JP7146310B2 - ナノ秒パルスバーストのメガヘルツ圧縮 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本特許は、２０１８年１１月８日に出願された、「ＭＥＧＡＨＥＲＴＺ ＣＯＭＰＲＥＳＳＩＯＮ ＯＦ ＮＡＭＯＳＥＣＯＮＤ ＰＵＬＳＥ ＢＵＲＳＴＳ」と題された米国仮特許出願第６２／７５７，７３９号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
参照による援用
本明細書に記載されているすべての公開物および特許出願は、個々の公開物または特許出願ごとに参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府が後援する研究に関する声明
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ／ＮＩＨＬＢＩ）によって授与された助成金番号Ｒ０１ＨＬ１２８３８１、および空軍科学研究局（ＡＦＯＳＲ）、助成金番号ＦＡ９５５０－１５－１－０５１７の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本明細書に記載の装置および方法は、低電圧（例えば、＜２０Ｖ）および高周波数（例えば、メガヘルツ）で一連のナノ秒電気パルスを印加するための生物学的処置装置および方法に関する。
ナノ秒範囲のパルスを使用した電気処置は、医学、研究、およびバイオテクノロジーで多くの用途を有する。用途には、例えば、細胞および組織の電気刺激および活性化、細胞分化および細胞死の誘導、腫瘍および組織の切除、除細動などが含まれる。通常、ナノ秒範囲の電気パルスを使用する処置は、所望の生体効果のために局所電界閾値を超えるために高電圧を使用する。例えば、所望の生体効果に応じて、単一ナノ秒パルスの閾値は、単一パルスの場合は約数ｋＶ／ｃｍであり得、これは、より短いパルスの場合はより大きくなり得る。例えば、２．５ｋＶ／ｃｍは、２００ｎｓパルスによる心筋細胞の活性化のための典型的な閾値であり、１．８ｋＶ／ｃｍは、３００ｎｓのパルスでＨＥＫ２９３細胞におけるカルシウムトランジェントを誘導するための典型的な閾値であり、６ｋＶ／ｃｍおよび１ｋＶ／ｃｍは、それぞれ６０ｎｓおよび６００ｎｓのパルスによるＣＨＯ細胞の易透化のための典型的な閾値である。さらに、１Ｈｚ～１ｋＨｚの繰り返しレートで複数のナノ秒電気パルスを送達すると、通常は相加的に効果が増加するが、閾値電界を減少させることはなく、またはせいぜい閾値の適度な減少をもたらす（例えば、２～３倍）。
低電圧でナノ秒パルスを使用して所望の生体効果を達成するように電気パルスを提供することが望ましく、これにより、より安全でより低コストの処置が可能になり得る。
従来、サブマイクロ秒の電気療法は、生体効果を引き出すために、通常１～５０ｋＶ／ｃｍ超の高電界を必要とすると考えられていた。本明細書に記載されるように、本発明者らは、著しく低い電界を使用して、パルスが、高速バースト、例えば、最大数ＭＨ、に圧縮されるときに、時間的加算を行うことによってこの要件を克服できることを見出した。強力なナノ秒パルス電界（ｎｓＰＥＦ）を使用するこの技術は、細胞の活性化、ナノエレクトロポレーション、および特に心室心筋細胞や末梢神経線維などの神経を含む細胞の電気的励起、膜エレクトロポレーション、ならびに／または細胞の死滅に使用され得る。サブマイクロ秒の電気バースト（１００～１０００パルス）のメガヘルツ圧縮は、著しく低いエネルギー密度（例えば、約０．０１～０．１５ｋＶ／ｃｍ）での励起を可能にし、および／または以前よりも低いエネルギー密度（例えば、約０．４～０．６ｋＶ／ｃｍ）でのエレクトロポレーションを可能にし得る。いくつかの変形形態では、励起およびエレクトロポレーションの閾値が分離されているため、膜を破壊することなく複数の励起サイクルが実行され得る。エネルギーのこれらのサブマイクロ秒バーストの効率は、例えば、パルス持続時間または繰り返しレートのいずれかを増加させることによって、デューティサイクルとともに増加し得、および／または、例えば、パルス持続時間またはパルス数のいずれかを増加させることによって、「オン」の合計時間を増加させることによって増加し得る。いくつかの変形形態では、電気エネルギーのサブマイクロ秒バーストの効率は、振幅および持続時間がバーストの時間平均振幅および持続時間にほぼ等しい単一の「長い」パルスの効率と一致し得る。高周波数（例えば、５ｋＨｚ以上、１０ｋＨｚ以上、１００ｋＨｚ以上、２００ｋＨｚ以上、５００ｋＨｚ以上、１ＭＨｚ以上など）およびサブマイクロ秒の電気バーストを伴う低電界の使用は、したがって、励起閾値を下げる、および／またはエレクトロポレーションを容易にするための効率的な方法を提供し得る。
したがって、本明細書に記載されるのは、非常に低い電界値（例えば、ターゲット組織で１ｋＶ／ｃｍ未満）であるが、高い周波数（例えば、メガヘルツ）で、サブマイクロ秒範囲のパルス電界を使用して、１つ以上の望ましい生体効果および／または生理学的効果を誘発し得る方法および装置（例えば、システム、デバイスなど）である。
例えば、本明細書に記載されるのは、生体組織のターゲット領域を処置して生体効果を誘発するための方法であり、この方法は、サブマイクロ秒のパルス電界を生体組織に通すことを含み、パルス電界は、生体組織のターゲット領域で１ｋＶ／ｃｍ未満の振幅を有し、パルス電界は、０．１メガヘルツ以上（例えば、０．２ＭＨｚ以上、０．５ＭＨｚ以上、１ＭＨｚ以上など）でパルス状にされる。サブマイクロ秒のパルス電界は、例えば、１０００ｎｓ以下のナノ秒範囲のパルスを含み得る。
生体効果は、電気刺激（例えば、活動電位の誘発、電圧感受性イオンチャネルの活性化、荷電イオンの流入の誘発、１つ以上の細胞の脱分極など）、ポレーション、免疫応答の誘発、細胞を介した物質の転送など、のうちの１つであり得る。
皮膚、肝臓、腎臓、神経、脳、脊椎、肺、筋肉、脂肪、呼吸器、胃腸、膀胱、および生殖のうちのいずれか１つ以上を含む、任意の適切な生体組織をターゲットにすることができる。特に、組織は、癌を含むがこれに限定されない疾患組織であり得る。
また本明細書に記載されるのは、本明細書に記載の方法のいずれかを実行するように構成されている生体組織を処置するための装置（例えば、システム）である。例えば、システムは、コントローラ、生体組織の近くに配置されるように適合された電極のセットを備えるアプリケータ、および１つ以上のパルス発生器を含み得、各パルス発生器は、サブマイクロ秒のパルス（例えば、１０００ｎｓ以下の持続時間を有する）を生成するように構成され、コントローラは、０．１メガヘルツ超の周波数（例えば、０．２ＭＨｚ以上、０．５ＭＨｚ以上、１ＭＨｚ以上など）で一連のサブマイクロ秒パルスを印加するように構成されている。システムは、１ｋＶ／ｃｍ未満、例えば、０．０１～０．１５ｋＶ／ｃｍ、または０．６ｋＶ／ｃｍ未満の電界強度を生成するように構成され得る。アプリケータによって印加される電圧の振幅は、２０Ｖ以下であり得る。コントローラは、複数のパルス発生器を調整して、複数のパルス発生器の各々からのナノ秒パルスを組み合わせるように構成され得る。
例えば、生体組織を処置するためのシステムは、複数のパルス発生器、および１つ以上のプロセッサを備えるコントローラを含み得、コントローラは、１つ以上のプロセッサに、ナノ秒のパルス電界を生体組織に通す動作を実行させるための命令を格納している機械可読有形媒体を含み、パルス電界は、１ｋＶ／ｃｍ未満の振幅を有し、パルス電界は、０．１メガヘルツ以上（例えば、０．２ＭＨｚ以上、０．５ＭＨｚ以上、１ＭＨｚ以上など）でパルス状にされる。
また本明細書に記載されるのは、組織のターゲット領域において生体効果を誘発する方法であり、複数の空間的に分離されたパルス電気エネルギー源が同時に駆動されて、パルス状（例えば、サブマイクロ秒パルス）の電気エネルギーを組織に印加する。例えば、生体組織を処置して生体効果を誘発するための方法は、第１のナノ秒パルス電界をターゲット領域に送達することであって、第１のナノ秒パルス電界の各パルスは、１マイクロ秒以下の持続時間である、送達することと、第１のナノ秒パルス電界と同時に、第２のナノ秒パルス電界をターゲット領域に送達することであって、第２のナノ秒パルス電界の各パルスは、１マイクロ秒以下の持続時間である、送達することと、ターゲット領域に合計パルス電界を形成することであって、合計パルス電界は、第１および第２のナノ秒パルス電界の重ね合わせを含み、かつ１ｋＶ／ｃｍ未満の振幅を有し、合計パルス電界は、０．１メガヘルツ以上（例えば、０．２ＭＨｚ以上、０．５ＭＨｚ以上、１ＭＨｚ以上など）のパルス周波数を有するパルスを含む、形成することと、を含み得る。
また本明細書に記載されるのは、パルス発生器の動作の方法である。いくつかの実施形態では、この方法は、高周波数のサブマイクロ秒のパルス電界を生成することを含み、高周波数のサブマイクロ秒のパルス電界は、１ｋＶ／ｃｍ未満の電界強度、０．１メガヘルツ以上（例えば、０．２ＭＨｚ以上、０．５ＭＨｚ以上、１ＭＨｚ以上など）の周波数を有し、各パルスは、１０００ｎｓ未満の持続時間を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のパルス発生器の動作の方法は、第１のナノ秒パルス電界を送達することであって、各パルスは持続時間が１マイクロ秒未満である、送達することと、第１のナノ秒パルス電界と同時に、第２のナノ秒パルス電界を送達することであって、各パルスは持続時間が１マイクロ秒未満である、送達することと、第１および第２のパルス電界を合計して、１ｋＶ／ｃｍ未満の電界強度および０．１ＭＨｚ以上（例えば、０．５ＭＨｚ以上、１ＭＨｚ以上など）の周波数を有する第１および第２のサブマイクロ秒パルス電界の重ね合わせを含む、高周波数のサブマイクロ秒パルス電界を送達することと、を含む。
これらの方法のいずれかにおいて、第１および第２のナノ秒パルス電界のうちの少なくとも１つは、バイポーラパルスを含み得（および好ましくは両方とも）、これは、放出された電界の供給源（例えば、電極、アンテナなど）の近くの効果を低減し得る。
また本明細書に記載されるのは、生体組織を処置するためのシステムであって、それは、複数のパルス発生器と、１つ以上のプロセッサを備えるコントローラとを含み、コントローラは、１つ以上のプロセッサに第１のナノ秒パルス電界を生体組織を通してターゲット領域に通過させることであって、第１のナノ秒パルス電界の各パルスは、持続時間が１０００ｎｓ以下である、通過させることと、第１のナノ秒パルス電界と同時に、第２のナノ秒パルス電界を生体組織を通してターゲット領域に通過させることであって、第２のナノ秒パルス電界の各パルスは、持続時間が１０００ｎｓ以下である、通過させることと、ターゲット領域に合計パルス電界を形成することであって、合計パルス電界は、第１および第２のナノ秒パルス電界の重ね合わせを含み、１ｋＶ／ｃｍ未満の振幅を有し、合計パルス電界は、０．１メガヘルツ以上のパルス周波数を有するモノポーラパルスを含み、さらに各パルスの持続時間が１０００ｎｓ以下である、形成することと、の動作を実行させるための命令を格納している機械可読有形媒体を含む。
本発明の新規の特徴は、以下の特許請求の範囲に具体的に記載されている。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、およびその添付の図面を参照することによって得られるであろう。
本明細書に記載のサブマイクロ秒（例えば、ナノ秒）の電気パルス列の例であり、低いピーク電圧（例えば、２０Ｖ未満）、およびパルス間の高周波数（例えば、メガヘルツ）を有する（例えば、連続するナノ秒パルス間に通常５００ｎｓ未満の間隔を有する）。本明細書に記載の方法および装置は、サブマイクロ秒パルスに言及し、これは、概して、約１マイクロ秒以下の持続時間を有するパルスを含むが、いくつかの変形形態では、１０μｓ以下（例えば、１００００ｎｓ以下）のパルスを含み得る。例えば、いくつかの用途では、サブマイクロ秒パルスは各々、０．１ｎｓ～１０００ｎｓ（例えば、５０～５００ｎｓ、１００～４００ｎｓなど）である場合がある。 例えば、パルス間に１００μｓの間隔を有する、周波数１０ｋＨｚで１００ｎｓのパルス列（下）を示す例である。各パルスは、任意の単位で上のトレースに示されている細胞の膜内外電位差の増加と放電とを誘発し、この例では、細胞は、８μｓの放電時間を有する。閾値レベルは、上部の破線によって示されている。 図２Ａと同様であるが、周波数２００ｋＨｚ、または各パルス間は５μｓでパルス化している。 図２Ａおよび図２Ｂと同様であるが、周波数１ＭＨｚ、または各パルス間は１μｓでパルスしている。示されているように、この周波数では、細胞膜は次のナノ秒パルスの前に完全に放電せず、その結果、膜電位は、わずか数パルス後に閾値（閾値１）を超え、追加のパルス後に第２の閾値（閾値２）を超え始めている。 低エネルギー（例えば、低電界）および高周波数（例えば、メガヘルツ範囲）でナノ秒範囲の電気パルスを印加するための装置の一例の概略図である。例えば、装置は、電源を制御するコントローラと、約０．１ｎｓ～１０００ｎｓのパルス幅、０．１Ｖ～２０Ｖの振幅、および０．１ＭＨｚ～３０ＭＨｚの周波数を有するパルスを印加するように構成された１つ以上のナノ秒パルス発生器とを含むように構成され得る。 図３に示されるようなデバイス用のパルス発生器の回路図の一例を図示する。 １０００ｎｓ未満に分離された（例えば、０．１ＭＨｚ以上の周波数を有する）ナノ秒パルスの列を送達するためにコントローラによって制御され得る複数のパルス発生器を含む、低電界および高周波数（例えば、メガヘルツ）でナノ秒電気パルスを印加するための装置の概略図の例である。 図４Ｂに示されるようなデバイスによって形成されるナノ秒の列の例であり、図４Ｃでは、（図４Ｂからの）パルス発生器が、パルス列内の各パルスの生成を担うことが示されている。 低電界および高周波数（例えば、メガヘルツ）でナノ秒パルスを生成するように構成されたパルス発生装置の別の例である。図５では、パルス発生器を使用して、バイポーラパルスを生成することができる。 メガヘルツ範囲の低電圧で（例えば、異なるアプリケータおよび／または均一なアプリケータの異なる電極から）空間的に分離されたナノ秒パルスの印加を制御および／または調整するように構成されたパルス発生装置（例えば、システム）の別の変形形態の概略図である。このアプリケータは、本明細書に記載されているように、バイポーラナノ秒パルス化で特に有用であり得る。 低電界およびメガヘルツ周波数でナノ秒パルスを細胞に印加するための実験用セットアップの例である。図７のセットアップはまた、細胞の画像化を可能にする。 低電界（例えば、８５Ｖ／ｃｍ）およびメガヘルツ周波数（例えば、３．３３ＭＨｚ）でのナノ秒パルスによるマウス心室心筋細胞の励起の例を図示する。図８Ａでは、３．３３ＭＨｚで２００ｎｓパルスのパルス列（パルス間で１００ｎｓ分離している）が１０秒で印加された。図８Ａは、カルシウム活性化（Ｆｌｕｏ－４色素放出、左の列）および結果として生じる細胞収縮（ＤＩＣ、右の列）のタイムラプス記録を示す。画像は上から下まで０．２４秒間隔で撮影された。同じ実験で撮影された次の画像（最大４８秒、図示せず）は、追加の変更を明らかにしていない。バーストパラメータおよびバースト送達の開始（矢印）が示されている。 低電界（例えば、１５０Ｖ／ｃｍ）およびメガヘルツ周波数（例えば、３．３３ＭＨｚ）でナノ秒の電気パルスを印加することによる不可逆的な細胞損傷（例えば、細胞のポレーション、細胞死の誘発）の例を図示する。図８Ｂでは、ナノ秒の電気パルスの列がマウス心室細胞に印加され、２００ｎｓパルスのパルス列が、１０秒の時点で３．３３ＭＨｚ（パルス間で１００ｎｓ分離している）で印加された。図８Ｂは、より高い振幅バーストに起因する不可逆的な細胞膜損傷および細胞再成形の選択されたタイムラプスを示す。画像の各ペアが撮影された時間が、図の右側に示されている。 １６０～３４０Ｖ／ｃｍで１０００ナノ秒のパルス（例えば、３．３３ＭＨｚ、２００ｎｓ幅）のバーストによる心室心筋細胞の反復励起の効果を図示する。励起は、縦線によって示された時間に印加された。励起により、細胞質ゾルのカルシウム濃度が急上昇し、Ｆｌｕｏ－４色素を使用して画像化された。励起の第１の閾値は１６０Ｖ／ｃｍで達し、カルシウムの非破壊的な流入をもたらした。４００Ｖ／ｃｍより上で、細胞破壊が発生した。１００Ｖ／ｃｍでの同じバーストは、効果を引き起こさなかったが、４００Ｖ／ｃｍでは、励起に続いて長引くＣａ２＋の増加があった（細胞膜へのエレクトロポレーション的損傷の兆候）。 図９に示したものと同様の心室心筋細胞の反復励起を示す別の例である。励起の閾値はわずかに異なるが、同様の効果が見られる。 図１１Ａは、１０００ナノ秒のパルス（３．３３ＭＨｚ、２００ｎｓ幅のパルス）の列（例えば、バースト）に曝されたマウス心室心筋細胞における励起、可能なエレクトロポレーション、および明確なエレクトロポレーションの閾値電界を示す棒グラフである。励起は、Ｆｌｕｏ－４色素で画像化された細胞質ゾルＣａ２＋濃度における短いスパイクによって証明された。刺激後の低振幅の自発的Ｃａ２＋変動の出現は、エレクトロポレーション的膜破壊（「おそらくエレクトロポレーション」）の可能性のある兆候と見なされた。観察の４０秒以内に静止レベルに戻らないＣａ２＋の制御されない増加（図９の下部のトレースなど）は、エレクトロポレーションの証拠と見なされた。図１１Ｂ－１１Ｅは、ＦｌｕｏＶｏｌｔ色素で測定した単離された心室心筋細胞（ＶＣＭ）の活動電位閾値を図示する。図１１Ｂは、すべて１００ｎｓの間隔を有する、１００ｎｓ、２００ｎｓ、または４００ｎｓのパルスのバーストに対するパルス数の効果を示すグラフであり、パルス数を増やすと、すべての持続時間について同様に閾値が減少したことを示している。図１１Ｃは、「オン」の合計時間に対してプロットされた閾値がパルス持続時間に依存しなかったことを示すグラフである。図１１Ｄは、より低い時間平均電界でのより短い高周波数、サブマイクロ秒、低電界パルス励起ＶＣＭのバーストを示すグラフである。図１１Ｂ～図１１Ｄのすべてについて、平均±ｓ．ｅ．、ｎ＝６～１０。図１１Ｅは、持続時間が５０～６００ｎｓの１０００パルスのバーストについて、図１１Ｄと同じ結果を示すグラフである。パルス間間隔は、０．０９から４．８μｓまで変化させた。平均±ｓ．ｅ．、ｎ＝２５～３０。 ＣＨＯ細胞に２ＭＨｚのナノ秒パルス列を印加した場合の効果をまとめたグラフ（この例では、ナノ秒パルスは５８０Ｖ／ｃｍで３００ｎｓの持続時間である）。エラーバーを含めて、調べた８つの細胞すべての平均値を示す線が含まれている。図１２Ａは、３００ｎｓのパルスの圧縮された列（例えば、バースト）によるＣＨＯ細胞のエレクトロポレーション、具体的には、バースト後の８つのＣＨＯ細胞の代表的なグループにおける細胞質ゾルＣａ ２＋応答の時間経過を示す（矢印）。黒の実線は個々の細胞からのデータであり、点のある曲線はそれらの平均値＋／－ｓ．ｅ．である。 図１２Ａに示されるのと同じデータに基づく、ナノ秒パルスの印加後の経時的なＣＨＯ細胞のエレクトロポレーション（左がＤＩＣ画像、右がＦｌｕｏ－４発光）を図示する。この図は、示された時点での同じ細胞の代表的なＤＩＣ（左側）およびＦｌｕｏ－４発光（右側）の画像を示す。 バイポーラキャンセルを図示する。図１３（下部）は、ＣＨＯ細胞におけるバイポーラおよびユニポーラナノ秒パルスによるＣａ２＋活性化を示す（平均＋／－ｓ．ｅ．、ｎ＝２０～２８）。図１３の上部は、バイポーラおよび単相のパルス形状および振幅を示す。 オフセットおよびオーバーラップするバイポーラナノ秒パルス列（例えば、バースト）のメガヘルツ圧縮を図示し、これは、高周波数（例えば、メガヘルツ）の２つのバイポーラナノ秒パルス列を、高周波数（例えば、メガヘルツ）のユニポーラ電気ナノ秒パルス列に重ね合わせることによって遠隔刺激を提供し得る。このアプローチは、矩形列バイポーラパルスおよび刺激電極の線形アレイについて図示されている。２対の独立した接地絶縁電極（ａ－ａ’およびｂ－ｂ’）は、右側に示すように、２つの同期したナノ秒のバイポーラ電気パルス列を送達する。ナノ秒バイポーラパルスの各々は、少なくとも部分的なバイポーラキャンセルのために電気刺激に対して本質的に非効率的であるが、オーバーラップするターゲット領域（ｃ－ｃ’）でのそれらの重ね合わせは、示されるように、ａ－ａ’とｂ－ｂ’との間でパルス列の周波数を調整することによって高周波数（例えば、メガヘルツレート）で局所的に生物学的に有効なナノ秒ユニポーラパルス列を形成する。ｃ－ｃ’エリアにおけるユニポーラナノ秒パルス列の形成は、電極ａ－ａ’およびｂ－ｂ’の間に印加されるエネルギーのタイミングおよび振幅を制御することによって達成され得る。バイポーラキャンセルは、電極付近のパルス電界の効果を低減することがあるため、電極またはその近くに関連していること、遠隔ターゲット領域では、モノポーラ場は、オーバーラップするターゲット領域において非常に高速な（例えば、メガヘルツ）パルシングを使用するときに、電荷の蓄積に起因する閾値の低下から恩恵を受けることがあることに留意されたい。 図１４Ａと同様であるが、ターゲット領域ｃ－ｃ’で組み合わされるパルス列（例えば、サブマイクロ秒のパルス列）の使用を図示する。 一実施形態によるＣＡＮＣＡＮの概念を図示する概略図を示す。上部：Ａ－Ａ’およびＢ－Ｂ’は２つの独立した電極の対である。ＡとＢとの間の線は、電極の各対から電界が送達されるエリアを表し、領域Ｃ－Ｃ’で互いに重なり合って無効になっている。下部：電極の各対は、それ自体が生物学的に非効率的な減衰正弦波（ＤＳＷ）を送達する。Ｂ－Ｂ’からのＤＳＷが位相シフトされると、２つのＤＳＷがＣ－Ｃ’エリアで生物学的に有効なユニポーラパルスに重なる。この領域では、「キャンセルのキャンセル」またはＣＡＮＣＡＮがある。 図１５Ａと同様であるが、ターゲット領域ｃ－ｃ’で組み合わされるパルス列（例えば、サブマイクロ秒のパルス列）の使用を図示する。 ６０％のデューティサイクルで印加されたパルス電気エネルギーの例を示す。 ３４０ｎｓパルス、５または１００パルス／バーストのバーストによる励起の閾値に対するパルス繰り返しレートの効果を示すグラフである。 示されたサブマイクロ秒のパルス持続時間とは無関係に、閾値時間平均電界がバースト持続時間とともに減少することを図示するグラフである（この例では、１１～１８ｎｓが最短設定の持続時間範囲である）。 示された持続時間の単一パルスおよび高周波数、サブマイクロ秒、低電界バーストの励起閾値の比較を示す棒グラフである。図１６Ｂ～図１６Ｄにおいて、平均±ｓ．ｅ．、ｎ＝５～９、および単離されたカエル坐骨神経を使用して収集されたデータ。 図１７Ａ－１７Ｆは、Ｃａ２＋取り込みまたはＹＯ－ＰＲＯ－１色素取り込みによって証明された高周波数、サブマイクロ秒、低電界バーストによるＣＨＯおよびＨＥＫ細胞のエレクトロポレーションの一例を図示する。図１７Ａは、（ＣＨＯ細胞において）１００パルス、４００ｎｓのバーストが０．１～０．３ＭＨｚを超えるとますます効率的になることを示すグラフである。ラベルは、電界をｋＶ／ｃｍで示し、データポイントあたり２０～３０細胞。図１７Ｂは、示されたデューティサイクル（矢印）で５００ｎｓ、０．６４ｋＶ／ｃｍの１０００パルスによって誘発された、（ＨＥＫ細胞における）ＹＯ－ＰＲＯ－１取り込みの時間経過を示すグラフである。図１７Ｃは、繰り返しレートに対してプロットされた図１７Ｂからの最後のデータポイントを示すグラフであり、１ＭＨｚ未満では効果がないことを示している。図１７Ｄは、ＨＥＫ細胞において同じバースト（矢印）によって誘発された、Ｃａ２＋トランジェントを示すグラフである。図１７Ｅは、示された電界で１つの５００μｓパルスによって誘発された同様のＣａ２＋トランジェントを示すグラフである。図１７Ｆは、単一の５００μｓパルスの電界に対して（および高周波数、サブマイクロ秒、低電界バーストのデューティサイクルに対して）プロットされた図１７Ｄおよび図１７ＥのグラフからＣａ２＋トランジェントの最大振幅を示す。すべてのパネルについて、平均±ｓ．ｅ．、ｎ＝１１～２７。ＨＥＫ細胞は、低コンダクタンス溶液において刺激された。 図１８Ａ－１８Ｄは、高周波数、サブマイクロ秒、低電界バーストに２４時間暴露した後のＥＬ－４細胞の生存率を図示するグラフである。図１８Ａは、エレクトロポレーションキュベットに送達される高周波数、サブマイクロ秒、低電界パルスの形状を図示する。破線は、時間平均振幅を示す。図１８Ｂは、約１．９ｋＶ／ｃｍの低電界に対する１００Ｈｚおよび３ＭＨｚバーストのパルス数の効果を図示する。図１８Ｃは、５ｋＶ／ｃｍの高電界に対して同じ依存性を示すグラフである。図１８Ｄは、示されたパラメータでの高周波数、サブマイクロ秒、低電界バーストが細胞の約５０％を殺すのに対し、単一パルス（その持続時間はバースト持続時間に等しく、振幅はバーストの平均に等しい）の効果は小さいことを図示する棒グラフである。平均±ｓ．ｅ．、ｎ＝５～６。＊ｐ＜０．０００１、ｔ検定。
本明細書に記載されているのは、０．１メガヘルツ以上（ＭＨｚ）の周波数でサブマイクロ秒（例えば、ナノ秒）範囲の電気パルスを使用して１つ以上の望ましい生体効果よび／または生理学的効果を誘発し得る方法および装置（システム、デバイスなど）であり、これは、他の技術と比較して実質的により低い電界の使用を可能にし得る。便宜上、本開示によるこの電気パルシングは、メガヘルツ圧縮、ナノ秒パルスのメガヘルツ圧縮、またはナノ秒パルス列（例えば、バースト）のメガヘルツ圧縮と呼ばれる場合がある。通常、非常に短く、高強度のパルス（例えば、高電界、典型的には１ｋＶ／ｃｍよりはるかに大きい）を指す従来のナノ秒パルス電界処置とは異なり、ナノ秒パルスのメガヘルツ圧縮は、はるかに低い強度を使用し得、例えば、５～１０倍以上の減少となる。例えば、ナノ秒パルスのメガヘルツ圧縮は、１ｋＶ／ｃｍ未満（例えば、９００Ｖ／ｃｍ未満、８００Ｖ／ｃｍ未満、７５０Ｖ／ｃｍ未満、７００Ｖ／ｃｍ未満、６００Ｖ／ｃｍ未満、５００Ｖ／ｃｍ未満など）である非常に低い電界値を使用し得（例えば、ターゲット部位で）、これは、ナノ秒電気パルスを非常に速いレートで、例えば、メガヘルツ（ＭＨｚ）の範囲で印加することによって可能になる。メガヘルツの範囲には、０．１ＭＨｚ以上（例えば、０．２ＭＨｚ以上、０．４ＭＨｚ以上、０．５ＭＨｚ以上、０．７ＭＨｚ以上、１ＭＨｚ以上など）が含まれ得る。驚くべきことに、本明細書に記載の装置および方法は、ナノ秒電気パルスの生物学的効率をもたらし、非常に低い電界値で、具体的には、以前は効果がないと考えられていた電界値で、生体効果を誘導することが示されている。本明細書に記載の装置は、例えば、典型的には、１マイクロ秒以下（例えば、約９００ｎｓ未満、約８００ｎｓ未満、約７００ｎｓ未満、約６００ｎｓ未満、約５００ｎｓ未満、４５０ｎｓ未満、４００ｎｓ未満、３５０ｎｓ未満、３００ｎｓ未満など）である、連続するナノ秒電気パルス間の間隔を有する、メガヘルツ範囲の低振幅ナノ秒電気パルスのパルス列（例えば、バースト）を送達するように特に構成されている。
上記のように、従来の高強度、サブマイクロ秒パルシングは、短いパルス持続時間で電界（ＥＦ）閾値を超えるために、高パルス電圧に制限されていた（例えば、サブマイクロ秒パルシングを印加する場合）。この閾値は、パルスが短くなると数十ｋＶ／ｃｍまで増加する。ナノ秒範囲内の神経刺激の強度－持続時間曲線は、通常、１００ｎｓおよび１ｎｓのパルスに対してそれぞれ約１～２４０ｋＶ／ｃｍの閾値を必要とする。例えば、単一の高強度、サブマイクロ秒のパルス電界刺激について報告された閾値には、１．４～２．４ｋＶ／ｃｍ（例えば、２００ｎｓパルスによる心筋細胞の活性化の場合）、１．８ｋＶ／ｃｍ超（例えば、３００ｎｓパルスでＨＥＫ２９３細胞にカルシウムトランジェントを誘導する場合）、６ｋＶ／ｃｍ～１ｋＶ／ｃｍ（例えば、６０ｎｓおよび６００ｎｓパルスによるＣＨＯ細胞の易透化の場合）が含まれる。したがって、これらの閾値に到達するために必要なパルス電圧は法外に高いと長い間信じられてきた。例えば、２ｃｍのギャップを有する２つの平行平板電極間の腫瘍を切除するために１０ｋＶ／ｃｍを達成するには、通常、電極に２０ｋＶを印加する必要がある。このような電圧は、ほとんどのパルス発生器の能力を超えており、高電圧の危険を提示し得る。本明細書に記載の方法および装置は、これらの問題を回避し得る。
例えば、本明細書に記載の方法および装置は、同等または優れた効果を提供しながら、より低い電界強度を使用し得る。例えば、本明細書に記載の方法および装置は、多様な細胞および組織タイプの非化学的活性化を引き起こし、高用量では、壊死および／またはアポトーシス経路による高度に選択的な細胞殺傷をもたらすために、例えば、イオン選択性ナノポアの活性化（例えば、興奮性細胞と非興奮性細胞の両方での細胞質ゾルＣａ２＋の動員、および細胞膜の内向き整流性およびイオン選択性安定ナノポアの開放）を含む神経筋刺激のために、高強度、サブマイクロ秒パルスの電界が効果的に使用されることが以前に示された場所に使用され得る。したがって、本明細書に記載の方法および装置はまた、除細動、末梢神経および脳深部刺激、ならびに組織または細胞の切除（例えば、癌の切除）にも使用され得る。
複数の刺激を送達すると、ターゲット細胞の膜に段階的な電圧が蓄積し、パルス間間隔が、誘導された膜内外電位差の緩和よりも短い場合、最終的に励起またはエレクトロポレーションの閾値に達する結果になり得る。哺乳類細胞の充電時定数は、通常０．１～１μｓである。時間的加算は、３～５時定数（連続パルス間で９５および９９％の放電に対応）よりも小さいパルス間間隔でのみ期待でき、これは、数十ｋＨｚから１ＭＨｚを超える繰り返しレートに変換される。本明細書に記載されるように、１Ｈｚ～５ｋＨｚの繰り返しレートで複数のサブマイクロ秒パルス電気エネルギーを送達することは、単一パルスよりも強い効果を引き起こし得るが、閾値を下げることはないか、または閾値を適度に下げるかのどちらかである。
例えば、本明細書に記載されているのは、例えば、１０～１５０Ｖ／ｃｍの電界レベルでの励起およびエレクトロポレーションを容易にするサブマイクロ秒の電気パルスバーストのＭＨｚ圧縮である。記載したように、効率はパルスおよびバーストのパラメータに依存し得、これも従来の（「長い」）サブマイクロ秒の電気刺激とは異なる。
図１は、低電圧（または低電気密度、Ｖ／ｃｍ）および高周波数、例えば、メガヘルツ、で印加されたナノ秒パルス列（例えば、ナノ秒電気パルス列）の一例を図示する。図１において、パルス列は、各々がナノ秒範囲１０８以内の持続時間（例えば、持続時間約０．１ｎｓ～１０００ｎｓ、例えば、約０．１ｎｓ～約９５０ｎｓ、約１ｎｓ～約９００ｎｓ、約１ｎｓ～約８００ｎｓ、約１ｎｓ～約７５０ｎｓ、約１ｎｓ～約７００ｎｓ、約１ｎｓ～約６００ｎｓ、約１０００ｎｓ未満、約９００ｎｓ未満、約８００ｎｓ未満、約７５０ｎｓ未満、約６００ｎｓ未満、約５００ｎｓ未満など）を有する複数のナノ秒パルス１０１を含み得る。ナノ秒パルスは、約１０００ｎｓ未満、約９００ｎｓ未満、約８００ｎｓ未満、約７５０ｎｓ未満、約７００ｎｓ未満、約６００ｎｓ未満、約５００ｎｓ未満など、のパルス間隔１０６によって分離され得る。このため、ナノ秒電気パルスの周波数は、約０．１ＭＨｚ～約５０ＭＨｚ、約０．１ＭＨｚ～約４０ＭＨｚ、約０．１ＭＨｚ～約３０ＭＨｚ、約０．１ＭＨｚ～約２５ＭＨｚ、約０．１ＭＨｚ～約２０ＭＨｚ、約１ＭＨｚ～約５０ＭＨｚ、約１ＭＨｚ～約４０ＭＨｚ、約１ＭＨｚ～約３０ＭＨｚ、約１ＭＨｚ～約２５ＭＨｚ、約１ＭＨｚ～約２０ＭＨｚ、０．１ＭＨｚ超、０．２ＭＨｚ超、０．５ＭＨｚ超、０．１ＭＨｚ超、１．５ＭＨｚ超、２ＭＨｚ超、２．５ＭＨｚ超など、メガヘルツの範囲にあり得る。
図１に示されるようなパルス列のナノ秒パルスによって印加されるエネルギーは、比較的低くてもよい。例えば、各ナノ秒パルスによって印加されるピーク電圧は、約５００Ｖ未満、約１００Ｖ未満、約５０Ｖ未満、約４０Ｖ未満、約３０Ｖ未満、約２５Ｖ未満、約２０Ｖ未満、約０．５Ｖ～５０Ｖ、約１Ｖ～２５Ｖなどであり得る。同様に、印加されたナノ秒パルスの結果として生じる電界（例えば、組織での）は、例えば、約１０００Ｖ／ｃｍ未満、約９００Ｖ／ｃｍ未満、約８００Ｖ／ｃｍ未満、約７００Ｖ／ｃｍ未満、約６００Ｖ／ｃｍ未満、約５５０Ｖ／ｃｍ未満、約１Ｖ／ｃｍ～約１０００Ｖ／ｃｍ、約１０Ｖ／ｃｍ～約９００Ｖ／ｃｍなどであり得る。
一般に、ナノ秒パルスのメガヘルツ圧縮は、直接または間接的に生体細胞および／または組織に印加され得る。例えば、印加は、１つ以上の組織貫通電極を介して、および／または表面電極を介して、患者の体内に行われ得る。いくつかの変形形態では、ナノ秒パルスのメガヘルツ圧縮を使用する電気刺激が、単離された細胞および／または単離された組織に印加され得る。
特定の作用理論によって拘束されることなく、ナノ秒パルスのメガヘルツ圧縮を使用するナノ秒パルスの印加は、印加された電気エネルギーがターゲット細胞または細胞領域に蓄積することを可能にし得、複数の小振幅（例えば、約５００Ｖ未満、約１００Ｖ未満、約５０Ｖ未満、約４０Ｖ未満、約３０Ｖ未満、約２０Ｖ未満、約０．１Ｖ～５０Ｖ、約１Ｖ～３０Ｖ、約１Ｖ～２０Ｖなど）パルスを合計して、生体効果の閾値を超えるレベルにすることを可能にする。例えば、生細胞の有効放電時間よりも短い周波数でメガヘルツ範囲で印加されるナノ秒電気パルスは、所望の効果のための閾値を超えるまで電荷を合計する結果となり得る。異なる哺乳動物細胞の場合、細胞（例えば、細胞膜）の放電時定数（τ）は、通常、小さい細胞の場合の約１００ｎｓから大きい細胞の場合の約１マイクロ秒まで変化し（そして、組織内に密に詰まった細胞の場合はさらに長くなることがあり）、したがって、放電持続時間が１τ、２τ、３τ、および４τに等しい場合、誘導膜電位はそれぞれ約３７％、１５％、および５％、２％に減少する。ナノ秒電気パルスが放電速度よりも速い速度でパルス列に印加される場合（例えば、膜が完全に放電されていない場合）、誘導電位が、残りの電位の上に加わり得ることが可能である。複数のパルスがすべて十分に短いパルス間間隔で印加されると、誘導膜電位は徐々に上昇し、閾値電位を超えて生体効果を誘導することができる。例えば、図２Ａ～図２Ｃを参照。例えば、誘導電位の時間的合計を可能にするために、４τがパルス間の最長の時間間隔であると仮定すると、パルス間間隔は、小さい細胞の場合は４００ｎｓ、大きい細胞の場合は２，５００ｎｓを超えることはない（不規則な形状を有するさらに大きな細胞の場合は、おそらく最大１０，０００）。より短いパルス間間隔は、閾値膜内外電位差のより速い蓄積を可能にし得る。実際には、これは、ナノ秒電気パルス列を圧縮して、０．１～２ＭＨｚの高い繰り返しレートで刺激を送達し得ることを意味し、これよりさらに高いレート（最大１，０００ＭＨｚ）を用いると、より短いナノ秒電気パルスおよびより小さな細胞の振幅閾値をさらに下げるのに役立つ。
図２Ａの例では、ナノ秒パルスが、１０ｋＨｚの周波数のパルス列で細胞または組織に印加される（例えば、各パルス間で約１００μｓ分離されている）。下部のトレースに示すように、個々のパルスの持続時間は１０ｎｓである。上部のトレースは、各パルスの結果として課せられた膜電位（任意の単位）を示す。この例の組織または細胞の場合、放電時間は約８μｓである。水平の破線２０３は、生体効果（例えば、刺激、ポレーションなど）の最小閾値を表し、これは、膜（外側の細胞膜および／または１つ以上の内側の細胞膜を含み得る）の電位が閾値に達したときにトリガーされ得る。組織または細胞は、異なるまたは増加する効果に対応する複数の閾値を有する場合がある。
図２Ｂおよび図２Ｃは、ナノ秒パルスバーストのメガヘルツ圧縮を図示し、メガヘルツ圧縮が、パルス振幅を増加させることなく、細胞または組織が生体効果の１つ以上の閾値に到達し、それを超えることを可能にすることを示す。例えば、図２Ｂでは、各１００ｎｓパルス（下部のトレース）が、膜内外電位差（上部のトレース、任意の単位）を誘導する。エネルギーはパルス間間隔ほど速く放電されないため、示されるように、ナノ秒パルスの継続的な印加により、課せられた膜電位が閾値２０３を超えるまで、エネルギーは蓄積し、これは、対応する生物効果をもたらし得る。図２Ｂでは、わずかに高いレート（例えば、各パルス間が約５μｓの１００ｎｓパルス）が、何らかの生体効果を誘導し得る低い閾値２０３に到達するのを助けるより少ない時間的合計をもたらす。図２Ｃでは、高い繰り返しレート（例えば、１ＭＨｚ、パルス間が１μｓ）が適用されるとき、課せられた膜電位は、より速く蓄積し、はるかに高い閾値２０５に到達し得る。
ナノ秒パルスのメガヘルツ圧縮を適用するためのシステム
図３～図５は、ナノ秒パルスのメガヘルツ圧縮を提供するために使用され得るシステムの例を図示する。例えば、図３は、ナノ秒パルスのメガヘルツ圧縮を使用してナノ秒パルシングを適用するためのシステム３０１の一例の概略図である。図３において、システムは、少なくともコントローラ３０３、１つ以上のパルス発生器３０５、電源、および１つ以上のアプリケータ３０９を含み得る。システムは携帯型であり得、電源は、電池および／または壁電源（例えば、コンセント）から電力を受け取る電力調節回路を含み得る。電池は、充電式であってもよい。システムは、少なくとも部分的に囲まれていてもよい。いくつかの変形形態では、アプリケータは、１つ以上のケーブルを介して接続され得る。あるいは、アプリケータは、コンパクトなハンドヘルド構成でシステムの残りの部分と統合されてもよい。
コントローラは、周波数がメガヘルツ範囲（例えば、約０．９ＭＨｚ～１００ＭＨｚ）にあるように、個々のパルスが固定または調整可能なパルス間間隔によって分離される、固定または調整可能なナノ秒パルス列を印加するように構成され得る。パルス間間隔は、約１０００ｎｓ～５０ｎｓ、約１０００ｎｓ～７５ｎｓ、約１０００ｎｓ～８０ｎｓ、約１０００ｎｓ～９０ｎｓ、約１０００ｎｓ～１００ｎｓなどのように、例えば、１２００ｎｓ～５０ｎｓ（例えば、メガヘルツ周波数範囲内）であり得る。いくつかの変形形態では、コントローラは、印加される刺激をこの周波数範囲内に制限するように構成または適合され、いくつかの変形形態では、装置は、ユーザがこのメガヘルツ範囲内で適用される周波数／パルス間間隔を調整することを可能にするように、コントローラと通信する１つ以上のユーザ入力（ノブ、ダイヤル、タッチスクリーンなど）を含み得る。代替的または追加的に、コントローラは、ユーザが、パルスの数、パルスが印加される持続時間、および／または印加される電圧を調整することを可能にするように構成され得る。印加される電圧は、典型的には、所定の範囲内であり得る（例えば、約０．１Ｖ～約５０Ｖ、約０．１Ｖ～４０Ｖ、約０．５Ｖ～３０Ｖ、約１Ｖ～約２０Ｖ、約５０未満、約４０Ｖ未満、約３０Ｖ未満、約２５Ｖ未満、約２０Ｖ未満などの電圧振幅）。いくつかの変形形態では、電界の強度は、選択され得る（例えば、約１Ｖ／ｃｍ～約９００Ｖ／ｃｍ、約１Ｖ／ｃｍ～約８００Ｖ／ｃｍ、約１０Ｖ／ｃｍ～約７５０Ｖ／ｃｍ、約１０Ｖ／ｃｍ～約７００Ｖ／ｃｍ、約５０Ｖ／ｃｍ～約６５０Ｖ／ｃｍ、１０００Ｖ／ｃｍ未満、９００Ｖ／ｃｍ未満、８００Ｖ／ｃｍ未満、７５０Ｖ／ｃｍ未満、７００Ｖ／ｃｍ未満、６００Ｖ／ｃｍ未満、５００Ｖ／ｃｍ未満など）。これらの範囲のいずれも、低電圧範囲内と見なされ得る。述べたように、いくつかの変形形態では、コントローラは、ユーザ（例えば、医師、外科医、技師など）が、本明細書に記載の範囲のいずれかを含む、所定の値のセットまたは範囲から選択することを可能にし得る。いくつかの変形形態では、ユーザは、パルス数、パルス持続時間（ナノ秒範囲内）、パルス振幅（例えば、所定の低電圧範囲内のピーク電圧）、パルス間間隔、および／または周波数（例えば、メガヘルツ範囲内）などのうちの１つ以上のプリセット値を提供され得る。いくつかの変形形態では、装置は、プリセットされ得るか、または適切なパラメータを自動的に選択し得、ユーザは、開始もしくは停止のみを選択し得るか、または限られた数のパラメータ状態から選択し得る。
コントローラは、システムの動作を制御すること、および／またはユーザから制御入力を受け取ることを可能にするために、ハードウェア、ソフトウェア、および／またはファームウェアを含み得る。例えば、コントローラは、１つ以上のプロセッサ、１つ以上のタイミング回路、１つ以上のメモリなどを含む回路を含み得る。述べたように、システムは、１つ以上の入力（例えば、制御）を含み得、および／または別のデバイスからの入力（例えば、有線または無線接続を介して）を受け取り得る。システムは、デバイス動作のインジケータ（例えば、準備完了、スタンバイなど）および／または設定（パルス数、周波数、電圧振幅など）を含む、１つ以上の出力（例えば、モニター、ディスプレイ、ＬＥＤなど）を含み得る。
述べたように、本明細書に記載のシステムのいずれかは、１つ以上のアプリケータを含み得る。アプリケータは、電極のアレイを含む２つ以上の電極を含み得る。電極は、組織貫通型または非組織貫通型であり得る。例えば、組織貫通電極は針電極であり得、非組織貫通型は、１つ以上の表面電極であり得る。
本明細書に記載の装置のいずれかにおいて、コントローラは、図３に示すように、１つ以上（例えば、複数）のパルス発生器の起動を調整し得る。ｎ個のパルス発生器の各々は、調整された時間にナノ秒パルスを印加するように構成され得、これらのパルスは、単一の刺激に組み合わされ得る。個々のプリーズ発生器は、上記のような低電圧範囲内のピーク電圧で、ナノ秒範囲（例えば、約０．１ｎｓ～約１０００ｎｓ）のパルス持続時間を有するパルスを送達するように構成され得る。図３は複数のパルス発生器を図示しているが、様々な用途では１つのパルス発生器のみが使用されてもよいことを理解されたい。
例えば、図４Ａは、使用され得るパルス発生器回路の例を概略的に図示する。図４Ａでは、回路４００は、Ｎ型（ｎチャネル）ＭＯＳＦＥＴスイッチ（Ｍ１）によって切り替えられるプリチャージコンデンサ（Ｃ１）を含む。スイッチは、１つ以上の低電圧ＭＯＳＦＥＴドライバによってトリガーされ得る。この例では、ツェナーダイオード４０３を変圧器出力に配置して、電圧をクランプし得る。出力電圧は、（例えば、上記の低電圧範囲内に）設定され得る。設定は、Ｒ、Ｌ、Ｃおよび値を選択することによって変更され得、超高速パルシングに好都合の臨界減衰モードを作成する。
図４Ｂに図示されるように、いくつかの実施形態では、図４Ａに概略的に示されるパルス発生器回路などの複数のパルス発生器回路は、上記のように、一緒に結合され、コントローラによって制御され得る。図４Ｂでは、各ブロック（１、２、３、および４）は、コントローラによって制御され、かつ低電界（例えば、低電圧範囲）を有するメガヘルツパルシング周波数内のパルスの複合され／組み合わされたナノ秒パルス列を形成するために使用され得るパルス発生器を表す。図４Ｂでは、単一のパルス発生器は、高周波数で（例えば、マルチＭＨｚ範囲内で）ナノ秒持続時間のパルスを生成する必要はなく、代わりに、いくつかのパルス発生器がグループ化されてパルスを生成する。パルスレジームにおいて比較的低い電圧（例えば、＜１ｋＶ、上記の低電圧範囲を含む）を使用する場合、ＲＣスイッチモジュールを横方向に組み合わせて、任意の振幅、幅、および間隔の多相のパルスを生成することができる。各モジュールは異なるＤＣ電源で充電できるため、異なる出力電圧を提供することができる。各モジュールは個別にトリガーできるため、様々なパルス幅（ＰＷ）と遅延が可能である。あるいは、モジュールのすべてまたは一部が同一のパルスを生成し得、これは、上記のように組み合わされ得る。図４Ｃは、図４Ｂに示されるような、４つの別個であるがリンクされたパルス発生器から発生するナノ秒持続時間パルスの組み合わされた列の一例を図示する。この例では、パルスは無極性であり（例えば、すべて正またはすべて負になる）、同等のパルスとして示されており、述べたように、いくつかの変形形態では、異なる持続時間および／または異なる電圧を有するパルスが、同じパルス列内に適用され得る。いくつかの変形形態では、以下でより詳細に説明するように、ナノ秒の持続時間のバイポーラパルスがメガヘルツ周波数範囲で送達され得る。
例えば、図５は、バイポーラ刺激を提供するように構成されたパルス発生器の概略図の別の例を図示する。図５では、パルス発生器５００は、正のパルシング回路と負のパルシング回路とを組み合わせて、バイポーラパルス発生器を作成した。図５において、負のパルシング回路のスイッチ接続は、ドレインから接地への（および電源から負への）充電であり、これは、正のパルシング回路に示されているものと反対である。同じ負荷抵抗を、正および負の両方のパルシング回路に使用できる。電圧およびパルス幅は、差動で調整することができる。正または負のパルシング回路のうちの１つだけをトリガーすることもでき、それにより、正または負のパルスのどちらかが送達される。任意の長さの遅延を、任意の間隔で挿入することができる。図５に示されるような複数のバイポーラ刺激装置は、図４Ｂに示されるように組み合わされ得、メガヘルツ周波数刺激を可能にする。図４Ａ～図５Ｂに示されるパルス発生器は、本明細書に記載の方法を実行するために使用され得るパルス発生器の単なる非限定的な例を表す。記載された周波数でナノ秒パルスの列を生成するために、他のパルス発生器が使用または構成されてもよい。
本明細書に記載のシステムのいずれも、図６に示すように構成することもでき、単一のコントローラが、異なる場所（例えば、体上または体内の）からナノ秒電気パルスを印加するために使用され得るパルス発生器の２つ以上のセットを制御する。図６において、システム６０１は、単一のコントローラ６０３（いくつかの変形形態では、２つ以上のリンクされたコントローラであってもよい）を含み、パルス発生器６０５．．６０５’および６１５．．６１５’の２つ（または２つのセット）の各々からメガヘルツ周波数範囲の低電圧でナノ秒パルスを印加することによって、電気刺激を制御および調整する。バイポーラパルシングの文脈で以下により詳細に説明されるように、これは、電極付近の効果を最小限に抑えた非侵襲的電気刺激を可能にし得る。同じ電源６０７または異なる電源を使用して、電力を供給することができる（例えば、パルス発生器に）。各々がナノ秒パルスを印加するための電極を含む１つ以上のアプリケータ６０９、６０９’を使用することができる。いくつかの変形形態では、既知のまたは所定の距離および／または幾何形状によって分離され得る、異なる電極セットを有する単一のアプリケータが使用され得る。図７に示される例の１つの変形形態では、電極の先端間の約１４０μｍで、約１６Ｖを印加するパルスは、約５７０Ｖ／ｃｍに相当した。
低電圧ナノ秒パルスが高周波数（例えば、メガヘルツ）で適用される、ナノ秒パルスバーストのメガヘルツ圧縮の適用が、効果を実証するためにインビトロモデルを使用して調べられた。例えば、図７は、図５に示されるようなシステムに結合された一対の電極７０７、７０７’を通して高周波数で低電圧ナノ秒パルスを印加しながら、１つ以上の培養または外植された細胞を光学的に（例えば、顕微鏡画像化システム７０５に結合されたレーザー７０３を使用して）検査した試験装置７００の一構成を図示する。図７に示されるものと同様のシステムを使用して、メガヘルツバースト圧縮の使用が、インビトロでいくつかのタイプの哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、および酵素的に単離されたマウスの主要心室心筋細胞、ＶＣＭ）において検証された。ナノ秒範囲の電気パルスの効果が、Ｆｌｕｏ－４蛍光インジケータを使用した細胞質ゾルＣａ２＋活性化のタイムラプス記録および細胞形状変化の透視記録によって記録された。細胞のタイプやその他の条件、およびナノ秒範囲の電気パルスの強度に応じて、これらの観察結果は、細胞膜の易透化、電位依存性カルシウムチャネルの開放、収縮活動、および／または細胞再形成、または膜破壊による他のタイプの生体効果を反映していた。
図８Ａ～図８Ｂ、図９、図１０、図１１Ａ、および図１２Ａ～図１２Ｂは、サブマイクロ秒（例えば、ナノ秒）パルスの試験の例を図示し、例えば、パルス持続時間が５０～３００ｎｓであり、主に２００ｎｓおよび３００ｎｓの刺激に焦点を合わせている。パルスは、約１５０～４５０ｎｓのパルス間間隔に対応する、約１．６～３．３３ＭＨｚの繰り返しレートで、１００～５，９００パルスのバーストで送達された。パルス振幅は約２～１７Ｖの間で変化し、結果として生じる電界は、細胞位置でそれぞれ約７０～５７０Ｖ／ｃｍであった。２６個の個々のＶＣＭでのナノ秒範囲の処置における合計約２００パルスの電気刺激および他の細胞タイプ（＞１２０個の個々の細胞）での処置における８０ナノ秒を超えるパルスが検査された。（ナノ秒範囲のパルス電界を使用する標準的な処置と比較して）非常に低いパルス振幅にもかかわらず、細胞応答は一貫して記録された（図８Ａ～図１２Ｂに示されるように）。ＶＣＭの活性化および収縮を引き起こした最低の電界は、わずか８５Ｖ／ｃｍであった（例えば、図８Ａ、１，０００パルスのバースト、２００ｎｓのパルス持続時間、３．３３ＭＨｚを示す）。これは、２００ｎｓのパルス（単一の２００ｎｓパルスを含む）に対する約２．５ｋＶ／ｃｍの公開された閾値と比較して、電界の＞３０分の１への減少であった。わずかに高い電界、約１６０Ｖ／ｃｍは、試験された１８ＶＣＭのうち１７ＶＣＭでカルシウム活性化（励起）および細胞収縮を引き起こし、機能的であり、このタイプの応答を生成できることが試験され、証明された。閾値は、細胞が電界に対して平行もしくは垂直に配向されているか、またはいずれか他の角度に配向されているかについての有意な依存性を示さなかった。メガヘルツ周波数範囲のナノ秒パルスを使用するこの低電界では、個々のＶＣＭでの励起を、エレクトロポレーションまたは損傷の兆候なしに、複数回繰り返すことができる（例えば、図８Ｂを参照）。電界を励起閾値を超えて約２倍に増加させると、結果として、自発的なスパークレットや細胞質ゾルのＣａ２＋の静止レベルの上昇などの適度な膜破壊が観察された。電界がわずか約４００＋／－１８Ｖ／ｃｍにさらに増加すると、不可逆的なＶＣＭエレクトロポレーションが引き起こされ、細胞質ゾルのＣａ２＋は回復せず、ＶＣＭは健全な「レンガの形」から「ミートボールの形」に変形し、恒久的なＶＣＭ損傷の兆候が認められた。例えば、図８Ｂおよび図１１Ａならびに図９の最後のトレースを参照）。一般に、励起応答はまた、４００または５００パルス、０．１６ｋＶ／ｃｍで３．３３ＭＨｚなどのより短いパルス列で、ならびにより短い１００ｎｓパルス（３９００パルス、２ＭＨｚ、５７０Ｖ／ｃｍ）で観察された。ＶＣＭは、２秒ごとに印加される数十の圧縮ナノ秒電気パルスバーストの列によって繰り返し励起された（データは示していない）。
図８Ａ～図８Ｂに示されるように、高周波数、サブマイクロ秒、低電界電気エネルギーのバーストは、マウス心室心筋細胞（ＶＣＭ）の刺激および／またはエレクトロポレーションに使用され得る。いくつかの変形形態では、高周波数、サブマイクロ秒、低電界刺激が、除細動に使用され得る。本明細書に記載されるように、以前に制限された高電圧の必要性は、高速バーストを印加することによって相殺することができる。例えば、図８Ａ、図９、および図１１Ａに示すように、１０００、２００ｎｓのパルスを３．３３ＭＨｚのバーストに圧縮すると、わずか８０～２００Ｖ／ｃｍでの励起が可能になり、これは、単一の２００ｎｓの衝撃を用いるよりも１０～２０倍低い。そのような高周波数、サブマイクロ秒、低電界刺激バーストによる励起（図８Ａおよび図９に示すような）は、より強い電界による膜損傷後の持続するＣａ２２＋上昇および細胞収縮とは明らかに異なっていた（図８Ｂに示されるように）。単一の低周波数（例えば、＜１ＭＨｚ）、サブマイクロ秒、高電界（例えば、１ｋＶ／ｃｍ超）の刺激パルスによるＶＣＭ励起は、励起閾値で損傷を与え、異常な活動電位と長続きするＣａ２＋上昇とを引き起こした。この現象は、概して真実であり、低周波数、サブマイクロ秒、高電界刺激とは対照的に、本明細書に記載の高周波数、サブマイクロ秒、低電界刺激は、実質的に損傷が少なく、一方非常に効果的であった。
例えば、図９に示すように、ＭＨｚバーストによる繰り返しの刺激は損傷を引き起こさなかった。エレクトロポレーションの最初の兆候は、３５０～４００Ｖ／ｃｍで観察され（例えば、図８Ｂおよび図１１Ａを参照）、つまり、励起閾値の２～３倍（ｐ＜０．００１）であり、大きな安全ウィンドウを可能にする。サブマイクロ秒のパルス刺激間の固定された１００ｎｓ間隔で、閾値は、１００ｎｓから４００ｎｓまでのパルス幅のべき関数として減少した（例えば、図１１Ｂを参照）。閾値は、バースト内の「オン」の合計時間によって決定されたのに対し、個々の高周波数、サブマイクロ秒、低電界パルス持続時間は重要ではなかった（例えば、図１１Ｃを参照）。バースト持続時間に対してプロットされた閾値時間平均電界は、より短いパルスに対してより小さかった（図１１Ｄ）。
この予期しない結果は、ＶＣＭが１０００パルスのバーストによって励起された別のセットの実験で検証され、パルス持続時間は５０ｎｓから６００ｎｓまで異なり、パルス間間隔は９０ｎｓから４．８μｓまで変えられた。バースト持続時間に対して時間平均閾値電界値をプロットすると、より短いパルスに対して有意により小さい値が得られ（図１１Ｅ）、ＶＣＭでの以前の実験と一致するが、神経励起が対照的である（例えば、以下の図１６Ａ～図１６Ｄを参照）。これは、サブマイクロ秒パルシングの特定の効果を示し、従来のパルスとは明らかに異なり得る。
ＨＥＫ２９３およびＣＨＯ細胞では、ナノ秒範囲のパルスのバーストのメガヘルツ圧縮により、Ｃａ２＋トランジェントが誘発され、図１２Ａ～図１２Ｂに示すように、刺激後４０秒以内に完全または部分的な回復が観察された。一度に１つの細胞としてナノ秒範囲のパルスを受けたＶＣＭとは対照的に、これらの培養細胞は小集団として暴露された。応答の確率および振幅は、より高い電界（試験された範囲：１３０～５７０Ｖ／ｃｍ）、より高いパルス数（試験された範囲：１００～１，０００）、およびより短いパルス間間隔（試験された範囲：１５０～３００ｎｓ）で増加した。公開されている研究との比較を容易にするために、パルス持続時間は３００ｎｓで一定に保たれた。より低い周波数での典型的なナノ秒パルシング（単一パルシングを含む）は、約１．８ｋＶ／ｃｍで３００ｎｓパルス（複数可）に対する応答の閾値を有していた。ＣＨＯ細胞は電位依存性Ｃａ２＋チャネルを発現しないため、Ｃａ２＋トランジェントはエレクトロポレーションの結果であると考えられる。
この実験的研究に基づいて、ナノ秒バーストのメガヘルツ圧縮（例えば、メガヘルツ周波数範囲での低電圧ナノ秒パルスの印加）は、励起およびエレクトロポレーションの両方の電気エネルギー閾値の大幅な低減を可能にした。驚くべきことに、励起およびエレクトロポレーションの閾値の明確な分離（例えば、図１１Ａを参照）、ならびに損傷のない繰り返し励起もあり、これは、ナノ秒範囲の従来の電気パルス場を使用する場合に問題であった。
ナノ秒バーストのメガヘルツ圧縮の適用
上で簡単に論じたように、本明細書に記載の方法および装置（例えば、デバイス、システム、アプリケータなど）のいずれかを使用して、組織を処置することができる。腫瘍組織を含めて、皮膚、肝臓、腎臓、神経（脳、脊椎、末梢）、肺、筋肉、脂肪、呼吸器、胃腸、膀胱、生殖などの組織を含むがこれらに限定されない任意の適切な組織を処置することができる。本明細書に記載の低電界（例えば、低電圧）および高周波数（例えば、メガヘルツ）でのナノ秒パルスは、生物学的機能を操り、疾患を処置するために使用され得る。このような電気刺激に対する応答には、神経および筋肉の励起、免疫細胞（または別様に免疫応答を刺激すること）および内分泌細胞の活性化、細胞分化、エレクトロポレーション、壊死およびアポトーシス細胞死を含むがこれらに限定されない、様々な生体効果が含まれ得る。したがって、低電界およびメガヘルツ周波数でのナノ秒パルスの使用は、電気刺激が適用され得る事実上すべての適応症で使用され得る。一般に、本明細書に記載の高周波数ナノ秒パルス発生器およびそれらを使用する方法のいずれも、医学療法に使用することができる。
例えば、本開示の方法および装置は、心臓ペーシング、除細動、筋力トレーニングおよびリハビリテーション、疼痛管理、パーキンソン病の症状の緩和、精神障害、および癌の切除に使用され得る。それらはまた、神経筋および精神疾患の診断および研究に使用され得る。
例えば、本明細書に記載のデバイス、システム、および方法は、様々な切除処置（例えば、放射線ベース）、皮膚科処置（例えば、皮膚癌などの様々な皮膚状態の処置）、一般外科処置（例えば、膵切除）、心臓病学（例えば、弁修復）、婦人科（例えば、子宮摘出術）、脳神経外科（例えば、腫瘍切除）など、において利用され得る。
本明細書に記載の方法のいずれも、励起および／または切除もしくは他の組織処置のいずれかのために、興奮性組織（神経組織を含むがこれに限定されない）に適用され得る。例えば、本明細書に記載されているのは、神経および心筋などの興奮性組織の刺激、てんかん、パーキンソン病および脳卒中などの神経障害の処置のための方法および装置である。心臓障害には、心房細動および心室細動を含むことができる。上で実証したように、１つまたはグループの細胞の膜電位は、本明細書に記載の方法を使用して直接励起することができる。本明細書に記載の方法および装置は、血小板などの細胞における分泌を刺激するために使用することができる。
本明細書に記載の方法および装置は、特に、脳、末梢神経、筋肉、および心臓の処置における使用が見出され得る。上記のように、これらの方法は、心臓ペーシング、除細動、パーキンソン病の脳深部刺激療法、骨格筋の機能を回復するための機能的ナノ秒電気パルス、ならびに線維筋痛症、うつ病、認知症、てんかん、糖尿病性ニューロパチー、および他の多くの新たな用途のための疼痛管理に使用され得る。特に、本明細書に記載の低電界（例えば、低電圧）および高周波数（例えば、メガヘルツ）でのナノ秒パルスは、神経および筋肉のターゲットにおいて活動電位（ＡＰ）を調節または導入することが有益であり得る任意の適応症を処置するために使用され得る。例えば、本明細書に記載の方法および装置は、静止電位の調節（例えば、シフト）のために使用され、シナプス効率を変えることができる。ＡＰ誘導は、挿入もしくは埋め込まれた電極を通して、または表面から非侵襲的に、ターゲットに過渡電圧勾配を生み出すことによって達成される。代替的または追加的に、本明細書に記載の方法および装置のいずれもエレクトロポレーションに使用することができる。
本明細書に記載の組織のいずれも、メガヘルツ周波数範囲の低電圧ナノ秒パルスの列を印加することにより、ナノ秒パルスのメガヘルツ圧縮の適用を使用して選択的に調節され得る。いくつかの変形形態では、本明細書に記載の方法は、少なくとも部分的に、細胞のサイズおよび／または細胞の膜含有量に基づいて細胞を調節し得る。例えば、これらの方法は、他の細胞と比較して、放電のための高い時定数（例えば、より高い静電容量）を有する細胞に影響を及ぼし得、これは、細胞の組成および／またはサイズの関数であり得る。
例えば、低電界およびメガヘルツ周波数でのナノ秒電気パルスは、にきび、脂漏性角化症、ケロイド、伝染性軟属腫、アクロコルドン、乾癬、乳頭腫、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、黒色腫、黒皮症、脂漏性過形成、シリンゴマ、先天性毛細血管奇形（ポートワインしみ）、メラスマ、光線性角化症、黒色丘疹性皮膚炎、血管線維腫、皮膚腫瘍、皮膚の老化、しわの寄った皮膚、老年性血管腫、表皮／皮脂嚢胞、基底細胞癌腫、皮膚の老化、良性腫瘍、前癌性腫瘍、癌、およびいぼ、のうちの１つ以上の処置を含む、患者の皮膚を処置するために使用され得る。これらの方法および装置はまた、刺青除去、毛包破壊、瘢痕／ケロイドの減少、脂肪の減少、およびしわの減少を含む美容皮膚処置にも使用され得る。例えば、本明細書に記載の方法および装置は、黒色腫を自己破壊させることによって処置するのに有用であり得る。一般に、これらの方法は、皮膚病変のインビトロ処置に有用であり得る。
低電界（例えば、低電圧）および高周波数（例えば、メガヘルツ）でナノ秒電気パルスを印加するための本明細書に記載の方法および装置は、ナノ電気切除およびワクチン接種に有用であり得る。
したがって、本明細書に記載の方法およびデバイスは、様々な疾患の処置に使用され得る。「疾患」は、癌性、前癌性、および良性、または当技術分野で知られている他の疾患を含む、組織の異常な、制御されていない成長に関連付けられる対象内または対象上の任意の異常な状態を含む。本発明の方法およびデバイスは、悪性、良性、軟組織、または固形として特徴付けられるかどうかにかかわらず、あらゆるタイプの癌、ならびに転移前および転移後の癌を含むすべての病期およびグレードの癌の処置に使用することができる。異なるタイプの癌の例には、胃癌（例えば、腹部癌）、結腸直腸癌、消化管間質腫瘍、消化管カルチノイド腫瘍、結腸癌、直腸癌、肛門癌、胆管癌、小腸癌、および食道癌などの消化器癌および胃腸癌、乳癌、肺癌、胆嚢癌、肝臓癌、膵臓癌、虫垂癌、前立腺癌、卵巣癌、腎癌（例えば、腎細胞癌）、中枢神経系の癌、皮膚癌（例えば、黒色腫）、リンパ腫、神経膠腫、絨毛癌、頭頸部癌、骨肉腫、ならびに血液癌、が含まれるが、これらに限定されない。
これらの方法および装置はまた、または代替的に、癌を切除し、腫瘍の処置を含む、新しい癌の成長に対する耐性を生成するために有用であり得る。腫瘍の例には、良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）、子宮筋腫、膵臓癌腫、肝癌腫、腎臓癌腫、結腸癌腫、基底前細胞癌腫、およびバレット食道に関連付けられた組織が含まれる。
本明細書に記載の方法および装置は、遺伝子エレクトロトランスファーまたは「ＧＥＴ」に使用することができる。いくつかの変形形態では、癌を含む疾患は、腫瘍に導入される遺伝子（例えば、免疫応答を刺激する可能性のある遺伝子をコードする１つ以上のプラスミド）の移送によって処置され得る。例えば、黒色腫は、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）の遺伝子を含むプラスミドを使用して処置され得、これは、ナイーブＴ細胞のＴｈ１細胞への分化、ならびにインターフェロンガンマおよび腫瘍壊死因子アルファの産生を刺激し得る。あるいは、本明細書に記載の方法および装置のいずれかを使用して、特に腫瘍細胞を含む組織の細胞を穿孔し得る。これは、原形質膜を横切る小分子の輸送を可能にするのに十分な大きさの細孔を生成することによって細胞を透過性にし得る。図８Ａ～図８Ｂに示されるように、可逆的および不可逆的エレクトロポレーションの両方が達成され得る。例えば、本明細書に記載の方法および装置は、電気化学療法（ＥＣＴ）に使用することができ、黒色腫、基底細胞癌腫、乳癌、およびカポジ肉腫を含むいくつかの皮膚腫瘍ターゲットの処置に使用することができる（ブレオマイシン、シスプラチン、または他の薬物の使用を含む場合がある）。本明細書に記載の方法および装置は、壊死につながることがある不可逆エレクトロポレーション（ＩＲＥ）を引き起こすために使用され得る。例えば、本明細書に記載の方法および装置は、他の適応症の中でもとりわけ、前立腺、脳腫瘍切除（神経膠腫を含む）、膵臓癌、結腸直腸肝転移、切除不能な腎腫瘍、および直腸新生物を処置するのに有効であり得る。
本明細書に記載のナノ秒パルス列のメガヘルツ圧縮は、それらが細胞（複数可）の細胞内領域に浸透し得るため、癌を含む疾患の処置に特に有効であり得る。原形質膜を越えて浸透する能力（おそらくナノ秒範囲で最大振幅に達するパルス立ち上がり時間のため）は、通常、細胞内および細胞小器官内電荷が再分配されて、課された場をキャンセルするのに必要な時間よりもはるかに速い。これは、本明細書に記載の方法および装置が、ナノ秒範囲の電気パルスを印加することによって小さな細胞小器官を透過性にすることを可能にし得る（例えば、小胞、ミトコンドリア、小胞体、および核を含む）。
本明細書に記載の方法および装置はまた、血小板の活性化に有用であり得（トロンビンの非存在下において）、例えば、これらの方法は、多血小板血漿のナノ秒範囲で電気パルスを印加して、創傷治癒を改善し、血流を増強するために使用することができる。
上記のように、本明細書に記載のナノ秒パルスバーストのメガヘルツ圧縮を使用して、腫瘍の成長に影響を与えることができ、例えば、低電界および高周波数、例えば、メガヘルツで、ナノ秒範囲の電気パルスを用いて腫瘍を処置し、それにより、腫瘍が数日から数週間で消失し、免疫原性細胞死（ＩＣＤ）の特徴を提示することがあり、例えば、ＥＲから細胞表面へのカルレティキュリン転座、ＡＴＰ放出、およびＨＭＧＢ１放出などのＤＡＭＰを放出する。これらの方法はまた、転移を抑制するために使用され得る。
高電圧（例えば、３０ｋＶ／ｃｍ）を使用したナノ秒範囲のパルス電界の使用と同様に、本明細書に記載の方法はまた、薬物を使用せず、非常に速く、瘢痕を残さない処置を提供し得、１回または数回の処置だけで処置し得る。しかしながら、他のパルスレジームとは異なり、本明細書に記載の方法および装置は、所望の効果（免疫原性細胞死効果を含む）を達成するために大きな電界を必要としない。したがって、切除帯のサイズはより大きくなり得、より容易に適用され、および／または組織に耐性があり得る。
本明細書で与えられる例は、図示および例示のみを目的とするものであり、記載される説明は、網羅的または限定的であることを意図するものではないことに留意されたい。
バイポーラパルスターゲティングによるナノ秒バーストのメガヘルツ圧縮
一般に、ナノ秒バーストのメガヘルツ圧縮、例えば、低電界および高周波数（例えば、メガヘルツ）でナノ秒パルスを提供するための本明細書に記載の方法および装置は、印加電気エネルギーのための複数の供給源（例えば、電極、アンテナなど）と共に使用され得る。例えば、二組の電極を使用して、組織上、組織内、または組織周辺の別々の領域から、印加されたエネルギーが合計される（例えば、重ね合わせによって）領域にエネルギーを印加し、メガヘルツ範囲（例えば、約１メガヘルツ以上）にある周波数でサブマイクロ秒パルスのパルス列を生成すると、おそらく細胞膜（複数可）で電荷の蓄積が起こり得、結果として生じるメガヘルツ圧縮は、単一パルスを含めてより低いレートでパルス状にされた印加電界と比較して、実質的により低い閾値で生体効果をトリガ－する結果となり得る。上記のように、これは、印加されるエネルギーの量に関連して、生体効果をトリガ－するための閾値の明らかな低下と見なされ得る。
本出願のいくつかの実施形態において、ナノ秒バーストのメガヘルツ圧縮のための、例えば、低電界および高周波数（例えば、メガヘルツ）でナノ秒パルスを提供するための本明細書に記載の方法および装置は、電極またはその近く（非ターゲット領域）での電気パルシングの影響を最小限に抑えながら、電気パルスの印加から離れた処置ゾーンを特にターゲットにするために、バイポーラパルスの使用と組み合わせて適用され得る。２０１８年８月１６日に出願された、米国出願第１６／１０４，０８９号（「ＴＡＲＧＥＴＥＤ ＲＥＭＯＴＥ ＥＬＥＣＴＲＯＳＴＩＭＵＬＡＴＩＯＮ ＢＹ ＩＮＴＥＲＦＥＲＥＮＣＥ ＯＦ ＢＩＰＯＬＡＲ ＮＡＮＯＳＥＣＯＮＤ ＰＵＬＳＥＳ」）は、異なるがオーバーラップする組織の領域から特にターゲットのオーバーラップする領域（ＣＡＮＣＡＮと呼ばれる）まで高電圧でバイポーラナノ秒パルスを使用することについて説明している。興味深いことに、図１３に示されるように、高電圧（例えば、高電界強度）でバイポーラナノ秒パルスを使用するナノ秒パルス活性化は、細胞膜における生体効果の活性化をもたらさない。以下により詳細に説明される図１３に示されるように、バイポーラナノ秒パルスの使用は、おそらくパルスのバイポーラの性質のために、組織に対するナノ秒パルスの効果を相殺するように見え、後半（例えば、パルスの負方向の部分）は、パルスの前半（例えば、正方向）部分に起因する電荷の移動を元に戻す。しかしながら、２つのバイポーラパルスが重なり合って同期していない場合、これは、例えば、パルスが組織の２つの異なる領域から異なる時間に印加される場合に発生し得、オーバーラップ領域の電界が重なって、オーバーラップ領域においてモノポーラパルスになり得る。したがって、オーバーラップ領域は、組織の残りの部分がバイポーラナノ秒パルシングの影響を受けない場合でも、結果として生じるモノポーラナノ秒パルシングの影響を受け得る。
ナノ秒バーストのメガヘルツ圧縮をこのＣＡＮＣＡＮ効果と組み合わせて、深部組織領域でも非常に効果的な電気パルス（例えば、電気刺激を含むがこれに限定されない）を提供し得る。このメガヘルツ圧縮ＣＡＮＣＡＮ技術は、ナノ秒パルシングのメガヘルツ圧縮を使用するときに効果を誘発するのに必要とされるエネルギーが、メガヘルツ圧縮なしで必要とされるエネルギーよりも劇的に低いため、特に効果的であり得る。この効果は、アンテナを使用してナノ秒バーストを高周波数（例えば、メガヘルツ範囲内）で放出することによってさらに強化され得る。
したがって、本明細書では、異なる場所から高いレート（例えば、メガヘルツ）でバイポーラナノ秒電気パルスの複数の列を放出して、複数のバイポーラナノ秒パルス列が重なって、低電界でモノポーラナノ秒パルスの局所的な列を形成するオーバーラップの領域を形成するための方法および装置（例えば、図７を参照）についても記載される。低電界で結果として生じる重ねられたモノポーラナノ秒パルスは、局所的なオーバーラップ領域において生体効果（例えば、刺激、ポレーションなど）を誘発する閾値を超えることがある。
ＣＡＮＣＡＮでナノ秒バーストのメガヘルツ圧縮を使用すると、ＣＡＮＣＡＮ効果が鮮明になる場合がある。ＣＡＮＣＡＮのバイポーラキャンセルの使用をナノ秒バーストのメガヘルツ圧縮と組み合わせるのはやや反直感的であり、メガヘルツ圧縮が単一の供給源からのバイポーラパルシング（例えば、低電界強度でのバイポーラのナノ秒パルスの単一列）に影響を与える可能性は低いためである。（従来のバイポーラナノ秒パルシングのように）すべてのパルスで即時放電があるため、バイポーラパルス列は、メガヘルツ圧縮を受ける必要がなく、これは、パルス間の電荷を時間的に合計することによって膜での電圧効果を高め得る。加えて、メガヘルツの繰り返しレートを使用すると、実質的に低い電界強度を適用して同等の生体効果を達成することが可能になるので、これらの方法および装置は、組織の厚さによる減衰を補償し得る。加えて、バイポーラパルスとユニポーラパルスの間にはるかに強い（例えば、より鮮明な）違いがあり得、これによりターゲティングの改善が可能になり得る。これは、例えば、興奮性組織（例えば、神経組織）において、電気的損傷なしに、電気パルスからの増強された生体効果（例えば、刺激）をさらに可能にし得る。例えば、いくつかの変形形態では、２つの同期された「ＣＡＮＣＡＮ」パルス列が、４対の電極から生成され得、組織の深さ内でより長いパルスにオーバーラップし得る。
本明細書に記載のメガヘルツ圧縮方法および装置は、パルスを放出する電極の複数のセットでのパルス電気エネルギーの効果を低減するためにバイポーラキャンセルと組み合わせて使用することができるが、これらの方法および装置は、バイポーラキャンセルを使用する必要がないことを理解されたい。上記のように、これらの方法および装置は、組み合わせ得る複数の場所からのパルス電界を適用する方法および装置を含めて、組織内での重ね合わせによって生体効果を生み出すためにパルスサブマイクロ秒エネルギーを適用する任意の方法または装置で使用され得る。
したがって、本明細書に記載されているのは、高周波数での複数のオフセットナノ秒のバイポーラ電気パルス間のオーバーラップが、オーバーラップのターゲット領域に局在化される高周波数（例えば、メガヘルツ）を有するナノ秒のモノポーラ電気パルス列をもたらす複数の異なる場所から離れたオーバーラップの領域をターゲットにするために、オフセットされた複数の異なる場所の各々から高周波数（例えば、メガヘルツ）でナノ秒のバイポーラ電気パルスを実行するための方法および装置である。便宜上、それらを実行するためのこれらの方法および装置は、本明細書では、オフセットおよびオーバーラップするバイポーラナノ秒バーストのメガヘルツ圧縮と呼ばれ得る。
例えば、本明細書に記載されているのは、電極を挿入せずに深部組織および器官において生体効果を選択的に誘発するために、電気パルスの印加から離れたナノ秒電気パルスの印加を特にターゲットにするためのオフセットおよびオーバーラップするバイポーラナノ秒バーストのメガヘルツ圧縮である。ナノ秒の持続時間（およびメガヘルツの繰り返しレート）のバイポーラ刺激の局所的な重ね合わせは、ナノ秒電気パルスを利用する治療および診断処置の浸透の深さおよび精度を高め得る。これらの方法および装置の例示的な用途には、とりわけ、精神障害、パーキンソン病、および深部腫瘍のターゲット切除に対する疼痛管理を含むがこれらに限定されない、上記のもののいずれかが含まれ得る。
オフセットおよびオーバーラップするバイポーラナノ秒バーストのメガヘルツ圧縮は、深いターゲットの選択的、非侵襲的、局所的な電気刺激を可能し得る。特定の実施形態では、本開示は、刺激極性の反転に続くそれらの刺激効果をキャンセルするためのナノ秒電気パルスの固有の特性の使用、ならびに所望の生物学的反応を誘発するための閾値を低下させ得る高周波数（メガヘルツ）刺激に関連する。いくつかの実施形態では、図１３に図示されるように、バイポーラナノ秒電気パルスの第２の位相は、第１の位相の刺激効果をキャンセルし、したがって、バイポーラ刺激全体がその半分よりも弱くなる。次に、２つのバイポーラ刺激をモノポーラ刺激に重ねると、キャンセルがキャンセルされ（「ＣＡＮＣＡＮ」）、刺激効率が回復する。図１４Ａの例は、２つのバイポーラパルス列が、電極から離れたエリアｃ－ｃ’においてどのようにモノポーラ刺激を生成することができるかを示す。バイポーラパルスは、メガヘルツ周波数で繰り返され得る。この技術は、結果として生じる電界が低い（例えば、１ｋＶ／ｃｍ未満）場合でも、電極から離れた場所で選択的な電気刺激を可能にし得る。
オフセットおよびオーバーラップするバイポーラナノ秒バーストのメガヘルツ圧縮のための方法および装置は、破壊が最小限であり得る（例えば、非侵襲的）。本明細書に開示される方法および装置はまた、典型的には、既存のアプローチよりも少ない手順ステップ、より低いコスト、およびより少ない細胞を伴う。加えて、本明細書に開示される方法および関連する態様はまた、一貫した正確に定義された電界の使用、効率的な媒体交換、および薬物の適用／除去、ならびに加えて無菌状態を伴い得る。
図１４Ａにおいて、要素ａ－ａ’間の第１のナノ秒パルス列および要素ｂ－ｂ’間の第２のナノ秒パルス列は、相互の高調波として構成され得、その結果、領域ｃ－ｃ’における２つのパルス列の合計は、十分に高い周波数となり、その結果、生体効果（例えば、脱分極、ポレーションなど）をトリガ－するための電界の閾値は、合計されたパルス列によって満たされる。図１４Ｂは、同様の効果を図示し、組織のターゲットｃ－ｃ’領域において約１メガヘルツを超える周波数のモノポーラパルス列を形成するために組み合わされるパルス列の使用を示しており、電界は比較的低くてもよい（例えば、＜１ｋＶ／ｃｍ）が、それでも本明細書に記載されているような生体効果をトリガ－し得る。
本明細書に記載のオフセットおよびオーバーラップするバイポーラナノ秒バーストのメガヘルツ圧縮のための方法および装置は、目標とする非侵襲的エレクトロポレーションまたは電気刺激のためにバイポーラナノ秒電気パルスの固有の非効率性を克服し得る。本明細書に記載のオフセットおよびオーバーラップするバイポーラナノ秒バーストのメガヘルツ圧縮は、バイポーラ電気パルスは単独で、低い生体効率を有するという事実を利用している。図１５Ａに示されるように、１対の電極（Ａ－Ａ’）の間に適用される減衰波（例えば、減衰正弦波、ＤＳＷとして示される）は、生物学的に効果がない。位相シフトされた（電極Ｂ－Ｂ’の間に適用された）第２のＤＳＷも同様に効果がない。しかしながら、２つのＤＳＷの重ね合わせおよび同期により、２対の電極（Ｃ－Ｃ’）から離れた領域に生物学的に有効なユニポーラパルスが作成される。言い換えると、２つの生物学的に無効なＤＳＷを重ね合わせる効果は、バイポーラナノ秒電気パルスのキャンセル効果をキャンセルし、ユニポーラパルスを作成する。この概念は、「キャンセルのキャンセル」またはＣＡＮＣＡＮ効果と呼ばれる。図１５Ｂは、同様の例であり、ターゲットｃ－ｃ’領域において組み合わされて約０．１メガヘルツ以上の周波数（例えば、０．２ＭＨｚ以上、０．５ＭＨｚ以上、１ＭＨｚ以上など）のモノポーラパルス列を形成するパルス列の使用を示しており、電界は比較的低くてもよい（例えば、＜１ｋＶ／ｃｍ）が、それでも本明細書に記載されているような生体効果をトリガ－し得る。
それ自体は非効率的である、２つの適切に成形されたバイポーラナノ秒電気パルス列の重ね合わせおよび同期は、生物学的に有効なユニポーラパルス列を遠隔で復元する。これは、電極から離れた特定の場所で、時間的に一致する後続の各位相中に生成された電界が互いに無効になるためであり、その結果、残っているのはユニポーラパルスとしての第１の位相だけである。この無効化は、２つの独立したナノ秒パルス列からの電界成分の方向が反対である場合に発生し、その領域において０ｋＶ／ｃｍの｜Ｅ｜強度を生成する。
ＣＡＮＣＡＮを成功させるための主な目標の１つは、ナノ秒の電気パルス送達電極近くでユニポーラパルスと比較して低い効果を有しながら、遠隔でユニポーラと同等の効果を生み出すことである。電界モデリングの結果は、７０％の第２の位相振幅が、５０％の第２の位相振幅よりも電極の近くでより少ない電界無効化を提供し得ることを予測している。これは、次に、２つのナノ秒の電気パルス列が同期して送達されるときに、電極の近くでより良いバイポーラキャンセルをもたらし得る。したがって、いくつかの変形形態では、第１のパルス列の第２の位相のみの振幅は、位相Ａの７０％であり得、一方、第３の位相の振幅は、２５％のままである。７０％の第２の位相振幅では、電極付近の電界の無効化が少なくなり、バイポーラキャンセル効果が優勢になる。対照的に、電極間の中央では、効果は非同期送達とは最大に異なり、最大の電界無効化およびＣＡＮＣＡＮを示している。
２つの生物学的に無効なバイポーラナノ秒パルス列を生物学的に有効なユニポーラパルス列に重ね合わせることによる遠隔エレクトロポレーション。キャンセルのキャンセル、またはＣＡＮＣＡＮと呼ばれるこの効果は、各バイポーラナノ秒パルスの同時位相中に生成された電界の方向が反対であり、お互いを無効にするときに発生し、電極から離れた領域にユニポーラ曝露のみを残し、一方、他の場所ではバイポーラのままである。その結果、ＣＡＮＣＡＮは、ターゲットエレクトロポレーションのためのバイポーラナノ秒電気パルシングの固有の非効率性に依拠する。ＣＡＮＣＡＮの効率は、達成されるバイポーラキャンセルの程度に正比例すると予想される。
オフセットおよびオーバーラップするバイポーラナノ秒バーストのメガヘルツ圧縮による遠隔でのユニポーラパルスの形成は、非侵襲的に深いターゲットにアクセスする可能性を提示する。オフセットおよびオーバーラップするバイポーラナノ秒バーストのメガヘルツ圧縮は、同様に電気刺激にまで及ぶことがある。
上記のようなメガヘルツ圧縮および空間加算を利用した同様の効果は、バイポーラパルシングがなくても適用され得る。例えば、いくつかの変形形態では、ギガヘルツ周波数未満の複数の低電界モノポーラパルス列が放出され得、それ自体では生体効果はほとんどないが、ターゲット領域で空間的に合計すると、ナノ秒バーストのメガヘルツ圧縮をもたらすのに十分な高周波数（例えば、メガヘルツ範囲）のパルス列をもたらし、合計を考えると、領域において生体効果をトリガ－し得る。
上記のように、組織または細胞（例えば、場合によっては、単離された組織または細胞、例えば、体から除去されたもの）を使用して、本明細書に記載の方法および装置が、細胞および組織を効果的に処置するために使用され得ることを確認した。単離された組織および細胞の例は例証のためのみであり、本明細書に記載のこれらの技術、方法、および装置（例えば、デバイス、システムなど）は、生きている人間または動物の無傷または半無傷の組織（例えば、器官など）で使用され得ることを理解されたい。
例えば、図７～図１３を参照して上で説明したように、本明細書で説明した方法および装置を例証するために細胞を使用した。例えば、付着細胞株を含む細胞：ＨＥＫ２９３（ヒト上皮腎臓）、ＣＨＯ－Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣）、およびマウス心室心筋細胞（ＶＣＭ）が、タイムラプス蛍光イメージングアッセイに使用され、懸濁液ベースのＥＬ－４細胞（例えば、マウスリンパ腫）が、生存率研究に使用された。ＶＣＭは、ランゲンドルフ灌流中の酵素消化によって成体ＤＢＡ／２Ｊマウスから分離された。ＶＣＭは、ラミニンでコーティングされた１０ｍｍガラスカバースリップに播種され、４８時間以内に実験に使用された。
本明細書に記載の方法および装置は、電気的に興奮性細胞を刺激するために使用され得る。例えば、神経複合活動電位（ＣＡＰ）は、ウシガエルアメリカ食用ガエルの神経（ｎ．坐骨神経＋ｎ．腓骨筋）から誘発され、ＣＡＰ記録が実行された。単離された神経が、両端で結紮され、１４０ＮａＣｌ、５．４ＫＣＬ、１．５ＭｇＣｌ２、２ＣａＣｌ２、１０グルコース、および１０ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３、２９０～３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、１．６Ｓ／ｍ）を含む冷却生理溶液（ｍＭ）内に入れられた。ＣＡＰは、以下に説明する様々な発生器で誘発され、ＭＰ１６０データ収集システム（ＢＩＯＣＡＰ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州ゴリ－タ）で記録された。
一部の実験では、１Ｈｚ～３ないし４ＭＨｚの繰り返しレートで５～１０００パルスのバーストが使用され、個々のサブマイクロ秒パルシング持続時間は、１１～５００ｎｓの範囲であった。持続時間が最大１ｍｓの単一パルスを使用して、様々なタイミングおよび強度パラメータでのサブマイクロ秒バーストによる生体効果を比較した。このような多様な刺激を様々な生物学的負荷（８～２００オームのインピーダンス）に送達するために、本明細書に記載のようないくつかの高出力サブマイクロ秒発生器が使用され、場合によっては低電力モデル５７７デジタル遅延発生器（Ｂｅｒｋｌｅｙ Ｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ、カリフォルニア州サンラファエル）が、比較のために使用された（パルスパラメータの設定には柔軟性があるが、モデル５７７のパルス振幅の出力は２００オーム負荷でわずか２０Ｖに制限されていた）。本明細書で説明するように構成されたパルス発生器は、バースト持続時間および最小パルス持続時間を制限する場合があるが、１００～２００オームの負荷（カバースリップ上の付着細胞など）で最大約３ｋＶ、または８～１０オームの負荷（細胞増殖培地を有するエレクトロポレーションキュベットなど）で最大５００Ｖを送達することができる。キュベット曝露を除いて、これらの実験のパルスは通常、ユニポーラでほぼ矩形であり、立ち上がりおよび立ち下がり時間はパルス持続時間の１５％未満であった（例えば、図１６Ａを参照）。キュベット曝露の場合、２００ｎｓの持続時間（高さ５０％）の採用設定での長い立ち上がりおよび立ち下がり時間は、三角形のパルス形状をもたらした。いくつかの実施例では、単一の、ほぼ矩形の、ユニポーラの長いパルス（例えば、数百マイクロ秒のパルス持続時間）の生成には、モデルＳ８８刺激装置または特注のＭＯＳＦＥＴベースの発生器のいずれかを利用した。いくつかの実施例では、パルスの形状および振幅は、ＴＤＳ３０５２オシロスコープ（Ｔｅｋｔｒｏｎｉｘ、オレゴン州ビーバートン）を用いて制御された。
細胞の刺激および易透化を示す実施例では、サブナノ秒パルシングに対する細胞応答は、タイムラプス蛍光イメージングによってモニターされて、膜電位の変化（例えば、ＦｌｕｏＶｏｌｔ色素で）または細胞質ゾルＣａ２＋の増加（例えば、Ｆｌｕｏ－４もしくはＦｌｕｏ－８色素、またはＹＯ－ＰＲＯ－１色素の取り込みで）のいずれかを検出した。膜電位およびＣａ２＋インジケータは、細胞に事前にロードされていたが、ＹＯ－ＰＲＯ－１は、実験全体を通して１μＭで浴溶液に加えられた。いくつかの実施例では、浴溶液は、コンダクタンスを低下させ、エレクトロポレーションを促進にするために、上で定義された生理溶液、または（示された場合）等浸透圧ショ糖溶液と１：９で混合された同じ溶液のいずれかであった。パルス発生器に接続された一対のタングステン棒電極（直径１００μｍ、ギャップ１４０～１７０μｍ）を、選択した細胞（または細胞の小集団）がそれらの先端間の中央にくるように顕微鏡の視野内に位置付け、次に、電極をカバースリップ表面の上５０μｍに正確に持ち上げた。パルスパワーシステムは、例えば、Ｄｉｇｉｄａｔａ １４４０ＡボードおよびＣｌａｍｐｅｘソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）を使用したＴＬＬパルスプロトコルによって、トリガ－され、画像取得と同期された。電界は、有限要素ソルバーＣＯＭＳＯＬ Ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓ（ストックホルム、スウェーデン）を使用した３Ｄ数値シミュレーションによって計算された。
いくつかの実施例では、細胞生存率アッセイが実行された。ＥＬ－４細胞を増殖培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）に１．２ １０６／ｍｌで再懸濁し、１００μｌのアリコートを１ｍｍギャップのエレクトロポレーションキュベットに入れた。サブマイクロ秒パルスのバーストが室温で印加され、曝露による最大（断熱）加熱が、他の場所で説明されているように計算され、摂氏６度を超えなかった。細胞をインキュベータに戻し、Ｐｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅ代謝アッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して２４時間での生存率を測定した。
末梢神経刺激
本明細書に記載の方法、装置は、興奮性細胞を刺激するために使用され得る。例えば、末梢神経が、上記の方法および装置を使用して刺激された。神経線維は、神経に損傷を与えることなく、高周波数（例えば、メガヘルツ）、サブマイクロ秒、低電界（例えば、１ｋＶ／ｃｍ未満）の刺激によって繰り返し励起することができる。例えば、図１６Ｂ～図１６Ｄに示されるように、神経は、サブマイクロ秒の刺激（図１６Ａに示されるものと同様）を使用して励起された。図１６Ｂでは、３４０ｎｓのパルスが、５パルスおよび１００パルスのバーストで、１Ｈｚ～２ＭＨｚの繰り返しレートで印加された。この実施例では、約７ｋＨｚまでのレートで加算がなかったため、バーストの閾値は、単一の３４０ｎｓパルスの閾値とおそらく等しい。１０ｋＨｚを超えるレートでの加算は、べき関数に続く閾値の低下によって見られ、１００パルスのバーストではより高速であり、これにより、多数のより小さなパルスからの膜内外電位差の蓄積が可能になった。約２ＭＨｚで、１００パルスバーストの閾値は、これらの細胞の場合４００～５００から１０Ｖ／ｃｍに低下した。５パルスバーストの閾値は、すでに０．３ＭＨｚで理論上の最小値（単一パルスの閾値の１／５）に低下し、パルス間に感知できるほどの放電がないことを示唆している。
サブマイクロ秒バーストによって誘導される膜電位は、バースト中の時間平均電界によって決定され得る。この値は、閾値電界にデューティサイクルを掛けたものとして計算することができる。図１６Ｃに示されるように、バースト持続時間に対してプロットされた時間平均電界の閾値は、サブマイクロ秒のパルス持続時間に関係なくほぼ同じであることが見出された。したがって、持続時間がバースト持続時間に等しい単一の「長い」パルスの閾値を予測することができる。図１６Ｄに図示するように、３．３ＭＨｚで１０００、２００ｎｓパルスのバースト（デューティサイクル６７％、バースト持続時間３００μｓ）により、神経励起閾値が３６０±４Ｖ／ｃｍ（単一の２００ｎｓパルスの場合）から１．６３±０．２Ｖ／ｃｍに減少した。このようなバースト中の時間平均電界は、約１．６３ｘ ０．６７＝１．１Ｖ／ｃｍであった。これは、単一の３００μｓパルスの測定閾値であった（１．０４±０．２Ｖ／ｃｍ）。１つの２００μｓパルス（パルス持続時間はバーストの「オン」の合計時間に等しい）の測定閾値は、ほんのわずかばかり高く、例えば、１．２１＋／－０．１７Ｖ／ｃｍであった。しかしながら、高周波数、サブマイクロ秒、低電界バーストの効率と単一の長いパルスとの間の単純な関係は、常に有効であるとは限らない。一般に、効果を生み出すために必要な電界（例えば、図１６Ｂ～図１６Ｄにおいて、電気的に興奮性の細胞膜を励起するために）は、通常、パルスバースト内の繰り返しレートが増加する（例えば、隣接するパルス間の遅延を減少させる）につれて減少する。パルシングパラメータ（例えば、周波数、繰り返しレート／パルス間間隔など）の正確な値は、異なる組織のタイプや細胞のタイプによって変わり得るが、同じ一般的な傾向が当てはまり得る。
上記のように、高周波数（例えば、メガヘルツ）、サブマイクロ秒、低電界（例えば、１ｋＶ／ｃｍ未満）のパルス刺激のための方法および装置は、興奮性および非興奮性細胞のエレクトロポレーションに使用され得る。例えば、図１７Ａ～図１７Ｆは、高周波数、サブマイクロ秒、低電界パルスバーストによる非興奮性細胞のエレクトロポレーションを図示している。図１７Ａ～図１７Ｆにおいて、エレクトロパーミアビリゼーションは、電位依存性チャネルを発現しないＣＨＯおよびＨＥＫ細胞において測定された。図１７Ａでは、１００、４００ｎｓのパルスのバーストがＣａ２＋インジケータＦｌｕｏ－４を入れたＣＨＯ細胞に送達された。様々な電界強度について、１ｋＨｚ～１ＭＨｚのパルス繰り返しレートを試験し、検出可能なＣａ２＋の上昇に応答した細胞と応答しなかった細胞の数をカウントした。図１７Ａの各データポイントは、３つ以上の独立した実験からの合計２０～３０個の細胞からの応答画分を表す。約０．９６～１．４７ｋＶ／ｃｍの電界値は、低い繰り返しレートではＣａ２＋応答を引き起こさなかったが、約０．３ＭＨｚ以上でますます効率的になった。この周波数は、神経刺激の場合よりも約２桁高く（例えば、図１６Ｂと比較）、約１μｓの推定充電時定数と一致していた。約１．８３ｋＶ／ｃｍのより高い電界は、１ｋＨｚで細胞の７０％において効率的であった。単に１０ｋＨｚおよび１００ｋＨｚでの応答画分の増加は完全には理解されておらず、Ｃａ２＋トランジェントも激しくなったため、検出が向上した結果である場合がある。
約０．６４ｋＶ／ｃｍの低電界で、１０００、５００ｎｓのパルスのバーストは、約０．８～１ＭＨｚ未満のＣａ２＋イオンまたはＹＯ－ＰＲＯ－１へのＨＥＫ細胞の易透化を引き起こさなかった（例えば、図１７Ｂ～図１７Ｄを参照）。この周波数を超えると、この実施例ではエレクトロパーミアビリゼーションが急激に増加した。ＭＨｚバースト（図１７Ｄ）と単一の長いパルス（図１７Ｅ）とによって誘発されるＣａ２＋トランジェントの時間経過と形状は類似しており、エレクトロポレーションの同じ基本的なメカニズムを示唆している。図１７Ｆに示されているように、ＭＨｚバーストによって誘導されるＣａ２＋応答の大きさは、その持続時間がバースト中の「オン」の合計時間（バーストの合計持続時間ではなく）に等しくなるようにされた単一の「長い」パルスの大きさに一致する可能性がある。応答を誘発するための一致条件は、次式のとおりであることがわかった。
Ｅｌｐ＝（ＥｎｓＰＥＦ）ｘ（デューティサイクル）＋０．０５ ［１］
ここで、ＥｌｐおよびＥｎｓＰＥＦは、それぞれ、細胞場所での長いパルス（５００μｓ）によって、およびサブマイクロ秒パルス（５００ｎｓ）によって生成される電界値（ｋＶ／ｃｍ）である。このような関連は、サブマイクロ秒バーストと一致する単一パルスとが、重度にエレクトロポレーションされた細胞での生存率の低下など、同等の生理学的結果を有するはずであることを示唆した。しかしながら、実験はこれを確認しなかった。高周波数、サブマイクロ秒、低電界パルシングによってエレクトロポレーションされたＥＬ４細胞の生存率も調べた。例えば、エレクトロポレーションキュベット内の比較的大きな細胞集団の高周波数、サブマイクロ秒、低電界パルス処理の生存率実験が実行され、高周波数、サブマイクロ秒、低電界パルスバーストは三角形の形状をしており、高さ５０％で幅２００ｎｓであり、印加電圧はパルス間で常に完全にゼロに低下するとは限らなかった（図１８Ａ）。１０００の高周波数、サブマイクロ秒、低電界パルスのバーストを、２つの異なるピーク振幅（１９０および５００Ｖ、細胞懸濁液で１．９および５ｋＶに変換）で、および低または高繰り返しレート（１００Ｈｚおよび３ＭＨｚ）で、印加した。１．９ｋＶ／ｃｍの電界は、１００Ｈｚで印加された２００ｎｓパルスのエレクトロポレーション閾値を下回っていたため、最大４０００パルスのバーストは細胞の生存率を低下させなかった。３ＭＨｚで印加された同じパルスは、閾値を上回り、試験されたすべてのパルス数で生存率が約２分の１に減少した（図１８Ｂ、１００Ｈｚと比較してｐ＜０．００１、ｔ検定）。約５ｋＶ／ｃｍでは、はるかに少ないパルス数が、１００Ｈｚバーストおよび３ＭＨｚバーストの両方について生存率を低下させたが、３ＭＨｚバーストの方がはるかに効率的であった（図１８Ｃ、ｐ ＜０．００１）。
不規則なパルス形状では、バースト中の時間平均電圧および電界は、高周波数、サブマイクロ秒、低電界のパルス振幅にデューティサイクルを掛けることによって計算できなかった。代わりに、電圧はバースト中に０．２ｎｓの分解能でデジタル化され、それらの平均が計算され、これは、バースト内の高周波数、サブマイクロ秒、低電界パルスのピーク電圧が１９０Ｖ（１．９ｋＶ／ｃｍ）の場合、１０８Ｖ（１．０８ｋＶ／ｃｍ）に相当した。別の一連の実験（図１８Ｄ）では、高周波数、サブマイクロ秒、低電界パルスバースト（１０００パルス、４００ｎｓ、３ＭＨｚ、１．９ｋＶ／ｃｍ）で処置された細胞の生存率が、持続時間がバースト持続時間（３３３μｓ）に等しく、電界がバーストの時間平均値（１．０８ｋＶ／ｃｍ）に等しい単一パルスと並べて比較された。高周波数、サブマイクロ秒、低電界パルスバースト後の生存率は約５０％であり、前のセット（図１７Ｂ）と一致していたが、「同等の」単一パルスは効率が大幅に低下し、生存率が８７．６±１．４％、ｐ＜０．０００１に低下した。したがって、高周波数、サブマイクロ秒、低電界パルスのＭＨｚバーストは、時間平均振幅によって予測されるよりも効率的で、潜在的に、未知の高周波数、サブマイクロ秒、低電界パルス固有の効果に起因する。
これらの実験は、最大ＭＨｚの繰り返しレートの高周波数、サブマイクロ秒、低電界パルスバーストによる励起およびエレクトロポレーションが、効果的であり、かつ効率的であることを例証した。多様なターゲットおよびエンドポイントはすべて、高周波数、サブマイクロ秒、低電界パルスの効率の増加および閾値の低下を示した。高周波数、サブマイクロ秒、低電界パルスバーストの効率は、概して、バーストあたりのパルス数、それらの振幅、およびデューティサイクルとともに増加した。効率は、持続時間および振幅が、高周波数、サブマイクロ秒、低電界パルスバーストの持続時間および時間平均振幅にそれぞれ等しい、単一の長いパルスとは大幅に異なり得る。
本明細書に記載の方法（ユーザインターフェースを含む）のいずれも、ソフトウェア、ハードウェア、またはファームウェアとして実装することができ、プロセッサ（例えば、コンピュータ、タブレット、スマートフォンなど）によって実行され得る一連の命令を格納する非一時的なコンピュータ可読記憶媒体として説明され得、プロセッサによって実行されるとき、プロセッサに、表示、ユーザとの通信、分析、パラメータ（タイミング、周波数、強度などを含む）の修正、決定、警告などを含むがこれらに限定されないステップのいずれかの実行を制御させる。
特徴または要素が、本明細書で別の特徴または要素「上にある」と言及される場合、それは他の特徴または要素上に直接存在することができ、または介在する特徴および／または要素も存在し得る。対照的に、機能または要素が、別の機能または要素に「直接存在する」と言及される場合、介在する機能または要素は存在しない。特徴または要素が、別の特徴または要素に「接続されている」、「取り付けられている」または「結合されている」と言及される場合、それは他の特徴または要素に直接接続、取り付け、または結合され得、または介在する機能または要素が存在する場合がある。対照的に、機能または要素が別の機能または要素に「直接接続されている」、「直接取り付けられている」、または「直接結合されている」と言及される場合、介在する機能または要素は存在しない。一実施形態に関して説明または示されているが、そのように説明または示されている特徴および要素は、他の実施形態に適用することができる。別の特徴に「隣接して」配設された構造または特徴への言及は、隣接する特徴と重複するか、またはその下にある部分を有し得ることも当業者には理解されるであろう。
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、本発明を限定することを意図するものではない。例えば、本明細書で使用される場合、単数形の「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数形も含むことを意図している。本明細書で使用される場合、「および／または」という用語は、関連するリストされたアイテムの１つ以上のありとあらゆる組み合わせを含み、「／」と省略され得る。
「下（ｕｎｄｅｒ）」、「下（ｂｅｌｏｗ）」、「下方（ｌｏｗｅｒ）」、「上（ｏｖｅｒ）」、「上方（ｕｐｐｅｒ）」などのような空間的に相対的な用語は、説明を容易にするために、図に示されるように、ある要素または特徴の、別の要素（複数可）または特徴（複数可）との関係を説明するために、本明細書で使用され得る。空間的に相対的な用語は、図に示されている方向に加えて、使用中または動作中のデバイスの異なる方向を包含することを意図していることが理解されよう。例えば、図のデバイスが反転している場合、他の要素または特徴の「下（ｕｎｄｅｒ）」または「下（ｂｅｎｅａｔｈ）」として記述されている要素は、他の要素または特徴の「上（ｏｖｅｒ）」に向けられる。したがって、「下（ｕｎｄｅｒ）」という例示的な用語は、上と下の両方の方向を包含することができる。デバイスは、他の方法で方向付けられ（９０度または他の方向に回転され）てもよく、本明細書で使用される空間的に相対的な記述子は、それに応じて解釈され得る。同様に、「上向き（ｕｐｗａｒｄｌｙ）」、「下向き（ｄｏｗｎｗａｒｄｌｙ）」、「垂直（ｖｅｒｔｉｃａｌ）」、「水平（ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ）」などの用語は、特に明記されていない限り、説明の目的でのみ本明細書で使用される。
「第１の」および「第２の」という用語は、本明細書では様々な特徴／要素（ステップを含む）を説明するために使用され得るが、文脈が別段の指示をしない限り、これらの特徴／要素はこれらの用語によって限定されるべきではない。これらの用語は、ある特徴／要素を別の特徴／要素から区別するために使用される場合がある。したがって、本発明の教示から逸脱することなく、以下で論じる第１の特徴／要素は、第２の特徴／要素と呼ぶことができ、同様に、以下で論じる第２の特徴／要素は、第１の特徴／要素と呼ぶことができる。
本明細書および以下の特許請求の範囲を通じて、文脈上別段の定めがない限り、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、および「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、様々な構成要素を、方法および物品（例えば、デバイスおよび方法を含む組成物および装置）において共同で使用することができることを意味する。例えば、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、述べられた要素またはステップを含むことを意味するが、他の要素またはステップを除外することを意味しないと理解されるであろう。
一般に、本明細書に記載の装置および方法のいずれも包括的であると理解されるべきであるが、構成要素および／またはステップのすべてまたはサブセットは、代わりに排他的であり得、様々な構成要素、ステップ、サブコンポーネントまたはサブステップ「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または代わりに「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」として表現される場合がある。
本明細書の明細書および特許請求の範囲で使用される場合、実施例で使用される場合を含み、特に明記されていない限り、すべての数は、その用語が明示的に表示されない場合でも、「約」または「おおよそ」という単語が前に付いているかのように読むことができる。「約」または「おおよそ」という言い回しは、大きさおよび／または位置を説明するときに、説明される値および／または位置が、値および／または位置の合理的な予想範囲内にあることを示すために使用され得る。例えば、数値は、記述された値（または値の範囲）の＋／－０．１％、記述された値（または値の範囲）の＋／－１％、記述された値（または値の範囲）の＋／－２％、記述された値（または値の範囲）の＋／－５％、記述された値（または値の範囲）の＋／－１０％などの値を有し得る。本明細書に与えられた任意の数値はまた、文脈が別段の指示をしない限り、その値の約またはおおよそを含むと理解されるべきである。例えば、値「１０」が開示されている場合、「約１０」も開示されている。本明細書に列挙されている任意の数値範囲は、そこに含まれるすべてのサブ範囲を含むことを意図している。また、当業者が適切に理解するように、値が開示されているとき、値「以下」、「値以上」、および値間の可能な範囲も開示されていることを理解されたい。例えば、値「Ｘ」が開示されている場合、「Ｘ以下」ならびに「Ｘ以上」（例えば、ここでＸは数値である）も開示されている。また、用途全体を通じて、データはいくつかの様々なフォーマットで提供され、このデータは、終了点および開始点、ならびにデータポイントの任意の組み合わせの範囲を表すことも理解されたい。例えば、特定のデータポイント「１０」および特定のデータポイント「１５」が開示されている場合、１０および１５の間と同時に、１０および１５超、１０および１５以上、１０および１５未満、１０および１５以下、および１０および１５に等しいことが開示されていると見なされると理解される。２つの特定のユニット間の各ユニットもまた開示されていることも理解される。例えば、１０と１５とが開示されている場合、１１、１２、１３、および１４もまた開示されている。
様々な例示的な実施形態が上に記載されているが、特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲から逸脱することなく、様々な実施形態に対していくつかの変更のいずれかを行うことができる。例えば、記載された様々な方法のステップが実行される順序は、代替の実施形態ではしばしば変更され得、他の代替の実施形態では、１つ以上の方法のステップは完全にスキップされ得る。様々なデバイスおよびシステムの実施形態のオプションの特徴は、いくつかの実施形態に含まれ得、他の実施形態には含まれ得ない。したがって、前述の説明は、主に例示的な目的で提供されており、特許請求の範囲に記載されているように、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
本明細書に含まれる実施例および例示は、限定ではなく例示として、主題が実施され得る特定の実施形態を示している。前述のように、他の実施形態を利用し、そこから導き出すことができ、その結果、構造的および論理的な置換ならびに変更を、本開示の範囲から逸脱することなく行うことができる。本発明の主題のそのような実施形態は、実際、複数が開示されている場合、本出願の範囲を任意の単一の発明または発明の概念に自発的に限定することを意図することなく、単に便宜のために「発明」という用語によって本明細書で個別にまたは集合的に言及され得る。したがって、特定の実施形態が本明細書で例示および説明されてきたが、同じ目的を達成するように計算された任意の構成を、示された特定の実施形態の代わりに用いることができる。本開示は、様々な実施形態のありとあらゆる適応または変形を網羅することを意図している。上記の実施形態、および本明細書に具体的に記載されていない他の実施形態の組み合わせは、上記の説明を検討すると当業者には明らかであろう。

Claims (23)

  1. 電気パルスを送達して電気エネルギーの閾値を下げて生体効果を誘発するためのシステムであって、
    コントローラと、
    細胞または生体組織の近くに配置されるように適合された複数の電極を含むアプリケータと、
    １つ以上のパルス発生器であって、前記１つ以上のパルス発生器が各々、１０００ｎｓ未満の持続時間を有するサブマイクロ秒パルスを生成するように構成されている、１つ以上のパルス発生器と、を備え、
    前記コントローラが、１）前記アプリケータから、０．１メガヘルツ（ＭＨｚ）以上の周波数でサブマイクロ秒パルスの列を印加するとともに、２）前記細胞または生体組織に基づいてサブマイクロ秒パルスの列のパラメータを、自動的に選択しまたはユーザが選択できて、前記周波数が前記細胞または生体組織の有効放電時間よりも短くなるようにして、前記生体効果を誘発するのに必要な前記電気エネルギーの閾値を下げるように構成されている、システム。
  2. 前記コントローラが、１ＭＨｚ以上で前記サブマイクロ秒パルスの列を印加するように構成されている、請求項１に記載のシステム。
  3. 前記サブマイクロ秒パルスの列が、１ｋＶ／ｃｍ未満の電界強度を有する、請求項１または２に記載のシステム。
  4. 前記サブマイクロ秒パルスの列が、サブマイクロ秒のバイポーラパルスの第１の列と、サブマイクロ秒のバイポーラパルスの第２の列とを含み、前記第１の列および前記第２の列は、生物学的に効果がなく、前記複数の電極から離れた領域において重ね合わせることにより生物学的に有効なユニポーラパルスが得られるように構成されている、請求項１～３のいずれかに記載のシステム。
  5. 前記コントローラが、前記サブマイクロ秒パルスの列の前記サブマイクロ秒パルスの電圧の振幅が２０Ｖ以下であるように、前記１つ以上のパルス発生器を制御するように構成されている、請求項１～４のいずれかに記載のシステム。
  6. 前記コントローラが、前記サブマイクロ秒パルスの列の周波数を設定または選択するための１つ以上のユーザ入力を受信するように構成されている、請求項１～５のいずれかに記載のシステム。
  7. 前記コントローラが、前記サブマイクロ秒パルスの列の前記サブマイクロ秒パルスの電圧の振幅または持続時間を設定または選択するための１つ以上のユーザ入力を受信するように構成されている、請求項１～６のいずれかに記載のシステム。
  8. 前記複数の電極が、針電極を備える、請求項１～７のいずれかに記載のシステム。
  9. 前記アプリケータが、ハンドヘルドアプリケータであるように構成されている、請求項１～８のいずれかに記載のシステム。
  10. 前記１つ以上のパルス発生器が、１ｎｓ～９００ｎｓの持続時間を有する前記サブマイクロ秒パルスを生成するように構成されている、請求項１～９のいずれかに記載のシステム。
  11. 前記サブマイクロ秒パルスの列が少なくとも１００以上のパルスを含む、請求項１～１０のいずれかに記載のシステム。
  12. 生体組織を処置するためのシステムであって、
    コントローラと、
    細胞または生体組織の近くに配置されるように適合された複数の電極を含むアプリケータと、
    １つ以上のパルス発生器であって、前記１つ以上のパルス発生器が各々、１０００ｎｓ未満の持続時間を有するサブマイクロ秒パルスを生成するように構成されている、１つ以上のパルス発生器と、を備え、
    前記コントローラが、前記アプリケータから、０．１メガヘルツ（ＭＨｚ）以上の周波数で、サブマイクロ秒のバイポーラパルスの第１の列とサブマイクロ秒のバイポーラパルスの第２の列とを印可するように構成され、前記第１の列および前記第２の列は、生物学的に効果がなく、前記複数の電極から離れた領域において重ね合わせることにより生物学的に有効なユニポーラパルスが得られるように構成されている、システム。
  13. 前記コントローラが、前記１つ以上のパルス発生器に、高周波数の、サブマイクロ秒のパルス電界の１００を超えるパルスを送達させるように構成されている、請求項１２に記載のシステム。
  14. 前記１つ以上のパルス発生器が複数のパルス発生器を含み、前記コントローラが、前記複数のパルス発生器を調整し、前記複数のパルス発生器の各々からのサブマイクロパルスを組み合わせて、サブマイクロ秒のバイポーラパルスの前記第１の列およびサブマイクロ秒のバイポーラパルスの前記第２の列のうちの少なくとも一方を形成するように構成されている、請求項１２または１３に記載のシステム。
  15. 前記高周波数の、サブマイクロ秒のパルス電界が、８００Ｖ／ｃｍ以下の電界強度を有する、請求項１３または請求項１３を引用する請求項１４に記載のシステム。
  16. 前記高周波数の、サブマイクロ秒のパルス電界が、１メガヘルツ以上の周波数を有する、請求項１３、１５および請求項１３を引用する請求項１４のいずれかに記載のシステム。
  17. 前記第２の列が前記第１の列に対して位相シフトされている、請求項１２～１６のいずれかに記載のシステム。
  18. 前記コントローラが命令のセットを格納している機械可読有形媒体を含み、前記命令のセットが、前記コントローラに、前記高周波数の、サブマイクロ秒のパルス電界の前記周波数、振幅、または前記持続時間を設定または選択するためのユーザ入力を受信させるように構成されている、請求項１３または請求項１３を引用する請求項１４～１７のいずれかに記載のシステム。
  19. 前記複数の電極が、電極の第１のセットと電極の第２のセットとを含む、請求項１２～１８のいずれかに記載のシステム。
  20. 前記１つ以上のパルス発生器の各パルス発生器が、正相および逆相を有するサブマイクロ秒のバイポーラパルスを生成するように構成されている、請求項１～１９のいずれかに記載のシステム。
  21. 前記複数の電極がタングステン棒電極を有する、請求項１～２０のいずれかに記載のシステム。
  22. 前記システムが、単離された細胞、腫瘍、皮膚、肝臓、腎臓、神経、脳、脊椎、肺、筋肉、脂肪組織、呼吸組織、胃腸組織、膀胱、および生殖組織のうちの１つ以上の処置のために構成されている、請求項１～２１のいずれかに記載のシステム。
  23. 前記サブマイクロ秒パルスが減衰されている、請求項１～２２のいずれかに記載のシステム。
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