KR102564962B1 - 니트로사민의 정성 또는 정량분석방법 및 이를 이용한 의약품의 품질관리방법 - Google Patents

니트로사민의 정성 또는 정량분석방법 및 이를 이용한 의약품의 품질관리방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 내부표준물질 존재 하에 순상 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography; HPLC)를 수행하는 단계를 포함하는, 의약품 중 니트로사민(nitrosamines)의 정성 또는 정량분석방법 및 이를 이용한 의약품의 품질관리방법에 관한 것이다.

Description

니트로사민의 정성 또는 정량분석방법 및 이를 이용한 의약품의 품질관리방법{Method for qualitative or quantitative analysis of nitrosamines and quality control method of medicines usinig the same}
본 발명은 내부표준물질 존재 하에 순상 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography; HPLC)를 수행하는 단계를 포함하는, 의약품 중 니트로사민(nitrosamines)의 정성 또는 정량분석방법 및 이를 이용한 의약품의 품질관리방법에 관한 것이다.
니트로사민은 화학구조식 R2N-N=O(R은 통상 알킬기)의 유기 화합물로서, 탈수소화된 아민에 결합된 니트로소기(nitroso group, NO+)을 갖는 것이 특징이며 대부분의 니트로사민은 발암성이다. 1956년, 영국 과학자 John Barnes와 Peter Magee는 디메틸니트로사민이 랫트에서 간 종양을 생성함을 보고하였으며, 후속 연구는 테스트한 300종의 니트로사민류 중의 약 90%가 광범위한 동물에서 발암성임을 나타내었다.
한편, ARB(angiotensin II receptor blocker) 계열 고혈압 치료제를 시작으로 라니티딘, 니자티딘, 메트포르민, 리파펜틴, 리팜핀에 이르기까지 다수 의약품에서 예기치 못하게 니트로사민계 불순물이 검출되는 사태가 발생하였다. 이에 미국 식품의약국(Food and Drug Administration; FDA)은 모든 의약품에서 니트로사민계 불순물의 존재를 최소화하고 이를 확인하기 위한 위험관리 전략이 마련돼야 한 필요성을 나타낸다는 취지에서 이와 관련된 가이드라인(Control of Nitrosamine Impurities in Human Drugs: Guidance for Industry)을 제정하여 2020년 9월 발표하기에 이르렀다.
상기 가이드라인에 따르면 FDA는 원료의약품 또는 완제의약품에서 존재할 수 있는 니트로사민계 불순물로 NDMA(N-nitrosodimethylamine)와 NDEA(N-nitrosodiethylamine) 외에 NMPA(N-Nitrosomethylphenylamine), NDIPA(N-Nitrosodiisopropylamine), NIPEA(N-Nitrosoisopropylethylamine), NDRA(N-Nitrosodibutylamine), NMBA(N-Nitroso-N-methyl-4-aminobutyric Acid) 등 7종을 제시했다. 불순물 종류에 따라 일일 섭취허용범위도 달라진다. NDMA와 NDBA의 1일허용섭취량은 96ng, NDEA와 NMPA, NIPEA, NDIPA는 26.5ng으로 차이를 뒀다. 상기 1일허용섭취량은 FDA 허가 적응증을 기반으로 약물의 일일 최대복용량을 70년동안 복용한다고 가정했을 때 10만명당 1명에서 추가로 암이 발생할 확률을 고려해 설정한 수치다. 나아가, 상기 1일허용섭취량 보다 높은 수준의 니트로사민이 검출된 약물에 대해서는 제조업체들에 자진 회수를 권고하였다.
나아가, 시간의 경과에 따라, 특히 제산제(antacids)가 실온보다 따뜻한 곳에 보관되었을 때, 라니티딘 중의 NDMA 형태가 허용 불가한 수준에 이르므로, 잔탁(Zantac)과 같은 라니티딘을 포함하는 제산제의 제조업체에게 FDA가 제품의 회수를 요청한 케이스도 보고된 바 있다.
따라서, 원료물질 및 제조공정은 물론 보관/유통 중인 완제의약품에 대해서도 니트로사민 예컨대, NDMA의 함량을 모니터링할 필요가 있다.
이에 본 발명자들은 질량분석기와 같은 고가의 장비를 필요로 하지 않으면서 낮은 정량한계로 발암물질인 니트로사민을 정량분석할 수 있는 방법을 발굴하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, UV-Vis 검출기와 결합된 순상 HPLC를 이용하되 내부표준물질을 함께 포함하여 분석함으로써 1 ng/mL까지의 낮은 정량한계를 달성함은 물론, 우수한 분리능 및/또는 재현성을 나타낼 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 내부표준물질 존재 하에 순상 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography; HPLC)를 수행하는 단계를 포함하는, 의약품 중 니트로사민(nitrosamines)의 분석방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 3 이상의 상이한 기지의 농도로 검출하고자 하는 표준물질을 포함하고, 정해진 동일한 농도로 내부표준물질을 포함하는 복수의 표준 용액을 준비하는 제1단계; 상기 순상 HPLC를 이용한 분석방법을 적용하여 측정된 값으로부터 검정곡선을 작성하는 제2단계; 상기 표준물질을 포함하는 것으로 의심되는 미지 시료 용액에 상기 순상 HPLC를 이용한 분석방법을 적용하여 데이터를 수집하는 제3단계; 및 상기 제3단계로부터 수집한 데이터를 제2단계로부터 획득한 검정곡선에 대입하여 시료 용액 중의 표준물질의 농도를 산출하는 제4단계;를 포함하는, 미지 시료 용액 중의 표준물질의 정량분석방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 3 이상의 상이한 기지의 농도로 검출하고자 하는 1종 이상의 니트로사민을 포함하고, 정해진 동일한 농도로 상기 니트로사민에 대한 내부표준물질을 포함하는 복수의 표준 용액을 준비하는 제1단계; 상기 순상 HPLC를 이용한 분석방법을 적용하여 측정된 값으로부터 검정곡선을 작성하는 제2단계; 니트로사민을 포함할 가능성이 있는 의약품의 생산 공정으로부터 임의의 시료를 선택하여 준비한 시료 용액에 상기 순상 HPLC를 이용한 분석방법을 적용하여 데이터를 수집하는 제3단계; 상기 제3단계로부터 수집한 데이터를 제2단계로부터 획득한 검정곡선에 대입하여 임의로 선택된 의약품 시료 용액 중의 나트로사민의 농도를 산출하는 제4단계; 및 상기 제4단계로부터 산출된 나트로사민의 농도가 해당 의약품에 허용된 한계치를 초과하는 경우 해당 공정으로부터 생산된 의약품을 불량으로 판단하는 제5단계;를 포함하는, 의약품의 품질관리방법을 제공하는 것이다.
본 발명에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
아울러, 본 발명의 명세서 전체에 있어서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
이하, 본 발명을 보다 자세히 설명한다.
본 발명의 제1양태는 내부표준물질 존재 하에 순상 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography; HPLC)를 수행하는 단계를 포함하는, 의약품 중 니트로사민(nitrosamines)의 분석방법을 제공한다.
예컨대, 본 발명의 분석방법은 200 내지 270 nm 범위에서 선택되는 파장에서의 흡광도를 측정하여 물질을 검출할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 분석방법으로 검출하고자 하는 물질인 니트로사민류의 화합물은 220 내지 250 nm 범위에서 최대흡수파장을 가지며 200 내지 290 nm 파장 범위에서 흡광피크를 나타낸다. 이들 화합물은 상기 파장 범위의 자외선을 흡수하여 π→π* 전이를 일으킨다. 따라서, 해당 범위에서, 나아가 최대흡수파장 근처의 파장에서 흡광도를 측정함으로써 이들 물질의 존재 및/또는 농도를 확인할 수 있다.
이를 구현하기 위하여, 상기 HPLC는 검출기로서 UV-Vis 분광광도계를 구비할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 분석방법은 내부표준물질을 포함하여 수행함으로써 물질의 미량분석은 물론 정량분석이 가능한 것이 특징이다. 본 발명의 용어, "내부표준물질(internal standard)"은 분석하고자 하는 화합물과 화학적으로 유사한 물질이나 시료 중에 자연히 존재할 것으로 기대되지 않는 물질을 선택하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 분석하고자 하는 화합물과 동일한 작용기, 끓는 점 및 활성을 갖는 화합물을 선택할 수 있다. 나아가, 상업적 이용 가능성, 적용되는 분석 방법 및 비용 등을 종합적으로 고려하여 선택하는 것이 바람직하다. 예컨대, 상기 내부표준물질로 수소대신 중수소가 치환된 니트로사민을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적인 내부표준물질의 종류에 대해서는 이하 보다 구체적으로 예시한다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 분석방법은 정성적 또는 정량적 분석이 모두 가능하다.
본 발명의 용어, "순상(normal phase) HPLC"는 극성 컬럼과 이동상으로서 비극성 용매를 이용하여 분석물질 중의 작용기의 극성도에 의해 분리하는 방식의 HPLC를 의미한다. 통상 순상 HPLC에 이용되는 컬럼은 실라놀기(Si-OH)를 갖는 실리카겔 또는 상기 실리카겔의 실라놀기에 시아노기(-CN) 또는 아미노기(-NH2)가 도입된 실리카겔이 충진될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 순상 HPLC에서의 물질 분리는 컬럼 충진물질의 작용기와 분석물질 간의 상호작용에 의해 달성될 수 있다. 순상 HPLC를 이용한 분석물질의 분리는 시료의 극성 정도에 따라 이루어지며, 그 분리 정도는 컬럼의 충진물질의 종류, 입자크기, 기공율 및/또는 기공크기, 이동상으로 사용하는 용매의 종류 및/또는 혼합용매의 경우 용매들의 비율, 유량, 온도 및/또는 주입량에 대해 의존적으로 변화할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 분석방법에 사용되는 상기 순상 HPLC는 실리카 컬럼을 구비할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예컨대, 본 발명의 분석방법은 비극성 유기용매를 포함하는 이동상을 사용하여 용리시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 상기 유기용매는 비극성 용매인 헥산 또는 이소옥탄일 수 있다. 또는 상기 비극성 용매에 에탄올 등의 저급알코올을 소량 함유하는 혼합용매를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예컨대, 본 발명의 분석방법은 컬럼 온도에 의해 영향을 거의 받지 않는다. 본 발명의 분석방법에 있어서, 컬럼의 온도는 별도의 제약 없이 15 내지 40℃, 예컨대, 실온 상태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예컨대, 본 발명의 분석방법에 있어서, 샘플러의 온도는 0 내지 10℃로 유지할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 샘플러는 시료 주입장치의 샘플 바이알이 위치하는 부분을 지칭한다. 상기 샘플러의 온도에는 특별한 제약이 없으나, 시료 용액의 용매의 비점을 고려하여 선택할 수 있다. 구체적으로, 용매의 휘발에 의해 농도가 변화하는 것을 예방할 수 있는 한, 샘플러의 온도 조건은 제한되지 않는다. 예컨대, 본 발명의 일 실시예에서는 용매로서 상대적으로 낮은 비점의 헥산을 사용하였는 바, 이를 고려하여 5℃로 유지하였으나, 이에 제한되지 않는다.
예컨대, 본 발명의 분석방법을 적용할 수 있는 상기 의약품은 니트로사민류를 포함하거나 공정 중에 니트로사민이 생성될 수 있는 의약품을 제한없이 포함할 수 있다. 예컨대, 칸데사르탄(candesartan), 이르베사르탄(irbesartan), 로사르탄(losartan), 발사르탄(valsartan), 피마사르탄(fimasartan), 올메사르탄(olmesartan), 메트포르민(metformin), 라니티딘(ranitidine) 및 니자티딘(nizatidine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 물질을 유효성분으로 포함하는 원료물질 또는 완제의약품일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이때, 분석하고자 하는 물질인 니트로사민은 N-니트로소디메틸아민(N-nitrosodimethylamine; NDMA), N-니트로소디에틸아민(N-nitrosodiethylamine; NDEA), ,N-니트로소메틸에틸아민(N-nitrosomethylethylamine; NMEA), N-니트로소디프로필아민(N-nitrosodipropylamine; NDPA), N-니트로소디부틸아민(N-nitrosodibutylamine; NDBA), N-니트로소피롤리딘(N-nitrosopyrrolidine; NPYR), N-니트로소피페리딘(N-nitrosopiperidine; NPIP), N-니트로소몰포린(N-nitrosomorpholine; NMOR), N-니트로디이소프로필아민(N-nitrosodiisopropylamine; DIPNA), N-니트로에틸이소프로필아민(N-nitrosoethylisopropylamine; EIPNA), 및 N-니트로소-N-메틸-4-아미노부티르산(N-nirtoso-N-methyl-4-aminobutyricacid; NMBA)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 물질일 수 있다.
예컨대, 상기 니트로사민의 분석을 위한 내부표준물질로는 N-니트로소디메틸-d6-아민(N-Nitrosodimethyl-d6-amine; NDMA-d6), N-니트로소디에틸-d10-아민(N-nitrosodiethyl-d10-amine; NDEA-d10), N-니트로소메틸에틸-d3-아민(N-nitrosomethylethyl-d3-amine; NMEA-d3), N-니트로소디-n-프로필-d14-아민(N-nitrosodi-n-propyl-d14-amine; NDPA-d14), N-니트로소디-n-부틸-d18-아민(N-nitrosodi-n-butyl-d18-amine; NDBA-d18), N-니트로소피롤리딘-d8(N-nitrosopyrrolidine-d8; NPYR-d8), N-니트로소피페리딘-d10(N-nitrosopiperidine-d10; NPIP-d10), 및 N-니트로소몰포린-d8(N-nitrosomorpholine-d8; NMOR-d8)로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 분석방법에 사용되는 상기 실리카 컬럼은 길이 150 내지 500 mm의 원통형 컬럼 또는 이에 상응하는 조건의 컬럼을 하나 또는 2개 이상을 직렬로 연결하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 컬럼의 길이가 짧은 경우 분석하고자 하는 물질과 내부표준물질의 피크가 충분히 분리되지 못할 수 있는 한편, 컬럼의 길이가 길어지는 경우, 분석에 상당한 시간이 소요될 수 있어 경제적이지 못하며, 오히려 피크의 테일링으로 인해 대칭계수가 높아질 수 있다.
이때, 상기 실리카 컬럼은 평균 직경 1 내지 60 μm, 구체적으로, 2 내지 20 μm, 또는 3 내지 10 μm 크기의 입자가 충진된 것일 수 있다. 상기 실리카 컬럼은 내부 직경 2 내지 10 mm, 구체적으로, 3 내지 7 mm 또는 4 내지 6 mm의 원통형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 충진된 입자의 크기가 작거나, 컬럼의 직경이 작은 경우 띠 넓어짐이 발생할 수 있어 로딩 가능한 시료의 양이 제한될 수 있으며, 충진된 입자의 크기가 크거나 컬럼의 직경이 큰 경우에는 시료의 전개가 빨라 원하는 수준의 분리도를 달성하기 어려울 수 있다. 따라서, 컬럼에 충진되는 입자의 크기, 및 컬럼의 직경은 컬럼의 길이와 함께 종합적으로 고려하여 원하는 분리도 및/또는 검출한계를 달성할 수 있도록 상호 유기적으로 결정할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예컨대, 상기 컬럼은 원하는 규격으로 주문제작하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것을 아니며, 상용화된 제품을 단독으로 또는 직렬로 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 제2양태는 3 이상의 상이한 기지의 농도로 검출하고자 하는 표준물질을 포함하고, 정해진 동일한 농도로 내부표준물질을 포함하는 복수의 표준 용액을 준비하는 제1단계; 제1양태의 분석방법을 적용하여 측정된 값으로부터 검정곡선을 작성하는 제2단계; 상기 표준물질을 포함하는 것으로 의심되는 미지 시료 용액에 제1양태의 분석방법을 적용하여 데이터를 수집하는 제3단계; 및 상기 제3단계로부터 수집한 데이터를 제2단계로부터 획득한 검정곡선에 대입하여 시료 용액 중의 표준물질의 농도를 산출하는 제4단계;를 포함하는, 미지 시료 용액 중의 표준물질의 정량분석방법을 제공한다.
예컨대, 상기 미지 시료는 니트로사민류를 포함하거나 공정 중에 니트로사민이 생성될 수 있는 의약품, 예컨대, 칸데사르탄(candesartan), 이르베사르탄(irbesartan), 로사르탄(losartan), 발사르탄(valsartan), 피마사르탄(fimasartan), 올메사르탄(olmesartan), 메트포르민(metformin), 라니티딘(ranitidine) 및 니자티딘(nizatidine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 물질을 유효성분으로 포함하는 원료물질 또는 완제의약품일 수 있다. 상기 미지 시료는 이상의 원료물질 또는 완제의약품을 그 함량을 고려하여 정해진 분량의 용매에 용해시켜 준비한 용액 상태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이때, 검출하고자 하는 표준물질은 N-니트로소디메틸아민(N-nitrosodimethylamine; NDMA), N-니트로소디에틸아민(N-nitrosodiethylamine; NDEA), ,N-니트로소메틸에틸아민(N-nitrosomethylethylamine; NMEA), N-니트로소디프로필아민(N-nitrosodipropylamine; NDPA), N-니트로소디부틸아민(N-nitrosodibutylamine; NDBA), N-니트로소피롤리딘(N-nitrosopyrrolidine; NPYR), N-니트로소피페리딘(N-nitrosopiperidine; NPIP), N-니트로소몰포린(N-nitrosomorpholine; NMOR), N-니트로디이소프로필아민(N-nitrosodiisopropylamine; DIPNA), N-니트로에틸이소프로필아민(N-nitrosoethylisopropylamine; EIPNA), 및 N-니트로소-N-메틸-4-아미노부티르산(N-nirtoso-N-methyl-4-aminobutyricacid; NMBA)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 니트로사민일 수 있다.
이때 사용가능한 내부표준물질은 N-니트로소디메틸-d6-아민(N-Nitrosodimethyl-d6-amine; NDMA-d6), N-니트로소디에틸-d10-아민(N-nitrosodiethyl-d10-amine; NDEA-d10), N-니트로소메틸에틸-d3-아민(N-nitrosomethylethyl-d3-amine; NMEA-d3), N-니트로소디-n-프로필-d14-아민(N-nitrosodi-n-propyl-d14-amine; NDPA-d14), N-니트로소디-n-부틸-d18-아민(N-nitrosodi-n-butyl-d18-amine; NDBA-d18), N-니트로소피롤리딘-d8(N-nitrosopyrrolidine-d8; NPYR-d8), N-니트로소피페리딘-d10(N-nitrosopiperidine-d10; NPIP-d10), 및 N-니트로소몰포린-d8(N-nitrosomorpholine-d8; NMOR-d8)로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
예컨대, 본 발명의 정량분석방법에 있어서, 제1단계의 표준 용액은 표준물질 및 내부표준물질을 0.1 내지 100 ng/mL 농도로 포함있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 범위 내에서 선택되는 상대적으로 높은 농도로 표준물질을 함유하는 원액을 준비한 후 일정한 비율로 반복하여 희석함으로써 정해진 비율로 희석된 일련의 용액을 준비하거나, 원액을 정해진 상이한 분량으로 내부표준물질 및 용매와 혼합하여 조절된 농도로 표준물질을 포함하는 용액을 준비할 수 있으나, 그 방법은 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 정량분석방법에 있어서, 제2단계로부터 획득한 검정곡선은 1 내지 50 ng/mL 범위에서 0.998 이상의 결정계수(r2)를 나타내며, 표준용액 1 ng/mL에 대한 신호 대 잡음비(signal-to-noise ratio; S/N ratio)가 10 이상을 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명의 정량분석방법은 표준 용액 5 ng/mL에 대해 2.0 이하의 피크 대칭계수를 나타내는 것이 특징이다.
나아가, 본 발명의 정량분석방법은 표준 용액 5 ng/mL에 대해 6회 반복 측정시 내부표준물질의 피크면적에 대한 표준물질의 피크면적의 상대표준편차는 5.0% 이하의 재현성 있는 결과를 제공할 수 있다.
이는, 본 발명의 정량분석방법이 한국 식약처에서 요구하는 의약품 중의 니트로사민 검출 방법에 대한 시스템적합성 기준을 충족함을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 정량분석방법은 메트포르민을 비롯한 의약품 중의 니트로사민의 정량분석에 적용될 수 있다.
또한, 본 발명의 분석방법에 있어서 제2단계로부터 측정된 크로마토그램에서 표준물질과 내부표준물질의 피크는 1.5 이상의 분리도를 나타낼 수 있다.
또한, 전술한 바와 같이, 본 발명의 정량분석방법에 의해 도출된 검정곡선은 우수한 선형성을 나타내는 바, 1 ng/mL까지의 낮은 검출한계를 갖는 것이 특징이다. 따라서, 다른 의약품과 달리, 1 ng/mL의 낮은 정량한계를 요구하는 메트포르민 등의 완제의약품 시험법에 대한 기준을 충족시킬 수 있다. 이는 본 발명의 정량분석방법이 가장 까다로운 시험법을 요구하는 메트포르민은 물론 전술한 다양한 의약품 중의 니트로사민의 정량분석에 사용될 수 있음을 나타낸다.
본 발명의 제3양태는 3 이상의 상이한 기지의 농도로 검출하고자 하는 1종 이상의 니트로사민을 포함하고, 정해진 동일한 농도로 상기 니트로사민에 대한 내부표준물질을 포함하는 복수의 표준 용액을 준비하는 제1단계; 제1양태의 분석방법을 적용하여 측정된 값으로부터 검정곡선을 작성하는 제2단계; 니트로사민을 포함할 가능성이 있는 의약품의 생산 공정으로부터 임의의 시료를 선택하여 준비한 시료 용액에 제1양태의 분석방법을 적용하여 데이터를 수집하는 제3단계; 상기 제3단계로부터 수집한 데이터를 제2단계로부터 획득한 검정곡선에 대입하여 임의로 선택된 의약품 시료 용액 중의 나트로사민의 농도를 산출하는 제4단계; 및 상기 제4단계로부터 산출된 나트로사민의 농도가 해당 의약품에 허용된 한계치를 초과하는 경우 해당 공정으로부터 생산된 의약품을 불량으로 판단하는 제5단계;를 포함하는, 의약품의 품질관리방법을 제공한다.
본 발명의 품질관리방법을 적용할 수 있는 대상 의약품은 상기 예시한 바와 같다.
예컨대, 본 발명의 품질관리방법은 상기 의약품의 원료물질 또는 완제의약품의 생산 공정에 제한없이 적용할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 품질관리방법은 니트로사민류를 포함하거나 공정 중에 니트로사민이 생성될 수 있는 의약품의 생산 공정에 제한없이 적용할 수 있다. 예컨대, 칸데사르탄(candesartan), 이르베사르탄(irbesartan), 로사르탄(losartan), 발사르탄(valsartan), 피마사르탄(fimasartan), 올메사르탄(olmesartan), 메트포르민(metformin), 라니티딘(ranitidine) 및 니자티딘(nizatidine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 물질을 유효성분으로 포함하는 원료물질 또는 완제의약품의 생산 공정에 적용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 분석방법은 UV-Vis 분광광도계와 결합된 순상 HPLC를 이용하여 내부표준물질과 함께 분석함으로써, 질량분석기와 같은 고가의 장비를 사용하지 않고도 낮은 정량한계로 의약품 중의 니트로사민을 정성적 및/또는 정량적으로 분석할 수 있으므로, 상기 분석방법은 의약품 생산 공정 등에서 원료물질 및/또는 완제의약품의 품질관리에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 NDMA 정량분석을 위한 검정곡선의 예를 나타낸 도이다.
도 2는 1 ng/mL 농도의 표준용액에 대한 크로마토그램으로부터의 신호 대 잡음비 산출을 예시한 도이다.
도 3은 5 ng/mL 농도의 표준용액에 대한 크로마토그램으로부터의 대칭계수 산출을 예시한 도 이다.
도 4는 5 ng/mL 농도의 표준용액에 대한 크로마토그램에서 표준용액과 내부표준용액의 분리도 산출을 예시한 도이다.
도 5는 단일 실리카 컬럼과 이동상으로 이소옥탄을 사용하여 5 ng/mL 농도의 NDMA 및 10 ng/mL 농도의 내부표준용액 NDMA-d6을 분리하는 크로마토그램을 나타낸 도이다.
도 6은 단일 실리카 컬럼과 이동상으로 헥산을 사용하여 5 ng/mL 농도의 NDMA 및 10 ng/mL 농도의 NDMA-d6을 분리하는 크로마토그램을 나타낸 도이다.
도 7은 2개 실리카 컬럼과 이동상으로 이소옥탄을 사용하여 50 ng/mL 농도의 NDMA 및 10 ng/mL 농도의 NDMA-d6을 분리하는 크로마토그램을 나타낸 도이다.
도 8은 2개 실리카 컬럼과 이동상으로 헥산을 사용하여 10 ng/mL 농도의 NDMA-d6 존재 하에 각각 10 ng/mL 농도의 NDMA와 NEMA를 동시에 분리하는 크로마토그램을 나타낸 도이다.
도 9는 이동상으로 수용성 용매인 메탄올을 이용하여 수행한 역상 분석법에 의해 측정한 NDMA 표준용액 및 메트포르민 용액에 대한 크로마토그램을 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 효과를 보다 더 구체적으로 설명하고자 하나, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: NDMA 용액(표준용액)의 제조
먼저, NDMA 표준품 20 mg을 취하여 100 mL 플라스크에 넣고 헥산을 넣어 표선하여 200 μg/mL 농도의 NDMA 용액(표준원액 A)을 제조하였다.
다음으로, 상기 표준원액 A 5 mL을 취하여 50 mL 플라스크에 넣고 헥산을 넣어 표선하여 20 μg/mL 농도의 NDMA 용액(표준원액 B)을 제조하였다.
마지막으로, 상기 표준원액 B 5.0 mL을 취하여 100 mL 플라스크에 넣고 헥산을 넣어 표선하여 1 μg/mL 농도의 NDMA 용액(표준원액 C)을 제조하였다.
제조예 2: NDMA-d6 용액(내부표준용액)의 제조
NDMA 표준품 대신에 NDMA-d6 표준품을 사용하는 것을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로 일련의 희석을 통해, 각각 200, 20, 및 1 μg/mL 농도의 NDMA-d6 용액(내부표준원액 A 내지 C)을 제조하였다.
제조예 3: 직전성 용액의 제조
하기 표 1에 개시한 분량으로 표준원액 C 및 내부표준원액 C를 취하고 헥산으로 표선하여 최종농도 1 내지 50 ng/mL의 직선성 표준용액을 준비하였다.
직선성 표준용액 조제(mL) 최종농도
(ng/mL)
표준원액 C 내부표준원액 C 최종부피
1 0.2 2.0 200 1
2 0.3 2.0 200 1.5
3 1.0 2.0 200 5
4 2.0 2.0 200 10
5 4.0 2.0 200 20
6 10.0 2.0 200 50
실시예 1: HPLC 구동 조건
상기 제조예 3에서 준비한 일련의 직선성 표준용액에 대해 하기 표 2의 조건으로 HPLC 분석을 수행하고, 그 결과로부터 도출한 검정곡선을 도 1에 나타내었다.
이동상 이소옥탄:에탄올 혼합액(97:3)
컬럼 Kromasil SIL 100-5SIL(4.6 mm×500 mm, 5.0 μm)
컬럼온도 실온
검출파장 247 nm
유량 1.0 mL/min
주입량 1200 μL
샘플러온도 5℃
실시예 2: 시스템적합성 확인
상기 실시예 1에 따라 일련의 직선성 표준용액에 대해 작성한 도 1의 검정곡선을 최적화하여 1 내지 50 nm/mL 범위의 검량선에서 0.9999의 결정계수(r2)를 얻었으며, 이로부터 식약청에서 요구하는 0.998 이상의 기준을 충족함을 확인하였다.
나아가, 1 ng/mL 농도의 표준용액에 대해 6회 반복하여 분석을 수행하고, 측정된 크로마토그램의 예를 도 2에 나타내었다. 상기 크로마토그램으로부터 신호 대 잡음비(signal-to-noise ratio; S/N ratio)를 산출하여 하기 표 3에 나타내었다. 표 3에 나타난 바와 같이, 평균 12의 S/N 비를 나타냄은 물론 6회의 개별 측정에 대한 S/N 비 모두 식약청에서 요구하는 기준인 10 이상의 값을 나타내었다.
1회 2회 3회 4회 5회 6회 평균
12.1 12.8 12.1 11.9 12.8 10.4 12.0
또한, 5 ng/mL 농도의 표준용액에 대해 측정된 크로마토그램으로부터 NDMA 피크 대칭계수를 산출하여 하기 표 4에 나타내었다. 첫회 측정된 크로마토그램에 대한 대칭계수 산출 방식을 도 3에 예시하였다. 표 4에 나타난 바와 같이, 측정된 대칭계수는 모두 식약청에서 요구하는 기준인 2.0 이하의 값을 나타내었다.
1회 2회 3회 평균
1.10857 1.14804 1.15385 1.13682
아울러, 5 ng/mL 농도의 표준용액에 대해 6회 반복하여 분석을 수행하고, 내부표준물질의 피크면적에 대한 NDMA 피크면적의 상대표준편차를 산출하여 하기 표 5에 나타내었다. 표 5에 나타난 바와 같이 산출된 피크면적비의 상대표준편차는 1.62%로 식약청에서 요구하는 기준인 5.0% 이하를 충족하였다.
횟수 NDMA 피크면적 NDMA-d6 피크면적 피크면적비
(NDMA/NDMA-d6)
1 15.59936 26.09632 0.60
2 15.83425 26.19047 0.60
3 15.41694 25.52828 0.60
4 14.25294 22.85893 0.62
5 14.90912 24.19378 0.62
6 14.90467 24.15161 0.62
평균 0.61
표준편차 0.01
상대표준편차 1.62
마지막으로, 5 ng/mL 농도의 표준용액에 대해 측정된 크로마토그램으로부터 표준용액과 내부표준용액의 분리도를 도 4와 같이 산출하였으며, 그 결과 계산된 분리도는 2.35로 공정서에서 요구되는 조건인 1.5 이상을 만족하였다.
실시예 3: 이동상의 선택에 따른 크로마토그램 및 분리도
3-1. 이소옥탄
5 ng/mL 농도의 NDMA 및 10 ng/mL 농도의 내부표준물질 NDMA-d6을 헥산으로 희석한 시료를 이동상으로 이소옥탄을 사용하여 실시예 1의 분석조건으로 분리하였다. 측정된 크로마토그램은 도 5에 나타내었으며, 이로부터 산출된 분리도는 2.05였다.
3-2. 헥산
이동상으로 헥산을 사용하는 것을 제외하고는 상이 3-1과 동일한 방법으로 시료를 분석하였다. 측정된 크로마토그램은 도 6에 나타내었으며, 이로부터 산출된 분리도는 1.71이었다.
실시예 4: 컬럼 수에 따른 크로마토그램 및 분리도
50 ng/mL 농도의 NDMA 및 10 ng/mL 농도의 내부표준물질 NDMA-d6을 헥산으로 희석한 시료를 실시예 1과 유사한 분석조건으로 분리하되 총 컬럼 길이가 동일하도록 250 mm 길이의 실리카 컬럼 2개를 직렬 연결하여 사용하고, 이동상으로는 이소옥탄을 사용하였다. 측정된 크로마토그램은 도 7에 나타내었으며, 이로부터 산출된 분리도는 2.37이었다. 상기 분리도 값은 500 mm 길이의 단일 실리카 컬럼을 사용한 실시예 3에 비해 증가된 것으로, 이는 2개 이상의 컬럼을 직렬 연결하여 사용하더라도 총 컬럼 길이가 동일한 경우 동등 이상의 분리도를 달성할 수 있음을 나타내는 것이며, 따라서 원하는 분리도를 달성하기 위하여 시판되는 컬럼을 조합하여 사용할 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 5: 복수의 표준물질을 함유하는 시료에 대한 크로마토그램 및 분리도
각각 10 ng/mL 농도의 NDEA 및 NDMA와 10 ng/mL 농도의 내부표준물질 NDMA-d6을 헥산으로 희석한 시료를 실시예 4에서와 같이 직렬 연결한 2개의 실리카 컬럼 및 이동상으로 헥산을 사용하여 실시예 1의 분석조건으로 분리하였다. 측정된 크로마토그램은 도 8에 나타내었다. 각 물질은 10 ng/mL 농도에서 정량적으로 검출이 확인되었다. 이는 본 발명의 검출방법이 복수의 표준물질도 동시에 정량적으로 분석할 수 있음을 나타낸다.
비교예 1: 수용성 용매를 이용한 역상 분석법
이동상으로 수용성 용매인 메탄올을 이용하여 100 ng/mL 농도로 메탄올에 희석한 NDMA 시료를 분석하고, 측정된 크로마토그램을 도 9에 나타내었다. 동일한 조건에서 메트포르민에 대한 분석을 실시하여 그 결과를 도 9에 함께 나타내었다. 도 9에 나타난 바와 같이, 이동상으로서 수용성 용매를 이용하는 경우 표준용액 중의 NDMA 피크의 검출은 가능하였으나, 메트포르민 제제에 적용시 수용성 부형제에 의한 다양한 간섭이 심하게 발생하여 검출대상물질인 NDMA 피크의 분리가 불가하였다. 이는 수용성 용매를 이용한 역상 분석법으로는 NDMA 특이성을 확인하기 어려움을 나타낸다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (21)

  1. 내부표준물질 존재 하에 순상 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography; HPLC)를 수행하는 단계를 포함하는, 의약품 중 니트로사민(nitrosamines)의 분석방법으로서,
    상기 HPLC는 검출기로서 UV-Vis 분광광도계를 구비한 것이고,
    상기 검출기는 200 내지 270 nm 범위에서 선택되는 파장에서의 흡광도를 측정하여 검출하는 것이며,
    상기 니트로사민은 N-니트로소디메틸아민(N-nitrosodimethylamine; NDMA), N-니트로소디에틸아민(N-nitrosodiethylamine; NDEA), ,N-니트로소메틸에틸아민(N-nitrosomethylethylamine; NMEA), N-니트로소디프로필아민(N-nitrosodipropylamine; NDPA), N-니트로소디부틸아민(N-nitrosodibutylamine; NDBA), N-니트로소피롤리딘(N-nitrosopyrrolidine; NPYR), N-니트로소피페리딘(N-nitrosopiperidine; NPIP), N-니트로소몰포린(N-nitrosomorpholine; NMOR), N-니트로디이소프로필아민(N-nitrosodiisopropylamine; DIPNA), N-니트로에틸이소프로필아민(N-nitrosoethylisopropylamine; EIPNA), 및 N-니트로소-N-메틸-4-아미노부티르산(N-nirtoso-N-methyl-4-aminobutyricacid; NMBA)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 물질인 것이고,
    1 ng/mL까지의 낮은 검출한계를 갖는, 의약품 중 니트로사민(nitrosamines)의 분석방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    내부표준물질로 수소대신 중수소가 치환된 니트로사민을 사용하는 것인, 분석방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 분석은 정성적 또는 정량적인 것인, 분석방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 순상 HPLC는 실리카 컬럼을 구비한 것인, 분석방법.
  7. 제1항에 있어서,
    비극성 유기용매를 포함하는 이동상을 사용하여 용리시키는 것인, 분석방법.
  8. 삭제
  9. 제4항에 있어서,
    상기 내부표준물질은 N-니트로소디메틸-d6-아민(N-Nitrosodimethyl-d6-amine; NDMA-d6), N-니트로소디에틸-d10-아민(N-nitrosodiethyl-d10-amine; NDEA-d10), N-니트로소메틸에틸-d3-아민(N-nitrosomethylethyl-d3-amine; NMEA-d3), N-니트로소디-n-프로필-d14-아민(N-nitrosodi-n-propyl-d14-amine; NDPA-d14), N-니트로소디-n-부틸-d18-아민(N-nitrosodi-n-butyl-d18-amine; NDBA-d18), N-니트로소피롤리딘-d8(N-nitrosopyrrolidine-d8; NPYR-d8), N-니트로소피페리딘-d10(N-nitrosopiperidine-d10; NPIP-d10), 및 N-니트로소몰포린-d8(N-nitrosomorpholine-d8; NMOR-d8)로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 분석방법.
  10. 3 이상의 상이한 기지의 농도로 검출하고자 하는 표준물질을 포함하고, 정해진 동일한 농도로 내부표준물질을 포함하는 복수의 표준 용액을 준비하는 제1단계;
    제1항, 제4항 내지 제7항, 및 제9항 중 어느 한 항의 분석방법을 적용하여 측정된 값으로부터 검정곡선을 작성하는 제2단계;
    상기 표준물질을 포함하는 것으로 의심되는 미지 시료 용액에 제1항, 제4항 내지 제7항, 및 제9항 중 어느 한 항의 분석방법을 적용하여 데이터를 수집하는 제3단계; 및
    상기 제3단계로부터 수집한 데이터를 제2단계로부터 획득한 검정곡선에 대입하여 시료 용액 중의 표준물질의 농도를 산출하는 제4단계;
    를 포함하는, 미지 시료 용액 중의 표준물질의 정량분석방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 검출하고자 하는 표준물질은 N-니트로소디메틸아민(N-nitrosodimethylamine; NDMA), N-니트로소디에틸아민(N-nitrosodiethylamine; NDEA), ,N-니트로소메틸에틸아민(N-nitrosomethylethylamine; NMEA), N-니트로소디프로필아민(N-nitrosodipropylamine; NDPA), N-니트로소디부틸아민(N-nitrosodibutylamine; NDBA), N-니트로소피롤리딘(N-nitrosopyrrolidine; NPYR), N-니트로소피페리딘(N-nitrosopiperidine; NPIP), N-니트로소몰포린(N-nitrosomorpholine; NMOR), N-니트로디이소프로필아민(N-nitrosodiisopropylamine; DIPNA), N-니트로에틸이소프로필아민(N-nitrosoethylisopropylamine; EIPNA), 및 N-니트로소-N-메틸-4-아미노부티르산(N-nirtoso-N-methyl-4-aminobutyricacid; NMBA)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 니트로사민인 것인, 정량분석방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 내부표준물질은 N-니트로소디메틸-d6-아민(N-Nitrosodimethyl-d6-amine; NDMA-d6), N-니트로소디에틸-d10-아민(N-nitrosodiethyl-d10-amine; NDEA-d10), N-니트로소메틸에틸-d3-아민(N-nitrosomethylethyl-d3-amine; NMEA-d3), N-니트로소디-n-프로필-d14-아민(N-nitrosodi-n-propyl-d14-amine; NDPA-d14), N-니트로소디-n-부틸-d18-아민(N-nitrosodi-n-butyl-d18-amine; NDBA-d18), N-니트로소피롤리딘-d8(N-nitrosopyrrolidine-d8; NPYR-d8), N-니트로소피페리딘-d10(N-nitrosopiperidine-d10; NPIP-d10), 및 N-니트로소몰포린-d8(N-nitrosomorpholine-d8; NMOR-d8)로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 정량분석방법.
  13. 제10항에 있어서,
    제1단계의 표준 용액은 표준물질 및 내부표준물질을 0.1 내지 100 ng/mL 농도로 포함하는 것인, 정량분석방법.
  14. 제10항에 있어서,
    제2단계로부터 획득한 검정곡선은 1 내지 50 ng/mL 범위에서 0.998 이상의 결정계수(r2)를 나타내며, 표준용액 1 ng/mL에 대한 신호 대 잡음비(signal-to-noise ratio; S/N ratio)가 10 이상인 것인, 정량분석방법.
  15. 제10항에 있어서,
    표준 용액 5 ng/mL에 대해 2.0 이하의 피크 대칭계수를 나타내는 것인, 정량분석방법.
  16. 제10항에 있어서,
    표준 용액 5 ng/mL에 대해 6회 반복 측정시 내부표준물질의 피크면적에 대한 표준물질의 피크면적의 상대표준편차는 5.0% 이하인 것인, 정량분석방법.
  17. 제10항에 있어서,
    제2단계로부터 측정된 크로마토그램에서 표준물질과 내부표준물질의 피크는 1.5 이상의 분리도를 나타내는 것인, 정량분석방법.
  18. 제10항에 있어서,
    1 ng/mL까지의 낮은 검출한계를 갖는 것인, 정량분석방법.
  19. 3 이상의 상이한 기지의 농도로 검출하고자 하는 1종 이상의 니트로사민을 포함하고, 정해진 동일한 농도로 상기 니트로사민에 대한 내부표준물질을 포함하는 복수의 표준 용액을 준비하는 제1단계;
    제1항, 제4항 내지 제7항 및 제9항 중 어느 한 항의 분석방법을 적용하여 측정된 값으로부터 검정곡선을 작성하는 제2단계;
    니트로사민을 포함할 가능성이 있는 의약품의 생산 공정으로부터 임의의 시료를 선택하여 준비한 시료 용액에 제1항, 제4항 내지 제7항, 및 제9항 중 어느 한 항의 분석방법을 적용하여 데이터를 수집하는 제3단계;
    상기 제3단계로부터 수집한 데이터를 제2단계로부터 획득한 검정곡선에 대입하여 임의로 선택된 의약품 시료 용액 중의 나트로사민의 농도를 산출하는 제4단계; 및
    상기 제4단계로부터 산출된 나트로사민의 농도가 해당 의약품에 허용된 한계치를 초과하는 경우 해당 공정으로부터 생산된 의약품을 불량으로 판단하는 제5단계;
    를 포함하는, 의약품의 품질관리방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 의약품은 원료물질 또는 완제의약품인 것인, 품질관리방법.
  21. 제19항에 있어서,
    상기 의약품은 칸데사르탄(candesartan), 이르베사르탄(irbesartan), 로사르탄(losartan), 발사르탄(valsartan), 피마사르탄(fimasartan), 올메사르탄(olmesartan), 메트포르민(metformin), 라니티딘(ranitidine) 및 니자티딘(nizatidine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 물질을 유효성분으로 포함하는 것인, 품질관리방법.
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