KR102556144B1 - 나노초 펄스 버스트의 메가헤르츠 압축 - Google Patents

Abstract

전기장 강도가 매우 낮지만(예를 들어, 1 kV/cm 미만) 주파수가 높은(예를 들어, 메가헤르츠) 마이크로초 미만 범위의 펄스화 전기장을 사용하여 한 가지 이상의 바람직한 생물학적 및/또는 생리학적 효과를 일으키기 위해 생물학적 조직을 처리하는 방법 및 장치(시스템, 기기 등).

Description

나노초 펄스 버스트의 메가헤르츠 압축

관련 출원의 교차 참조

이 특허는 2018년 11월 8일자로 출원된 발명의 명칭이 "나노초 펄스 버스트의 메가헤르츠 압축(MEGAHERTZ COMPRESSION OF NANOSECOND PULSE BURSTS)"인 미국 임시 특허 출원 제62/757,739호의 우선권을 주장하며, 이의 전체 내용은 본원에 원용되어 포함된다.

원용

본 명세서에 언급된 모든 간행물들과 특허 출원들은 그 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 원용되어 포함된다고 표시된 것과 동일한 범위까지 그들의 전체 내용이 본원에 원용되어 포함된다.

연방 지원 연구에 대한 진술

이 발명은 국립보건원(NIH/NIHLBI: National Institute of Health)이 수여한 보조금 번호 R01HL128381호와 공군 과학 연구실(AFOSR: Air Force Office of Scientific Research)이 수여한 보조금 번호 FA9550-15-1-0517호에 따라 정부의 지원을 받아 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 가지고 있다.

기술분야

본 명세서에 기술된 장치 및 방법은 저전압(예를 들어, 20 V 미만) 및 고주파수(예를 들어, 메가헤르츠)의 나노초 전기 펄스들의 열(train of nanosecond electrical pulses)을 적용하기 위한 생물학적 처리 장치 및 방법에 관한 것이다.

나노초 범위의 펄스를 사용하는 전기적 처리는 의학, 연구, 및 생명공학 분야에서 많이 응용되고 있다. 그러한 응용에는, 예를 들면, 세포 및 조직의 전기 자극 및 활성화, 세포 분화 및 사망 유도, 종양 및 조직 절제, 제세동 등이 포함된다. 일반적으로 나노초 범위의 전기 펄스를 사용하는 처리는 원하는 생물학적 효과(bio-effect)를 위한 국소 전기장 역치를 초과하도록 고전압을 사용한다. 예를 들어, 원하는 생물학적 효과 여하에 따라, 단일 나노초(ns) 펄스에 대한 역치는 단일 펄스에 대해 수 kV/cm 정도일 수 있는데, 더 짧은 펄스에 대해서는 더 클 수 있다. 예를 들어, 2.5 kV/cm는 200 ns 펄스에 의한 심근세포 활성화에 대한 전형적인 역치이고; 1.8 kV/cm는 300 ns 펄스를 사용하는 HEK293 세포에서 칼슘 과도 현상을 유도하기 위한 전형적인 역치이고; 6 kV/cm와 1 kV/cm는 각각 60 ns 및 600 ns 펄스에 의한 CHO 세포의 투과화(permeabilization)의 전형적인 역치이다. 또한, 다수의 나노초 전기 펄스를 1 Hz 내지 1 kHz의 반복률로 전달하게 되면, 효과는 일반적으로 더해지는 방식으로 증가하는데, 역치 전기장의 감소 없이 증가하거나, 아니면 고작해야 역치를 많지 않게(예를 들어, 2배 내지 3배) 감소시키는 결과를 내는 정도로 해서 증가한다.

더 안전하고 저렴한 처리를 할 수 있게 하는 저전압의 나노초 펄스를 사용하여 원하는 생물학적 효과를 달성할 수 있도록 전기 펄스를 제공하는 것이 바람직하다.

전통적으로, 마이크로초 미만(sub-microsecond) 전기 요법은 생물학적 효과를 유도하기 위해 일반적으로 1 내지 50 kV/cm 이상의 높은 전기장이 필요하다고 생각되었다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 본 발명자들은 펄스들을 상당히 낮은 전기장을 사용하여 예를 들어 최대 수 MHz까지의 고속 버스트(burstt)로 압축할 때 시간적 합치기(temporal summation)를 사용함으로써 이러한 요건을 극복할 수 있다는 것을 발견했다. 강렬한 나노초 펄스화 전기장(nsPEF: nanosecond pulsed electric filed)을 사용하는 이 기술은 특히 심실 심근세포 및 말초신경 섬유와 같은 신경을 포함하는 전기적 세포의 세포 활성화, 나노 전기천공 및 여기와, 막 전기천공과, 그리고/또는 세포 사멸에 사용될 수 있다. 마이크로초 미만 전기 버스트(100 내지 1000 펄스)의 메가헤르츠 압축은 상당히 낮은 에너지 밀도(예를 들어, 약 0.01 내지 0.15 kV/cm)에서의 여기를 가능하게 하고/하거나, 이전에 비해서 낮은 에너지 밀도(예를 들어, 약 0.4 내지 0.6 kV/cm)에서의 전기 천공이 이루어지게 할 수 있다. 일부 변형 예에서, 여기 역치와 전기천공 역치가 구별되어 있기 때문에, 다수의 여기 사이클이 막 파괴 없이 수행될 수 있다. 마이크로초 미만 에너지 버스트의 효율은 예를 들어 펄스 지속 시간이나 혹은 반복률을 증가시킴으로써 듀티 사이클로 증가할 수 있고/있거나, 총 "온(ON)" 시간을 증가시킴으로써, 예를 들어 펄스 지속 시간이나 혹은 횟수를 증가시킴으로써, 증가할 수 있다. 일부 변형 예에서, 마이크로초 미만 전기 에너지 버스트의 효율은 진폭 및 지속 시간이 버스트의 시간 평균 진폭 및 지속 시간과 거의 동일한 단일의 "긴" 펄스의 효율과 일치할 수 있다. 따라서, 고주파수(예를 들어, 5 kHz 이상, 10 kHz 이상, 100 kHz 이상, 200 kHz 이상, 500 kHz 이상, 1 MHz 이상 등)와, 마이크로초 미만 전기 버스트가 있는 낮은 전기장을 사용하게 되면, 여기 역치를 낮추고/낮추거나 전기 천공을 용이하게 하는 효과적인 방법이 제공될 수 있다.

따라서, 전기장 값이 매우 낮지만(예를 들어, 표적 조직에서 1 kV/cm 미만) 주파수가 높은(예를 들어, 메가헤르츠) 마이크로초 미만 범위의 펄스화 전기장을 사용하여 한 가지 이상의 바람직한 생물학적 및/또는 생리학적 효과를 일으킬 수 있는 방법 및 장치(예를 들어, 시스템, 기기 등)이 본원에 기술된다.

예를 들어, 생물학적 효과를 일으키기 위해 생물학적 조직의 표적 영역을 처리하는 방법이 본원에 기술되는 바, 이 방법은 생물학적 조직에 마이크로초 미만 펄스화 전기장을 통과시키는 것을 포함하고, 여기서 펄스화 전기장은 생물학적 조직의 표적 영역에서 1 kV/cm 미만의 진폭을 가지며, 0.1 MHz 이상(예를 들어, 0.2 MHz 이상, 0.5 MHz 이상, 1 MHz 이상 등)으로 펄스화된다. 마이크로초 미만 펄스화 전기장은 나노초 범위의 펄스, 예를 들어 1000 ns 이하의 펄스를 포함할 수 있다.

생물학적 효과는 다음 중 하나일 수 있다: 전기 자극(예를 들어, 활동 전위를 일으키는 자극, 전압에 민감한 이온 채널을 활성화시키는 자극, 하전 이온 내로의 유입을 일으키는 자극, 세포 또는 세포들을 탈분극시키는 자극 등), 천공, 면역 반응 유발, 세포를 통한 물질 전달 등.

피부, 간, 신장, 신경 세포, 뇌, 척추, 폐, 근육, 지방, 호흡기, 위장, 방광, 및 생식기 중 하나 이상을 포함하는 임의의 적절한 생물학적 조직이 표적화될 수 있다. 특히, 생물학적 조직은, 암을 포함하지만 이에 국한되지 않는 질병 조직일 수 있다.

또한, 본원에 기술된 방법들 중 임의의 방법을 수행하도록 구성된, 생물학적 조직을 처리하기 위한 장치(예를 들어, 시스템)도 본원에 기술된다. 예를 들어, 본 시스템은 제어기; 생물학적 조직에 근접하게 배치되도록 구성된 전극 세트를 포함하는 어플리케이터; 및 하나 이상의 펄스 발생기를 포함할 수 있고, 여기서 각각의 펄스 발생기는 마이크로초 미만 펄스(예를 들어, 1000 ns 이하의 지속 시간을 갖는 펄스)를 생성하도록 구성되고, 제어기는 주파수가 0.1 MHz 이상(예를 들어, 0.2 MHz 이상, 0.5 MHz 이상, 1 MHz 이상 등)인 마이크로초 미만 펄스들의 열을 적용하도록 구성된다. 시스템은 1 kV/cm 미만, 예를 들어 0.01 내지 0.15 kV/cm, 또는 0.6 kV/cm 미만의 전기장 강도를 생성하도록 구성될 수 있다. 어플리케이터에 의해 인가되는 전압의 진폭은 20 V 이하일 수 있다. 제어기는 복수의 펄스 발생기 각각으로부터의 나노초 펄스들을 결합하기 위해 복수의 펄스 발생기들을 조화되게 조정하도록(coordinate) 구성될 수 있다.

예를 들어, 생물학적 조직을 처리하기 위한 시스템은 복수의 펄스 발생기; 및 하나 이상의 프로세서를 포함하는 제어기를 포함할 수 있고, 상기 제어기는, 하나 이상의 프로세서로 하여금 생물학적 조직에 나노초 펄스화 전기장을 통과시키도록 하는 작동을 실행하게 하는 명령어를 저장하는 기계 판독 가능 유형(tangible) 매체를 포함하고, 상기 펄스화 전기장은 1 kV/cm 미만의 진폭을 가지며, 0.1 MHz 이상(예를 들어, 0.2 MHz 이상, 0.5 MHz 이상, 1 MHz 이상 등)으로 펄스화된다.

또한, 조직의 표적 영역에 생물학적 효과를 일으키는 방법도 본원에 기술되는 바, 이 방법에서는 다수의 공간적으로 분리된 펄스 전기 에너지원이 동시에 구동되어서 조직에 전기 에너지의 펄스(예를 들어, 마이크로초 미만의 펄스)를 적용한다. 예를 들어, 생물학적 효과를 일으키기 위해 생물학적 조직을 처리하는 방법은 제1 나노초 펄스화 전기장을 표적 영역에 전달하는 단계 - 여기서 제1 나노초 펄스화 전기장의 각 펄스는 지속 시간이 1 마이크로초 이하임 -; 제1 나노초 펄스화 전기장과 동시에, 제2 나노초 펄스화 전기를 표적 영역에 전달하는 단계 - 여기서 제2 나노초 펄스화 전기장의 각 펄스는 지속 시간은 1 마이크로초 이하임 -; 및 표적 영역에 합해진 펄스화 전기장을 형성하는 단계 - 여기서 합해진 펄스화 전기장은 제1 나노초 펄스장과 제2 나노초 펄스화 전기장의 중첩을 포함하고, 1 kV/cm 미만의 진폭을 가지며, 또한 합해진 펄스화 전기장은 0.1 MHz 이상(예를 들어, 0.2 MHz 이상, 0.5 MHz 이상, 1 MHz 이상 등)의 펄싱 주파수를 갖는 펄스들을 포함함 - 를 포함한다.

또한, 펄스 발생기 작동 방법도 본원에 기술된다. 일부 실시형태에서, 본 방법은 고주파수 마이크로초 미만 펄스화 전기장(high-frequency, sub-microsecond pulsed electric field)을 생성하는 단계를 포함하며, 여기서 고주파수 마이크로초 미만 펄스화 전기장은 전기장 강도가 1 kV/cm 미만이고, 주파수가 0.1 메가헤르츠 이상(예를 들어, 0.2 MHz 이상, 0.5 MHz 이상, 1 MHz 이상 등)이며, 각 펄스의 지속 시간이 1000 ns 미만이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 펄스 발생기의 작동 방법은 제1 나노초 펄스화 전기장을 전달하는 단계 - 여기서 각 펄스는 지속 시간이 1 마이크로초 미만임 -; 제1 나노초 펄스화 전기장과 동시에, 제2 나노초 펄스화 전기장을 전달하는 단계 - 여기서 각 펄스는 지속 시간이 1 마이크로초 미만임 -; 및 제1 펄스화 전기장과 제2 펄스화 전기장을 합하여, 전기장 강도가 1 kV/cm 미만이고 주파수가 0.1 MHz 이상(예를 들어, 0.5 MHz 이상, 1 MHz 이상 등)인, 제1 마이크로초 미만 펄스화 전기장과 제2 마이크로초 미만 펄스화 전기장의 중첩을 포함하는 고주파수 마이크로초 미만 펄스화 전기장을 전달하는 단계를 포함한다.

이들 방법들 중 임의의 방법에 있어서, 제1 나노초 펄스화 전기장과 제2 나노초 펄스화 전기장 중 적어도 하나(그리고 바람직하게는 둘 다)는 쌍극(bipolar) 펄스를 포함할 수 있으며, 이는 방출되는 전기장의 소스들(예를 들어, 전극, 안테나 등) 근처의 효과를 감소시킬 수 있다.

또한, 본원에는 생물학적 조직을 처리하기 위한 시스템도 기술되는 바, 이 시스템은 복수의 펄스 발생기; 및 하나 이상의 프로세서를 포함하는 제어기를 포함할 수 있고, 제어기는 하나 이상의 프로세서로 하여금, 제1 나노초 펄스화 전기장을 생물학적 조직을 통해 표적 영역으로 보내도록 하는 작동 - 여기서 제1 나노초 펄스화 전기장의 각 펄스는 지속 시간이 1000 ns 이하임 -; 제1 나노초 펄스화 전기장과 동시에, 제2 나노초 펄스화 전기장을 생물학적 조직을 통해 표적 영역으로 보내도록 하는 작동 - 여기서 제2 나노초 펄스화 전기장의 각 펄스는 지속 시간이 1000 ns 이하임 -; 및 표적 영역에 합해진 펄스화 전기장을 형성하도록 하는 작동 - 여기서 합해진 펄스화 전기장은 제1 나노초 펄스화 전기장과 제2 나노초 펄스화 전기장의 중첩을 포함하며, 1 kV/cm 미만의 진폭을 가지며, 또한 합해진 펄스화 전기장은 0.1 메가헤르츠 이상의 펄싱 주파수를 갖는 단극 펄스를 포함하며, 또한 각 펄스는 1000 ns 지속 시간 이하임 - 을 실행하게 하는 명령어를 저장하는 기계 판독 가능 유형 매체를 포함한다.

본 발명의 신규 특징들은 하기 청구범위에 구체적으로 기재된다. 본 발명의 원리가 이용되는 예시적인 실시형태들을 설명하는 하기의 상세한 설명과 첨부 도면을 참조함으로써 본 발명의 특징들과 이점들을 더 잘 이해하게 될 것이다.
도 1은 피크 전압이 낮고(예를 들어, 20V 미만) 펄스들 사이의 주파수가 높은(예를 들어, 메가헤르츠)(예를 들어, 일반적으로 500 ns 미만인 순차적 나노초 펄스들 사이의 간격을 가짐), 본원에 기술된 바와 같은 마이크로초 미만(예를 들어, 나노초) 전기 펄스들의 열의 예이다. 본원에 기술된 방법 및 장치는, 일반적으로는 약 1 마이크로초 이하의 지속 시간을 갖는 펄스를 포함하지만 일부 변형 예에서는 10 μs 이하(예를 들어, 10000 ns 이하)의 펄스를 포함할 수 있는 마이크로초 미만 펄스와 관련된다. 예를 들어, 일부 적용에서, 마이크로초 미만 펄스들은 각각 0.1 ns 내지 1000 ns(예를 들어, 50 내지 500 ns, 100 내지 400 ns 등)일 수 있다.
도 2a는 예를 들어 펄스들 사이의 간격이 100 μs인 10 kHz 주파수의 100 ns 펄스들의 열(아래쪽)을 보여주는 예이다. 각 펄스는 위쪽 트레이스도에 표시된 세포 내의 막 통과 전위의 임의의 단위의 증가와, 방전을 일으키며; 이 예에서 세포는 8 μs의 방전 시간을 갖는다. 역치(threshold) 수준은 상단에 파선으로 표시된다.
도 2b는 도 2a와 유사하지만 200 kHz의 주파수로, 또는 각 펄스 사이의 간격을 5 μs로 유지하여, 펄싱하는 것이다.
도 2c는 도 2a 및 도 2b와 유사하지만 1 MHz의 주파수로, 또는 각 펄스 사이의 간격을 1 μs로 유지하여, 펄싱하는 것이다. 도시된 바와 같이, 이 주파수에서, 세포막은 다음 나노초 펄스 전에 완전히 방전되지 않고, 그 결과 막 전위가 단지 몇 번의 펄스 후에 역치(역치 1)를 초과하게 되고 추가 펄싱 후에 두 번째 역치(역치 2)를 초과하는 상태에 이르게 된다.
도 3은 에너지가 낮고(예를 들어, 낮은 전기장) 주파수가 높은(예를 들어, 메가헤르츠 범위) 나노초 범위의 전기 펄스를 적용하기 위한 장치의 한 예의 개략도이다. 예를 들어, 본 장치는 전원 공급 장치를 제어하는 제어기와, 펄스 폭이 약 0.1 ns 내지 1000 ns이고 진폭이 0.1 V 내지 20 V이며 주파수가 0.1 MHz 내지 30 MHz인 펄스를 적용하도록 구성된 하나 또는 복수의 나노초 펄스 발생기를 포함하도록 구성될 수 있다.
도 4a는 도 3에 도시된 것과 같은 장치에 있어서의 펄스 발생기를 위한 회로 개략도의 한 예를 예시한다.
도 4b는 전기장이 낮고 주파수가 높은(예를 들어, 메가헤르츠) 나노초 전기 펄스를 적용하기 위한 장치로서, 1000 ns 미만으로 분리된(예를 들어, 0.1 MHz 이상의 주파수를 갖는) 나노초 펄스들의 열을 전달하도록 제어기에 의해 제어될 수 있는 복수의 펄스 발생기를 포함하는 장치의 개략도의 예이다.
도 4c는 도 4b에 도시된 것과 같은 장치에 의해 형성된 나노초 펄스들의 열의 한 예로서, 이 도 4c에는, 펄스들의 열의 각 펄스를 생성하는 펄스 발생기(도 4b)가 표시된다.
도 5는 낮은 전기장 및 높은 주파수(예를 들어, 메가헤르츠)의 나노초 펄스를 생성하도록 구성된 펄스 발생기 장치의 또 다른 예이다. 도 5에서, 펄스 발생기는 쌍극 펄스를 생성하는 데 사용될 수 있다.
도 6은 메가헤르츠 범위이고 저전압인, 공간적으로 분리된 나노초 펄스들의 적용(예를 들어, 여러 어플리케이터들로부터의 적용 및/또는 하나의 동형의 어플리케이터의 여러 전극들로부터의 적용)을 제어하고/하거나 조화되게 조정하도록 구성된 펄스 발생기 장치(예를 들어, 시스템)의 또 다른 변형 예의 개략도이다. 이 어플리케이터는 본원에 설명된 바와 같이 쌍극 나노초 펄싱에 특히 유용할 수 있다.
도 7은 전기장이 낮고 주파수가 메가헤르츠 수준인 나노초 펄스들을 세포에 적용하기 위한 실험 장치(experimental setup)의 예이다. 도 7의 장치는 세포의 이미징도 가능하게 한다.
도 8a는 낮은 전기장(예를 들어, 85 V/cm) 및 메가헤르츠 주파수(예를 들어, 3.33 MHz)의 나노초 펄스들에 의한 마우스 심실 심근세포의 여기의 예를 예시한다. 도 8a에서, 3.33 MHz의 200 ns 펄스들의 펄스 열(펄스들 사이에 100 ns로 분리됨)이 10초에 적용되었다. 도 8a는 칼슘 활성화(Fluo-4 염료 방출, 왼쪽 열) 및 결과적인 세포 수축(DIC, 오른쪽 열)의 시간 경과 기록을 보여주고 있다. 이미지들은 위에서 아래로 0.24초 간격으로 촬영되었다. 동일한 실험에서 촬영한 다음 이미지들(최대 48초, 나타내지 않음)은 추가적인 변화를 드러내지 않았다. 버스트 파라미터들과 버스트 전달의 시작(화살표)이 표시되어 있다.
도 8b는 낮은 전기장(예를 들어, 150 V/cm) 및 메가헤르츠 주파수(예를 들어, 3.33MHz)의 나노초 전기 펄스들을 적용함에 따른 비가역적 세포 손상(예를 들어, 세포의 천공, 세포 사멸 야기)의 예를 예시한다. 도 8b에서, 나노초 전기 펄스들의 열이 마우스 심실 세포에 적용되었는데; 200 ns 펄스들의 펄스 열이 10초 시점에서 3.33 MHz(펄스들 사이에 100 ns로 분리됨)로 적용되었다. 도 8b는 더 높은 진폭 버스트로 인한 비가역적 세포막 손상 및 세포 재형성의 선택된 시간 경과를 보여주고 있다. 각 쌍의 이미지가 촬영된 시간은 도면의 오른쪽에 표시되어 있다.
도 9는 160 내지 340 V/cm인 1000 나노초 펄스(예를 들어, 3.33 MHz, 200 ns 폭)의 버스트에 의한 심실 심근 세포의 반복된 여기의 효과를 예시한다. 여기는 수직선으로 표시된 시간에 적용되었다. 여기는 세포질 칼슘 농도에 있어서의 스파이크 파형을 초래했고, 이는 Fluo-4 염료를 사용하여 이미지화되었다. 여기의 제1 역치는 160 V/cm에 달하였고, 그 결과로 비파괴적인 칼슘 유입이 발생했다. 400 V/cm 초과에서 세포 파괴가 발생했다. 100 V/cm에서의 동일한 버스트들은 아무런 효과도 일으키지 않은 반면에, 400 V/cm에서의 여기에 뒤이어서는 연장된 Ca2+ 증가가 일어났다(세포막에 대한 전기 천공 손상의 징후).
도 10은 도 9에 도시된 것과 유사한 심실 심근 세포의 반복된 여기를 보여주는 또 다른 예이다. 여기의 역치들은 약간씩 다르지만 유사한 효과가 관찰된다.
도 11a는 1000 나노초 펄스들(3.33 MHz, 200 ns 폭의 펄스들)의 열(예를 들어, 버스트)에 노출된 쥣과 동물(murine)의 심실 심근 세포에서의 여기, 가능한 전기 천공, 및 확실한 전기 천공에 대한 역치 전기장을 보여주는 막대 그래프이다. 여기는 Fluo-4 염료로 이미지화된 바와 같이 세포질 Ca2+ 농도에 있어서의 단시간 스파이크에 의해 입증되었다. 자극에 뒤이은 낮은 진폭의 자발적 Ca2+ 변동의 출현은 전기 천공성 막 파괴의 가능한 징후("전기 천공일 수 있음")로 간주되었다. 관찰 40초 이내에 휴지 수준으로 돌아가지 않는 제어되지 않은 Ca2+ 증가(예컨대, 도 9의 하단 트레이스도)는 전기 천공의 증거로 간주되었다.
도 11b 내지 도 11e는 FluoVolt 염료로 측정된, 단리된 심실 심근 세포(VCM)에 대한 활동 전위 역치를 예시한다. 도 11b는 100 ns 펄스들의 버스트, 200 ns 펄스들의 버스트, 또는 400 ns 펄스들의 버스트 - 이들은 모두 100 ns 간격을 가짐 - 에 있어서의 펄스 수의 효과를 보여주는 그래프로서, 펄스 수를 증가시키면 모든 지속 시간 동안 역치가 유사하게 감소함을 보여주고 있다. 도 11c는 총 "온" 시간에 대해 그래프화된 역치들은 펄스 지속 시간에 의존하지 않았음을 보여주는 그래프이다. 도 11d는 시간 평균 전기장이 더 낮은, 더 짧은 고주파수 마이크로초 미만 저전기장 펄스 여기 VCM의 버스트들을 보여주는 그래프이다. 도 11b 내지 도 11d 모두에 있어서, 평균 ± s.e., n=6-10.
도 11e는 1000 펄스들의 버스트, 지속 시간 50 내지 600 ns인 경우에 도 11d와 동일한 결과를 보여주는 그래프이다. 펄스간 간격은 0.09에서 4.8 μs까지로 다양했다. 평균 ± s.e., n=25-30.
도 12a는 2 MHz의 나노초 펄스들의 열(이 예에서 나노초 펄스는 580 V/cm에서 지속 시간이 300 ns임)을 CHO 세포에 적용한 효과를 요약한 그래프이다. 검사한 8개 세포 모두의 평균 값을 보여주는, 오차 막대를 포함한 선이 포함되어 있다. 도 12a는 300 ns 펄스들의 압축된 열(예를 들어, 버스트)에 의한 CHO 세포의 전기 천공을 보여주고 있으며, 특히 버스트(화살표) 이후의 대표적인 8개 CHO 세포 그룹에서의 세포질 Ca2+ 반응의 시간 경과를 보여주고 있다. 검은 색 실선은 개별 세포들로부터 나온 데이터이고, 이 있는 곡선은 평균값 +/- s.e이다.
도 12b는 도 12a에 도시된 것과 동일한 데이터에 기초한 나노초 펄스들을 적용한 이후의 시간에 따른 CHO 세포의 전기 천공을 예시하고 있다(왼쪽은 DIC 이미지, 오른쪽은 Fluo-4 방출). 이 도면은 표시된 시점에서의 동일한 세포의 대표적인 DIC 이미지(왼쪽)와 Fluo-4 방출 이미지(오른쪽)를 보여주고 있다.
도 13은 쌍극 상쇄를 예시하고 있다. 도 13(아래쪽 도면)은 CHO 세포에서의 쌍극 및 단극 나노초 펄스에 의한 Ca²⁺ 활성화를 보여주고 있다(평균 +/- s.e., n=20-28). 도 13의 위쪽 도면은 쌍극 및 단극상 펄스의 형태 및 진폭을 보여주고 있다.
도 14a는 편위 및 중첩되는 쌍극 나노초 펄스 열들(예를 들어, 버스트들)의 메가헤르츠 압축을 예시하는 것으로, 이는 고주파수(예를 들어, 메가헤르츠)의 두 개의 쌍극 나노초 펄스 열들을 고주파수(예를 들어, 메가헤르츠)의 단극 전기 나노초 펄스 트레인으로 중첩시킴으로써 원격 자극을 제공할 수 있다. 직사각형 열의 쌍극 펄스들 및 자극 전극들의 선형 어레이에 대한 접근법이 예시되어 있다. 두 쌍의 독립적인 접지 절연 전극(a-a' 및 b-b')은 오른쪽에 표시된 것처럼 두 개의 동기화된 나노 쌍극 전기 펄스 열을 전달한다. 나노초 쌍극 펄스들 각각은 적어도 부분적인 쌍극 상쇄로 인해 전기 자극에 본질적으로 효과가 없지만, 중첩 표적 영역(c-c')에서의 펄스들의 중첩은 도시된 바와 같이 a-a'과 b-b' 사이에서 펄스 열의 주파수를 조정함으로써 국소적으로 생물학적으로 효과적인 고주파수(예를 들어, 메가헤르츠 반복률)의 나노초 단극 펄스 열을 형성한다. c-c' 영역에서의 단극 나노초 펄스 열의 형성은 전극 a-a'과 전극 b-b' 사이에 적용되는 에너지의 타이밍과 진폭을 제어함으로써 달성될 수 있다. 쌍극 상쇄는 전극 근처에서 펄스화 전기장의 영향을 감소시킬 수 있으므로 전극에 또는 전극 근처에 관련되지만, 원격 표적 영역에서, 단극 전기장은 중첩 표적 영역에서 매우 빠른(예를 들어, 메가헤르츠) 펄싱을 사용할 때에는 전하 축적으로 인한 역치 감소에 이로울 수 있다는 것을 주지해야 한다.
도 14b는 도 14a와 유사하지만, 표적 영역 c-c'에서 결합되는 펄스 열들(예를 들어, 마이크로초 미만 펄스 열들)의 사용을 예시하고 있다.
도 15a는 일 실시형태에 따른 CANCAN 개념을 예시하는 개략도를 보여주고 있다. 위쪽 도면: A-A'과 B-B'은 두 개의 독립적인 전극 쌍이다. A와 B 사이의 선은 C-C' 영역에서 서로 중첩되며 무효화시키는 각 쌍의 전극으로부터 전기장이 가해지는 영역을 나타낸다. 아래쪽 도면: 각 전극 쌍은 본질적으로 생물학적으로 효과가 없는 감쇠 사인파(DSW)를 전달한다. B-B'으로부터의 DSW가 위상 변위되면, 두 DSW는 C-C'영역에서 생물학적으로 효과적인 단극 펄스로 중첩된다. 이 영역에는 "상쇄의 상쇄" 또는 CANCAN이 있다.
도 15b는 도 15a와 유사하지만, 표적 영역 c-c'에서 결합되는 펄스 열들(예를 들어, 마이크로초 미만 펄스 열들)의 사용을 예시하고 있다.
도 16a는 60% 듀티 사이클에서 적용된 펄스화 전기 에너지의 예를 보여주고 있다.
도 16b는 340 ns 펄스들의 버스트에 의한 여기 역치에 대한 펄스 반복률, 즉 5 또는 100 펄스/버스트의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 16c는 표시된 마이크로초 미만 펄스 지속 시간 (11-18 ns는 이 예에서 가장 짧은 설정에 있어서의 지속 시간 범위임)과 무관하게 버스트 지속 시간에 따라 역치 시간-평균 전기장이 감소하는 것을 나타내는 그래프이다.
도 16d는 표시된 지속 시간의 단일 펄스에 있어서의 여기 역치와 고주파수 마이크로초 미만 저전기장 버스트에 있어서의 여기 역치의 비교를 보여주는 막대 차트이다. 도 16b 내지 도 16d에서, 평균 ± s.e., n = 5-9이고, 데이터는 단리된 개구리 좌골 신경을 사용하여 수집된 것이다.
도 17a 내지 도 17f는 Ca²⁺ 흡수 또는 YO-PRO-1 염료 흡수에 의해 입증된 고주파수 마이크로초 미만 저전기장 버스트에 의한 CHO 세포 및 HEK 세포의 전기 천공의 한 예를 예시하고 있다. 도 17a는 (CHO 세포에서) 100 펄스, 400 ns 버스트가 0.1 내지 0.3 MHz 이상에서 점점 더 효과적이게 되는 것을 보여주는 그래프이다. 라벨은 kV/cm 단위의 전기장을 나타내며, 데이터 포인트 당 세포는 20 내지 30개이다. 도 17b는 표시된 듀티 사이클에서 1000개의 500 ns, 0.64 kV/cm 펄스(화살표)에 의해 유발된 YO-PRO-1 흡수(HEK 세포에서)의 시간 경과를 보여주는 그래프이다. 도 17c는 반복률에 대해 그래프화된 도 17b의 마지막 데이터 포인트를 보여주는 그래프로서, 1 MHz 미만에서 효과가 없음을 보여주고 있다. 도 17d는 HEK 세포에서 동일한 버스트(화살표)에 의해 유발된 Ca²⁺ 과도 현상을 보여주는 그래프이다. 도 17e는 표시된 전기장의 하나의 500 μs 펄스에 의해 유발된 유사한 Ca²⁺ 과도 현상을 보여주는 그래프이다. 도 17f는 단일 500 μs 펄스에 있어서의 전기장(및 고주파수 마이크로초 미만 저전기장 버스트에 있어서의 듀티 사이클)에 대해 그래프화된 도 17d 및 도 17e의 그래프로부터의 Ca²⁺ 과도 현상의 최대 진폭을 보여주고 있다. 모든 패널에 있어서, 평균 ± s.e., n=11-27. HEK 세포들을 낮은 전도도 용액에서 자극하였다.
도 18a 내지 도 18d는 고주파수 마이크로초 미만 저전기장 버스트에 노출된 후 24시간 동안 EL-4 세포의 생존력을 예시하는 그래프이다. 도 18a는 전기 천공 큐벳에 전달되는 고주파수 마이크로초 미만 저전기장 펄스의 형태를 예시하고 있다. 파선은 시간 평균 진폭을 나타낸다. 도 18b는 약 1.9 kV/cm의 저전기장에서의 100 Hz 버스트 및 3 MHz 버스트에 있어서의 펄스 수의 효과를 예시하고 있다. 도 18c는 5 kV/cm의 고전기장에서의 동일한 의존성을 보여주는 그래프이다. 도 18d는, 표시된 파라미터에서의 고주파수 마이크로초 미만 저전기장 버스트는 세포들 중 약 50%를 죽이는 반면에 단일 펄스(지속 시간은 버스트 지속 시간과 같고 진폭은 버스트의 평균과 같음)는 그보다 효과가 적다는 것을 예시하는 막대 차트이다. 평균 ± s.e., n=5-6. * p <0.0001, t-검정.

주파수가 0.1 메가헤르츠(MHz) 이상인, 마이크로초 미만(예를 들어, 나노초) 범위의 전기 펄스들을 사용하여 하나 이상의 바람직한 생물학적 및/또는 생리적 효과를 일으킬 수 있는 방법 및 장치(시스템, 장치 등)가 본원에 기술되는 바, 이는 다른 기술에 비해 상당히 낮은 전기장을 사용할 수 있게 한다. 편의상, 본 개시내용에 따른 이러한 전기 펄싱은 메가헤르츠 압축, 나노초 펄스의 메가헤르츠 압축, 또는 나노초 펄스 열들(예를 들어, 버스트들)의 메가헤르츠 압축으로 지칭될 수 있다. 일반적으로 매우 짧은 고강도 펄스(예를 들어, 일반적으로 1 kV/cm보다 훨씬 큰 고전기장)를 지칭하는 전통적인 나노초 펄스화 전기장 처리와 달리, 나노초 펄스들의 메가헤르츠 압축은 훨씬 낮은 강도를, 예를 들어 5배 내지 10배 이상으로 줄어든 강도를, 사용할 수 있다. 예를 들어, 나노초 펄스들의 메가헤르츠 압축은 1 kV/cm 미만(예를 들어, 900 V/cm 미만, 800 V/cm 미만, 750 V/cm 미만, 700 V/cm 미만, 600 V/cm 미만, 500 V/cm 미만 등)의 매우 낮은 전기장 값을 (예를 들어, 표적 부위에) 사용할 수 있는데, 이는, 예를 들어 메가헤르츠(MHz) 범위와 같은, 매우 빠른 반복률의 나노초 전기 펄스를 적용함으로써 가능해진다. 메가헤르츠 범위는 0.1 MHz 이상(예를 들어, 0.2 MHz 이상, 0.4 MHz 이상, 0.5 MHz 이상, 0.7 MHz 이상, 1 MHz 이상 등)을 포함할 수 있다. 놀랍게도, 본원에 기술된 장치 및 방법은 매우 낮은 전기장 값에서, 특히 이전에는 효과가 없다고 믿었던 전기장 값에서 생물학적 효과가 유발되도록 하는 나노초 전기 펄스의 생물학적 효과를 일으키는 것으로 밝혀졌다. 본원에 기술된 장치는 메가헤르츠 범위의, 예를 들면 일반적으로 1 마이크로초 이하인 순차적인 나노초 전기 펄스들 사이에 간격(예를 들어, 약 900 ns 미만, 약 800 ns 미만, 약 700 ns 미만, 약 600 ns 미만, 약 500 ns 미만, 450 ns 미만, 400 ns 미만, 350 ns 미만, 미만 300 ns 등)을 갖는, 저진폭 나노초 전기 펄스들의 펄스 열들(예를 들어, 버스트들)을 전달하도록 특정적으로 구성된다.

위에서 언급한 바와 같이, 전통적인 고강도 마이크로초 미만 펄싱은 짧은 펄스 지속 시간 동안(예를 들어, 마이크로초 미만 펄스 발생 적용 시) 전기장(EF) 역치를 초과하도록 하기 위해서 높은 펄스 전압으로 제한되었었다. 이 역치는 펄스가 짧아짐에 따라 최대 수십 kV/cm까지 증가한다. 나노초 범위 내의 신경 자극에 대한 강도-지속 시간 곡선은 일반적으로 100 ns 펄스 및 1 ns 펄스에 대해 각각 약 1 내지 240 kV/cm의 역치를 필요로 한다. 예를 들어, 단일 고강도 마이크로초 미만 펄스화 전기장 자극에 대한 보고된 역치에는 1.4 내지 2.4 kV/cm(예를 들어, 200 ns 펄스에 의해 심근 세포를 활성화하는 경우), 1.8 kV/cm 초과(예를 들어, 300 ns 펄스를 사용하여 HEK293 세포에서 칼슘 과도 현상을 유도하는 경우), 6 kV/cm 내지 1 kV/cm(예를 들어, 60 ns 펄스 및 600 ns 펄스에 의한 CHO 세포의 투과화의 경우)가 포함된다. 따라서, 이러한 역치에 도달하는 데 필요한 펄스 전압은 금지 수준까지로 높다고 오랫동안 믿어 왔다. 예를 들어, 2 cm 간격이 있는 두 개의 평행 판 전극들 사이에서 종양을 절제하기 위해 10 kV/cm를 달성하는 데에는 일반적으로 전극에 20 kV를 인가해야 한다. 이러한 전압은 대부분의 펄스 발생기의 성능을 넘어선 것이며, 고전압 위험을 야기시킬 수 있다. 본원에 기술된 방법 및 장치는 이러한 문제점들을 피할 수 있다.

예를 들어, 본원에 기술된 장치 및 방법은 필적하는 효과 또는 우수한 효과를 제공하면서도 더 낮은 전기장 강도를 사용할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 방법 및 장치는, 다양한 세포 및 조직 유형의 비화학적 활성화를 유발하고 그리고 더 높은 용량에서는 괴사 및/또는 세포 사멸 경로에 의한 고도로 선택적인 세포 사멸을 제공하는 데 있어서는, 예를 들어 이온 선택성 나노포어 활성화를 포함한 신경근 자극(예를 들어, 흥분성 및 비흥분성 세포 모두에서 세포질 Ca2+의 가동화, 및 세포막에서 내부 정류 및 이온 선택 안정 나노포어 개방)을 위해서는, 고강도 마이크로초 미만 펄스화 전기장이 효과적으로 사용된다고 이전에 밝혀져 있는 경우에서 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 방법 및 장치는 또한 제세동, 말초 신경 및 심부 뇌 자극, 및 조직 또는 세포 절제(예를 들어, 암 절제)에도 사용될 수 있다.

다중 자극을 전달하게 되면, 표적 세포의 막에 전압이 단계적으로 축적되어, 결국에는 펄스간 간격이 유도된 막 통과 전위의 이완보다 짧을 때에 여기 또는 전기 천공 역치에 도달하게 되는 결과로 이어질 수 있다. 포유류 세포의 충전 시간 상수는 전형적으로 0.1 내지 1 μs이다. 시간적 합치기는 3 내지 5 시간 상수(순차적 펄스들 간의 95% 및 99% 방전에 해당)보다 작은 펄스간 간격에서만 예상할 수 있으며, 이는 수십 kHz에서 1 MHz 초과의 반복률로 변환된다. 본원에 설명된 바와 같이, 다수의 마이크로초 미만 펄스화 전기 에너지를 1 Hz 내지 5 kHz의 반복률로 전달하는 것은 단일 펄스보다 더 강한 효과를 일으킬 수 있지만, 역치를 감소시키지 않거나 역치를 적당히 감소시킨다.

예를 들어, 본원에서는 예를 들어 10 내지 150 V/cm의 전기장 수준에서 여기 및 전기 천공을 촉진하는 마이크로초 미만 전기 펄스 버스트의 MHz 압축이 설명된다. 설명된 바와 같이, 효율은 펄스 및 버스트 파라미터에 따라 달라질 수 있으며, 이는 전통적인 ("긴") 마이크로초 미만 전기 자극과도 다르다.

도 1은 낮은 전압(또는 V/cm 단위의 낮은 전기 밀도) 및 높은 주파수, 예를 들어 메가헤르츠 주파수로 적용되는 나노초 펄스 열(예를 들어, 나노초 전기 펄스 열)의 한 예를 예시하고 있다. 도 1에서, 펄스 열은 각각 나노초 범위(108) 내의 지속 시간(예를 들어, 약 0.1 ns 지속 시간 내지 1000 ns, 예를 들어 약 0.1 ns 내지 약 950 ns, 약 1 ns 내지 약 900 ns, 약 1 ns 내지 약 800 ns, 약 1 ns 내지 약 750 ns, 약 1ns 내지 약 700 ns, 약 1 ns 내지 약 600 ns, 약 1000 ns 미만, 약 900 ns 미만, 약 800 ns 미만, 약 750 ns 미만, 약 600 ns 미만, 미만 약 500 ns 미만 등)을 갖는 복수의 나노초 펄스(101)를 포함할 수 있다. 나노초 펄스들은 약 1000 ns 미만, 약 900 ns 미만, 약 800 ns 미만, 약 750 ns 미만, 약 700 ns 미만, 약 600 ns 미만, 약 500 ns 미만 등의 펄스 간격(106)에 의해 분리될 수 있다. 따라서, 나노초 전기 펄스의 주파수는 메가헤르츠 범위에, 예컨대 약 0.1 MHz 내지 약 50 MHz, 약 0.1 MHz 내지 약 40 MHz, 약 0.1 MHz 내지 약 30 MHz, 약 0.1 MHz 내지 약 25 MHz, 약 0.1 MHz 내지 약 20 MHz, 약 1 MHz 내지 약 50 MHz, 약 1 MHz 내지 약 40 MHz, 약 1 MHz 내지 약 30 MHz, 약 1 MHz 내지 약 25 MHz, 약 1 MHz 내지 약 20 MHz, 0.1 MHz 초과, 0.2 MHz 초과, 0.5 MHz 초과, 0.1 MHz 초과, 1.5 MHz 초과, 2 MHz 초과, 2.5 MHz 초과 등의 범위에 있을 수 있다.

도 1에 나타낸 것과 같은 펄스 열의 나노초 펄스들에 의해 가해지는 에너지는 비교적 낮을 수 있다. 예를 들어, 각 나노초 펄스에 의해 인가되는 피크 전압은 약 500 V 미만, 약 100 V 미만, 약 50 V 미만, 약 40 V 미만, 약 30 V 미만, 약 25 V 미만, 약 20 V 미만, 약 0.5 V 내지 50 V, 약 1 V 내지 25 V 등일 수 있다. 유사하게, (예를 들어, 조직에서의) 적용된 나노초 펄스의 결과적인 전기장은 예를 들어 약 1000 V/cm 미만, 약 900 V/cm 미만, 약 800 V/cm 미만, 약 700 V/cm 미만, 약 600 V/cm 미만, 약 550 V/cm 미만, 약 1 V/cm 내지 약 1000 V/cm, 약 10 V/cm 내지 900 V/cm 등일 수 있다.

일반적으로, 나노초 펄스들의 메가헤르츠 압축은 생물학적 세포 및/또는 조직에 직접 또는 간접적으로 적용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 적용은 하나 이상의 조직 관통 전극 및/또는 표면 전극을 통해 환자의 신체 안으로 행해질 수 있다. 일부 변형 예에서, 나노초 펄스들의 메가헤르츠 압축을 사용하는 전기 자극은 단리된 세포 및/또는 단리된 조직에 적용될 수 있다.

특정 작용 이론에 구속되지 않고 설명하면, 나노초 펄스들의 메가헤르츠 압축을 사용하는 나노초 펄스의 적용은 적용된 전기 에너지가 표적 세포 또는 세포 영역에 축적되게 하여, 다수의 작은 진폭(예를 들어, 약 500 V 미만, 약 100 V 미만, 약 50 V 미만, 약 40 V 미만, 약 30 V 미만, 약 20 V 미만, 약 0.1 V 내지 50 V, 약 1 V 내지 30 V, 약 1 V 내지 20 V 등)의 펄스들을, 생물학적 효과에 대한 역치를 초과하는 수준까지 합할 수 있게 한다. 예를 들어, 살아 있는 세포의 유효 방전 시간보다 짧은 주파수로 메가헤르츠 범위에서 적용되는 나노초 전기 펄스들은 원하는 효과를 위한 역치를 초과한, 전하의 합치기가 이루어지게 할 수 있다. 여러 포유류 세포에 있어서, 세포(예를 들어, 세포막)의 방전 시간 상수(τ)는 일반적으로 작은 세포의 경우 약 100 ns에서부터 큰 세포의 경우 약 1 마이크로초까지(조직 내에 밀집되게 채워져 있는 세포의 경우에는 더 길 수 있음) 다양하고, 따라서 유도된 막 전위는 방전 지속 시간이 1τ, 2τ, 3τ, 및 4τ일 때 각각 약 37%, 15%, 5%, 및 2%로 감소한다. 나노초 전기 펄스가 방전 속도보다 빠른 속도로 펄스 열에 적용될 때에는(예를 들어, 막이 완전히 방전되지 않은 경우) 유도 전위가 나머지 전위에 추가되는 것이 가능할 수 있다. 다수의 펄스들 모두가 충분히 짧은 펄스간 간격으로 적용되는 상태에서는, 유도된 막 전위가 점차 올라가서 역치 전위를 초과하게 되어 생물학적 효과가 유도될 수 있다. 예를 들어, 도 2a 내지 도 2c 참조. 예를 들어, 4τ가 유도 전위의 시간적 합치기를 가능하게 하는, 펄스들 사이의 가장 긴 시간 간격이라고 가정하면, 펄스간 간격은 작은 세포의 경우는 400 ns를, 큰 세포의 경우는 2,500 ns를 초과할 수 없다(아마도 불규칙한 모양의 더 큰 세포의 경우에는 최대 10,000일 것이다). 짧은 펄스간 간격은 역치 막 통과 전위가 더 빨리 축적되게 할 수 있다. 실제로, 이것은, 나노초 전기 펄스 열이 0.1 내지 2 MHz의 높은 반복률로 자극을 전달하도록 압축될 수 있으며 이 때 더 짧은 나노초 전기 펄스 및 더 작은 세포에 대한 진폭 역치를 더 줄이는 데 있어서는 더 높은 반복률(최대 1,000 MHz)이 유용하다는 것을 의미한다.

도 2a의 예에서, 나노초 펄스들이 10 kHz의 주파수(예를 들어, 각 펄스 사이가 약 100 μs로 분리됨)의 펄스 열에서 세포 또는 조직으로 적용된다. 아래쪽 트레이스도에 표시된 바와 같이 개별 펄스는 지속 시간이 10 ns이다. 위쪽 트레이스도는 각 펄스에서 발생하는 부과된 멤브레인 전위(임의 단위)를 보여주고 있다. 이 예시적인 조직 또는 세포의 경우에서, 방전 시간은 약 8 μs이다. 수평 파선(203)은 막(외부 세포막 및/또는 하나 이상의 내부 세포막을 포함할 수 있음)의 전위가 역치에 도달할 때에 트리거될 수 있는 생물학적 효과(예를 들어, 자극, 천공(portion) 등)를 위한 최소 역치를 나타낸다. 조직 또는 세포는 각기 다르거나 증가하는 효과들에 해당하는 다수의 역치를 가질 수 있다.

도 2b 및 도 2c는 나노초 펄스 버스트들의 메가헤르츠 압축을 예시하는 것으로서, 메가헤르츠 압축은 펄스 진폭을 증가시키지 않아도 세포 또는 조직이 생물학적 효과를 위한 하나 이상의 역치에 도달하여 초과할 수 있게 한다는 것을 보여주고 있다. 예를 들어, 도 2b에서, 각각의 100 ns 펄스(아래쪽 트레이스도)는 막 통과 전위(위쪽 트레이스도, 임의 단위)를 유도한다. 에너지는 펄스간 간격만큼 빠르게 방전되지 않기 때문에, 나노초 펄스들의 지속적인 적용으로 인해 부과된 막 전위가 도시된 바와 같이 역치(203)를 초과하게 될 때까지 축적되고, 그 결과 해당하는 생물학적 효과를 일으킬 수 있다. 도 2b에서, 약간 높은 반복률(예를 들어, 각 펄스 사이가 약 5 us인 100 ns 펄스들)은 일부 생물학적 효과를 유도할 수 있는 낮은 역치(203)에 도달하는 것을 돕는 부수적인 시간적 합치기가 이루어지게 한다. 도 2c에서, 높은 반복률(예를 들어, 펄스 사이가 1 us인 1 MHz)이 적용될 때, 부과된 막 전위는 더 빨리 축적되어 훨씬 더 높은 역치(205)에 도달할 수 있다.

나노초 펄스들의 메가헤르츠 압축을 적용하기 위한 시스템

도 3 내지 도 5는 나노초 펄스들의 메가헤르츠 압축을 제공하는 데 사용될 수 있는 시스템의 예들을 예시하고 있다. 예를 들어, 도 3은 나노초 펄스들의 메가헤르츠 압축을 사용하여 나노초 펄싱을 적용하기 위한 시스템(301)의 한 예의 개략도이다. 도 3에 도시된 바와 같이, 시스템은 적어도 하나의 제어기(303), 하나 이상의 펄스 발생기(305), 전원 공급 장치, 및 하나 이상의 어플리케이터(309)를 포함할 수 있다. 이 시스템은 휴대용일 수 있고, 전원은 배터리 및/또는 벽면 전원(예를 들어, 콘센트)로부터 전력을 받는 전력 조절 회로를 포함할 수 있다. 배터리는 충전식일 수 있다. 시스템은 적어도 부분적으로 밀폐될 수 있다. 일부 변형 예에서, 어플리케이터는 하나 이상의 케이블을 통해 연결될 수 있다. 대안적으로, 어플리케이터는 시스템의 나머지 부분과 컴팩트한 휴대용 구성으로 통합될 수 있다.

제어기는 주파수가 메가헤르츠 범위(예를 들어, 약 0.9 MHz 내지 100 MHz)에 있도록 개별 펄스들이 고정 또는 조정 가능한 펄스간 간격으로 분리되는, 고정 또는 조정 가능한 나노초 펄스 열을 적용하도록 구성될 수 있다. 펄스간 간격은 예를 들어 1200 ns 내지 50 ns(예를 들어, 메가헤르츠 주파수 범위 내)일 수 있고, 예컨대 약 1000 ns 내지 50 ns, 약 1000 ns 내지 75 ns, 약 1000 ns 내지 80 ns, 약 1000 ns 내지 90 ns, 약 1000 ns 내지 100 ns 등일 수 있다. 일부 변형 예에서, 제어기는 적용되는 자극을 이 주파수 범위 내로 제한하도록 구성 또는 개조되고, 일부 변형 예에서, 장치는 사용자가 적용되는 주파수/펄스간 간격을 이 메가헤르츠 범위 내에서 조정할 수 있도록 하기 위해 제어기와 통신하는 하나 이상의 사용자 입력 장치(노브, 다이얼, 터치스크린 등)를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 제어기는 사용자가 펄스의 수, 펄스가 적용되는 지속 시간, 및/또는 인가되는 전압을 조정할 수 있게 구성될 수 있다. 인가되는 전압은 일반적으로 사전에 결정된 범위(예를 들어, 약 0.1 V 내지 약 50 V, 약 0.1 V 내지 40 V, 약 0.5 V 내지 30 V, 약 1 V 내지 약 20 V, 약 50 V 미만, 약 40 V 미만, 약 30 V 미만, 약 25 V 미만, 약 20 V 미만 등의 전압 진폭) 이내 일 수 있다. 일부 변형 예에서, 전기장의 강도가 선택될 수 있다(예를 들어, 약 1 V/cm 내지 약 900 v/cm, 약 1 V/cm 내지 약 800 v/cm, 약 10 V/cm 내지 약 750 v/cm, 약 10 v/cm 내지 약 700 v/cm, 약 50 v/cm 내지 약 650 v/cm, 1000 v/cm 미만, 900 v/cm 미만, 800 v/cm 미만, 750 v/cm 미만, 700 v/cm 미만, 600 v/cm 미만, 500 v/cm 미만 등). 이러한 범위는 저전압 범위 내에서 고려될 수 있다. 언급된 바와 같이, 일부 변형 예에서, 제어기는 사용자(예를 들어, 의사, 외과의, 전문가 등)가 여기에 설명된 범위들 중 임의의 범위를 포함한 사전에 결정된 값 또는 범위의 세트로부터 선택하게 할 수 있다. 일부 변형 예에서, 사용자는 펄스 수, 펄스 지속 시간(나노초 범위 내), 펄스 진폭(예를 들어, 사전에 결정된 저전압 범위 내의 피크 전압), 펄스간 간격, 및/또는 주파수(예를 들어, 메가헤르츠 범위 내) 등 중에서 하나 이상에 대한 사전 설정 값을 제공받을 수 있다. 일부 변형 예에서, 장치는 적절한 파라미터를 사전에 설정할 수 있거나 자동으로 선택할 수 있고, 사용자는 시작 또는 중지만을 선택할 수 있거나 제한된 수의 파라미터 상태들 중에서 선택할 수 있다.

제어기는 시스템의 작동을 제어하고/하거나 사용자로부터 제어 입력을 수신할 수 있도록 하는 하드웨어, 소프트웨어, 및/또는 펌웨어를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제어기는 하나 이상의 프로세서, 하나 이상의 타이밍 회로, 하나 이상의 메모리 등을 포함하는 회로를 포함할 수 있다. 언급된 바와 같이, 시스템은 하나 이상의 입력 장치(예를 들어, 제어 장치)을 포함할 수 있고/있거나, 다른 기기로부터 (예를 들어, 유선 또는 무선 연결을 통해) 입력을 수신할 수 있다. 시스템은 기기 작동(예를 들어, 준비, 대기 등) 및/또는 설정(펄스 수, 주파수, 전압 진폭 등) 표시기들을 포함하는 하나 이상의 출력 장치(예를 들어, 모니터, 디스플레이, LED 등)을 포함할 수 있다.

언급된 바와 같이, 본원에 기술된 시스템들 중 임의의 시스템은 하나 이상의 어플리케이터를 포함할 수 있다. 어플리케이터는 전극 어레이를 포함하여 2개 이상의 전극을 포함할 수 있다. 전극은 조직 침습형 또는 조직 비침습형일 수 있다. 예를 들어, 조직 침습형 전극은 바늘 전극일 수 있고; 조직 비침습형은 표면 전극 또는 전극들일 수 있다.

본원에 기술된 장치들 중 임의의 장치에서, 제어기는 도 3에 도시된 바와 같이 하나 이상의(예를 들어, 복수의) 펄스 발생기의 작동을 조화되게 조정할 수 있다. n개의 펄스 발생기들 각각은 조화되게 조정된 시간에 나노초 펄스들을 적용하도록 구성될 수 있으며, 이러한 펄스들은 단일 자극으로 결합될 수 있다. 개별 펄스 발생기들은 전술한 바와 같이 저전압 범위 내의 피크 전압에서 나노초 범위(예를 들어, 약 0.1 ns 내지 약 1000 ns)의 펄스 지속 시간을 갖는 펄스를 전달하도록 구성될 수 있다. 도 3은 복수의 펄스 발생기를 예시하고 있지만, 다양한 응용에서 오직 하나의 펄스 발생기가 사용될 수 있음을 이해해야 한다.

예를 들어, 도 4a는 사용될 수 있는 펄스 발생기 회로의 예를 개략적으로 예시하고 있다. 도 4a에서, 회로(400)는 N-타입(n-채널) MOSFET 스위치 (M1)에 의해 절환되는 프리차지 커패시터(pre-charged capacitor)(C1)를 포함한다. 스위치는 하나 이상의 저전압 MOSFET 드라이버에 의해 트리거될 수 있다. 이 예에서, 전압을 클램핑하기 위해 제너 다이오드(403)가 변압기 출력부에 배치될 수 있다. 출력 전압을 (예를 들어, 위에서 설명한 저전압 범위 내로) 설정할 수 있다. 설정은 초고속 펄싱에 유리한 임계 감쇠 모드를 생성하는, R, L, C, 및 값을 선택하여 수정할 수 있다.

도 4b에 예시된 바와 같이, 일부 실시형태에서, 도 4a에 개략적으로 도시된 펄스 발생기 회로와 같은 복수의 펄스 발생기 회로들이 함께 결합되어서 위에서 언급한 바와 같이 제어기에 의해 제어될 수 있다. 도 4b에서, 각 블록(1, 2, 3, 4)은 펄스 발생기를 나타내는 것으로서, 이 펄스 발생기는 제어기에 의해 제어될 수 있으며, 전기장이 낮으며(예를 들어, 저전압 범위) 펄싱 주파수가 메가헤르츠 이내인 펄스들의 복합/결합된 나노초 펄스 열을 형성하는 데 사용될 수 있다. 도 4b에서, 단일 펄스 발생기는 고주파수(예를 들어, 다중 MHz 범위 내)의 나노초 지속 시간 펄스들을 생성할 필요가 없고, 대신에 펄스 발생기들 중 여러 개를 그룹화하여 펄스를 생성한다. 펄스 영역에서 비교적 낮은 전압(예를 들어, 위에서 설명한 저전압 범위를 포함하여, 1 kV 미만)을 사용할 때, RC 스위치 모듈들을 측면에 결합시켜서 임의의 진폭, 폭, 및 간격의 다중 위상 펄스를 생성할 수 있다. 각 모듈은 상이한 DC 전원으로 충전될 수 있고, 그에 따라 상이한 출력 전압을 제공하게 된다. 다양한 펄스 폭(PW) 및 지연이 이루어질 수 있게, 각 모듈은 개별적으로 트리거될 수 있다. 대안적으로, 모듈들 중 전부 또는 일부는 위에서 설명한 바와 같이 결합될 수 있는 동일한 펄스들을 생성할 수 있다. 도 4c는 도 4b에 도시된 바와 같이 4개의 별개이지만 연결된 펄스 발생기들부터 발생하는 나노초 지속 시간 펄스들의 결합된 열의 일 예를 예시하고 있다. 이 예에서, 펄스들은 비극성(예를 들어, 모두가 양 또는 음으로 진행)이며 등가 펄스로 표시되지만, 언급한 바와 같이, 일부 변형 예에서는, 동일한 펄스 열 내에 상이한 지속 시간 및/또는 상이한 전압을 갖는 펄스들이 적용될 수 있다. 일부 변형 예에서, 아래에서 더 상세히 설명되는 바와 같이, 나노초 지속 시간의 쌍극 펄스들이 메가헤르츠 주파수 범위로 전해질 수 있다.

예를 들어, 도 5는 쌍극 자극을 제공하도록 구성된 펄스 발생기에 대한 개략도의 또 다른 예를 도시한다. 도 5에서, 펄스 발생기(500)는 쌍극 펄스 발생기를 생성하기 위해 양의 펄싱 회로와 음의 펄싱 회로를 결합시킨 것이다. 도 5에서, 음의 펄싱 회로 내의 스위치 연결은 드레인에서 접지로의(그리고 전원에서 음극으로의) 충전인데, 이는 양의 펄싱 회로에 표시된 것과 반대이다. 양의 펄싱 회로와 음의 펄싱 회로 모두에 동일한 부하 저항이 사용될 수 있다. 전압 및 펄스 지속 시간은 다르게 조정될 수 있다. 양의 펄스나 혹은 음의 펄스가 전달되도록 양의 펄싱 회로 또는 음의 펄싱 회로 중 단지 하나만 트리거될 수도 있다. 임의의 길이의 지연이 임의의 간격으로 삽입될 수 있다. 도 5에 도시된 것과 같은 복수의 쌍극 자극기들이 도 4b에 도시된 바와 같이 결합되어서 메가헤르츠 주파수 자극이 이루어지게 할 수 있다. 도 4a 내지 도 5b에 도시된 펄스 발생기는 본원에 기술된 방법을 수행하는 데 사용될 수 있는 펄스 발생기의 단지 비제한적인 예를 나타낸다. 설명된 주파수의 나노초 펄스들의 열을 생성하기 위해 그 밖의 다른 펄스 발생기가 사용되거나 구성될 수 있다.

본원에 기술된 시스템들 중 임의의 시스템은 또한 도 6에 도시된 바와 같이 구성될 수 있는데, 이 경우에서는 하나의 제어기가 (예를 들어, 신체 상의 또는 내부의) 각기 다른 위치에서 나노초 전기 펄스들을 적용하는 데 사용될 수 있는 2개 이상의 펄스 발생기 세트를 제어한다. 도 6에서, 시스템(601)은, 2개(또는 2세트)의 펄스 발생기(605...605' 및 615...615') 각각에서 메가헤르츠 주파수 범위의 저전압의 나노초 펄스들을 적용함에 따른 전기 자극을 제어하고 조화되게 조정하는 하나의 제어기(603)(일부 변형 예에서는 2개 이상의 연결된 제어기일 수 있음)를 포함한다. 쌍극 펄싱과 관련하여 아래에서 더 자세히 설명되는 바와 같이, 이는 전극 인접 영향(near-electrode effect)을 최소로 하는 비침습성 전기 자극이 이루어지게 할 수 있다. 동일한 전원 공급 장치(607) 또는 상이한 전원 공급 장치들이 (예를 들어, 펄스 발생기들에) 전력을 공급하는 데 사용될 수 있다. 나노초 펄스를 적용하기 위한 전극들을 각각 포함하는 하나 이상의 어플리케이터(609, 609')가 사용될 수 있다. 일부 변형 예에서, 기지의 또는 사전에 결정된 거리 및/또는 기하학적 형태에 의해 분리될 수 있는 상이한 전극 세트들을 갖는 단일 어플리케이터가 사용될 수 있다. 도 7에 도시된 예의 한 변형 예에서, 전극들의 끝단 사이를 약 140 um로 하여 약 16 V를 인가하는 펄스는 약 570 V/cm에 상당한다.

저전압 나노초 펄스들이 높은 주파수(예를 들어, 메가헤르츠)로 적용되는 나노초 펄스 버스트들의 메가헤르츠 압축을 적용시킨 것은 효과를 입증하기 위해 시험관내 모델을 사용하여 검사되었다. 예를 들어, 도 7은 시험 장치(700)의 한 가지 배치를 예시하고 있는바, 여기서는 도 5에 도시된 것과 같은 시스템에 결합된 한 쌍의 전극(707, 707')을 통해 고주파수의 저전압 나노초 펄스들을 적용하면서 하나 이상의 배양 또는 이식된 세포를 (예를 들어, 현미경 이미징 시스템(705)에 결합된 레이저(703)를 사용하여) 광학적으로 검사하였다. 메가헤르츠 버스트 압축을 사용하는 것은, 도 7에 도시된 것과 유사한 시스템을 사용하여, 시험관내 여러 유형의 포유류 세포(예를 들어, CHO, HEK 293, 및 효소적으로 단리된 뮤린 일차 심실 심근 세포(VCM: ventricular cardiomyocyte))에서 확인되었다. 나노초 범위의 전기 펄스의 효과는 Fluo-4 형광 표시기를 사용한 세포질 Ca2+ 활성화의 시간 경과 기록 및 세포 모양 변화의 철조법(transillumination) 기록에 의해 증명되었다. 세포 유형 및 기타 조건과, 나노초 범위의 전기 펄스의 강도 여하에 따라, 이러한 관찰은 세포막 투과화, 전압 게이트 칼슘 채널의 개방, 수축 활동, 및/또는 세포 재형성, 또는 막 파괴로 인한 기타 유형의 생물학적 효과를 반영했다.

도 8a 내지 도 8b, 도 9, 도 10, 도 11a, 및 도 12a 내지 도 12b는 예를 들어 펄스 지속 시간이 50 내지 300 ns인 마이크로초 미만(예를 들어, 나노초) 펄스를 주로 200 ns 자극 및 300 ns 자극에 초점을 맞추어서 시험하는 예들을 예시하고 있다. 펄스는 약 150 내지 450 ns의 펄스간 간격에 해당하는 약 1.6 내지 3.33 MHz의 반복률로 100 내지 5,900개 펄스들의 버스트로 전달되었다. 펄스 진폭은 약 2 V에서 17 V까지로 변했으며, 결과적으로 발생하는 전기장은 세포 위치에서 각각 약 70 V에서 570 V/cm까지이다. 26개의 개별 VCM에서 나노초 범위 처리에 있어서의 총 약 200개의 전기 자극 펄스와, 다른 세포 유형(120개 초과의 개별 세포)의 처리에 있어서의 80개 이상의 나노초 펄스가 검사되었다. 극히 낮은(나노초 범위의 펄스화 전기장을 사용하는 표준 처리와 비교할 때임) 펄스 진폭에도 불구하고 세포 반응이 일관되게 기록되었다(도 8a 내지 도 12b에 나타낸 바와 같음). VCM 활성화 및 수축을 일으킨 최저 전기장은 85 V/cm에 불과했다(예를 들어, 도 8a는 펄스 수가 1,000, 펄스 지속 시간이 200 ns, 주파수가 3.33 MHz인 버스트를 보여주고 있다). 이는 200 ns 펄스(단일 200 ns 펄스를 포함)의 경우에 약 2.5 kV/cm의 공표된 역치에 비해 전기장이 30배 넘게 감소한 것이다. 약 160 V/cm인 약간 더 높은 전기장은 18개 VCM 중 17개에서 칼슘 활성화(여기) 및 세포 수축을 일으켰는데, 이러한 VCM들은 시험을 거쳐 기능적으로 입증되었으며 이러한 유형의 반응을 일으킬 수 있는 것이다. 역치는 세포가 전기장에 평행하게, 또는 수직으로, 또는 임의의 다른 각도로 배향되었는지 여부와 관련한 유의적 의존성을 나타내지 않았다. 메가헤르츠 주파수 범위의 나노초 펄스를 사용하는 이러한 낮은 전기장에서, 개별 VCM의 여기는 전기 천공 또는 손상의 징후 없이 여러 번 반복될 수 있었다(예를 들어, 도 8b 참조). 전기장을 여기 역치보다 약 2배 넘게 증가시키게 되면 자연 발생적 불꽃 및 세포질 Ca2+의 휴지 수준 상승과 같은 적당한 막 파괴가 관찰되었다. 전기장을 단지 약 400 +/- 18 V/cm까지만 더 증가시키는 경우, 세포질 Ca2+의 회복이 없는 비가역적인 VCM 전기 천공과, 건강한 "벽돌 모양"에서 "미트볼 모양"으로의 VCM 변형과, 인식되게 표시되는 영구적인 VCM 손상이 야기된다. 예를 들어, 도 8b 및 도 11a와 도 9의 마지막 트레이스도를 참조. 일반적으로, 여기 반응은 0.16 kV/cm에서 3.33 MHz인 400 또는 500개의 펄스들과 같은 더 짧은 펄스 열로도 관찰되었을 뿐만 아니라, 더 짧은 100 ns 펄스(570 V/cm에서 2 MHz인 3900개의 펄스들)에서도 관찰되었다. VCM은 2초마다 적용된 수십 개의 압축된 나노초 전기 펄스 버스트들로 반복적으로 여기되었다(데이터는 표시되지 않음).

도 8a 및 도 8b에 나타낸 바와 같이, 고주파수 마이크로초 미만 저전기장 전기 에너지의 버스트들이 마우스 심실 심근 세포(VCM)의 자극 및/또는 전기 천공에 사용될 수 있다. 일부 변형 예에서, 고주파수 마이크로초 미만 저전기장 자극이 제세동에 사용될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 고전압에 대한 이전의 제한적 필요성은 높은 반복률의 버스트를 적용함으로써 상쇄될 수 있다. 예를 들어, 1000개의 200 ns 펄스들을 3.33 MHz 버스트로 압축하게 되면, 도 8a, 도 9, 및 도 11a에 나타낸 바와 같이, 단일 200 ns 충격보다 10 내지 20배 낮은 단지 80 내지 200 V/cm으로 여기시키는 것이 가능해졌다. 이러한 고주파수 마이크로초 미만 저전기장 자극 버스트에 의한 여기(도 8a 및 도 9에 나타낸 바와 같음)는 더 강한 전기장에 의한 막 손상에 이어지는 지속적인 Ca²⁺ 상승 및 세포 수축(도 8b에 도시됨)과 명확하게 달랐다. 단일 저주파수(예를 들어, 1 MHz 미만) 마이크로초 미만 고전기장(예를 들어, 1 kV/cm 초과) 자극 펄스에 의한 VCM 여기는 여기 역치에서 손상을 일으켜서, 비정상적인 활동 전위와 오래 지속되는 Ca²⁺ 상승을 유발했다. 이 현상은 대체로 사실 그대로였는데, 저주파수 마이크로초 미만 고전기장 자극과는 대조적으로, 본원에 기술된 고주파수 마이크로초 미만 저전기장 자극은 매우 효과적이면서도 손상을 실질적으로 적었다.

예를 들어, 도 9에 도시된 바와 같이, MHz 버스트로 반복된 자극은 손상을 일으키지 않았다. 전기 천공의 초기 징후는 350 내지 400 V/cm(예를 들어, 도 8b 및 도 11a 참조), 즉 여기 역치(p <0.001)보다 2 내지 3배 높은 곳에서 관찰되었는데, 이는 큰 안전 창(safety window)을 허용하는 것이다. 마이크로초 미만 펄스 자극 사이의 간격이 고정된 100 ns인 경우, 역치는 100에서 400 ns까지의 펄스 폭에 대해 전력 함수로서 감소했다(예를 들어, 도 11b 참조). 역치는 버스트 내의 총 "온" 시간에 의해 결정되는 반면, 개별 고주파수 마이크로초 미만 저전기장 펄스 지속 시간은 중요하지 않았다(예를 들어, 도 11c 참조). 버스트 지속 시간에 대해 그래프화된 역치 시간 평균 전기장은 펄스가 짧을수록 더 작았다(도 11d).

이 예상치 못한 결과는 VCM이 1000개 펄스들의 버스트 - 펄스 지속 시간은 50에서 600 ns까지로 다양했으며 펄스간 간격은 90 ns에서 4.8 μs까지로 변화시켰음 - 에 의해 여기되는 별도의 실험 세트에서 확인되었다. 버스트 지속 시간에 대한 시간 평균 역치 전기장 값을 플로팅한 결과, 더 짧은 펄스에 대해서 상당히 더 작은 값들이 산출되었는데(도 11e), 이는 VCM에서의 이전 실험과 일치하지만 신경 여기와는 대조되는 것이다(예를 들어, 아래의 도 16a 내지 도 16d 참조). 이는 전통적인 펄스와는 명확히 다른, 마이크로초 미만 펄싱의 특정 효과를 나타내는 것일 수 있다.

HEK293 및 CHO 세포에서, 나노초 범위의 펄스 버스트들의 메가헤르츠 압축은 도 12a 및 도 12b에 도시된 바와 같이 자극 후 40초 관찰 이내에 완전히 또는 부분적으로 회복되는 Ca2+ 과도 현상을 이끌어냈다. 한 번에 하나의 세포로 나노초 범위의 펄스를 받은 VCM과 대조되게, 이들 배양된 세포들은 작은 그룹 단위로 노출되었다. 더 높은 전기장(시험 범위: 130 내지 570 V/cm), 더 높은 펄스 수(시험 범위: 100 내지 1,000), 및 더 짧은 펄스간 간격(시험 범위: 150 내지 300 ns)의 경우, 반응 확률과 진폭이 증가했다. 펄스 지속 시간은 공표된 작업과의 비교를 용이하게 하기 위해 300 ns로 일정하게 유지되었다. 낮은 주파수에서의 전형적인 나노초 펄싱(단일 펄싱 포함)은 약 1.8 kV/cm의 300 ns 펄스에 대해 반응 역치를 가졌다. CHO 세포는 전압 게이트된 Ca2+ 채널을 발현하지 않으므로, Ca2+ 과도 현상은 전기 천공의 결과라고 생각된다.

이 실험 작업에 기초할 때, 나노초 버스트의 메가헤르츠 압축(예를 들어, 메가헤르츠 주파수 범위의 저전압 나노초 펄스의 적용)은 여기와 전기 천공 모두에 대한 전기 에너지 역치를 크게 줄일 수 있게 하였다. 놀랍게도, 여기 역치와 전기 천공 역치(예를 들어, 도 11a 참조)의 명확한 분리와, 손상 없는 반복된 여기도 또한 있는데, 이는 나노초 범위의 전통적인 펄스화 전기장을 사용할 때에는 문제가 되었던 것이다.

나노초 버스트들의 메가헤르츠 압축의 적용

위에서 간략히 논의된 바와 같이, 본원에 기술된 방법들 및 장치들(예를 들어, 장치, 시스템, 어플리케이터 등) 중 임의의 것은 조직을 처리하는 데 사용될 수 있다. 피부, 간, 신장, 신경 세포(뇌, 척추, 말초), 폐, 근육, 지방, 호흡기, 위장, 방광, 생식기, 종양 조직 포함한 기타 조직을 포함하지만 이에 국한되지 않는 임의의 적절한 조직이 처리될 수 있다. 본원에 기술된 저전기장(예를 들어, 낮은 전압) 및 고주파수(예를 들어, 메가헤르츠)의 나노초 펄스는 생물학적 기능을 조작하고 질병을 처리하는 데 사용될 수 있다. 이러한 전기적 자극에 대한 반응에는, 신경 및 근육 자극, 면역 활성화(또는, 달리 표현해서, 면역 반응을 자극), 및 내분비 세포, 세포 분화, 전기 천공, 괴사, 및 아포토시스 세포 사멸을 포함하지만 이에 국한되지 않는, 다양한 생물학적 효과가 포함될 수 있다. 따라서, 저전기장 및 메가헤르츠 주파수의 나노초 펄스는 전기 자극을 가할 수 있는 사실상 모든 적응증(indication)에 사용될 수 있다. 일반적으로, 본원에 기술된 고주파수 나노초 펄스 발생기 및 이들을 사용하는 방법은 의료 요법에 사용될 수 있다.

예를 들어, 본 개시내용의 방법들 및 장치들은 심장 박동, 제세동, 근육 훈련 및 재활, 통증 제어, 파킨슨병 증상 완화, 정신 장애, 및 암 절제에 사용될 수 있다. 또한 신경 근육 및 정신병 진단 및 연구에도 사용될 수 있다.

예를 들어, 본원에 기술된 기기들, 시스템들, 및 방법들은 다양한 절제 절차(예를 들어, 방사선 기반), 피부과 절차(예를 들어, 피부암과 같은 다양한 피부 질환 처리), 일반 수술 절차(예를 들어, 췌장 절제술), 심장학(예를 들어, 판막 복구술), 부인과학(예를 들어, 자궁 적출술), 신경외과(예를 들어, 종양 절제) 등에서 활용될 수 있다.

본원에 기술된 방법들 중 임의의 방법은 여기 및/또는 절제 또는 기타 조직 처리를 위해 흥분성 조직(신경 조직을 포함하지만 이에 국한되지 않음)에 적용될 수 있다. 예를 들어, 신경 및 심장 근육과 같은 흥분성 조직의 자극을 위한, 그리고 간질, 파킨슨병, 및 뇌졸중과 같은 신경 장애를 처리하기 위한, 방법들 및 장치들이 본원에 기술된다. 심장 질환에는 심방 세동 및 심실 세동이 포함될 수 있다. 위에서 증명된 바와 같이, 하나의 세포 또는 한 그룹의 세포의 막 전위는 본원에 기술된 방법을 사용하여 직접 여기시킬 수 있다. 본원에 기술된 방법들 및 장치들은 혈소판과 같은 세포에서 분비를 자극하는 데 사용될 수 있다.

본원에 기술된 방법들 및 장치들은 뇌, 말초 신경, 근육, 및 심장을 처리하는 데 있어서 특별한 용도를 찾을 수 있다. 위에 언급된 바와 같이, 이러한 방법들은 심장 박동, 제세동, 파킨슨병의 심부 뇌 자극, 골격근의 기능을 복원하기 위한 기능성 나노초 전기 펄스, 및 섬유 근육통, 우울증, 치매, 간질, 당뇨병성 신경 병증, 및 기타 여러 분야의 새로운 응용 분야에 대한 통증 조절에 사용될 수 있다. 구체적으로, 본원에 기술된 저전기장(예를 들어, 낮은 전압) 및 고주파수(예를 들어, 메가헤르츠)의 나노초 펄스는 신경 및 근육 표적에서 활동 전위(AP)를 조절하거나 도입하는 것이 유익할 수 있는 임의의 적응증을 처리하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 방법들 및 장치들은 시냅스 효율을 변경시키는, 휴지 전위의 변조(예를 들어, 변위)에 사용될 수 있다. AP 유도는, 삽입되거나 이식된 전극을 통해서나 혹은 표면에서 비침습적으로, 표적에 과도 전압 구배를 생성함으로써 수행된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 본원에 기술된 방법들 및 장치들 중 임의의 것은 전기 천공에 사용될 수 있다.

본원에 기술된 조직들 중 임의의 조직은 나노초 펄스들의 메가헤르츠 압축의 적용을 사용하여 저전압 나노초 펄스들의 열들을 메가헤르츠 주파수 범위에서 적용함으로써 선택적으로 조절될 수 있다. 일부 변형 예에서, 본원에 기술된 방법들은 세포의 크기 및/또는 세포의 막 함량에 적어도 부분적으로 기초하여 세포를 조절할 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법들은 다른 세포들에 비해 방전을 위한 시간 상수 - 이는 세포의 구성 및/또는 크기의 함수일 수 있음 - 가 높은(예를 들어, 더 높은 커패시턴스) 세포에 영향을 미칠 수 있다.

예를 들어, 저전기장 및 메가헤르츠 주파수의 나노초 전기 펄스는 여드름, 지루성 각화증, 켈로이드, 전염물렁종, 연성섬유종, 건선, 유두종, 인간 유두종 바이러스(HPV), 흑색종, 기미, 피지 증식, 한관종, 선천성 모세혈관 기형(포트 와인 얼룩), 기미, 광선 각화증, 흑색구진성 피부병, 혈관 섬유종, 피부 종양, 노화 피부, 주름진 피부, 체리 혈관종, 표피/피지 낭종, 기저 세포 암종, 노화 피부, 양성 종양, 전암성 종양, 암, 및 사마귀 중 하나 이상의 처리를 포함하여 환자의 피부를 처리하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방법들 및 장치들은 또한 문신 제거, 모낭 파괴, 흉터/켈로이드 감소, 지방 감소, 및 주름 감소를 포함한 미용 피부 처리에도 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 방법들 및 장치들은 흑색종을 자체적으로 파괴되게 하여 흑색종을 처리하는 데 유용할 수 있다. 일반적으로, 이러한 방법들은 피부 병변의 체외 처리에 유용할 수 있다.

저전기장(예를 들어, 낮은 전압) 및 고주파수(예를 들어, 메가헤르츠)의 나노초 전기 펄스를 적용하기 위한 본원에 기술된 방법들 및 장치들은 나노 전기 절제 및 백신 접종에 유용할 수 있다.

따라서, 본원에 기술된 방법들 및 기기들은 다양한 질병 처리에 사용될 수 있다. "질병"은 암성, 전암성, 및 양성인 것을 포함하는 조직의 비정상적이고 제어되지 않는 성장과 관련된 대상체 내 또는 대상체 상의 임의의 비정상적 질환, 또는 당 업계에 알려진 기타 질병을 포함한다. 본 발명의 방법들 및 기기들은 악성, 양성, 연조직 또는 고형으로 특징지어지는지 여부와 무관하게 임의의 유형의 암과, 전이 전후 암을 포함한 모든 단계 및 등급의 암의 처리에 사용될 수 있다. 다른 유형의 암의 예는, 예컨대 위암(예를 들어, 위암), 결장 직장암, 위장 기질 종양, 위장 유암종 종양, 결장암, 직장암, 항문암, 담관암, 소장암, 및 식도암과 같은, 소화기 및 위장 암; 유방암; 폐암; 담낭암; 간암; 췌장암; 맹장암; 전립선암, 난소 암; 신장암(예를 들어, 신장 세포 암종); 중추 신경계의 암; 피부암(예를 들어, 흑색종); 림프종; 신경교종; 융모암; 두경부암; 골육종; 및 혈액 암을 포함하지만 이에 국한되지 않는다.

이들 방법들 및 장치들은 또한, 또는 대안적으로, 종양 처리를 포함하여, 암을 제거하고 새로운 암 성장에 대한 저항력을 생성하는 데에도 유용할 수 있다. 종양의 예는 양성 전립선 비대증(BPH), 자궁 섬유종, 췌장 암종, 간 암종, 신장 암종, 결장 암종, 기저 세포 암종, 및 바렛 식도와 관련된 조직을 포함한다.

본원에 기술된 방법들 및 장치들은 유전자-전기 전달(gene-electrotransfer) 또는 "GET"에 사용될 수 있다. 일부 변형 예에서, 암을 포함한 질병은 종양에 도입되는 유전자의 (예를 들어, 면역 반응을 자극할 수 있는 유전자를 코딩하는 하나 이상의 플라스미드에서의) 전달에 의해 치리될 수 있다. 예를 들어, 흑색종은, 나이브 T 세포에서 Th1 세포로의 분화뿐만 아니라 인터페론-감마 및 종양 괴사 인자-알파의 생성을 자극할 수 있는, 인터루킨 12(IL-12) 유전자를 수용하는 플라스미드를 사용하여 처리할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 본원에 기술된 방법들 및 장치들 중 임의의 것은 특히 종양 세포를 포함하는 조직의 세포를 천공하는 데 사용될 수 있다. 이는 작은 분자들이 원형질막을 가로질러 수송될 수 있게 하기에 충분히 큰 세공을 생성함으로써 세포를 투과화시킬(permeabilize) 수 있다. 도 8a 및 도 8b에 나타낸 바와 같이, 가역적 및 비가 역적 전기 천공 모두가 달성될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 방법들 및 장치들은, 흑색종, 기저 세포 암종, 유방암, 및 카포시 육종을 포함한 여러 피부 종양 표적의 처리(블레오마이신, 시스플라틴, 또는 기타 약물의 사용을 포함할 수 있음)에 사용될 수 있는 전기 화학 요법(ECT: electrochemotherapy)에 사용될 수 있다. 본원에 기술된 방법들 및 장치들은 괴사를 유발할 수 있는 비가역적 전기 천공(IRE: irreversible electroporation)을 유발하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 방법들 및 장치들은 다른 적응증들 중에서 전립선, 뇌종양 절제(신경교종 포함), 췌장암, 결장 직장 전이, 절제 불가능한 신장 종양, 및 직장 신생물을 처리하는 데 효과적일 수 있다.

본원에 기술된 나노초 펄스 열들의 메가헤르츠 압축은 암을 포함하는 질병 처리에 특히 효과적일 수 있는데, 왜냐하면 펄스 열들은 세포(들)의 세포내 영역으로 침투할 수 있기 때문이다. 원형질막을 넘어서 침투하는 능력은(아마도 나노초 범위에서 전체 진폭에 도달하는 펄스 상승 시간에 기인함) 세포내(intracellular) 및 세포소기관간(intraorganellar) 전하가 재분배되어서 부과된 전기장을 상쇄시키는 데 필요한 시간보다 일반적으로 훨씬 빠르다. 이는 본원에 기술된 방법들 및 장치들이 나노초 범위의 전기 펄스를 적용함으로써 작은 세포소기관(예를 들어, 소포, 미토콘드리아, 소포체, 및 핵 포함)을 투과화시킬 수 있게 한다.

또한, 본원에 기술된 방법들 및 장치들은 혈소판 활성화(트롬빈 부재 하에)에도 사용될 수 있는데; 예를 들어, 이러한 방법들은 나노초 범위의 전기 펄스를 혈소판이 풍부한 혈장에 적용하여서 상처 치유를 개선하고 혈류를 향상시키는 데 사용될 수 있다.

위에서 언급된 바와 같이, 본원에 기술된 나노초 펄스 버스트들의 메가헤르츠 압축은 종양 성장에 영향을 주기 위해 사용될 수 있고; 예를 들면, 저전기장 및 고주파수, 예를 들어, 메가헤르츠의 나노초 범위의 전기 펄스로 종양을 처리하는 데 사용될 수 있고, 그에 따라 종양이 며칠에서 몇 주에 걸쳐 사라지고 면역원성 세포 사멸(ICD)의 특성을, 예를 들어, 예컨대 ER에서 세포 표면으로의 칼레티쿨린(calreticulin) 전위, ATP 방출, 및 HMGB1 방출과 같은 DAMP 방출을 나타낼 수 있다. 이러한 방법들은 또한 전이를 억제하는 데에도 사용될 수 있다.

고전압(예를 들어, 30 kV/cm)을 사용하는 나노초 범위의 펄스화 전기장의 사용과 유사하게, 본원에 기술된 방법들은 또한 약물이 없고 매우 빠르며 흉터를 남기지 않는 처리법을 제공할 수 있으며, 단지 한 가지 처리법 또는 몇 가지 처리법으로 처리할 수 있다. 그러나, 본원에 기술된 방법들 및 장치들은 다른 펄스화 요법들과는 달리 목표하는 효과(면역원성 세포 사멸 효과 포함)를 달성하는 데 큰 전기장을 필요로 하지 않는다. 따라서, 절제 영역의 크기가 더 클 수 있고, 조직에 의해 더 쉽게 적용 및/또는 용인될 수 있다.

본원에 제공된 예들은 단지 예시 및 예를 들기 위한 것일 뿐이고, 기재된 설명은 총망라한 것이거나 제한적인 것으로 의도되지 않는다는 점을 주지해야 한다.

쌍극 펄스를 표적 지향시키는 나노초 버스트들의 메가헤르츠 압축

일반적으로, 나노초 버스트들의 메가헤르츠 압축을 위한, 예를 들어, 저전기장 및 고주파수(예를 들어, 메가헤르츠)의 나노초 펄스를 제공하기 위한, 본원에 기술된 방법들 및 장치들은 적용되는 전기 에너지를 위한 다수의 소스(예를 들어, 전극, 안테나 등)와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 조직 위, 내부, 또는 주변의 별개의 영역들과, 메가헤르츠 범위(예를 들어, 약 1 메가헤르츠 이상)의 주파수의 마이크로초 미만 펄스들의 펄스 열이 생성되도록, 적용되는 에너지가 합해지는(예를 들어, 중첩에 의해) 영역에서 에너지를 적용하는 데 두 세트의 전극이 사용될 수 있고, 그 결과 세포막에 전하가 축적될 가능성이 있고, 결과적인 메가헤르츠 압축은 단일 펄스를 포함하여 더 낮은 속도로 펄싱되는 적용된 전기장에 비해 실질적으로 더 낮은 역치에서 생물학적 효과를 유발시킬 수 있다. 전술한 바와 같이, 이는 생물학적 효과를 유발시키는 역치를, 가해지는 에너지의 양을 기준으로 할 때, 명백히 낮추는 것으로 볼 수 있다.

본 출원의 일부 실시형태에서, 나노초 버스트들의 메가헤르츠 압축을 위한, 예를 들어, 저전기장 및 고주파수(예를 들어, 메가헤르츠)의 나노초 펄스를 제공하기 위한, 본원에 기술된 방법들 및 장치들은, (비표적 영역에서) 전극에서 또는 전극 근처에서의 전기 펄싱의 영향을 최소화하면서 전기 펄스의 적용으로부터 소정의 거리에 있는 처리 영역을 특정적으로 표적으로 삼기 위해, 쌍극 펄스를 사용하는 것과 결합하여 적용될 수 있다. 2018년 8월 16일자로 출원된 미국 출원 제16/104,089호["쌍극 나노초 펄스의 간섭에 의한 표적 지향 원격 전기 자극(TARGETED REMOTE ELECTROSTIMULATION BY INTERFERENCE OF BIPOLAR NANOSECOND PULSES)"]는 중첩 영역(CANCAN이라고 함)을 특정적으로 표적으로 삼기 위해 조직의 상이하지만 중첩되는 영역들로부터 고전압의 쌍극 나노초 펄스를 사용하는 방법을 기술하고 있다. 흥미롭게도, 도 13에 도시된 바와 같이, 고전압(예를 들어, 높은 전기장 강도)의 쌍극 나노초 펄스를 사용하는 나노초 펄스화 활성화는 세포막에서의 생물학적 효과의 활성화를 일으키지 못했다. 도 13에 나타나 있고 아래에서 더 자세히 설명하는 바와 같이, 쌍극 나노초 펄스의 사용은 나노초 펄스가 조직에 미치는 영향을 상쇄하는 것으로 보이며, 이는 펄스의 두 번째 절반부(예를 들어, 펄스의 음으로 진행하는 부분)이 펄스의 첫 번째 부분(예를 들어, 양으로 진행하는 부분)으로 인한 임의의 전하 이동을 원상태로 돌려버리는 펄스의 쌍극 특성 때문일 수 있다. 그러나, 예를 들어 펄스가 조직의 상이한 두 영역에서 상이한 시간에 적용될 때 발생할 수 있는 경우인, 두 개의 쌍극 펄스가 중첩되지만 동기화되지 않는 경우, 중첩 영역의 전기장이 중첩되어서 그 중첩 영역에 단극 펄스가 생성될 수 있다. 따라서, 조직의 나머지 부분이 쌍극 나노초 펄싱의 영향을 받지 않는 동안에도 중첩 영역은 결과적인 단극 나노초 펄싱의 영향을 받을 수 있다.

나노초 버스트의 메가헤르츠 압축은 이 CANCAN 효과와 결합되어서, 심부 조직 영역에도 아주 효과적인 전기 펄스(예를 들어, 전기 자극을 포함하지만 이에 국한되지 않음)를 제공할 수 있다. 이 메가헤르츠 압축 CANCAN 기술은 특히 효과적일 수 있는데, 왜냐하면 나노초 펄싱의 메가헤르츠 압축을 사용할 때 소정의 효과를 일으키는 데 필요한 에너지는 메가헤르츠 압축이 없는 상태에서 필요한 것보다 획기적으로 낮기 때문이다. 이 효과는 고주파수(예를 들어, 메가헤르츠 범위 내)의 나노초 버스트들을 방출하기 위한 안테나를 사용함으로써 한층 더 향상될 수 있다.

따라서, 상이한 위치들에서 높은 반복률(예를 들어, 메가헤르츠)의 쌍극 나노초 전기 펄스들의 다수의 열을 방출하여 중첩 영역 - 이 영역에는 다수의 쌍극 나노초 펄스 열들이 중첩되어 저전기장의 단극 나노초 펄스들의 국소화 열(localized train)이 형성됨 - 을 형성하는 방법들 및 장치들도 또한 본원에 기술된다(예를 들어, 도 7 참조). 결과적으로 생성된, 저전기장의 중첩된 단극 나노초 펄스들은 국소화 중첩 영역에 생물학적 효과(예를 들어, 자극, 천공 등)를 일으키기 위한 역치를 초과할 수 있다.

나노초 버스트들의 메가헤르츠 압축을 CANCAN과 함께 사용하면 CANCAN 효과가 또렷해질 수 있다. CANCAN의 쌍극 상쇄를 나노초 버스트의 메가헤르츠 압축과 결합하여 사용하는 것은 다소 직관적이지 않은 것인데, 왜냐하면 메가헤르츠 압축은 단일 소스(예를 들어, 전기장 강도가 낮은 쌍극 나노초 펄스들의 단일 열)로부터의 쌍극 펄싱에 영향을 미치지 않을 가능성이 있기 때문이다. 모든 펄스에서 즉각적인 방전이 발생하기 때문에(전통적인 쌍극 나노초 펄싱에서처럼), 쌍극 펄스 열은 메가헤르츠 압축의 여지가 없다는 것이 분명한데, 메가헤르츠 압축은 펄스들 사이의 전하를 시간적으로 합쳐서 막에서의 전압 효과를 향상시킬 수 있는 것이다. 또한, 메가헤르츠 반복률을 사용하면 실질적으로 낮은 전기장 강도를 적용해서 필적하는 생물학적 효과를 달성할 수 있게 되므로, 이러한 방법들 및 장치들은 조직 두께로 인한 감쇠를 보상할 수 있다. 또한, 쌍극 펄스와 단극 펄스 사이에는 훨씬 더 강한(예를 들어, 더 격심한) 차이가 있을 수 있으며, 이는 표적 지향(targeting)을 개선할 수 있게 할 것이다. 이는 예를 들어 흥분성 조직(예를 들어, 신경 조직)에 전기 천공 손상 없이 전기 펄스로부터 향상된 생물학적 효과(예를 들어, 자극)가 추가로 발휘되게 할 수 있다. 예를 들어, 일부 변형 예에서, 2개의 동기화된 "CANCAN"펄스 열들이 4쌍의 전극으로부터 생성될 수 있으며, 이 펄스 열들은 중첩되어서 조직 깊이 내에서 더 긴 펄스가 될 수 있다.

본원에 기술된 메가헤르츠 압축 방법들 및 장치들은 펄스를 방출하는 다수의 전극 세트에서의 펄스화 전기 에너지의 영향을 줄이기 위해 쌍극 상쇄와 함께 사용될 수 있지만, 이러한 방법들 및 장치들은 쌍극 상쇄를 사용할 필요가 없음을 이해해야 한다. 위에서 언급된 바와 같이, 이러한 방법들 및 장치들은, 결합시킬 수 있는 다수의 위치로부터의 펄스화 전기장들을 조직 내 중첩에 의해 적용하는 방법들 및 장치들을 포함하여, 펄스화 마이크로초 에너지를 적용하여 생물학적 효과를 생성하는 임의의 방법 또는 장치와 함께, 사용될 수 있다.

따라서, 복수의 상이한 위치들로부터 소정의 거리에 중첩 영역 - 여기서 복수의 편위된(offset) 고주파수의 나노초 쌍극 전기 펄스들 간의 중첩은 표적화된 중첩 영역에 편재되는 고주파수(예를 들어, 메가헤르츠)의 나노초 단극 전기 펄스 열을 생성하게 된다 - 을 표적으로 삼을 수 있도록, 편위된 복수의 상이한 위치들 각각으로부터의 고주파수(예를 들어, 메가헤르츠)의 나노초 쌍극 전기 펄싱을 수행하는 방법들 및 장치들이 본원에 기술된다. 편의상, 이를 수행하는 이러한 방법들 및 장치들은 여기서는 편위 및 중첩되는 쌍극 나노초 버스트들의 메가헤르츠 압축으로 지칭될 수 있다.

예를 들어, 심부 조직 및 기관에 전극을 삽입하지 않고도 생물학적 효과를 선택적으로 일으킬 수 있도록 하기 위해 전기 펄스들이 적용되는 곳으로부터 소정의 거리를 특정적으로 표적으로 삼아 나노초 전기 펄스를 적용하기 위한, 편위 및 중첩되는 쌍극 나노초 버스트들의 메가헤르츠 압축이 본원에 기술된다. 나노초 지속 시간의(그리고 메가헤르츠 반복률의) 쌍극 자극의 국소 중첩은 나노초 전기 펄스를 사용하는 치유적 처리 및 진단 처리의 정밀도와 침투 깊이를 증가시킬 수 있다. 이들 방법들 및 장치들의 예시적인 적용 분야는, 많은 것들 중에서도 특히, 정신 질환, 파킨슨병, 및 심부 종양의 표적 절제에 대한 통증 조절을 비제한적으로 포함하여, 위에 언급된 것들 중 임의의 것을 포함할 수 있다.

편위 및 중첩되는 쌍극 나노초 버스트들의 메가헤르츠 압축은 심부 표적들에 대한 선택적이고 비침습적이고 국소화 전기 자극을 가능하게 할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용은 원하는 생물학적 반응 일으키는 역치를 낮출 수 있는 고주파수(메가헤르츠) 자극을 사용하는 것뿐만 아니라, 자극 극성 반전 이후의 자극 효과를 상쇄시키기 위해 나노초 전기 펄스의 고유한 특성을 사용하는 것에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 쌍극 나노초 전기 펄스의 두 번째 위상은 첫 번째 위상의 자극 효과를 상쇄시키므로, 전체 쌍극 자극은 도 13에 나타낸 바와 같이 그의 절반보다 더 약해진다. 결국, 두 개의 쌍극 자극을 단극성 자극으로 중첩시키면 상쇄가 상쇄("CANCAN")되어 자극 효율이 복원된다. 도 14a의 예는 두 개의 쌍극 펄스 열들이 전극으로부터 떨어진 영역 c-c'에 어떻게 단극성 자극을 생성할 수 있는지를 보여준다. 쌍극 펄스들이 메가헤르츠 주파수로 반복될 수 있다. 이 기술은 생성된 전기장이 낮은(예를 들어, 1 kV/cm 미만) 경우에도 전극에서 멀리 떨어진 위치에 선택적 전기 자극을 가능하게 할 수 있다.

편위 및 중첩되는 쌍극 나노초 버스트들의 메가헤르츠 압축을 위한 방법들 및 장치들은 최소 파괴적(예를 들어, 비침습적)일 수 있다. 또한, 본원에 개시된 방법들 및 장치들에는 일반적으로 기존 접근법보다 더 적은 수의 절차 단계, 더 낮은 비용, 및 더 적은 수의 세포가 수반된다. 게다가, 본원에 개시된 방법들 및 관련된 양태들에는 또한, 일관되고 정확하게 한정된 전기장의 사용, 효율적인 배지(media) 교환 및 약물 적용/제거, 그리고 무균 상태의 추가가 수반될 수 있다.

도 14a에서, 요소들(a-a') 간의 제1 나노초 펄스 열과 요소들(b-b') 간의 제2 나노초 펄스 열이 서로의 고조파로 구성될 수 있고, 그에 따라 c-c' 영역에서의 두 펄스 열의 합이 충분히 높은 주파수가 되어서, 전기장이 생물학적 효과(예를 들어, 탈분극, 천공 등)를 유발하게 되는 역치가 합해진 펄스 열에 부합된다. 도 14b는 유사한 효과를 예시하는 것으로서, 조직의 표적 c-c' 영역에 약 1 메가헤르츠보다 높은 주파수의 단극 펄스 열이 형성되도록 결합되는 펄스 열들을 사용하는 것을 보여주고 있으며, 여기서 전기장은 비교적 낮을 수 있지만(예를 들어, 1 kV/cm 미만) 본원에 기술된 바와 같은 생물학적 효과는 여전히 유발시킬 수 있다.

본원에 기술된, 편위 및 중첩되는 쌍극 나노초 버스트들의 메가헤르츠 압축을 위한 방법들 및 장치들은 표적화된 비침습성 전기 천공 또는 전기 자극을 위한 쌍극 나노초 전기 펄스의 고유한 비효율성을 극복할 수 있다. 본원에 기술된, 편위 및 중첩되는 쌍극 나노초 버스트들의 메가헤르츠 압축은, 쌍극 전기 펄스 그 자체는 낮은 생물학적 효율을 갖는다는 사실을 이용한다. 도 15a에 예시된 바와 같이, 한 쌍의 전극 A-A' 사이에 적용된 감쇠파(예를 들어, 감쇠 정현파(DSW)로 나타냄)는 생물학적으로 효과가 없다. 위상 변위된 두 번째 DSW(전극 B-B' 사이에 적용됨)도 유사하게 효과가 없다. 그러나 두 DSW의 중첩 및 동기화는 상기 두 쌍의 전극에서 멀리 떨어진 영역 C-C'에 생물학적으로 효과적인 단극 펄스를 생성한다. 즉, 생물학적으로 효과가 없는 두 DSW의 중첩에 의한 효과는 단극 펄스를 생성하면서 쌍극 나노초 전기 펄스의 상쇄 효과를 상쇄시킨다. 이 개념을 "상쇄의 상쇄(cancellation of cancellation)" 또는 CANCAN 효과라고 칭한다. 도 15b는 유사한 예로서, 표적 c-c' 영역에 약 0.1 메가헤르츠 이상(예를 들어, 0.2 MHz 이상, 0.5 MHz 이상, 1 MHz 이상 등)의 주파수의 단극 펄스 열이 형성되도록 결합되는 펄스 열들을 사용하는 것을 보여주고 있으며, 여기서 전기장은 비교적 낮을 수 있지만(예를 들어, 1 kV/cm 미만) 본원에 기술된 바와 같은 생물학적 효과는 여전히 유발시킬 수 있다.

그 자체로는 효과가 없는 두 개의 적합하게 성형된 쌍극 나노초 전기 펄스 열들의 중첩 및 동기화는 생물학적으로 효과적인 단극 펄스 열을 멀리 떨어져서 복원시킨다. 그 이유는, 전극에서 멀리 떨어진 특정 위치에서는, 시간적으로 일치하는 각각의 후속 위상 중에 생성된 전기장(E-field)들은 서로를 무효화시키므로, 남는 것은 단극 펄스로서의 첫 번째 위상뿐이기 때문이다. 이러한 무효화는 두 개의 독립적인 나노초 펄스 열들로부터의 전기장 성분들이 반대 방향일 때 발생하여, 그 영역에 0 kV/cm인 |E| 강도를 생성한다.

성공적인 CANCAN의 주요 목표들 중 하나는 나노초 전기 펄스 전달 전극 근처에는 단극 펄스에 비해 낮은 효과가 생기도록 하면서 멀리 떨어진 곳에는 단극의 효과와 동일한 효과가 생성되게 하는 것이다. 전기장 모델링 결과에 의하면, 70%의 제2 위상 진폭은 50%의 제2 위상 진폭보다 더 적은 전기장 무효화를 전극 근처에 제공할 수 있다는 것이 예측된다. 결국에는, 이로 인해, 두 개의 나노초 전기 펄스 열이 동시에 전달되는 경우에는 전극 근처에 더 나은 쌍극 상쇄가 일어날 수 있다. 따라서, 일부 변형 예에서는, 제1 펄스 열의 두 번째 위상의 진폭만 위상 A의 70%로 하는 반면에 세 번째 위상의 진폭은 25%로 유지되게 할 수 있다. 두 번째 위상 진폭이 70%인 상태에서는, 전극 근처의 전기장 무효화가 적어져서, 쌍극 상쇄 효과가 우세해진다. 대조적으로, 전극들 사이의 중앙에서는, 이러한 효과는 비동기 전달과는 최대로 다른데, 이는 최대 전기장 무효화 및 CANCAN을 나타낸다.

생물학적으로 효과가 없는 두 개의 쌍극 나노초 펄스 열들을 생물학적으로 효과적인 단극 펄스 열로 중첩시킨 것에 의한 원격 전기 천공. 상쇄의 상쇄 또는 CANCAN이라고 명명된 이러한 효과는 각각의 쌍극 나노초 펄스의 위상들이 일치하는 중에 생성된 전기장들이 반대 방향이고 서로를 무효화시킬 때에 발생하여서, 전극에서 멀리 떨어진 영역에는 단극 노출만 남기고 그 외의 다른 곳에는 쌍극을 유지시킨다. 결과적으로, CANCAN은 표적 지향 전기 천공을 위한 쌍극 나노초 전기 펄싱의 본질적인 비효율성에 의존한다. CANCAN의 효율성은 달성된 쌍극 상쇄 정도에 정비례할 것으로 예상된다.

편위 및 중첩되는 쌍극 나노초 버스트들의 메가헤르츠 압축에 의해 단극 펄스가 멀리 떨어진 곳에 형성된다는 것은 심부 표적에 비침습적으로 접근할 수 있는 가능성을 보여주는 것이다. 편위 및 중첩되는 쌍극 나노초 버스트들의 메가헤르츠 압축은 마찬가지로 전기 자극으로 확장될 수 있다.

위에 설명된 바와 같은 메가헤르츠 압축과 공간적 합치기를 이용하는 유사한 효과를 쌍극 펄싱 없이도 적용할 수 있다. 예를 들어, 일부 변형 예에서는, 자체적으로는 생물학적 효과가 있다고 해도 거의 없지만, 표적 영역에서 공간적으로 합쳐지는 경우에는, 나노초 버스트들의 메가헤르츠 압축을 일으키기에 충분한 고주파수(예를 들어, 메가헤르츠 범위) 펄스 열로 생성될 수 있는, 기가헤르츠 주파수보다 낮은 다수의 저전기장 단극 펄스 열들이 방출되어서, 합쳐지기가 보이는 영역에 생물학적 효과를 유발시킬 수 있다.

실시예

전술한 바와 같이, 조직 또는 세포(예를 들어, 일부 경우에서, 단리된 조직 또는 세포, 예를 들어 신체로부터 제거된 것)를 사용하여, 본원에 기술된 방법들 및 장치들이 그러한 세포 및 조직을 효과적으로 처리하는 데 사용될 수 있음을 확인하였다. 단리된 조직 및 세포의 예는 단지 예시하기 위한 것이고, 본원에 기술된 이러한 기술들, 방법들, 및 장치들(예를 들어, 기기, 시스템 등)은 살아 있는 인간 또는 동물의 온전한 또는 반온전한 조직(예를 들어, 기관 등)과 함께 사용될 수도 있다는 것을 이해해야 한다.

예를 들어, 도 7 내지 도 13을 참조하여 위에서 설명한 바와 같이, 세포는 본원에 기술된 방법들 및 장치들을 예시하기 위해 사용되었다. 예를 들어, 부착 세포주, 즉 HEK 293(인간 상피 신장), CHO-K1(중국 햄스터 난소), 및 마우스 심실 심근 세포(VCM)를 포함하는 세포를 시간 경과 형광 이미징 분석에 사용하였으며, 현탁 기반 EL-4 세포(예를 들어, 마우스 림프종)를 생존력 연구에 사용하였다. VCM은 랑겐도르프 관주(Langendorff perfusion) 동안 효소 소화에 의해 성체 DBA/2J 마우스로부터 단리되었다. VCM을 라미닌 코팅된 10 mm 유리 커버 슬립에 시드하였고, 48시간 이내에 실험에 사용하였다.

본원에 기술된 방법들 및 장치들은 전기 여기성 세포를 자극하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 황소 개구리 Rana catesbiana의 신경(n. ischiadicus + n. peroneus)에서 신경 화합물 활동 전위(CAP)를 유발시켰고, CAP 기록을 수행했다. 단리된 신경을 양쪽 끝에서 연결하였고, 140 NaCl, 5.4 KCl, 1.5 MgCl₂, 2 CaCl₂, 10 글루코오스, 및 10 HEPES(pH 7.3, 290 내지 300 mOsm/kg, 1.6 S/m)를 함유하는 냉각된 생리학적 용액(mM)에 담갔다. CAP을 아래에 설명된 상이한 생성기들을 사용하여 일으켰고, MP160 데이터 수집 시스템(BIOPAC Systems, 캘리포니아주 골레타 소재)을 사용하여 기록했다.

일부 실험에서, 1 Hz 내지 3 또는 4 MHz의 반복률의 5개 내지 1000개 펄스들의 버스트들이 사용되었으며, 이 때 개별 마이크로초 미만 펄싱은 지속 시간이 11 내지 500 ns였다. 지속 시간이 최대 1 ms인 단일 펄스를 사용하여, 다양한 타이밍 및 강도 파라미터에서의 마이크로초 미만 버스트들과 생물학적 효과들을 비교했다. 이러한 다양한 자극을 여러 생물학적 부하들(8 내지 200 옴의 임피던스)로 전달하기 위해, 본원에 설명된 여러 개의 고전력 마이크로초 미만 생성기를 사용하였고, 일부 경우에서는, 비교를 위해 저전력 모델 577 디지털 지연 발생기(Berkley Nucleonics, 캘리포니아주 산 라파엘 소재)(펄스 파라미터 설정에는 유연하지만, 모델 577 펄스 진폭의 출력은 200 옴 부하에서 단지 20 V로만 제한되었다)를 사용하였다. 본원에 기술된 바와 같이 구성된 펄스 발생기들은 버스트 지속 시간 및 최소 펄스 지속 시간을 제한할 수 있지만, 100 내지 200 옴 부하(예컨대, 커버슬립 상의 부착 세포)에 최대 약 3 kV를, 또는 8 내지 10 옴 부하(예컨대, 세포 성장 배지가 있는 전기 천공 큐벳)에 최대 500 V를 전달할 수 있다. 큐벳 노출을 제외하고, 이러한 실험에서 펄스는 일반적으로 단극이고 거의 직사각형이었으며, 상승 및 하강 시간은 펄스 지속 시간의 15% 미만이었다(예를 들어, 도 16a 참조). 큐벳 노출의 경우, 200 ns 지속 시간의 사용 설정에서(50% 높이에서) 긴 상승 및 하강 시간은 삼각형 펄스 모양을 생성했다. 일부 실시예에서, 단일의 거의 직사각형인 단극성 긴 펄스(예를 들어, 수백 마이크로초의 펄스 지속 시간)의 생성은 모델 S88 자극기 또는 주문 제작형 MOSFET 기반 생성기를 사용했다. 일부 실시예에서, 펄스 모양과 진폭은 TDS3052 오실로스코프(Tektronix, 오리건주 비버튼 소재)로 제어되었다.

세포 자극 및 투과화를 보여주는 실시예에서, 나노초 미만 펄싱에 대한 세포 반응을 시간 경과 형광 이미징으로 모니터링하여, 막 전위의 변화를 (예를 들어, FluoVolt 염료를 사용하여) 검출하거나, 또는 세포질 Ca²⁺의 증가를 (예를 들어, Fluo-4 또는 Fluo-8 염료, 또는 YO-PRO-1 염료 흡수를 사용하여) 검출하였다. 막 전위 및 Ca²⁺ 지표는 세포에 사전에 장입시킨 반면에, YO-PRO-1은 1 μM의 욕 용액(bath solution)에 실험 전체에 걸쳐서 첨가했다. 일부 실시예에서, 욕 용액은, 전도도를 감소시키고 전기 천공을 용이하게 하기 위한, 위에 정의된 생리학적 용액이거나, (지시된 경우에는) 이와 동일한 용액을 등삼투압 자당(isosmotic sucrose) 용액과 1:9로 혼합한 것이다. 펄스 발생기에 연결된 한 쌍의 텅스텐 막대 전극(직경: 100 um, 간격: 140 내지 170 urn)을 현미경 시야 내에 배치하여, 선택한 세포(또는 소그룹의 세포들)를 전극의 팁들 사이의 중앙에 위치하도록 한 다음, 전극을 커버슬립 표면 위 50 μm까지 정확하게 들어 올렸다. 펄스화 전력 시스템을, 예를 들어 Digidata 1440A 보드 및 Clampex 소프트웨어(Molecular Devices, 캘리포니아주 포스터시 소재)를 사용하여 TLL 펄스 프로토콜에 의해, 트리거하고 이미지 취득과 동기화시켰다. 유한 요소 솔버인 COMSOL Multiphysics(스웨덴 스톡홀름)를 사용하여 3D 수치 시뮬레이션으로 전기장을 계산했다.

일부 실시예에서, 세포 생존력 분석을 수행했다. 1.2 10⁶/ml의 성장 배지(10% FBS가 있는 DMEM)에 재현탁된 EL-4 세포, 및 1 mm 간격 전기 천공 큐벳에 배치된 100 μl 분취량. 마이크로초 미만 펄스 버스트를 실온에서 적용했고, 그 노출로 인한 최대(단열) 가열은 다른 곳에서 설명되어 있는 바와 같이 계산했으며 섭씨 6도를 초과하지 않았다. 세포를 인큐베이터로 돌려보냈고, Presto Blue 대사 분석(ThermoFisher Scientific, 매사추세츠주 월담 소재)을 사용하여 생존력을 24시간 동안 측정했다.

말초 신경 자극

본원에 기술된 방법들 및 장치들은 여기성 세포를 자극하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 위에서 설명한 방법 및 장치를 사용하여 말초 신경을 자극했다. 신경 섬유를 고주파수(예를 들어, 메가헤르츠) 마이크로초 미만 저전기장(예를 들어, 1 kV/cm 미만) 자극으로 신경 손상 없이 반복적으로 여기시킬 수 있다. 예를 들어, 도 16b 내지 도 16d에 나타낸 바와 같이, 마이크로초 미만 자극(도 16a에 도시된 것과 유사함)을 사용하여 신경을 여기시켰다. 도 16b에서, 340 ns 펄스를 1 Hz 내지 2 MHz의 반복률로 5 펄스 버스트 및 100 펄스 버스트로 적용했다. 이 실시예에서, 약 7 kHz까지의 반복률에서는 합쳐지기가 없었으므로, 버스트의 역치는 단일 340 ns 펄스의 역치와 같을 가능성이 있다. 전력 함수를 따르며 100 펄스 버스트의 경우에서 더 빨라진 역치의 감소에 의해, 10 kHz를 넘어선 반복률에서 합쳐지기가 보이는데, 이는 더 많은 수의 작은 펄스들로부터 막 통과 전위 축적이 이루어지게 한다. 약 2 MHz에서, 100 펄스 버스트의 역치는 이들 세포의 경우에는 400 내지 500 V/cm에서부터 10 V/cm까지 떨어졌다. 5 펄스 버스트의 역치는 이미 0.3 MHz에서 이론적 최소값(단일 펄스 역치의 1/5)으로 떨어지는데, 이는 펄스들 사이에 상당한 정도의 방전이 없음을 시사하는 것이다.

마이크로초 미만 버스트에 의해 유도된 막 전위는 버스트 동안의 시간 평균 전기장에 의해 결정될 수 있다. 이 값은 역치 전기장과 듀티 사이클을 곱하여 계산할 수 있다. 버스트 지속 시간에 대해 그래프화한 시간 평균 전기장의 역치 값은 도 16c에 나타낸 바와 같이 마이크로초 미만 펄스 지속 시간에 관계 없이 거의 동일한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 지속 시간이 버스트 지속 시간과 동일한 단일의 "긴" 펄스의 역치가 예측될 수 있다. 도 16d에 예시된 바와 같이, 주파수가 3.3 MHz이고 지속 시간이 200 ns인 1000개 펄스들의 열(듀티 사이클 67%, 버스트 지속 시간 300 μs)은 신경 여기 역치를 360±4 V/cm(단일 200 ns 펄스의 경우)로부터 1.63±0.2 V/cm까지 감소시켰다. 이러한 버스트 동안의 시간 평균 전기장은 약 1.63 x 0.67 = 1.1 V/cm였다. 이는 단일 300 μs 펄스(1.04 ± 0.2 V/cm)의 측정된 역치였다. 단일 200 μs 펄스(펄스 지속 시간은 버스트의 총 "온"시간과 같음)의 측정된 역치는, 예를 들어 1.21 +/- 0.17 V/cm와 같이, 단지 약간만 더 높았다. 그러나 고주파수 마이크로초 미만 저전기장 버스트의 효율성과 단일의 긴 펄스의 효율성 간의 단순한 상관관계가 항상 유효한 것은 아니다. 일반적으로, 효과를 일으키는 데 필요한(예를 들어, 도 16b 내지 도 16d에서는, 전기 여기성 세포막을 여기시키는 데 필요한) 전기장은 일반적으로 펄스 버스트 내의 반복률이 증가함에 따라(예를 들어, 인접한 펄스들 사이의 지연이 감소함에 따라) 감소한다. 펄싱 파라미터의 정확한 값(예를 들어, 주파수, 반복률/펄스간 간격 등)은 여러 가지 조직 유형이나 세포 유형에 따라 다를 수 있지만, 동일한 일반적인 추세가 적용될 수 있다.

전술한 바와 같이, 고주파수(예를 들어, 메가헤르츠) 마이크로초 미만 저전기장(예를 들어, 1 kV/cm 미만) 펄스화 자극을 위한 방법들 및 장치들은 여기성 세포 및 비여기성 세포의 전기 천공에 사용될 수 있다. 예를 들어, 도 17a 내지 도 17f는 고주파수 마이크로초 미만 저전기장 펄스 버스트에 의한 비여기성 세포의 전기 천공을 예시하고 있다. 도 17a 내지 도 17f에서, 어떠한 전압 게이트 채널도 발현하지 않는 CHO 및 HEK 세포에서 전기 투과화(electropermeabilization)를 측정했다. 도 17a에서, 지속 시간이 400 ns인 100개 펄스들의 버스트를 Ca2+ 식별자 Fluo-4가 장입된 CHO 세포로 전달했다. 각기 다른 전기장 강도에 대해, 펄스 반복률을 1 kHz에서 1 MHz까지 시험하였고, 감지할 수 있는 Ca²⁺ 상승에 반응한 세포와 반응하지 않은 세포의 수를 세었다. 도 17a의 각 데이터 점은 3 개 이상의 독립적인 실험에서 얻은, 총 20 내지 30개 세포의 반응 비율을 나타낸다. 약 0.96 내지 1.47 kV/cm의 전기장 값은 낮은 반복률에서는 Ca²⁺ 반응을 일으키지 않았지만, 약 0.3 MHz 이상에서는 점점 더 효과적이게 되었다. 이 주파수는 신경 자극을 위한 것보다(예를 들어, 도 16b와 비교) 약 2 크기 자릿수(order of magnitude)만큼 더 높았으며, 약 1 μs의 추정된 충전 시간 상수와 일치했다. 약 1.83 kV/cm의 더 높은 전기장은 1 kHz에서는 세포의 70%에서 효과적이었고; 단지 10 kHz와 100 kHz에서의 반응 비율의 증가는 완전히 이해되지 않았는데, 이는 Ca²⁺ 과도 현상도 더 강해졌기 때문에 검출이 더 잘 되었던 결과일 수 있다.

약 0.64 kV/cm의 낮은 전기장 하에서, 지속 시간이 500 ns인 1000개 펄스들의 버스트는 약 0.8 내지 1 MHz 아래에서는 HEK 세포의 Ca²⁺ 이온이나 혹은 YO-PRO-1로의 투과화를 일으키지 않았다(예를 들어, 도 17b 내지 도 17d 참조). 이 주파수를 넘어선 주파수에서는, 전기 투과화가 이 실시예에서는 급격히 증가했다. MHz 버스트들(도 17d)과 단일의 긴 펄스들(도 17e)에 의해 유발된 Ca²⁺ 과도 현상의 시간 경과 및 모양은 유사했으며, 이는 전기 천공의 기본 메커니즘이 동일함을 시사하는 것이다. MHz 버스트 유도 Ca²⁺ 반응의 크기는, 도 17f에 도시된 바와 같이, 지속 시간이 버스트 동안의 총 "온" 시간과 동일한(총 버스트 지속 시간과 동일한 것이 아님) 단일의 "긴" 펄스의 것과 일치할 수 있다. 반응을 일으키기 위한 정합 조건은 다음과 같음을 확인했다:

E_lp = (E_nsPEF) x (듀티 사이클) + 0.05 [1]

여기서, E_lp 및 E_nsPEF는 각각, 세포 위치에서 긴 펄스(500 μs)와 마이크로초 미만 펄스(500 ns)에 의해 생성된 전기장 값(kV/cm)이다. 이러한 관련성은 마이크로초 미만 버스트들 및 일치된 단일 펄스들이, 심하게 전기 천공된 세포의 생존력 감소와 같은, 비교되는 생리적 결과를 가지고 있음이 분명하다는 것을 시사하고 있다. 그러나 실험에서는 이것을 확인하지 못했다. 고주파수 마이크로초 미만 저전기장 펄싱에 의해 전기 천공된 EL4 세포의 생존력도 검사했다. 예를 들어, 전기 천공 큐벳에서의 비교적 큰 세포 집단에 대한 고주파수 마이크로초 미만 저전기장 펄스 처리의 생존력 실험을 수행하였고; 여기서, 고주파수 마이크로초 미만 저전기장 펄스 버스트는 50% 높이에서 폭이 200 ns인 삼각형 모양을 가졌고, 인가된 전압은 펄스들 사이에서 항상 완전히 0으로 떨어지지 않았다(도 18a). 1000개의 고주파수 마이크로초 미만 저전기장 펄스들의 버스트들을 두 개의 상이한 피크 진폭(190 및 500 V, 세포 현탁액에서 1.9 및 5 kV로 변환됨) 및 낮거나 높은 반복률(100 Hz 및 3 MHz)로 적용했다. 1.9 kV/cm인 전기장은 100 Hz로 적용된 200 ns 펄스에 있어서의 전기 천공 역치보다 낮았으므로, 최대 4000개 펄스들의 버스트들은 세포 생존력을 감소시키지 않았다. 3 MHz로 적용된 위와 동일한 펄스는 상기 역치보다 높았으며, 모든 시험된 펄스 수의 경우에서 생존력이 약 2배 감소했다(도 18b, 100 Hz, t-검정 대비 p < 0.001). 약 5 kV/cm에서, 훨씬 적은 수의 펄스는 100 Hz 버스트와 3 MHz 버스트의 경우 모두에서 생존력을 감소 시켰지만, 3 MHz 버스트가 훨씬 더 효과적이었다(도 18c, p < 0.001).

불규칙한 펄스 모양으로 인해, 버스트 동안의 시간 평균 전압 및 전기장은 고주파수 마이크로초 미만 저전기장 펄스 진폭과 듀티 사이클을 곱하여 계산할 수 없었다. 대신에, 전압들을 버스트 동안 0.2 ns 분해능으로 디지털화하여 그 전압들의 평균을 계산했는데, 이는 버스트 중의 고주파수 마이크로초 미만 저전기장 펄스의 피크 전압이 190 V(1.9 kV/cm)일 때 108 V(1.08 kV/cm)와 동일했다. 별개의 일련의 실험(도 18d)에서, 고주파수 마이크로초 미만 저전기장 펄스 버스트(1000회 펄스, 400 ns, 3 MHz, 1.9 kV/cm)로 처리된 세포의 생존력을, 지속 시간이 버스트 지속 시간(333 μs)과 동일하고 전기장이 버스트 중의 시간 평균 값(1.08 kV/cm)과 동일한 단일 펄스와 나란히 비교했다. 고주파수 마이크로초 미만 저전기장 펄스 버스트 후의 생존력은 이전의 세트(도 17b)와 일치하는 약 50%였지만, "동등한" 단일 펄스는 현저하게 덜 효과적이었고 생존력을 단지 87.6±1.4%, p < 0.0001까지만 감소시켰다. 따라서, 고주파수 마이크로초 미만 저전기장 펄스의 MHz 버스트는 시간 평균 진폭으로 예측한 것보다 더 효과적이었고, 이는 고주파수 마이크로초 미만 저전기장 펄스의 알려지지 않은 특유한 효과로 인한 것일 가능성이 있다.

이러한 실험은 MHz까지의 반복률을 갖는 고주파수 마이크로초 미만 저전기장 펄스 버스트에 의한 여기 및 전기 천공이 효과적이고 효율적이라는 것을 예증하였다. 다양한 표적들 및 종말점들 모두는 고주파수 마이크로초 미만 저전기장 펄스 효율이 증가했고 역치가 감소했음을 보여주었다. 고주파수 마이크로초 미만 저전기장 펄스 버스트의 효율성은 일반적으로 버스트 당 펄스 수, 버스트의 진폭, 및 듀티 사이클에 따라 증가했다. 이 효율성은 지속 시간 및 진폭이 각각 고주파수 마이크로초 미만 저전기장 펄스 버스트의 지속 시간 및 시간 평균 진폭과 동일한 단일의 긴 펄스와 현저하게 다를 수 있다.

본원에 기술된 방법들(사용자 인터페이스를 포함) 중 임의의 방법은 소프트웨어, 하드웨어, 또는 펌웨어로 구현될 수 있고, 프로세서(예를 들어, 컴퓨터, 태블릿, 스마트폰 등)에 의해 실행될 수 있는 명령어 세트를 저장하는 비일시적 컴퓨터 판독 가능 저장 매체로 설명될 수 있으며, 여기서 명령어는 프로세서에 의해 실행될 때 그 프로세서로 하여금 디스플레이, 사용자와의 통신, 분석, 파라미터(타이밍, 주파수, 강도 등을 포함) 수정, 결정, 경고 등을 이에 국한됨이 없이 포함하는 단계들 중 임의의 단계를 수행하는 것을 제어하게 하는 것이다.

본원에서 어떤 특징부 또는 요소가 다른 특징부 또는 요소 "상에" 있는 것으로 언급되는 경우, 이는 그 다른 특징부 또는 요소 바로 위에 있을 수 있거나, 개재되는 특징부 및/또는 요소도 또한 존재할 수 있다. 반대로, 어떤 특징부 또는 요소가 다른 특징부 또는 요소에 "바로 위에" 있는 것으로 언급되는 경우, 개재되는 특징부 또는 요소는 없는 것이다. 어떤 특징부 또는 요소가 다른 특징부 또는 요소에 "연결", "부착", 또는 "결합"된다고 언급되는 경우, 이는 그 다른 특징부 또는 요소에 바로 연결, 부착, 또는 결합되는 것일 수 있거나, 개재되는 특징부 및/또는 요소도 또한 존재할 수 있다는 것도 또한 이해될 것이다. 반대로, 어떤 특징부 또는 요소가 다른 특징부 또는 요소에 "바로 연결", "바로 부착", 또는 "바로 결합"되는 것으로 언급되는 경우, 개재되는 특징부 또는 요소는 없는 것이다. 이렇게 설명되거나 도시된 특징부 및 요소는 일 실시형태와 관련하여 설명되거나 도시되었어도 다른 실시형태에 적용될 수 있다. 또한, 다른 특징부 "인접하게" 배치된 구조 또는 특징부에 대한 언급에는 인접한 특징부와 겹치거나 밑에 놓이는 부분이 있을 수 있다는 것도 또한 당업자는 이해하게 될 것이다.

본원에 사용된 용어는 특정 실시형태를 설명하기 위한 것이지, 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다. 예를 들어, 본원에 사용된 단수 형태("a", "an", "the")는 문맥상 명확하게 달리 나타내지 않는 한 복수 형태도 포함하도록 의도된 것이다. 본원에 사용된 "및/또는" 이라는 용어는 연관된 나열 항목들 중 하나 이상의 임의의 조합 및 모든 조합을 포함하며, "/"로 축약해서 쓸 수 있다.

"아래", "밑", "하부", "위", "상부" 등과 같은 공간적으로 상대적인 용어는 본원에서는 도면에 예시된 다른 요소(들) 또는 특징부(들)에 대한 한 요소 또는 특징부의 관계를 설명하기 위해 설명의 편의상 사용될 수 있다. 이러한 공간적으로 상대적인 용어는 도면에 도시된 방향 외에도 사용 또는 작동 중인 장치의 여러 방향들을 포함하도록 의도된 것임을 이해하게 될 것이다. 예를 들어, 도면의 장치가 반전된 경우, 다른 요소 또는 특징부의 "아래" 또는 "밑"으로 설명된 요소는 그 다른 요소 또는 특징부 "위"에 배향되게 된다. 따라서, 예시적인 용어인 "아래"는 위 및 아래 방향 모두를 포함할 수 있다. 장치가 다르게 배향(90도 또는 다른 방향으로 회전)될 수 있으며, 본원에 사용되는 공간적으로 상대적인 서술어는 그에 따라 해석된다. 유사하게, "상향", "하향", "수직", "수평" 등의 용어는 본원에서는 특별히 달리 나타내지 않는 한 설명의 목적으로만 사용된다.

"제1" 및 "제2"라는 용어는 본원에서는 다양한 특징부/요소(단계 포함)를 설명하기 위해 사용될 수 있지만, 이러한 특징부/요소는 문맥상 달리 나타내지 않는 한 이러한 용어에 의해 제한되지 않아야 한다. 이러한 용어는 어느 한 특징부/요소를 다른 특징부/요소와 구별하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 교시에서 벗어나지 않는 범위에서, 아래에서 논의되는 제1 특징부/요소는 제2 특징부/요소로 명명될 수 있고, 마찬가지로, 아래에서 논의되는 제2 특징부/요소는 제1 특징부/요소로 명명될 수 있다.

본 명세서 및 이어지는 청구범위 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, "포함하다"라는 단어와, "포함한다" 및 "포함하는"과 같은 변형어는, 다양한 컴포넌트들이 방법 및 물품(예를 들어, 조성물, 기기를 포함한 장치, 방법)에서 공동으로 사용될 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 용어 "포함하는"은 임의의 언급된 요소들 또는 단계들을 포함하는 것을 의미하지만 임의의 다른 요소들 또는 단계들의 배제는 의미하지 않는다는 것을 이해하게 될 것이다.

일반적으로, 본원에 기술된 모든 장치 및 방법은 포괄적인 것으로 이해되어야 하지만, 컴포넌트들 및/또는 단계들의 전부 또는 부분 집합은 대안적으로 배타적일 수 있으며, 다양한 컴포넌트들, 단계들, 하위 컴포넌트들, 또는 하위 단계들"로 구성된" 또는 대안적으로는 "로 본질적으로 구성된"으로 표현될 수 있다.

달리 명시적으로 지정되지 않는 한 실시예에서 사용되는 것을 포함하여, 본원에서 명세서 및 청구범위에 사용되는, 모든 숫자는 "약" 또는 "대략"이라는 용어가 명시적으로 나타나지 않더라도 그 단어가 앞에 있는 것처럼 읽을 수 있다. "약" 또는 "대략"이라는 문구는 크기 및/또는 위치를 설명할 때에 설명되는 값 및/또는 위치가 값 및/또는 위치의 합리적인 예상 범위 내에 있음을 나타내기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 수치는 명시된 값(또는 값 범위)의 +/- 0.1%, 명시된 값(또는 값 범위)의 +/- 1%, 명시된 값(또는 값 범위)의 +/- 2%, 명시된 값(또는 값 범위)의 +/- 5%, 명시된 값(또는 값 범위)의 +/- 10% 등인 값을 가질 수 있다. 또한, 본원에 제공된 임의의 수치는 문맥상 달리 나타내지 않는 한 약 또는 대략의 그 값을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, "10"이라는 값이 개시되면 "약 10"도 개시된 것이다. 본원에 언급된 임의의 수치 범위는 그 안에 포함된 모든 하위 범위를 포함하도록 의도된 것이다. 또한, 어떤 값이 개시된 경우 그 값 "이하", 그 값 "이상", 및 값들 사이의 가능한 범위도 당업자에 의해 적합하게 이해되는 바와 같이 개시된 것이라고 이해된다. 예를 들어, 값 "X"가 개시되면 "X 이하"뿐만 아니라 "X 이상"(예를 들어, X가 수치인 경우)도 개시된 것이다. 또한, 본 출원 전반에 걸쳐 데이터가 다양한 형식으로 제공되며, 이러한 데이터는 데이터 점들의 모든 조합에 있어서의 종말점 및 시작점과 범위를 나타낸다는 것이 이해된다. 예를 들어, 특정 데이터 점 "10"과 특정 데이터 점 "15"가 개시된 경우, 10 및 15 초과, 이상, 미만, 이하, 동등뿐만 아니라 10 내지 15도 개시된 것으로 간주된다는 것이 이해된다. 또한, 2개의 특정 단위 사이의 각각의 단위도 또한 개시된 것으로 이해된다. 예를 들어, 10과 15가 개시되면, 11, 12, 13, 및 14도 개시된 것이다.

다양한 예시적인 실시형태들이 위에서 설명되었지만, 청구범위에 의해 기술된 바와 같은 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 다양한 실시형태들에 대한 다수의 변경이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 설명된 다양한 방법 단계들이 수행되는 순서는 대안적인 실시형태에서 종종 변경될 수 있으며, 다른 대안적인 실시형태에서는 하나 이상의 방법 단계가 모두 생략될 수 있다. 다양한 장치 및 시스템 실시형태의 선택적 특징부들은 일부 실시형태에는 포함될 수 있고 다른 실시형태에는 포함되지 않을 수 있다. 따라서, 전술한 설명은 주로 예시적인 목적으로 제공된 것이어서, 청구범위에 기재된 바와 같은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

본원에 포함된 실시예 및 예시는 본 특허대상이 실시될 수 있는 특정 실시형태를 제한이 아닌 예시로서 보여주는 것이다. 언급된 바와 같이, 이로부터 다른 실시형태들이 이용되고 도출되어서, 구조적 및 논리적 대체 및 변경이 본 개시내용의 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있도록 할 수 있다. 본 발명의 특허대상의 이러한 실시형태들은, 하나 이상의 발명이 사실상 개시된 경우 본 출원의 범위를 임의의 단일 발명 또는 발명 개념으로 자발적으로 제한하려는 의도 없이 단지 편의상으로만, "발명"이라는 용어로 개별적으로 또는 집합적으로 지칭될 수 있다. 따라서, 특정 실시형태들이 본원에 예시되고 설명되었지만, 동일한 목적을 달성하기 위해 계산된 임의의 배열이 도시된 특정 실시형태를 대체할 수 있다. 본 개시내용은 다양한 실시형태의 임의의 그리고 모든 개작 또는 변형을 포함하도록 의도되어 있다. 상기 실시형태들의 조합들과 본원에 구체적으로 설명되지 않은 다른 실시형태들은 상기 설명을 검토했을 때 당업자에게 명백해질 것이다.

Claims (38)

1. 생물학적 효과를 유발하기 위한 전기 에너지 임계값을 감소시키기 위해 전기 펄스를 전달하는 시스템으로서,
   제어기;
   세포 또는 생물학적 조직에 근접하게 배치되도록 구성된 복수의 전극을 포함하는 어플리케이터; 및
   하나 이상의 펄스 발생기 - 여기서 하나 이상의 펄스 발생기 각각은 1000 ns 미만의 지속 시간을 갖는 마이크로초 미만 펄스를 생성하도록 구성됨 - 를 포함하고,
   상기 제어기는
   1) 0.1 메가헤르츠(MHz) 이상의 주파수의 마이크로초 미만 펄스들의 열을 상기 어플리케이터로부터 적용하고,
   2) 생물학적 효과를 유발하는데 필요한 전기 에너지 역치(threshold)를 감소시키기 위해, 주파수가 세포 또는 생물학적 조직의 유효 방전 시간보다 낮게되도록 세포 또는 생물학적 조직을 기반으로 마이크로초 미만 펄스들의 열의 파라미터를 사용자가 선택하도록 허용하거나 자동으로 선택하도록 구성된,
   전기 펄스를 전달하는 시스템.
2. 제1항에 있어서, 상기 제어기는 1 MHz 이상의 주파수의 마이크로초 미만 펄스들의 열을 적용하도록 구성된, 전기 펄스를 전달하는 시스템.
3. 제1항에 있어서, 상기 마이크로초 미만 펄스들의 열은 1 kV/cm 미만의 전기장 강도를 갖는, 전기 펄스를 전달하는 시스템.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로초 미만 펄스들의 열은 마이크로초 미만 쌍극 펄스들의 제 1 열 및 마이크로초 미만 쌍극 펄스들의 제 2 열을 포함하고, 상기 제 1 열 및 제 2 열은 생물학적으로 유효하지 않고 상기 복수의 전극으로부터 떨어진(remote) 영역에서 생물학적으로 유효한 단극 펄스를 생성하기 위해 중첩을 야기하도록 구성된, 전기 펄스를 전달하는 시스템.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제어기는 마이크로초 미만 펄스들의 열의 마이크로초 미만 펄스의 전압 진폭이 20 V 이하가 되게끔 하나 이상의 펄스 발생기를 제어하도록 구성된, 전기 펄스를 전달하는 시스템.
6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제어기는 마이크로초 미만 펄스들의 열의 주파수를 설정 또는 선택하기 위한 하나 이상의 사용자 입력을 수신하도록 구성된, 전기 펄스를 전달하는 시스템.
7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제어기는 마이크로초 미만 펄스들의 열의 마이크로초 미만 펄스의 전압 진폭 또는 지속 시간을 설정 또는 선택하기 위한 하나 이상의 사용자 입력을 수신하도록 구성된, 전기 펄스를 전달하는 시스템.
8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 전극은 바늘 전극을 포함하는, 전기 펄스를 전달하는 시스템.
9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 어플리케이터는 휴대용 어플리케이터가 되도록 구성된, 전기 펄스를 전달하는 시스템.
10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 펄스 발생기는 1 ns 내지 900 ns의 지속 시간을 갖는 마이크로초 미만 펄스를 생성하도록 구성된, 전기 펄스를 전달하는 시스템.
11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로초 미만 펄스들의 열은 적어도 100개 이상의 펄스를 포함하는, 전기 펄스를 전달하는 시스템.
12. 전기 펄스를 전달하는 시스템으로서,
    제어기;
    세포 또는 생물학적 조직에 근접하게 배치되도록 구성된 복수의 전극을 포함하는 어플리케이터; 및
    하나 이상의 펄스 발생기 - 여기서 하나 이상의 펄스 발생기 각각은 1000 ns 미만의 지속 시간을 갖는 마이크로초 미만 펄스를 생성하도록 구성됨 - 를 포함하고,
    상기 제어기는
    1) 0.1 메가헤르츠(MHz) 이상의 주파수의 마이크로초 미만 쌍극 펄스들의 제 1 열 및 마이크로초 미만 쌍극 펄스들의 제 2 열을 상기 어플리케이터를 통해 적용하고, 상기 제 1 열 및 제 2 열은 생물학적으로 유효하지 않고 상기 복수의 전극으로부터 떨어진(remote) 영역에서 생물학적으로 유효한 단극 펄스를 생성하기 위해 중첩을 야기하도록 구성된, 전기 펄스를 전달하는 시스템.
13. 제12항에 있어서,
    상기 제어기는,
    하나 이상의 펄스 발생기가 고주파수, 마이크로초 미만 펄스화 전기장의 펄스를 100개보다 많이 전달하게 하도록 구성된, 전기 펄스를 전달하는 시스템.
14. 제12항에 있어서,
    하나 이상의 펄스 발생기는 복수의 펄스 발생기를 포함하고,
    상기 제어기는 마이크로초 미만 쌍극 펄스들의 제 1 열 및 마이크로초 미만 쌍극 펄스들의 제 2 열 중 적어도 하나를 형성하도록 복수의 펄스 발생기 각각으로부터의 마이크로초 미만 펄스들을 조합하기 위해 복수의 펄스 발생기를 조정하도록 구성된, 전기 펄스를 전달하는 시스템.
15. 제12항에 있어서,
    하나 이상의 펄스 발생기는 800V/m 이하의 전기장 강도를 갖는 고주파수 마이크로초 미만 펄스화 전기장을 전달하도록 구성된, 전기 펄스를 전달하는 시스템.
16. 제12항에 있어서,
    하나 이상의 펄스 발생기는 1 메가헤르츠 이상의 주파수를 갖는 고주파수 마이크로초 미만 펄스화 전기장을 전달하도록 구성된, 전기 펄스를 전달하는 시스템.
17. 제12항에 있어서,
    상기 제 2 열은 제1 열에 대해 위상-변위된(phase-shifted), 전기 펄스를 전달하는 시스템.
18. 제12항에 있어서,
    상기 제어기는 하나 이상의 프로세서를 포함하고,
    명령어 세트를 저장하는 기계-판독가능한 유형의 매체를 포함하는 제어기는 고주파수 마이크로초 미만 펄스화 전기장의 주파수 또는 진폭 또는 지속 시간을 설정 또는 선택하기 위한 사용자 입력을 수신하도록 구성된, 전기 펄스를 전달하는 시스템.
19. 제12항에 있어서,
    복수의 전극은 제1 전극 세트 및 제2 전극 세트를 포함하는, 전기 펄스를 전달하는 시스템.
20. 제12항에 있어서,
    하나 이상의 펄스 발생기의 각각의 펄스 발생기는 양의 위상 및 음의 위상을 갖는 마이크로초 미만 쌍극 펄스를 생성하도록 구성된, 전기 펄스를 전달하는 시스템.
21. 제12항에 있어서,
    복수의 전극은 텅스텐 막대 전극을 포함하는, 전기 펄스를 전달하는 시스템.
22. 제12항에 있어서,
    단리된 세포, 종양, 피부, 간, 신장, 신경 세포, 뇌, 척추, 폐, 근육, 지방 조직, 호흡기 조직, 위장 조직, 방광, 및 생식기 조직 중 하나 이상에 전기 펄스를 전달하도록 구성된, 전기 펄스를 전달하는 시스템.
23. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    마이크로초 미만 펄스들은 감쇠되는(damped), 전기 펄스를 전달하는 시스템.
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