用pH7.4的PBS将待测样品分别配制成质量浓度为8000ppm、4000ppm、2000ppm、1000ppm、500ppm的样品。
分别取300μL不同质量浓度的待测样品溶液、PBS(作为自溶血对照)、0.01％SDS(以PBS配制，作为全溶血对照)，加入离心管，再分别加入300μL 10000个/mL的绵羊红细胞悬液，充分混匀。在38℃水浴中振荡孵育10min，然后以4000rpm的速度离心10min，取上清液，分别读取540nm和575nm波长下的OD值。
以540nm的OD值计算溶血率(HR)：
HR＝(OD待测样品-OD自溶血)/(OD全溶血-OD自溶血)×100％，
在HR的基础上，根据直线回归方程计算导致红细胞半数溶血时的样品浓度，即HC50值。
12.5测试结果
测试样品的溶血率结果见下表15及图1。
表15测试样品的溶血率(％)
Figure BDA0003331958680000251
结果表明，在浓度4000ppm的范围之内，与0.01％SDS阳性对照相比，肽(4)的溶血率在3％以内，说明其溶血活性很低，安全性高。而对于肉豆蔻酰六肽-23，在浓度大于1000ppm时，其溶血率超过50％，表现出较强的溶血活性。
根据肉豆蔻酰六肽-23的溶血率结果，进行线性拟合，计算得到肉豆蔻酰六肽-23的HC50约为979.2ppm(见表16)。由于肽(4)在4000ppm以内溶血率极低，未能据此计算出合适的HC50。
表16测试样品的HC50
Figure BDA0003331958680000252
综上所述，本发明的抗菌肽对红细胞影响小，溶血活性低，具有比肉豆蔻酰六肽-23更高的安全性。
实施例13含肽(4)的脂质体的制备
Figure BDA0003331958680000261
将磷脂酰胆碱称重且溶于氯仿。于真空下蒸发溶剂，直至得到磷脂薄层，将此层于55℃以所需浓度的肽水溶液处理而水化，得到多室脂质体。将多室脂质体通过高压均质处理，得到尺寸更加小而均一的单室脂质体。
实施例14含肽(4)的微米乳液组合物
Figure BDA0003331958680000262
按照处方用量，称取B相的成分加于容器中。接着，将D相添加至B相且于连续搅拌下均质化。随后将A相添加至混合物。最后，添加C相，得到抗菌肽微米乳液组合物。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步详细的说明，但是不表示本发明的具体实施是局限于这些说明。对于本发明所属领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或是替换，都应视为属于本发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种通式(I)所示的抗菌肽，或其立体异构体、或立体异构体的混合物、或其美容上可接受的盐、或其药学上可接受的盐，
R1-Val-Lys-X1-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-X2-Lys-X3-X4-R2 (I)
通式(I)中，
X1和X2彼此独立地选自：-Arg-、-Lys-、-His-或-Gly-；
X3选自：-Trp-、-Val-、-Asn-或-Gln-；
X4选自：-Trp-、-Val-或-Met-；
R1选自：H或R3-CO-，其中R3选自：取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烯基；
R2选自：-NR4R5或-OR4，其中R4和R5彼此独立地选自：H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烯基；
所述烷基是指具有1-24个碳原子(可选具有1-16个碳原子；可选具有1-14个碳原子；可选具有1-12个碳原子；可选具有1、2、3、4、5、或6个的碳原子)的饱和脂肪族直链或支链的烷基；可选选自：甲基、乙基、异丙基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、2-乙基己基、2-甲基丁基、或5-甲基己基；
所述烯基是指具有2-24个碳原子(可选具有2-16个碳原子；可选具有2-14个碳原子；可选具有2-12个碳原子；可选具有2、3、4、5、或6个碳原子)的直链或支链烯基；所述烯基具有一个或多个碳-碳双键，可选具有1、2或3个共轭或非共轭的碳-碳双键；所述烯基是通过一个单键而结合至分子的其余部分；可选选自：乙烯基、油烯基、或亚油烯基；
可选地，所述“取代的烷基”、“取代的烯基”中的取代基选自C1-C4烷基；羟基；C1-C4烷氧基；氨基；C1-C4氨基烷基；C1-C4羰氧基；C1-C4氧基羰基；卤素(如氟、氯、溴、以及碘)；氰基；硝基；叠氮化物；C1-C4烷基磺酰基；硫醇；C1-C4烷硫基；C6-C30芳氧基如苯氧基；-NRb(C＝NRb)NRbRc，其中Rb和Rc是独立地选自：H、C1-C4烷基、C2-C4烯基、C2-C4炔基、C3-C10环烷基、C6-C18芳基、C7-C17芳烷基、具有三至十元的杂环基、或氨基的保护基。
2.根据权利要求1所述的通式(I)所示的抗菌肽、或其立体异构体、或立体异构体的混合物，或其美容上可接受的盐、或其药学上可接受的盐，其特征在于，R1选自：H、乙酰基、叔-丁酰基、己酰基、2-甲基己酰基、辛酰基、癸酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基、油酰基或亚油酰基；
可选地，R1选自H、乙酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基或棕榈酰基；
可选地，R1是H、乙酰基或棕榈酰基。
3.根据权利要求1所述的通式(I)所示的抗菌肽、或其立体异构体、或立体异构体的混合物，或其美容上可接受的盐、或其药学上可接受的盐，其特征在于，R4、R5彼此独立地选自：H、甲基、乙基、己基、十二烷基或十六烷基；
可选地，R4是H并且R5选自：H、甲基、乙基、己基、十二烷基或十六烷基；
可选地，R2是-OH或-NH2。
4.根据权利要求1-3任一项所述的通式(I)所示的抗菌肽，或其立体异构体、或立体异构体的混合物、或其美容上可接受的盐、或其药学上可接受的盐，其特征在于，选自下列肽(1)-(19)：
(1)H-Val-Lys-Arg-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Arg-Lys-Trp-Trp-OH；
(2)H-Val-Lys-Arg-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Arg-Lys-Trp-Trp-NH2；
(3)H-Val-Lys-Arg-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Lys-Lys-Trp-Val-OH；
(4)H-Val-Lys-Arg-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Lys-Lys-Trp-Val-NH2；
(5)Ac-Val-Lys-Arg-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Lys-Lys-Trp-Val-OH；
(6)Ac-Val-Lys-Arg-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Lys-Lys-Trp-Val-NH2；
(7)Palm-Val-Lys-Arg-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Lys-Lys-Trp-Val-OH；
(8)Palm-Val-Lys-Arg-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Lys-Lys-Trp-Val-NH2；
(9)H-Val-Lys-Lys-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-His-Lys-Val-Met-OH；
(10)H-Val-Lys-Lys-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-His-Lys-Val-Met-NH2；
(11)H-Val-Lys-His-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Gly-Lys-Asn-Val-OH；
(12)H-Val-Lys-His-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Gly-Lys-Asn-Val-NH2；
(13)H-Val-Lys-Gly-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Gly-Lys-Gln-Val-OH；
(14)H-Val-Lys-Gly-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Gly-Lys-Gln-Val-NH2；
(15)H-Val-Lys-Gly-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Gly-Lys-Gln-Val-OH；
(16)H-Val-Lys-Gly-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Gly-Lys-Gln-Val-NH2；
(17)H-Val-Lys-Arg-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Lys-Lys-Trp-Met-NH2；
(18)H-Val-Lys-Lys-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Lys-Lys-Trp-Val-NH2；
(19)H-Val-Lys-Gly-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Arg-Lys-Trp-Gly-Lys-Asn-Trp-NH2。
5.根据权利要求1所述的通式(I)所示的抗菌肽，或其立体异构体、或立体异构体的混合物、或其美容上可接受的盐、或其药学上可接受的盐，其特征在于，
所述美容上可接受的盐或药学上可接受的盐包括通式(I)所示的抗菌肽的金属盐，所述金属包括：锂、钠、钾、钙、镁、锰、铜、锌或铝；
可选地，所述美容上可接受的盐或药学上可接受的盐包括通式(I)所示的抗菌肽与无机酸或有机酸形成的盐，所述有机酸包括：乙酸、柠檬酸、乳酸、丙二酸、马来酸、酒石酸、延胡索酸、苯甲酸、天冬氨酸、谷氨酸、琥珀酸、油酸、三氟乙酸、草酸、扑酸或葡萄糖酸；
可选地，所述无机酸包括：盐酸、硫酸、硼酸或碳酸。
6.一种美容或药用组合物，其特征在于，包括有效量的权利要求1-5任一项所述的通式(I)所示的抗菌肽，或其立体异构体、或立体异构体的混合物、或其美容上可接受的盐、或其药学上可接受的盐，以及至少一种赋形剂和任选的美容上或药学上可接受的佐剂；
可选地，所述佐剂选自：胶原合成刺激剂、调节PGC-1α合成的剂、调节PPARγ的活性的剂、增加或减少脂肪细胞的甘油三酸酯含量的剂、刺激或延迟脂肪细胞分化的剂、脂解剂或刺激脂肪分解的剂、溶脂剂、生脂剂、乙酰胆碱受体聚集的抑制剂、抑制肌肉收缩的剂、抗胆碱能试剂、弹性蛋白酶抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、黑色素合成刺激或抑制剂、增白剂或脱色剂、促色素沉着剂、自晒黑剂、抗老化剂、NO-合酶抑制剂、5α-还原酶抑制剂、赖氨酰羟化酶和/或脯氨酰羟化酶的抑制剂、抗氧化剂、自由基清除剂和/或抗大气污染的剂、活性羰基类物质清除剂、抗糖化剂、抗组胺剂、抗病毒剂、抗寄生虫剂、乳化剂、润肤剂、有机溶剂、液体推进剂、皮肤调理剂、保湿剂、保留水分的物质、α羟基酸、β羟基酸、增湿剂、表皮水解酶、维生素、氨基酸、蛋白质、色素或着色剂、染料、生物聚合物、胶凝聚合物、增稠剂、表面活性剂、软化剂、粘合剂、防腐剂、抗皱剂、能够减少或治疗下眼袋的剂、去角质剂、角质剥离剂、角质层分离剂、抗微生物剂、抗真菌剂、抑真菌剂、灭菌剂、抑菌剂、刺激真皮或表皮大分子的合成和/或能够抑制或预防它们的降解的剂、刺激弹性蛋白合成的剂、刺激核心蛋白聚糖合成的剂、刺激层粘连蛋白合成的剂、刺激防御素合成的剂、刺激伴侣蛋白合成的剂、刺激cAMP合成的剂、热休克蛋白、刺激HSP70合成的剂、刺激热休克蛋白合成的剂、刺激透明质酸合成的剂、刺激纤连蛋白合成的剂、刺激去乙酰化酶合成的剂、刺激脂质和角质层组分的合成的剂、神经酰胺、脂肪酸、抑制胶原降解的剂、抑制弹性蛋白降解的剂、抑制丝氨酸蛋白酶的剂、刺激成纤维细胞增殖的剂、刺激角质形成细胞增殖的剂、刺激脂肪细胞增殖的剂、刺激黑色素细胞增殖的剂、刺激角质形成细胞分化的剂、抑制乙酰胆碱酯酶的剂、皮肤松弛剂、刺激糖胺聚糖合成的剂、抗角化过度剂、粉刺溶解剂、抗银屑病剂、抗皮炎剂、抗湿疹剂、DNA修复剂、DNA防护剂、稳定剂、止痒剂、用于治疗和/或护理敏感性皮肤的剂、固化剂、紧致剂、重构剂、抗拉伸纹剂、粘合剂、调节皮脂产生的剂、止汗剂、刺激愈合的剂、协助愈合的剂、刺激再上皮化的剂、协助再上皮化的剂、细胞因子生长因子、镇静剂、抗炎剂、麻醉剂、作用于毛细血管循环和/或微循环的剂、刺激血管生成的剂、抑制血管渗透性的剂、静脉紧张剂、作用于细胞代谢的剂、用于改善真皮-表皮接合的剂、诱导毛发生长的剂、毛发生长抑制或延缓剂、香料、螯合剂、植物提取物、精油、海洋提取物、得自生物发酵过程的剂、无机盐、细胞提取物、防晒剂、以及有效抗A和/或B紫外线的有机或无机光防护剂或其混合物。
7.根据权利要求6所述的美容或药用组合物，其特征在于，所述美容或药用组合物的制剂选自：霜剂、油、奶、香膏、泡沫、洗剂、凝胶、擦剂、浆液、皂、洗发精、润发乳、血清、软膏、摩丝、润发油、粉末、杆剂、笔剂、喷雾剂、气溶胶、胶囊剂、片剂、颗粒剂、口香糖、溶液、混悬液、乳剂、糖浆剂、酏剂、多糖薄膜、胶冻或明胶；
可选地，所述胶囊剂包括：软胶囊剂、硬胶囊剂，可选为明胶胶囊剂；
可选地，所述片剂包括：糖衣片剂。
8.一种美容上或药学上可接受的递送系统或缓释系统，其特征在于，包含有效量的权利要求1-5任一项所述的通式(I)所示的抗菌肽，或其立体异构体、或立体异构体的混合物、或其美容上可接受的盐、或其药学上可接受的盐，或权利要求6或7所述的美容或药用组合物；
所述美容上或药学上可接受的递送系统或缓释系统选自：脂质体、油质体、非离子型表面活性剂脂质体囊泡、醇质体、毫米胶囊、微米胶囊、纳米胶囊、纳米结构的脂质载体、海绵状物、环糊精、类脂囊泡、胶束、毫米球、微米球、纳米球、脂质球、微米乳液、纳米乳液、毫米粒子、微米粒子或纳米粒子；可选为脂质体或微米乳液，可选具有反胶束的内部结构的油包水型微米乳液。
9.权利要求1-5任一项所述的通式(I)所示的抗菌肽，或其立体异构体、或立体异构体的混合物、或其美容上可接受的盐、或其药学上可接受的盐，或权利要求6或7所述的美容或药用组合物，或权利要求8所述的美容上或药学上可接受的递送系统或缓释系统在制备抑菌和/或杀菌的美容组合物或药物组合物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述抑菌是抑制细菌和/或真菌，所述杀菌是杀灭细菌和/或真菌。
11.权利要求1-5任一项所述的通式(I)所示的抗菌肽，或其立体异构体、或立体异构体的混合物、或其美容上可接受的盐、或其药学上可接受的盐，或权利要求6或7所述的美容或药用组合物，或权利要求8所述的美容上或药学上可接受的递送系统或缓释系统在制备抗菌祛痘的美容组合物或药物组合物中的用途。
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