KR102560164B1 - mRNA 발현 증진을 위한 UTR 서열 및 이를 포함하는 mRNA 서열 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다형성 β-카테닌의 UTR을 포함하는 발현 효율이 증진된 mRNA 분자에 관한 것이다. 본 발명의 mRNA 분자, 핵산 분자, 발현 컨스트럭트 및/또는 발현 벡터를 이용하는 경우, 목적하는 단백질의 번역 효율을 효과적으로 증진시킬 수 있다. 또한 외부 유입 mRNA의 발현양을 조절하여 향후 mRNA 백신으로 활용할 수 있다.

Description

mRNA 발현 증진을 위한 UTR 서열 및 이를 포함하는 mRNA 서열{UTR sequence for enhancing mRNA expression and mRNA sequence comprising the same}

본 발명은 mRNA 발현 증진을 위한 UTR 서열 및 이를 포함하는 mRNA 서열에 관한 것이다.

mRNA(messenger RNA)는 RNA 분자가 단백질을 생산하는데 있어서 '설계도'와 같은 역할을 한다. mRNA는 DNA 원형으로부터 전사되고, 합성될 단백질을 코딩하는 코딩 영역(coding region)을 필수적으로 포함하며, 비번역 영역(Untranslated Region) (UTR)을 포함할 수 있다. 비번역 영역이란, mRNA의 개시 코돈의 업스트림(upstream) 및 정지 코돈의 다운스트림(downstream)에 있는 부위로서, 단백질로 번역되지 않는 서열을 의미한다. 일반적인 진핵세포 mRNA는 5’과 3’에 UTR을 가진다. UTR은 mRNA의 분해 또는 번역을 조절하여 mRNA의 안정성 및 발현에 중요한 영향을 미치며, 궁극적으로 단백질의 양 조절에 중요한 역할을 한다. 특히, 3’UTR은 mRNA의 발현과 mRNA의 안정성 조절뿐만 아니라, mRNA의 세포내 국소화(localization)에도 기여한다. 한 유전자로부터 선택적 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 여러가지 형태의 3’UTR 이형체가 생성될 수 있으나, 이러한 그룹에 해당되는 유전자의 숫자는 매우 적다. 이렇게 한 유전자로부터 만들어진 multi-UTR 이형체 별로 발현의 효율 증진에 미치는 영향에 대한 연구는 보고된 바가 없다.

한편, 많은 연구들을 통해 Wnt 신호 전달 경로 (signaling pathway)의 구성 (component)들과 신호전달 과정이 밝혀지게 되었다 (Bryan T. MacDonald, 2009). Wnt 신호전달에서 선도적인 역할을 하고 있는 Hubrecht Institute의 Dr. Hans Clevers 연구팀에서 Canonical Wnt pathway를 발표하면서, 핵심 조절자(key regulator)인 β-카테닌(β-catenin)이 더욱 집중 조명을 받게 되었다. β-카테닌은 세포 내에서 다양한 기능을 수행하는 다중-기능성 분자(multi-functional molecule)로서 인간 CTNNB1 유전자로부터 발현되는 단백질이다(Tomas Valenta and Basler, 2012). β-카테닌(β-catenin)은 길이가 다른 3개의 3’UTR을 가질 수 있다. 이러한 β-카테닌의 mRNA의 3’UTR의 이형체에 따른 단백질 발현 양상의 변화에 관해서는 종래 연구된 바가 없다.

본 발명자들은 이와 같이 종래 연구된 바 없는 β-카테닌 mRNA의 UTR 유형 별 단백질 발현 효율에 관한 연구를 수행하였다. 나아가, β-카테닌 mRNA의 3’UTR 이형체를 단편화하여 3’UTR 이형체 중에서도 발현 효율에 중요한 영향을 미치는 요소를 확인하기 위한 연구를 수행하였다. 이를 통하여 본 발명자들은 발현 효율이 증진된 mRNA 플랫폼 시스템을 제안하고자 한다.

대한민국 등록특허 제10-1769231호 (2017.08.10. 등록)

본 발명자들은 mRNA의 번역 효율을 증진시킬 수 있는 방안을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 β-카테닌 mRNA의 5’UTR 및 소정의 3’UTR을 포함하는 mRNA 서열의 번역 효율이 유의하게 증진될 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 번역 효율이 증진된 mRNA 분자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 mRNA 분자를 암호화하는 핵산 분자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 발현 컨스트럭트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현 벡터를 포함하는 분리된 숙주세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 목적 단백질의 발현 효율이 증진된 mRNA 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 목적 단백질을 코딩하는 코딩 영역; (b) 상기 코딩 영역의 5’말단에 결합된 β-카테닌의 5’UTR(untranslated region, 비번역 영역); 및 (c) 상기 코딩 영역의 3’말단에 결합된 β-카테닌의 3’UTR 또는 이의 단편을 포함하는 mRNA 분자를 제공한다.

본 발명자들은 mRNA의 번역(translation) 효율을 증진시킬 수 있는 방안을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 β-카테닌 mRNA의 5’UTR 및 소정의 3’UTR을 포함하는 mRNA 서열의 번역 효율이 유의하게 증진될 수 있음을 규명하였다.

본 명세서 상의 용어 “β-카테닌(beta-catenin)”은 Catenin beta-1으로도 알려져 있으며, 인간 CTNNB1 유전자로부터 발현되는 단백질을 의미한다. β-카테닌은 카데린 단백질 복합체의 서브유닛으로, 세포운명결정, 세포이동, 세포극성 조절에 관여하는 Wnt 세포신호전달의 주요한 인자로 알려져 있다. 인간 CTNNB1 유전자는 GenBank(CTNNB1, catenin beta 1 [Homo sapiens (human)], Gene ID: 1499) 등의 공지된 데이터베이스를 통해 접근 가능하다.

본 명세서 상의 용어 “목적 단백질”은 β-카테닌 뿐만 아니라 임의의 단백질을 포함하며, 당업자가 본 발명의 mRNA 분자를 이용하여 발현 효율을 증진시켜 대량으로 생산하고자 하는 단백질을 의미한다.

본 명세서 상의 용어 “목적 단백질을 코딩하는 코딩 영역”은 mRNA의 부분으로서, 코돈으로 구성된 부분이다. 코돈은 “유전 코드(genetic code)”에 의해 제공된 정보에 따라 단백질로 번역된다. 코딩 영역은 통상적으로 개시 코돈(start codon)으로 시작하여 정지 코돈(stop codon)으로 종료된다. 일반적으로, 시작 코돈은 AUG 트리플렛이며, 정지 코돈은 UAA, UAG 또는 UGA이다. 단백질-코딩 이외에도, 코딩 영역의 부분은 엑손의 스플라이싱 인핸서(exonic splicing enhancer) 또는 엑손의 스플라이싱 사일런서(silencer)로서 pre-mRNA에서 조절 서열로서 역할을 할 수 있다. 본 발명의 목적 단백질을 코딩하는 코딩 영역은 β-카테닌 유전자의 코딩 영역 서열 외에도 다양한 외래 유전자의 핵산 서열로부터 전사된 서열을 포함할 수 있고, 단백질의 변화를 가져오지 않는 뉴클레오타이드에서의 변이가 존재하는 바, 동일한 목적 단백질을 수득하기 위한 mRNA 서열이라 하더라도 다양한 뉴클레오타이드의 변이를 갖는 코딩 영역을 포함할 수 있다. 상술한 단백질의 변화를 가져오지 않는 뉴클레오타이드에서의 변이는, 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈(예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함하고, 상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에서 이용되는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 적용 대상(subject)에 도입하고자 하는 단백질을 번역할 수 있는 mRNA 서열의 코딩 영역(coding region)에 본 발명의 5’UTR 및 3’UTR 또는 이의 단편이 결합되어 있는 mRNA 분자를 이용함으로써, 상기 단백질의 번역(translation) 수준(level)을 유의하게 증진시킬 수 있다.

본 명세서 상의 용어 “UTR(untranslated region, 비번역 영역)”은 mRNA의 개시 코돈의 업스트림(upstream) 및 정지 코돈의 다운스트림(downstream)에 있는 부위로서, 번역되지 않는 서열을 의미한다. mRNA의 개시 코돈의 업스트림에 있는 UTR은 5’UTR이라고 불리며, mRNA의 정지 코돈의 다운스트림에 있는 UTR은 3’UTR이다. mRNA에서의 비번역 영역은 mRNA 안정성 및 mRNA 번역 모두를 조절하는데 중추적인 역할을 한다. 본 발명자들은 이러한 UTR의 특성을 이용하여, 종래 연구된 바 없는 β-카테닌의 UTR이 단백질 발현 효율을 증진시킴을 규명하였다.

본 명세서 상의 용어 “β-카테닌의 5’UTR”은 β-카테닌 유전자의 mRNA의 5’UTR를 의미하며, 본 명세서 상의 용어 “β-카테닌의 3’UTR”은 β-카테닌 유전자의 mRNA의 3’UTR을 의미한다.

본 명세서 상의 용어 “β-카테닌의 3’UTR 또는 이의 단편”은 본 발명자들이 β-카테닌 유전자의 mRNA의 3’UTR 서열의 최적화를 위해 번역 효율을 검증한 일종의 3’UTR 서열들을 의미하며, 3’UTR의 alternative splicing에 의한 이형체들, 후술될 실시예에서 단편화한 UTR-1의 단편들(F2 내지 F4)을 포함할 수 있다. β-카테닌은 같은 코딩 영역(coding region)을 가지지만 alternative splicing에 의하여 3가지의 3’UTR 이형체(isoform)(UTR-1, UTR-2 및 UTR-3)가 존재한다. UTR-3은 인트론 15(In15) 및 엑손 16(E16)를 포함하는 길이가 가장 긴 이형체이다. UTR-2는 인트론 15가 제거된 중간 길이의 이형체이다. UTR-1은 인트론 15(In15)와 엑손 16A(E16A)가 제거된 길이가 가장 짧은 이형체이다. 3’UTR 또는 이의 단편의 종류에 따라 mRNA의 위치와 번역 효율이 상이할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 mRNA 분자의 목적 단백질을 코딩하는 코딩 영역은 개시 코돈을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 mRNA 분자의 목적 단백질을 코딩하는 코딩 영역은 종결 코돈을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 β-카테닌의 3’UTR의 단편은 3’UTR 전체 서열 중 적어도 인트론 15(Intron 15, In15) 부위가 삭제된 것이다. 본 발명에서, 인트론 15(Intron 15, In15) 부위가 삭제되었다는 것은 인트론 15 부위가 전부 또는 일부 결실되었음을 포함한다.

본 명세서 상의 “인트론 15(Intron 15, In15) 부위”는 서열번호 3에 나타냈으며, 서열번호 8의 13번째 내지 317번째 뉴클레오타이드 서열 부분을 의미한다. 본 명세서 상의 서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열은 In15 부위를 포함하는 이형체이고, 본 명세서 상에서 UTR-3로 지칭된다. In15 부위를 포함하는 3’UTR 서열을 포함하는 mRNA 서열의 경우, 세포질로 이동이 제한적이나, In15 부위를 포함하지 않는 3’UTR 서열을 포함하는 mRNA 서열들의 경우, 세포질 내로 이동이 원활하며, 이로써 단백질로의 번역 효율에도 영향을 미칠 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 β-카테닌의 3’UTR의 단편은 엑손 16A(Exon 16A, E16A) 부위가 추가적으로 삭제된 것이다. 본 발명에서, 엑손 16A 부위가 삭제되었다는 것은 엑손 16A 부위가 전부 또는 일부 결실되었음을 포함한다. 본 명세서 상의 “엑손 16A(Exon 16A, E16A) 부위”는 서열번호 4에 나타냈으며, 서열번호 7의 13번째 내지 171번째 뉴클레오타이드 서열 부분 및 서열번호 8의 318번째 내지 476번째 뉴클레오타이드 서열 부분을 의미한다. 특히 β-카테닌의 5’UTR과 3’UTR이 함께 쓰이는 경우에 있어서, 3’UTR로서 In15 부위가 결실되고, E16A 부위가 포함된 3’UTR이 사용될 때, 코딩 영역에 의해 암호화된 단백질의 발현 효율이 증진된다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 β-카테닌의 3’UTR의 단편은 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 9 내지 서열번호 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 RNA 서열로 이루어진 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 β-카테닌의 3’UTR의 단편은 서열번호 10의 RNA 서열로 이루어진 것이다.

본 발명에서 이용되는 β-카테닌의 5’UTR, 3’UTR 및 3’UTR의 단편은 각각 서열번호 1 및 서열번호 6 내지 서열번호 13에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성(예컨대, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 또는 69%), 보다 바람직하게는 70%의 상동성(예컨대, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 또는 79%), 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성(예컨대, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%), 가장 바람직하게는 90%의 상동성(예컨대, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%)을 나타내는 서열을 의미한다. 상기 70% 이상 100% 이하의 모든 정수 및 이 사이의 소수는 % 상동성과 관련하여 본 발명의 범위 내에 포함된다.

서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981) Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 ncbi 웹사이트의 BLAST 페이지를 통하여 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 ncbi 웹사이트의 BLAST help 페이지에서 확인할 수 있다.

본 발명의 mRNA 분자는 5’UTR의 5’말단에 5’캡 구조 (cap structure)을 포함할 수 있고, 3’UTR의 3’말단에서 폴리(A) 테일 구조를 추가적으로 포함할 수 있다. 이로서, mRNA 분자의 안정성 및 번역 효율이 더욱 증진될 수 있다. 또한, mRNA 안정성을 향상시키고, mRNA 번역을 증진시키는 것으로 알려진 N1-메틸슈도우리딘과 같은 변형된 천연 뉴클레오타이드 및 인공 뉴클레오타이드가 혼입될 수 있고, 본 발명의 mRNA 분자에 대해 상술한 정도의 변형이 허용됨은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명하다.

본 발명의 mRNA 분자는 대상(subject)의 체내에 직접 주입하거나, In vitro 세포에 대한 적용 등 다양한 형태로 사용될 수 있으며, mRNA 서열을 활용한 치료제, mRNA 백신, 질병의 진단, 약물의 스크리닝 등 다양한 용도로 활용될 수 있다. 본 발명의 mRNA 분자는 mRNA 분자의 안정성 향상을 위해 종래 알려진 다양한 방법을 사용할 수 있으며, 구체적으로 예를 들면, 인지질 막으로 둘러싸는 방법을 사용하여 세포 내 전달에 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 5’UTR은 서열번호 1의 RNA 서열로 이루어진 것이다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 mRNA 분자를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

본 명세서에서, 용어 "핵산(nucleic acids)"은 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 명세서에서, 용어 “mRNA 분자를 코딩하는 핵산 분자”는 본 발명의 mRNA 분자를 전사(transcription)하는 주형으로서의 핵산 분자인 것으로 충분하며, 어느 특정 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 자명하다.

본 명세서에서, 본 발명의 mRNA 분자를 코딩하는 핵산 분자의 ORF(Open Reading Frame) 영역은 외래 핵산 서열로부터 전사된 서열일 수 있고, 단백질의 변화를 가져오지 않는 뉴클레오타이드에서의 변이가 존재하는 바, 동일한 목적 단백질을 수득하기 위한 핵산 서열이라 하더라도 다양한 뉴클레오타이드의 변이를 갖는 ORF를 포함할 수 있다. 상술한 단백질의 변화를 가져오지 않는 뉴클레오타이드에서의 변이는, 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈(예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함하고, 상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에서 이용되는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 5’UTR 및 3’UTR 또는 이의 단편의 경우에는 비번역 영역에 해당하고, ORF 영역에 비해서는 비교적 제한된 변환이 허용될 것이지만, 당업자의 상식 수준에서, 번역 활성에 유의한 변화를 가져오지 않는 미세한 변형들은 허용될 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 발현 컨스트럭트를 제공한다.

본 명세서에서 용어 "발현 컨스트럭트(expression construct)"는 세포 내에서 단백질 발현을 위한 최소의 엘리먼트(elemnet)만을 포함하는 핵산분자를 의미하는 것으로 정의된다. 본 발명의 발현 컨스트럭트는 종래 공지된 다양한 프로모터를 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 본 발명의 핵산서열에 작동적으로 연결(operatively linked)되어 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.

본 명세서에서 용어 "작동적으로 연결(operatively linked)"은 핵산 발현 조절 서열, 예를 들어 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이와 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열 은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독(translation)을 조절하게 된다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 발현 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 포함하는 분리된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙 주로 하여 구축될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, pLλ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pLλ 프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예를 들어, pGL3/Luc, pBABE, pSK349, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19), 파지(예를 들어, λgt·λ4B, λ-Charon, λΔz1 및 M13) 또는 바이러스(예를 들어, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 벡터는 리포터 분자, 예를 들어 루시페레이스 및 β-글루쿠로니다아제를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반할 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 벡터는 FLAG 벡터, YFP 벡터, 또는 GFP 벡터일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 숙주세포는 본 발명의 벡터로 일시적으로 형질전환 또는 형질감염시켜 본 발명의 벡터를 일시적으로 발현할 수 있는 세포 뿐만 아니라, 본 발명의 벡터를 안정하게 지속적으로 발현시킬 수 있는 안정 세포주(stable cell line)를 포함한다. 안정 세포주란 특정 유전자가 지놈에 통합(integration)되어 세포가 분열 및 증식하여도 여러 세대에 거쳐 그 유전자가 소실되지 않고 계속 전달되어 발현되는 세포주를 의미한다.

본 발명의 벡터를 안정하게 지속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포 또는 세포주는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli Origami2, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110와 같은 E. coli 균주, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환 또는 형질감염시키는 경우에는 숙주세포로서, 이스트(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포 및 동물 세포(예컨대, HCT116, HT-29, SW480, HEK293, U2OS, CHO(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.

본 발명에서, “형질전환” 또는 “형질감염” 은 유전자를 숙주세포 내에 도입 후 발현시킬 수 있도록 하는 것을 의미한다. 목적 유전자가 도입된 벡터를 숙주세포 내로 형질전환 또는 형질감염시키는 방법은 염기를 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 목적 단백질을 코딩하는 RNA 서열의 5’말단 및 3’말단에 각각 β-카테닌의 5’UTR 및 β-카테닌의 3’UTR 또는 이의 단편을 결합시키는 단계를 포함하는 목적 단백질의 발현 효율이 증진된 mRNA 제조 방법을 제공한다.

본 발명에서, 상술한 “결합시키는 단계”는 각각의 mRNA 단편을 물리적으로 결합시키는 것 만을 의미하는 것이 아니고, DNA 분자로부터 전사(transcription)를 통해 5’ 말단 및 3’ 말단에 각각 β-카테닌의 5’UTR 및 β-카테닌의 3’UTR 또는 이의 단편을 결합된 목적단백질을 코딩하는 mRNA 서열을 생산하는 공정을 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 3’UTR의 단편은 3’UTR 전체 서열 중 적어도 인트론 15(Intron 15, In15) 부위가 삭제된 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 3’UTR의 단편은 엑손 16A(Exon 16A, E16A) 부위가 추가적으로 삭제된 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 3’UTR 또는 이의 단편은 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 9 내지 서열번호 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 RNA 서열로 이루어진 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 3’UTR 또는 이의 단편은 서열번호 10의 RNA 서열로 이루어진 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 mRNA는 시험관 내 전사(in vitro transcription)를 통하여 제조되는 것일 수 있다.

본 명세서 상의 용어 “시험관 내 전사(in vitro transcription)”란 세포외, 시험관 내에서의 DNA 의존적 RNA 합성을 의미하는 것이다. 주형 DNA는 시험관 내 전사 전에 적당한 제한 효소로 선형화될 수 있다. RNA 시험관 내 전사에 이용되는 시약은, 전형적으로, 박테리오파지-인코딩된 RNA 폴리머레이스(bacteriophage- encoded RNA polymerases)(T7, T3, SP6 또는 Syn5)와 같은 폴리머레이스; 4개의 염기(base)(아데닌, 시토신, 구아닌 및 우라실)에 대한 NTP(ribonucleotide triphosphate)이며, 이외에 선택적으로 캡 아날로그; 변형된 뉴클레오타이드; RNase 억제제 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명자들은 본 발명의 β-카테닌의 5’UTR 및 β-카테닌의 3’UTR 또는 이의 단편을 포함하는 mRNA가 DNA 플라스미드를 통해 세포 내에서 합성되는 경우 뿐만 아니라, 시험관 내 전사(in vitro transcription)를 통해 합성된 상기 mRNA 를 사용하는 경우에도, 목적 단백질 효율이 증진되고, 이에 따라 세포내 발현 양상이 조절될 수 있음을 확인하였다. 이로써, 본 발명의 β-카테닌의 5’UTR 및 β-카테닌의 3’UTR 또는 이의 단편을 포함하는 mRNA가 면역성을 조절할 수 있고, 대량생산이 가능한 암 백신 mRNA 구조체로서 적용할 수 있음을 제시하였다.

상기 본 발명의 mRNA 제조 방법은 상술한 본 발명의 다른 양태의 발현 효율이 증진된 mRNA 분자를 이용하는 것이므로, 양 발명 간에 중복되는 부분은 모두 동일하게 적용되며, 본 명세서의 복잡성을 방지하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 단백질 발현 효율이 증진된 mRNA 분자, 이를 코딩하는 핵산 분자, 발현 벡터, 형질전환체, 숙주세포 및 조성물을 이용하는 경우, 목적하는 단백질의 발현을 효과적으로 증진시킬 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

i) 본 발명은 (a) 목적 단백질을 코딩하는 코딩 영역; (b) 상기 코딩 영역의 5’말단에 결합된 β-카테닌의 5’UTR(untranslated region, 비번역 영역); 및 (c) 상기 코딩 영역의 3’말단에 결합된 β-카테닌의 3’UTR 또는 이의 단편을 포함하는 mRNA 분자를 제공한다.

ii) 본 발명은 상기 mRNA 분자를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

iii) 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 발현 컨스트럭트를 제공한다.

iv) 본 발명은 상기 발현 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

v) 본 발명은 상기 재조합 벡터를 포함하는 분리된 숙주세포를 제공한다.

vi) 본 발명은 상기 mRNA 분자를 포함하는 단백질 발현 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 단백질 발현 효율이 증진된 mRNA 분자, 이를 코딩하는 핵산 분자, 발현 벡터, 형질전환체, 숙주세포 및 조성물을 이용하는 경우, 목적하는 단백질의 발현을 효과적으로 증진시킬 수 있다. 이는 DNA 플라스미드를 사용한 형질전환 및 형질감염을 통해서 뿐만 아니라, 시험관 내 전사(In vitro transcription)로 합성된 mRNA의 경우에도 가능하다. 이와 같이, 본 발명을 이용하는 경우 항원성이 높은 단백질을 안정적으로 합성할 수 있으며, 이로써 면역성을 조절할 수 있는 암 백신 mRNA 구조체로서의 적용 가능성을 제시한다.

도 1a는 β-카테닌 3’UTR의 이형체의 모식도를 나타낸 것이다.
도 1b는 대장암 세포주 HCT116, HT-29 및 SW480 세포에서의 β-카테닌 3’ UTR mRNA 위치를 분석하기 위하여 RNA-FISH를 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 1c는 대장암 세포주 HCT116, HT-29 및 SW480 세포에서 β-카테닌 3’UTR 이형체 별 세포 위치에 따른 분포를 핵(Nuc)과 세포질(Cyt)로 나눠 정량한 결과를 나타낸 것이다.
도 2a는 β-카테닌 UTR 루시페레이스 리포터를 이용하여 HEK293 세포주에서의 β-카테닌 UTR에 따른 번역 효율을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2b는 β-카테닌 UTR 루시페레이스 리포터를 이용하여 SW480 세포주에서의 β-카테닌 UTR에 따른 번역 효율을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 β-카테닌 코딩 영역을 YFP(yellow fluorescent protein, 노랑 형광 단백질)로 대체한 발현 컨스트럭트들의 모식도를 나타낸 것이다. (1: YFP, 2: 5’UTR + YFP, 3: 5’UTR + YFP + UTR-1, 4: 5’UTR + YFP + UTR-2, 5: 5’UTR + YFP + UTR-3, 6: 5’UTR + YFP + ACTB 3’UTR)
도 3b는 도 3a의 YFP 컨스트럭트를 사용하여 U2OS 세포에서 YFP을 발현시키고, 단백질 발현을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다. (1: YFP, 2: 5’UTR + YFP, 3: 5’UTR + YFP + UTR-1, 4: 5’UTR + YFP + UTR-2, 5: 5’UTR + YFP + UTR-3, 6: 5’UTR + YFP + ACTB 3’UTR)
도 4a는 UTR-1을 단편화(fragmentation)하여 제작한 단편(fragment) 발현 컨스트럭트들의 모식도를 나타낸 것이다.
도 4b는 도 4a의 단편 발현 컨스트럭트를 사용하여 U2OS 세포에서 YFP을 발현시키고, 단백질 발현을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 IVT-RNA-GFP 컨스트럭트의 모식도를 나타낸 것이다. (1: GFP, 2: 5’UTR + GFP, 3: 5’UTR + GFP + UTR-1, 4: 5’UTR + GFP + UTR-2, 5: 5’UTR + GFP + ACTB 3’UTR)
도 5b는 IVT-mRNA를 TBE agarose gel에 로딩하여 RNA 합성을 확인한 결과를 나타낸 것이다. (1: GFP, 2: 5’UTR + GFP, 3: 5’UTR + GFP + UTR-1, 4: 5’UTR + GFP + UTR-2, 5: 5’UTR + GFP + ACTB 3’UTR)
도 5c는 U2OS 세포에 IVT-RNA를 형질감염하여 단백질 발현 효율을 웨스턴 블랏으로 분석한 결과를 나타낸 것이다. (1: GFP, 2: 5’UTR + GFP, 3: 5’UTR + GFP + UTR-1, 4: 5’UTR + GFP + UTR-2, 5: 5’UTR + GFP + ACTB 3’UTR)
도 5d는 U2OS 세포에 IVT-RNA를 형질감염하여 GFP 형광을 면역형광 분석을 통해 관찰한 결과를 나타낸 것이다. (1: GFP, 2: 5’UTR + GFP, 3: 5’UTR + GFP + UTR-1, 4: 5’UTR + GFP + UTR-2)

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: RNA-FISH(Fluorescence in situ hybridization)를 통한 세포 내 3’UTR 이형체별 위치 분석

실시예1-1: 세포 배양 및 형질감염

HCT116 세포, SW480 세포(결장 직장 선암)는 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640(Hyclone)에서 배양하였다. HEK293 세포(배아 신장), HT-29 세포, U2OS 세포를 Dulbecco의 Modified Eagle 배지(DMEM)(Hyclone)에서 배양하였다. 각 배지에는 10% 소 태아 혈청(FBS)와 1% 항생제(Hyclone)를 함유하였다. 세포의 배양 조건은 5% CO2, 37℃ 였다. HEK293는 제조업체의 지침에 따라 PEI 방법(PEI MAX 40K, Polysciences, Inc.)을 사용하여 세포의 형질감염을 수행하였고, 다른 세포들은 Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 사용하여 형질감염을 수행하였다.

실시예 1-2: FISH(Fluorescence in situ hybridization)

β-카테닌은 같은 코딩 영역(coding region)을 가지지만 3’UTR의 세 가지 alternative splicing 이형체 (UTR-1, UTR-2 및 UTR-3)가 있다. UTR-3은 인트론 15(In15) 및 엑손 16(E16)를 포함하는 길이가 가장 긴 이형체이다. UTR-2는 인트론 15가 제거된 중간 길이의 이형체이다. UTR-1은 인트론 15(In15)와 엑손 16A(E16A)가 제거된 길이가 가장 짧은 이형체이다(도 1a).

각기 다른 3’UTR 이형체가 mRNA의 위치에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 각 β-카테닌 mRNA 3'UTR 이형체를 시각적으로 확인하기 위한 Cy3 또는 Cy5 형광을 탐침한 프로브를 제작하였고(도 1b 및 표 1), 대장암 세포주 HCT116, HT-29 및 SW480 세포에서 RNA-FISH (RNA-Fluorescent In Situ Hybridization)를 수행하여 세포내 3’UTR mRNA 위치를 분석하였다.

β-카테닌 mRNA-FISH 실험을 위해 세포는 커버슬립(coverslips)에서 배양하였다. 세포를 실온에서 10 분 동안 4 % 파라포름알데히드로 고정시켰고, 1×PBS로 3 회 세척 후, 0.5 ug/ml Digitonin으로 투과하였다. 샘플들을 3% BSA in 4×SSC에 100 μg/ml Salmon sperm DNA (Stratagene)를 넣은 prehybridization 버퍼로 42℃에서 20 분 동안 인큐베이션하였다. Prehybridization 버퍼를 제거하고, 10% dextran sulfate in 4×SSC에 본 발명자들이 제작한 β-카테닌 3’UTR mRNA 프로브(표 1)를 넣은 hybridization 버퍼로 42℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 다음, 상기 샘플들을 실온에서 각 washing 버퍼로 5 분 동안 4×SSC로 3 회, 2×SSC로 1 회, 1×SSC로 1 회, 1×PBS로 1 회 세척하였다. 모든 샘플들은 VECTSHIELD 마운팅 용액(Vector Laboratories)를 사용하여 DAPI를 염색하고, 유리 슬라이드 상으로 마운팅하였다. 상기 세포들을 공초점 현미경 (Fluoview, FV3000; Olympus, Melcille, NY)에 의해 시각화하였다.

FISH 프로브 서열
프로브	Detection	서열 (5'>3')	서열번호
16B Junction	3'UTR-1	[5CY5]TGTTACTCCTAAAGGATGATTTACAG[3'-dT] (26 mer)	14
16A Junction	3'UTR-2	[5CY3]AGACAATACAGCTAAAGGATGATTTACA[3'-dT] (28 mer)	15
Intron15	3'UTR-3	[5CY3]TAAACCACTCCCACCCTACCAAC[3'-dT] (23 mer)	16

도 1b에 나타난 바와 같이, 3 가지 대장암 세포에서 UTR-1 mRNA는 대부분 핵에서 관찰되었지만 세포질에서도 일부 위치하는 것을 확인할 수 있었다. UTR-2 mRNA는 RNA 형태가 분산되어 보이거나 과립(granule) 형태로 보이는 차이는 있었으나 대부분 세포질에만 위치했으며, 그와 반대로 UTR-3 mRNA는 핵에만 위치하는 것을 관찰할 수 있었다.

또한, 세포 위치에 따른 분포를 핵(Nuc)과 세포질(Cyt)로 나눠 정량을 하였을 때, UTR 이형체에 따른 FISH 이미지 결과와 같이, UTR-2 mRNA의 약 80% 이상이 세포질에 존재하는 것을 알 수 있었다(도 1c).

이와 같이, 3’UTR 이형체에 따른 세포 내 mRNA 위치가 상이함을 확인할 수 있었다.

실시예 2: β-카테닌 UTR 루시페레이스 리포터를 이용한 β-카테닌 UTR 유형에 따른 번역 효율 분석

실시예 1에서와 같이 β-카테닌 3’UTR 이형체 종류에 따른 세포 내 mRNA 발현 위치가 상이함은 단백질의 발현이 3’UTR에 의해 조절될 수 있음을 시사한다. 그 가능성을 입증하기 위하여, 루시페레이스 리포터(luciferase reporter)를 제작하여 β-카테닌 3’UTR의 번역 효율을 확인하였다.

β-카테닌 UTR 루시페레이스(luciferase) 리포터를 제작하기 위해, 표 2에 나열된 루시페레이스 어세이용 프라이머를 사용하여 SW480 세포의 β-카테닌 mRNA에서 RT-PCR로 5’UTR 및 3개의 3’UTR(UTR-1, UTR-2, UTR-3)을 증폭하였다. 5’UTR PCR 산물을 HindⅢ와 NcoⅠ 효소로 절단하고 pGL3/Luc 벡터에서 루시페레이스 유전자의 업스트림(upstream) 내로 클로닝하였다. 3 개의 각 3’UTR PCR 산물들은 XbaI 효소로 절단하여 pGL3/Luc 벡터에서 루시페레이스 유전자의 다운스트림(downstream) 내로 클로닝하였다. 그리고 5’UTR 및 3 개의 각 3’UTR을 포함하는 β-카테닌 루시페레이스 리포터를 구축하기 위해, 위에서 제작한 3개의 3’UTR 클론에서 In-Fusion 프라이머를 사용하여 In-Fusion HD Cloning PCR 방법으로 증폭하였다. PCR 산물들을 XbaI 효소로 절단하고, pGL3/Luc β-카테닌 5’UTR 클론의 루시페레이스 유전자의 다운스트림 내로 클로닝하였다.

프라이머	제한 효소	서열(5'→3')	서열번호
β-cat 5’UTR F	HindⅢ	GGAAGCTTAGGATACAGCGGCTTCTGC	17
β-cat 5'UTR R	NcoⅠ	GGCCATGGTGTCCACGCTGGATTTTCA	18
β-cat 3'UTR F	XbaⅠ	ATTCTAGAGATACTGACCTGTAAATCATCC	19
β-cat 3'UTR R		CATCTAGAAATGAATTAAAAGTTTAATTCTGAACC	20
In-Fusion β-cat 3'UTR-1 F		GCCGTGTAATTCTAGAATCATCCTTTAGGAGTAACAA	21
In-Fusion β-cat 3'UTR-2 F		GCCGTGTAATTCTAGAATCATCCTTTAGCTGTATTGT	22
In-Fusion β-cat 3'UTR-3 F		GCCGTGTAATTCTAGAATCATCCTTTAGGTAAGAAGT	23
In-Fusion β-cat 3'UTR R		CCGCCCCGACTCTAGACAATCGAATGAATTAAAAGT	24

β-카테닌 mRNA UTR의 번역 효율을 측정하기 위한 루시페레이스 어세이 실험을 위하여, HEK293 세포를 12-웰 플레이트에 배양하였다. 세포에 각 pGL3/Luc β-카테닌 UTR 리포터들을 pRL-TK 벡터와 함께 공동 형질감염시켰다. 형질감염시킨 세포를 1×PBS로 세척하여 수확한 뒤, 원심분리로 cell down하여 1×수동 용해 버퍼(passive lysis buffer)(Promega)를 첨가하고 세포를 용해하였다. 용해한 세포를 15분간 13000 rpm으로 원심분리하여 cell down시키고 상층액에 있는 용해물만 새 튜브로 옮겼다. 그리고 각각의 샘플을 듀얼-루시페레이스 분석 키트 (Promega)를 사용하여 GLOMAX20/20 광도계로 분석하였다.

SW480 세포에 대해서도 상기 HEK293 세포에서와 동일한 방법으로 β-카테닌 mRNA UTR의 번역 효율을 측정하기 위한 루시페레이스 어세이 실험을 수행하였다.

그 결과를 도 2a 및 도 2b에 나타내었다. 도 2a 및 2b에 나타난 바와 같이, HEK293 세포 및 SW480 세포에서 모두, 3’UTR만 존재하는 경우에는 이형체 별 번역 효율은 대체로 낮고 각 이형체 사이에 큰 차이가 없었음을 알 수 있었다. 반면, 실제 세포 상황과 유사하게 5’UTR과 3’UTR이 같이 존재하는 경우, 번역 효율이 현저하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 5’UTR과 UTR-1이 같이 존재하는 경우 및 5’UTR과 UTR-2가 같이 존재하는 경우에 번역 효율이 더욱 증가하였으며, 그에 반해 UTR-3의 경우에는 번역 효율이 증가하는 정도가 미미하였다(도 2a 및 도 2b). 따라서, UTR-1 및 UTR-2 mRNA가 세포질에 많이 위치함으로써 번역 효율을 증진시키는 데 중요한 역할을 함을 확인할 수 있었다.

실시예 3: FLAG YFP + 3’UTR 과발현 리포터를 통한 β-카테닌 UTR 유형에 따른 번역 효율 분석

β-카테닌 3’UTR mRNA 자체의 기능을 보다 정확히 판단하기 위하여 β-카테닌 코딩 영역을 YFP(yellow fluorescent protein, 노랑 형광 단백질)로 대체하고 FLAG로 태깅한 발현 컨스트럭트를 제작하였다(도 3a).

우선 FLAG로 태깅한 β-카테닌의 코딩 영역(coding region, CR)을 포함하는 발현 컨스트럭트를 구축하고, 이를 YFP(yellow fluorescent protein, 노랑 형광 단백질)로 대체하였다.

pCAN Myc 태그가 붙은 β-카테닌 코딩 영역(CR) 플라스미드는 Dr. Paul McCrea(오스틴 텍사스 대학교)로부터 제공받았다. β-카테닌 과발현을 위해, 제공받은 pCAN Myc β-카테닌 CR 클론에서 β-cat CR F 및 β-cat CR R 프라이머를 사용하여 DNA를 증폭시켰다. PCR 산물은 BamHI 효소로 절단하고, p3xFLAG-CMV-10 벡터에 클로닝하였다. 3xFLAG-β-cat CR의 업스트림에 5’UTR을 포함하여 PCR로 증폭시키고, pCS2 벡터에 클로닝하였다. 기존에 제작한 3개의 pGL3/Luc β-카테닌 3’UTR 클론에서 3개의 β-cat 3’UTR을 β-cat CR + 3’UTR 프라이머 세트를 사용하여 증폭시키고 XbaI, ApaI 효소로 절단하고 위에서 클로닝한 pCS2 β-cat 5’UTR 3xFLAG β-cat CR 클론에 클로닝하였다. 사용된 프라이머는 표 3에 나타내었다.

프라이머	제한효소	서열(5'→3')	서열번호
β-cat CR F	BamHⅠ	GCGGGATCCAATGGCTACTCAAGCTGATTTG	25
β-cat CR R		TGGGATCCAGGTCAGTATCAAACCAGGC	26
β-cat CR+3'UTR-1 F	XbaⅠ	GCTCTAGAATCATCCTTTAGGAGTAACAATAC	27
β-cat CR+3'UTR-2 F		GCTCTAGAATCATCCTTTAGCTGTATTGTCT	28
β-cat CR+3'UTR-3 F		GCTCTAGAATCATCCTTTAGGTAAGAAGTTTA	29
β-cat CR+3'UTR R	ApaⅠ	ATGGGCCCCAATCGAATGAATTAAAAGTTT	30

그 후 기존의 EcoRI 효소 부위를 부위 특이적 돌연변이 유도(site-directed mutagenesis) 방법으로 MluI 효소 부위로 치환하고 pEBB YFP 클론에서 YFP F 및 R 프라이머(표 4)를 사용하여 DNA를 증폭하고 위에서 제작한 pCS2 클론들에 MluI, XbaI 효소로 절단하고 클로닝하였다. 또한 β-cat UTR의 발현효율을 비교하기 위하여, 어떤 상황에서도 잘 발현되는 하우스키핑 유전자 중에서 β-액틴의 3’UTR(서열번호 31)을 pCS2 β-cat 5’UTR 3xFLAG YFP 클론에 동일한 방법으로 클로닝하였다.

프라이머	제한효소	서열(5'→3')	서열번호
YFP Forward primer	MluⅠ	GACGCGTATGGTGAGCAAGGGCGA	32
YFP Reverse primer	XbaⅠ	TCTAGATTAAGCTCGAGATCTGAGTCCGG	33
YFP β-actin 3'UTR F	XbaⅠ	CCCTCTAGATAGGCGGACTATGACTTAGTTGCGT	34
YFP β-actin 3'UTR R	ApaⅠ	GCGGGGCCCTCATTTTTAAGGTGTGCACTTTTA	35

U2OS 세포에 YFP 컨스트럭트를 형질감염하여 단백질 발현 효율을 웨스턴블랏으로 분석하였다.

형질감염시킨 각 세포를 1×PBS로 세척하여 수확한 뒤, 원심분리로 cell down하여 1×수동 용해 버퍼(Passive lysis buffer)(Promega)를 첨가하여 용해하였다. 용해시킨 세포를 15 분간 13000 rpm으로 원심분리하여 cell down시키고 상층액에 있는 용해물만 새 튜브로 옮겼다. 추출된 단백질 용해물을 4×샘플 버퍼 (200 mM Tris-HCl, pH6.8, 8% SDS, 40% 글리세롤, 0.4% 브로모페놀 블루, 400 mM DTT)로 현탁하였다. 단백질 샘플을 8% 및 12% SDS-PAGE 겔 상에서 분리하였고, 폴리비닐리덴 다이플 루오라이드 멤브레인(PVDF)(Millipore)으로 옮겼다. 상기 멤브레인을 1 시간 동안 5% 탈지유(skim milk)로 블로킹한 후 프라이머리 항체로 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 사용한 항체는 다음과 같다:

anti-FLAG M2 (F3165, sigma- aldrich), anti-GFP (SC-126, Santacruz) 및 anti-β-actin (ab6276, Abcam)(표 5).

제조사	항체
Sigma-Aldrich F3165	FLAG M2
Santacruz SC-126	GFP
Abcam ab6276-100	Beta-actin

그 결과, 역시 5’UTR과 UTR-1이 모두 존재하는 경우 및 5’UTR과 UTR-2이 모두 존재하는 경우에 발현 효율이 높았으며, β-액틴의 3’UTR보다도 더 높은 효율을 보였다(도 3b).

실시예 4: FLAG YFP + 3’UTR 단편 과발현 리포터를 통한 발현 효율 증진 요소(element) 분석

β-카테닌 3’UTR mRNA 중에서도 어떤 부분이 발현 효율을 증진시키는 데 가장 큰 역할을 하는 조절 요소(element)인지 확인하기 위하여, UTR-1을 단편화(fragmentation)하고, 단편(fragment) 발현 컨스트럭트를 제작하였다(도 4a).

단편으로는 F2(fragment 2, 서열번호 9), F3(fragment 3, 서열번호 10), F4(fragment 4, 서열번호 11) F2+F3(fragment 2 + fragment 3, 서열번호 12), F3+F4(fragment 3 + fragment 4, 서열번호 13)을 제작하였다.

F2, F3 및 F4는 해당 F 및 R 프라이머를 사용하여 DNA를 증폭한 후, XbaI, ApaI 효소로 절단하고, 위에서 제작한 FLAG YFP 클론에 삽입하였다. DNA 증폭을 위해서 pCS2 β-cat 5’UTR 3xFLAG β-cat CR+3’UTR-3클론을 주형으로 사용하였다. 사용한 프라이머는 표 6에 나타내었다.

프라이머	제한효소	서열(5'→3')	서열번호
YFP 3'UTR-1 F2 F	XbaⅠ	CCCTCTAGACTGTATTGTCTGAACTTGCATT	36
YFP 3'UTR-1 F2 R	ApaⅠ	CGCGGGCCCTTGAGTAATGGTGTAGAACA	37
YFP 3'UTR-1 F3 F	XbaⅠ	CCCTCTAGAGTAACTGTTTTTTAAGTCTCTCGT	38
YFP 3'UTR-1 F3 R	ApaⅠ	CGCGGGCCCTAGGGTAAATCAGTAAGAGGTGT	39
YFP 3'UTR-1 F4 F	XbaⅠ	CCCTCTAGATGGTCCAATTAGTTTCCTTTTTAA	40
YFP 3'UTR-1 F4 R	ApaⅠ	CGCGGGCCCTAAACTTTTAATTCATTCGATTG	41

U2OS 세포에 상기 단편 발현 컨스트럭트를 형질감염시켜 단백질 발현을 분석한 결과, UTR-1의 단편 중 F3이 존재하는 경우에 가장 발현 효율이 높은 것을 확인할 수 있었다(도 4b). 이를 통하여, UTR-1의 단편 중 F3가 발현 효율 증진에 가장 중요한 요소임을 알 수 있었다.

실시예 5: 시험관 내 전사(in vitro transcription)된 RNA(In vitro-RNA)의 UTR 유형에 따른 발현 효율 분석

DNA 플라스미드에서 확인한 결과와 마찬가지로, UTR이 In Vitro-RNA(IVT-RNA)의 세포내 발현 양상에 영향을 주는지 분석하기 위하여 IVT-RNA-GFP 컨스트럭트를 제작하였다(도 5a).

Bacterial T7 RNA 폴리머레이스가 작동할 수 있는 T7 프로모터가 포함되어 있는 클론인 GEM-11zf(+)에 SalI, BamHI 효소로 절단한 후 EGFP 코딩 서열을 삽입하였다. EGFP(Enhanced green fluorescent protein) 단백질 생성에 있어 CTNNB1의 5’UTR 및 3’UTR의 기능을 확인하기 위하여 CTNNB1의 5’UTR은 EcoRI, SalI, 3가지 버전의 3’UTR(UTR-1, UTR-2, UTR-3)은 BamHI, ApaI 효소로 절단한 후 삽입하였다. 사용한 프라이머는 표 7에 나타내었다. EGFP 코딩 서열은 pEGFP-C1에서, CTNNB1의 5’UTR과 3’UTR은 SW480 세포주에서 추출한 RNA를 cDNA로 합성한 후 PCR하여 얻은 것이다.

프라이머 (제한효소)	서열(5'→3')	서열번호
GFP F (SalI)	CCCGTCGACTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC	42
GFP R (BamHI)	CCCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAG	43
5'UTR F (EcoRI)	CCCGAATTCAGGATACAGCGGCTTCTGCG	44
5'UTR R (SalI)	CCCGTCGACTGTCCACGCTGGATTTTCAA	45
UTR-1 F (BamHI)	CCCGGATCCGAGTAACAATACAAATGGATTTTG	46
UTR-1 R (ApaI)	CGCGGGCCCCAATCGAATGAATTAAAAGTTTA	47
UTR-2 F (BamHI)	CCCGGATCCGTAACTGTTT TTTAAGTCTCTCGT	48
UTR-2 R (ApaI)	CGCGGG CCCACACCTCTTACTGATTTACCC	49

T7 폴리머레이스 단백질을 다음과 같은 방법으로 정제하였다. BL21 세포주에 His-T7 RNA 폴리머레이스 발현 벡터(RNA polymerase expression vector)를 형질전환한 후 얻은 콜로니를 액체 500 mL LB 배지에서 37℃, 오버나이트로 인큐베이션하였다. OD600값이 0.4일때, 0.5 mM IPTG를 넣어준 후 3 시간동안 다시 인큐베이션하였다. Cell down 후 펠렛에 용해 버퍼(lysis buffer) (20 mM Tris-Cl (pH 8.0), 0.1% Triton X-100, 200 mM NaCl, 1 mM Imidazole)를 넣고 재현탁하였다. Ice에서 20 분 인큐베이션 후, sonication 해주는 데 amplification 60%로 15 초, 20 회 반복하였다. 4℃에서 23,000 x g 조건으로 30 분 동안 원심분리하여 얻은 상등액(supernatant)을 용해 버퍼로 2 번 preclearing하고, 1.5 mL His-resin과 함께 4℃에서 4 시간 동안 shaking해주었다. 원심분리를 통해 상등액은 버리고 resin만 얻은 후, resin의 6 배 부피의 용출 버퍼(elution buffer)(20 mM Tris-Cl (pH 8.0), 0.1% Triton X-100, 200 mM NaCl, 200 mM Imidazole)를 넣고 4℃에서 오버나이트로 인큐베이션하였다. 원심분리한 후 상등액만 얻어서 AmiconUltra-2 Centrifugal Filter Unit (Merk, UFC205024)을 이용하여 T7 RNA 폴리머레이스만 concentration시켜 주었다. 얻은 T7 RNA 폴리머레이스는 스토리지 버퍼(storage buffer)(50 mM Tris-Cl (pH 7.9), 100 mM NaCl, 20 mM DTT, 1 mM EDTA, 50% glycerol, 0.1% Triton X-100)에 넣고, 200 uL씩 aliquot한 후 -20℃에 보관하였다.

다음과 같은 방법으로 In vitro 전사(transcription)를 수행하였다. 10X T7 폴리머레이스 버퍼 (200 mM HEPES-KOH (pH 7.5), 10 mM MgCl2, 40 mM DTT, 2 mM spermidine), 10 mM rNTP, 20 U RNase inhibitor, 정제한 T7 RNA 폴리머레이스를 1 uL 넣고, 37℃에서 오버나이트로 인큐베이션하였다. 합성된 RNA는 8% Urea-acrylamide gel에 로딩하여 적절한 사이즈의 RNA 부분만 잘라서 phenol/chloroform precipitation한 후, RNA clean & Concentrator (Zymo)를 사용하여 정제하였다.

각 IVT-RNA를 TBE agarose gel에 로딩하여 확인하였을 때, RNA가 만들어진 것을 확인할 수 있었다(도 5b). U2OS 세포에 IVT-RNA를 형질감염하여 단백질 발현 효율을 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 그 결과, β-액틴의 3’UTR보다 β-카테닌 UTR RNA에서 단백질 발현 효율이 더 높음을 알 수 있었다(도 5c).

위의 RNA를 U2OS 세포에 형질감염하여 GFP 형광을 면역형광 분석을 통해 관찰하였다. 도 5d에 나타난 바와 같이, GFP 코딩영역만 있는 경우와 5’UTR RNA를 넣어줬을 때, 핵 근처에 aggresome 형태로 단백질이 뭉쳐있는 것을 관찰할 수 있었다. 반면, UTR-1과 UTR-2 RNA의 경우 세포질에 과립(granule) 형태로 단백질이 발현되며, 세포막 근처까지 멀리 발현되는 것을 관찰할 수 있었다(도 5d). 이로써 IVT-RNA을 사용하는 경우에도 β-카테닌 UTR에 의하여 단백질 발현을 증진시킬 수 있음을 확인할 수 있었고, 이를 RNA 백신 구조체로서 활용할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Dankook University <120> UTR sequence for enhancing mRNA expression and mRNA sequence comprising the same <130> PN220011 <160> 49 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 268 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-catenin 5'UTR <400> 1 aggauacagc ggcuucugcg cgacuuauaa gagcuccuug ugcggcgcca uuuuaagccu 60 cucggucugu ggcagcagcg uuggcccggc cccgggagcg gagagcgagg ggaggcggag 120 acggaggaag gucugaggag cagcuucagu ccccgccgag ccgccaccgc aggucgagga 180 cggucggacu cccgcggcgg gaggagccug uuccccugag gguauuugaa guauaccaua 240 caacuguuuu gaaaauccag cguggaca 268 <210> 2 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E15 of beta-catenin 3'UTR <400> 2 aucauccuuu ag 12 <210> 3 <211> 305 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> In15 of beta-catenin 3'UTR <400> 3 guaagaaguu uuaaaaagcc aguuugggua aaauacuuuu acucugccua cagaacuuca 60 gaaagacuug guugguaggg ugggaguggu uuaggcuauu uguaaaucug ccacaaaaac 120 agguauauac uuugaaagga gaugucuugg aacauuggaa uguucucaga uuucugguug 180 uuaugugauc auguguggaa guuauuaacu uuaauguuuu uugccacagc uuuugcaacu 240 uaauacucaa augaguaaca uuugcuguuu uaaacauuaa uagcagccuu ucucucuuua 300 uacag 305 <210> 4 <211> 159 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E16A of beta-catenin 3'UTR <400> 4 cuguauuguc ugaacuugca uugugauugg ccuguagagu ugcugagagg gcucgagggg 60 ugggcuggua ucucagaaag ugccugacac acuaaccaag cugaguuucc uaugggaaca 120 auugaaguaa acuuuuuguu cugguccuuu uuggucgag 159 <210> 5 <211> 625 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E16B of beta-catenin 3'UTR <400> 5 gaguaacaau acaaauggau uuugggagug acucaagaag ugaagaaugc acaagaaugg 60 aucacaagau ggaauuuauc aaacccuagc cuugcuuguu aaauuuuuuu uuuuuuuuuu 120 uuaagaauau cuguaauggu acugacuuug cuugcuuuga aguagcucuu uuuuuuuuuu 180 uuuuuuuuuu uuugcaguaa cuguuuuuua agucucucgu aguguuaagu uauagugaau 240 acugcuacag caauuucuaa uuuuuaagaa uugaguaaug guguagaaca cuaauucaua 300 aucacucuaa uuaauuguaa ucugaauaaa guguaacaau uguguagccu uuuuguauaa 360 aauagacaaa uagaaaaugg uccaauuagu uuccuuuuua auaugcuuaa aauaagcagg 420 uggaucuauu ucauguuuuu gaucaaaaac uauuugggau auguaugggu aggguaaauc 480 aguaagaggu guuauuugga accuuguuuu ggacaguuua ccaguugccu uuuaucccaa 540 aguuguugua accugcugug auacgaugcu ucaagagaaa augcgguuau aaaaaauggu 600 ucagaauuaa acuuuuaauu cauuc 625 <210> 6 <211> 642 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-catenin 3'UTR-1 <400> 6 aucauccuuu aggaguaaca auacaaaugg auuuugggag ugacucaaga agugaagaau 60 gcacaagaau ggaucacaag auggaauuua ucaaacccua gccuugcuug uuaaauuuuu 120 uuuuuuuuuu uuuuaagaau aucuguaaug guacugacuu ugcuugcuuu gaaguagcuc 180 uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuugcagu aacuguuuuu uaagucucuc guaguguuaa 240 guuauaguga auacugcuac agcaauuucu aauuuuuaag aauugaguaa ugguguagaa 300 cacuaauuca uaaucacucu aauuaauugu aaucugaaua aaguguaaca auuguguagc 360 cuuuuuguau aaaauagaca aauagaaaau gguccaauua guuuccuuuu uaauaugcuu 420 aaaauaagca gguggaucua uuucauguuu uugaucaaaa acuauuuggg auauguaugg 480 guaggguaaa ucaguaagag guguuauuug gaaccuuguu uuggacaguu uaccaguugc 540 cuuuuauccc aaaguuguug uaaccugcug ugauacgaug cuucaagaga aaaugcgguu 600 auaaaaaaug guucagaauu aaacuuuuaa uucauucgau ug 642 <210> 7 <211> 801 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-catenin 3'UTR-2 <400> 7 aucauccuuu agcuguauug ucugaacuug cauugugauu ggccuguaga guugcugaga 60 gggcucgagg ggugggcugg uaucucagaa agugccugac acacuaacca agcugaguuu 120 ccuaugggaa caauugaagu aaacuuuuug uucugguccu uuuuggucga ggaguaacaa 180 uacaaaugga uuuugggagu gacucaagaa gugaagaaug cacaagaaug gaucacaaga 240 uggaauuuau caaacccuag ccuugcuugu uaaauuuuuu uuuuuuuuuu uuuaagaaua 300 ucuguaaugg uacugacuuu gcuugcuuug aaguagcucu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu 360 uuuugcagua acuguuuuuu aagucucucg uaguguuaag uuauagugaa uacugcuaca 420 gcaauuucua auuuuuaaga auugaguaau gguguagaac acuaauucau aaucacucua 480 auuaauugua aucugaauaa aguguaacaa uuguguagcc uuuuuguaua aaauagacaa 540 auagaaaaug guccaauuag uuuccuuuuu aauaugcuua aaauaagcag guggaucuau 600 uucauguuuu ugaucaaaaa cuauuuggga uauguauggg uaggguaaau caguaagagg 660 uguuauuugg aaccuuguuu uggacaguuu accaguugcc uuuuauccca aaguuguugu 720 aaccugcugu gauacgaugc uucaagagaa aaugcgguua uaaaaaaugg uucagaauua 780 aacuuuuaau ucauucgauu g 801 <210> 8 <211> 1106 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-catenin 3'UTR-3 <400> 8 aucauccuuu agguaagaag uuuuaaaaag ccaguuuggg uaaaauacuu uuacucugcc 60 uacagaacuu cagaaagacu ugguugguag ggugggagug guuuaggcua uuuguaaauc 120 ugccacaaaa acagguauau acuuugaaag gagaugucuu ggaacauugg aauguucuca 180 gauuucuggu uguuauguga ucaugugugg aaguuauuaa cuuuaauguu uuuugccaca 240 gcuuuugcaa cuuaauacuc aaaugaguaa cauuugcugu uuuaaacauu aauagcagcc 300 uuucucucuu uauacagcug uauugucuga acuugcauug ugauuggccu guagaguugc 360 ugagagggcu cgaggggugg gcugguaucu cagaaagugc cugacacacu aaccaagcug 420 aguuuccuau gggaacaauu gaaguaaacu uuuuguucug guccuuuuug gucgaggagu 480 aacaauacaa auggauuuug ggagugacuc aagaagugaa gaaugcacaa gaauggauca 540 caagauggaa uuuaucaaac ccuagccuug cuuguuaaau uuuuuuuuuu uuuuuuuuaa 600 gaauaucugu aaugguacug acuuugcuug cuuugaagua gcucuuuuuu uuuuuuuuuu 660 uuuuuuuuug caguaacugu uuuuuaaguc ucucguagug uuaaguuaua gugaauacug 720 cuacagcaau uucuaauuuu uaagaauuga guaauggugu agaacacuaa uucauaauca 780 cucuaauuaa uuguaaucug aauaaagugu aacaauugug uagccuuuuu guauaaaaua 840 gacaaauaga aaauggucca auuaguuucc uuuuuaauau gcuuaaaaua agcaggugga 900 ucuauuucau guuuuugauc aaaaacuauu ugggauaugu auggguaggg uaaaucagua 960 agagguguua uuuggaaccu uguuuuggac aguuuaccag uugccuuuua ucccaaaguu 1020 guuguaaccu gcugugauac gaugcuucaa gagaaaaugc gguuauaaaa aaugguucag 1080 aauuaaacuu uuaauucauu cgauug 1106 <210> 9 <211> 290 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment 2 of beta-catenin 3'UTR-1 <400> 9 gaguaacaau acaaauggau uuugggagug acucaagaag ugaagaaugc acaagaaugg 60 aucacaagau ggaauuuauc aaacccuagc cuugcuuguu aaauuuuuuu uuuuuuuuuu 120 uuaagaauau cuguaauggu acugacuuug cuugcuuuga aguagcucuu uuuuuuuuuu 180 uuuuuuuuuu uuugcaguaa cuguuuuuua agucucucgu aguguuaagu uauagugaau 240 acugcuacag caauuucuaa uuuuuaagaa uugaguaaug guguagaaca 290 <210> 10 <211> 296 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment 3 of beta-catenin 3'UTR-1 <400> 10 guaacuguuu uuuaagucuc ucguaguguu aaguuauagu gaauacugcu acagcaauuu 60 cuaauuuuua agaauugagu aaugguguag aacacuaauu cauaaucacu cuaauuaauu 120 guaaucugaa uaaaguguaa caauugugua gccuuuuugu auaaaauaga caaauagaaa 180 augguccaau uaguuuccuu uuuaauaugc uuaaaauaag cagguggauc uauuucaugu 240 uuuugaucaa aaacuauuug ggauauguau ggguagggua aaucaguaag aggugu 296 <210> 11 <211> 248 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment 4 of beta-catenin 3'UTR-1 <400> 11 ugguccaauu aguuuccuuu uuaauaugcu uaaaauaagc agguggaucu auuucauguu 60 uuugaucaaa aacuauuugg gauauguaug gguaggguaa aucaguaaga gguguuauuu 120 ggaaccuugu uuuggacagu uuaccaguug ccuuuuaucc caaaguuguu guaaccugcu 180 gugauacgau gcuucaagag aaaaugcggu uauaaaaaau gguucagaau uaaacuuuua 240 auucauuc 248 <210> 12 <211> 492 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment 2 + fragment 3 of beta-catenin 3'UTR-1 <400> 12 gaguaacaau acaaauggau uuugggagug acucaagaag ugaagaaugc acaagaaugg 60 aucacaagau ggaauuuauc aaacccuagc cuugcuuguu aaauuuuuuu uuuuuuuuuu 120 uuaagaauau cuguaauggu acugacuuug cuugcuuuga aguagcucuu uuuuuuuuuu 180 uuuuuuuuuu uuugcaguaa cuguuuuuua agucucucgu aguguuaagu uauagugaau 240 acugcuacag caauuucuaa uuuuuaagaa uugaguaaug guguagaaca cuaauucaua 300 aucacucuaa uuaauuguaa ucugaauaaa guguaacaau uguguagccu uuuuguauaa 360 aauagacaaa uagaaaaugg uccaauuagu uuccuuuuua auaugcuuaa aauaagcagg 420 uggaucuauu ucauguuuuu gaucaaaaac uauuugggau auguaugggu aggguaaauc 480 aguaagaggu gu 492 <210> 13 <211> 429 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment 3 + fragment 4 of beta-catenin 3'UTR-1 <400> 13 guaacuguuu uuuaagucuc ucguaguguu aaguuauagu gaauacugcu acagcaauuu 60 cuaauuuuua agaauugagu aaugguguag aacacuaauu cauaaucacu cuaauuaauu 120 guaaucugaa uaaaguguaa caauugugua gccuuuuugu auaaaauaga caaauagaaa 180 augguccaau uaguuuccuu uuuaauaugc uuaaaauaag cagguggauc uauuucaugu 240 uuuugaucaa aaacuauuug ggauauguau ggguagggua aaucaguaag agguguuauu 300 uggaaccuug uuuuggacag uuuaccaguu gccuuuuauc ccaaaguugu uguaaccugc 360 ugugauacga ugcuucaaga gaaaaugcgg uuauaaaaaa ugguucagaa uuaaacuuuu 420 aauucauuc 429 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FISH probe of beta-catenin 3'UTR-1 <400> 14 tgttactcct aaaggatgat ttacag 26 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FISH probe of beta-catenin 3'UTR-2 <400> 15 agacaataca gctaaaggat gatttaca 28 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FISH probe of beta-catenin 3'UTR-3 <400> 16 taaaccactc ccaccctacc aac 23 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-catenin 5'UTR Forward primer <400> 17 ggaagcttag gatacagcgg cttctgc 27 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-catenin 5'UTR Reverse primer <400> 18 ggccatggtg tccacgctgg attttca 27 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-catenin 3'UTR Forward primer <400> 19 attctagaga tactgacctg taaatcatcc 30 <210> 20 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-catenin 3'UTR Reverse primer <400> 20 catctagaaa tgaattaaaa gtttaattct gaacc 35 <210> 21 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> In-Fusion beta-catenin 3'UTR-1 Forward primer <400> 21 gccgtgtaat tctagaatca tcctttagga gtaacaa 37 <210> 22 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> In-Fusion beta-catenin 3'UTR-2 Forward primer <400> 22 gccgtgtaat tctagaatca tcctttagct gtattgt 37 <210> 23 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> In-Fusion beta-catenin 3'UTR-3 Forward primer <400> 23 gccgtgtaat tctagaatca tcctttaggt aagaagt 37 <210> 24 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> In-Fusion beta-catenin 3'UTR Reverse primer <400> 24 ccgccccgac tctagacaat cgaatgaatt aaaagt 36 <210> 25 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-catenin Coding Region Forward primer <400> 25 gcgggatcca atggctactc aagctgattt g 31 <210> 26 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-catenin Coding Region Reverse primer <400> 26 tgggatccag gtcagtatca aaccaggc 28 <210> 27 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-catenin Coding Region + 3'UTR-1 Forward Primer <400> 27 gctctagaat catcctttag gagtaacaat ac 32 <210> 28 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-catenin Coding Region + 3'UTR-2 Forward primer <400> 28 gctctagaat catcctttag ctgtattgtc t 31 <210> 29 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-catenin Coding Region + 3'UTR-3 Forward primer <400> 29 gctctagaat catcctttag gtaagaagtt ta 32 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-catenin Coding Region + 3'UTR Reverse primer <400> 30 atgggcccca atcgaatgaa ttaaaagttt 30 <210> 31 <211> 600 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin 3'UTR <400> 31 gcggacuaug acuuaguugc guuacacccu uucuugacaa aaccuaacuu gcgcagaaaa 60 caagaugaga uuggcauggc uuuauuuguu uuuuuuguuu uguuuugguu uuuuuuuuuu 120 uuuuggcuug acucaggauu uaaaaacugg aacggugaag gugacagcag ucgguuggag 180 cgagcauccc ccaaaguuca caauguggcc gaggacuuug auugcacauu guuguuuuuu 240 uaauagucau uccaaauaug agaugcguug uuacaggaag ucccuugcca uccuaaaagc 300 caccccacuu cucucuaagg agaauggccc aguccucucc caaguccaca caggggaggu 360 gauagcauug cuuucgugua aauuauguaa ugcaaaauuu uuuuaaucuu cgccuuaaua 420 cuuuuuuauu uuguuuuauu uugaaugaug agccuucgug cccccccuuc ccccuuuuuu 480 gucccccaac uugagaugua ugaaggcuuu uggucucccu gggagugggu ggaggcagcc 540 agggcuuacc uguacacuga cuugagacca guugaauaaa agugcacacc uuaaaaauga 600 600 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YFP Forward primer <400> 32 gacgcgtatg gtgagcaagg gcga 24 <210> 33 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YFP Reverse primer <400> 33 tctagattaa gctcgagatc tgagtccgg 29 <210> 34 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YFP beta-actin 3'UTR Forward primer <400> 34 ccctctagat aggcggacta tgacttagtt gcgt 34 <210> 35 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YFP beta-actin 3'UTR Reverse primer <400> 35 gcggggccct catttttaag gtgtgcactt tta 33 <210> 36 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YFP 3'UTR-1 F2 Forward primer <400> 36 ccctctagac tgtattgtct gaacttgcat t 31 <210> 37 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YFP 3'UTR-1 F2 Reverse primer <400> 37 cgcgggccct tgagtaatgg tgtagaaca 29 <210> 38 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YFP 3'UTR-1 F3 Forward primer <400> 38 ccctctagag taactgtttt ttaagtctct cgt 33 <210> 39 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YFP 3'UTR-1 F3 Reverse primer <400> 39 cgcgggccct agggtaaatc agtaagaggt gt 32 <210> 40 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YFP 3'UTR-1 F4 Forward primer <400> 40 ccctctagat ggtccaatta gtttcctttt taa 33 <210> 41 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YFP 3'UTR-1 F4 Reverse primer <400> 41 cgcgggccct aaacttttaa ttcattcgat tg 32 <210> 42 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP Forward primer <400> 42 cccgtcgact tacttgtaca gctcgtccat gcc 33 <210> 43 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP Reverse primer <400> 43 cccggatcca tggtgagcaa gggcgag 27 <210> 44 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'UTR Forward primer <400> 44 cccgaattca ggatacagcg gcttctgcg 29 <210> 45 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'UTR Reverse primer <400> 45 cccgtcgact gtccacgctg gattttcaa 29 <210> 46 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UTR-1 Forward primer <400> 46 cccggatccg agtaacaata caaatggatt ttg 33 <210> 47 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UTR-1 Reverse primer <400> 47 cgcgggcccc aatcgaatga attaaaagtt ta 32 <210> 48 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UTR-2 Forward primer <400> 48 cccggatccg taactgtttt ttaagtctct cgt 33 <210> 49 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UTR-2 Reverse primer <400> 49 cgcgggccca cacctcttac tgatttaccc 30

Claims (16)

1. 다음을 포함하는 mRNA 분자:
   (a) 목적 단백질을 코딩하는 코딩 영역;
   (b) 상기 코딩 영역의 5’말단에 결합된 β-카테닌의 5’UTR(untranslated region); 및
   (c) 상기 코딩 영역의 3’말단에 결합된 β-카테닌의 3’UTR의 단편, 상기 β-카테닌의 3’UTR의 단편은 서열번호 10의 RNA 서열로 이루어진 것임.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 5’UTR은 서열번호 1의 RNA 서열로 이루어진 것인, mRNA 분자.
   
3. 제1항 또는 제2항의 mRNA 분자를 코딩하는 핵산 분자.
   
4. 제3항의 핵산 분자를 포함하는 발현 컨스트럭트.
   
5. 제4항의 발현 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터.
   
6. 제5항의 재조합 벡터를 포함하는 분리된 숙주세포.
   
7. 목적 단백질을 코딩하는 RNA 서열의 5’ 말단 및 3’ 말단에 각각 β-카테닌의 5’UTR 및 β-카테닌의 3’UTR의 단편을 결합시키는 단계를 포함하는 목적 단백질의 발현 효율이 증진된 mRNA 제조 방법으로서, 상기 β-카테닌의 3’UTR의 단편은 서열번호 10의 RNA 서열로 이루어진 것인, 목적 단백질의 발현 효율이 증진된 mRNA 제조 방법.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 mRNA는 시험관 내 전사(in vitro transcription)를 통하여 제조되는 것인, 목적 단백질의 발현 효율이 증진된 mRNA 제조 방법.
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