JP5329978B2 - メラノーマの自己破壊を引き起こすナノ秒パルス電界 - Google Patents
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Description
複数の異なる種類の癌療法において、電界が用いられている。これらの一部には、高熱療法によって細胞を死滅させるために43℃より高くまで腫瘍を加熱する、無線周波またはマイクロ波の装置が必要である(K.K.Tanabe, S.A.Curley, G.D.Dodd, A.E.Siperstein, S.N.Goldberg (2004) Cancer. 100:641-650; D.Haemmerich, P.F.Laeseke (2005) Int.J.Hyperthermia. 21:755-760)。その他のものは、腫瘍細胞を透過処理して毒性の薬物またはDNAの導入を可能にするために、パルス電界を使用する(M.L.Lucas, R.Heller (2003) DNA Cell Biol. 22:755-763; Y.Kubota, Y.Tomita, M.Tsukigi, H.Kurachi, T.Motoyama, L.M.Mir (2005) Melanoma Res. 15:133-134; A.Gothelf, L.M.Mir, J.Gehl (2003) Cancer Treat.Rev. 29:371-387)。インサイチューにおいてナノ秒パルス電界で処置された線維肉腫腫瘍が、同じ動物における対照腫瘍と比較して増殖速度の減少を示したことが、過去の研究によって示されている(S.J.Beebe, P.Fox, L.J.Rec, K.Somers, R.H.Stark, K.H.Schoenbach (2002) IEEE Transactions on Plasma Science. 30:286-292)。
本発明の1つまたは複数の局面によって、組織中の標的細胞においてアポトーシスを選択的に開始させる方法を提供する。本方法は、少なくとも1 nsPEFを該組織に印加する段階を含む。少なくとも1 nsPEFとは、少なくとも約10ナノ秒〜約1マイクロ秒以下のパルス持続時間と、少なくとも約10 kV/cm〜約350 kV/cm以下の電界パルス強度とを有する。本発明の1つまたは複数の態様において、本方法はインサイチューで実施される。
本発明の原理の理解を促進するために、ここで好ましい態様に対する言及を行い、その説明のために特定の用語を使用する。これによって本発明の範囲の制限を意図しているわけではないことは、言うまでもなく理解されよう。むしろ、本発明が関連する技術分野の当業者により意図されるであろう、本発明のそのような改変およびさらなる修正ならびに本明細書で説明される本発明の原理のさらなる適用は、本発明の一部となることが意図されている。
E = Vm/fa (1)
であり、式中、aは細胞の半径であり、fは細胞の形状に依存する形状因子である。球形の細胞に関してはfが1.5であり;両端部における半球の直径がdである長さlの円柱細胞に関しては、形状因子は
f = l/(l-d/3) (2)
である。
材料および方法
細胞組織培養
マウスメラノーマB16-F10細胞をATCC(Manassas, VA)から入手し、使用時まで液体窒素中で凍結保存した。これらを37℃の湯浴中で融解させた後、10%ウシ胎児血清(FBS, Atlanta Biologicals)、4 mM L-グルタミン(Cellgro)、および2%ペニシリン-ストレプトマイシン溶液(Cellgro)を追加したDMEM(ダルベッコ改変イーグル培地)を含む培養フラスコに移した。5% CO2/95%大気/100%加湿インキュベータ中で、37℃で細胞を増殖させた。
106 B16-F10マウスメラノーマ細胞を含む2〜10μlを疎性輪紋状組織(loose areolar tissue)の皮膚の直下に注射することにより、雌性SKH-1マウス(免疫適格性の無毛アルビノ種、Charles River, Wilmington, MA)120匹内で2〜4つの腫瘍を誘導した。数日以内にメラノーマ腫瘍が注射部位で見られる。5日以内に、腫瘍は典型的には3 mm幅となり、血管新生を表す。未処置の腫瘍は典型的に、数週間以内に10 mm以上の幅まで成長する。全ての動物試験について、1.6%イソフルラン含有酸素を用いた吸入麻酔下で、マウスを維持した。マウス#4〜#63内の腫瘍を5針電極アレイで処置し、#64〜#120を平行平板電極で処置した。典型的な実験において、2つの腫瘍を対照として用い、同一マウスにおける残りの2つをnsPEFで処置した。
徹照および倍率1.2の表面写真撮影の両方によってメラノーマを毎日画像化し、マウス50から超音波画像撮影も始めた。Visualsonics Vevo 770(Visualsonics Inc., Toronto, Canada)を用いて、インサイチューにおける腫瘍を画像化した。30μmの空間分解能を提供するステッピングモータースキャナ(stepper motor scanner)を備えた55 MHzの708モデルスキャンヘッドを用いた(Visualsonics Inc., Toronto, Canada)。パワードプラモード(power Doppler mode)により、各腫瘍について血流画像を得た。
マウスを安楽死させた直後かつ腫瘍切開15分前に、リン酸緩衝ホルマリン(10%)を腫瘍部位の皮下の疎性輪紋状層内部に注射した。腫瘍を、室温で24〜48時間、ホルマリン固定液(最低で20×腫瘍体積)中に置いた。腫瘍および周囲の皮膚を切りそろえて、外側と内側両方の表面を写真撮影した。固定された腫瘍を、標準的な30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%×3エタノールシリーズを用いて脱水し、100%×2キシレン中で透明にし、60℃において溶融パラフィン浴中で2回浸潤させ(それぞれ1時間)、その後、パラフィンブロックに包埋した。7μm厚の切片を切り出し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
インピーダンス75Ωのパルス形成ネットワークを用いた。図1に示すように、これは、ブルームライン構成で配置された30対の高電圧コンデンサおよび30個の誘導子からなり、300 ns長の高電圧パルスを生じる(J.F.Kolb, S.Kono, K.H.Schoenbach (2006) Bioelectromagnetics. 27(3):172-87)。パルスは最初は火花ギャップによって引き起こされたが、これは後に、マイクロコントローラにより制御される水銀置換リレー(mercury displacement relay)と交替させた。対象にかかる電圧は高圧プローブ(P6015A、Tektronix, Beaverton, CA)を用いてモニターし、電流はPearsonコイル(2877モデル、Pearson Electronics Inc., Palo Alto, CA)で測定した。電流および電圧は、デジタルオシロスコープ(TDS3052、Tektronix, Beaverton, OR)を用いて同時に記録した。
以下の3種類の電極を用いた:5針アレイ、2針アレイ、および平行平板。Teflon基板から2 mm延びた30ゲージ皮下針(直径300μm)を用いて、5針アレイ(図2)を作製した。中心針は陽極であり、中心電極から4 mm間隔を空けて配置された周囲の針4本は、互いに接続されて陰極を形成した。皮膚に沿って破壊電界強度を増大させるため、および、パルス電界印加の際の針間のフラッシュオーバーの可能性を減少させるために、針挿入の前に植物油を皮膚に塗った。平行平板電極(図6A)はステンレス鋼製であり、処置対象の腫瘍のサイズに応じて3〜5 mmの直径を有した。電極から皮膚を分離するために、0.5 mm厚の導電性の寒天層(1 M NaClを含む2%寒天)でこれらの電極を被覆した。処置のために、0.5〜1 mm離した2枚の平板の間に各腫瘍を配置し、一方で、立ち上がり時間が約30ナノ秒で、持続時間300 nsおよび振幅4〜8 kVの100パルスを周波数0.5 Hzで印加した。
nsPEFへの曝露後に、インビトロにおいてメラノーマ腫瘍抽出物からカスパーゼ活性を測定した。メラノーマをマウスから切り出し、液体窒素中で凍結させた。融解させた組織ホモジネートから抽出物を調製し、以前に記載されたとおりに(L.K.Parvathenani, E.S.Buescher, E.Chacon-Cruz, S.J.Beebe (1998) J.Biol.Chem. 273:6736-6743)蛍光発生基質Ac-DEVD-AFC(Alexis Biochemicals, San Diego, CA)を用いて、カスパーゼ活性を分析した。このペプチド配列は、カスパーゼ1、3、4、および7に関するPARP切断部位であるAsp216に基づき、これは切断の際に蛍光の増大を示す。簡潔には、抽出物を50μM DEVD-AFC(Asp-Glu-Val-Asp-AFC)と共にインキュベーションし、蛍光(励起400 nmおよび発光505 nm)を測定した。カスパーゼ単位は、抽出タンパク質1ミリグラムあたりの、1分あたりに切断された基質(pmol)として定義した。
2つの異なる電極構成を用いて電界を印加した。第1のものは5針電極アレイ(図2A)であり、ここで針はマウス皮膚内部に約2 mm挿入された。マウス59匹において、中心針を処置されるべきメラノーマの中央に配置し、外側の針4本はメラノーマの境界縁の外側とした。この電極アレイは鋭く非均一な電界を示し、その力線は、皮膚の表面に対して平行でありかつ中心電極の近傍で最も強い(図2B)。針アレイがメラノーマ内部に2〜3分間挿入されて除去される場合、メラノーマは正常に増殖し続ける(図3H〜M)。しかし、除去前に100パルス(8 kV、300 ns、0.5 Hz)を針アレイに与えると、メラノーマは2日以内に収縮しはじめる(図3O〜T)。腫瘍周囲の毛細血管から赤血球が漏出するので、パルス後に腫瘍への血流が妨害される(図3P)。局所的血流は通常、約2週間のあいだ回復しない。パルスから2日後、角質層は、表皮の表在性びらんを伴う壊死および出血の徴候を示し、腫瘍は暗くなる(図3Q)。これは、腫瘍細胞に加えて、電極間の皮膚の表皮細胞(角質層へと分化する)が300 nsパルス電界(nsPEF)により損傷を受けていることを示唆する。メラノーマの存在しない皮膚領域を処置し、同じ期間にわたって同様の表在性びらんを観察することによって、これらの結果が確認された(図3A〜F)。表皮と接触する針上方の軸を絶縁することで、この損傷は低減されうる。
腫瘍が初回処置から2〜3週間後に収縮を停止した場合に、2回目の100パルス3日間のシリーズで該腫瘍を処置した。3種類のそのような場合において、腫瘍の完全な寛解が観察され、一例を図7に示す。初回処置から2か月以内に、メラノーマは、徹照法でも、超音波でも、または連続切片組織学的調査でも検出不可能となった。
5 mm平板の間の組織に送達されるエネルギーは、平板間の距離が1 mmである場合、0.2 Jである。特定の水温とすると、これは2〜3℃しか組織温度を上昇させない。ごく小さな熱電対を腫瘍内部に挿入することによってこの温度上昇を直接測定し、100パルス後に到達した最大温度が33℃であったことを確認した(図8)。これは温熱療法効果に必要な最低温度よりも10℃低く、したがって、nsPEFが腫瘍増殖に与える効果が温熱療法によるものである可能性は非常に低い。
腫瘍退縮の原因であり得る電界パルスの印加後に、以下2つの、腫瘍における即時的な変化を同定した:(a) 腫瘍細胞核が迅速に核濃縮(pyknotic)となること;および (b) 腫瘍への血流が停止すること。未処置の腫瘍細胞は、染色の薄い(lightly staining)多形核および、微細分散メラニン顆粒を含む大量の細胞質を示した(図9)。処置済みの腫瘍は、染色の濃い収縮核、および個々の細胞の脱接着(dyshesion)を示し、これらは粗い細胞内メラニン顆粒および拡大間質腔内に凝集した細胞外メラニン顆粒を有した。腫瘍細胞核はパルス後数分間以内に54%収縮し、3時間以内に68%収縮する。腫瘍サイズが90%減少したため(図9E)、その後2週間の間にさらなる核収縮は起こらなかった。腫瘍核の一部は電界軸に沿って伸長したが、これは必ずしも観察されるとは限らない。処置後1および3時間では細胞密度が高いので、この期間中に腫瘍細胞自体も収縮する。パルス印加後の核濃縮は、以前に観察されたいずれの核濃縮的な応答よりも速く起こり(S.M.Albarenque, K.Doi (2005) Exp.Mol.Pathol. 78:144-149)、かつこれは、電気的変形(electrodeformation)[18]に、または、細胞の核ラミナに会合して核の伸長および収縮を生じる細胞骨格要素との直接電界相互作用(P.K.Wong, W.Tan, C.M.Ho (2005) J.Biomech. 38:529-535; Y.Gruenbaum, A.Margalit, R.D.Goldman, D.K.Shumaker, K.L.Wilson (2005) Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 6:21-31)に、起因しうる。
観察された迅速な核濃縮は、細胞DNAがnsPEFの直接的または間接的な標的であり得ることを示唆するものである。この損傷が誘導される正確な機構は未だ明らかではない。2つの可能性のある機構としては、アポトーシス経路におけるDNaseの活性化、または、機械的に誘導されるDNA切断が挙げられる。直径10μmの典型的な腫瘍細胞核は、各パルスの間、その全体にわたって約40 Vの電圧勾配を受けると考えられる。この電界は、核の迅速な電気機械的変形を引き起こすのに十分な程大きく、これによって、核膜に付着したDNAに対して機械的なショックが生じ、これはDNAを損傷させる可能性がある。
各々がメラノーマ腫瘍を1個ずつ有するマウス27匹(実験用13匹および対照14匹)を用いて試験を開始した。各実験用マウスを、持続時間300 nsおよび振幅40 kV/cmの300パルスで処置した。処置済みの腫瘍全てが24時間以内に収縮を始め、2週間のあいだ収縮し続けた。これらのうち11個がこの時点で増殖を再開し、同じパルスパラメータで2回目の処置を受けた。腫瘍のうち2個が収縮し続け、もはや検出不可能である。2回処置した腫瘍11個のうち3個は、2回目の処置から約3週間後に3回目の処置を受けた。13個の実験用腫瘍は全て、完全な寛解を示している(図11)。対照的に、対照14匹のうち11匹は、本発明者らのプロトコールに明記されたとおり、その腫瘍が1.3 cmまで成長した時点で安楽死させねばならなかった。対照のうち3個は、このサイズに到達する前に増殖を停止したので、未だ生存している。これらのマウスはB16メラノーマ細胞の注射の際に6ヶ月齢であり、その免疫応答は、これらマウス3匹においてメラノーマを十分に抑えられるほどに強い可能性がある。実験用マウスのうち9匹の1回目の処置から120日目、および残り4匹の1回目の処置から90日目に、これらのマウスは腫瘍非含有のままであった。
重要な問題には、動物に注射された癌細胞ではなく天然の表皮細胞から生じた皮膚腫瘍の応答が必要である。UV誘導メラノーマを背中に有するトランスジェニックマウス2匹が、300パルス、300 ns、40 kV/cmの処置に対して十分に応答したことが、予備試験により示されている。これらのマウスの暗い色素沈着のために、徹照データの入手は不可能であった。しかし、超音波画像および表面画像の両方により、これらのメラノーマの迅速な収縮が示されている(図12)。
「同心型」構成を用いる以外は図2に示すのと同じ、2針システムを使用したメラノーマ処置も成功した。腫瘍に沿って連続的に2針が配置されたメラノーマ腫瘍では、図13に示すとおり24時間の期間内に腫瘍がかなり収縮した。同心型アレイではなく線形アレイの、2つまたはそれ以上からなるユニットの針システムの利点とは、針を腫瘍内部に直接挿入する必要がないという事実であり、したがって、汚染および/または転移の可能性が回避される。
Claims (5)
- パルス発生器を含む、メラノーマ処置用のナノ秒パルス電界(nsPEF)送達装置であって、
該パルス発生器が、少なくとも1 nsPEFをメラノーマ細胞を含む組織に印加するものであり、かつ該少なくとも1 nsPEFのそれぞれが、少なくとも300ナノ秒〜1マイクロ秒以下のパルス持続時間と、少なくとも20 kV/cm〜40 kV/cm以下の電界パルス強度とを有し、
該少なくとも1 nsPEFの印加が、少なくとも100 nsPEFの印加であり、
該少なくとも100 nsPEFの印加が、1回または複数回繰り返される、
装置。 - インサイチューで実施される、請求項1記載の装置。
- 少なくとも100 nsPEFの印加が複数回繰り返される、請求項1または2記載の装置。
- カスパーゼ活性を有意に上昇させることなくメラノーマ細胞を含む組織中の血流を阻害してメラノーマが処置される、請求項1〜3のいずれかに記載の装置。
- 高圧電源、およびnsPEFを標的細胞に導くための手段を有する、請求項1〜4のいずれかに記載の装置。
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