KR102560025B1 - 뇌졸중의 치료 또는 예방 방법 - Google Patents

뇌졸중의 치료 또는 예방 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102560025B1
KR102560025B1 KR1020177016154A KR20177016154A KR102560025B1 KR 102560025 B1 KR102560025 B1 KR 102560025B1 KR 1020177016154 A KR1020177016154 A KR 1020177016154A KR 20177016154 A KR20177016154 A KR 20177016154A KR 102560025 B1 KR102560025 B1 KR 102560025B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
stroke
vegf
seq
compound
Prior art date
Application number
KR1020177016154A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20170082631A (ko
Inventor
울프 에릭손
잉그리스 닐슨
다니엘 로렌스
수 엔밍 조
Original Assignee
씨에스엘 리미티드
비-크리에이티브 스웨덴 아베
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2014904606A external-priority patent/AU2014904606A0/en
Application filed by 씨에스엘 리미티드, 비-크리에이티브 스웨덴 아베 filed Critical 씨에스엘 리미티드
Publication of KR20170082631A publication Critical patent/KR20170082631A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102560025B1 publication Critical patent/KR102560025B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/4886—Metalloendopeptidases (3.4.24), e.g. collagenase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/49—Urokinase; Tissue plasminogen activator
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21068—Tissue plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21073—Serine endopeptidases (3.4.21) u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24029—Aureolysin (3.4.24.29)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Abstract

개체의 뇌졸중의 영향을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 개체에 VEGF-B 신호 전달을 억제하는 화합물을 투여하는 것을 포함한다.

Description

뇌졸중의 치료 또는 예방 방법 {Method of Treating or Preventing Stroke}
본 발명은 혈관 내피 성장 인자-B (VEGF-B)의 길항에 의해 개체의 뇌졸중을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
관련 출원 데이터
본원은 2014년 11월 17일자로 출원된, 발명의 명칭 "뇌졸중의 치료 또는 예방 방법 (Method of Treating or Preventing Stroke)"이라는 호주 특허 출원 제2014904606호를 우선권 주장한다. 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
서열목록
본원은 전자 형태의 서열 목록과 함께 출원된다. 서열 목록의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
뇌졸중은 호주에서 심장 질환 다음으로 두번째 주요 사망 원인 및 장애 원인이다. 미국에서는 세번째로 큰 사망 원인이며, 매년 뇌졸중으로 14만명이 사망한다. 또한, 미국에서 심각한 장기간 장애의 주요 원인이기도 하다. 2005년에서 2050 년 사이에 미국에서 뇌졸중에 대한 예상 비용은 2조2천억 달러이다.
장애는 뇌졸중 생존자의 75%에게 그들의 고용 가능성을 감소시킬 만큼 충분히 영향을 미친다. 뇌졸중은 신체적, 정신적, 정서적 또는 세 가지의 조합에 영향을 줄 수 있다. 뇌졸중으로 유발될 수 있는 신체 장애 중 일부는 근육 약화, 마비, 욕창, 폐렴, 요실금, 실행증 (숙련 운동을 할 수 없음), 일상생활 수행의 어려움, 식욕 상실, 언어 상실, 시력 상실 및 통증을 포함한다. 뇌졸중이 매우 심하거나 뇌간의 일부와 같은 특정 위치에 있으면, 혼수상태 또는 사망이 발생할 수 있다.
뇌졸중으로 인한 정서적 문제는 뇌의 감정적인 중심에 대한 직접적인 손상의 결과 또는 좌절감과 새로운 한계에 적응하기 어려움으로 인한 결과로 발생할 수 있다. 뇌졸증 후 감정적인 어려움에는 우울증, 불안, 공황 발작, 정동 장애 (감정 표현이 없는 상태), 조증, 무관심 및 정신병이 포함된다.
뇌졸중으로 인한 인지적 장애로는 지각 장애, 언어 장애, 치매, 주의력 및 기억력 문제가 있다. 뇌졸중 환자는 자신의 장애를 인식하지 못하는 실인증이라 불리는 상태일 수도 있다. 편측 공간 무시 (hemispatial neglect)라고 불리는 상태에서, 환자는 손상된 뇌의 반구와 반대편 공간에 있는 어떤 것도 인지할 수 없다.
모든 뇌졸중 환자의 최대 10%가 발작을 일으키고, 가장 일반적으로 사건 발생 후 일주일 내에 발작한다. 뇌졸중의 중증도는 발작의 가능성을 높인다.
뇌졸중은 뇌로의 혈액 공급 장애 때문에 뇌 기능이 급속히 상실되는 현상이다. 이는 폐색 (혈전증, 동맥 색전증) 또는 출혈 (혈액 누출)로 인한 허혈 (혈류 부족) 때문일 수 있다. 결과적으로, 뇌에서 영향을 받는 부분은 기능을 할 수 없기 때문에, 신체의 한쪽 면에서 하나 이상의 팔다리를 움직이지 못하거나, 말을 이해하거나 공식화할 수 없거나, 시야의 한쪽 면을 볼 수 없게 될 수 있다. 뇌졸중은 종종 신경 세포의 죽음을 초래하고 사망으로 이어질 수 있다.
뇌졸중에는 두가지 일반적인 유형이 있다: (i) 허혈성 뇌졸중은 뇌에 대한 일시적인 또는 영구적인 폐색으로 야기되며 뇌졸중의 85%를 차지하며, (ii) 출혈성 뇌졸중은 파열된 혈관에 의해 야기되며 나머지 뇌졸중의 대부분을 차지한다. 허혈성 뇌졸중의 가장 흔한 원인은 대뇌 (예 : 대뇌 피질) 손상, 예를 들어 뇌의 운동 및 감각 피질을 손상시키는 중대뇌동맥 (내경동맥 하류의 뇌내 동맥)의 폐색이다. 이러한 손상으로 인해 편측마비 (hemiplegia), 반감각소실 (hemi-anesthesia)이 발생하고, 손상된 대뇌 반구에 따라 언어 또는 시각 장애가 발생한다.
루벨졸 (Rubeluzole)을 포함하는 N-메틸-D-아스파르테이트 수용체 길항제, 날메핀 (nalmefene), 클로메티아졸 (clomethiazole), 칼슘 채널 차단제 (α-아미노-3-하이드록시-5-메틸이속사졸-4-프로피온산 길항제, 세로토닌 작용제 (예 : 레피 노탄), 및 막 투과성 칼륨 채널 조절제를 포함), 티릴라자드 (tirilazad), 항-ICAM-1 항체, 인간 항백혈구성 항체 (Hu23F2G), 항혈소판 항체 (예를 들어, abciximab), 시티콜린 (외인성 형태의 시티딘-5'-디포스포콜린) 및 염기성 섬유 모세포 성장 인자 (bFGF)를 포함하는 일부 신경 보호제의 뇌졸중 치료에 대한 효능을 시험하였으나, 실패하였다.
전술한 내용으로부터 뇌졸중 치료제에 대한 필요성이 명백해질 것이다.
뇌졸중 후에도 성장 인자 VEGF-B의 신경 생존에 대한 영향이 연구되어 왔다. Sun et al., J. Cereb . Blood Flow and Metab ., 24:1146-1152, 2004.에서는 VEGF-B가 결여된 마우스에서 뇌졸중을 연구한 결과, 이 성장 인자의 결여가 현저히 큰 경색부피 및 신경학적 손상을 초래한다는 것을 발견했다. Li et al., J Clin. Invest., 118:913-923, 2008에서는 뇌졸중이 유도된 마우스의 뇌에 VEGF-B를 주입하여 세포사멸로부터 뉴런을 구제하는 것을 보여주었고, 뇌졸중 후 치료적 이점을 제공하는데 있어서 이 성장 인자의 역할을 다시 제안하였다. 이러한 연구들은 확장하여 Li et al., Cell Adhesion and Migration, 3:322-327, 2009에서는 VEGF-B가 세포사멸에 대한 뉴런을 보호하고, 이 성장 인자가 퇴행성 신경 질환을 치료하는데 치료적 가치가 있다고 제안하였다.
본 발명을 수행함에 있어서, 본 발명자들은 허혈성 뇌졸중과 같은 마우스의 뇌졸중 모델에서 혈관 내피 성장 인자-B (VEGF-B)의 신호전달 억제의 효과를 연구하였다. 본 발명자들은 뇌졸중의 유도 전후에 VEGF-B의 길항제 (예 : 길항 항체)를 투여함으로써 상기 성장인자의 효과를 연구하였다. 위에서 논의된 연구에 암시된 것과 대조적으로, 본 발명자들은 경색 크기, 뇌내 출혈 스코어 또는 혈액뇌장벽 (blood brain barrier) 파괴와 같은 뇌졸중의 영향을 감소시킬 수 있었다. 이는 뇌졸중의 발생을 예방하는 것과는 별개이다. 본 발명자들은 또한 경색 크기, 출혈 (예를 들어, 뇌내 출혈) 및 치명적인 출혈의 수를 감소시킴으로써 뇌졸중의 혈전 용해술의 결과를 개선시킬 수 있었다. 본 발명자들은 또한 뇌졸중 후 VEGF-B의 길항제 (예컨대, 길항 항체)를 투여하는 것은 혈전 용해제가 개체에 안전하게 투여될 수 있는 시간을 연장 시킨다는 것을 보여 주었다.
본 발명자들의 발견은 VEGF-B 신호전달을 억제함으로써 개체에서 뇌졸중의 영향을 감소시키는 방법의 기초를 제공한다. 이 발견은 또한 VEGF-B 신호전달을 억제함으로써 뇌졸중의 예방 또는 치료 방법의 기초를 제공한다.
예를 들어, 본원은 VEGF-B 신호 전달을 억제하는 화합물을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 뇌졸중의 영향을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명자들은 또한 뇌졸중을 앓은 개체에서 출혈의 빈도를 감소시킬 수 있음을 발견하였다. 따라서, 본원은 또한 뇌졸중을 앓은 개체에서 출혈의 빈도를 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물을 투여하는 단계를 포함한다. 일 예에서, 상기 방법은 혈전 용해제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
이러한 발견은 또한 출혈을 예방하기 위해 뇌졸중, 예를 들어 뇌내 출혈을 앓은 개체를 계속 치료하거나 또는 치료를 시작하기 위한 방법의 기초를 제공하며, 상기 방법은 VEGF-B 신호 전달을 억제하는 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 개체는 뇌출혈과 같은 출혈의 위험을 감소시키거나 예방하기 위해 본원에 개시된 방법을 수행한 후에 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물로 재치료될 수 있다.
본 발명자들은 또한 뇌졸중을 앓은 개체에서 치명적인 출혈의 가능성을 감소시킬 수 있다는 것을 발견했다. 따라서, 본원은 또한 뇌졸중을 앓은 개체에서 치명적인 출혈의 가능성을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 VEGF-B 신호 전달을 억제하는 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 일 예에서, 상기 방법은 혈전 용해제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명자들은 또한 혈액뇌장벽 (blood brain barrier) 파괴 또는 누출을 감소시킬 수 있음을 발견하였다. 따라서, 본 발명자들은 또한 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 혈액뇌장벽 파괴 또는 누출을 예방하는 방법을 제공한다. 일 실시예에서, 혈액뇌장벽 파괴 또는 누출은 부종과 관련된다. 일 실시예에서, 혈액뇌장벽 파괴 또는 누출은 상해, 예를 들어, 외상 및 / 또는 허혈에 의해 야기된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일 예에서, VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물은 뇌졸중 전후에 투여된다. 예를 들어, 화합물은 예방적으로 또는 치료학적으로 투여된다. 일 예에서, 화합물은 뇌졸중 전에 투여된다. 일 예에서, 화합물은 뇌졸중 후에 투여된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일 예에서, 화합물은 뇌졸중 전에 투여되고 뇌졸중 위험이 있는 개체에 투여된다.
뇌졸중의 위험이 있는 예시적인 대상은 당뇨병 및 / 또는 비만증이다. 예를 들어 당뇨병은 제2형 당뇨병이다.
뇌졸중으로 고통받을 위험이 있는 개체의 부가적 또는 대안적인 특징은 다음 특성 중 하나 이상을 포함한다 :
● 이미 뇌졸중 및 / 또는 일과성 허혈 발작으로 고통을 받았음;
● 뇌졸중의 가족력이 있음;
● 심장병으로 고통을 받음;
● 고혈압이 있음;
● 혈장 저밀도지질단백질 (LDL) 수치가 높음;
● 대사 증후군이 있음;
● 심장 이상이 있음; 및 / 또는
● 수술을 받았음.
일 예에서, 개체는 추가로 55세 이상, 예를 들어 65세 이상 또는 75세 이상이다.
본 명세서에 설명된 임의의 방법의 일 예에서, VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물은 뇌졸중 후에 투여되고, 상기 방법은 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물 및 혈전 용해제의 조합을 병용투여하는 것을 포함한다. 따라서, VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물은 치료학적으로 투여된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일 예에서, VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물은 뇌졸중 증상의 발병 후 약 1 내지 10 시간 동안 투여된다. 예를 들어, VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물은 뇌졸중 증상의 발병 후 약 1 내지 5 시간 동안 투여된다. VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물은 뇌졸중 증상의 발병 후 약 1 내지 4 시간 동안 투여된다. VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물은 뇌졸중 증상의 발병 후 약 1 시간 동안 투여된다.
뇌졸중의 증상은 통상의 기술자에게 명백할 것이며, 예를 들어 안면 약화, 팔 약화 및 / 또는 말하기 어려움 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일 예에서, VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물은 혈전 용해제 전에 투여된다. 예를 들어, VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물은 혈전 용해제가 투여되기 약 1 시간 내지 약 10 시간 전에 투여된다. 예를 들어, VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물은 혈전 용해제가 투여되기 약 1 시간 내지 약 6 시간 전에 투여된다. 예를 들어, VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물은 혈전 용해제가 투여되기 약 2 시간 내지 약 6 시간 전에 투여된다. 예를 들어, VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물은 혈전 용해제가 투여되기 약 3 시간 내지 약 5 시간 전에 투여된다. 예를 들어, VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물은 혈전 용해제가 투여되기 약 4 시간 전에 투여된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일 예에서, VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물은 뇌졸중 증상 발병 후 약 1 시간 및 혈전 용해제 투여 약 4 시간 전에 투여된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일 예에서, VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물의 투여는 혈전 용해제가 개체에 안전하게 투여될 수 있는 시간을 연장시킨다. 따라서, 본 발명은 또한 혈전 용해제가 개체에 안전하게 투여될 수 있는 시간을 연장시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물을 투여 한 다음 혈전 용해제를 투여하는 것을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일 예에서, 뇌졸중 증상의 발병 후 2 시간 이상 동안 상기 혈전 용해제를 투여한다. 예를 들어, 혈전 용해제는 뇌졸중의 증상 발병 후 3 시간 이상 투여된다. 예를 들어, 혈전 용해제는 뇌졸중 증상 발병 후 4 시간 이상 투여된다. 예를 들어, 혈전 용해제는 뇌졸중의 증상 발병 후 5 시간 이상 투여된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일 예에서, 혈전 용해제는 뇌졸중의 증상이 시작되는 시점 및 뇌졸중의 증상이 시작된 후 약 10 시간 동안 투여된다. 예를 들어, 혈전 용해제는 뇌졸중 증상의 발병 후 약 4 시간 내지 약 10 시간 동안 투여된다. 예를 들어, 혈전 용해제는 뇌졸중 증상의 발병 후 약 4 시간 내지 약 8 시간 동안 투여된다. 예를 들어, 혈전 용해제는 뇌졸중 증상의 발병 후 약 3 시간 내지 6 시간 동안 투여된다. 예를 들어, 혈전 용해제는 뇌졸중 증상의 발병 후 약 4 시간 내지 6 시간 동안 투여된다. 예를 들어, 혈전 용해제는 뇌졸중 증상의 발병 후 약 5 시간 동안 투여된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일 예에서, VEGF-B 신호 전달을 억제하는 화합물은 뇌졸중 증상의 발병 후 약 1 시간 동안 투여되고, 혈전 용해제는 뇌졸중 증상 발병 후 약 5 시간 동안 투여된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일 예에서, 상기 혈전 용해제는 조직 플라스미노겐 활성제, 라네토플라제 (lanetoplase), 레테플라제 (reteplase), 스타필로키나제 (staphylokinase), 스트렙토키나제 (streptokinase), 아니스트레플라제 (anistreplase), 데스모테플라제 (desmoteplase) 또는 유로키나아제 (urokinase)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일 예에서, 개체는 공복 혈당 수치가 상승하였다. 예를 들어, 개체는 공복 혈당치가 150mg/dL 이상이다. 예를 들어, 개체는 공복 혈당 수치가 180mg/dL 이상이다. 예를 들어, 개체는 공복 혈당 수치가 200mg/dL 이상이다. 예를 들어, 개체는 공복 혈당치가 300mg/dL 이상이다. 예를 들어, 개체는 공복 혈당 수치가 400mg/dL 이상이다.
일 실시예에서, 뇌졸중의 증상은 다음에서 선택된다:
● 경색 크기;
● 개체에서 출혈 발병률 감소;
● 개체에서 치명적인 출혈 가능성 감소; 및 / 또는
● 개체의 뇌내 출혈 점수에 의해 평가된 출혈 점수; 및 / 또는
● 뇌졸중 후 혈액뇌장벽 (blood brain barrier) 파괴 또는 누출.
본원에 개시된 임의의 방법의 일 예에서, 뇌졸중 후 혈액뇌장벽 파괴 또는 개체에서의 누출은 뇌부종을 초래할 수 있다.
전술한 것들의 각각을 평가하는 방법은 당업계에 공지되어 있고 / 있거나 본원에 기술되어 있다.
뇌졸중의 부가적인 영향은 당업계에 공지되어 있고 / 있거나 본원에 기술되어 있으며, 예를 들어, 마비, 부분 마비, 불분명한 발음, 비통합된 운동, 근력 약화, 저삼투압, 과민성 또는 비자발적 비정상 운동과 같은 운동 장애를 일으킬 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일 예에서, 화합물(들)은 다음 효과 중 하나 이상을 갖기에 충분한 양으로 투여된다:
● 개체에서 경색 크기 감소;
● 개체의 뇌내 출혈 점수에 의해 평가된 출혈 점수 감소;
● 개체의 혈액뇌장벽 파괴 또는 누출 감소; 및 / 또는
● 뇌졸중 후 뇌부종 감소.
본원에 기재된 임의의 방법의 일 예에서, 뇌졸중은 허혈성 뇌졸중이다. 예를 들어, 뇌졸중은 뇌 허혈성 뇌졸중이다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일 예에서, VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물은 VEGF-B에 결합한다. 예를 들어, 화합물은 VEGF-B에 결합하거나 VEGF-B에 특이 적으로 결합하고 VEGF-B 신호전달을 중화하는 항체 가변영역을 포함하는 단백질이다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일 예에서, 화합물은 항체 유사체이다. 예를 들어, 상기 화합물은 면역 글로불린의 항원 결합 도메인, 예를 들어 IgNAR, 카멜리드 항체 또는 T 세포 수용체를 포함하는 단백질이다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일 예에서, 화합물은 도메인 항체 (예를 들어, VEGF-B에 결합하는 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역만을 포함함) 또는 중쇄만의 항체 (예 : 카멜리드 항체 또는 IgNAR) 또는 이의 가변 영역이다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일 예에서, 화합물은 Fv를 포함하는 단백질이다. 예를 들어, 상기 단백질은 다음으로 이루어진 군에서 선택된다:
(i) 단일 사슬 Fv 단편 (scFv);
(ii) 이량 체 scFv (di-scFv); 또는
(iv) 디아바디 (diabody);
(v) 트리아바디 (triabody);
(vi) 테트라바디;
(vii) Fab;
(viii) F(ab')2;
(ix) Fv; 또는
(x) 항체 Fc 또는 중쇄 불변 도메인 (CH)2 및 / 또는 CH3의 불변 영역에 연결된 (i) 내지 (ix) 중 하나.
본원에 기재된 임의의 방법의 또 다른 예에서, 화합물은 항체이다. 예시적인 항체는 전장 및 / 또는 네이키드 (naked) 항체이다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일 예에서, 상기 화합물은 재조합, 키메라, CDR 이식체, 인간화, 합성인간화, 영장류화, 탈면역화 또는 인간 단백질이다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일 예에서, 화합물은 VEGF-B에 항체 2H10의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체 가변영역을 포함하는 단백질이다. 일 예에서, 상기 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 (VH) 및 서열번호 4로 표시되는 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 (VL)을 포함한다.
일 예에서, 화합물은 항체 2H10의 인간화된 가변영역을 포함하는 단백질이다. 예를 들어, 상기 단백질은 항체 2H10의 VH 및 / 또는 VL의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 가변영역을 포함한다. 예를 들어, 상기 단백질은 다음을 포함한다:
(i) (a) 서열번호 3의 아미노산 25-34에 기재된 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열번호 3의 아미노산 49-65에 기재된 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열번호 3의 아미노산 98-108에 기재된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH; 및 / 또는
(ii) (a) 서열번호 4의 아미노산 23-33에 기재된 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열번호 4의 아미노산 49-55에 기재된 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열번호 4의 아미노산 88-96에 기재된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL.
본원에 기재된 임의의 방법의 일 예에서, 화합물은 VH 및 VL을 포함하는 단백질이고, VH 및 VL은 항체 2H10의 인간화된 가변영역이다. 예를 들어, 단백질은 다음을 포함한다:
(i) (a) 서열번호 3의 아미노산 25-34에 기재된 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열번호 3의 아미노산 49-65에 기재된 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열번호 3의 아미노산 98-108에 기재된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH; 및
(ii) (a) 서열번호 4의 아미노산 23-33에 기재된 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열번호 4의 아미노산 49-55에 기재된 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열번호 4의 아미노산 88-96에 기재된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL.
핵산에 의해 암호화된 서열은 발현 중에 생산될 수 있는 모든 서열의 변이체를 포함하는 것은 당업자에게 명백하다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일 예에서, 전술된 상기 가변영역 또는 VH는 서열번호 5로 표시되는 서열을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일 예에서, 전술된 상기 가변영역 또는 VL은 서열번호 6으로 표시되는 서열을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일 예에서, 화합물은 항체이다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일 예에서, 상기 화합물은 서열번호 5로 표시되는 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 6으로 표시되는 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체이다.
일 실시예에서, 단백질 또는 항체는 전술한 상기 단백질 또는 항체를 암호화하는 핵산에 의해 암호화되는 단백질 또는 항체의 임의의 형태이다.
일 예에서, 단백질 또는 항체는 다음을 포함한다:
(i) (a) 서열번호 12를 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열번호 13을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열번호 14를 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH; 및 / 또는
(ii) (a) 서열번호 15를 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열번호 16을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열번호 17을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL.
일 예에서, 단백질 또는 항체는 다음을 포함한다:
(i) (a) 서열번호 24를 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열번호 25를 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열번호 26을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH; 및 / 또는
(ii) (a) 서열번호 27을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열번호 28을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열번호 29를 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL.
일 예에서, 단백질 또는 항체는 다음을 포함한다:
(i) (a) 서열번호 36을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열번호 37을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열번호 38을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH; 및 / 또는
(ii) (a) 서열번호 39를 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열번호 40을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열번호 41을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화되는 서열을 포함하거나 또는 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL.
일 예에서, 화합물은 조성물 내에 존재한다. 예를 들어, 상기 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 항체 가변영역 또는 VH 또는 VL 또는 항체를 포함하는 단백질을 포함한다. 일 예에서, 상기 조성물은 단백질 또는 항체의 하나 이상의 변이체를 추가로 포함한다. 예를 들어, 상기 변이체는 암호화된 C-말단 라이신 잔기가 결실된 변이체, 단백질의 N-말단에서 탈아미드화된 변이체 및 / 또는 글리코실화된 변이체 및 / 또는 피로글루타메이트를 포함하는 변이체, 및 / 또는 항체 또는 V 부위의 N-말단 글루타민 같은 N-말단 잔기가 결실된 변이체, 및 / 또는 분비 신호의 전부 또는 일부를 포함하는 변이체를 포함한다. 암호화된 아스파라긴 잔기의 deamidated 변이체는 이소아스파르트산과 아스파르트산 이성체 또는 심지어 인접한 아미노산 잔기를 포함하는 숙신아미드를 생성할 수 있다. 암호화된 글루타민 잔기의 deamidated 변이체는은 글루탐산을 초래할 수 있다. 이러한 서열 및 변이체의 이종 혼합물을 포함하는 조성물은 특정 아미노산 서열에 대해 언급될 때 포함되는 것으로 의도된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일 예에서, VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물은 VEGF-B의 발현을 억제 또는 예방한다. 예를 들어, 상기 화합물은 안티센스, siRNA, RNAi, 리보자임 및 DNAzyme 군으로부터 선택된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일 예에서, VEGF-B는 포유동물 VEGF-B, 예를 들어, 인간 VEGF-B이다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일 예에서, 개체는 포유류, 예를 들어 인간과 같은 영장류이다.
본원에 기재된 치료는 추가로 화합물을 투여하여 뇌졸중의 영향을 감소, 치료 또는 예방하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 뇌졸중의 영향을 감소시키는데 사용하기 위한 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물을 제공한다.
본 발명은 또한 뇌졸중의 영향을 감소시키기 위한 약제의 제조에서 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 뇌졸중의 영향을 감소시키는데 사용하기 위한 지침을 담은 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물을 포함하는 키트를 제공한다. 선택적으로, 키트는 혈전용해제 화합물을 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 뇌졸중을 앓은 개체에 혈전용해제 화합물과 함께 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물을 병용투여하기 위한, 지시와 함께 패키지된 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물을 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 뇌졸중을 앓은 개체에 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물과 함께 혈전 용해제를 병용투여하기 위한, 지시와 함께 패키지된 혈전 용해제를 포함하는 키트를 제공한다.
뇌졸중의 영향 및 화합물의 예시는 본원에 기재되어 있으며, 이전 여섯 단락에서 개시된 예에 준용하여 적용되어야 한다.
도 1a는 혈관 내피 성장 인자-B (VEGF-B) 단백질을 2시간 처리 후 지방산의 내피세포 흡수가 유의하게 증가된 것을 BODIPY-C12 추적자를 사용하여 측정한 그래프이다.
도 1b는 VEGF-B 단백질을 2시간 처리 후 포도당의 내피세포 흡수가 현저하게 감소된 것을 형광 포도당 유사체 (2-NBDG)를 사용하여 측정한 그래프이다. 값은 정상 흡수율과 대조군의 비율이다. 대조군과 비교하여 * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001.
도 1c는 2시간 또는 하룻밤 (o/n) 동안 지방산 (FA; 25μM 팔미트산 나트륨 및 25μM 올레산 나트륨)에 노출시킨 1차 (primary) 내피세포에서 (2-NBDG를 사용하여 측정했을 때) 포도당 흡수능 감소를 나타내는 그래프이다. 값은 평균 ± SEM이다. 대조군과 비교하여 ** P <0.01.
도 2a는 연령이 일치하는 정상 식이 마우스와 비교하여 식이-유도 비만 (DIO) 마우스에서 상승된 혈당치를 나타내는 그래프이다. 값은 평균 ± SEM이다. 대조군과 비교하여 *** P <0.001.
도 2b는 연령이 일치하는 정상 식이 마우스와 비교하여 식이-유도 비만 (DIO) 마우스에서 허혈성 뇌졸중 후 더 큰 경색 용적을 나타내는 그래프이다. 경색량은 TTC 염색에 의해 72 시간에 측정되었다. 값은 평균 ± SEM, n=10 / 그룹이다. 대조군과 비교하여 * P <0.01.
도 2c는 연령이 일치하는 정상 식이 마우스와 비교하여 DIO 마우스에서 허혈성 뇌졸중 후 증가된 출혈 스코어를 나타내는 그래프이다. 출혈은 스코어링 시스템에 의해 72 시간에 평가되었다. 값은 평균 ± SEM, n=10/그룹이다. 대조군과 비교하여 * P <0.01.
도 2d는 허혈성 뇌졸중 3 시간 후 DIO 마우스에서 qPCR에 의해 측정된 Nrp1 발현은 증가하는 반면, Vegfb 및 그의 수용체인 Vegfr1 ( Flt1 )의 전사수준은 대조군과 유의한 차이가 없다는 것을 나타내는 그래프이다. 값은 평균 ± SEM, n=3/그룹이다. 대조군과 비교하여 ** P <0.01.
도 3a는 2H10을 사용한 VEGF-B 길항 작용이 이소형 대조군 IgG로 처리된 마우스와 비교하여 DIO 마우스의 뇌에서 포도당 유사체 18F-데옥시글루코스 (18FDG) 흡수를 향상시키는 것을 나타내는 그래프이다. 2H10 처리된 식이로 유도 된 비만 마우스에서의 포도당 유사체 섭취량은 마른 생쥐에서 관찰된 것과 유사했다. n=2-5/군, 평균 ± SEM. #p <0.05, ** p <0.01.
도 3b는 VEGF-B 차단 항체 2H10의 전처리에 의해 연령이 일치하는 정상 식이 마우스와 비교하여 DIO 마우스에서 허혈성 뇌졸중 후 경색 부피가 감소된 것을 나타내는 그래프이다. 경색 부피는 2,3,5-triphenyltetrazolium-chloride (TTC) 염색으로 72 시간에 측정되었다. 값은 평균 ± SEM, n=10/그룹이다. 대조군과 비교하여 ** P <0.01.
도 3c는 VEGF-B 차단 항체 2H10의 전처리에 의해 연령이 일치하는 정상 식이 마우스와 비교하여 DIO 마우스에서 허혈성 뇌졸중 후 출혈 스코어가 감소된 것을 나타내는 그래프이다. 출혈은 스코어 시스템에 의해 72 시간에 평가되었다. 값은 평균 ± SEM, n=10/그룹이다. 대조군과 비교하여 ** P <0.01.
도 3d는 항-VEGF-B 항체 2H10으로 예방 치료한 다음, 허혈성 뇌졸중 1 시간 후 허혈성 음영부에서 포도당 전달체 Glut-1의 발현이 유지된 것을 나타내는 그래프이다. N=5/그룹. 평균 ± SEM, * p <0.05 vs 대조군, #p <0.05 vs 대조군.
도 3e는 DIO 마우스에서 항-VEGF-B 항체 2H10에 의한 예방 치료가 허혈성 뇌졸중 1 시간 후 혈액뇌장벽 누출 (덱스트란 유출로 측정)을 감소시키는 것을 나타내는 그래프이다. N=5/군, 평균 ± SEM, ** p <0.01.
도 3f는 예방적 항-VEGF-B 항체 처리에 의해 IgG 대조군 처리 마우스와 비교하여 DIO 마우스에서 허혈성 뇌졸중 후 오클루딘 (Occludin) 세린 인산화 (세린 잔기 490)의 감소를 나타내는 그래프이다. 대측성 반구 및 동측 음영부에서 포스포세린 특이적 항-오클루딘 항체로 염색을 정량화하여 픽셀 강도로 나타내었다. N=3, * p <0.05.
도 3g는 DIO 마우스에서 허혈성 뇌졸중 3 시간 후 대뇌 혈관에서의 지질 축적 (혈관 아디포필린 면역 염색법에 의해 측정)이 이소형 대조군 처리 (IgG)와 비교하여 항-VEGF-B 항체 2H10의 예방 치료에 의해 차단되는 것을 나타내는 그래프이다. 평균 ± SEM, ** p <0.01.
도 4a는 2H10 항체에 의한 VEGF-B 억제가 허혈성 뇌졸중 후 DIO 마우스에서 후기 혈전용해 후의 뇌졸중 부피를 상당히 감소시킴을 나타내는 그래프이다. 경색 크기는 TTC 염색에 의한 허혈성 뇌졸중 72 시간 후에 측정되었다. N=6-10/그룹, 평균 + SEM, ** p <0.01.
도 4b는 2H10 항체에 의한 VEGF-B의 억제가 허혈성 뇌졸중 후 DIO 마우스에서 후기 혈전용해 후의 출혈 스코어를 현저히 감소시키는 것을 나타내는 그래프이다. 출혈 스코어는 허혈성 뇌졸중 72 시간 후 조직학적으로 측정되었다. N=6-10/그룹, 평균 + SEM, ** p <0.01.
도 4c는 2H10 항체에 의한 VEGF-B의 억제가 허혈성 뇌졸중 후 식이-유도 비만 마우스의 후기 혈전용해 후의 생존 결과를 개선시키는 것을 보여주는 카플란 마이어 (Kaplan Meier) 생존 분석이다. N=10/군, 평균 + SEM, * p <0.05.
서열목록에 대한 설명
서열번호 1은 21개 아미노산 N-말단 신호 서열을 함유하는 인간 VEGF-B186 이소형의 아미노산 서열이다.
서열번호 2는 21개 아미노산 N-말단 신호 서열을 함유하는 인간 VEGF-B167 이소형의 아미노산 서열이다.
서열번호 3은 항체 2H10의 VH로부터의 아미노산 서열이다.
서열번호 4는 항체 2H10의 VL로부터의 아미노산 서열이다.
서열번호 5는 항체 2H10의 인간화 형태의 VH로부터의 아미노산 서열이다.
서열번호 6은 항체 2H10의 인간화 형태의 VL의 아미노산 서열이다.
서열번호 7은 항체 4E12의 VH로부터의 아미노산 서열이다.
서열번호 8은 항체 4E12의 VL의 아미노산 서열이다.
서열번호 9는 항체 2F5의 VH로부터의 아미노산 서열이다.
서열번호 10은 항체 2F5의 VL의 아미노산 서열이다.
서열번호 11은 재조합 인간 조직 플라스미노겐 활성제의 아미노산 서열이다.
서열번호 12는 항체 2H10의 VL CDR1로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 13은 항체 2H10의 VL CDR2로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 14는 항체 2H10의 VL CDR3으로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 15는 항체 2H10의 VH CDR1로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 16은 항체 2H10의 VH CDR2로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 17은 항체 2H10의 VH CDR3로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 18은 항체 2H10의 VL CDR1로부터의 아미노산 서열이다.
서열번호 19는 항체 2H10의 VL CDR2로부터의 아미노산 서열이다.
서열번호 20은 항체 2H10의 VL CDR3으로부터의 아미노산 서열이다.
서열번호 21은 항체 2H10의 VH CDR1로부터의 아미노산 서열이다.
서열번호 22는 항체 2H10의 VH CDR2로부터의 아미노산 서열이다.
서열번호 23은 항체 2H10의 VH CDR3으로부터의 아미노산 서열이다.
서열 번호 24는 항체 2F5의 VL CDR1로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 25는 항체 2F5의 VL CDR2으로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 26은 항체 2F5의 VL CDR3으로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 27은 항체 2F5의 VH CDR1로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 28은 항체 2F5의 VH CDR2로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 29는 항체 2F5의 VH CDR3으로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 30은 항체 2F5의 VL CDR1로부터의 아미노산 서열이다.
서열번호 31은 항체 2F5의 VL CDR2로부터의 아미노산 서열이다.
서열번호 32는 항체 2F5의 VL CDR3으로부터의 아미노산 서열이다.
서열번호 33은 항체 2F5의 VH CDR1로부터의 아미노산 서열이다.
서열번호 34는 항체 2F5의 VH CDR2로부터의 아미노산 서열이다.
서열번호 35는 항체 2F5의 VH CDR3으로부터의 아미노산 서열이다.
서열번호 36은 항체 4E12의 VL CDR1로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 37은 항체 4E12의 VL CDR2로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 38은 항체 4E12의 VL CDR3으로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 39는 항체 4E12의 VH CDR1로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 40은 항체 4E12의 VH CDR2로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 41은 항체 4E12의 VH CDR3으로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 42는 항체 4E12의 VL CDR1로부터의 아미노산 서열이다.
서열번호 43은 항체 4E12의 VL CDR2로부터의 아미노산 서열이다.
서열번호 44는 항체 4E12의 VL CDR3으로부터의 아미노산 서열이다.
서열번호 45는 항체 4E12의 VH CDR1로부터의 아미노산 서열이다.
서열번호 46은 항체 4E12의 VH CDR2로부터의 아미노산 서열이다.
서열번호 47은 항체 4E12의 VH CDR3으로부터의 아미노산 서열이다.
일반설명
본 명세서 전체에 걸쳐서, 특별히 달리 언급되거나 문맥상 달리 필요하지 않는 한, 단일 단계, 물질 조성물, 단계들의 군 또는 물질 조성물들의 군에 대한 언급은 상기 단계들, 물질 조성물들, 단계들의 군 또는 물질 조성물들의 군의 1개 및 다수(즉, 1개 이상)를 포함하는 것으로 이해해야 한다.
당해 분야에 숙련된 자라면 본 개시내용이 명확하게 기술된 것들 이외의 다른 변화 및 수정을 허용함을 인지할 것이다. 본 개시내용은 모든 상기 변화 및 수정을 포함하는 것으로 이해해야 한다. 본 개시내용은 또한 본 명세서에 언급되거나 나타낸 단계, 특징, 조성물 및 화합물 모두를 개별적으로 또는 총괄적으로, 및 상기 단계 또는 특징들의 모든 조합 또는 임의의 2개 이상을 포함한다.
본 개시내용은 본원에 기술된 특정 예들에 의해 범위가 제한되지 않으며, 상기 예들은 오직 예시의 목적을 위한 것이다. 기능적으로 등가의 생성물, 조성물 및 방법들은 명백하게 본 개시내용의 범위 내에 속한다.
본 개시내용의 임의의 예는 본원에서 특별히 달리 언급되지 않는 한 개시내용의 임의의 다른 예에 적절한 변경을 가하여 적용되는 것으로 이해해야 한다.
특별히 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 당해 분야(예를 들면, 세포 배양, 분자 유전학, 면역학, 면역조직화학, 단백질 화학 및 생화학)에 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는 것으로 이해해야 한다.
달리 나타내지 않는 한, 본 개시내용에 사용된 재조합 단백질, 세포 배양 및 면역학적 기술들은 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있는 표준 절차들이다. 상기 기술들은 문헌 [J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), and F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, including all updates until present), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988), and J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons](현재까지 모든 업데이트 포함)과 같은 출처들에 문헌 전체에 걸쳐 기술되고 설명되어 있다.
본원에서 가변 영역 및 그의 부분들, 면역글로불린, 항체 및 그의 단편들에 대한 설명 및 정의는 문헌 [Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991, Bork et al., J Mol. Biol. 242, 309-320, 1994, Chothia and Lesk J. Mol Biol. 196:901 -917, 1987, Chothia et al. Nature 342, 877-883, 1989 and/or or Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273, 927-948, 1997]에서의 논의에 의해 더 명확해질 수 있다.
본원에서 단백질 또는 항체에 대한 임의의 논의는 제조 및/또는 저장시에 생성된 단백질 또는 항체의 임의의 변이체를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, 제조 또는 저장시 항체는 탈아미드화 (예를 들면, 아스파라긴 또는 글루타민 잔기에서)되고/되거나, 변이된 글리코실화를 가지고/가지거나, 피로글루타민으로 전환된 글루타민 잔기를 가지고/가지거나, 제거되거나 "고정된(clipped)" N-말단 또는 C-말단을 가지고/가지거나, 불완전하게 처리되어 그 결과 항체의 말단에 남아 있는 신호 서열의 일부 또는 전체를 가질 수 있다. 특정 아미노산 서열을 포함하는 조성물은 명시되거나 암호화된 서열 및/또는 상기 명시되거나 암호화된 서열의 변이체의 이종 혼합물일 수 있는 것으로 이해된다.
용어 "및/또는", 예를 들면, "X 및/또는 Y"는 "X 및 Y" 또는 "X 또는 Y"를 의미하는 것으로 이해해야 하며, 두 의미 모두에 대해 또는 어느 한 의미에 대해 명백히 지지하는 것으로 이해해야 한다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 단어 "포함하다", 또는 "포함하는"과 같은 변형은 명시된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 군의 포함을 의미하지만, 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 군의 배제를 의미하는 것은 아님을 이해할 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "로부터 유도된"은 명시된 정수가 특정 공급원으로부터 꼭 직접적으로는 아닐지라도 상기 특정 공급원으로부터 수득될 수 있음을 나타내는 것으로 이해해야 한다.
선택된 정의
VEGF-B는 VEGF-B186 및 VEGF-B167로 지칭되는 2개의 주요 이소형이 존재하는 것으로 알려져 있다. 제한되는 것은 아니나 단지 명명을 위해, 인간 VEGF-B186의 대표적인 서열은 NCBI 참조 서열(Reference Sequence): NP_003368.1, NCBI 단백질 등록 번호 NP_003368, P49765 및 AAL79001, 및 서열번호 1에 나타나 있다. 본 개시내용의 맥락에서, VEGF-B186의 서열은 21개 아미노산 N-말단 신호 서열(예를 들면, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 21에 나타낸 바와 같은)이 결여될 수 있다. 제한되는 것은 아니나 단지 명명을 위해, 인간 VEGF-B167의 대표적인 서열은 NCBI 참조 서열: NP_001230662.1, NCBI 단백질 등록 번호 AAL79000 및 AAB06274, 및 서열번호 2에 나타나 있다. 본 개시내용의 맥락에서, VEGF-B167의 서열은 21개 아미노산 N-말단 신호 서열(예를 들면, 서열번호 2의 아미노산 1 내지 21에 나타낸 바와 같은)이 결여될 수 있다. VEGF-B의 또 다른 서열은 본원에 및 / 또는 공개적으로 이용가능한 데이터베이스에 제공된 서열을 이용하여 결정될 수 있고/있거나 표준 기술(예를 들면, 문헌 [Ausubel et al., (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, including all updates until present) or Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]에 기술된 바와 같은)을 이용하여 결정될 수 있다. 인간 VEGF-B에 대한 언급은 hVEGF-B로 약칭될 수 있다. 한 예로, 본원에서 VEGF-B에 대한 언급은 VEGF-B167 이소형에 대한 것이다.
본원에서 VEGF-B에 대한 언급은 또한 WO 2006/012688호에 기술된 바와 같은VEGF-B10-108 펩티드를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "뇌졸중"은 뇌 또는 뇌간으로의 혈류 장애로 인한 뇌 기능의 상실을 의미한다. 장애 (disturbance)는 예를 들어 혈전증 또는 색전증에 의해 야기된 허혈 (혈액 부족)일 수 있거나, 출혈로 인한 것일 수 있다. 일 예에서, 뇌 기능의 상실은 신경 세포의 죽음을 동반한다. 일례에서, 뇌졸중은 대뇌 또는 그의 영역으로부터의 혈액의 장애 또는 손실에 의해 유발된다. 일 예에서 뇌졸중은 뇌 혈관 원인의 신경학적 결함으로 24 시간 이상 지속되거나 24 시간 이내에 사망으로 중단된다 (세계 보건기구 (WHO)에서 정의). 24 시간을 초과하는 증상의 지속성은 증상이 24 시간 미만 지속되는 일과성 허혈 발작 (TIA)과 뇌졸중을 구분한다. 뇌졸중의 증상에는 hemiplegia (몸의 한쪽 마비); hemiparesis (몸의 한쪽 약화); 얼굴 근육 약화; 무감각; 감각 감소; 냄새 감각, 청각 감각, 시각 감각의 변형; 후각, 청각, 시력 상실; 눈꺼풀 처짐 (안검 하수); 안구 근육의 검출 가능한 약화; 개그 반사율 감소; 삼키는 능력 감소; 빛에 대한 눈동자 반응성 감소; 얼굴의 감각 감소; 균형 감소; 안구진탕증; 호흡수 변경; 변경된 심박수; 머리를 한쪽으로 돌리지 못하거나 또는 돌리는 능력 감소와 함께 흉쇄유돌근 약화; 언어의 약화; 실어증 (언어를 말하거나 이해할 수 없음); 실신 (변경된 자발적인 움직임); 시야 결손; 기억력 결핍; 반측무시 (hemineglect) 또는 편측무시 (hemispatial neglect) (병소 반대편의 시야 측면의 공간에 대한 주의력 결핍); 혼란된 사고; 혼동; 과잉성욕 제스처 발달; 실인증 (장애 존재에 대한 영구 거부); 걷기 어려움; 운동 조정력 변경; 현기증; 불균형; 의식 소실; 두통; 및 / 또는 구토를 포함한다.
용어 "뇌졸중의 영향"은 경색 크기, 출혈 스코어 및 / 또는 혈액뇌장벽 파괴 또는 누출 중 하나 이상을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 그러나, 이 용어는 이러한 영향에 국한되지 않으며 뇌졸중으로 인한 신경학적 또는 신체적 변화와 같은 개체의 임상적 변화 등 개체의 모든 변화를 포함한다. 그러한 변화 또는 영향에는 운동 장애, 뇌기능 상실 또는 여기에 설명된 증상이 포함된다.
용어 "뇌졸중 증상의 개시"는 개체 또는 다른 사람이 뇌졸중의 하나 이상의 증상을 인지하는 시간을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 적절한 증상이 여기에 설명되어 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "출혈의 발생률"은 개체 또는 개체군이 겪는 출혈의 수 또는 크기를 의미하는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 개체에서의 출혈 발생률의 감소는 개체에서의 출혈의 횟수 또는 크기의 감소 또는 뇌졸중의 결과로서 개체가 하나 이상의 출혈을 겪을 가능성을 감소시키는 것일수 있다.
용어 "치명적인 출혈의 가능성"이란 화합물(들)이 투여된 개체가 화합물 (들)을 투여하지 않은 개체 및 뇌졸중을 앓은 개체보다 출혈로 인해 사망할 가능성이 적음을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 분명히 그러한 가능성은 각 개체에 대해 나란히 비교를 요구하기보다는 모집단 데이터에 기초하여 계산될 수 있다. 이 용어는 또한 뇌졸중의 결과로서 사망 가능성을 줄이기 위한 명시적인 지원을 제공 할 것이다. 예를 들어, 본원은 추가적으로 뇌졸중의 결과로서 사망 가능성을 감소시키는 방법을 제공한다. 뇌졸중의 영향을 줄이는 것과 관련하여 위에서 설명한 모든 방법 단계는 그러한 방법과 동일하게 적용된다.
용어 "혈액뇌장벽 (blood brain barrier)"은 중추 신경계의 뇌 세포 외액으로부터 순환 혈액을 분리하는 매우 선택적인 투과성 장벽을 의미한다. 혈액뇌장벽의 고장 또는 누출은 뇌의 세포 외 공간 또는 뇌부종에 체액이 축적될 수 있다. 혈액뇌장벽의 파괴는 외상성 뇌 손상 또는 수막염 또는 뇌염으로 인한 허혈성 뇌졸중, 암 또는 뇌 염증과 같은 비외상성 원인으로부터 발생할 수 있다.
용어 "혈전 용해제"는 혈관의 폐색을 제한하기 위해 하나 이상의 혈병의 파괴를 유도하거나 중재 또는 증진시키는 화합물을 의미하는 것으로 간주되어야 한다. 혈전 용해제는 플라스민 (plasmin)에 의한 2 차 섬유소 용해를 자극하여 작용할 수 있다. 예시적으로 혈전 용해제는 조직 플라스미노겐 활성제 (tPA), 아니스트레플라제 (APSAC), 스트렙토키나제 (SK), 스타필로키나제 (SAK), 데스모테플라제 또는 유로키나아제 (uPA)를 포함한다.
일 예에서, 혈전 용해제는 "조직 플라스미노겐 활성제" 또는 tPA이다. tPA는 플라스미노겐의 플라스민으로의 전환을 촉매함으로써 혈병의 파괴에 관여하는 세린 프로테아제이다. 일 예에서, 조직 플라스미노겐 활성제 (tPA)는 재조합 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 따라서, 이는 재조합 조직 플라스미노겐 활성제 (r-tPA) 일 수 있으며, 예를 들어 서열번호 11에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 예시적으로 tPAs는 알테플라제 (alteplase), 리테플라제 (reteplase), 라노테플제 (lanoteplase) 또는 테넥테플라스 (tenecteplase)를 포함한다.
본원에 사용된 용어 혈전 용해제의 "효과적인 투여"(또는 유사)에 대한 언급은 혈전 용해제의 투여가 임상적으로 효과적인 결과를 제공한다는 것을 의미할 것이다. 즉, VEGF-B 신호전달 억제제를 투여하면서 동일한 혈전 용해제를 동일한 방식으로 (예를 들어, 동일한 시간 및 / 또는 유사한 혈당치를 갖는 환자) 투여하여 뇌졸중의 영향을 감소시키는 개선이 개체 또는 개체 집단에서 관찰된다.
본원의 설명에 기초하여 숙련된 당업자에게 명백한 바와 같이, 화합물의 "조합"을 투여하는 것에 대해 논의할 때, 본 발명은 화합물을 단일 조성물로서 투여하고, 화합물을 동시에 (그러나 별도의 조성물로) 투여하거나 또는 화합물을 순차적으로 투여하는 것을 포함한다.
용어 "재조합체"는 인공적인 유전학적 재조합의 생성물을 의미하는 것으로 이해해야 한다. 따라서, 항체 가변영역을 포함하는 재조합 단백질의 맥락에서, 상기 용어는 B 세포 성숙시 일어나는 천연 재조합의 산물인 개체의 신체 내에서 자연적으로 생기는 항체를 포함하지 않는다. 그러나, 상기 항체가 단리되는 경우, 상기 항체는 항체 가변영역을 포함하는 단리된 단백질로 간주될 것이다. 마찬가지로, 상기 단백질을 암호화하는 핵산이 단리되고 재조합 수단을 이용하여 발현되는 경우, 생성된 단백질은 항체 가변 영역을 포함하는 재조합 단백질이다. 재조합 단백질은 또한, 예를 들면, 그것이 발현되는 세포, 조직 또는 대상내에 존재할 때 인공적인 재조합 수단에 의해 발현된 단백질을 포함한다.
용어 "단백질"은 단일 폴리펩티드 쇄, 즉, 펩티드 결합에 의해 결합된 일련의 연속 아미노산 또는 서로에 공유적 또는 비-공유적으로 결합된 일련의 폴리펩티드 쇄(즉, 폴리펩티드 복합체)를 포함하는 것으로 이해해야 한다. 예를 들면, 일련의 폴리펩티드 쇄들은 적당한 화학적 또는 다이설파이드 결합을 이용하여 공유 결합될 수 있다. 비-공유 결합의 예로는 수소 결합, 이온 결합, 반데르발스(Van der Waals) 힘 및 소수성 상호작용이 포함된다.
용어 "폴리펩티드" 또는 "폴리펩티드 쇄"는 앞 단락으로부터 펩티드 결합에 의해 결합된 일련의 연속 아미노산들을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
숙련된 전문가라면, "항체"가 일반적으로 다수의 폴리펩티드 쇄, 예를 들면, 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 폴리펩티드 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 폴리펩티드로 구성된 가변 영역을 포함하는 단백질인 것으로 간주됨을 인지할 것이다. 항체는 또한 일반적으로 불변 도메인을 포함하며, 상기 불변 도메인의 일부는, 중쇄의 경우, 불변 단편 또는 결정화가능 단편(Fc)을 포함하는 불변 영역으로 배열될 수 있다. VH 및 VL은 상호작용하여, 1개 또는 일부 밀접하게 관련된 항원들에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 영역을 포함하는 Fv를 형성한다. 일반적으로, 포유동물로부터의 경쇄는 κ 경쇄 또는 λ 경쇄이고, 포유동물로부터의 중쇄는 α, δ, ε, γ 또는 μ이다. 항체는 임의의 유형(예를 들면, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예를 들면, IgG1,IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스의 항체일 수 있다. 용어 "항체"는 또한 인간화 항체, 영장류화 항체, 인간 항체, 합성인간화 항체 및 키메라 항체를 포함한다.
용어 "전장 항체", "온전한(intact) 항체" 또는 "전항체(whole antibody)"는 항체의 항원 결합 단편과 대조적으로, 그의 실질적으로 온전한 형태의 항체를 말하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 특히, 전항체는 Fc 영역을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 갖는 항체를 포함한다. 불변 도메인은 야생형 서열 불변 도메인(예를 들면, 인간 야생형 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "가변 영역" 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 본원에 정의된 바와 같은 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 부분들을 말하며, 상보성 결정 영역(CDR); 즉, CDRl, CDR2 및 CDR3, 및 골격 영역 (framework region)(FR)의 아미노산 서열을 포함한다. 대표적인 가변 영역은 3개의 CDR과 함께 3 또는 4개의 FR(예를 들면, FR1, FR2, FR3 및 선택적으로 FR4)을 포함한다. IgNAR로부터 유도된 단백질의 경우, 상기 단백질은 CDR2가 결여될 수 있다. VH는 중쇄의 가변 영역을 말한다. VL은 경쇄의 가변 영역을 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "상보성 결정 영역"(동의어: CDR; 즉, CDRl, CDR2 및 CDR3)은 그 존재가 항원 결합에 필수적인 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 말한다. 각각의 가변 도메인은 전형적으로 CDRl, CDR2 및 CDR3으로 식별된 3개의 CDR을 갖는다. CDR 및 FR에 지정된 아미노산 위치들은 문헌 [Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991], 또는 본 개시내용의 시행시 다른 번호 체계, 예를 들면, 문헌 [Chothia and Lesk J. Mol Biol. 196: 901-917, 1987; Chothia et al. Nature 342, 877-883, 1989; and/or Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273: 927-948, 1997]의 정규 번호 체계; 문헌 [Lefranc et al., Devel . And Compar. Immunol ., 27: 55-77, 2003]의 IMGT 번호 체계; 또는 문헌 [Honnegher and Plukthun J. Mol. Biol., 309: 657-670, 2001]의 AHO 번호 체계에 따라 정의될 수 있다.
"골격 영역"(FR)은 CDR 잔기들 이외의 다른 가변 도메인 잔기들이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "Fv"는, 다수의 폴리펩티드로 이루어지든지 또는 단일 폴리펩티드로 이루어지든지, VL 및 VH가 결합하여 항원 결합 부위를 갖는, 즉, 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 복합체를 형성하는 임의의 단백질을 의미하는 것으로 이해해야 한다. 항원 결합 부위를 형성하는 VH 및 VL은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재하거나 상이한 폴리펩티드 쇄들에 존재할 수 있다. 또한, 본 개시내용의 Fv (및 본 개시내용의 임의의 단백질)는 동일 항원에 결합하거나 결합하지 않을 수 있는 다수의 항원 결합 부위를 가질 수 있다. 상기 용어는 항체로부터 직접 유도된 단편뿐 아니라 재조합 수단을 이용하여 생성된 상기 단편에 상응하는 단백질을 포함하는 것으로 이해해야 한다. 일부 예에서, VH는 중쇄 불변 도메인(CH) 1에 결합되지 않고/않거나 VL은 경쇄 불변 도메인(CL)에 결합되지 않는다. 대표적인 Fv 함유 폴리펩티드 또는 단백질은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab') 단편, scFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 또는 더 고차 복합체, 또는 그의 불변 영역 또는 도메인, 예를 들면, CH2 또는 CH3 도메인에 결합된 상기 단편들 중 임의 단편, 예를 들면, 미니바디(minibody)를 포함한다. "Fab 단편"은 항체의 1가 항원-결합 단편으로 이루어지며, 전항체를 효소 파파인으로 절단하여 온전한 경쇄 및 중쇄의 일부로 이루어진 단편을 수득함으로써 생성될 수 있거나, 재조합 수단을 이용하여 생성될 수 있다. 항체의 "Fab' 단편"은 전항체를 펩신으로 처리한 후 환원시켜 온전한 경쇄, 및 VH 및 단일 불변 도메인을 포함하는 중쇄 일부로 이루어진 분자를 생성함으로써 수득될 수 있다. 상기 방식으로 처리된 항체 당 2개의 Fab' 단편이 수득될 수 있다. Fab' 단편은 또한 재조합 방법에 의해 생성될 수 있다. 항체의 "F(ab')2 단편"은 2개의 다이설파이드 결합에 의해 결속되는 2개의 Fab' 단편의 이량체로 이루어지며, 전항체 분자를 효소 펩신으로 처리함으로써 후속 환원 없이 수득된다. "Fab2" 단편은, 예를 들면, 류신 지퍼 또는 CH3 도메인을 사용하여 결합된 2개의 Fab 단편을 포함하는 재조합 단편이다. "단일쇄 Fv" 또는 "scFv"는 경쇄의 가변영역 및 중쇄의 가변영역이 적절한 유연성 폴리펩티드 링커에 의해 공유 결합되는 항체의 가변 영역 단편(Fv)을 함유하는 재조합 분자이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 단백질 또는 그의 항원 결합 부위와 항원과의 상호작용과 관련하여 용어 "결합하다"는 상기 상호작용이 항원 상의 특정 구조(예를 들면, 항원 결정기 또는 에피토프)의 존재에 의존함을 의미한다. 예를 들면, 항체는 일반적으로 단백질이 아니라 특정 단백질 구조를 인식하고 그에 결합한다. 항체가 에피토프 "A"에 결합하는 경우, 표지된 "A" 및 단백질을 함유하는 반응에서, 에피토프 "A"(또는 유리, 비표지된 "A")를 함유하는 분자의 존재는 항체에 결합된 표지된 "A"의 양을 감소시킬 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합하다"는 본 개시내용의 단백질이 대체 항원 또는 세포와 보다 더 자주, 더 신속하게, 더 긴 기간하에 및/또는 더 큰 친화도하에 특정 항원 또는 이를 발현하는 세포와 반응하거나 결합하는 것을 의미하는 것으로 이해해야 한다. 예를 들면, 단백질은 다른 성장 인자(예, VEGF-A)에 대해서 보다, 또는 다반응성 천연 항체에 의해(즉, 인간에서 자연적으로 발견되는 다양한 항원에 결합하는 것으로 알려진 천연 항체에 의해) 통상적으로 인식되는 항원에 대해서보다 실질적으로 더 큰 친화도(예를 들면, 20배 또는 40배 또는 60배 또는 80배 내지 100배 또는 150배 또는 200배)하에 VEGF-B에 결합한다. 반드시 그렇지는 않지만, 일반적으로, 결합에 대한 언급은 특이적 결합을 의미하며, 각각의 용어는 다른 용어에 대해 명백하게 지지하는 것으로 이해해야 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "상쇄시키다"는 단백질이 VEGF-R1을 통해 세포에서 VEGF-B-신호전달을 차단하거나, 감소시키거나, 방지할 수 있음을 의미하는 것으로 이해해야 한다. 상쇄를 측정하는 방법은 당해 분야에 알려져 있고/있거나 본원에 기술되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "예방하는", "예방하다" 또는 "예방"은 본 개시내용의 화합물을 투여함으로써 질병의 하나 이상의 증상의 발전을 중단시키거나 방해하는 것을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료하는", "치료하다" 또는 "치료"는 본원에 기술된 단백질을 투여함으로써 명시된 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 경감시키거나 제거하거나, 상기 질환 또는 질병의 진행을 지연시키는 것을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "개체"는 인간을 포함한 임의의 동물, 예를 들면, 포유동물을 의미하는 것으로 이해해야 한다. 대표적인 개체로는 인간 및 비-인간 영장류가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 예를 들면, 개체는 인간이다.
뇌졸중의 영향 감소
본원의 개시 내용은 예를 들어 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서의 뇌졸중의 하나 이상의 영향을 감소시키는 방법을 제공한다.
일 예에서, 개체는 당뇨병을 앓고 있다. 예를 들어, 당뇨병을 앓고 있는 개체는 임상적으로 인정되는 다음과 같은 당뇨병 마커를 가지고 있다:
● 공복 혈당치가 7nmol/L 또는 126mg/dl 이상;
● 공복 혈당치 (당일 언제든지 측정)는 당뇨병의 증상이 있는 11.1nmol/L 또는 200mg/dl 이상이어야 함;.
● 2 시간 간격으로 측정 한 경구 포도당 내성 검사 (OGTT) 값은 11.1nmol/L 또는 200mg/dl 이상. OGTT는 2 시간 또는 3 시간 동안 제공된다.
일 예에서, 개체는 제 1 형 당뇨병을 앓고 있다.
일 예에서, 개체는 제 2 형 당뇨병을 앓고 있다.
본 발명의 방법은 중추 신경계에서 임의의 형태의 허혈에 용이하게 적용될 수있다. 예를 들어, 개체는 망막 허혈의 징후 및 / 또는 증상을 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 중추 신경계에서 허혈의 영향, 예를 들어, 망막 허혈을 감소시키는 데 적용할 수 있다.
일 예에서, 개체는 뇌졸중이 아직 발병하지는 않았으나 뇌졸중의 위험은 있다. 개체는 대조군보다 뇌졸중 발생 위험이 높아지면 위험하다. 대조군 집단은 진단받지 않았거나 뇌졸중의 가족력이 있는 일반 집단 (예를 들어, 연령, 성별, 인종 및 / 또는 민족에 의해 매칭됨)으로부터 무작위로 선택된 하나 이상의 개체를 포함할 수 있다. 뇌졸중과 관련된 "위험 요소"가 해당 개체와 관련이 있는 것으로 밝혀지면 개체는 뇌졸중 위험이 있다고 간주될 수 있다. 위험 요소는 예를 들어, 개체 집단에 대한 통계적 또는 역학 연구를 통해 주어진 장애와 관련된 모든 활동, 특성, 사건 또는 속성을 포함할 수 있다. 따라서 개체는 근본적인 위험 인자를 밝혀내는 연구에 개체가 구체적으로 포함되지 않았더라도 뇌졸중의 위험이 있다고 분류 될 수 있다. 예를 들어, 심장 수술을 받지 않은 개체 집단에 비해 심장 수술을 받은 개체 집단은 일시적 뇌 허혈 발작의 빈도가 증가하기 때문에, 심장 수술을 받지 않은 개체는 일시적인 뇌 허혈 발작 (또는 뇌졸중)의 위험이 있다.
일 예에서, 뇌졸중의 위험이 있는 개체는 뇌혈관 수술, 클리핑, 스텐트 삽입 또는 미세 치료와 같은 뇌 또는 중추 신경계에 대한 외과적 수술을 받은 개체를 포함한다. 그러한 개체는 또한 뇌를 공급하는 혈관 (즉, 경동맥과 경정맥과 같은 뇌를 심장과 연결시키는 혈관) 또는 망막에 혈액을 공급하는 동맥에 영향을 미치는 신체의 다른 부분을 수술 받은 개체를 포함한다. 예시적인 부류의 개체는 뇌 동맥류를 치료하기 위한 혈관 내 수술을 받은 부류이다. 이러한 유형의 수술을 받은 개체는 뇌졸중 위험이 높다.
뇌졸중의 위험이 있는 일 예로, 흡연자, 고혈압, 당뇨병, 고 콜레스테롤 혈증 환자를 포함한다. 개체는 이전에 뇌졸중, 경미한 뇌졸중 또는 일시적인 허혈 발작이 있었던 개체들이다.
전술한 바와 같이, 본원 방법은 다음의 효과 중 하나 이상을 달성한다:
● 개체의 뇌내 출혈 스코어에 의해 평가된 출혈 스코어 감소; 및 / 또는
● 개체의 혈액뇌장벽 파괴 또는 누출 감소; 및 / 또는
● 뇌졸중 후 뇌척수액 감소.
경색 크기를 평가하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, echnetium-99m sestamibi 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영 (SPECT), 컴퓨터 단층 촬영 또는 자기 공명 영상을 포함한다.
뇌내 출혈 스코어를 측정하는 방법은 예를 들어, 문헌 [Hemphil et al., Stroke, 32:891-897, 2001]에 기재되어 있다. 출혈의 존재, 예를 들어, 뇌내 출혈은 예를 들어 MRI 또는 CT 스캐닝을 사용하여 결정될 수 있다.
혈액뇌장벽 파괴 / 누출 / 투과성은 임의의 추적자를 사용하여 MRI를 사용하여 검출될 수 있다.
일 예에서, 본원의 방법은 당업계에 공지되거나 본원에 기재된 뇌졸중의 증상을 감소시킨다.
당업자에게 명백한 바와 같이, 개체에서 뇌졸중의 증상 또는 영향의 "감소"는 뇌졸중을 겪었지만 본원에 기재된 방법으로 치료를 받지 않은 다른 개체와 비교 될 것이다. 반드시 두 개체을 나란히 비교할 필요는 없다. 오히려 모집단 자료에 의지할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 방법으로 치료를 받지 않은 뇌졸중을 앓고 있는 개체 집단 (선택적으로, 치료된 개체와 유사한 개체의 집단, 예를 들어, 연령, 체중, 당뇨병 상태, 혈당 수준)을 평가하고, 평균값은 본원에 기술된 방법으로 치료된 개체 또는 개체군의 결과와 비교된다.
VEGF -B 신호전달 억제제
항체 가변영역을 포함하는 단백질
대표적인 VEGF-B 신호전달 억제제는 항체 가변 영역을 포함하고, 예를 들면, VEGF-B에 결합하고 VEGF-B 신호전달을 상쇄시키는 항체 또는 항체 단편이다.
일 예에서, 항체 가변 영역은 VEGF-B에 특이적으로 결합한다.
적절한 항체 및 그의 가변 영역을 포함하는 단백질은 당해 분야에 공지되어 있다.
예를 들면, 항-VEGF-B 항체 및 그의 단편은 WO 2006/012688호에 기술되어 있다.
일 예에서, 항-VEGF-B 항체 또는 그의 단편은 VEGF-B에 대한 2H10의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 일 예에서, 항-VEGF-B 항체 또는 그의 단편은 항체 2H10 또는 그의 키메라, CDR 그라프트화 또는 인간화 변형체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 이와 관련하여, 항체 2H10은 서열번호 3에 나타낸 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 4에 나타낸 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 상기 항체의 대표적인 키메라 및 인간화 변형체는 WO 2006/012688호에 기술되어 있다.
일 예에서, 항-VEGF-B 항체 또는 그의 단편은 서열번호 5에 나타낸 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 6에 나타낸 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일 예에서, 항-VEGF-B 항체 또는 그의 단편은 VEGF-B에 대한 4E12의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 한 예에서, 항-VEGF-B 항체 또는 그의 단편은 항체 4E12 또는 그의 키메라, CDR 그라프트화 또는 인간화 변형체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 이와 관련하여, 항체 4E12는 서열번호 7에 나타낸 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 8에 나타낸 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일 예에서, 화합물은 항체 4E12의 인간화 가변 영역을 포함하는 단백질이다. 예를 들면, 상기 단백질은 항체 4E12의 VH 및/또는 VL의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 가변 영역을 포함한다. 예를 들면, 상기 단백질은 다음을 포함한다:
(i) (a) 서열번호 7의 아미노산 25 내지 34에 나타낸 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열번호 7의 아미노산 49 내지 65에 나타낸 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열번호 7의 아미노산 98 내지 105에 나타낸 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH; 및/또는
(ii) (a) 서열번호 8의 아미노산 24 내지 34에 나타낸 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열번호 8의 아미노산 50 내지 56에 나타낸 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열번호 8의 아미노산 89 내지 97에 나타낸 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL.
일 예에서, 항-VEGF-B 항체 또는 그의 단편은 VEGF-B에 대한 2F5의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 일 예에서, 항-VEGF-B 항체 또는 그의 단편은 항체 2F5 또는 그의 키메라, CDR 그라프트화 또는 인간화 변형체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 이와 관련하여, 항체 2F5는 서열번호 9에 나타낸 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 10에 나타낸 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일 예에서, 화합물은 항체 2F5의 인간화 가변 영역을 포함하는 단백질이다. 예를 들면, 상기 단백질은 항체 2F5의 VH 및/또는 VL의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 가변 영역을 포함한다.
예를 들면, 상기 단백질은 다음을 포함한다:
(i) (a) 서열번호 9의 아미노산 25 내지 34에 나타낸 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열번호 9의 아미노산 49 내지 65에 나타낸 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열번호 9의 아미노산 98 내지 107에 나타낸 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH; 및/또는
(ii) (a) 서열번호 10의 아미노산 24 내지 34에 나타낸 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열번호 10의 아미노산 50 내지 56에 나타낸 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열번호 10의 아미노산 89 내지 96에 나타낸 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL.
또 다른 예에서, 항체 또는 그의 가변 영역을 포함하는 단백질은, 예를 들면, 당해 분야에 공지되어 있거나 본원에 간략하게 기술된 바와 같은 표준 방법을 이용하여 제조된다.
면역화-기반 방법
항체를 제조하기 위해, 선택적으로 임의의 적절하거나 바람직한 보조제 및/또는 약학적으로 허용되는 담체를 사용하여 제형화된 VEGF-B 또는 에피토프 함유 단편 또는 그의 일부 또는 그의 변형된 형태 또는 그를 암호화하는 핵산("면역원")을 주사가능한 조성물의 형태로 객체 (예를 들면, 마우스, 래트, 닭 등과 같은 비-인간 동물 대상)에게 투여한다. 대표적인 비-인간 동물은 포유동물, 예를 들어, 뮤린 동물(예, 래트 또는 마우스)이다.
주사는 비강내, 근육내, 피하, 정맥내, 피내, 복강내, 또는 다른 공지된 경로에 의할 수 있다. 선택적으로, 면역원은 수차례 투여된다. 항체를 제조하고 특성화하기 위한 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들면, 문헌 [Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988] 참조). 마우스에서 항-VEGF-B 항체를 생성하는 방법은 WO 2006/012688호에 기술되어 있다.
다클론성 항체의 생성은 면역화 후 여러 시점에서 면역화된 동물의 혈액을 채혈하여 모니터링할 수 있다. 목적하는 항체 역가를 달성하기 위해 필요한 경우, 2차 추가접종(booster) 주사가 제공될 수 있다. 추가접종 및 역가측정 과정은 적절한 역가가 달성될 때까지 반복된다. 목적하는 수준의 면역원성이 달성되면, 면역화된 동물을 출혈시키고 혈청을 단리하고 저장하고/하거나, 상기 동물을 이용하여 단클론성 항체(mAb)를 제조한다.
단클론성 항체는 본 개시내용에 포함되는 대표적인 항체이다. 일반적으로, 단클론성 항체의 생성은, 항체 생성 세포를 자극하기에 충분한 조건하에서 대상(예를 들면, 설치류, 예, 마우스 또는 래트)을 면역원으로 면역화시키는 것을 포함한다. 몇몇 예에서, 인간 항체를 발현하고 뮤린 항체 단백질은 발현하지 않도록 유전자-조작된 마우스를 면역화시켜 항체를 생성한다(예를 들면, PCT/US2007/008231 호 및/또는 문헌 [Lonberg et al., Nature 368 (1994): 856-859]에 기술된 바와 같이). 면역화후, 항체 생성 체세포(예를 들면, B 림프구)를 불멸 세포, 예를 들면, 불멸 골수종 세포와 융합시킨다. 상기 융합 세포(하이브리도마)를 생성하기 위한 다양한 방법이 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌 [Kohler and Milstein, Nature 256, 495-497, 1975]에 기술되어 있다. 하이브리도마 세포는 이어서 항체 생성에 충분한 조건하에서 배양될 수 있다.
본 개시 내용은 항체를 생성하기 위한 다른 방법, 예를 들면, ABL-MYC 기술(예를 들면, 문헌 [Largaespada et al, Curr . Top. Microbiol . Immunol, 166, 91-96. 1990]에 기술된 바와 같은)을 고려한다.
라이브러리-기반 방법
본 개시내용은 또한 VEGF-B 결합 항체 또는 그의 가변 영역을 포함하는 단백질을 동정하기 위해 항체 또는 그의 항원 결합 도메인을 포함하는(예를 들면, 그의 가변 영역을 포함하는) 단백질의 라이브러리의 스크리닝을 포함한다.
본 개시내용에 의해 고려되는 라이브러리의 예로는 미감작(naive) 라이브러리(항원자극되지 않은 대상으로부터의), 면역화 라이브러리(항원으로 면역화된 대상으로부터의) 또는 합성 라이브러리가 포함된다. 항체 또는 그의 영역(예를 들면, 가변 영역)을 암호화하는 핵산은 통상적인 기술(예를 들면, 문헌 [Sambrook and Russell, eds, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed, vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001]에 기술된 바와 같은)에 의해 클로닝되고, 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 단백질을 암호화하고 디스플레이하기 위해 사용된다. 단백질의 라이브러리를 제작하기 위한 다른 기술은, 예를 들면, US 6300064 호(예를 들면, 모르포시스 AG(Morphosys AG)의 HuCAL 라이브리러); US 5885793 호; US 6204023 호; US 6291158 호; 또는 US 6248516 호에 기술되어 있다.
본 개시내용에 따른 단백질은 분비된 가용성 단백질일 수 있거나, 세포 표면 상의 융합 단백질로서, 또는 입자(예를 들면, 파지 또는 다른 바이러스, 리보솜 또는 포자)로서 제공될 수 있다. 다양한 디스플레이 라이브러리 포맷이 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 라이브러리는 시험관내 디스플레이 라이브러리(예를 들면, US 7270969 호에 기술된 바와 같은, 리보솜 디스플레이 라이브리러, 공유성 디스플레이 라이브러리 또는 mRNA 디스플레이 라이브러리)이다. 또 다른 예에서, 디스플레이 라이브러리는, 예를 들면, US 6300064 호; US 5885793 호; US 6204023 호; US 6291158 호; 또는 US 6248516 호에 기술된 바와 같은, 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질이 파지상에서 발현되는 파지 디스플레이 라이브러리이다. 다른 파지 디스플레이 방법들도 당해 분야에 공지되어 있으며 본 개시내용에 고려된다. 유사하게, 세포 디스플레이 방법, 예를 들면, US 5516637 호에 기술된 바와 같은, 예를 들면, 세균 디스플레이 라이브러리; 예를 들면, US 6423538 호에 기술된 바와 같은 효모 디스플레이 라이브러리, 또는 포유동물 디스플레이 라이브러리가 본 개시내용에 고려된다.
디스플레이 라이브러리를 스크리닝하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 한 예로, 본 개시내용의 디스플레이 라이브러리는, 예를 들면, 문헌 [Scopes,In: Protein purification: principles and practice, Third Edition, Springer Verlag, 1994]에 기술된 바와 같은 친화성 정제를 이용하여 스크리닝 된다. 친화성 정제 방법은 전형적으로 라이브러리에 의해 디스플레이된 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질을 표적 항원(예를 들면, VEGF-B)과 접촉시키고, 세척 후에, 항원에 결합되어 남아있는 도메인들을 용출시키는 것을 포함한다.
스크리닝에 의해 확인된 임의의 가변 영역 또는 scFv는 필요한 경우 완전 항체로 용이하게 변형된다. 가변 영역 또는 scFv를 완전 항체로 변형하거나 재포맷화하기 위한 대표적인 방법은, 예를 들면, 문헌 [Jones et al., J Immunol Methods. 354:85-90, 2010; or Jostock et al., J Immunol Methods, 289: 65-80, 2004]에 기술되어 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 예를 들면, 문헌 [Ausubel et al (In: Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047 150338, 1987] 및/또는 [Sambrook et al (In: Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001]에 기술된 바와 같은 표준 클로닝 방법들이 이용된다.
탈면역화 , 키메라 , 인간화, 합성인간화, 영장류화 및 인간 단백질
본 개시내용의 단백질은 인간화 단백질일 수 있다.
용어 "인간화 단백질"은, 인간 항체로부터의 FR에 그라프트되거나 그에 삽입된 비-인간 종(예를 들면, 마우스 또는 래트 또는 비-인간 영장류)으로부터의 항체로부터의 CDR을 포함하는, 인간-유사 가변 영역을 포함하는 단백질을 말하는 것으로 이해해야 한다(상기 유형의 항체는 또한 "CDR-그라프트된 항체"로도 지칭된다). 인간화 단백질은 또한, 인간 단백질의 하나 이상의 잔기가 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형되고/되거나 인간 단백질의 하나 이상의 FR 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 치환된 단백질을 포함한다. 인간화 단백질은 또한 인간 항체에서도 비-인간 항체에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 단백질의 임의의 추가의 영역(예를 들면, Fc 영역)은 일반적으로 인간 영역이다. 인간화는 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들면, US 5225539 호, US 6054297 호, US 7566771 호 또는 US 5585089 호의 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 용어 "인간화 단백질"은 또한, 예를 들면, US 7732578 호에 기술된 바와 같은 초-인간화 단백질을 포함한다.
본 개시내용의 단백질은 인간 단백질일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "인간 단백질"은 인간에서 발견되는 가변적이고 선택적으로 일정한 항체 영역을 갖는 단백질을 의미한다. 예를 들면, 인간 생식 세포 또는 체세포에서 또는 상기 부위를 사용하여 생산된 라이브러리로부터 유래된 것일 수 있다. "인간" 항체는 인간 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기, 예를 들면, 시험관 내에서 랜덤 또는 부위 지향 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이(특히 보존적 치환을 포함하는 돌연변이 또는 단백질의 소수의 잔기, 예를 들면, 단백질의 잔기들 중 1, 2, 3, 4 또는 5개 잔기에서의 돌연변이)를 포함할 수 있다. 상기 "인간 항체"는 반드시 인간의 면역 반응의 결과로서 생성되어야 하는 것은 아니며, 오히려 이들은 재조합 수단(예를 들면, 파지 디스플레이 라이브러리 스크리닝)을 이용하고/하거나 인간 항체 불변 및/또는 가변 영역을 암호화하는 핵산을 포함하는 유전자전이 동물(예, 마우스)에 의해서 및/또는 유도 선택(예를 들면, US 5565332 호에 기술된 바와 같은)을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 용어는 또한 상기 항체들의 친화도 증진된 형태를 포함한다. 본 개시내용에 있어서, 인간 단백질은 또한 인간 항체로부터의 FR 또는 인간 FR의 공통 서열로부터의 서열을 포함하는 FR을 포함하는 단백질을 포함하는 것으로 간주될 것이며, 여기서 CDR 중 하나 이상은, 예를 들면, US 6300064 호 및/또는 US 6248516 호에 기술된 바와 같이, 랜덤 또는 준-랜덤이다.
본 개시내용의 단백질은 합성인간화 단백질일 수 있다. 용어 "합성인간화 단백질"은 WO 2007/019620 호에 기술된 방법에 의해 제조된 단백질을 말한다. 합성인간화 단백질은, 뉴월드(New World) 영장류 항체 가변 영역으로부터의 FR 및 비-뉴월드 영장류 항체 가변 영역으로부터의 CDR을 포함하는 항체의 가변 영역을 포함한다. 예를 들면, 합성인간화 단백질은 뉴월드 영장류 항체 가변 영역으로부터의 FR 및 마우스 또는 래트 항체로부터의 CDR을 포함하는 항체의 가변 영역을 포함한다.
본 개시내용의 단백질은 영장류화 단백질일 수 있다. "영장류화 단백질"은 비-인간 영장류(예를 들면, 사이노몰거스 마카크(cynomolgus macaque))의 면역화 후에 제조된 항체로부터의 가변 영역을 포함한다. 선택적으로, 비-인간 영장류 항체의 가변 영역은 인간 불변 영역에 결합되어 영장류화 항체를 생성한다. 영장류화 항체를 생성하기 위한 대표적인 방법은 US 6113898 호에 기술되어 있다.
일 예에서, 본 개시내용의 단백질은 키메라 단백질이다. 용어 "키메라 단백질"은, 항원 결합 도메인이 특정 종(예를 들면, 마우스 또는 래트와 같은 뮤린)으로부터의 것이거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 반면, 단백질의 나머지 부분은 또 다른 종(예를 들면, 인간 또는 비-인간 영장류와 같은)으로부터 유래된 단백질로부터의 것이거나 또 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 단백질을 말한다. 한 예로, 키메라 단백질은 비-인간 항체(예를 들면, 뮤린 항체)로부터의 VH 및/또는 VL을 포함하는 키메라 항체이며, 상기 항체의 나머지 영역들은 인간 항체로부터의 영역들이다. 상기 키메라 단백질의 제조는 당해 분야에 공지되어 있으며, 표준 방법(예를 들면, US 6331415 호; US 5807715 호; US 4816567 호 및 US 4816397 호에 기술된 바와 같은)에 의해 달성될 수 있다.
본 개시내용은 또한, 예를 들면, WO 2000/34317 호 및 WO 2004/108158 호에 기술된 바와 같은 탈면역화 단백질을 고려한다. 탈면역화 항체 및 단백질은 하나 이상의 에피토프, 예를 들면, B 세포 에피토프 또는 T 세포 에피토프가 제거(즉, 돌연변이)됨으로써 대상이 항체 또는 단백질에 대한 면역 반응을 야기할 가능성을 감소시킨다.
항체 가변 영역을 포함하는 기타 단백질
본 개시내용은 또한 다음과 같은 항체의 가변 영역 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 다른 단백질을 고려한다:
(i) 항체의 VH 또는 VL의 전부 또는 일부를 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄인 단일-도메인 항체(예를 들면, US 6248516 호 참조);
(ii) 예를 들면, US 5844094 호 및/또는 US 2008152586 호에 기술된 바와 같은 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디;
(iii) 예를 들면, US 5260203 호에 기술된 바와 같은 scFv;
(iv) 예를 들면, US 5837821 호에 기술된 바와 같은 미니바디;
(v) US 5731168 호에 기술된 바와 같은 "키 앤 홀(key and hole)" 이중특이성 단백질;
(vi) 예를 들면, US 4676980 호에 기술된 바와 같은 헤테로접합체 단백질;
(vii) 예를 들면, US 4676980 호에 기술된 바와 같은 화학적 가교결합제를 사용하여 생성된 헤테로접합체 단백질;
(viii) 예를 들면, 문헌 [Shalaby et al, J. Exp. Med., 175: 217-225, 1992]에 기술된 바와 같은 Fab'-SH 단편; 또는
(ix) Fab3(예를 들면, EP 19930302894 호에 기술된 바와 같음).
불변 도메인 융합
본 개시내용은 항체의 가변 영역 및 그의 불변 영역 또는 Fc 또는 도메인, 예를 들면, CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함하는 단백질을 포함한다. 적절한 불변 영역 및/또는 도메인은 숙련된 전문가에게 명백할 것이고/이거나 상기 폴리펩티드의 서열은 공개적으로 이용가능한 데이터베이스로부터 용이하게 이용가능하다. 카밧 등(Kabat et al)은 일부 적절한 불변 영역/도메인에 대한 설명을 또한 제공하고 있다.
그의 불변 영역 및/또는 도메인은 생물 활성, 예를 들면, 이량체화, 예를 들면, FcRn(신생아 Fc 수용체)에 결합시킴으로써 연장된 혈청 반감기, 항원 의존성 세포독성(ADCC), 보체 의존성 세포독성(CDC), 항원 의존성 세포 식균작용(ADCP)을 제공하는데 유용하다.
본 개시내용은 또한, 예를 들면, US 7217797 호; US 7217798 호; 또는 US 20090041770 호(증가된 반감기 가짐) 또는 US 2005037000 호(증가된 ADCC)에 기술된 바와 같은, 돌연변이 불변 영역 또는 도메인을 포함하는 단백질을 고려한다.
안정화된 단백질
본 개시내용의 상쇄 단백질은 IgG4 불변 영역 또는 안정화된 IgG4 불변 영역을 포함할 수 있다. 용어 "안정화된 IgG4 불변 영역"은, Fab 팔 교환, 또는 Fab 팔 교환 또는 절반-항체(half-antibody)의 생성이 일어나는 경향 또는 절반-항체를 생성하는 경향을 감소시키도록 변형된 IgG4 불변 영역을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
"Fab 팔 교환"은, IgG4 중쇄 및 결합된 경쇄(절반-분자)가 또 다른 IgG4 분자로부터의 중쇄-경쇄 쌍과 교환되는, 인간 IgG4에 대한 일종의 단백질 변형을 말한다. 따라서, IgG4 분자는 2개의 별개의 항원을 인식하는 2개의 별개의 Fab 팔을 획득할 수 있다(이중특이성 분자 생성). Fab 팔 교환은 생체내에서 자연적으로 일어나며, 시험관 내에서는 정제된 혈액 세포 또는 환원된 글루타티온과 같은 환원제에 의해 유도될 수 있다. "절반 항체"는 IgG4 항체가 해리되어 각각 단일 중쇄 및 단일 경쇄를 함유하는 2개의 분자를 생성할 때 생성된다.
일 예로, 안정화된 IgG4 불변 영역은 카밧 시스템[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 1987 and/or 1991]에 따른 힌지 영역의 위치 241에 프롤린을 포함한다. 상기 위치는 EU 번호 체계[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 2001 and Edelman et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85, 1969]에 따른 힌지 영역의 위치 228에 상응한다. 인간 IgG4에서, 상기 잔기는 일반적으로 세린이다. 프롤린의 세린으로의 치환 후에, IgG4 힌지 영역은 서열 CPPC를 포함한다. 이와 관련하여, 숙련된 자라면 "힌지 영역"이 Fc 및 Fab 영역을 결합시켜 항체의 2개의 Fab 팔에 이동성을 부여하는 항체 중쇄 불변 영역의 프롤린-풍부 부분인 것을 인지할 것이다. 힌지 영역은 중쇄내 다이설파이드 결합에 포함되는 시스테인 잔기를 포함한다. 상기 힌지 영역은 일반적으로 카밧의 번호 체계에 따른 인간 IgG1의 Glu226으로부터 Pro243까지의 연장부로 정의된다. 다른 IgG 이소타입의 힌지 영역들은, 중쇄내 다이설파이드(S-S) 결합을 형성하는 첫번째 및 마지막 시스테인 잔기를 동일 위치에 배치함으로써 IgG1 서열에 맞추어 정렬될 수 있다(예를 들면, WO 2010/080538 호 참조).
추가의 단백질-기반 VEGF -B 신호전달 억제제
VEGF-B와 그의 수용체와의 생산적 상호작용을 방해할 수 있는 다른 단백질로는 돌연변이 VEGF-B 단백질이 포함된다.
일 예로, 억제제는 VEGF-B에 결합하는(및, 예를 들면, VEGF-A에는 실질적으로 결합하지 않는) VEGF-R1의 하나 이상의 도메인을 포함하는 가용성 단백질이다. 한 예에서, 가용성 단백질은 또한 항체, 예를 들면, IgG1 항체의 불변 영역을 포함한다. 예를 들면, 가용성 단백질은 Fc 영역, 및 선택적으로 항체, 예를 들면, IgG1 항체의 힌지 영역을 추가로 포함한다.
일 예에서, 단백질 억제제는 항체 모방체, 예를 들면, 항체와 유사한 방식으로 표적 단백질에 결합하는 가변 영역을 포함하는 단백질 스캐폴드(scaffold)이다. 대표적인 항체 모방체에 대한 설명은 다음에 이어진다.
면역글로불린 및 면역글로불린 단편
본 개시내용의 화합물의 한 예는 면역글로불린, 예를 들면, T 세포 수용체 또는 중쇄 면역글로불린(예를 들면, IgNAR, 카멜리드 항체)의 가변 영역을 포함하는 단백질이다.
중쇄 면역글로불린
중쇄 면역글로불린은, 이들이 중쇄를 포함하고 경쇄를 포함하지 않는 한 많은 다른 형태의 면역글로불린(예를 들면, 항체)과 구조적으로 상이하다. 따라서, 상기 면역글로불린은 또한 "중쇄만 있는 항체"로도 지칭된다. 중쇄 면역글로불린은, 예를 들면, 카멜리드 및 연골 어류에서 발견된다(IgNAR로도 불림).
천연 중쇄 면역글로불린에 존재하는 가변 영역은 일반적으로, 이들을 통상적인 4-쇄 항체에 존재하는 중쇄 가변영역("VH 도메인으로 지칭됨) 및 통상적인 4-쇄 항체에 존재하는 경쇄 가변 영역("VL 도메인"으로 지칭됨)과 구별하기 위해, 카멜리드 Ig 및 IgNAR중 V-NAR에서 "VHH 도메인"으로 지칭된다.
중쇄 면역글로불린은 관련 항원에 고 친화도 및 고 특이성 하에 결합하기 위해 경쇄의 존재를 필요로 하지 않는다. 이것은 단일 도메인 결합 단편이, 발현하기에 용이하고 일반적으로 안정하고 가용성인 경쇄 면역글로불린으로부터 유도될 수 있음을 의미한다.
카멜리드로부터의 중쇄 면역글로불린 및 그의 가변 영역 및 그의 제조 및/또는 단리 방법 및/또는 용도에 대한 일반적인 설명은 특히 하기 참조 WO 94/04678 호, WO 97/49805 호 및 WO 97/49805 호에서 확인된다.
연골 어류로부터의 중쇄 면역글로불린 및 그의 가변 영역 및 그의 제조 및/또는 단리 방법 및/또는 용도에 대한 일반적인 설명은 특히 WO 2005/118629 호에서 확인된다.
V-유사 단백질
본 개시내용의 화합물의 한 예는 T-세포 수용체이다. T 세포 수용체는 항체의 Fv 모듈과 구조적으로 유사하게 결합하는 2개의 V-도메인을 갖는다. 문헌 [Novotny et al., Proc Natl Acad Sci USA 88:8646-8650, 1991]은, T-세포 수용체의 2개의 V-도메인(알파 및 베타로 지칭)이 융합되고 단일쇄 폴리펩티드로 발현될 수 있는 방법, 및 또한, 항체 scFv와 직접적으로 유사한 소수성을 감소시키기 위해 표면 잔기를 변화시키는 방법을 기술하고 있다. 2개의 V-알파 및 V-베타 도메인을 포함하는 단일쇄 T-세포 수용체 또는 다량체성 T-세포 수용체의 생성을 기술하고 있는 다른 공개공보로는 WO 1999/045110 호 또는 WO 2011/107595 호가 포함된다.
항원 결합 도메인을 포함하는 다른 비-항체 단백질로는, 일반적으로 단량체성인 V-유사 도메인을 갖는 단백질이 포함된다. 상기 V-유사 도메인을 포함하는 단백질의 예로는 CTLA-4, CD28 및 ICOS가 포함된다. 상기 V-유사 도메인을 포함하는 단백질에 대한 추가의 개시는 WO 1999/045110 호에 포함되어 있다.
에드넥틴 ( Adnectin )
일 예에서, 본 개시내용의 화합물은 에드넥틴이다. 에드넥틴은, 루프 영역이 변이되어 항원 결합을 제공하는 인간 피브로넥틴의 열번째 제 III형 피브로넥틴(10Fn3) 도메인을 기반으로 한다. 예를 들면, 10Fn3 도메인의 β-샌드위치의 한쪽 말단에서 3개의 루프가 에드넥틴이 항원을 특이적으로 인식할 수 있게 조작될 수 있다. 추가의 세부사항에 대해서는 US 20080139791 호 또는 WO 2005/056764 호를 참조하시오.
안티칼린 ( Anticalin )
또 다른 예로, 본 개시내용의 화합물은 안티칼린이다. 안티칼린은, 스테로이드, 빌린, 레티노이드 및 지질과 같은 소형 소수성 분자들을 운반하는 세포외 단백질의 한 계열인 리포칼린으로부터 유도된다. 리포칼린은, 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 원추형 구조의 개방 말단에 다수의 루프를 갖는 견고한 β-시트 2차 구조를 갖는다. 상기 조작된 리포칼린은 안티칼린으로 알려져 있다. 안티칼린에 대한 추가의 설명은 US 7250297B1 호 또는 US 20070224633 호를 참조하시오.
어피바디 ( Affibody )
또 다른 예로, 본 개시내용의 화합물은 어피바디이다. 어피바디는 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 스태필로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus)의 단백질 A의 Z 도메인(항원 결합 도메인)으로부터 유도된 스캐폴드이다. Z 도메인은 약 58개 아미노산의 3-나선형 다발로 이루어진다. 라이브러리는 표면 잔기의 무작위화에 의해 제작되었다. 추가의 세부사항에 대해서는 EP 1641818 호를 참조하시오.
아비머 ( Avimer )
또 다른 예로, 본 개시내용의 화합물은 아비머이다. 아비머는 A-도메인 스캐폴드 계열로부터 유도된 다중도메인 단백질이다. 약 35개 아미노산의 천연 도메인은 정의된 다이설파이드 결합된 구조를 갖는다. 다양성은 A-도메인 계열에 의해 나타난 천연 변이의 셔플링에 의해 제공된다. 추가의 세부사항에 대해서는 WO 2002088171 호를 참조하시오.
DARPin
또 다른 예로, 본 개시내용의 화합물은 설계된 안키린 반복 단백질(Designed Ankyrin Repeat Protein, DARPin)이다. DARPin은 세포골격에 대한 내재막 단백질의 결합을 매개하는 단백질 계열인 안키린으로부터 유도된다. 단일 안키린 반복서열은 2개의 α-나선 및 β-회전으로 이루어지는 33개 잔기 모티프이다. 이들은, 각 반복서열의 첫번째 α-나선 및 β-회전에 잔기들을 무작위배정함으로써 상이한 표적 항원들에 결합하도록 조작될 수 있다. 그의 결합 계면은 모듈(친화도 증진 방법)의 수를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 추가의 세부사항에 대해서는 US 2004013208 호를 참조하시오.
단백질 제조 방법
재조합체 발현
재조합 단백질의 경우에, 이를 암호화하는 핵산을 발현 벡터에 클로닝시킬 수 있으며, 이어서 숙주 세포, 예를 들면, 달리 항체를 생성하지 않는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 포유동물 세포, 예를 들면, 유인원 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포, 인간 배아 신장(HEK) 세포 또는 골수종 세포에 형질감염시킨다. 본 개시내용의 단백질을 발현시키기 위해 사용되는 대표적인 세포는 CHO 세포, 골수종 세포 또는 HEK 세포이다. 상기 목적을 달성하기 위한 분자 클로닝 기술은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌 [Ausubel et al., (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, including all updates until present) 또는 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]에 기술되어 있다. 매우 다양한 클로닝 및 시험관내 증폭 방법이 재조합 핵산 제조에 적합하다. 재조합 항체를 제조하는 방법은 또한 당해 분야에 공지되어 있다(US 4816567 호 또는 US 5530101 호 참조).
단리 후에, 핵산은 추가의 클로닝(DNA의 증폭)을 위해 또는 무세포 시스템에서 또는 세포에서의 발현을 위해 발현 구조물 또는 발현 벡터에 삽입되고 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터"는 그의 가장 넓은 맥락으로 이해되어야 하며, 예를 들면, 발달상 및/또는 외부 자극에 반응하여 또는 조직 특이적 방식으로 핵산의 발현을 변화시키는 추가의 조절 요소(예를 들면, 상류 활성화 서열, 전사 인자 결합 부위, 인핸서 및 사일렌서(silencer))의 존재 또는 부재하에서, 정확한 전사 개시에 필요한 TATA 박스 또는 개시 요소를 포함한 게놈 유전자의 전사 조절 서열을 포함한다. 본원에서, 용어 "프로모터"는, 또한 재조합, 합성 또는 융합 핵산, 또는 그에 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 제공하거나 활성화하거나 증대시키는 유도체를 기술하기 위해 사용된다. 대표적인 프로모터는, 발현을 더 증대시키고/시키거나 상기 핵산의 공간적 발현 및/또는 시간적 발현을 변화시키기 위한 하나 이상의 특정 조절 요소들의 추가의 복제물를 함유할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산의 발현이 프로모터에 의해 조절되도록 프로모터를 핵산에 대해 위치시키는 것을 의미한다.
세포내 발현을 위한 많은 벡터들이 이용가능하다. 벡터 성분으로는 일반적으로 다음 중 하나 이상이 포함되지만, 이로 한정되지는 않는다: 신호 서열, 항체(예를 들면, 본원에 제공된 정보로부터 유도된)를 암호화하는 서열, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종료 서열. 숙련된 전문가라면 항체의 발현에 적합한 서열을 인지할 것이다. 대표적인 신호 서열로는 원핵세포 분비 신호(예, pelB, 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, Ipp 또는 열-안정성 엔테로톡신 II), 효모 분비 신호(예, 인버타제 리더, α 인자 리더 또는 산 포스파타제 리더) 또는 포유동물 분비 신호(예, 단순 헤르페스 gD 신호)가 포함된다.
표유동물 세포에서 활성인 대표적인 프로모터로는 사이토메갈로바이러스 극초기발현(immediate early) 프로모터(CMV-IE), 인간 연장 인자 1-α 프로모터(EF1), 소핵 RNA 프로모터(U1a 및 U1b), α-미오신 중쇄 프로모터, 유인원 바이러스 40 프로모터(SV40), 라우스 육종(Rous sarcoma) 바이러스 프로모터(RSV), 아데노바이러스(Adenovirus) 주요 말기발현 프로모터, β-액틴 프로모터; CMV 인핸서/β-액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터 또는 그의 활성 단편을 포함하는 하이브리드 조절 요소가 포함된다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형절진환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 현탁 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 인간 배아 신장 세포주(293 또는 293 세포); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 또는 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO)이다.
효모 세포, 예를 들면, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 및 사카로마이세스 폼베(S. pombe)를 포함하는 군에서 선택된 효모 세포에서의 발현에 적합한 전형적인 프로모터로는 ADH1 프로모터, GAL1 프로모터, GAL4 프로모터, CUP1 프로모터, PHO5 프로모터, nmt 프로모터, RPR1 프로모터 또는 TEF1 프로모터가 포함되나 이로 한정되지는 않는다.
단리된 핵산 또는 이를 포함하는 발현 구조물을 발현을 위해 세포에 도입하기 위한 수단은 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있다. 주어진 세포에 사용되는 기술은 공지된 성공적인 기술에 따라 달라진다. 재조합 DNA를 세포에 도입하기 위한 수단은 미세주사, DEAE-덱스트란에 의해 매개된 형질감염, 예를 들면, 리포펙타민(Gibco, MD, USA) 및/또는 셀펙틴(깁코, MD, USA)을 사용함으로써 리포솜에 의해 매개된 형질감염, PEG-매개된 DNA 흡수, 전기천공, 및 특히, 예를 들면, DNA-코팅된 텅스텐 또는 금 입자(어그레이스터스 인코포레이티드 (Agracetus Inc.), WI, USA)를 사용한 미립자 충격을 포함한다.
항체를 생성하기 위해 사용되는 숙주 세포는 사용되는 세포 유형에 따라서 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 시판하는 배지, 예를 들면, 함 F10(Ham's Fl0)(시그마(Sigma)), 최소 필수 배지(Minimal Essential Medium, MEM)(시그마), RPMl-1640(시그마) 및 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM(시그마)가 포유동물 세포를 배양하기에 적합하다. 본원에서 논의된 다른 세포 유형을 배양하기 위한 배지는 당해 분야에 공지되어 있다.
단백질 정제
생성/발현 후에, 본 개시내용의 단백질은 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 정제한다. 상기 정제는 비특이적 단백질, 산, 지질, 탄수화물 등을 실질적으로 함유하지 않는 본 개시내용의 단백질을 제공한다. 일 예에서, 단백질은 제제중 단백질의 약 90% 이상(예를 들면, 95%, 98% 또는 99%)이 본 개시내용의 단백질인 제제로 존재할 것이다.
본 개시내용의 단리된 단백질을 수득하기 위해, 다양한 고압(또는 고성능) 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 비-HPLC 폴리펩티드 단리 프로토콜, 예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 혼합방식 크로마토그래피, 상 분리 방법, 전기영동 분리, 침전법, 염용/염석 방법, 면역크로마토그래피 및/또는 기타 방법을 포함하는(이로 한정되지는 않는다) 펩티드 정제의 표준 방법을 이용한다.
일 예로, 친화성 정제는 표지를 포함하는 융합 단백질을 단리하기에 유용하다. 친화 크로마토그래피를 이용하여 단백질을 단리하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌 [Scopes, In: Protein purification: principles and practice, Third Edition, Springer Verlag, 1994]에 기술되어 있다. 예를 들면, 표지(폴리히스티딘 태그의 경우, 이것은, 예를 들면, 니켈-NTA일 수 있다)에 결합하는 항체 또는 화합물을 고체 지지체 상에 고정화시킨다. 이어서, 단백질을 포함하는 샘플을 고정화된 항체 또는 화합물과 결합이 일어나기에 충분한 시간동안 그러한 조건하에서 접촉시킨다. 세척하여 임의의 미결합 또는 비-특이적 결합 단백질을 제거한 후, 단백질을 용출한다.
항체의 Fc 영역을 포함하는 단백질의 경우, 단백질 A 또는 단백질 G 또는 그의 변형된 형태를 친화성 정제에 사용할 수 있다. 단백질 A는 인간 γl, γ2, 또는 γ4 중쇄 Fc 영역을 포함하는 정제된 단백질을 단리하는데 유용하다. 단백질 G는 모든 마우스 Fc 이소타입 및 인간 γ3에 추천된다.
핵산-기반 VEGF -B 신호전달 억제제
본 개시내용의 한 예에서, 본 개시내용의 임의의 예에 따라 본원에 기술된 바와 같은 치료 및/또는 예방 방법은 VEGF-B의 발현을 감소시키는 것을 포함한다. 예를 들면, 상기 방법은 핵산의 전사 및/또는 번역을 감소시키는 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 한 예에서, 상기 화합물은 핵산, 예를 들면, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 리보자임, PNA, 간섭 RNA, siRNA 또는 마이크로RNA이다.
안티센스 핵산
용어 "안티센스 핵산"은, 본 개시내용의 임의의 예에서 본원에 기술된 바와 같은 폴리펩티드를 암호화하고 mRNA 번역과 같은 전사후 사건을 방해할 수 있는 특정 mRNA 분자의 적어도 일부분에 상보적인 DNA 또는 RNA 또는 그의 유도체(예를 들면, LNA 또는 PNA) 또는 그의 조합을 의미하는 것으로 이해해야 한다. 안티센스 방법의 사용은 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들면, 문헌 [Hartmann and Endres (editors), Manual of Antisense Methodology, Kluwer (1999)] 참조).
본 개시내용의 안티센스 핵산은 생리적 조건하에서 표적 핵산과 하이브리드화될 것이다. 안티센스 핵산은, 구조적 유전자 또는 암호화 영역에, 또는 유전자 발현 또는 스플라이싱에 대한 조절을 수행하는 서열에 상응하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 안티센스 핵산은 VEGF-B를 암호화하는 핵산의 표적화된 암호화 영역, 또는 이들의 5'-미번역 영역(UTR) 또는 3'-UTR에 상응할 수 있다. 상기 안티센스 핵산은 부분적으로 인트론 서열에 상보적일 수 있으며, 상기 인트론 서열은 전사 중이나 후에, 예를 들면, 표적 유전자의 엑손 서열에만 스플라이싱될 수 있다. 안티센스 서열의 길이는 VEGF-B를 암호화하는 핵산의 적어도 19개의 연속 뉴클레오티드, 예를 들면, 적어도 50개 뉴클레오티드, 예를 들면, 적어도 100, 200, 500 또는 1000개 뉴클레오티드이어야 한다. 전체 유전자 전사체에 상보적인 전장 서열을 사용할 수 있다. 길이는 100 내지 2000개 뉴클레오티드일 수 있다. 표적화된 전사체에 대한 안티센스 서열의 동일성 정도는 적어도 90%, 예를 들면, 95 내지 100%이어야 한다.
VEGF-B에 대한 대표적인 안티센스 핵산은, 예를 들면, WO 2003/105754 호에 기술되어 있다.
촉매 핵산
용어 "촉매 핵산"은, 별개의 기질을 특이적으로 인식하고 상기 기질의 화학적 변형을 촉진하는 DNA 분자 또는 DNA-함유 분자(당해 분야에서는 "데옥시리보자임" 또는 "DNA자임"으로도 알려져 있음) 또는 RNA 또는 RNA-함유 분자("리보자임" 또는 "RNA자임"으로도 알려져 있음)를 말한다. 촉매 핵산에서 핵산 염기들은 염기 A, C, G, T(및 RNA의 경우 U)일 수 있다.
RNA 간섭
RNA 간섭(RNAi)은 특정 단백질의 생성을 특이적으로 억제하는데 유용하다. 이론으로 제한시키는 것이 아니고, 상기 기술은, 해당 유전자 또는 그의 일부의 mRNA, 이 경우에는 VEGF-B를 암호화하는 mRNA와 필수적으로 동일한 서열을 함유하는 dsRNA 분자의 존재에 의존한다. 편리하게, 상기 dsRNA는 재조합 벡터 숙주 세포에서 단일 프로모터로부터 생성될 수 있으며, 이때 센스 및 안티센스 서열이 하이브리드화되어 루프 구조를 형성하는 비관련 서열을 갖는 dsRNA 분자를 형성할 수 있게 하는 비관련 서열이 센스 및 안티센스 서열 측면에 인접해 있다. 본 개시내용에 적합한 dsRNA 분자의 설계 및 생성은, 특히 WO 99/32619 호, WO 99/53050 호, WO 99/49029 호 및 WO 01/34815 호를 고려하여, 당해 분야에 숙련된 자의 능력안에서 이루어질 것이다.
하이브리드화되는 센스 및 안티센스 서열의 길이는 각각 적어도 19개 연속 뉴클레오티드, 예를 들면, 적어도 30 또는 50개 뉴클레오티드, 예를 들면, 적어도 100, 200, 500 또는 1000개 뉴클레오티드이어야 한다. 전체 유전자 전사체에 상응하는 전장 서열을 사용할 수 있다. 길이는 100 내지 2000개 뉴클레오티드일 수 있다. 표적화된 전사체에 대한 센스 및 안티센스 서열의 동일성 정도는 적어도 85%, 예를 들면, 적어도 90%, 예를 들어, 95 내지 100%이어야 한다.
대표적인 소형 간섭 RNA("siRNA") 분자는 표적 mRNA의 약 19 내지 21개 연속 뉴클레오티드와 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들면, siRNA 서열은 다이뉴클레오티드 AA로 시작하고, 약 30 내지 70%(예를 들면, 30 내지 60%, 예를 들어 40 내지 60%, 예를 들면, 약 45% 내지 55%)의 GC-내용물을 포함하고, 예를 들면, 표준 BLAST 검색에 의해 측정시, 그것이 도입될 포유동물의 게놈내 표적 이외의 다른 임의의 뉴클레오티드 서열에 대해 높은 동일성 퍼센트를 갖지 않는다. VEGF-B의 발현을 감소시키는 대표적인 siRNA는 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology) 또는 노버스 바이올로지칼스(Novus Biologicals)에서 상업적으로 시판중이다.
VEGF-B의 발현을 감소시키는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)도 또한 당해 분야에 공지되어 있으며 산타 크루즈 바이오테크놀로지로부터 상업적으로 시판중이다.
스크리닝 분석법
VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물은, 예를 들면, 하기에 기술하는 바와 같은 당해 분야에 공지된 기술을 이용하여 확인할 수 있다. 유사하게, 본원에 기술된 방법에 사용하기에 적합한 VEGF-B 신호전달 억제제의 양은, 예를 들면, 하기에 기술하는 바와 같은 당해 분야에 공지된 기술을 이용하여 측정하거나 평가할 수 있다.
상쇄 분석법
VEGF-B에 결합하고 신호전달을 억제하는 화합물의 경우, 상쇄 분석법을 이용할 수 있다.
일 예에서, 상쇄 분석법은 검출가능하게 표지된 가용성 VEGF-R1의 존재 또는 부재하에서 VEGF-B를 화합물과 접촉시키거나, VEGF-R1 또는 가용성 VEGF-R1을 발현하는 세포의 존재 또는 부재하에서 검출가능하게 표지된 VEGFB를 화합물과 접촉시키는 것을 포함한다. 이어서, VEGF-R1에 결합된 VEGF-B의 수준을 평가한다. 화합물의 부재하에서와 비교하여 화합물의 존재하에서 결합된 VEGF-B의 감소된 수준은 화합물이 VEGF-B 신호전달의 결과로서 VEGF-R1에 대한 VEGF-B의 결합을 억제함을 시사한다.
또 다른 상쇄 분석법은 WO 2006/012688 호에 기술되어 있으며, 고체 지지체 상에 고정화된 제 2의 Ig-유사 도메인을 포함하는 VEGF-R1의 단편을 화합물과 함께 사전배양된 준포화 농도의 재조합 VEGF-B와 접촉시키는 것을 포함한다. 세척하여 미결합 단백질을 제거한 후, 고정화된 단백질을 항-VEGF-B 항체와 접촉시키고 결합된 항체의 양(고정화된 VEGF-B을 나타냄)을 측정한다. 화합물 부재하에서의 수준에 비해 결합된 항체의 수준을 감소시키는 화합물이 VEGF-B 신호전달의 억제제로 간주된다.
또 다른 예에서, VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물은, 증식을 위해 VEGF-B 신호전달에 의존성인 세포, 예를 들면, 인간 에리트로포이에틴 수용체의 세포내 도메인 및 VEGF-R1의 세포외 도메인을 혼입시킨 키메라 수용체를 발현시키기 위해 WO 2006/012688 호에 기술된 바와 같이 변형된 BaF3 세포를 사용하여 확인된다. 세포는 VEGFB의 존재하에서 및 화합물의 존재 또는 부재하에서 배양된다. 이어서, 표준 방법, 예를 들면, 콜로니 생성 분석법, 티미딘 혼입 또는 세포 증식의 또 다른 적절한 마커의 흡수(예를 들면, MTS 염료 환원 분석법)를 이용하여 세포 증식을 평가한다. VEGF-B의 존재하에서 증식 수준을 감소시키는 화합물이 VEGF-B 신호전달의 억제제로 간주된다.
화합물은 또한 표준 방법을 이용하여 VEGF-B에 결합하는 그의 능력에 대해 평가될 수 있다. 단백질에 대한 결합을 평가하는 방법은, 예를 들면, 문헌 [Scopes, In: Protein purification: principles and practice, Third Edition, Springer Verlag, 1994]에 기술된 바와 같이 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 방법은 일반적으로 화합물을 표지화시키고 이것을 고정화된 VEGF-B와 접촉시키는 것을 포함한다. 세척하여 비-특이적 결합된 화합물 을 제거한 후, 표지의 양, 및 결과로서 결합된 화합물을 검출한다. 물론, 화합물은 고정화되고 VEGF-B 표지화될 수 있다. 패닝(panning)-형 분석법도 또한 이용할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 표면 플라즈몬 공명 분석법도 이용할 수 있다.
발현 분석법
VEGF-B의 발현을 감소시키거나 방지하는 화합물은 세포를 상기 화합물과 접촉시키고 VEGF-B의 발현 수준을 측정함으로서 확인된다. 핵산 수준에서의 유전자 발현을 측정하기에 적합한 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 또는 마이크로어레이 분석법이 포함된다. 단백질 수준에서의 발현을 측정하기에 적합한 방법은 또한 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA), 형광 결합 면역흡착 분석법(FLISA), 면역형광 또는 웨스턴 블로팅(Western blotting)이 포함된다.
생체내 분석법
본원에 기재된 화합물은 동물 모델에서의 활성을 시험할 수 있다. 일 예시에서, 동물 모델은 대사 장애 및 고혈당의 모델이다. 예를 들어,식이-유도 비만 (DIO) 마우스 모델이다. 이것은 잘 정립된 실험 패러다임이며, 마우스는 말초 조직에서 과도한 또는 이소성 지질 침착을 일으키는데 이는 인슐린 감수성 및 포도당 섭취 장애와 관련 있으며, 마우스는 비만, 고인슐린 혈증, 고혈당증, 이상 지질 혈증 및 고혈압을 나타낸다 (Harberg, CE, et al. Nature 490, 426-430, Collins, S., 등, Pysiology & Behavior 81, 243-248).
비인간 동물 개체에서 허혈성 뇌졸중을 유도하기 위한 다양한 공지된 기술이 있으며, 대동맥 / 대정맥 폐쇄, 외부 목 지혈대 또는 커프, 출혈 또는 저혈압, 두개 내 고혈압 또는 총 경동맥 폐색, 2개 혈관 폐색 및 저혈압, 4개 혈관 폐색, 일측성 총 경동맥 폐색 (일부 종에서만) , 엔도셀린-1에 의한 동맥과 정맥의 수축, 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO), 자연발생 뇌경색 (자연발생 고혈압 쥐에서), 마크로 스펀지 색전술, 혈전 응고 색전증 또는 미소구체 색전증이 포함된다.
일 예에서, 뇌졸중 모델은 Su et al Nature Medicine, 2008; 14: 731-737에 기재된 바와 같이 허혈성 뇌졸중을 유발하는 중간 대뇌 동맥 폐쇄 (MCAO)를 포함한다.
약학 조성물 및 치료 방법
VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물(동의어: 활성 성분)은 비경구, 국부, 경구 또는 국소 투여, 에어로졸 투여 또는 경피 투여에, 예방적 또는 치료적 처치에 유용하다. 한 태양에서, 상기 화합물은 비경구적으로, 예를 들면, 피하 또는 정맥내로 투여된다.
투여될 화합물의 제형은 선택된 투여 경로 및 제형(예를 들면, 용액, 유화액, 캡슐)에 따라 달라질 것이다. 투여될 화합물을 포함하는 적절한 약학 조성물은 생리적으로 허용되는 담체중에 제조될 수 있다. 용액 또는 유화액의 경우, 적절한 담체로는, 예를 들면, 식염수 및 완충 배지를 포함하여, 수성 또는 알콜/수성 용액, 유화액 또는 현탁액이 포함된다. 비경구용 비히클로는 염화나트륨 용액, 링거(Ringer) 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트화 링거액 또는 고정유가 포함될 수 있다. 물, 완충수, 완충 식염수, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜), 덱스트로스 용액 및 글리신을 포함하여 다양한 적절한 수성 담체가 숙련된 전문가에게 공지되어 있다. 정맥내 비히클은 다양한 첨가제, 방부제 또는 유체, 영양소 또는 전해질 보충제를 포함할 수 있다(일반적으로, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 16th Edition, Mack, Ed. 1980] 참조). 조성물은 선택적으로 대략적인 생리 조건에 필요한 바와 같은 약학적으로 허용되는 보조제 물질, 예를 들면, pH 조정 및 완충제 및 독성 조절제, 예를 들면, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 및 락트산나트륨을 함유할 수 있다. 화합물은 당해 분야에 공지된 동결건조 및 복원 기술에 따라 저장을 위해 동결건조되고 사용전에 적절한 담체에 복원될 수 있다.
선택된 배지중 활성 성분의 최적 농도는, 숙련된 전문가에게 공지된 절차에 따라서 실험적으로 결정될 수 있으며, 목적하는 최종 약학 제형에 따라 달라질 것이다.
본 개시내용의 화합물의 투여를 위한 투여량 범위는 목적하는 효과를 제공할 만큼 충분히 큰 범위이다. 예를 들면, 조성물은 치료적으로 또는 예방적으로 효과적인 양의 화합물을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유효량"은 대상에서 VEGF-B의 신호전달을 억제/감소/방지하기에 충분한 화합물의 양을 의미하는 것으로 이해해야 한다. 숙련된 전문가라면 상기 양이, 예를 들면, 화합물 및/또는 특정 대상 및/또는 치료되는 상처의 유형 및/또는 중증도에 따라 달라질 것임을 인지할 것이다. 따라서, 상기 용어는 특정한 양, 예를 들면, 화합물의 중량 또는 수로 본 개시내용을 제한하는 것으로 이해해서는 안된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료 유효량"은 뇌졸중의 하나 이상의 증상을 감소 또는 억제하기에 충분한 양의 화합물을 의미하는 것으로 간주되어야 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "예방 유효량"은 뇌졸중의 하나 이상의 검출 가능한 증상의 발병을 예방 또는 억제하거나 지연시키는 화합물의 충분한 양을 의미하는 것으로 간주되어야 한다.
일 예에서, 화합물은 다음 효과 중 하나 이상을 갖기에 유효한 양으로 투여된다:
● 혈액뇌장벽의 파괴를 감소시키거나 예방함;
● 뇌의 혈관 투과성을 감소시키거나 예방함;
● 뇌의 경색 크기를 감소시키거나 예방함; 및 / 또는
● 두개 내 출혈을 감소시키거나 예방함.
투여량은 고점도 증후군, 폐부종, 울혈성 심부전 등과 같은 불리한 부작용을 야기할 만큼 크지 않아야 한다. 일반적으로, 투여량은 연령, 질병, 성별 및 환자에서 질환 정도에 따라 달라질 것이며, 당해 분야의 기술을 가진 자에 의해 결정될 수 있다. 투여량은 임의의 합병증의 경우에 개별 의사에 의해 조정될 수 있다.
투여량은, 1일 또는 수일 동안, 하루에 하나 이상의 용량 투여로, 약 0.1 내지 약 300 mg/kg, 예를 들면, 약 0.2 내지 약 200 mg/kg, 예를 들어, 약 0.5 내지 약 20 mg/kg으로 달라질 수 있다.
일부 예에서, 화합물은 후속 용량(유지 용량)보다 높은 초기(또는 부하) 용량으로 투여된다. 예를 들면, 화합물은 약 1 내지 약 30 mg/kg의 초기 용량으로 투여된다. 이어서, 화합물은 약 0.0001 내지 약 1 mg/kg의 유지 용량으로 투여된다. 유지 용량은 7 내지 35일마다, 예를 들면, 14일 또는 21일 또는 28일마다 투여될 수 있다.
일부 예에서, 화합물이 초기에 후속 용량에 사용되는 것보다 낮은 용량으로 투여되는 용량 증가 요법이 사용된다. 상기 투여량 요법은 대상의 초기에 겪는 부작용의 경우에 유용하다.
치료에 적절하게 반응하지 않는 개체의 경우, 1주일에 다중 용량이 투여될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 증가하는 용량이 투여될 수 있다.
일 예에서, 본 발명의 화합물(들)은 뇌졸중을 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되고 있거나 개발중인 적어도 하나의 추가의 공지 된 화합물과 조합하여 사용된다. 그러한 공지된 화합물의 예로는 조직 플라스미노겐 활성제 (예를 들어, 알 테플라제, 리테플라제, 테넥테플라스), 아니스트레플라제 (anistreplase), 스트렙토키나제 (streptokinase), 유로키나아제 (urokinase), 라네토플라제 (lanetoplase), 데스모테플라제 (desmoteplase) 및 스타필로키나제 (staphylokinase)와 같은 통상적인 혈전 용해제가 포함된다.
추가로, 본 발명의 방법은 또한 뇌졸중과 직접적 또는 간접적으로 관련된 다른 질병의 치료를 위한 적어도 하나의 다른 치료제의 동시 투여를 포함할 수 있으며, 고지혈증, 고지혈증, 비만, 신경 병증 및 / 또는 망막 병증 등으로 이에 국한되지는 않는다. 본 발명에 따른 화합물(들)과 함께 투여될 수 있는 제제의 추가의 예는 코르티코스테로이드; 면역 억제제; 항생제; 항고혈압제 및 이뇨제 (예 : ACE- 억제제); 담즙 격리제 수지, 콜레스티라민, 콜레스티폴, 니코틴산, 및 보다 구체적으로 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 (예를 들어, 피브레이트 (예, Gemfibrozil™))를 감소시키는데 사용되는 약물과 같은 지질 강하제 및 Lovastatin ™, Atorvastatin ™, Fluvastatin, Lescol™, Lipitor™, Mevacor™), Pravachol™, Pravastatin™, Simvastatin™, Zocor™, Cerivastatin™ 등과 같은 HMG-CoA 억제제; 지질의 장 흡수를 억제하는 화합물 (예를 들어, ezetiminde); 니코틴산; 비타민 D이다.
전술한 내용으로부터 명백한 바와 같이, 본원은 유효량의 제 1 화합물 및 제 2 화합물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상의 병용 치료 방법을 제공하며, 이때 상기 제제는 본 개시내용의 화합물(즉, VEGF-B 신호전달 억제제)이고, 제 2 약제는 뇌졸중의 예방 또는 치료를 위한 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "병용 치료"라는 어구에서 용어 "병용"은 제 2 약제의 존재하에서 제 1 약제를 투여하는 것을 포함한다. 병용 치료 방법은 제 1, 제 2, 제 3, 또는 추가의 약제를 병용 투여하는 방법을 포함한다. 병용 치료법은 또한 제 1 또는 추가 제제가 제 2 또는 추가 제제의 존재하에 투여되는 방법을 포함하며, 제 2 또는 추가 제제는 예를 들어 미리 투여될 수있다. 병용 치료 방법은 상이한 관계자에 의해 단계적으로 시행될 수 있다. 예를 들면, 한 관계자가 개체에게 제 1 약제를 투여할 수 있고, 제 2의 관계자가 개체에게 제 2의 약제를 투여할 수 있으며, 투여 단계는 제 1 약제(및/또는 추가의 약제)가 제 2 약제(및/또는 추가 약제)의 존재하에서의 투여를 추구하는 한 동시에, 또는 거의 동시에, 또는 별개 시간에 실행될 수 있다. 관계자 및 개체는 동일한 존재(예, 인간)일 수 있다.
추가의 치료제의 투여 시간은 본 발명의 화합물의 투여 시간으로부터 측정 될 수 있다. 간격은 예를 들어 5 분에서 24 시간 또는 48 시간이 될 수 있다. 간격은 예를 들어, 15 분 내지 6 시간, 15 분 내지 4.5 시간, 15 분 내지 3 시간, 15 분 내지 1 시간, 30 분 내지 6 시간, 또는 30 분 내지 3 시간, 또는 30 분 내지 4.5 시간 1 시간 내지 3 시간, 1 시간 내지 4.5 시간, 또는 1 시간 내지 5 시간, 또는 1 시간 내지 6 시간 또는 1 시간 내지 7 시간, 또는 1 시간 내지 8 시간, 또는 1 시간 내지 9 시간 또는 1 내지 10 시간이다.
일 예에서, 본 개시는 또한 개체에게 뇌졸중의 영향을 감소시키거나 뇌졸중을 치료하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 개체에게 혈전 용해제를 투여하는 것을 포함하며, 상기 개체는 VEGF-B 신호 전달 억제제를 투여받거나 이전 (예를 들어, 뇌졸중 증상이 발병한 이후로)에 VEGF-B 신호 전달 억제제를 투여받았거나 다른 치료를 받고 있다.
키트
본원의 또 다른 예는 전술한 바와 같이 뇌졸중의 치료에 유용한 화합물을 함유하는 키트를 제공한다.
일 예에서, 키트는 (a) 선택적으로 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제 중에 본원에 기술된 바와 같은 VEGF-B 신호 전달을 억제하는 화합물 및 / 또는 본원에 기재된 바와 같은 혈전 용해제를 포함하는 용기; (b) 개체에서 뇌졸중의 영향을 감소시키기 위한 설명서와 함께 패키지 삽입물을 포함한다.
본 개시내용의 상기 예에 따르면, 패키지 삽입물은 용기상에 존재하거나 용기에 부착된다. 적합한 용기는 예를 들어, 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 상기 용기는 뇌졸중을 치료하는데 효과적인 조성물을 보유 또는 함유하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통 가능한 마개를 갖는 정맥 내 용액백 또는 바이알일 수 있다). 조성물중 하나 이상의 활성 약제는 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물이다. 표지 또는 패키지 삽입물은 조성물이 투약량 및 투약 간격 및 다른 약제가 제공되는지에 관한 구체적인 지침과 함께 치료할 수 있는 대상 (예 : 뇌졸중이 있거나 발병하기 쉬운 대상)을 치료하는데 사용됨을 나타낸다. 키트는 또한 약학적으로 허용되는 희석제 완충제, 예를 들면, 주사용 정균수(BSFI), 포스페이트-완충 식염수, 링거액 및/또는 덱스트로스 용액을 포함하는 추가의 용기를 포함할 수 있다. 키트는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함 할 수 있다.
본 발명은 하기의 비 한정적인 실시예를 포함한다.
[ 실시예 ]
실시예 1: 인간의 원발성 뇌에서 유래된 내피세포에서 지방산 흡수 증가에 의해 체외에서 포도당 흡수가 감소함
VEGF -B로 자극된 1차 (primary) 내피세포는 지방산 흡수가 증가하고 포도당 흡수를 감소시킴
인간 1차 뇌 미세혈관 내피세포, HBMEC (계대 수 <5)를 5% fetal bovine serum (FCS)을 포함하는 complement 팩의 내피 기본배지에서 24-웰 플레이트로 37℃, 5% CO2의 배양기에서 배양하였다. 자극 6 시간 전에 FCS를 지방산이 없는 소혈청 알부민 (FAF-BSA)으로 대체하여 내피세포를 굶겼다. 세포에 비히클 (대조군), 100ng/ml VEGF-B167 (B167), 100ng/ml VEGF-B186 (B186) 또는 2μg/ml 항 -VEGF-B 항체 2H10을 2 시간 동안 첨가하여 세포를 자극하였다.
자극 후, BODIPY-표지된 지방산 (FA) 또는 형광 포도당 유사체 (2-NBDG)의 흡수를 측정하였다. 2-NBDG는 포도당 흡수의 마커로 사용되었다. 세포를 BODIPY-C12 또는 2-NBDG 추적자로 5 분 또는 20 분 동안 각각 배양하였다. 2-NBDG를 첨가하기 전에, 세포를 Kreb 's Ringer 완충액으로 10 분 동안 세척하여 배양 배지 유래 포도당을 제거하였다. FA 또는 포도당 추적자와 함께 배양한 후, 세포를 세척하고 이미지 획득 및 정량화 전에 고정시켰다.
100ng/ml의 VEGF-B 이소형 (VEGF-B167 또는 VEGF-B186)을 이용한 자극은 지방산 (FA) 흡수를 현저하게 증가시키고 포도당 흡수를 상당히 감소시켰다. 블로킹 VEGF-B 항체 2H10 단독 처리는 지방산 또는 포도당 흡수를 유의적으로 변화시키지 않았으나, 배양된 내피세포에서 VEGF-B의 내인성 생성 및 분비를 나타내는 FA 흡수의 감소 및 포도당 흡수의 증가 경향이 관찰되었다.
이러한 결과는 뇌혈관 내피세포가 증가된 FA 흡수 및 감소된 포도당 흡수로 VEGF-B에 반응할 수 있음을 보여 주며, 이는 지질 및 포도당의 흡수가 뇌 내피에서 상호 방식으로 연결될 수 있음을 시사한다.
도 1a 및 1b는 VEGF-B 단백질로 처리된 1차 뇌 유래 내피세포에서 증가된 FA 흡수 및 감소된 포도당 흡수를 나타낸다.
지방산에 노출된 1차 내피세포는 포도당 흡수량이 감소함
인간 1차 내피세포를 팔미트산 나트륨 및 올레산 나트륨 (50 μM)의 혼합물의 존재 또는 부재하에 2 시간 또는 밤새 성장시킨 다음, 2-NBDG 추적자를 처리하고 포도당 흡수를 분석하였다.
FA 풍부 환경 및 지질 로딩에 노출된 내피세포는 시험관 내에서 포도당 흡수능력이 상당히 감소한 것을 나타낸다. 이것은 식이-유도 비만 (DIO) 모델과 같은 생체내 고지질 환경의 내피세포가 유사하게 반응할 수 있으며, 생체내 DIO 환경에서 조직 포도당 흡수량이 감소한다는 것을 의미한다.
도 1c는 지방산에 노출된 주요 내피세포에서의 포도당 흡수 감소를 나타낸다. 지질 로딩에 노출된 내피세포는 포도당을 흡수하는 능력이 현저하게 감소하여, 내피세포에서 FA의 노출 및 흡수는 포도당 흡수를 감소시킨다는 것을 시사한다.
실시예 2: 식이-유도 비만 마우스는 혈당 수치가 증가하고 허혈성 발작의 빈도가 증가함
식이-유도 비만 ( DIO ) 마우스는 혈당 수치가 증가함
3 주령의 C57BL/6 마우스에게 고지방식이 (지방에서 60 % 칼로리) 또는 저지방식이 (정상식이, 지방에서 10 % 칼로리)를 15 주 동안 투여하였다. 혈당은 혈당치를 안정시키기 위해 2 시간 동안 음식을 회수한 후 하루 중 동일한 시간에 측정하였다. 꼬리 끝을 자르고 혈당 측정기로 혈액 한 방울을 측정하였다.
DIO 마우스는 이전의 연구 (Hagberg et al. Nature 2012; Collins et al. Physiology & Behavior 2004)에 따라, 연령이 일치하는 정상식이 마우스와 비교하여 상승된 혈당 수치를 나타냈다.
도 2a는 DIO 마우스가 연령이 일치하는 정상식이 마우스와 비교하여 혈당 수준이 증가한 것을 보여준다.
DIO 마우스는 더 심한 뇌졸중을 겪고, 자연 출혈의 빈도 및 큰 경색이 증가함
3 주령의 수컷 C57BL/6J 마우스를 뇌 허혈 (중대뇌동맥 폐색 (MCAO) 모델)로 유도하기 전 최소 12 주 동안 고지방식 (지방에서 60 % 칼로리) 또는 대조군 저지방식이 (정상식이, 지방에서 10 % 칼로리)를 하였다.
MCAO 모델을 사용하여 대뇌 허혈을 유도하기 위해, 마우스를 클로랄 하이드레이트 (450mg/kg)로 마취시키고 해부 현미경하에 안전하게 놓았다. 왼쪽 MCA는 개두술에 의해 노출시키고, 레이저 도플러 유동 프로브를 MCA의 분기점에서 1.5 mm dorsal 중앙 대뇌 피질의 표면에 놓았다. 프로브는 유량계에 연결하고, 연속 데이터 수집 프로그램으로 기록되는 조직 관류 유닛 (TPU)으로부터 상대 뇌 혈류 (CBF)를 측정하였다. 3.5mW 540nm 레이저는 MCA에서 6cm의 거리에서 보내고, Rose Bengal 염료 (RB) (50mg/kg)는 꼬리 정맥을 통해 주입하였다. TPU가 폐색 이전 수준의 20 % 미만으로 떨어지면 폐색이 안정화되고, 레이저 중단 10 분 이내에 회복되지 않는다.
경색 부피를 측정하기 위해, 뇌를 제거하고 2 mm 두께의 관상 절편으로 절단하고 4 % 2,3,5-triphenyltetrazolium-chloride (TTC)로 염색하였다. 뇌 전체에 걸친 5 개의 관상 동맥 경색 부위가 확인되었고 경색 및 반구 체적을 측정하였다. 경색 부피 측정은 대측성 반구의 부피에서 비경색 동측 반구의 부피를 빼서 계산하였다.
DIO 마우스는 자연 출혈 및 큰 경색의 발병률이 유의하게 증가되어 마른 마우스보다 더 심한 뇌졸중을 나타냈다. DIO 모델에서 뇌졸중 결과는 경색 크기와 자발연 뇌내 출혈 (ICH)의 발생률 모두에서 정상식이 마우스보다 유의하게 더 나빴다.
도 2b 및 2c는 DIO 마우스가 허혈성 뇌졸중 후 더 큰 뇌졸중 부피 및 출혈이 증가된 것을 보여준다.
DIO 마우스는 뇌 허혈 후 VEGF -B 수용체 Nrp1 의 발현이 유의하게 증가함
DIO 마우스를 전술한 바와 같이 MCAO가 되도록 하였다. 허혈 후 3 시간에 마우스를 관류하고 희생시키고, 편측 및 대측 반구를 균질화시켜 전체 RNA를 추출하였다. Vegfb 및 그의 수용체인 Vegfr1 ( Flt1 ) 및 뉴로필린-1 (Nrp1)의 전사수준을을 qPCR에 의해 정량화하였다.
Vegfb 및 Vegfr1 발현은 비 허혈성 대측성 반구에 비해 허혈성 반구에서 3 시간까지 유의하게 증가하지 않았으나, MCAO 후 3 시간에 허혈성 반구에서 Nrp1의 발현은 거의 3 배 증가하였다. 이는 VEGF-B 신호전달이 뇌허혈시 국소적으로 증가할 수 있음을 시사한다.
도 2d는 허혈성 뇌졸중 후 DIO 마우스에서 Nrp1 발현은 증가하지만 Vegf -b 또는 Flt1 발현은 유의하게 증가하지 않음을 보여준다.
실시예 3: 중화 항- VEGF -B 항체 ( 2H10 ) 의 예방적 처리는 DIO 마우스에서 허혈성 뇌졸중의 진행을 예방함
VEGF -B 길항 작용은 DIO 마우스의 뇌에서 포도당 흡수를 향상시킴
C57BL/6J 마우스에게 정상식이 (lean) 또는 고지방식이 (DIO)를 공급하고, DIO 마우스를 이소형 대조군 또는 항 VEGF-B 2H10 항체 (16 mg/kg)로 30 주 동안 주 2 회 처리한 다음 [18F]-DG PET 촬영을 하였다.
DIO는 야윈 대조 마우스와 비교하여 뇌에서 포도당 흡수 (표지된 포도당 유사체를 사용하여 측정)가 감소하였고, DIO 마우스에서 VEGF-B의 장기간 억제는 뇌에서의 포도당 흡수가 상당히 개선되었다. 이 결과는 말초 조직과 유사하게 DIO와 관련된 전신 대사 장애는 뇌가 혈액으로부터 포도당을 흡수하는 능력을 감소시킬 수 있으며, VEGF-B 신호전달이 DIO 모델에서 CNS 포도당 대사를 조절하데 중요한 역할을 할 수 있음을 시사한다.
도 3a는 2H10을 사용한 VEGF-B 길항 작용이 DIO 마우스의 뇌에서 포도당 흡수를 향상시키는 것을 보여준다.
예방적 항- VEGF -B 치료는 DIO 마우스에서 허혈성 뇌졸중의 심각성을 유의하게 감소시킴
VEGF-B가 신경혈관 기능 이상을 촉진시키고 대사 장애가 있는 배경에서 허혈성 뇌졸중의 중증도를 증가시키는지 여부를 직접 시험하기 위해, VEGF-B, 2H10 또는 이소형 대조군에 대한 모노클로날 항체를 처리한 경우 및 처리하지 않은 경우 DIO 마우스에서 혈전성 뇌졸중을 유도하였다.
마우스를 MCAO 전 7, 3 및 1 시간에 16 ㎎/㎏의 항체로 3 회 주사 (I.P.)하여 1 주 동안 처리하였다. 이어서, 마우스를 광 혈전성 MCAO가 되도록하여 전술한 바와 같이 분석하였다. DIO 백그라운드에서 VEGF-B 차단 항체 2H10으로 처리하면 경색 크기와 ICH가 현저하게 감소하였다.
도 3b 및 3c는 VEGF-B 차단 항체 (2H10)에 의한 예방적 처치가 DIO 마우스에서 허혈성 뇌졸중 후 결과를 개선함을 보여준다.
항- VEGF -B로 예방적 처리된 DIO 마우스는 뇌 허혈 후 포도당 전달체 Glut-1 의 발현을 유지함
3 주령의 C57BL/6J 마우스에게 17 주 동안 고지방식이를 공급한 후, 이소 타입 대조군 또는 항-VEGF-B 2H10 항체 16mg/kg을 MCAO 전 7, 3 및 1 시간에 IP 주입을 통해 1 주간 전처리하였다.
대조군 또는 2H10 항체로 전처리 된 DIO 마우스를 MCAO 후 1 시간에 관류시키고 PFA에서 고정시켜, 비브라토모 절편을 만들었다. 절편을 Glut-1에 대한 항체로 염색하고 면역형광으로 검출하였다.
MCAO 후 1 시간 이내에 DIO 마우스의 대뇌 혈관에서 포도당스 전달체 Glut-1을 염색한 결과, 허혈 구역의 경계에서 비 허혈성 반구 (contra)의 유사 혈관과 비교하여 Glut-1 염색의 현저한 손실이 나타났다.
MCAO 전의 VEGF-B 차단 항체 2H10로 일주일 동안 전처리는 음영부의 혈관에서 Glut-1 항원을 부분적으로 보존하였다. 이는 2H10으로 VEGF-B 신호를 차단하면 Glut-1 포도당 전달체 기능을 유지함으로써 허혈성 음영부에서 혈관이 보다 잘 포도당을 흡수할 수 있고, 이로 인해 혈류가 감소된 영역의 혈관이 음영부의 저산소 및 저혈당 환경에 더 잘 대처할 수 있게 한다는 것을 시사한다.
도 3d는 VEGF-B 차단 항체 2H10을 전처리 한 DIO 마우스의 비 허혈성 대측성 반구와 비교하여 허혈성 뇌 반구에서 Glut-1의 유지된 원형질막 발현과 상관관계가 있다는 것을 보여준다. 면역 형광의 상대적인 영역이 그려져 있다.
예방적 항- VEGF -B 처리는 뇌 허혈 후 DIO 마우스에서 혈액뇌장벽 누출을 감소시킴
DIO 마우스를 상기와 같이 2H10 또는 이소 타입 대조군 항체로 전처리한 후 MCAO 하였다. MCAO 유도 직전에, BBB 투과성 분석을 위해 마우스에 70kDa 형광 덱스트란 추적자를 주사 (IV) 하였다. MCAO 유도 1 시간 후, 마우스를 관류하고 가볍게 사후 고정시킨 다음 뇌의 BBB 투과성을 분석하였다.
MCAO 후 1시간 이내에 DIO 마우스에서 BBB 무결성의 극적인 손실이 관찰되었다. 이는 VEGF-B 차단 항체 2H10으로 처리함으로써 현저히 감소되었다. 이러한 결과는 VEGF-B 차단이 허혈의 첫 1 시간 동안 DIO 마우스에서 뇌 혈관 기능을 향상 시킨다는 것을 의미한다.
도 3e는 VEGF-B 차단 항체 2H10으로 전처리는 DIO 마우스에서 허혈성 뇌졸중 1 시간 후의 혈액뇌장벽 누출을 감소시킨 것을 보여준다.
예방적 항- VEGF -B 처리는 뇌 허혈 후 DIO 마우스에서 오클루딘 ( Occludin ) 인산화의 유도를 감소시킴
DIO 마우스를 상기와 같이 2H10 또는 이소 타입 대조군 항체로 전처리한 후 MCAO 하였다. 허혈 후 3 시간에 마우스를 관류하고 뇌를 수집하여 즉시 동결시켰다. 동결절편을 수득하고 포스포세린 특이적 항-Occludin 항체 (세린 잔기 490)로 면역형광 염색하고 형광 강도를 정량화 하였다.
오클루딘 (Occludin)은 MCAO 및 허혈 재관류 손상 후 신속하게 인산화되는 단단한 접합 단백질이다 (Muthusamy et al Journal of cerebral blood flow and metabolism 2014). 세린 잔기 490에서 Occludin의 인산화가 BBB 파괴 및 투과성에 관여한다는 것은 이전에 밝혀졌다 (Murakami et al Diabetes 2012; Murakami et al The Journal of Biological Chemistry 2009).
이소형 대조군 (IgG) 처리된 DIO 마우스는 MCAO 3시간 후 대측성 반구 (콘트라)와 비교하여 음영부 (ipsi)에서 Occludin 세린 인산화 (pS490)가 증가하여, 허혈성 반구에서 내피상피세포접합 (endothelial tight junction)의 해체 및 혈관 투과성 증가를 나타냈다. 항-VEGF-B 항체 2H10의 처리는, 항-VEGF-B 항체 2H10의 처리가 BBB 무결성이 향상된다는 개념을 뒷받침하는 동측 반구 음영부에서 Occludin 인산화의 유도를 감소시킨다.
도 3f는 DIO 마우스에서 허혈성 뇌졸중 후 Occludin 인산화가 항-VEGF-B 처리에 의해 감소됨을 보여준다.
예방적 항- VEGF -B 처리는 대뇌 허혈 후 DIO 마우스의 뇌 혈관에서 지질 축적을 차단함
VEGF-B 신호전달은 포도당 흡수를 하향 조절하고 지질 흡수를 증가시키기 때문에 (상기 나타낸 바와 같이), 마른 마우스 및 비만 마우스 및 2H10 항체를 처리한 비만 마우스에서 MCAO 후 대뇌 혈관의 지질 축적에 대해 조사하였다.
DIO 마우스를 상기 상세히 설명한 바와 같이, 2H10 또는 이소형 대조군 항체로 전처리 한 다음 MCAO 하였다. 전처리 하지 않은 DIO 마우스 및 연령이 일치하는 마른 대조군 마우스도 역시 MCAO 하였다. 허혈 후 3 시간에 마우스를 관류하고 뇌를 수집하여 즉시 동결시켰다. 동결절편을 획득하여 지질 방울 코팅 단백질 인 Adipophilin/Perilipin2에 대한 항체로 염색하고 정량화하였다.
MCAO 3 시간 이내에 허혈성 반구에서 대뇌 혈관 내로의 지질의 상당한 흡수가 관찰되었다. 매우 적은 아디포필린 염색이 관찰된 비-허혈성 대측성 반구와 관련하여, 마른 마우스의 허혈성 반구의 혈관 주위에 상당한 지질 흡수가 있었다. 그러나 이는 DIO 마우스보다는 현저히 적었으며, 이 비만 마우스에서는 혈관 주위 지질 축적 증가가 2H10 처리에 의해 크게 차단되었다.
이러한 결과는 마른 마우스에서 조차도, MCAO가 허혈성 조직에서의 신진대사 요구를 충족시키데 도움을 줄 수 있는 지질 섭취를 신속하게 유도하고, DIO는 이런 반응을 극적으로 강화시킨다는 것을 시사한다. 그러나 뇌 혈관 질환에서 과도한 지질 축적은, 특히 MCAO 후 산소 및 포도당 결핍과 관련하여 해로울 수 있다.
도 3g는 허혈성 뇌졸중 후 뇌 혈관에서의 지질 축적이 항-VEGF-B 항체 2H10에 의한 예방적 처리에 의해 차단된다는 것을 보여준다.
실시예 4: tPA 혈전 용해제와 병용 투여된 치료적 항- VEGF -B 처리는 경색 크기, 출혈을 감소시키고 DIO 마우스의 생존율을 증가시킴
상기와 같이, DIO 마우스를 MCAO 하고 2H10 또는 이소형 대조군 항체 (16mg/kg)로 뇌졸중 1 시간 후에 처리하였다. 추가로 4 시간 후, 유도된 혈병을 용해시키기 위해 tPA (Alteplase, 10mg/kg)를 정맥내 주입하여 혈전 용해제 치료를 하였다. 생존한 동물에서 분리한 뇌를 전술한 바와 같이 분석 하였다.
전형적으로, 혈전 용해제 tPA 치료의 효능은 시간이 지남에 따라 감소하고, 출혈전환의 위험은 증가한다 (Ahmed et al Lancet Neurology 2010). 현재의 결과는, 2H10 처리된 동물의 생존율이 후기 tPA 혈전 용해술 후에 이소형을 처리한 대조군에 비해 유의하게 높았으므로, MCAO 후 2H10으로 1 시간 지연 치료한 다음 4 시간 후 tPA 혈전 용해술이 경색 크기 감소, 출혈 감소 및 치명적인 출혈을 예방한다는 것을 보여준다.
이러한 결과는, 출혈 합병증을 감소시킴으로써 tPA 혈전 용해제의 안전성을 향상시킬 수 있는 tPA 치료에 대한 잠재적 보조제로 뇌졸중에서의 VEGF-B 길항제의 치료적 잠재력 제시 및 / 또는 tPA에 대한 치료 기간을 연장시킬 수 있다. 임상 환경에서 치료범위를 확장하는 것이 혈전 용해제 치료를 받는 더 많은 환자를 치료하는 가장 중요한 단계이다.
도 4a-c는 VEGF-B 차단 항체 2H10에 의한 VEGF-B의 저해가 후기 혈전 용해술 후의 결과를 향상시키는 것을 보여준다.
<110> CSL Limited B-Creative Sweden AB <120> Method of treating or preventing stroke <130> PI17-B095 <150> AU 2014904606 <151> 2014-11-17 <160> 47 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 207 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gln Leu 1 5 10 15 Ala Pro Ala Gln Ala Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln 20 25 30 Arg Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln 35 40 45 Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val 50 55 60 Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly 65 70 75 80 Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln 85 90 95 Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly 100 105 110 Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys 115 120 125 Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp Arg Ala Ala Thr Pro His His Arg 130 135 140 Pro Gln Pro Arg Ser Val Pro Gly Trp Asp Ser Ala Pro Gly Ala Pro 145 150 155 160 Ser Pro Ala Asp Ile Thr His Pro Thr Pro Ala Pro Gly Pro Ser Ala 165 170 175 His Ala Ala Pro Ser Thr Thr Ser Ala Leu Thr Pro Gly Pro Ala Ala 180 185 190 Ala Ala Ala Asp Ala Ala Ala Ser Ser Val Ala Lys Gly Gly Ala 195 200 205 <210> 2 <211> 188 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gln Leu 1 5 10 15 Ala Pro Ala Gln Ala Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln 20 25 30 Arg Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln 35 40 45 Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val 50 55 60 Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly 65 70 75 80 Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln 85 90 95 Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly 100 105 110 Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys 115 120 125 Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp Ser Pro Arg Pro Leu Cys Pro Arg 130 135 140 Cys Thr Gln His His Gln Arg Pro Asp Pro Arg Thr Cys Arg Arg Arg 145 150 155 160 Cys Arg Arg Arg Ser Phe Leu Arg Cys Gln Gly Arg Gly Leu Glu Leu 165 170 175 Asn Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arg Lys Leu Arg Arg 180 185 <210> 3 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence from a VH of antibody 2H10 <400> 3 Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Phe Trp 20 25 30 Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 His Ile Asn Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 50 55 60 Arg Met Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ser Tyr Ser Asn Tyr Val Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence from a VL of antibody 2H10 <400> 4 Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe Leu 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Tyr Thr Ser Thr Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu 65 70 75 80 Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Lys Thr Leu Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 5 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence from a VH of a humanized form of antibody 2H10 <400> 5 Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Phe Trp 20 25 30 Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 35 40 45 His Ile Asn Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 50 55 60 Arg Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ser Tyr Ser Asn Tyr Val Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 6 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a VL of a humanized form of antibody 2H10 <400> 6 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Lys Thr Leu Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 7 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence from a VH of antibody 4E12 <400> 7 Val Gln Pro Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Thr Phe Thr Asn Ser Trp 20 25 30 Ile Gly Trp Val Thr Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Asp Ile Phe Pro Gly Ser Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 50 55 60 Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Ile Glu Asn Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ala 115 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a VL of antibody 4E12 <400> 8 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Ser Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asn Thr Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Gln Ser Pro Arg Pro Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Cys Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr His Ser Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Ala Lys Leu Asp Leu Lys 100 105 <210> 9 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence from a VH of antibody 2F5 <400> 9 Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr Ser 1 5 10 15 Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Phe Tyr 20 25 30 Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Trp Phe Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Leu Lys 50 55 60 Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Ala Ala Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Thr 85 90 95 Arg Ser Pro Tyr Tyr Gly Tyr Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a VL of antibody 2F5 <400> 10 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Ser Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Ala Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 11 <211> 527 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant human tissue plasminogen activator <400> 11 Ser Tyr Gln Val Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gln Met Ile Tyr Gln 1 5 10 15 Gln His Gln Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn Arg Val Glu 20 25 30 Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gln Cys His Ser Val Pro Val 35 40 45 Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Gln Gln 50 55 60 Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Glu Gly Phe Ala 65 70 75 80 Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gln 85 90 95 Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala Glu 100 105 110 Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gln Lys Pro Tyr Ser Gly 115 120 125 Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys 130 135 140 Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Phe Lys Ala 145 150 155 160 Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys Ser Glu Gly 165 170 175 Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His 180 185 190 Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile 195 200 205 Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu 210 215 220 Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys 225 230 235 240 Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys 245 250 255 Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro 260 265 270 Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro 275 280 285 Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg 290 295 300 Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala 305 310 315 320 Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile 325 330 335 Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe 340 345 350 Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr 355 360 365 Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys 370 375 380 Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp 385 390 395 400 Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys 405 410 415 His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His 420 425 430 Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn 435 440 445 Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly 450 455 460 Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly 465 470 475 480 Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile 485 490 495 Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr 500 505 510 Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro 515 520 525 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of 2H10 VL CDR1 <400> 12 agggcaagtc aggacattag caatttttta aac 33 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of 2H10 VL CDR2 <400> 13 tacacatcaa cattacactc a 21 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of 2H10 VL CDR3 <400> 14 caacagggta aaacgcttcc tcccacg 27 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of 2H10 VH CDR1 <400> 15 ggctacactt tcactggctt ctggatacac 30 <210> 16 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of 2H10 VH CDR2 <400> 16 catattaatc ctggcaatgg tggcactaac tacaatgaga agttcaagag a 51 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of 2H10 VH CDR3 <400> 17 tcctatagta actacgtgcg ggctatggac tac 33 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of 2H10 VL CDR1 <400> 18 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe Leu Asn 1 5 10 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 2H10 VL CDR2 <400> 19 Tyr Thr Ser Thr Leu His Ser 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 2H10 VL CDR3 <400> 20 Gln Gln Gly Lys Thr Leu Pro Pro Thr 1 5 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 2H10 VH CDR1 <400> 21 Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Phe Trp Ile His 1 5 10 <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 2H10 VH CDR2 <400> 22 His Ile Asn Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Arg <210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 2H10 VH CDR3 <400> 23 Ser Tyr Ser Asn Tyr Val Arg Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 24 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 2F5 VL CDR1 <400> 24 aaggccagtc aggatgtggg tactgctgta gcc 33 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 2F5 VL CDR2 <400> 25 tgggcatcca cccggcacac t 21 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 2F5 VL CDR3 <400> 26 caacaatata gcagctctct cacg 24 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 2F5 VH CDR1 <400> 27 ggctacacct tcacaacctt ctatatacac 30 <210> 28 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 2F5 VH CDR2 <400> 28 tggttttatc ctggaaatgt taataccaac tacaatgaga agctcaaggg c 51 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 2F5 VH CDR3 <400> 29 tccccttact acggctacgt ttttgactac 30 <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 2F5 VL CDR1 <400> 30 Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 2F5 VL CDR2 <400> 31 Trp Ala Ser Thr Arg His Thr 1 5 <210> 32 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 2F5 VL CDR3 <400> 32 Gln Gln Tyr Ser Ser Ser Leu Thr 1 5 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 2F5 VH CDR1 <400> 33 Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Phe Tyr Ile His 1 5 10 <210> 34 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 2F5 VH CDR2 <400> 34 Trp Phe Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Leu Lys 1 5 10 15 Gly <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 2F5 VH CDR3 <400> 35 Ser Pro Tyr Tyr Gly Tyr Val Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 36 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 4E12 VL CDR1 <400> 36 aaggccagtc agaatgtgaa cactaatgta gcc 33 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 4E12 VL CDR2 <400> 37 tcggcatcct cccggtgcag t 21 <210> 38 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 4E12 VL CDR3 <400> 38 cagcaatatc acagctttcc gctcacg 27 <210> 39 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 4E12 VH CDR1 <400> 39 ggcgacacct tcaccaactc ctggataggc 30 <210> 40 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 4E12 VH CDR2 <400> 40 gatatttttc ctgggagtgg tcatactaac tacaatgaga agttcaagaa c 51 <210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 4E12 VH CDR3 <400> 41 gagaattatg cctggtttgc ttat 24 <210> 42 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 4E12 VL CDR1 <400> 42 Lys Ala Ser Gln Asn Val Asn Thr Asn Val Ala 1 5 10 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 4E12 VL CDR2 <400> 43 Ser Ala Ser Ser Arg Cys Ser 1 5 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 4E12 VL CDR3 <400> 44 Gln Gln Tyr His Ser Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 45 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 4E12 VH CDR1 <400> 45 Gly Asp Thr Phe Thr Asn Ser Trp Ile Gly 1 5 10 <210> 46 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 4E12 VH CDR2 <400> 46 Asp Ile Phe Pro Gly Ser Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asn <210> 47 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 4E12 VH CDR3 <400> 47 Glu Asn Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5

Claims (24)

  1. 혈관 내피 성장 인자-B (VEGF-B) 신호전달을 억제하는 화합물을 포함하는 개체에서 뇌졸중의 영향을 감소시키기 위한 약학 조성물로서, 상기 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물은:
    VEGF-B에 결합하거나 특이적으로 결합하여 VEGF-B 신호전달을 중화시키는 항체 가변영역을 포함하는 단백질이고,
    여기서 항체 가변영역은
    (i) (a) 서열번호 3의 아미노산 25-34에 기재된 서열을 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 3의 아미노산 49-65에 기재된 서열을 포함하는 CDR2; 및
    (c) 서열번호 3의 아미노산 98-108에 기재된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역: 및
    (ii) (a) 서열번호 4의 아미노산 23-33에 기재된 서열을 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 4의 아미노산 49-55에 기재된 서열을 포함하는 CDR2; 및
    (c) 서열번호 4의 아미노산 88-96에 기재된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물은 뇌졸중 전 또는 후에 투여하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물은 뇌졸중 전에 투여하고, 뇌졸중 위험이 있는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 당뇨병 및/또는 비만증을 앓고 있는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 당뇨병은 제2형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 다음 특성 중 하나 이상을 갖는 것을 특징으로 하는 약학 조성물:
    ● 이미 뇌졸중 및 / 또는 일과성 허혈 발작으로 고통을 받았음;
    ● 뇌졸중의 가족력이 있음;
    ● 심장병으로 고통을 받음;
    ● 고혈압이 있음;
    ● 혈장 저밀도지질단백질 (LDL) 수치가 높음;
    ● 대사 증후군이 있음;
    ● 심장 이상이 있음;
    ● 심장 수술 또는 고관절 치환 수술을 받았음.
  7. 제2항에 있어서, 상기 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물은 뇌졸중 후에 투여하고, 상기 약학 조성물은 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물 및 혈전 용해제를 조합하여 병용투여하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물은 혈전 용해제 전에 투여하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물의 투여는 혈전 용해제가 개체에 안전하게 투여될 수 있는 시간을 연장시키는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈전 용해제는 뇌졸중의 증상 발병 후 2시간 이상 동안 투여하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 혈전 용해제는 뇌졸중의 증상 발병 후 2 내지 6 시간 동안 투여하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  12. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 400mg/dL 초과의 혈당치를 갖는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  13. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈전 용해제는 조직 플라스미노겐 활성제, 라네토플라제 (lanetoplase), 레테플라제 (reteplase), 스타필로키나제 (staphylokinase), 스트렙토키나제 (streptokinase), 아니스트레플라제 (anistreplase), 데스모테플라제 (desmoteplase) 또는 유로키나아제 (urokinase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물(들)은 다음 효과 중 하나 이상을 갖기에 충분한 양으로 투여하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물:
    ● 개체에서 경색 크기의 감소;
    ● 개체의 뇌내 출혈 스코어로 평가한 출혈 스코어의 감소;
    ● 개체의 출혈 발생률 감소;
    ● 개체에서 치명적인 출혈의 가능성 감소;
    ● 뇌졸중 후 개체의 뇌부종 감소; 및 / 또는
    ● 뇌졸중 후 혈액뇌장벽 (blood brain barrier) 파괴 또는 누출 감소.
  15. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뇌졸중은 허혈성 뇌졸중 인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 제1항에 있어서, 상기 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물은:
    (i) 항체 2H10의 가변영역의 인간화된 형태(서열번호 3으로 표시되는 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 (VH) 및 서열번호 4로 표시되는 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 (VL)을 포함함); 또는
    (ii) 항체 2H10의 인간화된 형태; 또는
    (iii) 서열번호 5로 표시되는 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 6으로 표시되는 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
KR1020177016154A 2014-11-17 2015-11-17 뇌졸중의 치료 또는 예방 방법 KR102560025B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2014904606A AU2014904606A0 (en) 2014-11-17 Method of treating or preventing stroke
AU2014904606 2014-11-17
PCT/AU2015/050720 WO2016077878A1 (en) 2014-11-17 2015-11-17 Method of treating or preventing stroke

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20170082631A KR20170082631A (ko) 2017-07-14
KR102560025B1 true KR102560025B1 (ko) 2023-07-26

Family

ID=56012959

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177016154A KR102560025B1 (ko) 2014-11-17 2015-11-17 뇌졸중의 치료 또는 예방 방법

Country Status (13)

Country Link
US (2) US10336821B2 (ko)
EP (1) EP3220952B1 (ko)
JP (1) JP6863892B2 (ko)
KR (1) KR102560025B1 (ko)
CN (1) CN107106681B (ko)
AU (1) AU2015349610B2 (ko)
BR (1) BR112017010336A2 (ko)
CA (1) CA2967070C (ko)
DK (1) DK3220952T3 (ko)
ES (1) ES2881303T3 (ko)
PL (1) PL3220952T3 (ko)
RU (1) RU2744909C2 (ko)
WO (1) WO2016077878A1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10617756B2 (en) * 2017-01-05 2020-04-14 Shimojani, LLC Drug regimen for treatment of cerebral ischemia
US20190076510A1 (en) * 2017-09-13 2019-03-14 The Regents Of The University Of Michigan Protein kinase c inhibition to extend tissue plasminogen activator treatment for ischemic disease
BR112020010514A2 (pt) * 2017-11-29 2020-11-24 Csl Limited método para tratar ou prevenir lesão por isquemia-reperfusão

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009126698A2 (en) * 2008-04-09 2009-10-15 Ludwig Institute For Cancer Research Regulation of fatty acid transporters
JP2011046684A (ja) * 2009-07-27 2011-03-10 Niigata Univ 免疫製剤を含む脳梗塞治療用医薬品組成物

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030232439A1 (en) 2002-06-17 2003-12-18 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of VEGF-B expression
EP2476427B1 (en) * 2004-08-02 2018-01-17 Zenyth Operations PTY. Ltd. A method of treating cancer comprising a VEGF-B antagonist
AU2006283532B2 (en) * 2005-08-19 2012-04-26 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobin and uses thereof
EP2548578B1 (en) 2006-05-17 2014-08-20 The Ludwig Institute for Cancer Research Targeting VEGF-B regulation of fatty acid transporters to modulate human diseases
US20110318365A1 (en) 2007-09-15 2011-12-29 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Methods for treatment of degenerative disease associated with apoptosis
ES2711882T3 (es) 2013-11-28 2019-05-08 B Creative Sweden Ab Método de tratamiento de la nefropatía diabética
ES2851386T3 (es) 2013-12-18 2021-09-06 Csl Ltd Método de tratamiento de las heridas

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009126698A2 (en) * 2008-04-09 2009-10-15 Ludwig Institute For Cancer Research Regulation of fatty acid transporters
JP2011046684A (ja) * 2009-07-27 2011-03-10 Niigata Univ 免疫製剤を含む脳梗塞治療用医薬品組成物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Journal of Clinical Investigation. 1999. Vol.104, No.11, pp.1613-1620.

Also Published As

Publication number Publication date
EP3220952A4 (en) 2018-03-28
RU2017120031A3 (ko) 2019-05-15
CN107106681A (zh) 2017-08-29
RU2744909C2 (ru) 2021-03-17
US20190315849A1 (en) 2019-10-17
JP2017535551A (ja) 2017-11-30
CA2967070A1 (en) 2016-05-26
EP3220952A1 (en) 2017-09-27
AU2015349610A1 (en) 2017-05-25
BR112017010336A2 (pt) 2018-05-15
DK3220952T3 (da) 2021-07-19
CN107106681B (zh) 2021-11-09
US10961304B2 (en) 2021-03-30
WO2016077878A1 (en) 2016-05-26
ES2881303T3 (es) 2021-11-29
US20180237513A1 (en) 2018-08-23
US10336821B2 (en) 2019-07-02
PL3220952T3 (pl) 2022-01-31
CA2967070C (en) 2024-03-12
AU2015349610B2 (en) 2021-08-26
JP6863892B2 (ja) 2021-04-21
KR20170082631A (ko) 2017-07-14
RU2017120031A (ru) 2018-12-19
EP3220952B1 (en) 2021-04-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11859000B2 (en) Anti-CCR8 antibodies and uses thereof
US11773171B2 (en) WNT surrogate molecules and uses thereof
JP2002505097A (ja) 治療薬としてのｃｄ１４７結合分子
US9493554B2 (en) Methods of treating retinal disorders with anti-apelin antibodies
CN109310884B (zh) 治疗或预防肝病的方法
US10961304B2 (en) Method of reducing the effect of a stroke comprising administering an inhibitor of vascular endothelial growth factor B (VEGF-B)
JP2024511137A (ja) Ｃｄ４７およびｐｄ－ｌ１を標的とする二重特異性抗体ならびにその使用方法
EP2999715B1 (en) Novel antibody useful in neurological or neurodegenerative disorders
KR102466794B1 (ko) 상처 치료 방법
JP7189878B2 (ja) ヒトｃｄ１６０を結合する結合物及びその使用
JP2014529581A (ja) 構成的に活性なｕＰＡＲバリアントならびに阻害抗体の生成および単離へのそれの使用
KR20230007368A (ko) 항-tmprss6 항체 및 이의 용도
WO2015138411A1 (en) Anti-fibulin-3 antibodies and uses thereof
KR20240015200A (ko) 뇌신경계 질환 치료하기 위한 병용투여용 항체 및 이를 포함하는 약학조성물

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right