KR102571797B1 - 감마-사이클로덱스트린 중합체를 포함하는 약학적 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

감마-사이클로덱스트린 중합체를 포함하는 약학적 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

감마-사이클로덱스트린 기반 중합체를 포함하는 콜레스테롤 대사 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 일 양상의 감마-사이클로덱스트린 중합체를 포함하는 콜레스테롤 대사 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 감마-사이클로덱스트린 기반 중합체를 포함함으로써 세포막 콜레스테롤 추출을 최소화 하여 세포독성 및 용혈활성을 일으키지 않아, 세포 내 콜레스테롤 대사 및 배출을 용이하게 하고, IL-1β, MCP-1 및 TNF-α 사이토카인 분비를 효과적으로 억제하여 우수한 항염증 효과를 나타낼 수 있다.

Description

감마-사이클로덱스트린 중합체를 포함하는 약학적 조성물 및 이의 용도{Pharmaceutical composition comprising γ-cyclodextrin polymer, and uses thereof}
감마-사이클로덱스트린 중합체를 포함하는 콜레스테롤 대사 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
사이클로덱스트린(cyclodextrin)이란 글루코피라노우즈(glucopyranose) 단위들이 α-(1,4) 결합을 통해 링 구조를 하고 있으며, 6개 단위의 알파-사이클로덱스트린, 7개 단위의 베타-사이클로덱스트린, 그리고 8개 단위의 감마-사이클로덱스트린이 있다. 사이클로덱스트린의 C2와 C3에 결합해 있는 히드록시기와 C6에 결합해 있는 히드록시기는 서로 반대편 방향으로 외곽으로 펼쳐져 있기 때문에 링의 외곽은 친수성을 나타내고, C3와 C5- 의 수소이온과 에테르의 산소는 링의 안쪽방향으로 위치하게 되어 링의 내부는 상대적으로 소수성을 나타낸다. 사이클로덱스트린은 소수성 분자를 링 내부에 포접하여 착물(inclusion complex)을 형성하며 포접한 소수성 분자의 수용성을 향상시킬 수 있는 성질 때문에 화장품, 식품, 섬유, 환경 및 촉매, 약물전달, 의약품 등 다양한 분야에 응용되고 있다.
한편, 알파-, 베타-, 그리고 감마-사이클로덱스트린의 링 구조의 높이는 같지만 글루코피라노우즈 단위의 개수가 달라, 링 내부의 직경과 부피는 서로 다르다. 글루코피라노우즈 단위가 6개인 알파-사이클로덱스트린의 링 내부가 가장 작고, 8개인 감마-사이클로덱스트린의 링 내부가 가장 크다. 이러한 차이로 인해 알파-사이클로덱스트린은 상대적으로 작은 분자를, 감마-사이클로덱스트린은 상대적으로 큰 분자를 링 내부에 포접하며 착물을 형성하는데 용이한 것으로 알려져있다.
원료의약품으로 임상에서 가장 널리 쓰이고 있는 베타-사이클로덱스트린의 유도체 중 하나인 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린에 의한 청력 손실은 와우각(Cochlea)의 외유모세포(outer hair cell)에 대한 독성때문이라고 알려져 있으며, 이는 사이클로덱스트린이 세포막(plasma membrane)의 콜레스테롤을 추출하여 세포막의 불안정 및 붕괴를 야기하며, 내이세포는 이러한 세포막 붕괴에 민감성이 높아 세포독성 및 청력손실로 이어지게 될 수 있다고 알려져 있다. 따라서, 세포막 콜레스테롤 추출을 최소화 하여 세포막을 파괴하지 않으면서 세포내외 콜레스테롤 제거를 용이하게 할 수 있는 약물의 개발이 필요하다.
일 양상은 감마-사이클로덱스트린(γ-cyclodextrin) 중합체 또는 이의 유도체를 포함하는 콜레스테롤 대사 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
일 양상은 감마-사이클로덱스트린 중합체 또는 이의 유도체를 포함하는 콜레스테롤 대사 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
일 양상은 2.5kDa 내지 50kDa의 감마-사이클로덱스트린(γ-cyclodextrin) 중합체 또는 이의 유도체를 포함하는 중합체를 포함하는 콜레스테롤 대사 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에 정의되는 감마-사이클로덱스트린은 하기 [화학식 1]로 표시되는 글루코피라노우즈 단위들이 α-(1,4) 결합을 하고 있는 고리형 올리고사카라이드(Oligosaccharide)로, 8개 단위의 감마-사이클로덱스트린 및 이들의 유도체를 포함하는 것일 수 있다.
상기 용어 "유도체(derivative)"는 상기 화합물의 구조 일부를, 구체적으로는 C2, C3, 혹은 C6의 히드록시기를, 다른 원자나 원자단으로 치환하여 얻어지는 화합물을 말한다.
감마-사이클로덱스트린 기반 중합체의 중량평균분자량(이하 '분자량'으로 지칭)은 예를 들면, 약 2.5 kDa 내지 50 kDa, 약 3 kDa 내지 50 kDa, 약 3.5 kDa 내지 50 kDa, 약 4 kDa 내지 50 kDa, 약 4.5 kDa 내지 50 kDa, 약 5 kDa 내지 50 kDa, 약 5.5 kDa 내지 50 kDa, 약 6 kDa 내지 50kDa, 약 2.5 kDa 내지 45 kDa, 약 3 kDa 내지 45 kDa, 약 3.5 kDa 내지 45 kDa, 약 4 kDa 내지 45 kDa, 약 4.5 kDa 내지 45 kDa, 약 5 kDa 내지 45 kDa, 약 5.5 kDa 내지 45 kDa, 약 6 kDa 내지 45 kDa, 약 2.5 kDa 내지 40 kDa, 약 3 kDa 내지 40 kDa, 약 3.5 kDa 내지 40 kDa, 약 4 kDa 내지 40 kDa, 약 4.5 kDa 내지 40 kDa, 약 5 kDa 내지 40 kDa, 약 5.5 kDa 내지 40 kDa, 약 6 kDa 내지 40 kDa, 약 2.5 kDa 내지 35 kDa, 약 3 kDa 내지 35 kDa, 약 3.5 kDa 내지 35 kDa, 약 4 kDa 내지 35 kDa, 약 4.5 kDa 내지 35 kDa, 약 5 kDa 내지 35 kDa, 약 5.5 kDa 내지 35 kDa, 약 6 kDa 내지 35 kDa, 약 2.5 kDa 내지 30 kDa, 약 3 kDa 내지 30 kDa, 약 3.5 kDa 내지 30 kDa, 약 4 kDa 내지 30 kDa, 약 4.5 kDa 내지 30 kDa, 약 5 kDa 내지 30 kDa, 약 5.5 kDa 내지 30 kDa, 약 6 kDa 내지 30 kDa, 약 2.5 kDa 내지 25 kDa, 약 3 kDa 내지 25 kDa, 약 3.5 kDa 내지 25 kDa, 약 4 kDa 내지 25 kDa, 약 4.5 kDa 내지 25 kDa, 약 5 kDa 내지 25 kDa, 약 5.5 kDa 내지 25 kDa, 약 6 kDa 내지 25 kDa, 약 2.5 kDa 내지 20 kDa, 약 3 kDa 내지 20 kDa, 약 3.5 kDa 내지 20 kDa, 약 4 kDa 내지 20 kDa, 약 4.5 kDa 내지 20 kDa, 약 5 kDa 내지 20 kDa, 약 5.5 kDa 내지 20 kDa, 약 6 kDa 내지 20 kDa, 약 6.5 kDa 내지 50kDa, 약 6.5 kDa 내지 45kDa, 약 6.5 kDa 내지 40kDa, 약 6.5 kDa 내지 30kDa, 약 6.5 kDa 내지 20kDa, 약 7 kDa 내지 50kDa, 약 7 kDa 내지 45kDa, 약 7 kDa 내지 40kDa, 약 7 kDa 내지 30kDa, 약 7 kDa 내지 20kDa, 약 7.5 kDa 내지 50kDa, 약 7.5 kDa 내지 45kDa, 약 7.5 kDa 내지 40kDa, 약 7.5 kDa 내지 30kDa, 약 7.5 kDa 내지 20kDa, 약 8 kDa 내지 50kDa, 약 8 kDa 내지 45kDa, 약 8 kDa 내지 40kDa, 약 8 kDa 내지 30kDa, 약 8 kDa 내지 20kDa, 약 2.5kDa 내지 20kDa, 약 2.6kDa 내지 20kDa, 약 4kDa 내지 20kDa, 또는 약 10kDa 내지 20kDa일 수 있다.
상기 감마-사이클로덱스트린 기반 중합체의 분자량이 상기 범위를 벗어나는 경우에는 세포의 ABCA1 및 콜레스테릴 에스터의 수준 증가의 효과가 감소할 수 있고 또한 항염증 효과가 감소할 수 있으며, 다른 약물과의 병용 사용시 항염증 효과 및 콜레스테롤의 체외 배출 효과가 감소할 수 있다.
상기 감마-사이클로덱스트린 기반 중합체는 감마-사이클로덱스트린 단량체 2개 이상이 공유결합을 통해 형성된 중합체인 것을 의미하며, 단량체의 가교를 위하여 예를 들면 에피클로로히드린(epichlorohydrin)와 같은 양기능성 가교제(bifunctional cross-linker)가 이용될 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 감마-사이클로덱스트린 중합체를 형성하는 사이클로덱스트린 단량체의 개수는 예를 들면, 약 2 내지 35개, 약 2 내지 30개, 약 2 내지 25개, 약 2 내지 20개, 약 2 내지 15개, 약 2내지 10개, 약 3 내지 35개, 약 3 내지 30개, 약 3 내지 25개, 약 3 내지 20개, 약 3 내지 15개, 약 3 내지 10개, 약 4 내지 35개, 약 4 내지 30개, 약 4 내지 25개, 약 4 내지 20개, 약 4 내지 15개, 약 4 내지 10개, 약 5 내지 35개, 약 5 내지 30개, 약 5 내지 25개, 약 5 내지 20개, 약 5 내지 15개, 또는 약 5 내지 10개 범위일 수 있다.
본 명세서에서, 치환기는 치환되지 않는 모그룹(mother group)에서 하나 이상의 수소가 다른 원자나 작용기를 교환됨에 의하여 유도된다. 다르게 기재하지 않으면, 어떠한 작용기가 "치환된"것으로 여겨질 때, 그것은 상기 작용기가 할로젠기(halides), 탄소수 1 내지 40의 알킬기, 탄소수 2 내지 40의 알케닐기, 탄소수 2 내지 40의 알키닐기, 탄소수 3 내지 40의 시클로알킬기, 탄소수 3 내지 40의 시클로알케닐기, 및 탄소수 7 내지 40의 아릴기에서 선택된 하나 이상의 치환기로 치환됨을 의미한다.
작용기가 "선택적으로 치환된다"고 기재되는 경우에, 상기 작용기가 상술한 치환기로 치환될 수 있다는 것을 의미한다.
[화학식 1]
일 양상의 사이클로덱스트린 중합체는 치환기를 가진 중합체일 수 있으며, 일 양상의 사이클로덱스트린 중합체는 상기 [화학식 1]로 표시되는 감마-사이클로덱스트린의 중합체일 수 있다. 상기 화학식 1의 C2, C3, C6의 히드록실기에 결합된 R, R' 및 R''은 예를 들어 수소, C1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 히드록시 C1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 설포부틸에테르 C1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 카복시 C1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬일 수 있으나, 구체적으로는 수소, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 히드록시 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 설포부틸에테르 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 카복시 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬일 수 있고; 더욱 구체적으로는 수소, 메틸, 히드록시프로필, 설포부틸에테르, 또는 카복시 메틸일 수 있고, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화학식 1의 감마-사이클로덱스트린 유도체에 있어서, 치환된 히드록시 그룹은 예를 들어 1 내지 24개일 수 있으며, 1 내지 18개일 수 있으며, 1 내지 12개일 수 있으며, 2 내지 24개일 수 있으며, 2 내지 18개일 수 있으며, 3 내지 24개일 수 있으며, 3 내지 12개일 수 있으며, 4 내지 6개일 수 있으며, 또는 5개 내외일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
글루코스 하나당 치환된 히드록시 그룹을 의미하는 몰 치환도(molar substitution)로 나타낼 경우, 감마-사이클로덱스트린 유도체의 몰 치환도는 예를 들어 0.125 내지 3일 수 있으며, 0.125 내지 2.25일 수 있으며, 0.125 내지 1.5일 수 있으며, 0.25 내지 3일 수 있으며, 0.25내지 2.25일 수 있으며, 0.375 내지 3일 수 있으며, 0.375 내지 1.5일 수 있으며, 0.5 내지 0.75일 수 있으며, 또는 0.6 내외일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서 내 감마-사이클로덱스트린 중합체는 몰 치환도가 0.5 내지 0.75인 하기 [화학식 2]의 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린의 중합체일 수 있다.
[화학식 2]
상기 화학식 2의 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린의 중합체에 있어서, 중합체의 몰 치환도는 예를들어 0.125 내지 3일 수 있으며, 0.125 내지 2.25일 수 있으며, 0.125 내지 1.5일 수 있으며, 0.25 내지 3일 수 있으며, 0.25내지 2.25일 수 있으며, 0.375 내지 3일 수 있으며, 0.375 내지 1.5일 수 있으며, 0.5 내지 0.75일 수 있으며, 0.6 내외일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서 내 감마-사이클로 덱스트린 중합체는 몰 치환도가 0.5 내지 0.75인 상기 [화학식 2]의 구조를 가진 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린의 중합체일 수 있으며, 일 실시예서는 상기 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린을 제조하기 위하여 33 % NaOH 수용액에 500 mg/mL, 350 mg/mL, 250 mg/mL, 125 mg/mL의 농도로 녹이고 각각 0.5, 1, 3, 5, 7, 10의 에피클로로히드린 대 사이클로덱스트린의 몰비율 (에피클로로히드린/사이클로덱스트린)을 이용하여 중합반응을 수행하였다. 구체적으로 250 mg/mL의 농도에서 에피클로로히드린 대 사이클로덱스트린의 몰비율에 따라 5.3 kDa 내지 72.8 kDa 크기의 수용성 중합체가 제조될 수 있음을 확인하여, 사이클로덱스트린의 농도 및 에피클로로히드린의 몰 비율을 조절하여 적절한 크기(분자량)의 수용성 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체를 형성할 수 있음을 확인하였다.
에피클로로히드린에 의한 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린의 가교결합은 예를 들면 알콕사이드기(Alkoxide)가 유도된 히드록시그룹 간, 히드록시그룹과 히드록시 프로필 그룹 간, 히드록시프로필 그룹 간에 일어날 수 있으며 하기 [반응스킴 1]에 예시로 나타내었다.
[반응스킴 1]
또한, 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린은 단량체 하나당 여러개의 알콕사이드기를 가질 수 있으며 이들간의 무작위 가교결합(random cross-linking)이 일어나므로 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린은 선형 또는 환형의 복합적인 구조를 가질 수 있다. 형성할 수 있는 중합체의 구조의 예시는 아래의 표와 같으나 이에 제한되지 않는다.
[표 1]
본 명세서에서 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 콜레스테롤 대사 관련 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 콜레스테롤 대사 관련 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 용어, "개선"이란, 콜레스테롤 대사 관련 질환의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 용어, "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 설치류 (랫트, 기니피그 등), 생쥐 (mouse), 개, 고양이, 말, 소, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양 등의 포유류를 의미한다.
상기 콜레스테롤 대사 관련 질환은 콜레스테롤의 정상적인 대사가 나타나지 않아 세포 외에서 콜레스테롤의 용해가 나타나지 않고, 세포내 콜레스테롤의 대사 및 배출이 나타나지 않아 비정상적인 콜레스테롤 대사가 나타나 몸의 혈관, 뇌, 신장, 간, 폐 등을 포함한 몸의 다양한 조직 내 콜레스테롤의 축적으로 인하여 발생하게 되는 이상질환을 포함할 수 있다. 상기 콜레스테롤 대사 관련 질환은 예를 들면 니만픽병(Niemann-pick disease) C형(NPC), 알츠하이머성 치매, 파킨슨병, 초점성 분절성 사구체 경화증(focal segmental glomerulosclerosis: FSGS), 알포트 신드롬(Alport syndrome), 당뇨병성 신증(diabetic kidney disease), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 간질성 폐질환(interstitial pneumonia), 관절염(osteoarthritis), 지질 이상증 및 콜레스테롤 조절 이상에 의한 심혈관 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함할 수 있다.
상기 "지질 이상증"은 LDL콜레스테롤(LDL-C) 및 중성지방(TG)의 상승, HDL콜레스테롤(HDL-C)의 저하에 의해 발생되는 모든 지질 이상에 의한 질환을 총칭한다. 구체적으로 상기 지질 이상증은 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 고중성지방혈증, 복합 고지혈증 및 이상지질혈증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 "고지혈증(hyperlipidemia)"은 혈중에 지질 및/또는 지질단백질이 비정상적인 수준으로 상승된 질환을 말한다. 고지혈증은 상승된 지질의 종류에 따라 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia), 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia), 및 복합 고지혈증(combined hyperlipidemia)을 포함할 수 있다. 상기 "이상지질혈증"은 혈중에 총 콜레스테롤, LDL(low-density lipoprotein) 콜레스테롤 및 중성지방(triglyceride)이 증가되거나 HDL(high-density lipoprotein) 콜레스테롤이 감소된 상태를 말하는 것이다.
상기 심혈관 질환은 예를 들면 관상동맥질환, 말초혈관질환, 죽상경화성 심혈관질환, 및 뇌혈관질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 구체적으로는 예를 들어 고혈압, 협심증, 심근경색, 뇌경색, 뇌졸중, 부정맥, 이상지질혈증, 고지혈증, 관상동맥경화증 및 죽상동맥경화증으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 상기 감마-사이클로덱스트린 중합체 이외 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 약학적 첨가제를 더 포함하는 것일 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및/또는 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 또한 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 즉 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 희석제는 증량을 위해 사용되며, 만니톨, 락토스, 전분, 미결정셀룰로오스, 루디프레스, 인산이수소칼슘 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 결합제는 포비돈, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 붕해제는 크로스카멜로오스나트륨, 크로스포비돈, 전분글리콜산 나트륨, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 활택제는 스테아르산, 스테아르산 금속염류 (예: 스테아르산 칼슘, 스테아르산 마그네슘 등), 탈크, 콜로이드 실리카, 자당 지방산 에스테르, 수소화 식물성 오일, 왁스, 글리세릴 지방산 에스테르류, 글리세롤 디베헤네이트, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 약학적 조성물 내에 상기 감마-사이클로덱스트린(γ-cyclodextrin) 중합체 또는 이의 유도체는 이의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양으로 포함될 수 있다. 당업자는 조성물 중에 포함되는 화합물의 양적 상한 또는 하한을 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구용 또는 비경구용일 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 경구 또는 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다.
상기 경구용 제형으로 제조되는 경우에는 당해 기술분야에 공지된 임의의 경구용 고형제제, 구체적으로는 과립, 펠렛, 캡슐, 또는 정제의 제조방법에 따라 제조될 수 있다. 경구 투여 제형은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 건조시럽제, 또는 그 조합일 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제, 또는 피부외용제일 수 있다. 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 예를 들면, 정맥내 주입, 피하 주입(또는 투여), 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 뇌실내 투여, 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 상기 약학적 조성물의 전신전달을 위해서는 예를 들어 정맥내, 피하내, 중추신경계전달을 위해서는 수막공간내 투여가 가능하다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 방법, 배설율 또는 질병의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 임상 투여를 위해 공지의 기술을 이용하여 본 발명의 조성물을 적합한 제형으로 제제화할 수 있다.
상기 약학적 조성물의 투여방법은 통상의 환자의 증후와 질병의 심각도에 기초하여 본 기술분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다. 또한, 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제, 시럽제 등의 다양한 형태로 제제화 할 수 있으며 단위-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등으로 제공될 수도 있다.
또한 일 양상의 약학적 조성물은 순차적으로 또는 동시에 다른 약물과 병용 투여하여 투여할 수 있다. 일 양상의 조성물은 예를 들면 liver X receptor(LXR) 효능제, GLP-1 수용체, 에제티미브(ezetimibe) 제제, 피브린산(Fibric acid) 유도체, 니아신(Nicotinic acid) 계 제제, PCSK9 억제제 및 HMG-CoA 환원효소 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상과 병용하여 투여할 수 있다.
상기 LXR 효능제는 예를 들면 22(R)-하이드록시콜레스테롤, 24(S),25-에폭시콜레스테롤, 24(S)-하이드록시콜레스테롤, 27-하이드록시콜레스테롤, 콜레스테노익산, T-314407, T-0901317,　GW3965, SB742881, GSK 2186, WAY-252623(LXR-623), WAY-254011, WYE-672, DMHCA(N,N-Dimethyl-3b-hydroxycholenamide), 4-(3-바이아릴)퀴놀린 설폰, F3MethylAA, APD(acetyl-podocarpic dimer), 포도카르픽 이미드 이합체(podocarpic imide dimer), CRX000541, CRX000864, CRX000929, CRX000823, CRX000987, CRX001093, CRX001094, CRX156651, CRX000909, CRX000908, CRX000369, CRX001045, CRX001046, LN7181, LN7179, LN7172, LN6672, LN7031, LN7033, LN6500, LN6662, 리카르딘 C(Riccardin C), XL-652, DY136, DY142 및 하이포콜라마이드(3a,6a-dihydroxy-5b-cholanoic acid-N-methyl-N-methoxy-24-amide)로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 에제티미브 제제는 에제티미브 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염일 수 있다.
상기 GLP-1 수용체는 예를 들면 엑세나타이드(exenatide), 릭시세나타이드(lixisenatide) 및 리라글루타이드(liraglutide)로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
상기 피브린산(Fibric acid) 유도체는 예를 들면 젬피브로질(gemfibrozil), 베자피브레이트(bezafibrate), 페노피브레이트(fenofibrate) 및 시프로피브레이트(ciprofibrate)로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
상기 니아신(Nicotinic acid) 계 제제는 예를 들면 아시피목스(acipimox)일 수 있다.
상기 HMG-CoA 환원효소 저해제는 예를 들면 로수바스타틴, 심바스타틴,　아토바스타틴, 피타바스타틴, 프라바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
일 양상의 약학적 조성물은 세포막 콜레스테롤 추출을 일으키는 성질이 적어 세포독성 및 용혈활성이 낮으며, 콜레스테롤 용해 능력이 뛰어나며 세포의 콜레스테롤 대사를 향상시킬 수 있다. 또한 콜레스테롤 대사 조절을 통하여 세포의 염증반응을 완화시켜 항염증 활성을 나타낼 수 있어 염증성 사이토카인의 분비를 감소시킬 수 있다. 또한 상기 일 양상의 약학적 조성물에 포함되는 감마-사이클로덱스트린 중합체는 체내 주입시 콜레스테롤 대사와 배출을 향상시키켠서도 고농도에서도 내이독성이 나타나지 않는 특징을 가진다.
다른 양상은 2.5kDa 내지 50kDa의 감마-사이클로덱스트린(γ-cyclodextrin) 중합체 또는 이의 유도체를 포함하는 중합체를 포함하는 콜레스테롤 대사 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물 또는 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 식품이란 함은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미이고, 상기 식품 조성물은 식품, 식품 첨가제, 건강 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 의도이다.
일 양상의 감마-사이클로덱스트린이 첨가될 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 캔디, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영, 유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임 식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류, 아이스크림류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등), 비타민 복합제, 알코올 음료, 주류 및 그 밖의 건강보조식품류를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
본 명세서에서 기능성 식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 바람직하게는 본 발명의 기능성 식품은 콜레스테롤 대사 관련 질환의 예방 또는 개선에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현할 수 있는 식품을 의미한다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 상기 감마-사이클로덱스트린은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 감마-사이클로덱스트린 중합체의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 식품 또는 음료의 제조시에 상기 감마-사이클로덱스트린 중합체은 조성물 총 중량에 대하여 15 중량부 이하, 10 중량부 이하, 1중량 내지 15중량부, 1중량 내지 10중량부, 1중량 내지 5중량부, 또는 0.1중량 내지 15중량부의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품은 담체, 희석제, 부형제 및 첨가제 중 하나 이상을 더 포함하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제 및 액제 제형으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 제형될 수 있다.
상기 담체, 부형제, 희석제 및 첨가제의 구체적인 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 슈크로즈, 솔비톨, 만니톨, 에리스리톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 미세결정성셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸셀룰로즈, 물, 설탕시럽, 메틸셀룰로즈, 메틸 하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 활석, 스테아트산 마그네슘 및 미네랄 오일로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
본 명세서에서 정의되는 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
일 양상의 콜레스테롤 대사 관련 질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 감마-사이클로덱스트린 또는 이의 유도체를 0.01 내 지 95 %, 바람직하게는 1 내지 80 % 중량 백분율로 포함한다. 또한, 콜레스테롤 대사 관련 질환의 예방 또는 개선을 위한 목적으로 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태인 건강기능식품으로 제조 및 가공이 가능하다.
또 다른 양상은 감마-사이클로덱스트린(γ-cyclodextrin) 중합체를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 콜레스테롤 대사 관련 질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
일 양상의 감마-사이클로덱스트린(γ-cyclodextrin) 중합체의 투여량은 투여 방법, 복용자의 연령, 성별, 환자의 중증도, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 병용되는 약물을 고려하여 결정할 수 있다. 1일 유효 성분을 기준으로 하였을 때, 전신전달의 경우, 예를 들면 10 mg/kg 내지 10,000 mg/kg, 100 mg/kg 내지 5000 mg/kg, 또는 500 mg/kg 내지 2500 mg/kg으로 투여할 수 있고, 중추신경계 직접전달의 경우, 예를 들면 10 mg 내지 5,000 mg, 50 mg 내지 4,000 mg, 또는 100 mg 내지 3,000 mg으로 투여할 수 있고, 상기 투여는 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 감마-사이클로덱스트린(γ-cyclodextrin) 중합체는 콜레스테롤 대사 관련 질환의 치료 및 예방을 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
일 양상의 감마-사이클로덱스트린 중합체를 포함하는 콜레스테롤 대사 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 감마-사이클로덱스트린 기반 중합체를 포함함으로써 세포막 콜레스테롤 추출을 최소화 하여 세포독성 및 용혈활성을 일으키지 않아, 세포 내 콜레스테롤 대사 및 배출을 용이하게 하고, IL-1β, MCP-1 및 TNF-α 사이토카인 분비를 효과적으로 억제하여 우수한 항염증 효과를 나타낼 수 있다. 아울러, 상기 감마-사이클로덱스트린 중합체는 다른 양물과 병용하여 투여하는 경우 다른 사이클로덱스트린 중합체보다 우수한 콜레스테롤 배출 및 항염증 효과를 나타낼 수 있다.
또한 상기 감마-사이클로덱스트린 중합체는 사구체 여과를 통하여 효과적으로 체외로 배출되며, 고용량으로 투입된 경우에도 청력손실 및 전신적인 부작용이 나타나지 않아, 동맥경화증, 알츠하이머성 치매, 초점성 분절성 사구체 경화증, 니만픽병 C형과 같은 콜레스테롤 대사 관련 질환을 예방 또는 치료에 활용될 수 있다.
도 1은 사이클로덱스트린의 농도가 250 mg/mL조건에서 형성된 중합체들의 유체역학적 직경을 확인한 결과(도 1A) 및 에피클로로히드린 대 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 몰비율이 0.5, 1, 3, 10일 때의 대표 사이즈 분포를 확인한 결과(도 1B)에 나타낸 도이다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타냈다 (A의 n = 3).
도 2는 에피클로로히드린 대 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린의 몰비율이 0.5, 1, 3, 10일 경우의 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체를 주사전자현미경으로 관찰한 결과를 확인한 도이다(스케일바는 100nm이다).
도 3은 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체를 겔 투과 크로마토그래피를 통해 분석한 결과를 몰비율이 0.5, 1, 3 일경우를 대표적으로 나타낸 도이다.
도 4은 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체를 핵자기공명을 통해 분석한 결과를 나타낸 도이다(평균 몰 치환도 0.63).
도 5은 히드록시프로필-알파-, -베타-, -감마-사이클로덱스트린 단량체 및 중합체의 분자량에 따른 세포막 콜레스테롤 추출 수준을 확인한 도이다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타냈다 (n = 3).
도 6는 히드록시프로필-알파-, -베타-, -감마-사이클로덱스트린 단량체 및 중합체의 분자량에 따른 세포활성을 수준을 확인한 도이다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타냈다 (n = 3).
도 7는 히드록시프로필-알파 -베타 -감마-사이클로덱스트린 단량체 및 중합체의 분자량에 따른 용혈활성 수준을 확인한 도이다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타냈다 (n = 3).
도 8은 히드록시프로필-알파-, -베타-, -감마-사이클로덱스트린 단량체 및 중합체의 분자량에 따른 콜레스테롤 크리스탈 용해 수준을 확인한 도이다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타냈다 (n = 3).
도 9은 히드록시프로필-알파-, -베타-, -감마-사이클로덱스트린 단량체 및 중합체의 세포막 안정성, 세포 안정성, 용혈 안정성 및 콜레스테롤 용해능력을 분석한 히트맵을 나타낸 도이다. ***P < 0.001는 히드록시프로필-알파-사이클로덱스트린 중합체와 비교하여 얻은 값이며, #P < 0.05, ###P < 0.001는 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린 중합체와 비교하여 얻은 값이며, 일원배치 분산분석(One-way ANOVA)과 Tukey 사후분석을 이용하였다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타냈다 (n = 3).
도 10은 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체의 특징을 보여주는 모식도이다.
도 11는 형광 콜레스테롤을 섭취시킨 대식세포에 사이클로덱스트린을 처리해준 뒤 세포에 남아있는 콜레스테롤 양, ABCA1, 콜레스테릴 에스터의 수준을 확인한 도이다. *P < 0.05, ***P < 0.001는 PBS와 비교하여 얻은 값이며, #P < 0.05, ###P < 0.001은 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린 중합체와 비교하여 얻은 값이며, &&P < 0.01, &&&P < 0.001은 히드록시프로필-알파-사이클로덱스트린 중합체와 비교하여 얻은 값이며, 일원배치 분산분석(One-way ANOVA)와 Tukey 사후분석을 이용하였다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타냈다 (n = 3). HPαCDP는 히드록시프로필-알파-사이클로덱스트린 중합체, HPβCDP는 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린 중합체, HPγCDP는 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체이다.
도 12은 형광 콜레스테롤을 섭취시킨 대식세포에 다양한 농도의 사이클로덱스트린 중합체를 처리해준 뒤 세포에 남아있는 콜레스테롤 양과 세포활성을 확인한 도이다.
도 13은 형광콜레스테롤을 섭취시킨 대식세포에 다양한 종류의 감마-사이클로덱스트린 단량체와 중합체를 처리해준 뒤 세포에 남아있는 콜레스테롤 양과 세포활성을 확인한 도이다.
도 14는 형광 콜레스테롤을 섭취시킨 대식세포에 다양한 크기의 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체를 처리해준 뒤 세포에 남아있는 콜레스테롤 양을 확인한 도이다. ***P < 0.001는 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린과 비교하여 얻은 값이며, ###P < 0.001는 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린과 비교하여 얻은 값이며, 일원배치 분산분석(One-way ANOVA)과 Tukey 사후분석을 이용하였다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타냈다 (n = 3).
도 15는 콜레스테롤을 섭취시킨 대식세포에 다양한 크기의 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체를 처리해준 뒤 세포에 발현되는 ABCA1의 양을 확인한 도로서, 대표 히스토그램을 확인한 결과(도 15A) 및 이를 정량화 한 결과(도 15B)를 나타낸 것이다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 는 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린과 비교하여 얻은 값이며, ##P < 0.01는 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린과 비교하여 얻은 값이며, 일원배치 분산분석(One-way ANOVA)과 Tukey 사후분석을 이용하였다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타냈다 (n = 3).
도 16은 콜레스테롤을 섭취시킨 대식세포에 다양한 크기의 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체를 처리해준 뒤 세포 내 콜레스테릴 에스터의 수준을 확인한 도이다. **P < 0.01는 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린과 비교하여 얻은 값이며, ##P < 0.01는 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린과 비교하여 얻은 값이며, 일원배치 분산분석(One-way ANOVA)과 Tukey 사후분석을 이용하였다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타냈다 (n = 3).
도 17은 콜레스테롤을 섭취시킨 대식세포에 사이클로덱스트린과 GW3965혹은 리라글루티드를 각각 병용하여 처리해준 뒤 세포에 발현되는 ABCA1의 양을 확인한 도이다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001는 PBS와 비교하여 얻은 값이며, ###P < 0.001은 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린 중합체 + GW3965 또는 리라글루티드와 비교하여 얻은 값이며, &&&P < 0.001은 히드록시프로필-알파-사이클로덱스트린 중합체 + GW3965 혹은 리라글루티드와 비교하여 얻은 값이며, 일원배치 분산분석(One-way ANOVA)와 Tukey 사후분석을 이용하였다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타냈다 (n = 3).
도 18은 대식세포에 콜레스테롤을 섭취시켜 염증반응을 일으킨 뒤 사이클로덱스트린을 처리해주고 세포에서 분비되는 염증사이토카인(IL-1β, MCP-1 및 TNF-α)의 수준을 정량한 것을 확인한 도이다. **P < 0.01, ***P < 0.001 는 PBS와 비교하여 얻은 값이며, #P < 0.05는 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린 중합체와 비교하여 얻은 값이며, 일원배치 분산분석(One-way ANOVA)과 Tukey 사후분석을 이용하였다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타냈다 (n = 3).
도 19는 대식세포에 콜레스테롤을 섭취시켜 염증반응을 일으킨 뒤 사이클로덱스트린과 아토바스타틴을 병용하여 처리하여 세포에서 분비되는 염증사이토카인(IL-1β, MCP-1 및 TNF-α)의 수준을 정량한 것을 확인한 도이다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001는 PBS와 비교하여 얻은 값이며, ##P < 0.01, ###P < 0.001은 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린 중합체 + 아토바스타틴과 비교하여 얻은 값이며, &&P < 0.01, &&&P < 0.001은 히드록시프로필-알파-사이클로덱스트린 중합체 + 아토바스타틴과 비교하여 얻은 값이며, 일원배치 분산분석(One-way ANOVA)와 Tukey 사후분석을 이용하였다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타냈다 (n = 3). ATV는 아토바스타틴이다.
도 20은 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린에 의한 세포내 콜레스테롤 대사 및 배출 촉진과 항염증반응을 나타낸 모식도이다.
도 21는 C57BL/6 마우스에 사이클로덱스트린-콜레스테롤 복합체를 사이클로덱스트린 기준 500 mg/kg으로 정맥주사한 후 혈중 콜레스테롤의 체내 반감기를 확인한 결과(도 21A)와 소변 배출양의 결과(도 21B)를 나타낸 도이다. ***P < 0.001이며, 일원배치 분산분석(One-way ANOVA)과 Tukey 사후분석을 이용하였다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타냈다 (n = 3).
도 22는 C57BL/6 마우스에 사이클로덱스트린을 4 g/kg을 피하주사해준 뒤 소변으로 배출되는 콜레스테롤의 양을 확인한 도이다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 는 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린과 비교하여 얻은 값이며, 일원배치 분산분석(One-way ANOVA)과 Tukey 사후분석을 이용하였다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타냈다 (n = 3).
도 23은 C57BL/6 마우스에 사이클로덱스트린을 10 g/kg을 피하주사한 뒤 일주일간 몸무게 변화(도 23A)와 행동점수(도 23B)를 나타낸 도이다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001는 PBS와 비교하여 얻은 값이며, 이원배치 반복측정 분산분석(Two-way Repeated Measures ANOVA)과 Tukey 사후분석을 이용하였다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타냈다 (n = 5).
도 24는 C57BL/6 마우스에 사이클로덱스트린을 10 g/kg을 피하주사해준 뒤 일주일간 뒤 주요장기의 조직분석을 확인한 도이다.
도 25는 C57BL/6 마우스에 사이클로덱스트린을 10 g/kg 피하주사 및 5 g/kg brain weight 뇌실주사 해준 뒤 일주일 뒤 내이독성을 확인한 도로서, 공초점 현미경으로 관찰한 외유모 세포를 피하주사 일주일 후 관찰한 결과(도 25A), 피하주사 일주일 후 생존한 외유모세포를 정량화한 결과(도 25B) 및 뇌실주사 일주일 후 생존한 외유모세포를 정량화한 결과(도 25C)를 확인한 도이다. *P < 0.05, ***P < 0.001이며, 일원배치 분산분석(One-way ANOVA)과 Tukey 사후분석을 이용하였다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타냈다 (n = 3).
이하 일 양상을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 일 양상을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 일 양상의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니며, 일 양상의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 일 양상을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
실시예 1. 사이클로덱스트린 중합체 준비
히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린을 500 mL의 NaOH 수용액 (33 % w/w)에 각각 500 mg/mL, 350 mg/mL, 250 mg/mL, 125 mg/mL의 농도로 녹이고 상온에서 24시간동안 충분히 교반하여 알콕사이드(alkoxide)기를 유도하였다. 알콕사이드 간 가교결합을 형성하기 위하여 에피클로로히드린을 사이클로덱스트린 1몰당 0.5, 1, 3, 5, 7, 10몰의 비율로 첨가하고 상온에서 48시간동안 교반하였다. 중합반응을 중단하기 위하여 500 mL의 아세톤을 첨가하고 30분간 상온에 두었다. 데칸테이션(decantation)을 통해 상층의 아세톤을 제거한 뒤 50 ℃ 오븐에서 24시간 동안 두었다. pH조절을 위하여 10 N HCl을 이용하여 용액의 pH를 12로 만들어 주었다. 최종적으로 합성된 사이클로덱스트린 중합체를 얻기 위하여 투석 멤브레인을 이용하여 72시간 동안 증류수를 이용하여 투석하였으며 증류수는 하루에 2번 교체해 주었다. 회수된 혼합물은 0.45 μm 폴리비닐리덴플루오라이 (polyvinylidene fluoride; PVDF) 필터에 통과시켜준 뒤 동결건조를 통해 분말로서 얻었으며 상온에서 보관하였다. 시간에 따른 사이클로덱스트린의 농도 및 에피클로로히드린 대 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 몰비율에 따른 겔화 여부를 확인한 결과를 표 2에 나타내었다.
[표 2]
상기 표 2에서 확인한 바와 같이, 사이클로덱스트린의 농도가 350 mg/mL 이상일 경우 에피크롤로히드린/사이클로덱스트린 몰비율이 증가함에 따라 48시간 이내에 사이클로덱스트린 용액의 겔화가 관찰되었으며 이는 비수용성 중합체가 형성됨을 확인하였다. 또한 사이클로덱스트린의 농도가 250 mg/mL 이하일 경우 최대 10의 몰비율에서도 용액의 겔화가 관찰되지 않아, 수용성 중합체 형성을 유도하기 용이한 것을 확인하였다.
실시예 2. 사이클로덱스트린 중합체의 분자량, 크기 및 형태 관찰
사이클로덱스트린 중합체의 분자량 및 크기 분석을 위하여 Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instruments, Malvern, UK)을 이용하였다. 분자량 측정을 위하여 정적광산란(Static light scattering)을 이용하였으며 단일 각도(Single angle)에서 다양한 사이클로덱스트린 농도의 산란강도 (Kc/Rθ)를 측정하였으며 톨루엔(Toluene)을 기준 시료로 이용하였다. 분자량 계산은 Debye-plot을 이용하였으며, 분자량은 농도가 0 일때, Kc/Rθ의 값으로 구하였다. 또한 사이클로덱스트린 용액 (5 mg/mL)을 동적광산란(dynamic light scattering)을 이용하여 유체역학적 직경(hydrodynamic diameter)를 측정하였다. 나아가, 주사전자현미경을 이용하여 사이클로덱스트린 중합체의 형태를 관찰하였다. 상기 실시예 1에서 형성된 중합체들의 분자량(kDa)을 나타낸 결과를 표 3에 나타내었고, 사이클로덱스트린의 농도가 250 mg/mL 조건에서 형성된 중합체들의 유체역학적 직경을 도 1A에, 몰비율이 0.5, 1, 3, 10일 때의 대표 사이즈 분포를 도 1B에 나타내었다. 또한 몰비율에 따른 제조된 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체를 주사전자현미경을 통해 확인한 결과를 도 2에 나타내었다.
[표 3]
상기 표 3에서 확인한 바와 같이, 사이클로덱스트린의 반응 농도가 250 mg/mL일 경우, 에피클로로히드린 대 사이클로덱스트린의 몰비율에 따라 다양한 크기의 중합체를 유도할 수 있었다. 다만, 사이클로덱스트린의 농도가 350 mg/mL 이상일 경우 사구체 여과가 용이하지 않은 60 kDa 이상의 분자량을 갖는 중합체들이 형성되었으며 고르지 못한 입자분포를 확인하였다. 또한, 사이클로덱스트린의 농도가 125 mg/mL이하일 경우 몰비율 증가에 따라 다양한 크기의 중합체를 얻지 못하며 효과적인 중합 반응이 일어나지 않음을 확인하였다.
도 1A에서 확인한 바와 같이, 반응 농도가 250 mg/mL의 경우 0.5, 1, 3, 5, 7, 10의 몰비율을 이용하여 중합반응시 각각 4 ± 0.3 nm, 5.7 ± 0.25 nm, 6.0 ± 0.6 nm, 8.5 ± 1.7 nm, 8.7 ± 0.85 nm, 10.7 ± 0.7 nm의 유체역학적 직경을 갖는 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체들을 얻을 수 있음을 확인하였다. 또한 도 1B에서 확인한 바와 같이, 상기 다분산 지수(Polydispersity index; PDI) 을 확인한 결과, 각각의 몰 비율 통해 얻은 수득물들은 고른 분포를 가진 중합체를 형성했음을 확인하였다. 또한 도 2에서 확인한 바와 같이, 주사전자현미경을 통하여 제조된 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체를 확인한 결과, 에피클로로히드린의 몰 비율에 따라 서로 다른 크기의 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체가 효과적으로 형성될 수 있음을 확인할 수 있었다. 추가적으로, 도 3에서 확인한 바와 같이, 겔 투과 크로마토그래피를 통하여 서로 다른 크기의 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체가 형성됨을 확인할 수 있었다. 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체를 Bruker AVANCE II 500MHz 핵자기공명으로 분석한 결과의 예시를 도 4에 나타냈다. 따라서, 상기 중합조건을 이용하여 서로 다른 크기의 수용성 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체를 효과적으로 제조할 수 있음을 확인하였다.
실시예 3. 세포막 콜레스테롤 추출의 확인
Raw 264.7 세포를 10% 소 태아 혈청(fetal bovine serum : FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신이 있는 둘베코수정이글배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium : DMEM) 내에 유지하였다. 사이클로덱스트린의 세포 내 이입(endocytosis)를 억제하고 세포막 콜레스테롤 추출만을 유도하기 위하여 1 Х 105세포를 포름알데히드를 이용하여 상온에서 20분간 고정시킨 후 사이클로덱스트린을 PBS에 20 mg/mL의 농도로 녹여서 37 ℃에서 1시간동안 처리해 주었다. 처리해준 PBS를 회수하여 14,000g에서 30분간 원심분리하여 세포파편 및 마이크로베지클(microvesicles)을 제거해준 뒤 상층액의 콜레스테롤 농도를 Cholesterol Quantification Kit (Sigma Aldrich)를 이용하여 정량하였다. 히드록시프로필-알파-사이클로덱스트린 및 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린 중합체는 상기 250 mg/mL의 농도조건에서 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린과 동일한 방법으로 제조한 중합체를 사용하였다. 감마 사이클로덱스트린 및 이들의 중합체의 세포막 콜레스테롤 추출 수준을 알파- 및 베타-사이클로덱스트린 및 이들의 중합체와 비교한 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 확인한 바와 같이, 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 단량체 및 중합체는 모든 분자량에서 히드록시프로필-알파-사이클로덱스트린 및 히드록시프로필-베타 사이클로덱스트린 단량체 및 중합체보다 유의미하게 낮은 콜레스테롤 추출 수준을 나타내는 것을 확인하였다. 단량체의 경우 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린 (45 %), 히드록시프로필-알파-사이클로덱스트린 (42.8 %), 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 (5 %) 순으로 세포막 콜레스테롤 추출을 많이 유도하는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통하여 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 단량체가 물리화학적으로 세포막 콜레스테롤 추출을 유도하지 않는 것을 확인하였다.
중합체의 경우, 히드록시프로필-알파-사이클로덱스트린, 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린, 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린은 각각 최대 77.8 %, 93.9 %, 6.7 %의 세포막 콜레스테롤 추출을 유도하였으며, 약 80 kDa 의 중합체는 단량체에 비해 세포막 콜레스테롤 제거의 수준이 낮음을 확인하였다. 따라서, 사이클로덱스트린의 중합체 크기가 증가함에 따라 세포막 콜레스테롤 제거 효율이 증가하다가 감소하는 경향을 확인할 수 있었다. 종합적으로, 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체는 단량체의 물리화학적 성질 및 중합체의 구조로 인하여 다른 사이클로덱스트린 중합체보다 세포막 콜레스테롤 제거 효율을 현저히 낮출 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. 세포독성 확인
Raw 264.7 세포를 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신이 있는 DMEM 배지 중에서 유지하였다. 96-well 플레이트에 5 Х 104 세포씩 분주하였으며 24시간 후 사이클로덱스트린을 20 mg/mL 의 농도로 처리해 주었다. 37 ℃, 5% CO2에서 48시간 배양 후 CCK-8시약을 10 μL씩 추가해 주었으며 3시간 뒤 450 nm에서의 흡광도를 측정하여, 히드록시프로필-알파-, -베타-, -감마- 사이클로덱스트린 단량체 및 중합체의 분자량에 따른 세포활성를 확인한 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에서 확인한 바와 같이, 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 단량체 및 중합체는 분자량과 상관없이 알파 및 베타-사이클로덱스트린 보다 유의미하게 낮은 세포독성을 나타내는 것을 확인하였다. 단량체의 경우 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린 (9.6 %), 히드록시프로필-알파-사이클로덱스트린 (14.2 %), 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 (93.9 %) 순으로 낮은 세포활성을 보였다. 사이클로덱스트린에 의한 세포독성은 세포막 콜레스테롤의 과도한 추출에 의한 것으로 알려져 있는데, 이와 상응하여 콜레스테롤 추출의 정도와 세포독성이 양의 상관관계가 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 히드록시프로필-알파-사이클로덱스트린과 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린 중합체는 약 80 kDa에서 각각의 단량체보다 세포활성이 높아졌지만, 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린과 비교해서는 월등히 높은 세포독성을 보이는 것을 확인하였다. 따라서, 중합체 구조 및 크기가 세포막 콜레스테롤 추출에 영향을 주지만, 단량체의 종류가 더 중요할 수 있음을 확인하였고, 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 기반 중합체를 이용하여 세포독성을 최소화 할 수 있음을 확인하였다.
실시예 5. 용혈 활성 확인
용혈 활성 분석을 위해 야생형 C57/BL6생쥐의 전혈 30 μL를 50 mg/mL의 사이클로덱스트린을 포함하는 PBS 용액 300 μL와 혼합하여 37 ℃에서 1시간 동안 반응해 주었다. 혼합물을 3,000 g에서 5분간 원심분리한 후, 상등액을 사용하여 540 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 양성대조군(positive control)로는 적혈구 용해에 이용하는 암모늄-클로라이드-포타슘 용해 완충액(ACK lysis buffer)를 이용하여, 히드록시프로필-알파-, -베타-, -감마-사이클로덱스트린 단량체 및 중합체의 분자량에 따른 용혈활성을 확인하고 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에서 확인한 바와 같이, 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 단량체 및 중합체는 분자량과 상관없이 알파 및 베타-사이클로덱스트린 보다 유의미하게 낮은 용혈활성을 보이는 것을 확인하였다. 단량체의 경우 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린 (97.1 %), 히드록시프로필-알파-사이클로덱스트린 (93.5 %), 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 (1.6 %) 순으로 높은 용혈활성을 보이는 것을 확인하였다. 히드록시프로필-알파-사이클로덱스트린, 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린은 분자량 크기가 증가할 수록 용혈활성이 낮아지는 것을 확인할 수 있었다. 또한 사이클로덱스트린에 의한 용혈의 경우도 마찬가지로 세포막 콜레스테롤의 과도한 추출에 의한 것이며 이와 상응하여 콜레스테롤 추출의 정도와 용혈활성이 양의 상관관계를 보이는 것을 확인하였다. 히드록시프로필-알파-사이클로덱스트린과 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린 중합체는 약 80 kDa에서 각각의 단량체보다 용혈활성이 낮아졌지만, 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린과 비교해서는 월등히 높은 용혈활성을 보이는 것을 확인하였다. 따라서, 중합체 구조 및 크기가 세포막 콜레스테롤 추출에 영향을 주지만 단량체의 종류가 더 중요할 수 있음을 확인하였고, 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 기반 중합체를 이용하여 용혈활성을 최소화 할 수 있음을 확인하였다.
실시예 6. 콜레스테롤 크리스탈 용해 확인
먼저, 콜레스테롤 크리스탈 형성을 위하여 콜레스테롤 2 mg/ml 및 NBD-콜레스테롤 0.2 mg/mL를 포함하는 에탄올을 제조 후 증류수(30 % v/v)를 용액에 첨가하여 결정화를 유도하였다. 용액을 진공상태에서 완전히 건조시키고, PBS에 재현탁시킨 후, 30초간 초음파처리를 하였다. 5 mM 콜레스테롤 20 μL를 20 mg/mL의 사이클로덱스트린 300 μL와 혼합하여 37 ℃에서 2시간 동안 반응해 주었다. 혼합물을 14,000g에서 30분간 원심분리하여 용해되지 않은 콜레스테롤 크리스탈을 제거해 준 뒤에 상층액을 회수하여 용해된 NBD-콜레스테롤의 형광을 480 nm/520 nm 의 조건에서 측정하고, 히드록시프로필-알파-, -베타-, -감마- 사이클로덱스트린 단량체 및 중합체의 분자량에 따른 콜레스테롤 크리스탈 용해 수준을 확인한 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에서 확인한 바와 같이, 단량체의 경우 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린 (32.3 %), 히드록시프로필-알파-사이클로덱스트린 (21.9 %), 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 (12.1 %) 순으로 높은 콜레스테롤 크리스탈 용해가 나타나는 것을 확인하였다. 중합체의 경우, 분자량 크기가 증가함에 따라 콜레스테롤 용해 능력이 증가하며 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체가 가장 큰 효율의 증가를 나타내는 것을 확인하였다. 사이클로덱스트린 단량체 및 3-30 kDa의 중합체의 세포막 콜레스테롤 추출, 세포독성, 용혈활성 데이타를 기반으로 히트맵을 도 9에 나타내었고, 이를 통해 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체의 경우 세포막 콜레스테롤 추출에 의한 세포독성과 용혈활성이 낮으며 콜레스테롤 용해를 효과적으로 유도할 수 있다는 것을 확인하였다.
종합적으로, 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체는 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린의 물리화학적인 성질 및 중합체 구조로 인하여 세포막 콜레스테롤과의 반응성은 낮으면서 세포 외 콜레스테롤 크리스탈과는 효과적으로 반응하여 용해시킬 수 있다는 것을 도 10의 모식도에서 확인한 것과 같이 확인하였다.
실시예 7. 사이클로덱스트린 중합체의 조건 별 세포내 콜레스테롤 배출 및 콜레스테롤 처리 대사의 확인
7.1 사이클로덱스트린 중합체의 세포 내 콜레스테롤 배출 및 콜레스테롤 처리 대사의 확인
Raw 264.7 세포를 96-well 플레이트에 5 Х 104 세포씩 분주하였으며 24시간 후 콜레스테롤 크리스탈을 50 μM의 농도로 처리해 주었다. 3시간 후 세포에 섭취되지 않은 콜레스테롤 크리스탈을 배지 교체를 통하여 제거해 준 뒤 사이클로덱스트린 단량체 및 3-30 kDa의 중합체를 5 mg/mL 의 농도로 처리해 주었다. 37 ℃, 5% CO2에서 48 시간 배양해준 뒤 세포 내 콜레스테롤 형광을 형광 현미경을 이용하여 분석하였다. 또한, 사이클로덱스트린이 세포 내 콜레스테롤 대사에 미치는 영향을 알아보기 위하여 콜레스테롤 배출에 관여하는 ATP-binding cassette transporter (ABCA1)의 양을 세포유속분석기를 이용하여 정량하였고, 콜레스테롤의 저장 형태인 콜레스테릴 에스터의 양을 정량하여 도 11에 나타내었다.
도 11에서 확인한 바와 같이, 사이클로덱스트린과 사이클로덱스트린 중합체 가운데 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체가 가장 현저하게 세포 내 콜레스테롤 배출을 증가시키며, ABCA1 및 콜레스테릴 에스터의 수준 증가를 유도하는 것을 확인하였다.
7.2 사이클로덱스트린 중합체의 농도에 의한 세포 내 콜레스테롤 배출 및 세포 활성의 확인
사이클로덱스트린 중합체의 처리 농도에 의한 세포 내 콜레스테롤 배출 및 세포 활성을 확인하는 실험을 수행하였다. 농도 구배를 통하여 0.1, 1, 5, 10, 15 및 20 mg/mL의 다양한 농도의 사이클로덱스트린 중합체를 처리하였을 경우의 세포내 콜레스테롤과 세포 활성을 확인한 결과를 도 12에 나타내었다. 농도 조건을 달리한 것만 제외하고, 이외의 실험조건은 실시예 7.1과 동일하게 하였다.
도 12에서 확인한 바와 같이, 히드록시프로필-알파 및 -베타-사이클로덱스트린 중합체의 경우 농도의존적인 콜레스테롤 배출을 보여주었으나 농도가 증가함에 따라 세포활성의 감소를 일으키며 세포독성을 수반하는 것을 확인하였으다. 반면, 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린의 경우 고농도에서도 세포독성 없이 농도의존적인 콜레스테롤 배출효과를 얻을 수 있다는 것을 확인하였다. 이는 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체는 다른 중합체와 비교하여 같은 농도에서 콜레스테롤 배출이 현저하게 높을 뿐만 아니라 고농도에서도 세포독성을 일으키지 않아 고용량 처리가 가능하다는 것을 확인하였다.
7.3 사이클로덱스트린 중합체의 치환기에 의한 세포 내 콜레스테롤 배출 및 세포 활성의 확인
사이클로덱스트린 중합체의 치환기에 따라 세포 내 콜레스테롤 배출 및 세포 활성이 달라질 수 있는지를 확인하는 실험을 수행하였다. 구체적으로 20 mg/mL의 농도의 3-30 kDa의 알파-사이클로덱스트린 중합체, 히드록시프로필-알파-사이클로덱스트린 중합체, 설포부틸에테르-알파-사이클로덱스트린 중합체, 베타-사이클로덱스트린 중합체, 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린 중합체, 설포부틸에테르-베타-사이클로덱스트린 중합체, 감마-사이클로덱스트린 중합체, 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체 및 설포부틸에테르-감마-사이클로덱스트린 중합체를 이용하여 세포독성 및 콜레스테롤 배출능력을 확인하고 그 결과를 도 13에 나타내었다. 사이클로덱스트린 중합체의 농도와 치환기를 달리한 것을 제외하고, 이외의 실험조건은 실시예 7.1과 동일하게 하였다.
도 13에서 확인한 바와 같이, 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린, 설포부틸에테르-감마-사이클로덱스트린, 감마-사이클로덱스트린 중합체 순서대로 독성이 낮으며 콜레스테롤 배출에 효과적인 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 감마-사이클로덱스트린 기반 중합체가 세포독성을 낮추고 콜레스테롤 대사를 향상시키는데 유용한 것을 확인하였다. 특히 상기 중합체의 치환기가 히드록시프로필인 경우에 가장 세포독성이 낮으면서도 동시에 콜레스테롤 배출능이 우수한 것을 확인하였다.
7.4 사이클로덱스트린 중합체의 분자량에 따른 세포 내 콜레스테롤 배출효율 및 콜레스테롤 처리 대사의 확인
사이클로덱스트린 중합체의 분자량에 따라 세포 내 콜레스테롤 배출이 달라질 수 있는지를 확인하는 실험을 수행하였다. 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린, 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린과 5.6 kDa, 8.3 kDa, 19.4 kDa, 72.8 kDa의 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린을 5 mg/mL의 농도로 처리하였다. 상기 조건을 제외한 모든 실험조건은 실시예 7.1과 동일하게 수행하였고, 다양한 크기(중합체의 분자량)의 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체를 처리해준 뒤 세포에 남아있는 콜레스테롤 양을 확인한 결과를 도 14A 및 이를 정량화한 결과를 도 14B에 나타내었다.
도 14A 및 14B에서 확인한 바와 같이, 대조군인 PBS는 세포 내 콜레스테롤의 수준이 100 %로 나타나 콜레스테롤 배출이 전혀 나타나지 않는 것을 확인하였다. 이와 비교하여, 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린과 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린을 처리해준 군에서 각각 80.5 %, 75 %의 세포내 콜레스테롤 양을 확인하였다. 또한 5.6 kDa, 8.3 kDa, 19.4 kDa, 72.8 kDa의 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체를 처리해준 군에서는 각각 12.8 %, 10 %, 11 %, 16 %의 세포내 콜레스테롤 양을 확인할 수 있었다. 따라서, 단량체와 비교한 경우에도 평균 약 5배정도 높은 콜레스테롤 배출 효율이 나타나는 것임을 확인하였다.
또한 ABCA1의 발현을 통해 확인한 콜레스테롤 처리 대사를 확인한 실험을 수행하였다. 본 실험 역시 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린, 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린과 5.6 kDa, 8.3 kDa, 19.4 kDa 및 72.8 kDa의 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린을 5 mg/mL의 농도로 처리하였다. 상기 조건을 제외한 모든 실험조건은 실시예 7.1과 동일하게 수행하였고, 세포에 발현되는 ABCA1의 양을 대표 히스토그램으로 확인한 결과를 도 15A에, 이를 정량화 한 결과를 도 15B에 나타내었다.
도 15A 및 B에서 확인한 바와 같이, 다양한 분자량의 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체는 대조군인 PBS와 단량체보다 세포의 ABCA1 발현을 탁월하게 증가시키는 것을 확인하였다. 5.6 kDa, 8.3 kDa, 19.4 kDa, 72.8 kDa의 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체를 처리해준 군에서는 대조군인 PBS 와 비교하여 세포 내 ABCA1의 발현 양이 각각 3.3, 3.9, 3.2 및 2.4배가 증가한 것을 확인하였다.
또한 콜레스테롤을 섭취시킨 대식세포에 다양한 크기의 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체를 처리해준 뒤 세포 내 콜레스테릴 에스터의 수준을 확인하였다. 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린, 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린과 5.6 kDa, 8.3 kDa, 19.4 kDa 및 72.8 kDa의 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린을 5 mg/mL의 농도로 처리하였다. 상기 조건을 제외한 모든 실험조건은 실시예 7.1과 동일하게 수행하였고, 이를 확인한 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16에서 확인한 바와 같이, 다양한 크기의 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체는 PBS 및 단량체보다 세포의 콜레스테릴 에스터 양을 탁월하게 증가시키는 것을 확인하였다. 5.6 kDa, 8.3 kDa, 19.4 kDa 및 72.8 kDa의 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체를 처리해준 그룹에서는 PBS 와 비교하여 각각 2.7, 3.8, 3.6 및 2.8배 증가한 콜레스테릴 에스터양이 나타나는 것을 확인하였다.
종합적으로, 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체가 히드록시프로필-베타, -알파-사이클로덱스트린 중합체에 비하여 투여시 현저하게 세포내 콜레스테롤 대사를 향상시키는 것을 확인하였다. 또한 다양한 분자량에서 그 효과가 확인되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 8. 사이클로덱스트린 중합체와 다른 약물과의 병용 투여 효과 확인
사이클로덱스트린 중합체 단일 투여 이외 다른 약물을 병용과 투여한 경우의 콜레스테롤 대사를 보다 향상시킬 수 있어 상승작용이 나타날 수 있을지를 확인하는 실험을 수행하였다.
구체적으로 각각 2 mg/mL의 히드록시프로필-알파-사이클로덱스트린, 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린, 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 단량체와 히드록시프로필-알파-사이클로덱스트린, 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린, 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체와 콜레스테롤 조절에 중요한 역할을 하는 liver X receptor (LXR)의 작용제인 GW3965 및 GLP-1 작용제인 리라글루티드(Liraglutide)를 각각 1 μM 및 100 nM으로 상기 사이클로덱스트린 단량체와 중합체와 병용하여 콜레스테롤을 섭취시킨 대식세포에 투여하였다. 이후, 대조군인 PBS 와 비교하여 세포 내 ABCA1의 발현 양을 확인하였고, GW3965 와의 병용투여 및 리라글루티드와의 병용투여의 결과를 각각 도 17A 와 도 17B에 나타내었다.
도 17A 및 17B에서 확인하 바와 같이, GW3965 및 리라글루티드는 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체와 병용 처리한 경우에 유의할 정도의 ABCA1의 양을 증가를 유도하여 상승 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
따라서, 이와 같은 결과를 통하여 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체는 병용 사용조건에서도 다른 단량체 또는 중합체보다 현저하게 콜레스테롤 대사를 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 9. 사이클로덱스트린 중합체의 항염증 효과 확인
9.1 사이클로덱스트린 중합체 투여를 통한 항염증 효과의 확인
세포에 섭취된 콜레스테롤 크리스탈은 NLRP3 염증소체(inflammasome)의 활성을 유도하며 다양한 염증반응을 일으킨다고 알려져 있다. 따라서, 상기 실시예의 알파, 베타 또는 감마 사이클로덱스트린 단량체를 처리하는 경우 항염증 활성이 나타날 수 있는지를 확인하는 실험을 수행하였다.
Raw 264.7 세포를 96-well 플레이트에 5 Х 104 세포씩 분주하였으며 24시간 후 콜레스테롤 크리스탈을 50 μM의 농도로 처리해 주었다. 3시간 후 세포에 섭취되지 않은 콜레스테롤 크리스탈을 배지 교체를 통하여 제거해 준 뒤 사이클로덱스트린 단량체 및 3-30 kDa의 중합체를 5 mg/mL 의 농도로 처리해 주었다. 37℃, 5% CO2에서 48 시간 배양해준 뒤 배양액의 염증성사이토카인인 interleukin-1β (IL-1β), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), tumor necrosis factor-α (TNF-α)를 효소 결합 면역흡착 어세이 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)를 이용하여 정량하였고, 세포에서 분비되는 염증사이토카인의 양을 정량한 결과를 도 18에 나타내었다.
상기 도 18에서 확인한 바와 같이, 5 mg/mL의 농도에서 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체는 PBS만 처리해준 대조군에 비하여 유의미하게 IL-1β, MCP-1, TNF-α의 분비를 억제하였다. 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린 중합체의 경우 MCP-1의 분비를 대조군에 비하여 유의미하게 억제하였으나, 다른 염증성사이토카인은 유의미하게 억제하지 못함을 확인하였다. 사이클로덱스트린 단량체들은 유의미한 사이토카인 억제를 보이지 않음을 확인하였다.
9.2 사이클로덱스트린 중합체와 다른 약물의 병용투여를 통한 항염증 효과의 확인
사이클로덱스트린 중합체와 항염증 효과를 갖는 아토바스타틴 (Atorvastatin: ATV)을 병용 투여하는 경우 항염증 효과에 대한 상승작용이 나타날 수 있을지를 확인하는 실험을 수행하였다.
각각 2 mg/mL 농도의 히드록시프로필-알파-사이클로덱스트린, 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린, 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 단량체와 히드록시프로필-알파-사이클로덱스트린, 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린, 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체와 2 μM 농도의 아토바스타틴을 병용하여 대식세포에 투여하였다. 병용투여 이외의 조건은 상기 실시예 9.1과 동일하게 수행하였고, IL-1β, TNF-α 및 MCP-1의 염증 사이토카인의 분비량 변화를 확인하여 도 19에 나타내었다.
도 19에서 확인한 바와 같이, 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체와 병용 처리한 경우 가장 현저하게 염증 억제가 나타나, 항염증 효과에 있어서 상승작용이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체는 단독 및 병용 투여조건에서 다른 중합체보다 항염증 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다. 이에 종합적으로, 도 20에 나타난 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린에 의한 세포내 콜레스테롤 대사 및 배출 촉진과 항염증반응을 나타내는 모식도에서 확인한 바와 같이, 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체가 다른 사이클로덱스트린 단량체 및 중합체에 비해 세포내 콜레스테롤 대사 및 배출을 탁월하게 향상시키며 콜레스테롤에 의한 염증작용을 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였다.
실시예 10. 사이클로덱스트린에 의한 체내 콜레스테롤 배출 효과의 확인
히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린의 체내 콜레스테롤 배출을 확인하기 위하여 먼저 서로 다른 분자량의 중합체 50 mg을 PBS에 녹이고 1 mg의 NBD (2-(4-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-7-yl) aminoethyl) 형광이 표지된 콜레스테롤과 반응시켜 사이클로덱스트린-콜레스테롤 복합체(cyclodextrin-cholesterol inclusion complex)를 형성하였다. 그리고 이를 C57BL/6 마우스에 500 mg/kg 사이클로덱스트린의 양만큼 정맥주사해 주었다. 이는 20 g 몸무게의 쥐 기준 10 mg에 해당하는 양이다. 안와하정맥총(retro-orbital) 채혈을 통하여 주입 후 3분, 30분, 1시간, 4시간, 8시간, 24시간에 혈장 내 NBD 콜레스테롤의 양을 정량하였으며 1시간, 4시간, 24시간에 소변을 채취하여 소변내 NBD 콜레스테롤의 양을 정량하였고, 혈중 콜레스테롤의 체내 반감기와 소변 배출양을 나타낸 도 21에 나타내었고, 구체적으로 형광 콜레스테롤의 반감기를 확인한 결과를 도 21A에, 소변으로 배출된 콜레스테롤 양을 확인한 결과를 도 21B에 나타내었다.
도 21A에서 확인한 바와 같이, 사이클로덱스트린 단량체와 분자량이 5.6 kDa, 8.3 kDa, 19.4 kDa, 72.8 kDa인 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체는 각각 0.9시간, 1.1시간, 1.3시간, 2.0시간, 25시간의 혈액 내 반감기를 보였으며 중합체의 크기가 증가함에 따라 혈액 내 반감기도 증가한다는 것을 확인하였다. 도 21B에서 확인한 바와 같이, 1시간, 4시간, 24시간에 채취한 소변내 NBD 콜레스테롤의 양을 정량하였을 때, 사이클로덱스트린 단량체와 분자량이 분자량이 5.6 kDa, 8.3 kDa, 19.4 kDa, 인 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체는 유사한 소변내 콜레스테롤 양을 보였으나 분자량이 72.8 kDa인 중합체는 현저하게 떨어진 것을 확인하였다. 이를 통해 사구체 여과의 분획분자량이 약 60 kDa이기 때문에 그보다 큰 분자량을 갖는 중합체는 효과적인 사구체여과가 일어나지 않음을 확인할 수 있었다. 따라서, 사이클로덱스트린-콜레스테롤 복합체를 통한 콜레스테롤의 효과적인 체외 배출을 위해서는 사구체 여과의 분획 분자량 이하의 중합체를 이용하는 것이 적절하나, 너무 작은 중합체는 체내에서 빠르게 배출되므로 임계적 의의가 나타나는 중합체를 사용하는 것이 중요함을 확인하였다.
따라서, 4-60 kDa의 중합체는 향상된 반감기를 가지면서 사구체 여과를 통한 콜레스테롤 체외 배출을 용이하게 하여 가장 체내 콜레스테롤을 효과적으로 배출시킬 수 있는 중합체임을 확인하였다.
또한, 자연적인 환경에서 사이클로덱스린의 체내 콜레스테롤 포접 및 배출능력을 확인하기 위하여 사이클로 덱스트린 중합체를 투여하여 소변 내 클레스테롤 양을 확인하였다.
4g/kg의 사이클로덱스트린을 C57BL/6 마우스에 피하주사를 해준 뒤 4시간, 8시간, 24시간에 소변을 채취하여 소변내 콜레스테롤의 양을 Cholesterol Quantification Kit (Sigma Aldrich)을 이용하여 정량하였으며 24시간 동안 배출된 콜레스테롤의 양을 모두 합한 뒤 비교한 것을 도 22에 나타내었다.
도 22에서 확인한 바와 같이, 5.6 kDa, 8.3 kDa 및 19.4 kDa의 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체를 이용하였을 때 소변을 통한 체내 콜레스테롤 배출 양이 가장 높은 것을 확인하였다. 종합적으로, 적절한 분자량을 가지는 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체가 체내 콜레스테롤 포접 및 배출 향상에 기여할 수 있음을 확인하였다.
실시예 11. 전신 독성 및 내이독성 확인
전신독성을 확인을 위하여 야생형 C57/BL6 생쥐에 PBS에 녹인 사이클로덱스트린을 10 g/kg body weight의 양만큼 피하주사 해주었다. 중합체의 경우 3-30 kDa 사이의 분자량을 갖는 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체를 이용하였다. 일주일간 매일 쥐의 몸무게 및 행동특성을 관찰하였다. 쥐의 행동특성의 경우 Endpoints for Mouse Abdominal Tumor Models: Refinement of Current Criteria에서 제시한 기준에 따라 측정하였다. 주요 장기에 독성을 확인하기 위하여 7일 뒤 쥐를 희생하였으며 H&E 염색을 실시하였다. 내이독성 확인을 위하여 7일 뒤 쥐를 희생하였으며 와우각 내의 외유모세포를 현미경 관찰을 통하여 정량하였다. 또한, 중추신경계 직접전달시 내이독성확인을 위하여 26 G 주사기를 이용하여 PBS에 녹인 사이클로덱스트린을 5,000 mg/kg brain weight 만큼 뇌실주사하였다. 쥐의 brain weight는 주령에 따라 약 0.4 g으로 계산하였으며 결과적으로 2 mg의 사이클로덱스트린을 10 μL의 PBS에 녹여 주입해 주었다. 7일 뒤 와우각 내의 외유모세포를 현미경 관찰을 통하여 정량하였다.
일주일간 몸무게 변화를 확인한 결과를 도 23A에, 행동점수를 확인한 결과를 도 23B에 나타내었다. 또한, 일주일간 뒤 상기 마우스의 주요 장기의 조직분석을 도 24에 나타내었고, C57BL/6 쥐에 사이클로덱스트린을 10 g/kg 피하주사, 5 g/kg brain weight 뇌실주사 해준 뒤 일주일 뒤 내이독성을 공초점 현미경으로 관찰하였다. 구체적으로, 외유모 세포를 피하 주사 일주일 이후 확인한 결과를 도 25A에, 피하 주사 일주일 이후 외유모 세포를 정량화한 결과를 도 25B에, 뇌실주사 일주일 뒤 외유모세포를 정량화한 결과를 도 25C에 나타내었다.
도 23A에서 확인한 바와 같이, 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린의 경우 10 g/kg을 피하주사한 바로 다음날부터 몸무게 감소가 관찰되었으며 2일째에 6.4 %가량 몸무게가 감소했다가 시간에 따라 주사 전 몸무게로 회복하였다. 반면, 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 단량체 및 중합체는 몸무게 감소가 관찰되지 않은 것을 확인하였다. 도 23B에서 확인한 바와 같이, 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린 그룹에서는 고르지 못한 털, 활동량 감소, 자극에 의한 반응속도 감소 등을 보여 낮은 행동점수가 나타나는 것을 확인하였다. 반면, PBS와 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 단량체 및 중합체를 투여한 그룹의 경우 일주일 동안 가장 높은 11점의 행동점수를 보였으나 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린 투여 후 하루 뒤 평균 6점으로 가장 낮은 행동점수를 보였으며 서서히 정상화되는 것을 확인하였다.
도 24에서 확인한 바와 같이, 신장, 간, 비장, 심장, 폐의 조직을 현미경을 통해 관찰한 결과 독성이 나타나지 않았다.
도 25A 및 25B에서 확인한 바와 같이, 외유모 세포의 생존율로 측정한 내이 독성은 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린 (43.3 % 생존) 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 (74.7 % 생존), 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체 (98 % 생존) 순으로 높은 생존율이 나타나 내이독성이 현저히 낮아지는 것을 확인하였다. 이를 통해 전신전달을 통한 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체를 투여하는 경우, 전신독성 및 내이독성을 현저히 낮출 수 있음을 확인하였다.
또한 도 25C에서 확인한 바와 같이, 뇌실 내 주사 후 내이독성을 관찰하였을 때, 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린 (27.5 % 생존), 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 (69.7 % 생존), 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체 (84.4 % 생존) 순으로 높은 생존율이 나타나 내이독성이 현저히 낮아지는 것을 확인하였다. 따라서, 이러한 결과를 통하여 중추신경계 직접전달을 통한 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체 투여시 내이독성을 현저히 낮출 수 있음을 확인하였다.

Claims (16)

  1. 2.5kDa 내지 20kDa의 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린(hydroxypropyl-γ-cyclodextrin) 중합체를 포함하는, 콜레스테롤 대사 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 콜레스테롤 대사 관련 질환은 니만픽병(Niemann-pick disease) C형, 알츠하이머성 치매, 파킨슨병, 초점성 분절성 사구체 경화증(focal segmental glomerulosclerosis: FSGS), 알포트 신드롬(Alport syndrome), 당뇨병성 신증(diabetic kidney disease), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 간질성 폐질환(interstitial pneumonia), 관절염(osteoarthritis), 지질 이상증 및 콜레스테롤 조절 이상에 의한 심혈관 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 약학적 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체는 2 내지 35개의 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 단량체를 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 단량체는 0.125 내지 2.25의 몰 치환도(molar substitution)를 갖는 것인, 약학적 조성물.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 단량체는 0.375 내지 1.5의 몰 치환도(molar substitution)를 갖는 것인, 약학적 조성물.
  5. 삭제
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 중합체는 평균 2 내지 25개의 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 단량체를 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  7. 청구항 2에 있어서, 상기 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 단량체는 하기 화학식 1로 표현되는 것인, 약학적 조성물:
    [화학식 1]

    상기 R, R' 및 R''은 각각 독립적으로, 수소, C1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 히드록시 C1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 설포부틸에테르 C1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 카복시 C1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬일 수 있다.
  8. 삭제
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 지질 이상증은 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 고중성지방혈증, 복합 고지혈증 및 이상지질혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상; 및
    상기 콜레스테롤 조절 이상에 의한 심혈관 질환은 고혈압, 협심증, 심근경색, 뇌경색, 뇌졸중, 부정맥, 관상동맥경화증 및 죽상동맥경화증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 약학적 조성물.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 약학적 조성물은 liver X receptor(LXR) 효능제, GLP-1 수용체, 에제티미브(ezetimibe) 제제, 피브린산(Fibric acid) 유도체, 니아신(Nicotinic acid)계 제제 및 HMG-CoA 환원효소 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상과 병용하여 투여하는 것인, 약학적 조성물.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 LXR 효능제는 22(R)-하이드록시콜레스테롤, 24(S),25-에폭시콜레스테롤, 24(S)-하이드록시콜레스테롤, 27-하이드록시콜레스테롤, 콜레스테노익산, T-314407, T-0901317,　GW3965, SB742881, GSK 2186, WAY-252623(LXR-623), WAY-254011, WYE-672, DMHCA(N,N-Dimethyl-3b-hydroxycholenamide), 4-(3-바이아릴)퀴놀린 설폰, F3MethylAA, APD(acetyl-podocarpic dimer), 포도카르픽 이미드 이합체(podocarpic imide dimer), CRX000541, CRX000864, CRX000929, CRX000823, CRX000987, CRX001093, CRX001094, CRX156651, CRX000909, CRX000908, CRX000369, CRX001045, CRX001046, LN7181, LN7179, LN7172, LN6672, LN7031, LN7033, LN6500, LN6662, 리카르딘 C(Riccardin C), XL-652, DY136, DY142 및 하이포콜라마이드(3a,6a-dihydroxy-5b-cholanoic acid-N-methyl-N-methoxy-24-amide)로 이루어진 군에서 선택된 것인, 약학적 조성물.
  12. 청구항 10에 있어서, 상기 GLP-1 수용체는 엑세나타이드(exenatide), 릭시세나타이드(lixisenatide) 및 리라글루타이드(liraglutide)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 약학적 조성물.
  13. 청구항 10에 있어서, 상기 HMG-CoA 환원효소 저해제는 로수바스타틴, 심바스타틴,　아토바스타틴, 피타바스타틴, 프라바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 약학적 조성물.
  14. 청구항 10에 있어서, 상기 피브린산(Fibric acid) 유도체는 젬피브로질(gemfibrozil), 베자피브레이트(bezafibrate), 페노피브레이트(fenofibrate) 및 시프로피브레이트(ciprofibrate)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 약학적 조성물.
  15. 2.5kDa 내지 20kDa의 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린(hydroxypropyl-γ-cyclodextrin) 중합체를 포함하는, 콜레스테롤 대사 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물로서,
    상기 콜레스테롤 대사 관련 질환은 니만픽병(Niemann-pick disease) C형, 알츠하이머성 치매, 파킨슨병, 초점성 분절성 사구체 경화증(focal segmental glomerulosclerosis: FSGS), 알포트 신드롬(Alport syndrome), 당뇨병성 신증(diabetic kidney disease), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 간질성 폐질환(interstitial pneumonia), 관절염(osteoarthritis), 지질 이상증 및 콜레스테롤 조절 이상에 의한 심혈관 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 식품 조성물.
  16. 2.5kDa 내지 20kDa의 히드록시프로필-감마-사이클로덱스트린(hydroxypropyl-γ-cyclodextrin) 중합체를 포함하는, 콜레스테롤 대사 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물로서,
    상기 콜레스테롤 대사 관련 질환은 니만픽병(Niemann-pick disease) C형, 알츠하이머성 치매, 파킨슨병, 초점성 분절성 사구체 경화증(focal segmental glomerulosclerosis: FSGS), 알포트 신드롬(Alport syndrome), 당뇨병성 신증(diabetic kidney disease), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 간질성 폐질환(interstitial pneumonia), 관절염(osteoarthritis), 지질 이상증 및 콜레스테롤 조절 이상에 의한 심혈관 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 건강기능식품 조성물.
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