KR102551403B1 - 신규 니코틴 분해 효소 변형체 - Google Patents

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Abstract

야생형 NicA2 및 NOX 효소에 비해 증가된 니코틴 분해 활성 및/또는 감소된 면역원성을 나타내는 니코틴 분해 효소 변이체, 상기 변이체를 포함하는 조성물, 그리고 이를 사용하는 방법이 기재되어 있다.

Description

신규한 니코틴 분해 효소 변이체
관련 출원
본 출원은 35 USC § 119(e)에서 2017 년 2 월 3 일에 출원된 미국 가출원 제 62/454,331 호 및 2017 년 7 월 21 일에 출원된 미국 가출원 제 62/535,507 호의 우선권을 청구하며, 그 전체 내용은 본원에 참고로 편입된다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 니코틴 중독(addiction) 또는 니코틴 중독(poisoning)를 치료하는 분야에 관한 것이다. 야생형 NicA2 효소에 비해 증가된 니코틴 분해 활성 및/또는 감소된 면역원성을 나타내는 니코틴 분해 효소 변이체, 이들을 포함하는 조성물, 그리고 이들을 사용하는 방법이 기재되어 있다.
다음의 논의는 독자가 본 개시내용을 이해할 수 있도록 돕기 위해 제공되며 그에 대한 선행 기술을 기술하거나 구성하는 것으로 인정되지 않는다.
흡연은 세계적인 의료 문제이다. 세계보건기구는 현재 전세계적으로 13억명의 흡연자가 있으며 매년 담배 관련 사망자는 500만명에 이르는 것으로 추산하고 있다. 현재의 흡연 패턴이 계속되면 흡연으로 인해 2020년까지 매년 약 1천만명의 사망자가 발생할 것이다. 미국 질병통제센터(CDC)에 따르면, 담배 사용은 매년 미국에서 약 438,000명의 사망자를 발생시키는 예방가능한 사망 원인 중 하나이다. 또한 흡연으로 인해 연간 약 1570억 달러의 경제적 건강 관련 비용이 발생하는 것으로 추산된다. CDC는 미국의 4천5백만명의 성인 흡연자 중 70%가 금연을 원하지만 금연을 시도하는 사람들의 5% 미만이 12 개월 후에도 금연 상태를 유지한다고 추정한다.
담배를 끊는 것이 어려운 이유 중 하나는 담배 및 기타 담배 제품에서 니코틴에 중독된다는 것이다. 니코틴은 체내로 흡입되면 신속하게 혈류로 들어가고 이어서 혈액-뇌 장벽을 넘어 뇌에 도달하는 작은 분자이다. 뇌에 들어가면, 니코틴은 니코틴 수용체에 결합하여, 도파민과 같은 각성제를 방출하고 보상 체계를 활성화시키며 흡연자에게 중독을 유발하는 긍정적이고 즐거운 재시행 경험을 제공한다.
흡연 및 기타 담배 사용과 관련된 유해한 건강 영향 외에도, 니코틴을 너무 많이 섭취하거나 흡입하여 발생하는 니코틴 중독은 또 다른 니코틴 관련 건강 문제이다. 니코틴의 LD50은 랫트의 경우 50 mg/kg이고 마우스의 경우 3 mg/kg이다. 30-60 mg(0.5-1.0 mg/kg) 정도의 낮은 용량은 성인의 경우 치명적일 수 있지만, 어린이는 담배 1 개를 섭취한 후 병에 걸릴 수 있으며, 그 이상으로 섭취하면 어린이가 심하게 아플 수 있다. 반면에, 일부는 치사량이 인간 성인의 경우 500 mg 이상(1.0-7.1 mg/kg)이 될 수 있다는 증거가 있다. 두 경우 모두, 급성 니코틴 중독은 대개 니코틴 껌 또는 패치를 우연히 씹거나 전자 담배의 "전자 액체"를 섭취한 어린이에게서 발생한다. 드물게, 어린이들은 담배를 마신 후에도 아프기도 한다. 미국에서만 매월 수백 건의 급성 니코틴 중독 사례가 보고되고 있다.
전형적으로, 니코틴 중독의 초기 치료는 위장관 흡수를 줄이기 위한 활성탄의 투여를 포함할 수 있으며, 반면 추가의 치료는 니코틴 중독으로 인한 증상을 해결할 수 있다.
금연을 위한 야생형 NicA2 효소의 사용이 제안되었다(예를 들어, Xue et al., J. Am. Chem . Soc . 137: 10136-39(2015) 참조). 그럼에도 불구하고, 니코틴 중독을 치료하기 위한 추가의 제제, 조성물 및 방법, 뿐만 아니라 니코틴 중독을 치료하기 위한 제제, 조성물 및 방법이 여전히 필요하다.
야생형 NicA2 효소에 비해 증가된 니코틴 분해 활성 및/또는 감소된 면역원성을 나타내는 니코틴 분해 효소 변이체, 이들을 포함하는 조성물, 그리고 이들을 사용하는 방법이 본원에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 1에 제시된 야생형 NicA2 효소의 아미노산 서열의 변이체인 아미노산 서열을 포함하며, 여기에서 상기 변이체 서열은 야생형 NicA2 효소에 비해 니코틴 분해 활성을 증가시키고/시키거나 변이체의 면역원성을 감소시키는 서열번호: 1과 비교하여 적어도 하나의 치환, 부가, 또는 결실을 갖는다.
일부 구현예에서, 변이체는 야생형 NicA2 효소에 비해 증가된 니코틴 분해 활성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 야생형 NicA2 서열의 변이체는 서로 다른 위치에서 치환 AF104L, G106S, A107H, A107P, 107R, A107K, A107T, F355C, F355V, W427Q, W427E, W427S, W427M, W427H, W427L, W427R, R91A, R91Q, R91F, R91G, R91T, R91L, R91S, R91N, T250G, T250L, T250R, T250V, T250P, K340P, K340I, K340V, K340D, K340E, Q366K, Q366E, Q366V, Q366L, Q366I, Q366Y, T381P, T381I, T381V, T381Q, T381N, T381L, T381M, N462L, N462Y, N462S, N462F, N462G, N462E, N462A, N462M, I463F, I463Y, I463A, I463V, I463L, L217Q, L217G, L217E, L217I, L217C, 또는 L217S 또는 임의의 둘 또는 그 이상의 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 서열은 서열번호: 5-56 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체의 니코틴 분해 활성은 야생형 NicA2 효소의 니코틴 분해 활성의 적어도 200%, 적어도 300%, 또는 적어도 400%이다. 일부 구현예에서, 변이체 서열은 서열번호: 1의 아미노산 위치 91, 104, 106, 107, 217, 250, 340, 355, 366, 381, 427, 462, 또는 463에서 적어도 하나, 적어도 2개, 또는 적어도 3개의 치환(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체는 펩타이드의 N-말단에서 1-52 아미노산의 결실을 가질 수 있다. 예를 들어, 서열번호: 1로부터 유래된 변이체는 펩타이드의 N-말단으로부터 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 51 또는 52 아미노산의 결실을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 변이체는 부가적으로 또는 대안적으로 펩타이드의 C-말단으로부터 1 이상의 아미노산의 결실, 예컨대 C-말단 잔기의 결실을 가질 수 있다.
부가적으로 또는 대안적으로, 일부 구현예에서, NicA2 변이체는 야생형 NicA2 효소에 비해 감소된 면역원성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 야생형 NicA2 효소에 대한 면역원성은 75% 이상 감소된다. 일부 구현예에서, 변이체 서열은 서열번호: 1의 아미노산 10-32, 68-94, 189-225, 248-285, 296-327, 336-391, 또는 435-459로부터 선택된 영역 내의 면역원성 T-세포 에피토프에서 적어도 하나의 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 서열은 서열번호: 1의 아미노산 16-24, 73-81, 258-266, 302-310, 373-381, 또는 447-455로부터 선택된 면역원성 T-세포 에피토프에서 적어도 하나의 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 서열은(a) 서열번호: 1의 아미노산 잔기 74, 77, 78, 또는 80;(b) 서열번호: 1의 아미노산 잔기 262, 263, 264, 또는 266;(c) 서열번호: 1의 아미노산 잔기 303, 304, 306, 또는 310;(d) 서열번호: 1의 아미노산 잔기 374, 377, 378, 382, 또는 383; 및/또는(e) 서열번호: 1의 아미노산 잔기 450, 451, 452 또는 457로부터 선택된 위치에서 적어도 하나의 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 서열은 표 3의 에피토프 B에 대해 열거된 것들로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 치환 조합을 포함한다. 부가적으로 또는 대안적으로, 일부 구현예에서, 변이체 서열은 표 3의 에피토프 1에 대해 열거된 것들로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 치환 조합을 포함한다. 부가적으로 또는 대안적으로, 일부 구현예에서, 변이체 서열은 표 3의 에피토프 2에 대해 열거된 것들로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 치환 조합을 포함한다. 부가적으로 또는 대안적으로, 일부 구현예에서, 변이체 서열은 표 3의 에피토프 3에 대해 열거된 것들로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 치환 조합을 포함한다. 부가적으로 또는 대안적으로, 일부 구현예에서, 변이체 서열은 표 3의 에피토프 4에 대해 열거된 것들로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 치환 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체는(a) I262T;(b) I262S;(c) I262A;(d) I262T 및 A264L; 및/또는(e) I262T 및 N263R로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 치환 조합을 포함한다.
부가적으로 또는 대안적으로, 일부 구현예에서, 변이체는 아미노산 위치 74, 77, 78, 80, 262-266, 303, 304, 306, 310, 374, 377, 378, 382, 383, 450-452, 또는 457에서 적어도 하나의 치환을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 변이체는 아미노산 위치 262 또는 263에서 치환을 포함할 수 있거나, 변이체는 아미노산 위치 262 및 263에서 치환을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 치환은 I262A, I262T, 및/또는 N263R일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 변이체 서열은 서열번호: 62 또는 63의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 57에 제시된 야생형 NOX 효소의 아미노산 서열의 변이체인 아미노산 서열을 포함하며, 여기에서 상기 변이체 서열은 야생형 NOX 효소 또는 야생형 NicA2 효소와 비교하여 니코틴 분해 활성을 증가시키고 및/또는 변이체의 면역원성을 감소시키는 서열번호: 57과 비교하여 적어도 하나의 치환, 부가, 또는 결실을 갖는다.
일부 구현예에서, 야생형 NOX 서열의 변이체는 서열번호: 57의 위치 423에서 치환을 포함한다. 예를 들어, 변이체 서열은 치환 W423A, W423S, W423E, 또는 W423H를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 변이체 서열은 서열번호: 58-61 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, NOX 변이체의 니코틴 분해 활성은 야생형 NicA2 효소의 니코틴 분해 활성의 적어도 200%이다. 일부 구현예에서, NOX 변이체의 니코틴 분해 활성은 야생형 NOX 효소의 니코틴 분해 활성의 적어도 200%이다.
부가적으로 또는 대안적으로, 일부 구현예에서, NOX 변이체는 야생형 NOX 효소 또는 야생형 NicA2 효소에 비해 감소된 면역원성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 야생형 NOX 또는 NicA2 효소에 대한 면역원성은 75% 이상 감소된다.
부가적으로 또는 대안적으로, 일부 구현예에서, 변이체는 적어도 서열번호: 1 또는 57의 아미노산 1-38, 또는 서열번호: 1 또는 57의 아미노산 1-50, 또는 서열번호: 1 또는 57의 아미노산 1-51, 또는 서열번호: 1 또는 57의 아미노산 1-52의 결실을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체는 서열번호: 139의 아미노산 서열을 포함하는 His-태그와 같은 His-태그를 추가로 포함할 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 일부 구현예에서, 변이체는 야생형 서열의 S482에 상응하는 잔기의 결실과 같은 하나 이상의 C-말단 아미노산의 결실을 포함한다.
임의의 구현예에서, 변이체는 지속 작용성 변이체, 예컨대 변이체가 알부민 결합 펩타이드, 알부민 결합 단백질 도메인, 인간 혈청 알부민, 또는 불활성 폴리펩타이드, 예컨대 재조합 PEG(XTEN®), 호모-아미노산 중합체(HAP), 프롤린-알라닌 세린 중합체(PAS), 또는 엘라스틴 유사 펩타이드(ELP)에 접합된 것일 수 있다. 특정 구현예에서, 지속 작용성 변이체는 폴리에틸렌 글리콜에 접합된다(즉, 변이체는 PEG화된다).
일부 구현예에서, 본원에 기재된 니코틴 분해 효소 변이체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 조성물은 주사 또는 주입용으로 제형화된다. 일부 구현예에서, 조성물은 경구 투여용으로 제형화된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체 또는 조성물의 치료 유효량을 필요로 하는 포유동물 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 니코틴 중독을 치료하는 또는 금연을 촉진시키는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 포유동물 대상체는 인간 대상체이다. 일부 구현예에서, 니코틴 중독은 담배 제품 및 전자 담배로부터 선택된 니코틴 제품의 섭취와 관련된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 치료 유효량의 니코틴 분해 효소 변이체 또는 조성물을 필요로 하는 포유류 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 니코틴 중독을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 포유동물 대상체는 인간 대상체, 또는 보다 구체적으로 인간 어린이이다. 일부 구현예에서, 니코틴 중독은 담배 제품 및 전자 담배로부터 선택된 니코틴 제품의 소비와 관련된다.
또한, 니코틴 중독 또는 니코틴 중독을 치료하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체 및 조성물이 제공된다.
또한, 니코틴 중독의 치료 또는 금연의 촉진을 위한 약제의 제조에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체 및 조성물의 용도가 제공된다.
전술한 일반적인 설명 및 하기의 상세한 설명은 예시적이고 설명적인 것이며 본 발명에 대한 추가적인 설명을 제공하기 위한 것이다.
도 1은 야생형 NicA2(서열번호: 1) 및 NicA2Δ50(서열번호: 2)의 His-태그된 버전의 SDS-PAGE 분석을 도시한다. 레인 1 : MW 마커(Blue Plus2; Invitrogen); 레인 2 : 야생형 NicA2(서열번호: 1); 및 레인 3 : NicA2Δ50(서열번호: 2).
도 2는 본원에 기재된 바와 같이 야생형 NicA2와 변이체 니코틴 분해 효소를 비교하는 니코틴 분해 활성 검정의 결과를 도시한다. 상기 검정은 80 nM의 최종 농도로 정제된 단백질을 사용하였다.
도 3은 NicA2 결정 구조에서 활성 부위 주변의 잔기를 도시한다(Tararina et al., Biochem. 55:6595-98(2016)). 쉘 1은 어두운 회색으로 표시되고 쉘 2는 밝은 회색으로 표시된다. 제 1 및 제 2 쉘을 구성하는 잔기는 표 2에 나타난다.
도 4A-E는, 야생형 NicA2에 비해 면역원성 잠재력을 감소시키는 것으로 예측된,(표 3에서 열거된 바와 같이) 에피토프 B(도 4E), 1(도 4A), 2(도 4B), 3(도 4C) 및 4(도 4D)의 돌연변이를 갖는 특정 NicA2 변이체의 상대 활성을 도시한다.
도 5는 SDS-PAGE 분석을 사용하여 NicA2의 무작위 PEG화를 도시한다. 이들 결과는 PEG화가 PEG화 시약의 몰 과량 및 PEG 사슬 길이 증가에 의해 증가될 수 있음을 나타낸다.
도 6은 PEG화된 NicA2 투여된 동물의 혈청에서 NicA2의 약동학적(PK) 특성을 PEG화가 향상시킨다는 것을 도시한다.
도 7은 PEG화가 잠재적으로 NicA2상의 면역원성 에피토프를 마스킹할 수 있음을 도시한다.
도 8은 PEG화가 면역원성의 트랜스제닉 HLA-DR4 마우스 모델에서 NicA2-특이적 항체의 역가를 감소시킬 수 있음을 도시한다. NicA2의 PEG화는 트랜스제닉 DR4 마우스내 평균 NicA2-특이적 항체 역가에서 유의미한(≥ 10배) 감소를 초래하였고(4, 2, 및 2, NicA2-PEG1, -PEG2, 및 -PEG3 그룹으로부터의 동물은 각각 검출 한계(LOD) 미만의 역가를 가졌다), 이는 임상 환경에서 낮은 면역원성 잠재력을 시사한다.
도 9는 PEG화가 NicA2에의 노출에 의해 매개된 인간 T-세포 증식 반응 및 사이토카인 TNFγ 방출을 약화시킴을 도시한다. NicA2의 PEG화는 IFNγ 분비 수준(오른쪽 패널)의 감소 뿐만 아니라 평균 T 세포 증식 자극 지수(왼쪽 패널)의 유의미한 감소를 초래하였다. 3 ≥(점선)의 증가는 유의미한 증가 및 양성 반응으로 간주된다.
도 10은 PEG화된 NicA2 효소가 혈청에서 전체 니코틴 분해 활성을 유지함을 도시한다. PEG화는 랫트 혈청에서 니코틴을 분해하는 NicA2의 능력을 저해하지 않는 것으로 보였다.
도 11은 A107R 치환을 갖는 NicA2 변이체가 야생형 NicA2와 비교하여 낮은 니코틴 농도에서 혈청에서의 활성을 증가시키는 것을 도시한다.
야생형 NicA2 또는 NOX 효소에 비해 증가된 니코틴 분해 활성 및/또는 감소된 면역원성을 나타내는 니코틴 분해 효소, 이들을 포함하는 조성물, 그리고 필요로 하는 대상체에서 니코틴 중독을 치료하기 위한 방법 및 니코틴 중단(예를 들어, 금연)을 촉진시키기 위한 방법을 포함하는, 이들을 이용하는 방법이 본원에 기재되어 있다.
I. 정의
본원에서 사용된 바와 같이, 문맥이 달리 나타내지 않는 한, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 상호교환적으로 사용되며, 복수형을 포함하고 각 의미 내에 포함되도록 의도된다. 또한, 본원에서 사용된 바와 같이, "및/또는"은 열거된 항목 중 하나 이상의 임의의 모든 가능한 순열 및 조합을 가리키며 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 당업자에 의해 이해될 것이고 그것이 사용되는 맥락에 따라 어느 정도 달라질 것이다. 당업자에게 명확하지 않은 용어의 사용이 있는 경우, 그것이 사용되는 문맥을 고려하면, "약"은 특정 용어의 최대 ± 10%를 의미할 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료 유효량" 및 "치료 수준" 문구는 니코틴 분해 효소가 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게, 즉 대상체에서 니코틴을 분해, 및/또는 니코틴 중독을 치료 및/또는 금연을 촉진 및/또는 니코틴 중독을 치료하기 위해, 투여되는 특정 약리학적 효과를 제공하는 대상체에서의 니코틴 분해 효소 투여량 또는 혈장 농도를 의미한다. 이러한 투여량이 당업자에 의해 치료 유효량인 것으로 간주되더라도, 니코틴 분해 효소의 치료 유효량 또는 치료 수준이 주어진 대상체의 니코틴 중독 치료 또는 금연 촉진에 항상 효과적인 것은 아님이 강조된다. 단지 편의상, 예시적인 양이 아래에 제공된다.
당업자는 특정 대상체를 치료하기 위해 필요한 경우 표준 실무에 따라 이러한 양을 조정할 수 있다. 치료 유효량은 투여 경로 및 투약 형태, 대상체의 연령 및 체중, 및/또는 니코틴 중독의 정도, 대상체에 의해 일반적으로 소비된/섭취된 니코틴의 양, 및/또는 치료시 니코틴의 대상체의 혈장 수준 및/또는 치료시 뇌에 국한되는 니코틴의 양을 포함하는, 대상체의 상태에 따라 달라질 수 있다.
니코틴 중독 또는 금연과 관련하여 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 다음 중 하나 이상을 의미한다: 니코틴 회수의 하나 이상의 증상 또는 효과의 감소, 개선 또는 제거; 대상체에 의해 소비된 담배의 수량 또는 니코틴의 양의 감소; 및/또는 니코틴의 대상체의 혈장 수준의 감소 및/또는 대상체의 특정 조직(예를 들어, 뇌/중추 신경계, 심장 및 혈관계 등)에 국한된 니코틴 양의 감소.
니코틴 중독과 관련하여 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 니코틴의 하나 이상의 증상 또는 효과의 감소, 개선 또는 제거 및/또는 니코틴의 대상체의 혈장 수준의 감소 및/또는 대상체의 특정 조직(예를 들어, 뇌/중추 신경계, 심장 및 혈관계 등)에 국한된 니코틴의 양의 감소를 지칭한다.
용어 "개체", "대상체", 및 "환자"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 소, 개, 고양이, 말, 또는 인간과 같은 임의의 개별 포유동물 대상체를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, FDA 가이드 라인에 따르면, "어린이"는 0세부터 약 19세까지의 인간 대상체를 지칭한다. 대상체가 19세 넘어서 치료를 계속하더라도, 어린이는 약 19세가 되기 전에 치료 과정을 시작하는 대상체가 될 수 있다.
II. 니코틴, 니코틴 중독 및 니코틴 독성
니코틴은 담배 및 가지과의 다른 구성원을 포함하는 여러 유형의 식물에 의해 만들어진 질소 함유 화학물질이다. 인간, 포유동물 및 대부분의 다른 유형의 동물이 니코틴에 노출되는 경우, 그들의 심장 박동수, 심장 근육 산소 소비량, 및 심장 박출량을 증가시킨다. 니코틴의 소비는 또한 상승된 기민성, 행복감, 편안함과 관련있다. 그러나, 니코틴은 중독성이 높다.
뇌에서 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 결합함으로써, 니코틴은 이의 정신자극 효과를 이끌어내며 다양한 뇌 구조에서 여러 신경전달물질의 수준을 증가시킨다. 니코틴은 골격근보다 뇌에서 니코틴성 수용체에 대한 친화도가 높지만, 독성 용량에서라도 수축 및 호흡 마비를 유발시킬 수 있다. 니코틴의 선택성은 이들 수용체 아형의 특정 아미노산 차이로 인한 것으로 생각된다. 니코틴의 구조는 하기 화학식 I에서 제시된다.
화학식 I
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정기적으로 니코틴을 소비하고 그 다음 갑자기 멈추는 사람들은, 갈망, 공허감, 불안, 우울증, 우울, 과민반응, 및 부주의를 포함할 수 있는, 금단 증상을 경험한다. 미국 심장 학회에 따르면,(담배를 피우는) 니코틴은 적어도 헤로인만큼 끊기 가장 힘든 물질 중 하나이다.
니코틴 중독은 개인이 살담배, 담배, 니코틴 껌, 패치 또는 전자 담배의 "전자 액체"(예를 들어, 전자 담배 및 기타 기화 장치에 사용되는 니코틴 함유 액체) 또는 담배나 담배 추출물을 함유하는 기타 제품, 또는 니코틴을 함유하는 기타 제품, 공급물 또는 중간체를 소비할 때 발생할 수 있다. 실제로, 최근 연구는 전자 담배에 노출로부터 니코틴 중독의 발생이 2012 년 1 월과 2015 년 4 월 사이에 1492.9% 증가한 것으로 나타났다(Kamboj et al. PEDIATRICS 137(6): e20160041(2016)). 노출이(1 차 또는 2 차) 담배 연기의 흡입을 통해 발생할 수 있어도, 니코틴 중독이나 니코틴 과량투여는 대상체(전형적으로 어린이)가, 예를 들어 니코틴 껌을 씹거나 섭취하거나, 담배 또는 담배 잎 제품을 섭취하거나, 니코틴 패치를 섭취하거나 또는 전자 액체를 섭취함으로써, 더욱 흔히 발생한다. 추가적으로, 니코틴은 피부에 흡수될 수 있으므로, 니코틴 중독은 독성 수준의 니코틴이 피부와 직접 접촉하게 될 수 있다.
니코틴 중독은 신경학적 증상(경련, 혼수, 우울증, 혼란, 졸도, 두통), 심혈관 증상(빠른 심장 박동, 고혈압), 호흡기 증상(호흡 곤란, 급속 호흡), 위장 증상(호흡 곤란, 복부 경련, 구토), 근골격계 증상(근육 경련, 허약), 뿐만 아니라 사망을 만들어낼 수 있다.
III. 니코틴 분해 효소 변이체
본원에 기술된 것은 각각 서열번호: 1 또는 서열번호: 57에 제시된 야생형 NicA2 또는 NOX 효소의 아미노산 서열의 변이체인 아미노산 서열을 포함하는 니코틴 분해 효소 변이체로서, 여기에서 상기 변이체 서열은 야생형 NicA2 또는 NOX에 비해 니코틴 분해 활성을 증가시키고/시키거나 변이체의 면역원성을 감소시키는 서열번호: 1 또는 서열번호: 57과 비교하여 적어도 하나의 치환, 부가, 또는 결실을 갖는다.
NicA2(니코틴 산화환원효소; PPS_4081; GenBank 수탁 번호: AEJ14620.1)은 Pseudomonas putida 균주 S16으로부터 분리되었다. 참조, 예를 들어, Tang et al., PLOS GENETICS, 9(10): e1003923(2013). NicA2의 활성은 S16이 니코틴을 분해하여 N-메틸미오스민으로 산화시키는 촉매 역할을 하는 첫 번째 개입 단계이다. 이것은 니코틴 분해를 담당하는 P. putida S16 대사 캐스케이드에서 필수 효소로 보고된다. 야생형 NicA2 효소의 구조 분석은 Tararina et al., Biochem. 55:6595-98(2016)에 기재되어 있다.
NOX(니코틴 아민 산화효소; GenBank 수탁 번호 : AGH68979.1)은 슈도모나스 속 HZN6으로부터 분리되었다(참조, 예를 들어, Qiu et al., Appl. Environ. Microbiol. 78, 2154-2160(2012); Qiu et al., Appl. Environ. Microbiol. 79, 2164-2171(2013)). NOX는 NicA2와 밀접한 관련이 있으며, 아미노산 상동성은 83%이다. NOX는 NicA2와 같은 촉매 활성을 가지며, 니코틴을 N-메틸미오스민으로 분해하는 것으로 보고되었다.
본원은 개선된 활성 및/또는 감소된 면역원성을 갖는 야생형 NicA2 및 NOX의 변이체를 제공한다. 일부 구현예에서, 개시된 변이체는 야생형 NicA2 또는 NOX의 약 80, 약 85, 약 90, 약 95, 약 96, 약 97, 약 98, 또는 약 99%의 아미노산 상동성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 개시된 변이체는 야생형 NicA2 또는 NOX와 약 80, 약 85, 약 90, 약 95, 약 96, 약 97, 약 98, 또는 약 99%의 상동성을 공유할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 개시된 변이체는 NicA2와 NOX 사이에서 보존된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
야생형 NicA2, 야생형 NOX, 및 이의 예시적인 변이체의 아미노산 서열은 하기 표 1에 나타난다. 개시된 변이체는 C-말단에서 링커 및 His-태그(GGGGSGSGHHHHHH, 서열번호: 139)를 사용하여 생산되었으며, 이후 제거되었다. His-태그는 변이체의 정제를 돕는데 사용되었지만, His-태그가 필요없는 다른 정제용 수단 또는 방법은 또한 사용될 수 있다.
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상기한 바와 같이 니코틴 분해 효소 변이체는 야생형 NicA2 효소에 비해 증가된 니코틴 분해 활성 및/또는 감소된 면역원성을 나타낼 수 있다. 변이체는, 하나 이상의 결실, 부가, 또는 치환을 포함하는, 야생형 NicA2의 아미노산 서열에 대한 하나 이상의 변이를 포함할 수 있다. 치환 돌연변이는 "보존적" 또는 "비보존적"일 수 있다. "보존적"은 아미노산의 동일한 계열 내에서의 치환을 말하며, "비보존적"은 아미노산의 계열에 걸쳐서 치환을 말한다. 아미노산의 계열 그리고 그에 관련된 "보존적" 및 "비보존적" 치환은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 자연 발생 아미노산은 다음 4 계열로 나뉠 수 있으며 보존적 치환은 그 계열 내에서 발생할 것이고, 비보존적 치환은 다른 계열에 걸쳐서 발생할 것이다.
1) 염기성 측쇄를 가진 아미노산: 라이신, 아르기닌, 히스티딘.
2) 산성 측쇄를 가진 아미노산: 아스파르트산, 글루탐산
3) 비하전된 극성 측쇄를 가진 아미노산: 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신.
4) 비극성 측쇄를 가진 아미노산: 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판, 시스테인.
일부 구현예에서, 니코틴 분해 효소 변이체는 그의 니코틴 분해 활성과 관련된 야생형 NicA2 효소의 활성 부위에 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 서열번호: 1의 아미노산 잔기 90-93, 95, 102-109, 113, 116, 130, 132, 138, 155, 159, 210, 213-215, 217-220, 234, 245, 246, 248-251, 253, 254, 258, 334, 336, 339-342, 353, 355, 363-367, 378-382, 415-418, 423-429, 459-463, 465, 또는 466 중 어느 하나로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 돌연변이, 예컨대 표 2에서 열거된 그리고 도 3의 구조에서 도시된 위치에서 하나 이상의 보존적 치환, 비보존적 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다. 표 2에서 확인된 쉘 1 잔기는 공동 표면을 구성하는 반면, 쉘 2 잔기는 쉘 1과 접촉한다(도 3 참조). 예를 들어, 일부 구현예에서, 개시된 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 1의 아미노산 위치 91, 104, 106, 107, 217, 250, 340, 355, 366, 381, 427, 462, 또는 463에서 적어도 하나의 치환을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 변이체는 1, 2 또는 3 이상의 치환을 포함할 수 있다.
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일부 구현예에서, 니코틴 분해 효소 변이체는 그 니코틴 분해 활성과 관련된 야생형 NOX 효소에 대한 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 서열번호: 57의 아미노산 잔기 423에서의 돌연변이, 예컨대 하나 이상의 보존적 치환, 비보존적 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 변이체는 치환 W423A, W423S, W423E, 또는 W423H를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 니코틴 분해 활성을 증가시키거나 효소의 촉매 활성을 증가시키는 적어도 하나의 돌연변이는 변이체에 도입되어, 변이체가 보다 신속하게 및/또는 보다 효율적으로 니코틴을 분해할 수 있게 한다. 일부 구현예에서, 이러한 돌연변이는, 비제한적으로, kcat의 증가, KM의 감소, kcat/KM의 증가 및/또는 Vmax의 증가를 포함하는, 다양한 효소적 성능 측정치를 개선시킬 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 변이체는 야생형 NicA2 또는 야생형 NOX 효소의 활성 부위에서 및/또는 방향족 케이지에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 이상의 돌연변이를 포함할 수 있고, 야생형 NicA2 효소에 비해 증가된 kcat, 감소된 KM, 증가된 kcat/KM, 및/또는 증가된 Vmax에 의해 측정된 경우 증가된 니코틴 분해 활성을 나타낸다.
일부 구현예에서, 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 1의 위치 427에서 트립토판 및 위치 462에서 아스파라긴에 의해 형성된 야생형 NicA2 효소의 방향족 케이지에서 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 하나 이상의 보존적 치환, 비보존적 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 니코틴 분해 활성을 증가시키는 돌연변이는 서열번호: 1의 위치 427 또는 462 중 하나 이상, 예컨대, 서열번호: 1의 위치 427 또는 462 중 하나 이상에서 보존적 치환, 비보존적 치환, 부가, 또는 결실이다.
일부 구현예에서, 위치 427에서의 돌연변이는 치환 W427Q이고, 여기서(방향족 케이지에서) 서열번호: 1의 위치 427에서의 트립토판(W)는 글루타민(Q)로 치환된다. 서열번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 이것은 비극성, 방향족 아미노산이 극성, 비하전된 아미노산으로 대체되는 비보존적 치환이다. 일반적으로, 효소의 활성 부위로의 비보존적 치환은 효소를 기능정지 또는 작동불능으로 만들 것으로 예상되지만, 놀랍게도, 상기 변이체는 야생형 NicA2 효소와 비교하여 유의미하게 증가된 효소 분해 활성을 나타낸다.
일부 구현예에서, 위치 427에서의 돌연변이는 치환 W427E이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 427에서의 트립토판(W)는 글루탐산(E)로 치환된다. 서열번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 치환 W427S이고, 여기서 서열번호: 1의 427 위치에서의 트립토판(W)는 세린(S)로 치환된다. 서열번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 치환 W427M이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 427에서의 트립토판(W)는 메티오닌(M)으로 치환된다. 서열번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 치환 W427R이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 427에서의 트립토판(W)는 아르기닌(R)로 치환된다. 서열번호: 135의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 치환 W427H이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 427에서의 트립토판(W)는 히스티딘(H)로 치환된다. 서열번호: 137의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 치환 W427M이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 427에서의 트립토판(W)는 류신(L)로 치환된다. 서열번호: 138의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다.
일부 구현예에서, 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 1의 위치 91에서 아르기닌(R)에서의 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 하나 이상의 보존적 치환, 비보존적 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 니코틴 분해 활성을 증가시키는 돌연변이는 서열번호: 1의 위치 91, 104, 106, 107, 217, 250, 340, 355, 366, 381, 427, 462, 또는 463 중 하나 이상, 예컨대 서열번호: 1의 위치 91, 104, 106, 107, 217, 250, 340, 355, 366, 381, 427, 462, 또는 463 중 하나 이상에서 보존적 치환, 비보존적 치환, 부가, 또는 결실이다.
일부 구현예에서, 위치 91에서의 돌연변이는 치환 R91A이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 91에서 아르기닌(R)은 알라닌(A)로 치환된다. 서열번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 91에서의 돌연변이는 치환 R91Q이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 91에서 아르기닌(R)은 글루타민(Q)로 치환된다. 서열번호: 10 및 129의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 91에서의 돌연변이는 치환 R91F이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 91에서 아르기닌(R)은 페닐알라닌(F)로 치환된다. 서열번호: 11의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 91에서의 돌연변이는 치환 R91G이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 91에서 아르기닌(R)은 글리신(G)로 치환된다. 서열번호: 12의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 91에서의 돌연변이는 치환 R91T이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 91에서 아르기닌(R)은 트레오닌(T)로 치환된다. 서열번호: 13의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 91에서의 돌연변이는 치환 R91L이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 91에서의 아르기닌(R)은 류신(L)로 치환된다. 서열번호: 14의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 91에서의 돌연변이는 치환 R91S이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 91에서 아르기닌(R)은 세린(S)로 치환된다. 서열번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 91에서의 돌연변이는 치환 R91N이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 91에서 아르기닌(R)은 아스파라긴(N)으로 치환된다. 서열번호: 16의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다.
일부 구현예에서, 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 1의 위치 250에서 트레오닌(T)에서의 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 하나 이상의 보존적 치환, 비보존적 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 니코틴 분해 활성을 증가시키는 돌연변이는 서열번호: 1의 위치 91, 104, 106, 107, 217, 250, 340, 355, 366, 381, 427, 462, 또는 463 중 하나 이상, 예컨대 서열번호: 1의 위치 91, 104, 106, 107, 217, 250, 340, 355, 366, 381, 427, 462, 또는 463 중 하나 이상에서 보존적 치환, 비보존적 치환, 부가, 또는 결실이다.
일부 구현예에서, 위치 250에서의 돌연변이는 치환 T250G이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 250에서의 트레오닌(T)는 글리신(G)로 치환된다. 서열번호: 17의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 250에서의 돌연변이는 치환 T250L이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 250에서의 트레오닌(T)는 류신(L)로 치환된다. 서열번호: 18의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 250에서의 돌연변이는 치환 T250R이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 250에서의 트레오닌(T)는 아르기닌(R)로 치환된다. 서열번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 250에서의 돌연변이는 치환 T250V이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 250에서의 트레오닌(T)는 발린(V)로 치환된다. 서열번호: 20의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 250에서의 돌연변이는 치환 T250P이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 250에서의 트레오닌(T)는 프롤린(P)로 치환된다. 서열번호: 136의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다.
일부 구현예에서, 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 1의 위치 340에서 라이신(K)에서의 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 하나 이상의 보존적 치환, 비보존적 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 니코틴 분해 활성을 증가시키는 돌연변이는 서열번호: 1의 위치 91, 104, 106, 107, 217, 250, 340, 355, 366, 381, 427, 462, 또는 463 중 하나 이상, 예컨대 서열번호: 1의 위치 91, 104, 106, 107, 217, 250, 340, 355, 366, 381, 427, 462, 또는 463 중 하나 이상에서 보존적 치환, 비보존적 치환, 부가, 또는 결실이다.
일부 구현예에서, 위치 340에서의 돌연변이는 치환 K340P이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 340에서 라이신(K)는 프롤린(P)로 치환된다. 서열번호: 21의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 340에서의 돌연변이는 치환 K340I이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 340에서 라이신(K)는 이소류신(I)로 치환된다. 서열번호: 22의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 340에서의 돌연변이는 치환 K340V이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 340에서 라이신(K)는 발린(V)로 치환된다. 서열번호: 23의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 340에서의 돌연변이는 치환 K340D이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 340에서 라이신(K)는 아스파르트산(D)로 치환된다. 서열번호: 24의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 340에서의 돌연변이는 치환 K340E이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 340에서 라이신(K)는 글루탐산(E)로 치환된다. 서열번호: 25의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다.
일부 구현예에서, 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 1의 위치 366에서 글루타민(Q)에서의 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 하나 이상의 보존적 치환, 비보존적 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 니코틴 분해 활성을 증가시키는 돌연변이는 서열번호: 1의 위치 91, 104, 106, 107, 217, 250, 340, 355, 366, 381, 427, 462, 또는 463 중 하나 이상, 예컨대 서열번호: 1의 위치 91, 104, 106, 107, 217, 250, 340, 355, 366, 381, 427, 462, 또는 463 중 하나 이상에서 보존적 치환, 비보존적 치환, 부가, 또는 결실이다.
일부 구현예에서, 위치 366에서의 돌연변이는 치환 Q366K이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 366에서의 글루타민(Q)는 라이신(K)로 치환된다. 서열번호: 26 및 130의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 366에서의 돌연변이는 치환 Q366E이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 366에서의 글루타민(Q)는 글루탐산(E)로 치환된다. 서열번호: 27의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 366에서의 돌연변이는 치환 Q366V이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 366에서의 글루타민(Q)는 발린(V)로 치환된다. 서열번호: 28의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 366에서의 돌연변이는 치환 Q366L이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 366에서의 글루타민(Q)는 류신(L)로 치환된다. 서열번호: 29의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 366에서의 돌연변이는 치환 Q366I이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 366에서의 글루타민(Q)는 이소류신(I)로 치환된다. 서열번호: 30의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 366에서의 돌연변이는 치환 Q366Y이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 366에서의 글루타민(Q)는 티로신(Y)로 치환된다. 서열번호: 31의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다.
일부 구현예에서, 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 1의 위치 381에서의 트레오닌(T)에서의 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 하나 이상의 보존적 치환, 비보존적 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 니코틴 분해 활성을 증가시키는 돌연변이는 서열번호: 1의 위치 91, 104, 106, 107, 217, 250, 340, 355, 366, 381, 427, 462, 또는 463 중 하나 이상, 예컨대 서열번호: 1의 위치 91, 104, 106, 107, 217, 250, 340, 355, 366, 381, 427, 462, 또는 463 중 하나 이상에서 보존적 치환, 비보존적 치환, 부가, 또는 결실이다.
일부 구현예에서, 위치 381에서의 돌연변이는 치환 T381P이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 381에서의 트레오닌(T)는 프롤린(P)로 치환된다. 서열번호: 32의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 381 위치에서의 돌연변이는 치환 T381I이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 381에서의 트레오닌(T)는 이소류신(I)로 치환된다. 서열번호: 33의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 381에서의 돌연변이는 치환 T381V이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 381에서의 트레오닌(T)는 발린(V)로 치환된다. 서열번호: 34 및 131의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 381에서의 돌연변이는 치환 T381Q이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 381에서의 트레오닌(T)는 글루타민(Q)로 치환된다. 서열번호: 35의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 381에서의 돌연변이는 치환 T381N이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 381에서의 트레오닌(T)는 아스파라긴(N)으로 치환된다. 서열번호: 36의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 381에서의 돌연변이는 치환 T381L이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 381에서의 트레오닌(T)는 류신(L)로 치환된다. 서열번호: 37의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 381에서의 돌연변이는 치환 T381M이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 381에서의 트레오닌(T)는 메티오닌(M)으로 치환된다. 서열번호: 38의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다.
일부 구현예에서, 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 1의 위치 462에서의 아스파라긴(N)에서의 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 하나 이상의 보존적 치환, 비보존적 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 니코틴 분해 활성을 증가시키는 돌연변이는 서열번호: 1의 위치 91, 104, 106, 107, 217, 250, 340, 355, 366, 381, 427, 462, 또는 463 중 하나 이상, 예컨대 서열번호: 1의 위치 91, 104, 106, 107, 217, 250, 340, 355, 366, 381, 427, 462, 또는 463 중 하나 이상에서 보존적 치환, 비보존적 치환, 부가, 또는 결실이다.
일부 구현예에서, 위치 462에서의 돌연변이는 치환 N462L이고, 서열번호: 1의 위치 462에서의 아스파라긴(N)은 류신(L)로 치환된다. 서열번호: 39 및 132의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 462에서의 돌연변이는 치환 N462Y이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 462에서의 아스파라긴(N)은 티로신(Y)로 치환된다. 서열번호: 40 및 133의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 462에서의 돌연변이는 치환 N462S이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 462에서의 아스파라긴(N)은 세린(S)로 치환된다. 서열번호: 41의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 462에서의 돌연변이는 치환 N462F이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 462에서의 아스파라긴(N)은 페닐알라닌(F)로 치환된다. 서열번호: 42 및 137의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 462에서의 돌연변이는 치환 N462G이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 462에서의 아스파라긴(N)은 글리신(G)로 치환된다. 서열번호: 43의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 462에서의 돌연변이는 치환 N462E이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 462에서의 아스파라긴(N)은 글루탐산(E)로 치환된다. 서열번호: 44의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 462에서의 돌연변이는 치환 N462A이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 462에서의 아스파라긴(N)은 알라닌(A)로 치환된다. 서열번호: 45의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 462에서의 돌연변이는 치환 N462M이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 462에서의 아스파라긴(N)은 메티오닌(M)으로 치환된다. 서열번호: 138의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다.
일부 구현예에서, 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 1의 위치 463에서 이소류신(I)에서의 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 하나 이상의 보존적 치환, 비보존적 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 니코틴 분해 활성을 증가시키는 돌연변이는 서열번호: 1의 위치 91, 104, 106, 107, 217, 250, 340, 355, 366, 381, 427, 462, 또는 463 중 하나 이상, 예컨대 서열번호: 1의 위치 91, 104, 106, 107, 217, 250, 340, 355, 366, 381, 427, 462, 또는 463 중 하나 이상에서 보존적 치환, 비보존적 치환, 부가, 또는 결실이다.
일부 구현예에서, 위치 463에서의 돌연변이는 치환체 I463F이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 463에서의 이소류신(I)는 페닐알라닌(F)로 치환된다. 서열번호: 46의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 463에서의 돌연변이는 치환 I463Y이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 463에서의 이소류신(I)는 티로신(Y)로 치환된다. 서열번호: 47의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 463에서의 돌연변이는 치환 I463A이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 463에서의 이소류신(I)는 알라닌(A)로 치환된다. 서열번호: 48의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 463에서의 돌연변이는 치환 I463V이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 463에서의 이소류신(I)는 발린(V)로 치환된다. 서열번호: 49의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 463에서의 돌연변이는 치환체 I463L이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 463에서의 이소류신(I)는 류신(L)로 치환된다. 서열번호: 50의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다.
일부 구현예에서, 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 1의 위치 217에서 류신(L)의 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 하나 이상의 보존적 치환, 비보존적 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 니코틴 분해 활성을 증가시키는 돌연변이는 서열번호: 1의 위치 91, 104, 106, 107, 217, 250, 340, 355, 366, 381, 427, 462, 또는 463 중 하나 이상, 예컨대 서열번호: 1의 위치 91, 217, 250, 340, 366, 381, 427, 462, 또는 463 중 하나 이상에서 보존적 치환, 비보존적 치환, 부가, 또는 결실이다.
일부 구현예에서, 위치 217에서의 돌연변이는 치환 L217Q이며, 여기서 서열번호: 1의 위치 217에서의 류신(L)은 글루타민(Q)로 치환된다. 서열번호: 51의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 217에서의 돌연변이는 치환 L217G이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 217에서의 류신(L)은 글리신(G)로 치환된다. 서열번호: 52의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 217에서의 돌연변이는 치환 L217E이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 217에서의 류신(L)은 글루탐산(E)로 치환된다. 서열번호: 53의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 217에서의 돌연변이는 치환 L217I이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 217에서의 류신(L)은 이소류신(I)로 치환된다. 서열번호: 54의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 217에서의 돌연변이는 치환 L217C이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 217에서의 류신(L)은 시스테인(C)로 치환된다. 서열번호: 55의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 217에서의 돌연변이는 치환 L217S이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 217에서의 류신(L)은 세린(S)로 치환된다. 서열번호: 56의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다.
일부 구현예에서, 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 1의 위치 107에서 알라닌(A)에서의 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 하나 이상의 보존적 치환, 비보존적 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 니코틴 분해 활성을 증가시키는 돌연변이는 서열번호: 1의 위치 91, 104, 106, 107, 217, 250, 340, 355, 366, 381, 427, 462, 또는 463 중 하나 이상, 예컨대 서열번호: 1의 위치 91, 104, 106, 107, 217, 250, 340, 355, 366, 381, 427, 462, 또는 463 중 하나 이상에서 보존적 치환, 비보존적 치환, 부가, 또는 결실이다.
일부 구현예에서, 위치 107에서의 돌연변이는 치환 A107R이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 107에서의 알라닌(A)는 아르기닌(R)로 치환된다. 서열번호: 124 또는 134의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 107에서의 돌연변이는 치환 A107K이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 107에서의 알라닌(A)는 라이신(K)로 치환된다. 서열번호: 125의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 107에서의 돌연변이는 치환 A107T이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 107에서의 알라닌(A)는 티로신(T)로 치환된다. 서열번호: 126의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 107에서의 돌연변이는 치환 A107H이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 107에서의 알라닌(A)는 히스티딘(H)로 치환된다. 서열번호: 142의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 107에서의 돌연변이는 치환 A107P이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 107에서의 알라닌(A)는 프롤린(P)로 치환된다. 서열번호: 143의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다.
일부 구현예에서, 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 1의 위치 355에서 페닐알라닌(F)에서의 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 하나 이상의 보존적 치환, 비보존적 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 니코틴 분해 활성을 증가시키는 돌연변이는 서열번호: 1의 위치 91, 104, 106, 107, 217, 250, 340, 355, 366, 381, 427, 462, 또는 463 중 하나 이상, 예컨대 서열번호: 1의 위치 91, 104, 106, 107, 217, 250, 340, 355, 366, 381, 427, 462, 또는 463 중 하나 이상에서 보존적 치환, 비보존적 치환, 부가, 또는 결실이다.
일부 구현예에서, 위치 355에서의 돌연변이는 치환 F355C이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 355에서 페닐알라닌(F)가 시스테인(C)로 치환된다. 서열번호: 127의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 355에서의 돌연변이는 치환 F355V이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 355에서의 페닐알라닌(F)가 발린(V)로 치환된다. 서열번호: 128의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다.
일부 구현예에서, 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 1의 위치 104에서의 페닐알라닌(F)에서의 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 하나 이상의 보존적 치환, 비보존적 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 니코틴 분해 활성을 증가시키는 돌연변이는 서열번호: 1의 위치 91, 104, 106, 107, 217, 250, 340, 355, 366, 381, 427, 462, 또는 463 중 하나 이상, 예컨대 서열번호: 1의 위치 91, 104, 106, 107, 217, 250, 340, 355, 366, 381, 427, 462, 또는 463 중 하나 이상에서 보존적 치환, 비보존적 치환, 부가, 또는 결실이다.
일부 구현예에서, 위치 104에서의 돌연변이는 치환체 F104L이고, 여기서 서열번호: 1의 위치 104에서의 페닐알라닌(F)는 류신(L)로 치환된다. 서열번호: 140의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다.
일부 구현예에서, 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 1의 위치 106에서 글리신(G)에서의 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 하나 이상의 보존적 치환, 비보존적 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 니코틴 분해 활성을 증가시키는 돌연변이는 서열번호: 1의 위치 91, 104, 106, 107, 217, 250, 340, 355, 366, 381, 427, 462, 또는 463 중 하나 이상, 예컨대 서열번호: 1의 위치 91, 104, 106, 107, 217, 250, 340, 355, 366, 381, 427, 462, 또는 463 중 하나 이상에서 보존적 치환, 비보존적 치환, 부가, 또는 결실이다.
일부 구현예에서, 위치 106에서의 돌연변이는 서열번호: 1의 위치 106에서의 글리신(G)가 세린(S)로 치환되는 치환 G106S이다. 서열번호: 141의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다.
일부 구현예에서, 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 1에 대해 1, 2 또는 3 이상의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 니코틴 분해 효소는 서열번호: 1의 위치 427에서 트립토판(W)에서의 돌연변이, 위치 262에서 이소류신(I)에서의 돌연변이, 그리고 위치 263에서 아스파라긴(N)에서의 돌연변이, 예컨대 하나 이상의 보존적 치환, 비보존적 치환, 부가, 또는 결실을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 니코틴 분해 활성을 증가시키는 적어도 하나의 돌연변이는 서열번호: 1의 위치 107, 355, 262, 263, 217, 91, 463, 381, 366, 340, 250, 427, 또는 462 중 1, 2, 또는 3 이상, 예컨대 서열번호: 1의 위치 107, 355, 262, 263, 217, 91, 463, 381, 366, 340, 250, 427, 또는 462 중 하나 이상에서 보존적 치환, 비보존적 치환, 부가, 또는 결실이다.
일부 구현예에서, 돌연변이는 W427Q 및 I262A의 이중 치환이고, 예컨대 여기서 서열번호: 1의 위치 427에서의 트립토판(W)는 글루타민(Q)로 치환되고 서열번호: 1의 위치 262에서의 이소류신(I)는 알라닌(A)로 치환된다. 서열번호: 62의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 W427H 및 N462F의 이중 치환이고, 예컨대 여기서 서열번호: 1의 위치 427에서의 트립토판(W)는 히스티딘(H)로 치환되고 서열번호: 1의 위치 462에서의 아스파라긴(N)은 페닐알라닌(F)로 치환된다. 서열번호: 137의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 W427L 및 N462M의 이중 치환이고, 예컨대 여기서 서열번호: 1의 위치 427에서의 트립토판(W)는 류신(L)로 치환되고 서열번호: 1의 위치 462에서의 아스파라긴(N)은 메티오닌(M)으로 치환된다. 서열번호: 138의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 W427Q, I262T 및 N263R의 3중 치환이고, 예컨대 여기서 서열번호: 1의 위치 427에서의 트립토판(W)는 글루타민(Q)로 치환되고, 서열번호: 1의 262 위치에서의 이소류신(I)는 트레오닌(T)로 치환되고, 서열번호: 1의 263 위치에서의 아스파라긴(N)은 아르기닌(R)로 치환된다. 서열번호: 63의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다.
일부 구현예에서, 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 57의 위치 423에서 트립토판(W)에서의 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 하나 이상의 보존적 치환, 비보존적 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 니코틴 분해 활성을 증가시키는 돌연변이는 서열번호: 57의 423을 포함하는 위치 중 하나 이상, 예컨대 서열번호: 57의 위치 423 중 하나 이상에서 보존적 치환, 비보존적 치환, 부가, 또는 결실이다.
일부 구현예에서, 위치 423에서의 돌연변이는 치환 W423A이고, 여기서 서열번호: 57의 위치 423에서의 트립토판(W)는 알라닌(A)로 치환된다. 서열번호: 58의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 423에서의 돌연변이는 치환 W423S이고, 여기서 서열번호: 57의 위치 423에서의 트립토판(W)는 세린(S)로 치환된다. 서열번호: 59의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 423에서의 돌연변이는 치환 W423E이고, 여기서 서열번호: 57의 위치 423에서의 트립토판(W)는 글루탐산(E)로 치환된다. 서열번호: 60의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다. 일부 구현예에서, 위치 423에서의 돌연변이는 치환 W423H이고, 여기서 서열번호: 57의 위치 423에서의 트립토판(W)는 히스티딘(H)로 치환된다. 서열번호: 61의 아미노산 서열을 갖는 변이체는 이러한 변이체 유형의 예이다.
부가적으로 또는 대안적으로, 일부 구현예에서, 니코틴 분해 효소 변이체는 면역원성 T 세포 에피토프 내에 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 서열번호: 1의 위치 10-32, 68-94, 189-225, 248-285, 296-327, 336-391, 또는 435-459로부터 선택된 영역 내의 면역원성 T 세포 에피토프 내의 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 서열번호: 1의 위치 16-24, 73-81, 258-266, 302-310, 373-381, 또는 447-455로부터 선택된 면역원성 T 세포 에피토프 내의 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 이들 영역 중 하나 이상에서 하나 이상의 보존적 치환, 비보존적 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 개의 면역원성 T-세포 에피토프에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 변이체는 포유동물 대상체에게 투여될 때 감소된 면역원성을 나타낸다.
일부 구현예에서, 니코틴 분해 효소 변이체는, 이들의 모든 순열 및 조합을 포함하는, 서열번호: 1의 74, 77, 78, 80, 262-266, 303, 304, 306, 310, 374, 377, 378, 382, 383, 450-452, 또는 457로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 면역원성 T 세포 에피토프에서의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 변이체는, 에피토프 B에서의 하나 이상의 예시적인 돌연변이, 에피토프 1에서의 하나 이상의 예시적인 돌연변이, 에피토프 2에서의 하나 이상의 예시적인 돌연변이, 에피토프 3에서의 하나 이상의 예시적인 돌연변이, 및/또는 에피토프 4에서의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 아래 제시된 임의의 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 니코틴 분해 효소는 I262A 치환 또는 I262T/N263R 치환과 같은 서열번호: 1의 위치 262 및/또는 263에서 아미노산 치환을 가질 수 있다.
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부가적으로 또는 대안적으로, 일부 구현예에서, 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 1 또는 서열번호: 57의 1 내지 52 아미노산 잔기로부터의 N-말단 결실을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 변이체는 서열번호: 1 또는 서열번호: 57의 아미노산 잔기 1-16, 1-25, 1-38, 1-50, 1-51, 또는 1-52의 N-말단 결실을 포함한다. 따라서, 개시된 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 또는 52 연속 아미노산의 N-말단 결실을 포함한다.
일부 구현예에서, 개시된 변이체는 부가적으로 또는 대안적으로 펩타이드의 C-말단에서 결실을 포함할 수 있다. 예를 들어, 개시된 변이체는 펩타이드의 C-말단에서 하나 이상의 아미노산의 결실을 포함할 수 있다. 예를 들어, NicA2 변이체에서, 야생형 서열의 S482에 상응하는 아미노산은 결실될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 야생형 NicA2 효소(서열번호: 1)과, 또는 서열번호: 1의 최대 52 N-말단 아미노산 잔기의 결실을 갖는 이의 N-말단 결실 변이체에 대해 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 5이거나 또는 서열번호: 5를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 5의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 6이거나 또는 서열번호: 6을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 6의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 7이거나 또는 서열번호: 7을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 7의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 8이거나 또는 서열번호: 8을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 8의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 9이거나 또는 서열번호: 9를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 9의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 10이거나 또는 서열번호: 10을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 10의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 11이거나 또는 서열번호: 11을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 11의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 12이거나 또는 서열번호: 12를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 12의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 13이거나 또는 서열번호: 13을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 13의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 14이거나 또는 서열번호: 14를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 14의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 15이거나 또는 서열번호: 15를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 15의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 16이거나 또는 서열번호: 16을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 16의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 17이거나 또는 서열번호: 17을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 17의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 18이거나 또는 서열번호: 18을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 18의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 19이거나 또는 서열번호: 19를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 19의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 20이거나 또는 서열번호: 20을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 20의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 21이거나 또는 서열번호: 21을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 21의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 22이거나 또는 서열번호: 22를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 22의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 23이거나 또는 서열번호: 23을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 23의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 24이거나 또는 서열번호: 24를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 24의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 25이거나 또는 서열번호: 25를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 25의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 26이거나 또는 서열번호: 26을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 26의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 27이거나 또는 서열번호: 27을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 27의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 28이거나 또는 서열번호: 28을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 28의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 29이거나 또는 서열번호: 29를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 29의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 30이거나 또는 서열번호: 30을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 30의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 31이거나 또는 서열번호: 31을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 31의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 32이거나 또는 서열번호: 32를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 32의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 33이거나 또는 서열번호: 33을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 33의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 34이거나 또는 서열번호: 34를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 34의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 35이거나 또는 서열번호: 35를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 35의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 36이거나 또는 서열번호: 36을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 36의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 37이거나 또는 서열번호: 37을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 37의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 38이거나 또는 서열번호: 38을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 38의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 39이거나 또는 서열번호: 39를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 39의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 40이거나 또는 서열번호: 40을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 40의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 41이거나 또는 서열번호: 41을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 41의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 42이거나 또는 서열번호: 42를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 42의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 43이거나 또는 서열번호: 43을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 43의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 44이거나 또는 서열번호: 44를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 44의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 45이거나 또는 서열번호: 45를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 45의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 46이거나 또는 서열번호: 46을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 46의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 47이거나 또는 서열번호: 47을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 47의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 48이거나 또는 서열번호: 48을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 48의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 49 또는 서열번호: 49를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 49의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 50 또는 서열번호: 50을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 50의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 51이거나 또는 서열번호: 51을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 51의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 52이거나 또는 서열번호: 52를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 52의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 53이거나 또는 서열번호: 53을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 53의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 54이거나 또는 서열번호: 54를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 54의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 55이거나 또는 서열번호: 55를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 55의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 56이거나 또는 서열번호: 56을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 56의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 57이거나 또는 서열번호: 57을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 57의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 58이거나 또는 서열번호: 58을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 58의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 59이거나 또는 서열번호: 59를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 59의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 60이거나 또는 서열번호: 60을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 60의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 61이거나 또는 서열번호: 61을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 61의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 62이거나 또는 서열번호: 62를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 62의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 63이거나 또는 서열번호: 63을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 63의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 124이거나 또는 서열번호: 124를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 124의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 125이거나 또는 서열번호: 125를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 125의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 126이거나 또는 서열번호: 126을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 126의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 127이거나 또는 서열번호: 127을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 127의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 128이거나 또는 서열번호: 128을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 128의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 129이거나 또는 서열번호: 129를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 129의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 130이거나 또는 서열번호: 130을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 130의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 131이거나 또는 서열번호: 131을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 131의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 132이거나 또는 서열번호: 132를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 132의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 133이거나 또는 서열번호: 133을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 133의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 134이거나 또는 서열번호: 134를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 134의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 135이거나 또는 서열번호: 135를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 135의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 136이거나 또는 서열번호: 136을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 136의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 137이거나 또는 서열번호: 137을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 137의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 138이거나 또는 서열번호: 138을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 138의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 140이거나 또는 서열번호: 140을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 140의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 141이거나 또는 서열번호: 141을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 141의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 142이거나 또는 서열번호: 142를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 142의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 143이거나 또는 서열번호: 143을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체는 서열번호: 143의 변이체 서열과 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 변이체는 야생형 NicA2 또는 NOX 효소에 비해 증가된 니코틴 분해 활성을 나타내어, 이로써 그 활성은, AMPLEX® Red 검정(Thermo Fisher Scientific)과 같은 검정에 의해 결정된 바와 같이, 야생형 NicA2 또는 NOX 효소보다 적어도 약 110%, 약 120%, 약 130%, 약 140%, 약 150%, 약 160%, 약 170%, 약 180%, 약 190%, 약 200%, 약 210%, 약 220%, 약 230%, 약 240%, 약 250%, 약 260%, 약 270% , 약 280%, 약 290%, 약 300%, 약 310%, 약 320%, 약 330%, 약 340%, 약 350%, 약 360%, 약 370%, 약 380%, 약 390%, 약 400%, 약 410%, 약 420%, 약 430%, 약 440%, 약 450%, 약 460%, 약 470%, 약 480%, 약 490%, 약 500%, 약 550%, 약 600%, 약 650%, 약 700%, 약 750%, 약 800%, 약 850%, 약 900%, 약 950%, 약 1000%, 약 1100%, 약 1200%, 약 1300%, 약 1400%, 약 1500%, 약 1600%, 약 1700%, 약 1800%, 약 1900%, 약 2000%, 약 2250%, 약 2500%, 약 2750%, 약 3000%, 약 3250%, 약 3500%, 약 3750%, 약 4000%, 약 4250%, 약 4500%, 약 4750%, 또는 약 5000%이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 변이체는 야생형 NicA2 또는 NOX 효소에 비해 증가된 니코틴 분해 활성을 나타내어, 이로써 그 활성은 잔류 니코틴 농도가 37 ℃의 완충액 또는 랫트 혈청에서 고정된 농도의 효소로 배양 그리고 MeOH와 혼합에 의해 고정된 시점에서 활성을 급냉시킨 후 가스 크로마토그래피(GC; Hieda et al.: Immunization of rats reduces nicotine distribution to brain. Psychopharmacology, 143, 150-157, 1999)를 사용하여 측정되는 검정에 의해 결정된 바와 같이 야생형 NicA2 또는 NOX 효소보다 적어도 약 110%, 약 120%, 약 130%, 약 140%, 약 150%, 약 160%, 약 170%, 약 180%, 약 190%, 약 200%, 약 210%, 약 220%, 약 230%, 약 240%, 약 250%, 약 260%, 약 270%, 약 280%, 약 290%, 약 300%, 약 310%, 약 320%, 약 330%, 약 340%, 약 350%, 약 360%, 약 370%, 약 380%, 약 390%, 약 400%, 약 410%, 약 420%, 약 430%, 약 440%, 약 450%, 약 460%, 약 470%, 약 480%, 약 490%, 약 500%, 약 550%, 약 600%, 약 650%, 약 700%, 약 750%, 약 800%, 약 850%, 약 900%, 약 950%, 약 1000%, 약 1100%, 약 1200%, 약 1300%, 약 1400%, 약 1500%, 약 1600%, 약 1700%, 약 1800%, 약 1900%, 약 2000%, 약 2250%, 약 2500%, 약 2750%, 약 3000%, 약 3250%, 약 3500%, 약 3750%, 약 4000%, 약 4250%, 약 4500%, 약 4750%, 또는 약 5000%이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 변이체는 야생형 NicA2 또는 NOX와 비교하여 포유동물 대상체에서 감소된 면역원성을 나타내어, 이로써 야생형 NicA2 또는 NOX 효소보다 적어도 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100% 더 적은 면역원성이다. 달리 명시하지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같은 야생형 NicA2 또는 NOX 효소와 비교하여 "감소된 면역원성"은 하나 이상의 인실리코 접근법, 시험관내 검정, 생체내 연구(예를 들어, 형질전환 동물 사용), 인간 T-세포를 사용한 생체외 연구, 또는 인간 대상체로의 임상 연구에 의해 나타난 경우 감소된 면역원성을 나타낸다.
IV. 약학 조성물
본원에 개시된 니코틴 분해 효소 변이체는, 하기에 보다 상세히 논의된 바와 같이, 미리 결정된 투여 경로를 통해 표적 대상체(즉, 인간 또는 다른 포유동물)에 투여하기에 적합한 약학 조성물로 제형화될 수 있다.
약학 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이체 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다.
조성물은 정맥내, 피하, 복강내, 근육내, 경구, 비강, 폐, 안구, 질, 또는 직장 투여용으로 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 리포좀 제형, 등과 같이 정맥내, 피하, 복강내, 또는 근육내 투여용으로 제형화된다. 약학 조성물은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 즉시 방출성 조성물, 서방성 조성물, 지연 방출성 조성물 등이 되도록 제형화될 수 있다.
다양한 투여 형태에 대한 약학적으로 허용가능한 담체는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 고체 제제용 부형제, 윤활제, 결합제 및 붕해제가 공지되고; 액체 제제용 용매, 가용화제, 현탁제, 등장제, 완충제, 및 진정제가 공지된다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 하나 이상의 보존제, 항산화제, 착색제, 감미제/방향제, 흡착제, 습윤제 등과 같은 하나 이상의 추가 성분을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 주사 또는 주입에 의한 투여용으로 제형화된다. 일부 구현예에서, 조성물은 경구 투여용으로 제형화된다.
일부 구현예에서, 니코틴 분해 효소 변이체는(투여 후) 생체내 그의 반감기를 연장시키기 위해 변형된 지속 작용성 변이체이다. 다양한 기술은 펩타이드의 순환 반감기를 연장시키기 위해 당업계에 공지된다. 예를 들어, 일부 구현예에서 변이체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 반감기를 연장시키는 유사한 중합체에 접합된다. 하기 실시예 3에서 보다 상세히 논의된 바와 같이, 개시된 니코틴 분해 효소 변이체에 PEG를 접합시키는 것은 변이체의 약동학적 특성을 개선시킬 수 있다. 일부 구현예에서, PEG화는 변이체의 하나 이상의 면역원성 에피토프 마스킹, 변이체 특이적 항체 역가 감소, 및 T-세포 증식 및/또는 사이토카인 반응 약화로부터 선택된 하나 이상의 효과를 갖는다. 부가적으로 또는 대안적으로, 일부 구현예에서, 변이체를 PEG에 접합시키는 것은 니코틴 분해 효소 변이체의 효소 활성을 감소시키지 않거나, 효소 활성을 현저하게 감소시키지 않거나, 효소 활성을 제거하지 않는다.
PEG 사슬 길이 및 구조(즉, 선형 대 분지형)은 하기 실시예에서 예시된 바와 같이, 다른 특성에 영향을 미치거나, 전달하거나, 촉진하기 위해 선택되고 변화될 수 있다. PEG는, 하기 실시예에서 예시된 것을 포함하여, 단백질에 PEG를 접합시키는 것에 대해 공지된 방법에 의해 변이체에 접합될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 변이체는 서열번호: 2-56, 58-63 또는 124-134 중 어느 하나에 의해 정의된 변이체를 포함하여 PEG화될 수 있다. 개시된 효소 변이체에 PEG를 접합시키기 위한 목적으로, PEG 중합체의 크기 또는 길이가 변할 수 있다. 예를 들어, 개시된 효소 변이체에 접합된 선형 PEG는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 kDa와 같이 1-50 kDa, 5-40 kDa, 또는 10-20 kDa의 범위일 수 있다. 부가적으로, PEG 중합체는 20, 40, 60 또는 80 kDa와 같은 20-80 kDa 범위의 크기로 분지형일 수 있다.
일부 구현예에서, 변이체는 알부민 결합 펩타이드, 알부민 결합 단백질 도메인, 인간 혈청 알부민, 또는 불활성 폴리펩타이드에 융합된다. 펩타이드의 순환 반감기를 증가시키는데 사용된 예시적인 불활성 폴리펩타이드는, 비제한적으로, XTEN®(재조합 PEG 또는 "rPEG"로도 알려짐), 호모-아미노산 중합체(HAP; HAP화), 프롤린-알라닌 세린 중합체(PAS; PAS화) 또는 엘라스틴 유사 펩타이드(ELP; ELP화)를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "융합된"은, 달리 명시되지 않는 한, 다수의 도메인을 함유하는 단일 폴리펩타이드를 생성하는, 링커를 통해 또는 직접적으로의 유전적 융합을 포함한다.
V. 니코틴 중독 치료 또는 금연 촉진 방법
전술된 바와 같이, 본원에 기재된 변이체는 필요로 하는 포유동물 대상체에서 니코틴 중독을 치료 및/또는 금연(또는 다른 담배 제품의 사용 중지) 또는 흡연의 재발(또는 다른 담배 제품의 소비) 예방을 촉진시키는 방법에 유용하다.(편의상, 이하의 설명에서, 이들 방법은 집합적으로 니코틴 중독 치료 또는 금연 촉진으로서 지칭된다.) 일부 구현예에서, 대상체는 니코틴에 중독된 또는 흡연을 중단하거나 다른 니코틴 제품의 소비 또는 흡연으로부터 금욕을 유지하고자 하는, 또는 다른 니코틴 제품의 흡연 또는 소비의 재발을 막고자 하는 인간 대상체이다.
상기 방법은 일반적으로 본원에 기재된 바와 같은 치료 유효량의 니코틴 분해 효소 변이체(또는 이를 포함하는 약학 조성물)를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 그러나, 일부 구현예에서, 상기 방법은 생체내 변이체를 발현시키는 작제물에서 니코틴 분해 효소 변이체를 코딩하는 핵산을 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 이러한 구현예에서, 핵산은 아데노-관련 바이러스(AAV) 유전자 전달 벡터와 같은 적합한 벡터에서 제공될 수 있다. 이러한 방법에서의 사용에 적합한 다른 예시적인 벡터는 당업계에 공지된다. 참조, 예를 들어, Lukashev 및 Zamyatnin, Biochem., 81(7):700-8(2016)). 예시적인 벡터는 하나 이상의 인핸서(예를 들어, 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서), 프로모터(예를 들어, 닭 β-액틴 프로모터), 및/또는 발현 카세트의 특성을 강화시키는 다른 요소를 포함할 수 있다. 적합한 벡터를 제조하는 방법 및 생체내 발현 벡터를 사용하는 일반적인 방법은 당업계에 공지된다. 참조, 예를 들어,(참조 Hicks et al., Sci. Transl. Med., 4(140):140ra87(2012)).
일부 구현예에서, 니코틴 중독 치료 또는 금연 촉진을 필요로 하는 대상체는 흡연 담배, 씹는 담배, 전자 담배, 및/또는 기타 니코틴 전달 장치와 같은 니코틴 제품을 소비하는 인간 대상체이다. 그러한 대상체는 신체적으로 니코틴에 중독 및/또는 심리적으로 니코틴 제품 소비에 중독될 수도 아닐 수도 있다. 금연 치료를 필요로 하는 전형적인 대상체는 하루에 담배 적어도 1 개, 또는 그 이상, 예컨대 10 개 미만, 10-20 개, 20-30 개, 30-40 개, 또는 40 개 이상(또는 다른 담배 또는 니코틴 제품의 동등한 사용)을 포함하여, 하루에 담배 적어도 약 5 개, 적어도 약 10 개, 적어도 약 15 개, 적어도 약 20 개, 또는 그 이상을 흡연하는 것과 같이 담배 또는 다른 니코틴 제품을 매일 사용하거나 흡연한다.
일부 구현예에서, 치료 유효량의 니코틴 분해 효소 변이체는 니코틴의 혈장 수준을 감소시키는데, 뇌에 국한된 니코틴 수준을 감소시키는데, 또는 둘 모두에 효과적인 양이다.
니코틴은 혈액 뇌 장벽을 가로지른 후 이의 중요한 효과의 다수를 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 용도는 니코틴이 혈액-뇌-장벽을 가로지르는 것을 감소시키거나 예방한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체의 투여는 대상체의 혈류에서 순환하는 니코틴을 분해시켜, 니코틴이 혈액-뇌-장벽을 가로지르지 않도록 감소시키거나 예방한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 뇌에서 유래하는 니코틴의 생리적 및 심리적 효과를 감소시키거나 예방한다. 대상체가 이들 영향을 줄이거나 중단시킬 것이기 때문에, 그/그녀는 니코틴 제품을 소비하려는 욕구를 잃을 것이다. 부가적으로 또는 대안적으로, 개시된 니코틴 분해 효소 변이체는 말초 신경계를 자극하는 니코틴의 능력에 영향을 줌으로써 효과를 발휘할 수 있다.
투여되는 니코틴 분해 효소의 특정 양은 대상체의 연령 및/또는 체중, 일상적으로 소비된(예를 들어, 흡연된, 씹거나 흡입된) 니코틴의 양, 및/또는 치료시 대상체의 뇌 또는 혈장에서의 니코틴 수준 중 하나 이상에 의존할 수 있다. 일부 구현예에서, 변이체는 약 0.01 내지 약 20 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 18 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 16 mg/kg, 약 2 mg/kg 내지 약 14 mg/kg, 또는 약 5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 변이체는 약 0.01 mg/kg, 약 0.02 mg/kg, 약 0.03 mg/kg, 약 0.04 mg/kg, 약 0.05 mg/kg, 약 0.06 mg/kg, 약 0.07 mg/kg, 약 0.08 mg/kg, 약 0.09 mg/kg, 약 0.1 mg/kg, 약 0.2 mg/kg, 약 0.3, 약 0.4 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 0.6 mg/kg, 약 0.7 mg/kg, 약 0.8 mg/kg, 약 0.9 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 1.5 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 2.5 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 3.5 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 4.5 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 5.5 mg/kg, 약 6 mg/kg, 약 6.5 mg/kg, 약 7 mg/kg, 약 7.5 mg/kg, 약 8 mg/kg, 약 8/5 mg/kg, 약 9 mg/kg, 약 9.5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 10.5 mg/kg, 약 12 mg/kg, 약 12.5 mg/kg, 약 13 ㎎/㎏, 약 13.5 ㎎/㎏, 약 14 ㎎/㎏, 약 14.5 ㎎/㎏, 약 15 ㎎/㎏, 약 15.5 ㎎/㎏, 약 16 ㎎/㎏, 약 16.5 ㎎/㎏, 약 17 mg/kg, 약 17.5 mg/kg, 약 18 mg/kg, 약 18.5 mg/kg, 약 19 mg/kg, 약 19.5 mg/kg, 또는 약 20 mg/kg의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 변이체는 약 0.5 mg, 약 1 mg, 약 2.5 mg, 약 5 mg, 약 10 mg, 약 15 mg, 약 20 mg, 약 25 mg, 약 50 mg, 약 75 mg, 약 100 mg, 약 150 mg, 약 200 mg, 약 250 mg, 약 300 mg, 약 350 mg, 약 400 mg, 약 450 mg, 약 500 mg, 약 550 mg, 약 600, 약 650 mg, 약 700 mg, 약 750 mg, 약 800 mg, 약 850 mg, 약 900 mg, 약 950 mg, 약 1000 mg, 약 1050 mg, 약 1100 mg, 약 1150 mg, 약 1200 mg, 약 1250 mg, 약 1300 mg, 약 1350 mg, 약 1400 mg, 약 1450 mg, 약 1500 mg, 약 1550 mg, 약 1600 mg, 약 1650 mg, 약 1700 mg, 약 1750 mg, 약 1800 mg, 약 1850 mg, 약 1900 mg, 약 1950 mg, 약 2000 mg, 약 2050 mg, 약 2100, 약 2150 mg, 약 2200 mg, 약 2250 mg, 약 2300 mg, 약 2350 mg, 약 2400 mg, 약 2450 mg, 또는 약 2500 mg의 용량으로 투여된다. 하나 초과의 변이체가 투여될 때, 투여된 변이체의 총량은 상기 지침에 따라 될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 방법은 단일 투여량의 니코틴 분해 효소 변이체(들)(또는 이를 포함하는 조성물)을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 니코틴 중독의 증상 또는 효과가 감소, 개선 또는 제거될 때까지 또는 대상체가 흡연 또는 달리 니코틴 소비를 중단할 때까지의 예정된 기간 동안과 같이 반복 투여량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 징후/증상/효과가 지속되거나 대상체가 계속해서 니코틴 갈망을 경험하거나 새로운 경험을 하는 경우, 치료는 변이체(들)의 추가의 용량으로 반복된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 하루에 3 회 이상, 하루에 2 회, 또는 하루에 1 회 니코틴 분해 효소 변이체(들)(또는 이를 포함하는 조성물)을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 1 일 간격으로, 1 주일에 3 회, 1 주일에 2 회, 1 주일에 1 회, 2 주일에 1 회, 3 주일에 1 회, 1 개월에 1 회, 또는 덜 자주 니코틴 분해 효소 변이체(들)(또는 이를 포함하는 조성물)을 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 구현예에서, 니코틴 분해 효소 변이체는 상기 기재된 바와 같이 지속 작용성 니코틴 분해 효소 변이체일 수 있다.
일부 구현예에서, 치료는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21 일 또는 그 이상; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18 이상 주 개월; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 개월 이상; 또는 1, 2, 또는 3 년 이상 동안 또는 대상체가 니코틴 갈망이나 기타 니코틴 금단 증상을 더 이상 경험하지 못하거나, 흡연 또는 기타 담배 제품 사용을 중단한 때까지 계속할 수 있다.
VI. 니코틴 중독의 치료 방법
개시된 니코틴 분해 효소 변이체는 니코틴 중독, 니코틴 과량투여 또는 니코틴 독성을 치료하는데 사용될 수 있다. 편의상, 이들 방법은 니코틴 중독 치료로서 수집을 본원에서 지칭된다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 니코틴 중독을 치료하는 방법은 본원에 개시된 바와 같은 니코틴 분해 효소 변이체 또는 이를 포함하는 약학 조성물을 필요로 하는 포유동물 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 독성 분량의 니코틴을 섭취하거나 소비한 대상체에게 니코틴 분해 효소 변이체를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 니코틴 분해 효소 변이체 및 활성탄 또는 또 다른 제제와 같은 니코틴 중독을 치료하는데 유용한 다른 화합물 모두를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서, 효소 변이체 및 제 2 화합물(예를 들어, 활성탄)은 동일하거나 상이한 조성물로부터 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 따라서, 치료는 니코틴 중독의 증상 및/또는 효과를 다루기 위해 활성탄 및/또는 다른 보조 치료제를 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 치료 유효량의 니코틴 분해 효소 변이체는 니코틴 중독 또는 과량투여의 하나 이상의 증상 또는 효과를 감소, 개선 또는 제거하는데 효과적이다. 투여된 특정 양은 대상체의 연령 및/또는 체중, 섭취된 것으로 생각되는 니코틴의 양, 및/또는 치료시 니코틴의 대상체의 혈장 수준, 및/또는 치료시 니코틴의 대상체의 뇌 수준에 의존할 수 있다. 일부 구현예에서, 니코틴 중독에 대해 치료되는 대상체는 성인이고, 반면 일부 구현예에서, 상기 대상체는 어린이(즉, 19 세 미만)이다. 일부 구현예에서, 치료 유효량의 니코틴 분해 효소 변이체는 니코틴의 혈장 수준을 감소시키는데, 및/또는 대상체의 특정 조직(예를 들어, 뇌/중추 신경계, 심장 및 혈관계 등)에 국한되는 니코틴의 양을 감소시키는데 효과적인 양이다. 특정 구현예에서, 치료 유효량의 니코틴 분해 효소 변이체는 니코틴의 혈장 수준을 감소시키는데, 뇌에 국한된 니코틴의 수준을 감소시키는데, 또는 둘 모두에 효과적인 양이다.
투여되는 니코틴 분해 효소의 특정 양은 대상체의 연령 및/또는 체중, 급작스럽게 소비된 니코틴의 양, 및/또는 치료시 대상체의 뇌 또는 혈장에서 니코틴의 수준 중 하나 이상에 의존할 수 있다. 일부 구현예에서, 변이체는 약 0.01 내지 약 20 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 18 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 16 mg/kg, 약 2 mg/kg 내지 약 14 mg/kg, 또는 약 5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 변이체는 약 0.01 mg/kg, 약 0.02 mg/kg, 약 0.03 mg/kg, 약 0.04 mg/kg, 약 0.05 mg/kg, 약 0.06 mg/kg, 약 0.07 mg/kg, 약 0.08 mg/kg, 약 0.09 mg/kg, 약 0.1 mg/kg, 약 0.2 mg/kg, 약 0.3, 약 0.4 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 0.6 mg/kg, 약 0.7 mg/kg, 약 0.8 mg/kg, 약 0.9 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 1.5 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 2.5 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 3.5 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 4.5 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 5.5 mg/kg, 약 6 mg/kg, 약 6.5 mg/kg, 약 7 mg/kg, 약 7.5 mg/kg 약 8 mg/kg, 약 8/5 mg/kg, 약 9 mg/kg, 약 9.5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 10.5 mg/kg, 약 12 mg/kg, 약 12.5 mg/kg, 약 13 ㎎/㎏, 약 13.5 ㎎/㎏, 약 14 ㎎/㎏, 약 14.5 ㎎/㎏, 약 15 ㎎/㎏, 약 15.5 ㎎/㎏, 약 16 ㎎/㎏, 약 16.5 ㎎/㎏, 약 17 mg/kg, 약 17.5 mg/kg, 약 18 mg/kg, 약 18.5 mg/kg, 약 19 mg/kg, 약 19.5 mg/kg, 또는 약 20 mg/kg의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 변이체는 약 0.5 mg, 약 1 mg, 약 2.5 mg, 약 5 mg, 약 10 mg, 약 15 mg, 약 20 mg, 약 25 mg, 약 50 mg, 약 75 mg, 약 100 mg, 약 150 mg, 약 200 mg, 약 250 mg, 약 300 mg, 약 350 mg, 약 400 mg, 약 450 mg, 약 500 mg, 약 550 mg, 약 600, 약 650 mg, 약 700 mg, 약 750 mg, 약 800 mg, 약 850 mg, 약 900 mg, 약 950 mg, 약 1000 mg, 약 1050 mg, 약 1100 mg, 약 1150 mg, 약 1200 mg, 약 1250 mg, 약 1300 mg, 약 1350 mg, 약 1400 mg, 약 1450 mg, 약 1500 mg, 약 1550 mg, 약 1600 mg, 약 1650 mg, 약 1700 mg, 약 1750 mg, 약 1800 mg, 약 1850 mg, 약 1900 mg, 약 1950 mg, 약 2000 mg, 약 2050 mg, 약 2100, 약 2150 mg, 약 2200 mg, 약 2250 mg, 약 2300 mg, 약 2350 mg, 약 2400 mg, 약 2450 mg, 또는 약 2500 mg의 용량으로 투여된다. 하나 초과의 변이체가 투여될 때, 투여된 변이체의 총량은 상기 지침에 따라 될 수 있다.
니코틴 중독은 구토와 관련되어 있으므로, 비경구 투여 경로는 사용될 수 있다. 더욱이, 정맥내 투여는 복강내 투여보다 효과적일 수 있다. 따라서, 니코틴 중독을 치료하는 방법의 일부 구현예에서, 니코틴 분해 효소 변이체(들)(또는 이를 포함하는 조성물)은 정맥내 투여된다.
일부 구현예에서, 본 방법은 단일 투여량의 니코틴 분해 효소 변이체(들)(또는 이를 포함하는 조성물)을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 미리 결정된 기간 동안 또는 니코틴 중독 또는 독성의 증상 또는 효과가 감소, 개선 또는 제거될 때까지 또는 대상체가 흡연 또는 니코틴 소비를 중단할 때까지 반복된 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 징후/증상/효과가 지속되는 경우, 치료는 변이체(들)의 추가의 용량으로 반복된다.
일부 구현예에서, 치료는 과량투여 후 1 일 이상 동안, 예컨대 1 내지 3 일, 또는 1 내지 5 일 동안, 또는 과량투여 후 1, 2, 3, 4, 또는 5 일 동안 계속할 수있다. 일부 구현예에서, 대상체가 니코틴 중독 또는 독성의 증상을 더 이상 경험하지 않을 때까지 또는 대상체의 혈장 및/또는 뇌에서 니코틴의 수준이 충분히 안전한 수준으로 감소할 때까지 치료는 계속할 수 있다. 일부 구현예에서, 니코틴 분해 효소 변이체는 상기 기재된 바와 같이 지속 작용성 니코틴 분해 효소 변이체일 수 있다.
당해 분야의 숙련자는 본 개시내용이 목적을 수행하고 언급된 목적 및 이점, 뿐만 아니라 그 안에 내포된 것을 얻는데 적합하다는 것을 용이하게 이해할 것이다. 본원에서의 수정 및 다른 용도가 당업자에게 발생할 것이다. 이러한 변형은 본 개시내용의 사상 내에 포함된다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공된다. 그러나, 본 발명은 이들 실시예의 특정 조건 또는 세부사항에 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다.
실시예
실시예 1: 니코틴 분해 효소 변이체의 개발 및 시험
C-말단 His6-태그를 갖는 야생형(wt) NicA2 아미노산 서열(GenBank 수탁 번호: AEJ14620.1)의 대장균 발현을 위해 코돈 최적화된, 합성 유전자(GeneArt/Invitrogen에 의한 맞춤 DNA 합성)은 pET-22b(+)(Novagen)의 NdeI-XhoI 부위에 클로닝되었고, 발현 플라스미드는 대장균 BL21(DE3)으로 형질전환되었다. 이 작제물로부터 발현된 경우 예측된 야생형 NicA2 아미노산 서열을 표 1(서열번호: 1)에 나타난다.
크기의 이질성은 서열번호: 1을 인코딩하는 작제물로부터 발현된 단백질의 SDS-PAGE에 의해 동정되었고 제조 프로토콜에 따라 Cobalt TALON™ His-Tag 정제 수지(Clontech)를 사용하여 고정화 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)에 의해 정제되었다(도 1; 49kDa 마커 주위의 주 및 약 밴드). 단백질이 His-태그를 통해 정제됨에 따라, 이질성이 N-말단에 있다고 추측되었다. 온라인 검색 도구 PRED-TAT(compgen.org/tools/PRED-TAT, Pantelis et al., Combined prediction of Tat 및 Sec signal peptides with Hidden Markov Models, 2010 Bioinformatics)를 이용하여, 서열번호: 1의 위치 37에서의 알라닌(A) 잔기 다음의 관련된 절단 부위를 가진 추정 TAT 리더 서열은 동정되었다.
비-필수 박테리아 서열(서열번호: 1의 위치 16-24에서 특정 인실리코 예측 T-세포 에피토프 서열 포함)을 제거하기 위한, 면역원성 위험을 줄이기 위한, 뿐만 아니라 추정 N-말단 절단 부위 및 관련 생성물 이질성을 제거하기 위한 노력으로, 처음 50 개의 N-말단 잔기(NicA2Δ50; 서열번호: 2)를 제거하는 결실 작제물은 제조되었다.
이 영역이 촉매 활성을 손상시키지 않으면서 잠재적으로 결실될 수 있다고 믿어졌고; 결국, NicA2Δ50(서열번호: 2)는 대장균에서 발현되었고 상기 기재된 바와 같이 정제되었다. 도 1에서 볼 수 있듯이, 정제된 NicA2Δ50(서열번호: 2)는 SDS-PAGE 분석에 의해 균일하게 나타난다.
정제된 단백질에 관한 효소 활성의 분석은 Amplex Red 검정(Reszka, et al., Effects of peroxidase substrates on the Amplex red/peroxidase assay: Antioxidant properties of anthracyclines, Analytical Biochemistry 342: 327-337(2005))을 사용하여 수행되었다. 요약하면, NicA2에 의한 니코틴의 산화는 HRP(서양고추냉이 퍼옥시다제)로 레소루핀인, 적색 형광 제품으로 무색 Amplex Red 시약의 전환에 결합되는 H2O2의 생성을 초래한다. 분석은 최종 분석 농도가 10 μM이도록 S-니코틴(Sigma)의 첨가를 제외하고 본질적으로 분석 키트(Thermo; Cat # A22188)의 공급자가 권장하는 대로 수행되었다. 분석은 흑색 절반 면적 평면 바닥 96-웰 검정 플레이트(Corning Cat # 3993)에서 100 μL/웰의 총 부피로 수행되었다. 형광의 발색은 SoftMax Pro 데이터 진화 패키지(Molecular Devices)에서 각 시간 포인트에 대한 무 효소 대조군으로부터 파생된 값을 빼기 위해 "Plate Blank" 웰을 사용하여, 셋팅 555 nm에서 Ex; 590 nm에서 Em을 이용하는 SpectraMax M2 다중 모드 마이크로플레이트 플레이트 판독기(Molecular Devices)에서 검출되었다. 활성은, 병렬로 수행된, 야생형 NicA2 효소에 비해 시간의 함수로서 플롯된 형광 증가의 상대적인 경사로서 표시되었다.
Amplex Red 검정은 정제된 NicA2Δ50 단백질이 야생형 NicA2와 비교하여 23%의 활성 감소를 보였다는 것을 나타냈다(도 2 및 표 4). 2 개의 더 짧은 결실 작제물(NicA2Δd25(서열번호: 3) 및 NicA2Δ38 서열번호: 4)는 생성되었고 시험되었지만, 유사하게 야생형 효소에 비해 활성이 감소함을 보였다. 요약하면, 3 가지 결실 돌연변이체 모두는 야생형에 비해 감소된 활성을 보였다(표 5).
Figure 112019092440610-pct00026
Figure 112019092440610-pct00027
Figure 112019092440610-pct00028
Figure 112019092440610-pct00029
따라서, 야생형에 적어도 동등한 니코틴 분해 활성을 나타내는 NicA2Δ50 변이체를 설계하고 동정하는 것이 결정되었다. NOX 변이체는 또한 추가 시험을 위해 동정되었다.
NicA2 단백질은 활성 부위 잔기를 결정하기 위해 Discovery Studio 4.5(Dassault Systemes, BIOVIA Corp., San Diego CA)를 이용하여 시각화되었다. 작제물의 검사, FAD의 위치 및 추정되는 중요한 활성 부위 잔기(Tararina et al, 2016)의 보고에 기초하여, 추정된 활성 부위 공동은 정의되었다. 이 공동의 노출된 표면을 구성하는 모든 잔기는, 측쇄와 골격 원자를 모두 포함하여, 쉘 1 잔기로서 분류되었다(표 2). 정의된 쉘 1 잔기에 기초하여, 쉘 1과 직접 접촉하는 유사한 잔기는 쉘 2로서 정의되었다(표 2). 잔기 위치는 작제물의 수동 검사로 확인되었다.
합성 이중 가닥 DNA 단편 :
AAAGCAATATCGATGTGAATGATCGTGATGCAGTTACCCGTGAAGTTCAGAAAATG
TTTCCGGGTGTTGAAGTTCTGGGCACCGCAGCCTATGATTGGACCGCAGATCCGTTT
AGCTTAGGTGCCNNKGCCGCGTATGGTGTTGGTCAGCTGTCACGTCTGAAAGATCTG
CAGGCAGCAGAAGGTCGTATTCTGTTTGCGGGTGCAGAAACCAGCAATGGTTGGCA
TGCAAATATTGATGGTGCAGTTGAAAGCGGTCTGCGTGCAGGTCGTGAAGTTAAAC
AGCTGCTGAGCGGTGGTGGTGGATCCATAGG(서열번호: 64)
는 제한 효소 ClaI 및 BamHI로 절단되었고 상기 단편은 NicA2Δ50의 발현에 사용된 발현 플라스미드에서 상응하는 고유 부위에 클로닝되었다.
생성된 라이브러리는 상기 위치에서 가능한 모든 20 개의 아미노산을 갖는 변이체를 인코딩하는(DNA/코돈 수준에서) 32구성원 라이브러리를 생성하는 쉘 1 코돈 W427(표 2)의 NNK 무작위화를 가졌다. 라이브러리는 BL21 Gold(DE3)로 형질전환되었고, 단일 콜로니는 채취되어 카르베니실린(100 μg/ml)를 함유하는 LB 배지내 96 웰 플레이트에서 하룻밤 동안 성장되었다. 밤새 LB 배양액은 475 μl의 자동 유도 Magic Media(Invitrogen) + 카르베니실린(100 μg/ml)를 함유하는 새로운 96 딥웰 플레이트에 희석되었고, 격렬하게 진탕하면서 18 시간 동안 실온에서 성장되었다. 박테리아는 4000 rpm에서 15 분 동안 원심분리함으로써 플레이트에서 수확되었고, 펠렛은 -80 ℃에서 동결되었다. 펠렛은 1 ml 당 1 KU의 r-Lysozyme(Novagen)을 함유하는 실온 Bug Buster HT Reagent(Novagen) 100 μl에 녹이고, 실온에서 20 분 동안 진탕 플랫폼에서 배양함으로써 용해되었다. 투명한 용해물은 Bug Buster HT Reagent로 1:1(용적:용적)으로 희석하고 4 ℃에서 20 분 동안 4400 rpm으로 원심분리하여 불용성 세포 파편을 제거함으로써 준비되었다. 25 μl의 투명한 용해물은 새로운 96 웰 플레이트로 옮겨졌고 PBS 중의 2% 우유에서 1:1(용적:용적)으로 희석되었다. 희석된 용해물은 검정 플레이트(4 ℃에서 PBS 중의 5 μg/ml의 항-His Tag 항체(R&D Systems)로 o/n 코팅된; 웰당 50 μl; 그 다음 RT에서 2 시간 동안 4% 우유(PBS 중)으로 차단된 흑색 96웰 절반 면적 고 결합 플레이트(Corning)에 옮겨졌고 3 시간 동안 부드럽게 진탕하는 실온에서 배양되어 몰 과량의 발현된 His-태그된 효소로 고정화된 항-His mAb의 포화를 확인하였다. 이 단계는 본질적으로 성장, 유도 조건, 내재적 발현 수준 등에서의 차이에 의해 제공된 농도의 임의의 차이 표준화를 초래하고, 효소의 일관된 양이 후속 단계에서 각 웰의 활성에 대해 검정되도록 한다. 이것은 또한 변이체의 활성을 정확하게 측정하고 비교하기 위해 각 웰에서 효소를 정량화할 필요성을 제거한다. 플레이트는 PBST로 6x 및 Amplex Red Reagent Buffer(Thermo)로 1x 세척되어 결합되지 않은 물질을 제거하였다. 효소 분석은 각 웰에(상기 기재된 바와 같은) 10 μM S-니코틴을 포함하는 Amplex Red Solution 50 μl를 첨가하고 시간 경과에 따른 형광 발달을 모니터링함으로써 수행되었다.
하나의 96 웰 분석 플레이트로부터, 가장 높은 검정 활성을 갖는 10 개의 변이체(모두 야생형 NicA2를 발현시키는 포함된 콜로니로부터의 값과 비교하여 증가된 것)은 밤새 LB 배양물이 있는 마스터 플레이트로부터 분리되었고, 플라스미드 DNA는 제조 및 서열분석되었다. 서열분석은, 서열번호: 5, 6, 7, 및 8을 각각 초래하는, W427의 Q, E, S 및 M으로의 단일 돌연변이를 제공하는 NicA2Δ50(서열번호: 2)에 대한 서열 변화를 나타내었다. 부가적으로, 서열번호: 1의 위치 91, 217, 463, 381, 366, 340, 250, 427, 또는 462에서의 돌연변이를 갖는 추가 변이체, 뿐만 아니라 서열번호: 57의 위치 423에서의 돌연변이를 갖는 변이체는 또한 설계 및 스크리닝되었다. Amplex Red 스크리닝 검정에서 동정된 변이체의 활성의 리스트(상기 기재된 바와 같이 재검정된 각 변이체의 8 개의 개별 콜로니에 대한 평균)은 표 5에 나타내었다.
변이체 NicA2Δ50W427Q(서열번호: 5)는 상기 기재된 바와 같이 발현 및 정제되었다. 활성 검정은 정제된 야생형 NicA2 및 NicA2Δ50과 함께 상기 기재된 바와 같이 Amplex Red 검정을 사용하여 수행되었다. 도 2 및 표 4에 나타낸 바와 같이, W427Q 돌연변이는 놀랍게도 활성을 "회복"시켰을 뿐만 아니라 현저히 증가시켰으며, NicA2Δ50W427Q 변이체는 야생형 NicA2 효소에 비해 약 250%의 활성(2.5 배 증가)를 나타냈다. 정제된 단백질을 사용하여 얻은 이 데이터는 스크리닝 검정 형식으로 생성된 데이터와 일치한다(표 5).
NicA2를 쿼리 서열로서 사용하는 Protein BLAST 상동성 조사는, 83%의 상동성으로, 가장 가까운 친척으로서 Pseudomonas 속 HZN6으로부터 니코틴 아민 옥시다아제, NOX(Qiu et al., Appl. Environ. Microbiol. 78, 2154-2160(2012).; Qiu et al., Appl. Environ. Microbiol. 79, 2164-2171(2013))를 산출하였다. C-말단 His6-태그를 갖는 야생형(wt) NOX 아미노산 서열(GenBank 수탁 번호: AGH68979.1)의 대장균 발현을 위해 코돈 최적화된 합성 유전자(GeneArt/Invitrogen에 의한 맞춤 합성)은 pET-22b(+)의 NdeI-XhoI 부위에 클로닝되었고, 발현 플라스미드는 대장균 BL21(DE3)으로 형질전환되었다. 이 작제물로부터 발현된 경우 예측된 야생형 NOX 아미노산 서열은 표 1(서열번호: 57에 나타난다. NOX는 정제되었고 Amplex Red 활성 검정으로 검정되었다. 비록 wt NicA2와 비교하여 20% 감소된 활성에서지만, 효소는 실제로 니코틴 분해 및 H2O2 형성과 일치하는 활성을 나타냈다(표 5). W427에서 돌연변이를 가지고 있는 개선된 NicA2 변이체를 동정하는 것은 NOX의 동질성 W423 위치의 NNK 무작위화 라이브러리의 생성 및 스크리닝을 촉진시켰다. 상기 라이브러리는 키트 지침에 따라 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent), 상기 기재된 pET22 발현 벡터에서 NOX를 인코딩하는 DNA 템플레이트, 및 NNK 프라이머 NOX-W423NNK(표 6, 서열번호: 65)를 이용하여 생성되었다. 37 ℃에서 밤새 배양 및 플레이팅 형질전환 후, 8 개의 무작위 콜로니는 라이브러리 QC에 대해 서열분석되었고, 나머지 콜로니는 한천 플레이트에서 박리된 다음 DNA 미니프레프를 위해 풀링되었다. 이 DNA는 그 다음 BL21(DE3) 발현 균주에 형질전환되었고, 개별 클론은 상기 NicA2Δ50W427NNK 라이브러리에 대해 기재된 바와 같이 스크리닝되었다. 이 라이브러리 스크리닝은 wt NicA2: NOXW423A, S, E, 및 H(표 5)보다 활성이 2 배 내지 4.5 배 개선된 4 가지 변이체를 확인하였다. 흥미롭게도, 이들 변이체 모두가 wt NicA2와 비교하여 증가된 활성을 가지면, 이들은 생물치료학적 발달을 위하여 동등하게 양호한 시작점이 잠재적으로 될 수 있으며, NicA2에서 확인된 유익한 돌연변이(예를 들어, 표 5에 개시된 모든 돌연변이)는 NOX 백본에서 상동성 위치에서도 유리할 수 있다.
NicA2 위치 W427에서 개선된 변이체의 성공적인 식별을 감안하면, NicA2Δ50 백본에서 유사한 "NNK 라이브러리"는 다른 활성 부위(쉘 1) 위치: R91, T250, K340, Q366, T381, N462, I463F, 뿐만 아니라 제 2 쉘 잔기 L217에 대하여 생성되었다. 이들 후기 라이브러리는, 키트 지침에 따라, QUICKCHANGE™ Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent), pET22 발현 벡터에서 NicA2Δ50을 인코딩하는 DNA 템플레이트, 및 표 6, 서열번호: 66-73 각각에서 열거된 NNK 프라이머를 이용하여 생성되었다. 표 5에 나타낸 바와 같이, 상기 기재된 바와 같이 이들 라이브러리의 스크리닝은, Δ50 N-말단 결실을 지니고 있음에도 불구하고, 야생형 NicA2(서열번호: 5-56)보다 1-6.5 배의 활성 개선 범위를 갖는 변이체의 동정을 초래하였다. 흥미롭게도 L217이 제 2 쉘 잔기임에도 불구하고(표 3), 야생형보다 1.7 배 내지 2.8 배 증가된 활성을 부여하는 6 가지 치환은 확인되었다(표 5).
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표 2에 열거된 추가의 활성 부위 위치를 다루기 위해, 맞춤 Comprehensive Saturation Mutagenesis(CSM) 라이브러리는, 전장 NicA2의 하기 위치: PHE104, GLY105, GLY106, ALA107, TRP108, TYR214, TYR218, GLU249, PHE355, TRP364, TRP417, ALA426, 및 ALA461에서 모든 단일 아미노산(aa) 치환(변이체 당 하나의 돌연변이)를 검침하는, Revolve Biotechnologies, Inc.(Firnberg et al., PLoS One, 7:e52031(2012))에 의해 제공되었다.
앞서 기재된 바와 같이 Amplex Red 스크리닝 검정에서 이 라이브러리의 스크리닝은 개량된 변이체 NicA2A107R, NicA2A107K, NicA2A107T 및 NicA2F355C(표 5; 서열번호: 124-127)의 동정을 유도한다.
더 큰 라이브러리 크기를 통해 더욱 효율적으로 스크리닝하기 위해, Fluorescence-Activated Cell Sorting(FACS) 분류 프로토콜은 구현되었다. NicA2 변이체를 함유하는 라이브러리는 벡터 pET22b에 클로닝되었고 대장균 BL21(DE3) 균주로 형질전환되었다. 세포는 LB + 100 μg/mL 암피실린에 접종되었고 OD600이 0.6-0.8에 도달할 때까지 37 ℃에서 성장되었다. 발현은 1 mM IPTG로 유도되었고 배양물은 18 ℃로 옮겨졌고 밤새 발현되었다. 다음날, 세포는 5X PBS + 1 mM EDTA로 세정되어 니코틴에 세포를 투과시켜, NicA2에 의해 방출된 과산화수소와 반응시 형광성이 되는 산화환원 민감성 염료인, 5 μM 디하이드로로다민 123(DHR123), 그리고 5 mM 니코틴을 함유하는 동일한 완충액에 재현탁되었다. 세포 현탁액은 깨끗한 멸균 플라스크로 옮겨졌고 진탕하면서 실온에서 배양되었다. 2 시간 후, 세포는 5X PBS + 1 mM EDTA로 세정되었고, FITC 채널을 사용하여 FACS로 분류되어 DHR123 형광을 정량화하였다. 회수된 세포는 LB + 100 μg/mL 암피실린에서 재성장되었고, 필요에 따라 프로토콜은 반복되었다.
추론적 NicA2 활성에 대해 풍부한 CSM 라이브러리의 분류의 하나의 라운드에서 비롯한 생산량으로부터 클론의 서열분석은 변이체 NicA2W427R, NicA2T250P, NicA2W427H; N462F 및 NicA2W427L; N462M(각각 서열번호: 135-138)을 산출하였다.
개량된 변이체 NicA2Δ50R91Q, NicA2Δ50Q366K, NicA2Δ50T381V 및 NicA2Δ50N462Y의 결과에 기초하여, 동일한 돌연변이는 전장 NicA2에 도입되었고,(각각 서열번호: 129, 130, 131, 133으로 NicA2R91Q, NicA2Q366K, NicA2T381V 및 NicA2N462Y를 초래함), 활성은 Amplex Red 검정에서 이전에 기재된 바와 같이 평가되었다. 표 5에 나타낸 바와 같이, 이들 모든 예시적인 돌연변이는 전장 효소에서 활성 증진을 제공하였다. 그에 상응하여, NicA2A107R 변이체(서열번호: 124)의 높은 활성은 NicA2Δ50A107R 변이체(서열번호: 134)에서 유지되었다. 결론적으로, 표 5에 열거된 모든 돌연변이가 양쪽 전장 NicA2 및 결실 변이체 예컨대 NicA2Δ50, NicA2Δ25, NicA2Δ38, 또는 NicA2의 적어도 첫 50 N-말단 잔기를 최대로 포함하는 임의의 유사한 결실, 또는 이것이 전장 NicA2의 적어도 20%의 효소 활성을 갖는다면 임의의 N- 또는 C-말단 결실 변이체의 맥락에서 활성을 향상시킬 것으로 기대된다.
표 5로부터 선택된 다수의 잔기에서 돌연변이를 갖는 특정 변이체는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 생성될 수 있고, 표 5에서 선택된 다수의 위치에서 다중 돌연변이로 이루어진 라이브러리는 상기 기재된 바와 같이 생성 및 스크리닝될 수 있다. 이들 노력은 표 5에 열거된 임의의 개별 단일 돌연변이보다 높은 효소 활성으로 동일한 분자에서 여러 위치에 돌연변이가 있는 돌연변이체의 동정을 허용할 수 있다.
활성에 대한 중간 정도의 효과만을 갖는 제 1 에피토프를 제거하는 것이 가능하고, 활성의 이 감소가 표 5에 열거된 돌연변이에 의해 완화되거나 극복될 수 있는 서열번호: 2-4를 갖는 변이체로 나타내면, 다수의 다른 에피토프는 추가로 조사되었다.
NicA2 단백질에 대한 작제물 좌표는 면역원성 에피토프를 결정하기 위해 Discovery Studio 4.5(Dassault Systemes, BIOVIA Corp., San Diego CA)에서 검사되었다. MHC 대립유전자 DRB1*0401(Immune Epitope Database 및 Analysis Resource, IEDB, iedb.org)에 대한 T 세포 에피토프 스캐닝을 통해 잠재적인 에피토프로서 표시된 NicA2 서열의 영역은 돌연변이 에너지를 평가하기 위해 Discovery Studio에서 시행된 예측성 부위 포화 돌연변이유발 프로토콜을 사용하여 평가되었다. 이전에 정의된 각 영역에서 유리하게 스코어링된 돌연변이는 MHC 대립유전자 DRB1*0401에 대한 새로운 라운드의 IEDB T 세포 에피토프 예측과 교차참조되어 예측된 면역원성을 감소시키는 변화를 발견하였다. 가능한 돌연변이의 최종 선택은 Discovery Studio에서 유망한 구조적 변화의 시각화 및 수동 평가에 의해 확인되었다. 표 3은 실질적으로 니코틴 분해 활성 및 안정성을 유지하면서(상기 기재된 바와 같은 인실리코 스코어링에 기초한) 면역원성을 감소시키는 것으로 예측되었던 면역원성 T 세포 에피토프에서의 예시적인 돌연변이를 제시한다.
에피토프 1에 대한 돌연변이에 기초한 10 가지 변이체는 제한 효소 EcoRI 및 SacII로 절단된 합성 이중 가닥 DNA 단편(서열번호: 74-83, 표 7)을 야생형 NicA2(서열번호: 1)의 발현에 사용된 발현 플라스미드에서 상응하는 고유 부위에 클로닝함으로써 생성되었다. 다른 예시적인 에피토프 변이체의 핵산 서열은, 하기에 더 상세히 논의된 바와 같이, 서열번호: 84-113에 나타난다.
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개별 작제물에 대한 결찰은 BL21 Gold(DE3)으로 병렬로 형질전환되었고, 각 형질전환에서 8개의 단일 콜로니는 취득되어 카르베니실린(100 μg/ml)를 함유하는 LB 배지내 96 웰 플레이트에서 밤새 성장되었다. 각 변이체의 8개의 개별 클론의 스크리닝은 W427NNK 라이브러리의 스크리닝에 대해 상기 기재된 바와 같이 수행되었고, 검정 값은 도 4A-E에서 나타난 바와 같이 잠재적인 희귀한 이상치(총 8 개의 클론 중 1 개 초과 없음; 전형적으로 클로닝된 합성 DNA 내의 돌연변이 또는 삽입 없이 클론으로부터 비롯함)를 제거한 후 평균으로서 보고되었다. 5 가지 변이체는 야생형 NicA2 효소의 활성의 검정 값 ≥ 90%로 확인되었고, 이들 5 가지 변이체(I262T; I262S; I262A; I262T & A264L; 및 I262T & N263R; 도 4 참조)가 야생형과 유사한 효소 활성을 가지며, 인실리코 예측에 기초하여, 러버 면역원성 잠재력을 갖는 것으로 예측되는 것을 나타낸다.
표 3에 제시된 4 개의 다른 에피토프에서 돌연변이에 기초한 변이체는 상기 기재된 바와 같이 제조 및 평가되었다. 에피토프 B에 대해, 변이체는 제한 효소 NdeI 및 EcoRI로 절단된 합성 이중 가닥 DNA 단편(서열번호: 84-93, 표 7); 에피토프 2에 대해 SacII-ClaI로 절단된 DNA 단편(서열번호: 94-103, 표 7); 에피토프 3에 대해 SacII-ClaI로 절단된 DNA 단편(서열번호: 102-113, 표 7); 및 에피토프 4에 대해 ClaI-XhoI로 절단된 DNA 단편(서열번호: 114-123, 표 7)을 야생형 NicA2(서열번호: 1)의 발현에 사용된 발현 플라스미드에서 상응하는 고유 부위에 클로닝함으로써 생성되었다. 각 결찰 및 형질전환으로부터 8 개의 무작위 콜로니는 상기 기재된 바와 같이 시험되었다. 도 4A-E에 도시된 바와 같이, 2, 4 및 7 변이체는 에피토프 B, 2, 및 3 각각으로부터 야생형 NicA2 효소의 활성의 검정 값 ≥90%로 확인되었고, 이들 변이체(L74N & Y77R, R78Q, V304A & M306Q, V394A, V304T & M306I, M306I & L310R, L374Q & I377S, L374A & I377A; L374N & I382Q, I377A & I382T, I377T & I382T, I377T, 및 L374N & A383Q; 도 4 참조)가 야생형과 유사한 효소 활성을 가지며, 인실리코 예측에 기초하여, 러버 면역원성 잠재력을 갖는 것으로 예측되는 것을 나타낸다. 흥미롭게도, 에피토프 4에 대해 제안된 변이체 중 어느 것도 wt NicA2와 비교하여 40% 초과의 활성을 나타내지 않았다(도 4D 참조). 이 실시예에서 확인된 돌연변이(각각의 에피토프로부터 하나의 돌연변이)는, wt NicA2와 같거나 그보다 우수한 효소 활성을 갖는 단일 탈면역 효소 변이체를 생산하기 위해, d50W427Q 골격에 도입될 수 있거나, 표 5에 기재된 임의의 다른 확인된 단일 돌연변이 변이체, 또는 표 5에 열거된 돌연변이의 조합으로부터 유래된 임의의 수의 돌연변이와 조합될 수 있다.
TAT 리터 서열 내에 첫 번째 에피토프의 결실을 조합하는, 도 4에서 확인된 변이체를 사용하여 에피토프 1을 돌연변이시키는, 그리고 활성 증강 돌연변이 W427Q: NicA2Δ50W427Q;I262A(서열번호: 62) 및 NicA2Δ50W427Q;I262T;N263R(서열번호: 63)을 함유하는 2 개의 변이체는 생성되었다. 이들 변이체는 정제되었고, 효소 활성은 상기 기재된 바와 같이 Amplex Red 검정으로 평가되었다. 표 4에서 알 수 있듯이, 두 변이체는 면역원성을 감소시킬 것 같은 변경을 가졌음에도 불구하고 wt 이상의 증가된 활성을 갖는다.
실시예 2: NicA2 MHCII 에피토프의 동정
NicA2 MHCII 에피토프의 인실리코 조사는 가장 일반적인 8 가지 HLA-DR 대립유전자(Cantoret et al., PNAS USA 108: 1272-1277(2011); DRB1*0101, DRB1*1501, DRB1*1301, DRB1*1101, DRB1*0801, DRB1*0701, DRB1*0401, 및 DRB1*0301)에 기초하여 수행되었다. 조사는 NicA2의 예측된 면역원성 잠재력을 평가하기 위해 면역 에피토프 데이터베이스(Vita et al., Nucleic acids research, 43: D405-D412(2015)) 및 백분위 합의 순위 방법을 사용하여 수행되었다. 중첩하는 각 15-mer NicA2 펩타이드에 대한 백분위 합의 스코어는 8 가지 HLA-DR 대립유전자 전체에 걸쳐 평균화되었다. NicA2의 면역원성 잠재력은 전체 평균된 결합 스코어와 비교하여 MHCII에 대한 보다 엄격한 예측 결합에서 > 1 표준 편차이었던 모든 NicA2 서열을 선택함으로써 결정되었다. 이 방법은 광범위하게 면역원성인 것으로 예측되는 서열번호: 1(표 1에서 회색으로 강조 표시)의 잔기 10-32, 68-94, 189-225, 248-285, 296-327, 336-391 및 435-459를 반영하는 NicA2 서열의 45%에 걸쳐 8 개의 연속 서열을 나타냈다.
DRB1*0401 대립유전자만을 사용하는 보다 좁은 조사는 인실리코 수행되었다. 이 조사는 표 1의 서열번호: 1에 밑줄친 6 개의 가장 높은 순위의 면역원성 T-세포 에피토프를 산출하였다.
실시예 3: 니코틴 분해 효소의 PEG화
실험은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)를 NicA2 및 기타 니코틴 분해 효소, 예컨대 NOX 및 개시된 NOX 변이체에 접합용 프로토콜을 개발하기 위해, 그리고 활성 및 반감기에 대한 PEG화의 효과를 결정하기 위해 시도되었다.
SDS-PAGE 분석은 PEG화 시약의 몰 과량 및 PEG 사슬 길이가 증가함에 따라 PEG화의 정도가 증가함을 나타내었다. 야생형(wt) NicA2의 무작위 PEG화는 ≥2 시간 동안 얼음에서 100 mM Na3PO4, pH 7.6에서 7- 또는 20-배 몰 과량으로 10 또는 20 kDa NHS-PEG 시약(Sunbright® ME-100TS 또는 ME-200TS; NOF America Corporation)을 사용하여 그리고 5 mg/mL의 단백질 농도에서 수행되었다. 비접합된 PEG 시약의 제거는 50 kDa 컷오프가 있는 Amicon Ultra-15 원심분리 필터 장치를 사용하여 수행되었다. 2 μg 단백질에 해당하는 샘플은 MOPS 수행 완충액에서 수행된 SDS-PAGE 겔에 적재되었고 SimplyBlue SafeStain(Invitrogen)을 사용하여 염색되었다. 도 5에서 볼 수 있듯이, PEG화의 정도는 PEG화 시약의 과량 몰비를 조절함으로써 제어될 수 있다. 잔류 비접합된 단백질이 SDS-PAGE에 의해 검출되지 않았던 제제 NicA2-PEG1, -PEG2 및 -PEG3은 추가 분석을 위해 선택되었다.
PEG화가 NicA2의 약동학(PK) 특성을 향상시킬 수 있는지를 결정하기 위해, 혈청 농도는 랫트에서 정맥 주사(iv) 투여(5 mg/mL; N = 4; 2M + 2F) 후 시간의 함수로서 결정되었다. 이들 실험으로부터 데이터는 도 6에 나타난다. 간단히, MaxiSorp ELISA 플레이트(Nunc)는, NicA2 및 PEG화된 NicA2 단백질에서의 C-말단 His-태그에 결합할 수 있는, 항-His 태그 항체(R&D Systems)로 밤새 코팅되었다. 플레이트는 약 1 시간 동안 인산염 완충 식염수(PBS)에서 1% 탈지 분유(NFDM)으로 차단되었다. PBS + 0.1% Tween-20 중의 1% NFDM에서 혈청 샘플 및 NicA2 및 NicA2-PEG1-3 표준의 희석액은 플레이트에 첨가되었고 실온에서 2 시간 동안 배양되었다. 결합되지 않은 물질을 세척한(PBS + 0.1% Tween-20에서 수행된 모든 세척 단계) 후, 토끼 항-NicA2 다클론성 일차 검출 항체는 1 시간 배양을 위하여 웰에 첨가되었다. 세척 단계 후에는 서양고추냉이 퍼옥시다아제(HRP)-접합된 염소 항-토끼 IgG(Fc)(KPL International)이 첨가되었다. 플레이트는 세정되었고, 잔류하는 결합 복합체는 TMB 기질(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘; KPL International)로 검출되었다. 일단 산으로 정지시킨 후, 플레이트는 450 nm에서 분광광도계로 판독되었고 데이터는 SoftMax®Pro, 버전 5.4(Molecular Devices)에서 분석되었다.
추가의 실험은 PEG화가 NicA2상의 에피토프를 마스킹하는지 여부를 결정하기 위해 수행되었다. NicA2의 비PEG화된 또는 PEG화된 제제의 PBS내 연속 희석액은 상기 기재된 PK 실험(도 6)에서의 혈청 농도의 측정에 사용된 동일한 샌드위치 ELISA 검정에서 시험되었고, 신호(A450)은 농도의 함수로서 플롯팅되었다. 검정 민감도는 PEG화 정도(비PEG화된 분자에 비해 1.0의 A450을 얻는데 필요한 NicA2-PEG2 및 -PEG3의 약 1000 배 더 높은 농도)가 증가함에 따라 급격히 감소되며, 검출 항체 시약에 의해 인식된 에피토프가 PEG화된 분자 내에 덜 접근가능하다는 것을 나타낸다. 이들 결과는 도 7에 도시된다.
PEG화는 면역원성의 트랜스제닉 HLA-DR4 마우스 모델에서 NicA2 특이적 항체의 역가를 감소시키는 것으로 나타났다. 특히, 인간 DR4 트랜스제닉 마우스(N=6, 3M+3F, Taconic Biosciences)에서 Freunds Incomplete Adjuvant의 피하(s.c.) 주사 후 10 일째에 NicA2-특이적 항체 역가의 감소는 연구되었다. 이 마우스 모델은(DR4 수퍼타입을 대표하는) 인간 HLA-DRA 및 HLA-DRB*0401의 항원 결합 도메인을 갖는 하이브리드 MHC 클래스 II 분자를 보유하고 내인성 마우스 MHC 클래스 II 분자를 발현시키지 않는다. 역가는 ELISA에서 NicA2 코팅 플레이트, 및 염소 α-마우스 IgG-γ-HRP에 의한 검출을 사용하여 OD450 = 0.5를 얻는 혈청 희석액으로서 정의되었다. 시험된 최저 혈청 희석액은 50 배(검출 한계(LOD); 도 8에서 점선으로 표시)였다. NicA2의 PEG화는 트랜스제닉 DR4 마우스에서 평균 NicA2-특이적 항체 역가에 유의미한 ≥10 배 감소를 가져왔고(도 8; 4, 2, 및 2, 각각 NicA2-PEG1, -PEG2 및 -PEG3 군으로부터의 동물은 LOD 이하의 역가를 가짐), PEG화된 변이체가 임상적 셋팅에서 보다 낮은 면역원성을 발휘할 수 있음을 나타낸다.
PEG화가, 도 9에 도시된 바와 같이, NicA2에 노출됨으로써 매개된 인간 T-세포 증식 반응 및 사이토카인 TNFγ 방출을 약화시키는 것이 또한 관찰되었다. NicA2의 PEG화는 IFNγ 분비 수준(그림 9, 오른쪽 패널)에서의 감소 뿐만 아니라 평균 T 세포 증식 자극 지수(그림 9, 왼쪽 패널)의 유의미한 감소를 가져왔다(5 명의 건강한 지원자로부터의 독립적인 실험). 양성 대조군: 피토헤마글루티닌(PHA). 5 개의 독립적인 실험용 시험 결과는 기준선 응답(PBMC)에 비해 3 시험 농도에서 NicA2 및 NicA2-PEG2에 대하여 IFNγ 분비 수준에서의 배수 증가(유동 세포 계측법 및 Cytometric Bead Array 키트(BD Biosciences)로 측정)(오른쪽) 그리고 T 세포 증식 반응 자극 지수(SI; 3H-티미딘 섭취로 측정)(왼쪽)에 대하여 표시된다. 3 ≥(점선)의 증가는 유의미한 증가 및 양성 반응으로 간주된다.
PEG화된 효소가, 도 10에 도시된 바와 같이, 혈청에서 완전한 니코틴 분해 활성을 유지하는 것으로 또한 나타났다. Wt NicA2 또는 NicA2-PEG2는 37 ℃에서 미리 배양된 40 ng/mL S-니코틴(250 nM, 전형적인 흡연자에서 관찰된 혈장 수준과 동일함)을 함유하는 랫트 혈청에 0.075 mg/ml의 최종 농도로 첨가되었다. 샘플은 다양한 시점에서 회수되었고, 메탄올을 첨가하고 신속하게 혼합함으로써 효소 활성은 즉시 중단되었다. 잔류 니코틴 농도는 가스 크로마토그래피(GC)로 결정되었다. GC 검정의 LOD는 점선으로 표시된 2 ng/mL이었다. PEG화는 NicA2가 니코틴을 분해하는 능력을 저해하지 않는 것으로 나타났다.
실시예 4 - 혈청에서의 니코틴 분해 활성
시험 완충액에서 그리고 Amplex Red 검정의 높은(10 μM) 니코틴 농도(실시예 1에서 논의됨, 참조, 예를 들어, 표 4 및 5)에서, 뿐만 아니라 전형적인 흡연자에서 마주치게 되는 것에 더욱 관련된 혈청 농도에서 활성이 개선되었음을 확인하기 위해, Amplex Red 검정(NicA2A107R)로부터 예시적인 대표 변이체는 완충 용액보다는 혈청을 이용하는 검정(도 10에 도시된 데이터를 생성하기 위해 사용된 동일한 검정)에서 평가되었다.
간략하게, NicA2A107R은 40/ng/ml의 S-(-)-니코틴(250 nM)을 함유하는 랫트 혈청에 0.075 mg/ml의 최종 농도로 첨가되었다. 도 11에서 알 수 있듯이, 변이체 NicA2A107R은 흡연자에서 발견되는 혈청 농도에서 wt NicA2와 비교하여 이들 조건 하에서 니코틴 분해 활성을 증가시켰다.
실시예 5 - 니코틴 중독 치료
balb/c 마우스에서 니코틴의 최대 아치사 용량은 복강내로 2 mg/kg인 것으로 결정되었다. 니코틴의 효과는 용량 의존적이었고, 진정 요법, 스트라우브 테일, 떨림, 빈호흡, 등 아치화, 다리의 급속한 움직임, 격렬한 달리기, 올바른 반응의 상실, 및 간질/강박성 발작을 포함하였다. 이 실험에서, 야생형 NicA2는 개시된 효소 변이체가 니코틴 중독 또는 독성을 치료할 수 있음을 보여주기 위한 개념의 증명으로서 사용되었다.
7 내지 8 주령 balb/c 마우스(각 그룹에 대해 N=5)는 2 mg/kg 이하의 아치사 용량으로 니코틴을 투여하기 15 분 전 775 mg/kg의 wtNicA2 또는 음성 대조군(모두 iv)로 전처리되었다. 5 분 동안, 마우스는 발작 그리고 니코틴 중독 또는 독성의 표현형 징후에 대하여 모니터링되었고 표 8의 지시문에 따라 스코어링되었으며, 여기서 3 미만의 스코어는 발작이 없었다는 것을 나타낸다. 경련에 대한 민감도는 4 또는 5의 스코어를 얻은 동물의 백분율을 결정함으로써 계산되었다.
Figure 112019092440610-pct00042
하기 표 9에 나타낸 바와 같이, 모든 미처리된 마우스는 심한 발작이 있었고, 반면 NicA2로 전처리된 마우스는 발작이 없었다. 따라서, 이들 결과는 개시된 니코틴 분해 효소 변이체가 니코틴 중독을 치료하는데 사용될 수 있음을 나타낸다.
Figure 112019092440610-pct00043
wtNicA2(70 mg/kg 및 140 mg/kg)의 더 낮은 용량을 사용하는(랫트가 마우스보다 니코틴에 더욱 잘 견디기 때문에 4 mg/kg i.p.의 니코틴의 도전 용량을 사용하는) 랫트 발작 모델에서 유사한 실험은 효과가 없었다. 따라서, 효소의 용량은 효과적인 치료를 제공하는데 중요할 수 있다.
마우스 실험에서 성공적으로 사용된 775 mg/kg 용량은 인간에게는 실용적 용량이 아니다. 그러나, 상기 나타낸 바와 같이, 본원에 기재된 니코틴 분해 효소 변이체는 야생형 효소보다 더 큰 니코틴 분해 활성을 갖는다. 따라서, 본원에 개시된 효소 변이체가 인간에서의 사용에 적합한 용량으로 니코틴 중독에 대해 효과적일 것으로 여겨진다.
실시예 6: 니코틴 중독 치료 및/또는 금연 촉진
이 실시예는 인간 성인에서 니코틴 중독을 치료하고/하거나 금연을 촉진하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 변이체를 사용하는 방법을 예시한다.
정기적으로 담배를 피우지만, 금연하고자 하는 성인 인간 대상체는 니코틴 분해 효소 변이체(예를 들어, NicA2Δ50W427Q; 서열번호: 5, 또는 이의 지속 작용성 버젼)을 포함하는 약학 조성물의 치료적 투여량이 경구로 또는 정맥 주사 또는 피하 주사에 의해 투여된다. 대상체는 혈장내 순환하는 니코틴의 수준에 대하여, 뿐만 아니라 두통, 과민성, 불안, 및 불면과 같은 니코틴 금단과 관련된 징후 및 증상의 존재 및/또는 중증도, 뿐만 아니라 주어진 하루에 흡연된 담배의 수에 대하여 평가된다. 대상체는 혈장을 순환하는 니코틴의 수준이 목표(감소된) 수준에 도달할 때까지, 및/또는 니코틴 금단의 하나 이상의 징후/증상이 감소, 개선 또는 제거될 때까지, 및/또는 대상체가 니코틴 제품의 소비 수준을 감소할(예를 들어, 하루에 담배를 적게 피우는) 때까지, 및/또는 대상체가 니코틴 제품의 소비를 중단할(예를 들어, 금연할) 때까지 반복된 투여로 치료된다.
실시예 7: 니코틴 분해 효소 변이체를 갖는 소아 환자의 치료
이 실시예는 소아 환자에서 니코틴 중독의 치료에 니코틴 분해 효소 변이체를 사용하는 방법을 예시한다.
니코틴을 섭취한 것으로 알려진 또는 섭취한 것으로 의심되는 어린이는 정맥내, 근육내 또는 피하 주사에 의해 니코틴 분해 효소 변이체를 포함하는 치료 유효량의 약학 조성물이 투여된다. 어린이는, 비제한적으로, 발작, 혼수상태, 호흡 곤란, 및 심박수 증가를 포함하는, 니코틴 중독과 관련된 징후 및 증상의 존재 및/또는 심각성에 대해 평가되며, 상기 어린이는 하나 이상의 징후/증상이 감소, 개선 또는 제거될 때까지 치료된다. 임의로, 징후/증상이 지속되면 및/또는 니코틴 혈장/뇌 수준이 상승된 채로 유지되면, 약학 조성물의 또 다른 용량은 투여된다.
<110> ANTIDOTE THERAPEUTICS, INC. BOARD OF REGENTS, THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM <120> NOVEL NICOTINE DEGRADING ENZYME VARIANTS <130> PI19-5115 <140> 10-2019-7025873 <141> 2019-09-03 <150> 62/535,507 <151> 2017-07-21 <150> 62/454,331 <151> 2017-02-03 <160> 144 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 482 <212> PRT <213> Pseudomonas putida <400> 1 Met Ser Asp Lys Thr Lys Thr Asn Glu Gly Phe Ser Arg Arg Ser Phe 1 5 10 15 Ile Gly Ser Ala Ala Val Val Thr Ala Gly Val Ala Gly Leu Gly Ala 20 25 30 Ile Asp Ala Ala Ser Ala Thr Gln Lys Thr Asn Arg Ala Ser Thr Val 35 40 45 Lys Gly Gly Phe Asp Tyr Asp Val Val Val Val Gly Gly Gly Phe Ala 50 55 60 Gly Ala Thr Ala Ala Arg Glu Cys Gly Leu Gln Gly Tyr Arg Thr Leu 65 70 75 80 Leu Leu Glu Ala Arg Ser Arg Leu Gly Gly Arg Thr Phe Thr Ser Arg 85 90 95 Phe Ala Gly Gln Glu Ile Glu Phe Gly Gly Ala Trp Val His Trp Leu 100 105 110 Gln Pro His Val Trp Ala Glu Met Gln Arg Tyr Gly Leu Gly Val Val 115 120 125 Glu Asp Pro Leu Thr Asn Leu Asp Lys Thr Leu Ile Met Tyr Asn Asp 130 135 140 Gly Ser Val 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or other <400> 66 gaagcacgta gccgtttagg tggtnnkacc tttaccagcc gtttt 45 <210> 67 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (24)..(25) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 67 atgatgcatt catggatacc gaannkcatt atcgtattca gggtggcac 49 <210> 68 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (22)..(23) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 68 ggtcagctga gtaaaggtgc cnnkctgtat gttcatgtga aacag 45 <210> 69 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (28)..(29) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 69 gatgaacagc agccgctgaa ttgggttnnk acccatgatt atagtgatg 49 <210> 70 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (25)..(26) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 70 gaactgggca ccattctgag cattnnkatt gcacgtaaag aaaccattg 49 <210> 71 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (22)..(23) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 71 accagcaatg gttggcatgc annkattgat ggtgcagttg aaagc 45 <210> 72 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (28)..(29) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 72 gaaaccagca atggttggca tgcaaatnnk gatggtgcag ttgaaagc 48 <210> 73 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (25)..(26) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 73 gcacagatta atagctatat ggcannktat gccggtgaaa ccaccgataa a 51 <210> 74 <211> 395 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 74 gcaatgaatt cggtaaaaac attcgcattg cctttgaaaa actgtgtcat gatgcatggg 60 aagtttttcc gcgtccgcat gaaccgatgt ttaccgaacg tgcccgtgaa ctggataaat 120 caagcgttct ggatcgtatt aaaacactgg gtctgagccg tctgcagcag gcacagatta 180 atagctatat ggcactgtat gccggtgaaa ccaccgataa atttggtctg cctggtgttc 240 tgaaactgtt tgcatgtggt ggttggaatt atgatgcctt tatggatacc gaaacgcact 300 atcgtattca aggtggcacc attggtctgg cgaatcagat gctgaccgat agcggtgccg 360 aagttcgtat gagcgttccg gttaccgcgg atagg 395 <210> 75 <211> 395 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide" <400> 75 gcaatgaatt cggtaaaaac attcgcattg cctttgaaaa actgtgtcat gatgcatggg 60 aagtttttcc gcgtccgcat gaaccgatgt ttaccgaacg tgcccgtgaa ctggataaat 120 caagcgttct ggatcgtatt aaaacactgg gtctgagccg tctgcagcag gcacagatta 180 atagctatat ggcactgtat gccggtgaaa ccaccgataa atttggtctg cctggtgttc 240 tgaaactgtt tgcatgtggt ggttggaatt atgatgcctt tatggatacc gaaacgcact 300 atcgtattca aggtggcacc attggtctga aaaatgcaat ggataccgat agcggtgccg 360 aagttcgtat gagcgttccg gttaccgcgg atagg 395 <210> 76 <211> 395 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide" <400> 76 gcaatgaatt cggtaaaaac attcgcattg cctttgaaaa actgtgtcat gatgcatggg 60 aagtttttcc gcgtccgcat gaaccgatgt ttaccgaacg tgcccgtgaa ctggataaat 120 caagcgttct ggatcgtatt aaaacactgg gtctgagccg tctgcagcag gcacagatta 180 atagctatat ggcactgtat gccggtgaaa ccaccgataa atttggtctg cctggtgttc 240 tgaaactgtt tgcatgtggt ggttggaatt atgatgcctt tatggatacc gaaacgcact 300 atcgtattca aggtggcacc attggtctga ccaatgcaat gctgaccgat agcggtgccg 360 aagttcgtat gagcgttccg gttaccgcgg atagg 395 <210> 77 <211> 395 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 77 gcaatgaatt cggtaaaaac attcgcattg cctttgaaaa actgtgtcat gatgcatggg 60 aagtttttcc gcgtccgcat gaaccgatgt ttaccgaacg tgcccgtgaa ctggataaat 120 caagcgttct ggatcgtatt aaaacactgg gtctgagccg tctgcagcag gcacagatta 180 atagctatat ggcactgtat gccggtgaaa ccaccgataa atttggtctg cctggtgttc 240 tgaaactgtt tgcatgtggt ggttggaatt atgatgcctt tatggatacc gaaacgcact 300 atcgtattca aggtggcacc attggtctga gcaatgcaat gctgaccgat agcggtgccg 360 aagttcgtat gagcgttccg gttaccgcgg atagg 395 <210> 78 <211> 395 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide" <400> 78 gcaatgaatt cggtaaaaac attcgcattg cctttgaaaa actgtgtcat gatgcatggg 60 aagtttttcc gcgtccgcat gaaccgatgt ttaccgaacg tgcccgtgaa ctggataaat 120 caagcgttct ggatcgtatt aaaacactgg gtctgagccg tctgcagcag gcacagatta 180 atagctatat ggcactgtat gccggtgaaa ccaccgataa atttggtctg cctggtgttc 240 tgaaactgtt tgcatgtggt ggttggaatt atgatgcctt tatggatacc gaaacgcact 300 atcgtattca aggtggcacc attggtctgg ataatgcaat gaaaaccgat agcggtgccg 360 aagttcgtat gagcgttccg gttaccgcgg atagg 395 <210> 79 <211> 395 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 79 gcaatgaatt cggtaaaaac attcgcattg cctttgaaaa actgtgtcat gatgcatggg 60 aagtttttcc gcgtccgcat gaaccgatgt ttaccgaacg tgcccgtgaa ctggataaat 120 caagcgttct ggatcgtatt aaaacactgg gtctgagccg tctgcagcag gcacagatta 180 atagctatat ggcactgtat gccggtgaaa ccaccgataa atttggtctg cctggtgttc 240 tgaaactgtt tgcatgtggt ggttggaatt atgatgcctt tatggatacc gaaacgcact 300 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Claims (80)

  1. 서열번호: 1에 제시된 야생형 NicA2 효소의 아미노산 서열의 변이체 서열을 포함하는 니코틴 분해 효소 변이체로서, 상기 변이체는 서열번호: 1과 적어도 99% 이상의 상동성을 갖고, 하기로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 치환을 포함하는, 변이체:
    i. R91A, R91Q, R91F, R91G, R91T, R91L, R91S, 및 R91N;
    ii. F104L;
    iii. G106S;
    iv. A107H, A107P, A107R, A107K, 및 A107T;
    v. L217Q, L217G, L217E, L217I, L217C, 및 L217S;
    vi. T250P, T250G, T250L, T250R, 및 T250V;
    vii. K340P, K340I, K340V, K340D 및 K340E;
    viii. F355C 및 F355V;
    ix. Q366K, Q366E, Q366V, Q366L, Q366I, 및 Q366Y;
    x. T381P, T381I, T381V, T381Q, T381N, T381L, 및 T381M;
    xi. W427R, W427H, W427L, W427Q, W427E, W427S, 및 W427M;
    xii. N462M, N462L, N462Y, N462S, N462F, N462G, N462E, 및 N462A; 및
    xiii. I463F, I463Y, I463A, I463V, 및 I463L.
  2. 제 1 항에 있어서, 서열번호: 1에서 52 아미노산까지의 N-말단 결실을 포함하는, 변이체.
  3. 제 1 항에 있어서, 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함하는, 변이체:
    (a) L74N 및 Y77R;
    (b) L74N 및 Y77K;
    (c) L74Q 및 Y77R;
    (d) L74Q 및 Y77N;
    (e) L74N 및 Y77Q;
    (f) L74N 및 Y77H;
    (g) L74N 및 L80H;
    (h) L80F;
    (i) Y77R;
    (j) R78Q;
    (k) I262A 및 A264Q;
    (l) I262K 및 L266D;
    (m) I262T;
    (n) I262S;
    (o) I262D 및 L266K;
    (p) I262A;
    (q) I262T 및 A264L;
    (r) I262T 및 N263R;
    (s) M265H;
    (t) I262A 및 A264N;
    (u) V303T, V304N, 및 M306I;
    (v) V304A 및 M306Q;
    (w) V304A 및 M306N;
    (x) V304A;
    (y) V304A 및 M306H;
    (z) V304N 및 M306H;
    (aa) V304Q 및 M306H;
    (bb) V304N 및 M306I;
    (cc) V304T 및 M306I;
    (dd) M306I 및 L310R;
    (ee) L374Q 및 I377S;
    (ff) L374A 및 I377A;
    (gg) L374Q 및 I377A;
    (hh) L374N 및 I377A;
    (ii) L374N 및 I382Q;
    (jj) I377A 및 I382T;
    (kk) I377A 및 L378N;
    (ll) I377T 및 I382T;
    (mm) I377T;
    (nn) L374N 및 A383Q;
    (oo) I448Q 및 F450S;
    (pp) I448E 및 F450N;
    (qq) I448A 및 F450N;
    (rr) I448Q 및 F450Q;
    (ss) I448T 및 F450Q;
    (tt) I448E 및 F450L;
    (uu) T455K;
    (vv) L449H 및 F450A;
    (ww) F450A;
    (xx) I448A 및 F450Y;
    (yy) I262T;
    (zz) I262S;
    (aaa) I262A;
    (bbb) I262T 및 A264L; 및
    (ccc) I262T 및 N263R.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 변이체 서열은 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 변이체:
    서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 135, 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 서열번호: 15, 서열번호: 16, 서열번호: 129, 서열번호: 17, 서열번호: 18, 서열번호: 19, 서열번호: 20, 서열번호: 136, 서열번호: 21, 서열번호: 22, 서열번호: 23, 서열번호: 24, 서열번호: 25, 서열번호: 26, 서열번호: 27, 서열번호: 28, 서열번호: 29, 서열번호: 30, 서열번호: 31, 서열번호: 130, 서열번호: 32, 서열번호: 33, 서열번호: 34, 서열번호: 35, 서열번호: 36, 서열번호: 37, 서열번호: 38, 서열번호: 131, 서열번호: 39, 서열번호: 40, 서열번호: 41, 서열번호: 42, 서열번호: 43, 서열번호: 44, 서열번호: 45, 서열번호: 132, 서열번호: 133, 서열번호: 46, 서열번호: 47, 서열번호: 48, 서열번호: 49, 서열번호: 50, 서열번호: 51, 서열번호: 52, 서열번호: 53, 서열번호: 54, 서열번호: 55, 서열번호: 56, 서열번호: 124, 서열번호: 125, 서열번호: 126, 서열번호: 134, 서열번호: 142, 서열번호: 143, 서열번호: 127, 서열번호: 128, 서열번호: 62, 서열번호: 63, 서열번호: 137, 서열번호: 138, 서열번호: 140, 및 서열번호: 141.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 변이체의 니코틴 분해 활성이 야생형 NicA2 효소의 니코틴 분해 활성의 적어도 300%인, 변이체.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 야생형 NicA2 효소에 대한 면역원성이 75% 이상 감소되는, 변이체.
  7. 제 6 항 있어서, 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환 조합을 포함하는, 변이체:
    (a) L74N 및 Y77R;
    (b) L74N 및 Y77K;
    (c) L74Q 및 Y77R;
    (d) L74Q 및 Y77N;
    (e) L74N 및 Y77Q;
    (f) L74N 및 Y77H;
    (g) L74N 및 L80H;
    (h) L80F;
    (i) Y77R;
    (j) R78Q;
    (k) I262A 및 A264Q;
    (l) I262K 및 L266D;
    (m) I262T;
    (n) I262S;
    (o) I262D 및 L266K;
    (p) I262A;
    (q) I262T 및 A264L;
    (r) I262T 및 N263R;
    (s) M265H;
    (t) I262A 및 A264N;
    (u) V303T, V304N, 및 M306I;
    (v) V304A 및 M306Q;
    (w) V304A 및 M306N;
    (x) V304A;
    (y) V304A 및 M306H;
    (z) V304N 및 M306H;
    (aa) V304Q 및 M306H;
    (bb) V304N 및 M306I;
    (cc) V304T 및 M306I;
    (dd) M306I 및 L310R
    (ee) L374Q 및 I377S;
    (ff) L374A 및 I377A;
    (gg) L374Q 및 I377A;
    (hh) L374N 및 I377A;
    (ii) L374N 및 I382Q;
    (jj) I377A 및 I382T;
    (kk) I377A 및 L378N;
    (ll) I377T 및 I382T;
    (mm) I377T;
    (nn) L374N 및 A383Q;
    (oo) I448Q 및 F450S;
    (pp) I448E 및 F450N;
    (qq) I448A 및 F450N;
    (rr) I448Q 및 F450Q;
    (ss) I448T 및 F450Q;
    (tt) I448E 및 F450L;
    (uu) T455K;
    (vv) L449H 및 F450A;
    (ww) F450A;
    (xx) I448A 및 F450Y;
    (yy) I262T;
    (zz) I262S;
    (aaa) I262A;
    (bbb) I262T 및 A264L; 및
    (ccc) I262T 및 N263R.
  8. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 1의 적어도 1-38 아미노산의 결실 또는 서열번호: 1의 1-50 아미노산의 결실을 포함하는, 변이체.
  9. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체는 지속 작용형 변이체인, 변이체.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 지속 작용형 변이체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 연결된, 변이체.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 변이체 서열은 서열번호: 1의 하기의 변이를 포함하는, 변이체:
    (a) 하기로부터 선택되는 적어도 하나의 치환:
    xiii. R91A, R91Q, R91F, R91G, R91T, R91L, R91S, 및 R91N;
    xiv. F104L;
    xv. G106S;
    xvi. A107H, A107P, A107R, A107K, 및 A107T;
    xvii. L217Q, L217G, L217E, L217I, L217C, 및 L217S;
    xviii. T250P, T250G, T250L, T250R, 및 T250V;
    xixi. K340P, K340I, K340V, K340D 및 K340E;
    xx. F355C 및 F355V;
    xxi. Q366K, Q366E, Q366V, Q366L, Q366I, 및 Q366Y;
    xxii. T381P, T381I, T381V, T381Q, T381N, T381L, 및 T381M;
    xxiii. W427R, W427H, W427L, W427Q, W427E, W427S, 및 W427M;
    xxiv. N462M, N462L, N462Y, N462S, N462F, N462G, N462E, 및 N462A; 및
    xxv. I463F, I463Y, I463A, I463V, 및 I463L; 및
    (b) 서열번호: 1의 1-38 아미노산의 결실 또는 서열번호: 1의 1-50 아미노산의 결실.
  12. 제 11 항에 있어서, 서열번호: 1의 74, 77, 78, 80, 262-266, 303, 304, 306, 310, 374, 377, 378, 382, 383, 450-452 및 457번째 아미노산에서 선택되는 면역원성 T-세포 에피토프에서 적어도 하나의 치환, 부가 또는 결실을 포함하는, 변이체.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호: 1에 하기의 변이를 포함하는, 변이체:
    (a) 하기로부터 선택되는 적어도 하나의 치환:
    xxvi. R91A, R91Q, R91F, R91G, R91T, R91L, R91S, 및 R91N;
    xxvii. F104L;
    xxviii. G106S;
    xxix. A107H, A107P, A107R, A107K, 및 A107T;
    xxx. L217Q, L217G, L217E, L217I, L217C, 및 L217S;
    xxxi. T250P, T250G, T250L, T250R, 및 T250V;
    xxxii. K340P, K340I, K340V, K340D 및 K340E;
    xxxiii. F355C 및 F355V;
    xxxiv. Q366K, Q366E, Q366V, Q366L, Q366I, 및 Q366Y;
    xxxv. T381P, T381I, T381V, T381Q, T381N, T381L, 및 T381M;
    xxxvi. W427R, W427H, W427L, W427Q, W427E, W427S, 및 W427M;
    xxxvii. N462M, N462L, N462Y, N462S, N462F, N462G, N462E, 및 N462A; 및
    xxxviii. I463F, I463Y, I463A, I463V, 및 I463L; 및
    (b) 서열번호: 1의 1-38 아미노산의 결실 또는 서열번호: 1의 1-50 아미노산의 결실.
  14. 제 11 항에 있어서, 상기 변이체는 PEG에 연결된, 변이체.
  15. 제 13 항에 있어서, PEG에 연결된, 변이체.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 변이체 서열은 (a) 아미노산 위치 104, 107 또는 305에서 아미노산 치환되어, 니코틴 분해 활성이 증가되고, (b) 서열번호: 1의 1-50 아미노산이 결실된 것인, 변이체,
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호: 134의 아미노산 서열로 구성되고, 선택적으로 PEG에 연결된, 변이체.
  18. 제 16 항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호: 1에 상응하는 1-50 아미노산의 결실을 갖는 서열번호: 126의 아미노산 서열로 구성되고, 선택적으로 PEG에 연결된, 변이체.
  19. 제1항 내지 제5항 및 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항의 니코틴 분해 효소 변이체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 금연 촉진용, 또는 니코틴 중독증 또는 니코틴 독성 치료용 약학적 조성물.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 니코틴 중독은 담배 및 전자 담배로 구성되는 군으로부터 선택되는 담배 제품의 소비와 연관된, 약학적 조성물.
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