KR102571206B1

KR102571206B1 - ANK2 또는 EPAS1 유전자에서 CpG 부위의 메틸화 수준을 이용한 유방암 진단용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 방법

Info

Publication number: KR102571206B1
Application number: KR1020200185221A
Authority: KR
Inventors: 조제열; 요세프스 스커보트 요하네스
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2020-12-28
Filing date: 2020-12-28
Publication date: 2023-08-25
Also published as: KR20220093991A; WO2022145662A1

Abstract

유방암 특이적 ANK2 또는 EPAS1 메틸화 바이오마커를 이용한 유방암 진단용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 방법을 제공한다. 이에 의할 경우, 간편한 방법으로 유방암을 진단할 수 있고, 유방암을 높은 정확도 및 민감도로 진단할 수 있다.

Description

ANK2 또는 EPAS1 유전자에서 CpG 부위의 메틸화 수준을 이용한 유방암 진단용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 방법{Composition or kit for diagnosing breast cancer using methylation level of CpG site in gene encoding ANK2 or EPAS1, and method using the same}

유방암 또는 유선암을 진단하기 위한 조성물, 키트, 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것이다.

개와 사람의 유선암과 유방암은 다양한 유사성을 가지고 있다. 개를 암과 같은 인간 질병의 동물 모델로 삼는 것은 인간과 같은 환경에 노출되고 인간보다 더 빨리 자발적 질병 특성을 보이기 때문이다. 특히, 환경 자극이 유기체의 후생유전학에 지대한 영향을 미칠 수 있다고 알려져 있으며, 몇몇 유전자의 후생유전 이상은 인간 유방암의 발생과 연관되어 있음이 보고되었다. 따라서 개 유선암의 후생유전학을 조사하는 것은 비교 종양학 측면에서 매우 유용할 수 있다.

DNA 메틸화를 바이오마커로 사용하는 것은 조직과 액체생검 형태로 수많은 암에 대해 주목받았지만, 개의 유선암에서는 매우 제한적이었다. 혈액 내의 소량 존재하는 무세포 DNA(cell-free DNA: cfDNA)의 경우, 그 양의 변화가 여러 질병 상태와 연관되어 있고, 특정 유전자들이 가지는 유전적 변이와 후성유전적 조절이 질병상태의 cfDNA에서 검출될 수 있음이 보고되고 있다(Uehiro et al., Breast Cancer Research (2016) 18:129). 그러나, cfDNA는 혈액 내에 매우 적은 양으로 존재하고 사람마다 편차가 크다는 것은, cfDNA에서 특정 유전자의 변이를 검출하여 진단 마커로 이용하는데 있어 큰 제약으로 작용한다.

따라서, 유방암을 쉬운 방법으로 시료를 채취하고, 진단의 정확성이 우수한 유방암 특이적 바이오마커를 선별하는 것이 필요하다.

유방암 특이적 메틸화 바이오마커를 이용한 유방암 진단용 조성물을 제공된다.

유방암 특이적 메틸화 바이오마커를 이용한 유방암 진단용 키트를 제공한다.

유방암 특이적 메틸화 바이오마커를 검출하여 유방암 진단 방법을 제공한다.

유방암 특이적 메틸화 바이오마커를 검출하여 유방암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

일 양상은 ANK2(Ankyrin 2) 또는 EPAS1(Endothelial PAS domain-containing protein 1)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에서 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 진단용 조성물을 제공한다.

용어 "유방암(breast cancer)"는 유방에 생긴 암을 말하고, 상호교환적으로 "유선암"으로도 불릴 수 있다. 상기 유방암은 유선(mammary gland) 유방암, 소엽(lobule) 유방암, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

용어 "진단(diagnosis)"은 병명을 판정하는 일을 말하고, 유방암의 병명, 병의 상태, 병기, 병인, 합병증의 유무, 예후, 및 재발 등을 포함할 수 있다.

ANK2(Ankyrin 2)는 심근세포에서 이온 트랜스포터 및 이온 채널의 위치 및 막 안정화에 기능을 하는 단백질로서, Ankyrin-B, ANK-2, LQT4, Brain ankyrin, Non-erythroid ankyrin, 또는 brank-2로도 불릴 수 있다. ANK2는 보편적으로(ubiquitously) 발현되는 단백질이나 심장근에서 높게 발현될 수 있다. ANK2는 다중 ankyrin repeat를 포함하는 N-말단 도메인, spectrinn 결합 도메인과 사멸 도메인(death domain)을 포함하는 중앙 영역, 및 Ankyrin 2 활성을 결정하는 C-말단 조절 도메인을 포함할 수 있다. ANK2는 사람에서 Uniprot Accession No. Q01484의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 포함할 수 있다. ANK2는 개에서 CanFam3.1: Chromosome 32: 32,671,281-33,141,036의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. ANK2는 Ensembl Accession No. ENSG00000145362의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. ANK2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 인트론(intron)을 포함할 수 있다. ANK2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 Illumina ID cg25915539, cg17665652, 또는 cg08448479의 CpG 부위를 포함할 수 있다.

EPAS1(Endothelial PAS domain-containing protein 1)는 hypoxia-inducible factor-2alpha(HIF-2alpha)로도 알려져 있는 단백질로, 산소 농도에 대한 생리적 반응과 관련된 전사인자이다. EPAS1은 ECYT4, HIF2A, HLF, MOP2, PASD2, bHLHe73, 또는 endothelial PAS domain protein 1으로도 불릴 수 있다. EPAS1은 사람에서 Uniprot Accession No. Q99814의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 포함할 수 있다. EPAS1은 개에서 CanFam3.1: Chromosome 10: 48,551,410-48,634,844의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. EPAS1은 Ensembl Accession No. ENSG00000116016의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. EPAS1을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 인트론(intron)을 포함할 수 있다. EPAS1을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 Illumina ID cg20623601 또는 cg25124739의 CpG 부위를 포함할 수 있다.

용어 "메틸화(methylation)"은 DNA를 구성하는 염기에 메틸기가 부착되는 것을 말한다. 상기 메틸화는 CpG 뉴클레오티드 서열(CpG 부위)의 시토신에 메틸기가 부착되는 것일 수 있다. 메틸화가 일어난 경우 그로 인하여 전사 인자의 결합이 방해를 받게 되어 특정 유전자의 발현이 억제될 수 있다. 반대로, 비메틸화 또는 저메틸화가 일어나는 경우 특정 유전자의 발현이 증가할 수 있다.

상기 CpG 부위는 cg25915539, cg17665652, cg08448479, cg20623601, 및 cg25124739로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. cg25915539는 사람 Chr4: 114214080으로도 기재될 수 있다. cg17665652는 사람 Chr4: 114214094로도 기재될 수 있다. cg08448479는 사람 Chr4: 114214186으로도 기재될 수 있다. cg20623601은 사람 Chr2: 46526844로도 기재될 수 있다. cg25124739는 사람 Chr2: 46527099로도 기재될 수 있다. 시료가 게놈 DNA인 경우, 상기 CpG 부위는 cg25915539, cg17665652, cg08448479, cg20623601, 및 cg25124739로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 시료가 cfDNA인 경우, 상기 CpG 부위는 cg25915539, cg17665652, 및 cg08448479로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 시료가 인간 유래의 시료인 경우, 상기 CpG 부위는 cg08448479일 수 있다.

상기 CpG 부위의 메틸화 수준은 제한효소 절단 후 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR) 또는 메틸화 특이적인 PCR에 의해 측정될 수 있다. 메틸화 특이적인 PCR은 예를 들어 메틸화 특이적 PCR(methylation-specific polymerase chain reaction: MSP), 실시간 메틸화 특이적 PCR(real time methylation-specific polymerase chain reaction), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 또는 정량적 PCR이다. 상기 CpG 부위의 메틸화 수준은 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 중아황산염(bisulfite) 시퀀싱에 의해 측정될 수 있다.

상기 제제는 CpG 부위 증폭용 프라이머 세트 또는 CpG 부위 특이적 프로브; 메틸화 민감성 제한효소; 및 메틸화 비민감성 제한효소로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

상기 프라이머(primer)는 중합효소에 의한 중합 반응에서 중합 개시점을 제공하는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)로, 상기 프라이머는 핵산 증폭 반응에 사용되는 것일 수 있다. 상기 프라이머는 상기 표적 서열에 상보적인 영역과 혼성화된다. 용어 "증폭(amplification)"은 표적 서열 또는 그의 상보적인 서열의 카피 수를 증가시키는 것을 나타낸다. 상기 핵산 증폭 반응은 당업계에 알려진 방법에 의하여 수행될 수 있다. 핵산의 증폭은 증폭 동안 복수의 사이클을 필요로 하는 방법 또는 단일 온도에서 수행되는 방법을 포함한다. 순환 방법(cycling techniques)의 예는 열 순환을 필요로 하는 방법을 포함한다. 열 순환을 필요로 하는 방법은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)을 포함한다. PCR은 당업계에 알려져 있다. 등온 증폭 방법은 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification: SDA), 헬리카제 의존적 증폭(helicase dependant amplification: HDA), 엑소뉴클레아제 의존적 증폭(exonuclease dependant amplification), 리콤비나제 중합효소증폭(recombinase polymerase amplification: RPA), 루프 매개된 증폭(loop mediated amplification: LAMP), 핵산 기반 증폭(nucleic acid based amplification: NASBA 및 TMA), 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 프라이머는 선택되는 증폭 방법에 따라 1개, 또는 2개 이상의 세트로 포함될 수 있다.

상기 프라이머의 길이는 약 5 내지 약 100 뉴클레오티드(이하, 'nt'라고 함), 약 10 내지 약 80 nt, 약 10 내지 약 60 nt, 약 10 내지 약 50 nt, 약 10 내지 약 40 nt, 약 10 내지 약 30 nt, 또는 약 20 내지 약 30 nt일 수 있다.

상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 14로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

상기 프로브(probe)는 표적 서열에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프로브는 예를 들어 표적 핵산 서열과 같은 특이적인 핵산 서열의 상보적인 영역을 갖는 서열-특이적인 방법으로 혼성화되도록 고안된 특이적인 부분을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 프로브는 DNA, RNA, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있고, 검출가능한 표지로 표지될 수 있다.

상기 프라이머 또는 프로브는 그의 말단 또는 내부에 형광 물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 또는 방사성 동위원소 등으로 표지된 것일 수 있다.

용어 "제한효소(restriction enzyme)"은 DNA의 특정한 염기서열을 식별하고 이를 절단하는 엔도뉴클레아제(endonuclease)를 말한다. 제한효소가 식별하는 염기서열은 인식 서열이라고 한다.

용어 "메틸화 민감성 제한효소(methylation sensitive restriction enzyme)"는 제한효소의 인식 서열 중 CpG 부위의 메틸화의 존재에 따라 절단하거나 절단할 수 없는 효소를 말한다. 상기 메틸화 민감성 제한효소는 HpaII, BsiSI, 또는 이들의 조합일 수 있다. ANK2 또는 EPAS1을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에서 CpG 부위가 메틸화될 경우, 핵산 시료가 HpaII, BsiSI, 또는 이들의 조합에 의해 절단되지 않고 그 후의 PCR에 의해 표적 서열이 증폭될 수 있다. 반대로, ANK2 또는 EPAS1을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에서 CpG 부위가 메틸화되지 않을 경우, 핵산 시료가 HpaII, BsiSI, 또는 이들의 조합에 의해 절단되고, 그 후의 PCR에 의해 표적 서열이 증폭되지 않을 수 있다.

상기 메틸화 비민감성 제한효소는 제한효소의 인식 서열 중 CpG 부위의 메틸화와 관계 없이 인식 서열을 식별하여 절단할 수 있는 효소를 말한다. 상기 메틸화 비민감성 제한효소는 MspI일 수 있다. ANK2 또는 EPAS1을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에서 CpG 부위가 메틸화되었는지 여부와 무관하게, 핵산 시료가 MspI에 의해 절단될 수 있고, 그 후의 PCR에 의해 표적 서열이 증폭되지 않을 수 있다. MspI에 의해 절단된 핵산 시료는 음성 대조군으로 이용될 수 있다. HpaII와 MspI으로 절편화된 DNA의 증폭량의 차이는 ANK2 또는 EPAS1을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에서 CpG 부위의 메틸화 수준의 차이를 나타낼 수 있다.

다른 양상은 ANK2 또는 EPAS1을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에서 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제 및 핵산 증폭용 시약을 포함하는 유방암 진단용 키트를 제공한다.

상기 ANK2, EPAS1, CpG 부위, 메틸화 수준, 유방암 진단, 및 제제는 전술한 바와 같다.

상기 핵산 증폭용 시약은 중합효소, dNTP, 완충제, 핵산, 조효소, 형광물질, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 중합 효소는 예를 들어 Taq 중합효소이다.

다른 양상은 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산 시료를 수득하는 단계; 및 수득된 핵산 시료로부터 ANK2 또는 EPAS1을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에서 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는 유방암 진단 방법 또는 유방암 진단을 위해 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

상기 방법은 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산 시료를 수득하는 단계를 포함한다.

상기 개체는 사람, 개, 마우스, 소, 돼지, 말, 양, 또는 고양이를 포함한 포유동물일 수 있다. 상기 개체는 유방암을 앓거나 앓는 것으로 의심되는 개체일 수 있다.

상기 생물학적 시료는 상기 개체로부터 수득된 시료를 말한다. 상기 생물학적 시료는 예를 들면 조직, 혈액, 혈장, 혈청, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 점막액, 양수, 또는 이들의 조합일 수 있다.

상기 핵산 시료는 게놈 DNA(genomic DNA: gDNA), 무세포 DNA(cell free DNA: cfDNA), 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 gDNA는 생물학적 시료로부터 분리된 DNA일 수 있다. 상기 cfDNA는 세포 내에 존재하지 않고, 혈류에 존재하는 절단된 DNA를 말한다. 상기 cfDNA는 혈액, 혈장, 혈청, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 점막액, 양수, 또는 이들의 조합으로부터 분리된 DNA일 수 있다.

상기 생물학적 시료로부터 핵산 시료를 수득하는 방법은 당해 업계에서 통상적으로 사용되는 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 핵산 시료는 예를 들어, 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법, CTAB(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) 분리법, 및 상업적으로 이용가능한 DNA 추출 키트를 이용하여 수득될 수 있다.

상기 방법은 수득된 핵산 시료로부터 ANK2 또는 EPAS1을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에서 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함한다.

CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계는 상기 핵산 시료에 메틸화 민감성 제한효소, 메틸화 비민감성 제한효소, 또는 이들의 조합을 가하여 핵산 시료를 절단하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 핵산 시료는 ANK2 또는 EPAS1을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에서 CpG 부위의 메틸화 여부에 따라 절단될 수 있다.

상기 방법은 핵산 시료를 절단하는 단계 후에 상기 핵산 시료를 증폭하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 핵산 시료가 메틸화 민감성 제한효소 또는 메틸화 비민감성 제한효소에 의해 절단되지 않을 경우, 상기 핵산 시료의 표적 서열은 증폭될 수 있다. 반대로, 상기 핵산 시료가 메틸화 민감성 제한효소 또는 메틸화 비민감성 제한효소에 의해 절단될 경우, 상기 핵산 시료의 표적 서열은 증폭되지 않을 수 있다.

상기 방법은 ANK2 또는 EPAS1을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에서 CpG 부위의 메틸화 수준이 정상 대조군의 메틸화 수준에 비해 증가한 경우 상기 개체는 유방암에 걸릴 확률이 높거나 유방암에 걸린 것으로 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

ANK2 또는 EPAS1을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에서 CpG 부위의 메틸화 수준이 정상 대조군의 메틸화 수준에 비해 증가한 경우, 즉 ANK2 또는 EPAS1을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에서 CpG 부위의 과메틸화가 검출되는 경우, 상기 개체는 유방암에 걸릴 확률이 높거나 유방암에 걸린 것으로 결정될 수 있다.

유방암 특이적 메틸화 바이오마커를 이용한 유방암 진단용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 방법에 의할 경우, 혈액을 이용하여 간편한 방법으로 유방암을 진단할 수 있고, 유방암을 높은 정확도 및 민감도로 진단할 수 있다.

도 1a는 MBD-seq 및 RNA-seq를 이용한 표적 선별 과정의 모식도이고(괄호 안에 각 단계에서 선별된 유전자의 개수를 표시함), 도 1b는 상위 20개의 과메틸화된 유전자의 FPKM(Fragments Per Kilobase of transcripts per Million mapped reads)에 대한 RNA-seq 유전자 발현 수준(파란 점: 정상, 빨간 점: 유방암, *: p-값<0.05) 및 각 표적 요전자에 대한 변화 배수(log2 값, 회색 막대 그래프)를 나타낸 그래프이고, 도 1c는 정상 및 암에서 ANK2 및 EPAS1의 IGV(Integrative Genomics Viewer) peak calling을 나타낸 그래프이고, 도 1d는 11쌍의 개 유선암 조직과 인근 정상 조직에 대해 MBD-seq 데이터 중 ANK2 및 EPAS1의 전체 메틸화 수준을 나타낸 그래프이고(**: p-값<0.01, ****: p-값<0.0001), 및 도 1e 및 도 1f는 각각 ANK2 및 EPAS1에 대하여 10쌍의 개 유선암 조직(빨간색) 및 정상 조직(파란색) 시료에서 발현(FPKM)과 메틸화 간의 상관관계 그래프 및 FPKM과 메틸레이션에 대한 매칭(matching) 밀도 그래프이다(녹색: 발현, 주황색: 메틸화 수준).
도 2a 및 도 2b는 각각 ANK2 및 EPAS1의 중아황산염 시퀀싱 PCR(bisulfite sequencing PCR: BSP) 결과를 나타낸다.
도 3a는 ANK2 및 EPAS1에 대해 각 인트론의 CpG 섬에서 BSP 프라이머 세트(회색)와 MSP 프라이머 세트(노란색)의 위치를 나타낸 모식도이고, 도 3b는 ANK2 및 EPAS1 의 메틸화 지수를 나타낸 그래프이고(빨간색: CMT 시료, 파란색: 정상 시료), 도 3c는 전체 메틸화 수준을 나타내는 그래프이고(빨간색: CMT 시료, 파란색: 쌍을 이루는 정상 시료, *: p-값<0.05, **: p-값<0.01), 및 도 3d 및 도 3e는 각각 ANK2 및 EPAS1 각각에 대해 메틸화 수준의 ROC(Receiver operating characteristic) 곡선이다.
도 4a 및 도 4b는 각각 ANK2 및 EPAS1에 대해 cfDNA 과메틸화 분석 결과를 나타낸 그래프이다(빨간색: CMT, 파란색: 쌍을 이루는 정상 시료, *: p-값<0.05).
도 5a 및 도 5b는 각각 ANK2 및 EPAS1에 대한 평균 메틸화 수준을 나타내는 그래프이고(파란색: 정상, 빨간색: 유방암, 도 5b에서 연두색: CpG 섬, *: p-값<0.05), 도 5c 및 5d는 각각 ANK2 및 EPAS1에 대한 표적 유전자의 발현 수준을 나타내는 그래프이고(log2(rsem +1로 보정), 파란색: 정상, 빨간색: 유방암), 및 도 5e 및 도 f는 각각 ANK2 및 EPAS1에 대한 유전자 발현 수준에 따른 재발없는 생존율(relapse-free survival)을 나타내는 Kaplan-Meier 곡선이다.

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 유방암 환자의 생물학적 시료에서 차등 메틸화된 유전자의 메틸화 수준의 확인

1. 반려견의 유방암 조직에서 차등 메틸화된 유전자의 메틸화 수준의 확인

유선암을 갖는 반려견의 유선암 조직에서 정상조직 대비 메틸화 수준이 높은 유전자 후보를 발굴하였다.

구체적으로, 유선암을 갖는 반려견으로부터 유선암 조직(canine mammary tumor: CMT)과 인근 정상 조직(총 25쌍)을 분리하였다(서울대학교 동물병원 제공). DNEasy Blood & Tissue 키트(Qiagen)을 사용하여 유선암 조직과 인근 정상 조직으로부터 게놈 DNA(gDNA)를 분리하였다. 분리한 gDNA는 나노드롭 분광광도계를 사용하여 정량하였다.

도 1a의 모식도에 나타난 바와 같이, MBD-seq와 상응하는 RNA-seq를 사용하여 과메틸화된 차등-메틸화 영역(differentially methylated region: DMR)을 확인하였다. 우선, NCBI BioProject database(accession number PRJNA601533)에서 11쌍의 개 유선암 조직 및 인근 정상 조직에서 얻은 MBD-seq 데이터(Nam, A.-R et al., Clin. Epigenet. 2020, 12, 1-15)를 이용하여, 유전자 내의 DMR의 존재를 기반으로 차등-메틸화된 유전자 16,061개를 확인하였다(p-값<0.01). 그 중, 변화 배수(fold change)(log2 변화 배수 > 1.5)에 기반하여, 1269개의 과메틸화된 차등-메틸화된 유전자를 선별하였다.

도 1b에 나타난 바와 같이, 암 조직과 정상 조직 간에 메틸화 수준의 차이가 큰 상위 20개의 확인된 표적들 중, EPAS1, ANK2, DST 및 RUSC2는 RNA-seq data(SRA accession number: SRR8741587-SRR8741602)에서 확인된 바와 같이 개 유선암 조직(CMT)에서 유전자 발현이 하향 조절되었다. 이들 중, ANK2 및 EPAS1는 유의한 수준이었다(*: p-값 < 0.05). ANK2 21번째 인트론 및 EPAS1 1번째 인트론의 CpG 섬에서 CMT 차등-메틸화 영역이 확인되었다. CMT에서 메틸화 수준의 증가율은 10% 및 5%의 임계값을 갖는 선형 혼합 모델(linear mixed model: LMM)로 나타내었다(도 1c). 두 표적 영역에 대해 MBD-seq를 통해 검출된 전체 메틸화 수준은 정상 조직과 반대로 CMT에서 유의하게 과메틸화되었다(도 1d). MBD-seq에 사용된 11쌍의 개 유선암/정상 조직 중, 10쌍을 RNA-seq 분석에서도 사용하였다.

도 1e 및 도 1f에 나타난 바와 같이, MBD-seq 및 RNA-seq 모두에 대한 데이터를 갖는 10쌍이 모두 유의한 수준은 아니지만, 두 표적 모두에 대해 발현과 메탈화 간에 일반적인 역 상관 경향성을 나타내었다. 따라서, ANK2 및 EPAS1을 차등-메틸화 CMT 바이오마커 후보로 선정하였다.

2. 개 유선암과 인근 정상 조직에서 차등 메틸화 영역의 평가

MBD-seq를 통해 확인된 ANK2 및 EPAS1의 표적 인트론 영역을 추가로 분석하여 차등 메틸화를 평가하였다. 메틸화 분석 방법으로 정량적 메틸화 특이적 PCR(Quantitative methylation specific PCR: qMSP)을 수행하였다.

각 표적에 대해 무작위로 선택된 3 쌍의 CMT 및 정상 gDNA에서 중아황산염 시퀀싱 PCR(bisulfite sequencing PCR: BSP)을 수행하여 각 표적에 대한 대표적인 메틸화 패턴을 확립하였다. 구체적으로, gDNA 시료는 EZ DNA Methylation-Lightning kit (Zymo Research)를 사용하여 중아황산(bisulfite)로 처리하고, 중아황산 처리된 gDNA는 Qubit ssDNA Assay on the Qubit 3.0 Fluorometer(Invitrogen)으로 정량하였다. 각 시료는 qMSP를 수행하기 전에 물로 희석하여 동일한 농도로 준비하였다. 중아황산 처리된 gDNA는 BSP 프라이머 세트를 사용하여 중아황산염 시퀀싱 PCR(BSP)을 수행하였다.

도 2a 및 도 2b는 각각 ANK2 및 EPAS1의 중아황산염 시퀀싱 PCR(bisulfite sequencing PCR: BSP) 결과를 나타낸다. ANK2 및 EPAS1에 대해 각 3쌍의 정상 및 CMT 시료(회색 점선으로 구분함)에 대해 시퀀싱된 9 및 10개의 콜로니를 표시하였고, CpG의 메틸화는 검정색 원으로, 비메틸화는 흰색 원으로 표시하였고, 각 표적에 대한 정방향 및 역방향 MSP 프라이머 영역은 검정색 사각형으로 표시하였다. 도 2a 및 도 2b에 나타난 바와 같이, ANK2 및 EPAS1 표적 영역 모두 CMT에서 쌍을 이룬 정상 시료에 비해 더 많이 메틸화되었지만, 차등 메틸화의 양은 시료의 쌍에 따라 다양하였다.

그 후, qMSP를 수행하여 더 많은 시료들을 조사하였다. qMSP는 CFX96 Real-time PCR Detection System(Bio-Rad Laboratories) 및 MSP 프라이머 세트를 사용하여 수행하였다. 동일 시료에 대해 BSP 프라이머 세트를 사용한 정량적 PCR을 수행하여 MSP 결과를 보정하였다. 하나의 MSP 프라이머 세트는 적어도 6개의 CpG를 포함하고, 프라이머의 3' 말단의 마지막 3개 염기에 적어도 1개의 CpG가 위치하도록 디자인하였다. BSP 프라이머는 각 프라이머 세트에 CpG가 아닌 C를 적어도 4개를 포함하도록 디자인하였다. 각 시료는 MSP와 BSP 프라이머 세트를 모두 사용하여 3부제로 실행되었으며 PCR 조건은 95℃에서 15분 후, 95℃에서 30초, 표1에 표시된 각 어닐링 온도에서 30초, 72℃에서 30초 연장을 1 사이클로 하여 45 사이클을 수행한 후 72℃에서 5분 동안 최종 연장시켰다. 사용된 프라이머 세트는 하기 표 1에 나타내었다.

		정방향 프라이머 (5'->3')	역방향 프라이머 (5'->3')	산물의 크기 (bp)	어닐링 온도 (℃)
개	ANK2 BSP	TGAGTTTTTGTATAGTTGTAGTTAAAT (서열번호 1)	CTACTCTTCTAATAAAAAACACTTAAC (서열번호 2)	235	60
	ANK2 MSP	AATTTGTTATCGAGTTTTTCGCGG (서열번호 3)	CGCTTTAACCCTAAAATAATCGAACG (서열번호 4)	185	66
	EPAS1 BSP	AGAAAATAAAATTATAGTTAGTTTTTTTGA (서열번호 5)	AAACTTTTCCCTATTCCCAAAT (서열번호 6)	240	60.5
	EPAS1 MSP	AGTTAGTTTTTTTGAGCGCGTTGCGG (서열번호 7)	AACCCGACGCAAAACCGCGA (서열번호 8)	172	70
인간	ANK2 BSP	GAGTATAGTAAGGGAGTTGTTAGT (서열번호 9)	CCATCTACTACAAATAAAATATTACCAT (서열번호 10)	198	61
	ANK2 MSP	CGGTGTAATTAAACGAATTGGGATTTC (서열번호 11)	CTACAAATAAAATATTACCATCGAAAACACG (서열번호 12)	149	68
	EPAS1 BSP	GGGAGGGAATTTGTGTATTTTAT (서열번호 13)	ATTTTTCCCCTACTCCCAAA (서열번호 14)	182	60.5

메틸화 지수는 탈메틸화 지수(Akirav et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2011, 108, 19018-19023)를 기반으로 하고 메틸화되지 않은 DNA에 대한 메틸화 DNA의 양을 측정하여 보정하였다. MSP 판독값을 정규화하기 위해 대상 MSP 영역에 인접한 중아황산염 시퀀싱 PCR(bisulfite sequencing PCR: BSP) 프라이머 세트 및 Taq DNA 중합효소(Bioneer)를 사용하였고, 도 3a에 각 인트론의 CpG 섬에서 BSP 프라이머 세트(회색)과 MSP 프라이머 세트(노란색)의 위치를 표시하였다. PCR 앰플리콘은 MEGAquick-spin Plus Total Fragment DNA Purification kit(Intron Biotechnology)를 사용하저 정제하고, 정제된 앰플리콘은 pGEM T-Easy 벡터(Promega)에 라이게이션하고 대장균에서 클로닝하였다. 선별된 콜로니는 Macrogen에 의뢰하여 시퀀싱하였다.

ANK2 및 EPAS1 의 메틸화 지수를 도 3b에 나타내었다(빨간색: CMT 시료, 파란색: 쌍을 이루는 정상 시료). 도 3b에 나타난 바와 같이, ANK2 표적에 대해 분석된 15쌍의 시료 중 12 개는 메틸화 지수를 기준으로 정상에 비해 CMT에서 더 많이 메틸화된 반면, 15개의 EPAS1 표적 시료 중 9 개는 쌍을 이룬 정상에 비해 CMT에서 더 많이 메틸화되었다.

paired t-검정을 기반으로, 전체 메틸화 수준을 도 3c에 나타내었다(빨간색: CMT 시료, 파란색: 쌍을 이루는 정상 시료, *: p-값<0.05, **: p-값<0.01). 도 3c에 나타난 바와 같이, ANK2 및 EPAS1 표적 모두에 대해 CMT에서 유의하게 더 메틸화되는 것으로 나타났다.

CMT과 메틸화를 바이오마커로 이용하는 민감도와 특이도를 확인하기 위해, 두 표적 모두에 대해 ROC(Receiver operating characteristic) 곡선을 작성하고, ANK2 및 EPAS1 각각에 대해 도 3d 및 도 3e에 나타내었다. 도 3d에 나타난 바와 같이, ANK2는 0.764의 곡선하면적(area under the curve: AUC)을 가졌다. 도 3e에 나타난 바와 같이, EPAS1은 0.733의 AUC를 가졌다.

따라서, ANK2 인트론 21 및 EPAS1 인트론 1 영역은 정상 조직에 비해 CMT에서 과메틸화됨을 확인하였고, 유방암에 대한 조직 바이오마커임을 확인하였다.

3. 개 혈장 cfDNA에서 차등 메틸화의 검출

CMT 조직에서의 과메틸화 경향이 cfDNA에서도 검출되어 CMT에 대한 잠재적인 액체 생검 바이오마커가 될 수 있는지 여부를 평가하기 위해, CMT 및 정상 암컷 개의 혈장 시료에서 분리 된 cfDNA에 대해 동일한 qMSP 방법을 수행하였다.

ANK2 표적에 대해 19 마리의 CMT 개와 10 마리의 암이 없는 정상 개로부터 혈액 시료를 수집하고, 혈액으로부터 풀링(pooled)한 cfDNA 시료로 분석하였다. cfDNA는 QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(Qiagen)를 사용하여 혈액 시료로부터 분리하였고, Qubit HS dsDNA Assay(Invitrogen)을 이용하여 Qubit 3.0 Fluorometer로 정량하였다.

EPAS1 표적은 10 마리의 CMT와 10 마리의 정상 개의 cfDNA 시료로 분석하였다. ANK2 및 EPAS1에 대해 cfDNA 과메틸화 분석 결과를 각각 도 4a 및 도 4b에 나타내었다(빨간색: CMT, 파란색: 쌍을 이루는 정상 시료, *: p-값<0.05). 도 4a에 나타난 바와 같이, ANK2의 경우 CMT에서 정상에 비해 유의한 과메틸화 경향이 나타났다. 그러나, 도 4b에 나타난 바와 같이, EPAS1의 경우, 조직 시료에서 나타난 바와 달리, CMT에 대한 메틸화 수준 증가를 나타내지 않고, 대조적으로, CMT cfDNA는 EPAS1에 대해 정상 혈장에 비해 CMT에서 저-메틸화를 나타냈다.

따라서, 개 cfDNA에서, ANK2는 CMT 시료에서 유의한 과메틸화를 나타었고, ANK2는 유방암에 대한 액체 생검 바이오마커임을 확인하였다.

4. TCGA 데이터에서 분석된 오솔로그 인간 영역

개 유선암에서 보이는 과메틸화 경향이 사람 유방암에서도 나타나는지 여부를 확인하기 위해, liftOver(Kent W.J. et al., Genome Res. 2002;12:996-1006)를 이용하여 개 게놈(CanFam3.1)의 표적 영역을 인간 게놈(HG19)에 맵핑하였다. 개 ANK2 및 개 EPAS1 유전자와 인간 ANK2 및 인간 EPAS1 유전자 간의 서열 동일성을 BLAST로 분석하고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

표 2에 나타난 바와 같이, ANK2 및 EPAS1 표적에 대해 개 MBD-seq에서 확인된 500 bp 영역이 오솔로그(ortholog)인 인간 405 bp 영역에 대해 약 79% 서열 동일성 및 221 bp 영역에 대해 약 76% 서열 동일성을 갖는다는 것을 확인하였다.

인간 EPAS1 표적은, 개에서와 마찬가지로, 첫번째 인트론의 30번째 끝에 있는 CpG 섬에 위치한 오솔로그 영역을 가졌다. 개 ANK2 유전자의 21번째 인트론에 위치한 표적은 인간 ANK2의 21 번째 인트론에 오솔로그 영역을 가지고 있었지만, 인간 ANK2는 CpG 섬을 포함하지 않았다.

인간 ANK2 오솔로그는 CpG 섬을 포함하지 않기 때문에, qMSP 방법이 아니라, Diez-Villanueva et al., . Epigenet. Chromatin 2015, 8, 1-8에 기재된 바와 같이, 표적 영역에 대한 The Cancer Genome Atlas(TCGA)의 데이터를 조사하였다.

ANK2 및 EPAS1에 대한 TCGA 데이터를 분석하여, 평균 메틸화 수준(도 5a 및 도 5b), 표적 유전자의 발현 수준(도 5c 및 5d), 및 유전자 발현 수준에 따른 재발없는 생존율(relapse-free survival)을 나타내는 Kaplan-Meier 곡선(도 5e 및 도 f)을 확인하였다.

인간 유방암 데이터는 TCGA의 450k Infinium Chip methylation arrays 및 Illumina HISeq RNA-seq 데이터를 이용하여 수득하였다. 생존율은 ANK2 및 EPAS1의 발현 데이터와 GEO 데이터베이스에서 얻은 3951명의 환자의 재발없는 생존율을 이용하고, Kaplan-Meier Plotter를 사용하여 분석하였다.

도 5a에 나타난 바와 같이, 인간 ANK2 오솔로그는 4 개의 CpG 프로브 중 3개(cg25915539, cg17665652 및 cg08448479)에서 ANK2가 유의하게 과메틸화되는 것을 확인하였다(도 5a에서 하늘색 하일라이트로 표시됨). 이 영역들은 개의 오솔로그 영역에서 관찰한 과메틸화 영역에 상응하는 영역이었다. 또한, 이 영역의 CpG의 양은 개에 비해 인간에서 훨씬 적지만, 이 세 과메틸화된 인간 CpG는 두 종 모두 보존되며 개 유선암 시료에서 과메틸화되는 것으로 나타났다(도 2a). 또한, 도 5b에 나타난 바와 같이, 과메틸화된 개 EPAS1 영역과 오솔로그인 인간 EPAS1 영역은 2 개의 과메틸화된 CpG 프로브를 포함하였다.

도 5c 및 도 5d에 나타난 바와 같이, 인간 유방암에서 ANK2 및 EPAS1의 발현은 하향 조절되었고, 이는 개의 데이터와 일치하였다. 또한, 도 5e 및 도 5f에 나타난 바와 같이, ANK2 및 EPAS1의 하향 조절에 따라 개체의 생존율이 감소하였다.

인간 혈장 cfDNA의 메틸화 수준을 확인하기 위해, 삼성서울병원으로부터 인간 혈액 시료를 제공받았다. 유방암 수술을 받은 환자와 유방암 소견이 없는 건강한 정상인으로부터 혈액을 수집하였다. 전혈에 동일한 부피의 Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare)를 가하고, 18℃에서 500xg로 30분 동안 원심분리하여 혈장을 수득하였고, 혈장은 사용 전까지 -80℃에서 보관하였다.

ANK2에 대해, 인간 유방암 cfDNA의 4 개의 개별 시료와 5개의 풀링된 정상 cfDNA 시료에서 콜로니를 시퀀싱하였다. 인간 유방암(HBC) cfDNA, 인간 정상(HN) cfDNA, 개 정상(CN) 조직, 및 개 유선암(CMT) 조직에서 과메틸화된 CpG 섬의 메틸화 수준(%)을 하기 표 3에 나타내었다(CpG2: cg25915539, CpG3: cg17665652, CpG5: cg08448479).

표 3에 나타난 바와 같이, TCGA 데이터에서 과메틸화되는 것으로 확인된 3개의 CpG 중, CpG5(cg08448479)만이 인간 정상(HN)에 비해 인간 유방암(HBC) cfDNA에서 더 메틸화되었다. CpG5는 인간 정상(HN) 71.88%에서 인간 유방암(HBC) 85.48%로 메틸화 증가를 보였으며, 이는 개 정상(CN) 조직 31.03%에서 개 유선암(CMT) 조직 62.07%로 오솔로그 개 CpG에 대해 보이는 메틸화의 최대 증가와 일치하였다.

따라서, ANK2의 과메틸화 바이오마커는 인간 및 개 모두에서 조직 및 혈액 바이오마커로서 이용할 수 있음을 확인하였다.

<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY R&DB Foundation <120> Composition or kit for diagnosing breast cancer using methylation level of CpG site in gene encoding ANK2 or EPAS1, and method using the same <130> GN-137361-KR <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for bisulfite sequencing PCR of canine ANK2 <400> 1 tgagtttttg tatagttgta gttaaat 27 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for bisulfite sequencing PCR of canine ANK2 <400> 2 ctactcttct aataaaaaac acttaac 27 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for methylation-specific PCR of canine ANK2 <400> 3 aatttgttat cgagtttttc gcgg 24 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for methylation-specific PCR of canine ANK2 <400> 4 cgctttaacc ctaaaataat cgaacg 26 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for bisulfite sequencing PCR of canine EPAS1 <400> 5 agaaaataaa attatagtta gtttttttga 30 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for bisulfite sequencing PCR of canine EPAS1 <400> 6 aaacttttcc ctattcccaa at 22 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for methylation-specific PCR of canine EPAS1 <400> 7 agttagtttt tttgagcgcg ttgcgg 26 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for methylation-specific PCR of canine EPAS1 <400> 8 aacccgacgc aaaaccgcga 20 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for bisulfite sequencing PCR of human ANK2 <400> 9 gagtatagta agggagttgt tagt 24 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for bisulfite sequencing PCR of human ANK2 <400> 10 ccatctacta caaataaaat attaccat 28 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for methylation-specific PCR of human ANK2 <400> 11 cggtgtaatt aaacgaattg ggatttc 27 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for methylation-specific PCR of human ANK2 <400> 12 ctacaaataa aatattacca tcgaaaacac g 31 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for bisulfite sequencing PCR of human EPAS1 <400> 13 gggagggaat ttgtgtattt tat 23 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for bisulfite sequencing PCR of human EPAS1 <400> 14 atttttcccc tactcccaaa 20

Claims

ANK2(Ankyrin 2) 또는 EPAS1(Endothelial PAS domain-containing protein 1)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에서 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 진단용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 CpG 부위는 cg25915539, cg17665652, cg08448479, cg20623601, 및 cg25124739로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 제제는
CpG 부위 증폭용 프라이머 세트 또는 CpG 부위 특이적 프로브;
메틸화 민감성 제한효소; 및
메틸화 비민감성 제한효소로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
청구항 3에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 14로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 조성물.
청구항 3에 있어서, 상기 메틸화 민감성 제한효소는 HpaII, BsiSI, 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
청구항 3에 있어서, 상기 메틸화 비민감성 제한효소는 MspI인 것인 조성물.
ANK2(Ankyrin 2) 또는 EPAS1(Endothelial PAS domain-containing protein 1)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에서 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제 및 핵산 증폭용 시약을 포함하는 유방암 진단용 키트.
개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산 시료를 수득하는 단계; 및
수득된 핵산 시료로부터 ANK2(Ankyrin 2) 또는 EPAS1(Endothelial PAS domain-containing protein 1)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에서 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는 유방암 진단을 위해 정보를 제공하는 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 개체는 사람, 개, 마우스, 소, 돼지, 말, 양, 또는 고양이인 것인 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직, 혈액, 혈장, 혈청, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 점막액, 양수, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 핵산 시료는 게놈 DNA(genomic DNA: gDNA), 무세포 DNA(cell free DNA: cfDNA), 또는 이들의 조합인 것인 방법.
청구항 8에 있어서, CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계는 상기 핵산 시료에 메틸화 민감성 제한효소, 메틸화 비민감성 제한효소, 또는 이들의 조합을 가하여 핵산 시료를 절단하는 단계를 포함하는 것인 방법.
청구항 12에 있어서, 상기 방법은 핵산 시료를 절단하는 단계 후에 상기 핵산 시료를 증폭하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 CpG 부위는 cg25915539, cg17665652, cg08448479, cg20623601, 및 cg25124739로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 방법은 상기 CpG 부위의 메틸화 수준이 정상 대조군의 메틸화 수준에 비해 증가한 경우 상기 개체는 유방암에 걸린 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.