KR102552778B1

KR102552778B1 - 미세먼지 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용하는 확인방법

Info

Publication number: KR102552778B1
Application number: KR1020160081702A
Authority: KR
Inventors: 김형준; 나혜원; 배일홍; 정창조; 이태룡
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2016-06-29
Filing date: 2016-06-29
Publication date: 2023-07-10
Also published as: WO2018004254A1; CN109415767A; KR20180002324A; CN109415767B

Abstract

본 명세서에서는 대상이 미세먼지에 노출되었는지 여부를 객관적으로 확인할 수 있는 바이오마커로서 GSDMA 유전자를 제공할 수 있다. GSDMA 유전자는 기타 외부 환경 자극에는 반응하지 않으면서 미세먼지에 특이적으로 발현량 변화를 나타내어 미세먼지 특이적 바이어마커로서 사용될 수 있다.

Description

미세먼지 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용하는 확인방법{Biomarker for identifying exposure to particulate matter and identification method using the same}

본 명세서는 미세먼지 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용하는 확인방법에 관하여 기술한다.

미세먼지는 대기 중에 부유하는 입자상 물질로서, 주로 자동차의 배기가스, 화석 연료의 연소, 도로의 먼지 등으로부터 발생하는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 미세먼지는 평균입경 10㎛ 이하의 크기를 가진 것을 의미하며 미세먼지에 노출될 경우 호흡기 및 심혈관 질환뿐 아니라 피부, 안질환 등의 문제가 발생할 수 있다.

미세먼지는 그 크기가 매우 미소하기 때문에 육안으로 존재 여부를 식별하기 어려운 특징을 가지며 인체 건강에 직결되는 대기오염물질이기 때문에, 미세먼지에 대한 노출 여부를 명확하게 확인하는 방법에 대한 요구가 존재한다.

대한민국 특허출원 제10-2015-0074846호

일 관점에서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 미세먼지 노출 여부를 확인하기 위한 신규한 바이오마커를 제공하는 것이다.

다른 관점에서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 미세먼지 노출 여부 확인을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 관점에서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 미세먼지 노출 여부 확인용 키트를 제공하는 것이다.

또 다른 관점에서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 미세먼지 이외의 외부 환경 자극에 의하여는 변동이 없으나 미세먼지에 대한 노출에 의해 특이적으로 변동되는 바이오마커를 제공하는 것이다.

또 다른 관점에서, 본 발명이 해결하고 하는 과제는 미세먼지에 대한 노출을 특이적으로 확인할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

일 관점에서, 본 발명은 검체에서 GSDMA 유전자의 발현량을 검정하는 것을 포함하는 미세먼지 노출 여부 확인을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한다.

다른 관점에서, 본 발명은 GSDMA 유전자의 전사체에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍 또는 프로브, 및 가스더민 A(Gasdermin A) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 중 하나 이상을 포함하는 미세먼지 노출 여부 확인용 키트에 관한다.

일 관점에서, 본 발명은 미세먼지 노출 여부를 확인하기 위한 신규한 바이오마커를 제공할 수 있다.

다른 관점에서, 본 발명은 미세먼지 노출 여부 확인을 위한 정보 제공 방법을 제공할 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 미세먼지 노출 여부 확인용 키트를 제공할 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 미세먼지 이외의 외부 환경 자극에 의하여는 변동이 없으나 미세먼지에 대한 노출에 의해 특이적으로 변동되는 바이오마커를 제공할 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 미세먼지에 대한 노출을 특이적으로 확인할 수 있는 방법을 제공할 수 있다.

도 1는 Poly I:C 처리에 따른 GSDMA, TNF-alpha, 및 IL-6 유전자 발현량 변화를 확인한 그래프이다.
도 2은 Flagellin 처리에 따른 GSDMA, TNF-alpha, 및 IL-6 유전자 발현량 변화를 확인한 그래프이다.
도 3는 자외선 처리에 따른 GSDMA, TNF-alpha, 및 IL-6 유전자 발현량 변화를 확인한 그래프이다.
도 4은 미세먼지 처리에 따른 GSDMA 유전자 발현량 변화를 확인한 그래프이다.
도 5는 미세먼지 처리에 따른 GSDMA 발현량 변화를 조직면역염색(Immunohistochemistry)에 의하여 확인한 사진이다.
도 6은 피부 각질에서의 가스더민 A 단백질을 확인한 웨스턴블로팅 결과이다.
도 7은 서열번호 1의 GSDMA 유전자의 mRNA(NM_178171.4) 서열이다.

이하, 본 발명의 실시예들을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 본 출원에 개시된 기술은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 단지, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 출원의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 또한, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 출원의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 출원의 사상을 다양한 다른 형태로 구현할 수 있을 것이다.

본 명세서에서 “프로브(probe)”란 유전자의 표적 부위와 상보적으로 결합할 수 있는 서열의 염기를 갖는 폴리뉴클레오타이드, 그 변이체, 또는 폴리뉴클레오타이드와 이에 결합된 표지 물질을 포함하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 “프라이머(primer)”란 유전자의 표적 부위에 해당하는 특정 영역을 PCR을 이용하여 증폭하기 위하여 사용하는 유전자 특정 영역의 말단에 상보적으로 결합할 수 있는 서열의 염기를 갖는 폴리뉴클레오타이드 또는 그 변이체를 의미한다. 상기 프라이머는 특정 영역 말단과 완전히 상보적일 것을 요구하지 않으며, 상기 말단에 혼성화되어 이중사슬 구조를 형성할 정도로 상보적이라면 사용될 수 있다.

본 명세서에서 “혼성화(hybridization)”란 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다.　혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 뿐 아니라 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다.

본 명세서에서 “미세먼지”는 대기 중에 부유하는 미세한 입자상 물질(particulate matter, PM)을 의미한다. 미세먼지는 질산염(NO3-), 암모늄(NH4+), 황산염(SO42-) 등의 이온 성분과 탄소화합물(carbon　compounds), 금속(elements) 화합물 등으로 이루어져 있다. 입자 크기에 따라 평균 입경이 10㎛ 이하인 미세먼지(PM10), 평균 입경이 2.5㎛ 이하인 초 미세먼지(PM2.5)를 포함할 수 있으며, PM10 은 PM2.5fmf 포함할 수 있다. PM2.5는 체내에 침투가 용이하며 표면적이 크기 때문에 중금속 등 오염물질 흡착력이 커 건강에 미치는 악영향이 크다.

본 발명 일 실시예에서, 대상이 미세먼지에 노출되었는지 여부를 객관적으로 확인할 수 있는 바이오마커로서 GSDMA 유전자를 제공한다.

GSDMA 유전자는 가스더민 A(gasdermin A) 단백질을 코딩하며, 인간 GSDMA 유전자의 NCBI Gene ID는 284110이다. 본 발명자들은 GSDMA 유전자가 미세먼지에 대한 노출에 의하여 유의적인 발현량 증가를 나타내는 것을 발견하였다. GSDMA 유전자는 자외선, 바이러스, 박테리아 등의 미세먼지 이외의 외부환경의 자극에 의해서는 유의적 발현량 변화를 나타내지 않는 반면, 미세먼지에 대해서 특이적으로 반응하기 때문에 미세먼지 노출 여부 확인에 특이적인 바이오마커로서 사용될 수 있다.

본 발명 일 실시예에 따르면, 검체에서 GSDMA 유전자의 발현량을 검정하는 것을 포함하는 미세먼지 노출 여부 확인을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공할 수 있다.

상기 유전자의 발현량을 검정하는 것은 상기 검체에서 GSDMA 유전자의 전사체 또는 가스더민 A(Gasdermin A) 단백질의 수준을 측정하는 것을 포함할 수 있다.

미세먼지를 처리하지 않은 비처리 대조군과 비교하여 검체에서의 GSDMA 발현량 증가 여부를 확인하여 미세먼지에 대한 노출 여부를 확인할 수 있다.

일구체예에서, 검체에서 GSDMA 유전자의 전사체의 수준을 측정하는 것은 기술 분야에 알려진 통상적인 방법을 사용하여 수행할 수 있으며, 예를 들어, GSDMA 유전자의 전사체에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍 또는 프로브, 및 가스더민 A(Gasdermin A) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 중 하나 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 프라이머쌍 또는 프로브를 사용하는 경우, GSDMA 유전자의 전사체의 수준 측정은 상기 검체 중 상기 프라이머쌍 및 프로브 중 하나 이상과 혼성화된 전사체의 양을 측정하여 수행할 수 있다.

상기 프라이머는 GSDMA의 mRNA(서열번호 1, NM_178171.4)에 상보적이며, GSDMA의 mRNA를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 프로브는 GSDMA의 mRNA(서열번호 1, NM_178171.4)의 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 항체를 사용하는 경우, 가스더민 A 단백질 수준 측정은 상기 검체 중 상기 항체와 혼성화된 단백질의 양을 측정하여 수행할 수 있다.

상기 항체는 가스더민 A(Gasdermin A) 단백질에 대한 하나 이상의 단일클론 항체를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 GSDMA 유전자의 발현량 검정은 PCR(polymerase chain reaction), RT-PCR(reverse transcriptase polymerase chain reaction), 노던블로팅(northern blot analysis), 웨스턴블로팅(western blot analysis), 점블럿(dot blot assay), ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 및 마이크로어레이, 예를 들어 대립형질 특이적 혼성화(Allele-specific hybridization)를 이용한 TaqMan^TM 프로브법, 중합반응을 통한 대립형질 특이적 혼성화(Allele-specific hybridization)를 이용한 프로브법, 제한효소를 이용한 제한 단편화 길이 다형성(RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism)법, 용융온도(Tm, melting temperature)을 이용한 역동적 대립형질 특이적 혼성화(DASH, Dynamic Allele-Specific Hybridization)법, 중합반응을 이용한 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 대립형질 특이적 신장(Allele-Specific Extension)을 이용한 마이크로어레이 방법 등을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

검체는 인간으로부터 분리된 상피세포, 각질형성세포(keratinocyte), 섬유아세포 또는 멜라닌형성세포일 수 있으며, 예를 들어 각질형성세포일 수 있다.

대상으로부터 검체를 얻는 것은 기술 분야의 통상적인 방법에 따라 수행할 수 있으며, 피부에 대한 테이프스트리핑(tape stripping)과 같이 피부에 자극을 발생시키지 않고 비침습적 방법으로 수행할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일예에서 상기 테이프스트리핑은 예를 들어 1-20회, 예를 들어 5회 수행할 수 있으며 상기 범위 내에서 피부 자극을 발생하지 않고 검체를 얻을 수 있다.

일 구체예에서, 상기 방법은 GSDMA 유전자의 발현량이 비처리군(음성 대조군)의 발현량 대비 1.1배 이상, 1.2배 이상, 1.3배 이상, 1.4배 이상, 1.5배 이상, 1.6배 이상, 1.7배 이상, 1.8배 이상, 1.9배 이상, 2.0배 이상, 2.1배 이상, 2.2배 이상 2.3배 이상, 2.4배 이상, 2.5배 이상, 2.6배 이상, 2.7배 이상, 2.8배 이상, 2.9배 이상, 3.0배 이상, 3.1배 이상, 3.2배 이상, 3.3배 이상, 3.4배 이상, 3.5배 이상, 3.6배 이상, 3.7배 이상, 3.8배 이상, 3.9배 이상, 4.0배 이상, 4.1배 이상, 4.2배 이상, 4.3배 이상, 4.4배 이상, 4.5배 이상, 4.6배 이상, 4.7배 이상, 4.8배 이상, 4.9배 이상, 또는 5.0배 이상이고, 20.0배 이하, 19.5배 이하, 19.0배 이하, 18.5배 이하, 18.0배 이하, 17.5배 이하, 17.0배 이하, 16.5배 이하, 16.0배 이하, 15.5배 이하, 15.0배 이하, 14.5배 이하, 14.0배 이하, 13.5배 이하, 13.0배 이하, 12.5배 이하, 12.0배 이하, 11.5배 이하, 11.0배 이하, 10.5배 이하, 10.0배 이하, 9.5배 이하, 9.0배 이하, 9.0배 이하, 8.5배 이하, 8.0배 이하, 7.5배 이하, 7.0배 이하, 6.5배 이하, 6.0배 이하, 5.5배 이하 또는 5.0배 이하일 수 있으며, 예를 들어 1.1 내지 20.0배, 예를 들어 1.5 내지 10.0배, 예를 들어 2배 내지 8배인 경우 미세먼지에 노출된 것으로 확인할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명 일 실시예에 따르면, GSDMA 유전자의 전사체에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍 또는 프로브, 및 가스더민 A(Gasdermin A) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 중 하나 이상을 포함하는 미세먼지 노출 여부 확인용 키트를 제공할 수 있다.

상기 프라이머쌍, 프로브 및 항체는 상기 본 발명 일 실시예에 따른 정보를 제공하는 방법에 관하여 설명한 바와 동일하므로 기술을 생략한다.

이하, 실시예, 비교예 및 시험예를 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다. 이들은 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해 예시적으로 제시한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이 실시예, 비교예 및 시험예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가지는 자에 있어서 자명할 것이다.

[시험예 1] 인간 신생아 유래 표피 각질형성세포의 배양

인간 신생아 유래 표피 각질형성세포(Human epidermal neonatal keratinocyte cells)는 론자사(Lonza, Inc. 미국 메릴랜드주 워커스빌 소재)에서 구입하여 계대배양한 후 CO₂ 배양기(CO₂ incubator)에서 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 세포 배양액은 론자사의 지침서에 따랐다. 500 ml의 KBM-2(KBM^TM-2, CC-3103) 배지에 KGM-2 불렛 키트 CC-4152 (KGM ^TM-2 Bullet kit, CC-4152)(성분: BPE(Bovine pituitary extract)), 인간표피 성장인자(human epidermal growth factor, hEGF), 인슐린(Insulin), 하이드로코티손(Hydrocortisone), 트랜스페린 (Transferrin), 에피네프린(Epinephrine), 및 젠타마이신 설페이트+암포페리신-B(Gentamycin Suflate + Amphofericin-B: GA-1000))을 첨가한 KGM-2 불렛키트 CC-3107 (KGM ^TM-2 Bullet Kit, CC-3107)를 사용하였다.

[시험예 2] 미세먼지 이외의 외부 환경 자극에 대한 발현량 변화

시험예 1에서 배양된 각질형성세포에 바이러스, 박테리아의 감염상황을 유도하기 위해 Poly I:C 1μM, Flagellin 1μM 처리, 자외선A 및 자외선B (UVB 및 UVA)를 각각 UVB 25mJ, UVA 1J 및 UVA 10J로 조사 처리하고, GSDMA, TNF-alpha, IL-6 의 상대적 mRNA 발현양을 측정하였다. Poly I:C 및 Flagellin 은 invivogen (San Diego, California 92121 USA)의 것을 상업적으로 구입하여 사용하였으며, 자외선 조사는 BIO-SUN (Vilber Lourmat, Suebia, Germany)를 사용하였다.

KGM-2 불렛키트 CC-3107 (KGM ^TM-2 Bullet Kit, CC-3107)에 상기 각질형성세포를 50% confluency 로 분주하고 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 배양 후, Poly I:C, Flagellin 및 자외선 조사 처리 후 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 경과 후, 배양액을 제거하고, 2 ㎖ 인산염 완충액(Phosphate Buffered Saline, PBS)으로 세포를 세척한 다음, 트리졸 시약(Trizol reagent, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 세포 내의 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 키아젠사의 RNA 키트(QIAGEN RNeasy kt, QIAGEN, Valencia, CA)로 한번 더 정제한 후, 애질런트사의 바이오어낼라이저 2100 모델 기기(Agilent 2100 BioAnalyzer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 RNA의 질(quality)을 확인하였다. 인비트로젠사의 역전사키트(Superscript Reverse Transcriptase (RT) kit, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하였고, 이를 실시간 역전사 중합 효소 연쇄반응(Q-RT-PCR: real time-reverse transcription polymerase chain reaction)을 통해 정량적으로 분석하였다. GSDMA, TNF-alpha, IL-6 유전자의 발현 패턴 변화를 어플라이드바이오시스템사의 택맨 유전자 발현 시스템(TaqMan gene expression assay kit, Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 세포의 유전자 변화를 실시간 PCR 로 평가하였으며, 이용한 Q-RT-PCR과 실시간 PCR은 모두 라이프테크놀로지에서 배포하는 표준 프로토콜에 따라서 실행하였으며, 구체적으로 95℃에서 20초 동안 처리한 후, 95℃에서 3초 및 60℃에서 30초를 처리하는 공정을 40주기 진행하고, 상대적 mRNA 발현량을 측정하여 결과를 도 1 내지 도 3에 나타내었다. 이때, 각 유전자 증폭을 위해 사용한 프라이머는 하기와 같다. GSDMA (Hs00937853_m1, Life Technologies), TNF-alpha (Hs00174128_m1, Life Technologies), IL-6 (Hs00985639_m1 , Life Technologies).

도 1 내지 도 3에서 나타나는 바와 같이 TNF-alpha, IL-6는 바이러스, 박테리아, 자외선 등의 외부 환경 자극에 의해 발현량 변화가 현저하게 나타나는 반면, GSDMA 유전자는 이들 자극에 의해서는 발현량 변화가 거의 나타나지 않는 것을 확인할 수 있다.

[시험예 3] 미세먼지 포집 및 추출

미세먼지의 포집은 로우 볼륨 에어 샘플러(Sensidyne, Gillian, Low Volume Air Sampler, FL, U.S.A.)를 이용하였고, Filter pack은 매 측정일 오전 10시 전후에 필터와 디누더를 교체하여 약 24시간 동안 시료를 채취하였다. 2014년 2월 1일부터 2014년 2월 28일까지 서울의 풍하지역(경기도 용인시 처인구 소재, 한국외국어대학교 외국학 종합연구센터 생활관 6층 옥상)에서 매일 미세먼지를 포집하였으며, 측정시간은 진공펌프를 켜면서 타이머를 작동시키고 진공펌프를 끌 때 타이머의 시간을 기록하였다. 채취 유량은 16.7L/min으로 하여 측정 시작시 유량계(Model 4143, TSI Inc.)로 유량을 측정하고 측정이 끝날 때 다시 유량을 측정하였다. filter pack에 들어가는 Teflon 필터는 PM2.5 채취를 위해 Zefluor^TM 2.0 ㎛ (Pall lifesciences, Mexico)를 사용하였고 는 시료 채취 전과 후에 무게를 측정하였다. Teflon 필터의 무게를 측정하기 전 24 시간 동안 상대습도 40%의 데시케이터(NIKKO, Japan)에 항량시킨 후 소수점 5자리가 표시되는 전자저울(DVG215CD, Ohaus)에 무게를 두 번 측정하여 평균값을 기록하였다. 시료를 채취한 후에도 무게를 측정하기 전에 데시케이터에서 24시간 항량시킨 후 무게를 두 번 측정하여 채취 전에 측정한 무게와 비교하여 질량농도를 산출하였다. 미세먼지의 추출은 Teflon 필터를 1mL의 에탄올에 적신 후 14mL의 DW를 넣어 필터의 에어로졸 포집면이 수면에 닿도록 한 상태에서 뚜껑을 닫은 후 초음파 세척기로 30분간 초음파를 주어 실행하였다. 여과단계에서 수분에 의한 오차를 최소화하기 위하여 건조기(decicator)에서 48시간 동안 필터의 수분을 완전히 제거한 후, 0.1mg까지 측정할 수 있는 초정밀저울계(Mettler Toledo Company)를 이용하여 필터의 무게를 칭량하여 필터의 추출 전, 후 무게를 칭량하여, 미세먼지(PM2.5)를 포집 및 추출하였다.

[시험예 4] 미세먼지에 의한 GSDMA 발현량 변화

시험예 1에서 배양된 각질형성세포에 세포배양배지 1ml에 12.5㎍ 의 양으로 미세먼지(PM2.5; 시험예 3)를 처리하고, Gasdermin A, TNF-alpha, IL-6 의 상대적 mRNA 발현양을 측정하였다.

KGM-2 불렛키트 CC-3107 (KGM ^TM-2 Bullet Kit, CC-3107)에 상기 각질형성세포를 50% confluency 로 분주하고, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 배양 후, PM2.5 처리 후 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 경과 후, 배양액을 제거하고, 2 ㎖ 인산염 완충액(Phosphate Buffered Saline, PBS)으로 세포를 세척한 다음, 트리졸 시약(Trizol reagent, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 세포 내의 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 키아젠사의 RNA 키트(QIAGEN RNeasy kt, QIAGEN, Valencia, CA)로 한번 더 정제한 후, 애질런트사의 바이오어낼라이저 2100 모델 기기(Agilent 2100 BioAnalyzer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 RNA의 질(quality)을 확인하였다. 인비트로젠사의 역전사키트(Superscript Reverse Transcriptase (RT) kit, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하였고, 이를 실시간 역전사 중합 효소 연쇄반응(Q-RT-PCR: real time-reverse transcription polymerase chain reaction)을 통해 정량적으로 분석하였다. GSDMA 유전자의 발현 패턴 변화를 어플라이드바이오시스템사의 택맨 유전자 발현 시스템(TaqMan gene expression assay kit, Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 세포의 유전자 변화를 실시간 PCR 로 평가하였으며, 이용한 Q-RT-PCR과 실시간 PCR은 모두 라이프테크놀로지에서 배포하는 표준 프로토콜에 따라서 실행하였으며, 구체적으로 95℃에서 20초 동안 처리한 후, 95℃에서 3초 및 60℃에서 30초를 처리하는 공정을 40주기 진행하고, 상대적 mRNA 발현량을 측정하여 결과를 도 4에 나타내었다. 이때, 유전자 증폭을 위해 사용한 프라이머는 하기와 같다. Gasdermin A (Hs00937853_m1, Life Technologies)

도 4에서 나타나는 바와 같이 GSDMA 유전자는 미세먼지 처리에 의하여 현저한 발현량 변화를 나타내는 것을 확인할 수 있다.

[시험예 5] 미세먼지에 노출된 피부에서의 GSDMA 발현 확인

실제 피부조직에서 미세먼지에 대한 노출에 의하여 GSDMA 발현 증가가 발생하는지 여부를 항체를 이용한 면역화학적 염색법(Immunohistochemistry)을 사용하여 피부조직에서의 단백질 발현 여부를 분석하였다.

인간피부조직(Epiderm^TM, MatTek Corporation, Ashland, MA, USA)을 구입하여 미세먼지(PM2.5; 시험예 3를 3차 증류수 1ml에 미세먼지 25㎍/ml의 농도로 50㎕를 피부조직에 처리한 후, 4% 파라포름알데하이드가 함유된 인산완충식염수로 24시간에서 48시간 동안 후 고정(post-fixation)하였고, 30%의 수크로우즈가 함유된 인산완충식염수로 24시간 가량 처리하였다. 이후 피부조직용 주형(mold)에 놓고 30%의 설탕용액을 포함한 OCT 합성물을 담아 드라이 아이스 위에서 얼리고 이용되기 전까지 -80℃에서 보관하였다. 면역조직화학법을 통한 Gasdermin A 단백질의 발현 부위와 강도를 확인하기 위하여 Gasdermin A 단백질과 반응할 수 있는 항체는 Altas Antibodies 사(AlbaNova University Center, SE-106 91 Stockholm, Sweden)에서 제조한 항체를 사용하였다. 보관된 피부조직을 냉동미세절단기(cryostat microtome)을 이용하여 40㎛로 얇게 절단하고 피부조직절편을 PBS 용액에서 30분간 씻어내고 10% Bovine혈청이 포함된 PBS-T용액(10% TritonX-100이 인산완충식염수에 포함된 용액)으로 1시간 가량 블로킹 하였다. 결과적으로 보여질 이미지에서 주변의 비특이적 항원-항체 반응을 지양하고, Gasdermin A 특이적 발현부위를 좀 더 정확히 구분하기 위하여 Gasdermin A 항체:블로킹 용액의 비율이 1:500이 되도록 하였다. Gasdermin A 항체와 항원의 반응은 4℃에서 밤새도록 실시하거나, 상온(25 ℃)에서 3시간 가량 실시하였다. 1차 항체-항원반응이 끝난 후 인산완충식염수로 10분간 피부 조직절편을 씻어낸 후 2차 항체로 biotinylated secondary antibody (Invitrogen, USA)를 1:500의 비율로 희석하여 사용하였다. 2차 항체-항원반응이 끝난 후 인산완충식염수로 10분간 세 차례 피부조직절편을 씻어낸 후 streptavidin-HRP를 30분, DAB solution를 3분 (Invitrogen, USA)동안 인큐베이이션 하고, 슬라이드 글라스 위로 조직을 편평하게 봉입시켰다(mounting). 상온에서 약 5분간 건조시킨 후, crystal/mount 용액(Biomeda, USA)을 조직 위에 도포하여 커버 글라스를 덮어 표본을 준비하고, 이를 광학현미경(Olympus IX71, Olympus America, Melville, NY)으로 관찰하여 결과를 도 5에 나타내었다. 비처리군은 미세먼지 처리를 하지 않은 피부조직을 사용하였다. 시험은 동일 조건에서 별도의 인공피부를 사용하여 3회 실험하였고, 도 5의 (a), (b), (c)는 각 회당 실험 결과를 나타낸다.

도 5의 결과에서, 미세먼지를 처리한 표본의 경우 더 진한 갈색을 나타내어 GSDMA 발현량이 증가하였고 이에 따라 가스더민 A 단백질 수준이 현저하게 증가함을 알 수 있다.

[시험예 6] 웨스턴블랏을 통한 미세먼지 노출 여부 확인

각각 미세먼지가 많은 지역과 청정 지역에 거주하는 인간의 각질을 5회 Tape Stripping 하여 얻은 각질을 세포 용해(cell lysis) 용액을 넣고 Sonication 한 후, 볼텍스(vortex)하여 상층액을 얻은 후 단백질을 정량하였다. 미세먼지에 노출된 2명의 사람(미세먼지 많은 지역 거주자, 도 6(a) 및 도 6(b))과 미세먼지 노출되지 않은 사람(청정 지역 거주자, 도 6(c)) 의 단백질을 SDS-Gel 에 로딩한 후 Gasdermin A 항체 (Altas Antibodies, AlbaNova University Center, SE-106 91 Stockholm, Sweden) 를 사용하여 블롯팅하였다. 그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 미세먼지에 노출된 인간의 각질 (도 6(a) 및 (b))은 미세먼지에 노출되지 않은 경우의 인간의 각질(도 6(c))에 비하여 상대적(c)으로 증가된 Gasdermin A를 검출할 수 있었다.

<110> AMOREPACIFIC CORPORATION <120> Biomarker for identifying exposure to particulate matter and identification method using the same <130> 16P333/IND <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2164 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 ataaagcagc ctgtcctggc aagggatggt catcctctca acctacagac ccagtgagcc 60 ctaggccctc accccagacc cagctgctgg ataggaccca gccccgctcc cagagacaat 120 gaccatgttt gaaaatgtca cccgggccct ggccagacag ctaaaccctc gaggggacct 180 gacaccactt gacagcctca tcgacttcaa gcgcttccat cccttctgcc tggtgctgag 240 gaagaggaag agcacgctct tctggggggc ccggtacgtc cgcaccgact acacgctgct 300 ggatgtgctt gagcccggca gctcaccttc agacccaaca gacactggga attttggctt 360 taagaatatg ctggacaccc gagtggaggg agatgtggat gtaccaaaga cggtgaaggt 420 gaagggaacg gcagggctct cgcagaacag cactctggag gtccagacac tcagtgtggc 480 tcccaaggcc ctggagaccg tgcaggagag gaagctggca gcagaccacc cattcctgaa 540 ggagatgcaa gatcaagggg agaacctgta tgtggtgatg gaggtggtgg agacggtgca 600 ggaggtcaca ctggagcgag ccggcaaggc agaggcctgc ttctccctcc ccttcttcgc 660 cccattgggg ctacagggat ccataaatca caaggaggct gtaaccatcc ccaagggctg 720 cgtcctggcc tttcgagtga gacagctgat ggtcaaaggc aaagatgagt gggatattcc 780 acatatctgc aatgataaca tgcaaacctt ccctcctgga gaaaagtcag gagaggagaa 840 ggtcatcctt atccaggcat ctgatgttgg ggacgtacac gaaggcttca ggacactaaa 900 agaagaagtt cagagagaga cccaacaagt ggagaagctg agccgagtag ggcaaagctc 960 cctgctcagc tccctcagca aacttctagg gaagaaaaag gagctacaag accttgagct 1020 cgcacttgaa ggggctctag acaagggaca tgaagtgacc ctggaggcac tcccaaaaga 1080 tgtcctgcta tcaaaggagg ccgtgggcgc catcctctat ttcgttggag ccctaacaga 1140 gctaagtgaa gcccaacaga agctgctggt gaaatccatg gagaaaaaga tcctacccgt 1200 gcagctaaag ctggtggaga gcacgatgga acagaacttc ctgctggata aagagggtgt 1260 tttccccctg caacctgagc tgctctcctc ccttggggac gaggagctga ccctcacgga 1320 ggctctagtc gggctgagtg gcctggaagt gcagagatcg ggcccccaat atatgtggga 1380 cccagacacc ctccctcgcc tctgtgctct ttatgcaggc ctctctctcc ttcagcagct 1440 taccaaggcc tcctaatttg ccttttacgt ctgcttcatg actccctaat gccttcccaa 1500 cctcgtggtg ctgtgtcctt accacctaag ggcatttcag agccatcagc tgaagacatc 1560 tgaaatctca gctggtcacc catgataacc aacttccacc tgcccaacca tatatcaccc 1620 cctacccctc cagctccgca acccactaag cccatctgct gatgcttaaa ttttctttac 1680 ttttcttttc tttttttttt tttttttgag atggaggctc actctgtcac ccaggctgga 1740 gtgcagtggc ttgatcttgg ctcactgcaa cctccgcctc ccaggttcaa gcaattctcc 1800 tgcctcagcc tctcgagcag ctggaattac aggcacgtgc cacgacaccc agctaatttt 1860 tgtattttta gtagagacgg ggtttcacca tgttgcccag gttggtctcg aactcctggc 1920 ctcaagtgat ctgcccgcct cggcctccca aagtgctggg attacaggcg tgagccaccg 1980 tgcccggcct gtgcttaaat attctaggag tagaagcact cagactttta aaactatgag 2040 ccgtttcagc aaaactgaga aaaaaagaag attaattaat ttcctatcct aatccctcct 2100 acttatactt ccccaaaaaa caagctttac tggaattaat ggaaaatatt atgtcaatct 2160 tagg 2164

Claims

검체에서 GSDMA 유전자의 발현량을 검정하는 것을 포함하는 미세먼지 노출 여부 확인을 위한 정보를 제공하는 방법으로서,
상기 미세먼지는 평균 입경 2.5㎛ 이하의 초미세먼지인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 유전자의 발현량을 검정하는 것은 상기 검체에서 GSDMA 유전자의 전사체 또는 가스더민 A(Gasdermin A) 단백질의 수준을 측정하는 것을 포함하는, 방법.
제2항에 있어서,
상기 유전자의 발현량을 검정하는 것은 상기 전사체에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍 또는 프로브, 및 가스더민 A(Gasdermin A) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 중 하나 이상을 사용하는 것을 포함하는 것인, 방법.
제3항에 있어서,
상기 검체 중 상기 프라이머쌍 및 프로브 중 하나 이상과 혼성화된 전사체의 양, 또는 항체 중 하나 이상과 혼성화된 단백질의 양을 측정하여 검체에서의 GSDMA 유전자의 발현량을 검정하는 것을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 방법은 PCR(polymerase chain reaction), RT-PCR(reverse transcriptase polymerase chain reaction), 노던블로팅(northern blot analysis), 웨스턴블로팅(western blot analysis) 및 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 중 하나 이상을 사용하여 검체에서의 GSDMA 유전자의 발현량을 검정하는 것을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 검체는 인간으로부터 분리된 상피세포, 각질형성세포(keratinocyte), 섬유아세포 또는 멜라닌형성세포인, 방법.
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미세먼지 노출 여부 확인용 키트로서,
상기 미세먼지는 평균 입경 2.5㎛ 이하의 초미세먼지이고,
GSDMA 유전자의 전사체에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍 또는 프로브, 및 가스더민 A(Gasdermin A) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 중 하나 이상을 포함하는 미세먼지 노출 여부 확인용 키트.
제9항에 있어서,
상기 프로브는 GSDMA의 mRNA(NM_178171.4)의 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드; 중 하나 이상에 상보적인 폴리뉴클레오티드인, 키트.
제9항에 있어서,
상기 키트는 고상 지지체를 포함하고, 상기 고상 지지체의 표면에 상기 프로브가 결합된 것인, 키트.
제9항에 있어서,
상기 프라이머는 GSDMA의 mRNA(NM_178171.4) 서열에 상보적이며, GSDMA의 mRNA를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는, 키트.
제9항에 있어서,
상기 항체는 가스더민 A(Gasdermin A) 단백질에 대한 하나 이상의 단일클론 항체를 포함하는, 키트.
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