CN103012572B

CN103012572B - 一种降低烟草尼古丁含量的基因及应用

Info

Publication number: CN103012572B
Application number: CN2012105175535A
Authority: CN
Inventors: 韩生成; 王英典; 赵和平; 杨玉萍
Original assignee: Beijing Normal University
Current assignee: Beijing Normal University
Priority date: 2012-12-05
Filing date: 2012-12-05
Publication date: 2013-11-27
Anticipated expiration: 2032-12-05
Also published as: CN103012572A

Abstract

本发明公开了一种降低烟草尼古丁含量的基因及其应用。所述基因是一种烟草JAZ蛋白基因，命名为NtJAZ3，该基因编码的蛋白具有典型的TIFY结构域和jas结构域，且受茉莉素的诱导表达。通过构建NtJAZ3基因的RNAi转基因载体并转化烟草，成功抑制了NtJAZ3在烟草细胞中的表达，所获得的转基因烟草细胞系的尼古丁含量较野生型明显降低。本发明为获得低尼古丁含量烟草育种提供了重要的科学依据和技术支撑。

Description

一种降低烟草尼古丁含量的基因及应用

技术领域

本发明涉及烟草尼古丁的合成及调控相关基因，特别涉及调控烟草尼古丁合成的基因在降低烟草尼古丁含量方面的应用。

背景技术

吸烟严重危害人的身体健康，因而如何减少吸烟的危害已成为各国政府、医学专家、植物学家倾力关注、研究的课题之一。许多世界顶级烟草公司投入巨资对烟草次生代谢物的代谢途径、调控机制进行研究。尼古丁是一种吡啶类生物碱，主要存在于茄科烟草属（Nicotiana）植物中，是烟草体内的一种重要的次生代谢产物。目前对尼古丁生物合成的研究主要集中在克隆其代谢相关的酶并分析其生理和生化特性方面。尼古丁是在植物的根部形成并经过木质部转运到叶片沉积下来。尼古丁合成的前体是基本的氨基酸：精氨酸和鸟氨酸以及天门冬氨酸。它们经一系列的代谢合成途径中的关键酶PMT，QPT和MPO等催化最终生成尼古丁（Chintapakorn and Hamill,2003.Antisense-mediated down-regulation of putrescineN-methyltransferase activity in transgenic Nicotiana tabacum L.can lead to elevated levels ofanatabine at the expense of nicotine.Plant Molecular Biology 53:87-105.）。

尼古丁生物合成受多种因素的调控，发育调控的激素信号就是很重要的一类。茉莉素（JAs）是茉莉酸及其衍生物的统称，是植物体内起全局调控作用的植物生长调节物质，广泛分布于植物的幼嫩组织、花和发育的生殖器官中。并且在植物受到生物胁迫和非生物胁迫时，JAs还能改变细胞内基因表达和介导植物的防御反应。研究证明尼古丁代谢途径上的关键酶，如MPT，QPT和MPO均受植物伤诱导激素-茉莉素的诱导而表达，从而形成尼古丁。自1962年发现茉莉酸至今，人们对茉莉酸的合成途径已经非常了解，但对茉莉素的信号传导途径及其调控植物的生长发育和应激反应的分子机制并不清楚。

2007年三个课题组相继报道在拟南芥中发现了一类新的转录抑制调节子，被命名为茉莉素ZIM结构域蛋白家族（简称JAZ蛋白）。它通过抑制茉莉素响应基因的表达而发挥其生理功能（Chini et al.,2007.The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling.Nature 448:U664-U664;Thines et al.,2007.JAZ repressor proteins are targets of the SCFCO11complex during jasmonate signalling.Nature 448:U661-U662.;Yan et al.,2007.A DownstreamMediator in the Growth Repression Limb ofthe Jasmonate Pathway.Plant Cell 19,2470-2483.）。当没有茉莉素时，JAZ蛋白的C-端结合在MYC2转录因子的N-端，抑制茉莉素诱导基因的表达；当植物体内有茉莉素存在时，JAZ蛋白同SCF^COI1复合物相互作用，从而导致JAZ蛋白的聚泛素化而被26S蛋白酶体降解，释放出MYC2转录因子激活茉莉素诱导基因的表达。

研究尼古丁的代谢调控是非常有意义的一项工作。尼古丁对人体有很强的生理刺激作用，是烟草商业性使用的物质基础。对烟草而言，尼古丁是一种抵御昆虫侵害的防御性物质。在没有受到伤害的烟草植株中，尼古丁含量大约为0.1%-1.0%。受到植食性昆虫侵害或机械损伤后，烟草植株内茉莉素含量可以增加到原来的9倍（Ziegler et al.,2001.Herbivore-inducedallene oxide synthase transcripts and jasmonic acid in Nicotiana attenuata.Phytochemistry 58:729-738.），而尼古丁含量可以达到4-10倍（Baldwin,1998.Jasmonate-induced responses arecostly but benefit plants under attack in native populations.Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America 95,8113-8118.），这个浓度会使大多数食叶性昆虫立即死亡，从而保护受害虫侵害的组织，达到抗虫的目的。实验结果证明茉莉素可以调控尼古丁的生成，但是其分子机制并不清楚。

目前，对于JAZ蛋白的研究，在拟南芥中一共发现12个成员，这不难使我们思考，烟草中有没有这样的JAZ蛋白，以及这些蛋白是否参与了茉莉素诱导的烟草尼古丁的合成。

发明内容

本发明的目的在于寻找与烟草尼古丁含量相关的功能基因，进而提供一种降低烟草尼古丁含量的方法，为低尼古丁含量烟草育种提供技术手段。

本发明的研究发现，烟草中的某些NtJAZs是受茉莉素的诱导而表达。通过RNAi技术在烟草中干扰其各自的表达，获得转基因细胞系，检测发现这些转基因细胞系中尼古丁的含量相对野生型要低很多。由此推测，利用转基因技术，干扰、沉默或敲除某些NtJAZs，可为获得低尼古丁含量烟草育种提供重要的科学依据。鉴于该类基因的应用价值及其利用潜力的应用前景，有必要通过专利加以保护。

本发明提供的用于降低烟草尼古丁含量的基因属于JAZ家族蛋白基因，来源于烟草（Nicotiana tabacum），命名为NtJAZ3，编码下述蛋白质(i)或(ii)：

(i)序列表中的SEQ ID No：1所示氨基酸序列的蛋白质；

(ii)序列表中的SEQ ID No：1所示氨基酸序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加而衍生的蛋白质，并且所衍生的蛋白质具有与(i)所述蛋白质相同的功能。

序列表中的SEQ ID No：1序列由207个氨基酸残基组成，其中第93位至第98位氨基酸残基是TIFY结构域，第158位至第176位氨基酸残基是jas结构域。所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非上述结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。对氨基酸残基进行取代、缺失或添加，以及对相关功能的检测可以通过本领域的常规技术来实现。

本发明的烟草JAZ蛋白基因NtJAZ3可以是其cDNA序列，也可以是基因组DNA序列，或者是与这些序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列。例如序列表中SEQID NO：2所示的DNA序列。

通过对烟草转录组测序结果进行de novo拼接，利用所获得的烟草转录组数据以及NCBI公布的烟草基因组序列片段和EST片段进行拟南芥同源JAZ的Blast分析，本发明的相关研究获得了一系列烟草JAZ蛋白（NtJAZs）成员。其中，设计引物克隆了NtJAZ3的ORF全长序列（SEQ ID NO：2），其编码的蛋白序列如序列表中的SEQ ID No：1所示。序列分析结果表明，该蛋白含有保守的TIFY结构域和jas结构域。其次，利用通过RT-PCR及Real-time PCR发现该基因是受茉莉素诱导而表达的（图1）。

基于上述研究，本发明通过RNAi技术构建了NtJAZ3基因的RNAi转基因载体，成功获得了抑制NtJAZ3在烟草细胞中表达的转基因细胞系，所获得的转基因烟草细胞系拥有尼古丁含量相对对照明显降低的特异表型。可见，利用转基因技术，干扰、沉默或敲除NtJAZ3基因能够获得尼古丁含量降低的转基因烟草，这使得低尼古丁含量烟草育种成为可能，为降低烟草尼古丁含量提供了一种有效的技术手段。

在本发明的一个具体实例中，首先，为构建NtJAZ3的RNAi双元表达载体，选择此基因中较特异的一段核酸片段（序列表SEQ ID NO：2的第1-499bp序列）为RNAi的引导序列，设计引物获得此序列。然后，将此核酸片段以正反两个方向插入到植物表达载体pHZPRi-Hyg中构建成为NtJAZ3的RNAi双元表达载体。如图2所示，该载体中的两个NtJAZ3特异片段由一段GUS序列隔开，由CaMV 35S启动子引导表达。之后，将此质粒转入农杆菌LBA4404，并经由农杆菌将此质粒转入烟草BY-2悬浮细胞中。进而，通过Real-time PCR方法对RNAi的效率进行了检测。结果显示，所获得的转基因细胞系中NtJAZ3的表达被有效抑制（图3）。

针对NtJAZ3-RNAi转基因烟草细胞系，利用气质联用质谱分析技术测定了茉莉素处理72小时后细胞中尼古丁的含量。相比对照野生型烟草细胞，转化细胞系的尼古丁含量有明显的降低（图4）。因此，本发明为获得低尼古丁含量烟草育种提供重要的科学依据和技术支撑。

附图说明

图1、Real-time PCR检测茉莉素诱导下NtJAZ3的表达变化，其中：左图显示了NtJAZ3基因受茉莉素（JA）诱导，并随着JA作用的延长表达量逐渐增加的表达情况；右图是正对照，尼古丁合成途径中的关键酶PMT在JA诱导处理下的表达情况；以Actin为内参。

图2、NtJAZ3-RNAi植物表达载体构建示意图，该载体中，NtJAZ3的RNAi引导序列以正反两个方向插入植物表达载体GUS序列的两侧；图中，RB、LB示序列的左右边界；2×35S示启动子，Hyg示潮霉素抗性基因。

图3、烟草转基因细胞系的分子鉴定：所示为转化NtJAZ3-RNAi表达载体的烟草悬浮细胞转录水平的Real-time PCR鉴定结果，其中WT为烟草野生型BY-2细胞。

图4、烟草转基因细胞系尼古丁含量检测：利用RNAi技术反义抑制NtJAZ3在烟草BY-2细胞中的表达，收集未经MeJA处理和MeJA处理72小时样品，利用气质联用质谱分析技术（GC-MS）进行尼古丁含量检测，反义抑制NtJAZ3后尼古丁含量大幅度降低，WT为烟草野生型BY-2细胞对照。

具体实施方式

下述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实验方法所用的试剂，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到。

植物材料：烟草悬浮细胞系BY-2（Nicotiana tabacum L.cv.Bright Yellow 2）

1、实验材料的获得和RNA的提取

■不同时间MeJA处理BY-2细胞的取材方法

烟草悬浮细胞BY-2在MS（4.3g/l MS，100mg/l肌醇，30g/l蔗糖，200mg/l磷酸二氢钾，1mg/l VB1，0.2mg/l 2,4-D，pH=5.8）的液体培养基中24°C，120rpm摇床中悬浮培养，7天一个周期。

Real-time PCR实验所用材料：在进行茉莉素（MeJA）处理时，将生长4天的悬浮细胞传至无2,4-D的MS培养基中，24小时后，加入50μM茉莉素（终浓度）进行处理，分别在0、0.5、2、6、12、24小时收集样品，装入预冷的离心管中。液氮速冻后，转移到-80℃低温冰箱中保存，以用于Real-time PCR分析。

尼古丁含量检测实验所用材料：同上Real-time PCR实验所用材料处理，在MeJA处理72小时收集样品，-80℃低温冰箱中保存，以用于尼古丁含量检测。

■玻璃制品、塑料制品和电泳槽的去RNA酶处理

RNA相关实验过程中所用的玻璃制品在使用前于180℃烘烤8h。塑料制品，包括各种类型的枪头和离心管，用0.1%DEPC水溶液浸泡过夜，高压灭菌后置于80℃干燥箱中干燥。用于RNA电泳的电泳槽经清洗后，用无水乙醇中浸泡30min，然后在30%H₂O₂中浸泡30min，最后用灭菌的DEPC处理水冲洗5次。

■不同时间MeJA处理BY-2细胞总RNA的提取

Trizol法提取细胞总RNA，首先取分装于1.5ml离心管的植物材料（约0.1g），液氮研磨，每管加入1ml Trizol液，迅速混匀，室温下静置5-10分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离，离心12000g，10min，取新离心管加入1ml的氯仿，加入上一步的上清液，小心不要吸到下层沉淀，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15s，室温静置5min，12000g离心10分钟，取上清液（水相）转入一新的离心管，加入等体积异丙醇，-20℃放置2h，4℃，12000g离心10min，弃去上清液，加入1ml 75%乙醇，缓慢颠倒离心管，离心弃上清，重复一次。室温干燥。加适量DEPC处理水溶解RNA。

■RNA质量检测

在GBC Cintra 10e紫外分光光度计上测RNA样品在260nm和280nm的光吸收值，通过吸收值计算RNA样品的浓度和判断RNA样品的纯度。RNA光吸收值和浓度换算公式：1OD₂₆₀=40μg/mL。纯度判断方法：纯的RNA，其OD₂₆₀/OD₂₈₀为2.0，若污染了蛋白质或酚，OD₂₆₀/OD₂₈₀比值明显低于此值。然后通过1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。

■RNA样品中少量DNA的去除

通过无RNase的DNase消化RNA样品中残留的DNA，反应体系包括：1x RQ1 RNase-freeDNase Buffer、RNase inhibitor 20 unit、RQ1 RNase-free DNase 1μL、RNA样品50μg，用DEPC-H₂O补足体系至50μL。上述体系于37℃温育30min。DNA酶解反应结束后，用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀回收RNA样品。

2、NtJAZ3全长cDNA的克隆

提取茉莉素处理2小时的BY-2细胞总RNA，逆转录为cDNA，并以此cDNA为模板PCR扩增NtJAZ3全长序列。具体流程如下：

利用Fermentas公司的RevertAid^TM First Strand cDNA Synthesis Kit进行逆转，获得cDNA,配制反应体系I如下：2μg总RNA、1μL Oligo dT及加DEPC处理水补齐至12μL，于65℃温育5min后迅速置于冰上。然后加入反应体系II：4μL 5×reaction buffer、1μL RNase inhibitor、2μL 10mM dNTP Mix和1μL M-MuLV reverse transcriptase。混匀反应体系I和II，42℃逆转录反应60min，70℃处理5min，置于冰上2min，分装并保存于-20℃。

PCR扩增NtJAZ3编码基因：根据Blast分析序列，设计全长引物，使用高保真DNA聚合酶pfu扩增NtJAZ3编码基因。反应体系如下：2×PCR pfu Mix 25μL、上游引物1μM、下游引物1μM、cDNA 1.0μL，用dd H₂O补充反应体系至50.0μL。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性45sec，55℃退火45sec，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸7min。其中引物序列如下：

上游引物：5’-CACCATGGCATCATCGGAGATTGTGGA-3’（SEQ ID No：3）；

下游引物：5’-CTAGAATTGCTCAGCTTTCACTGG-3’（SEQ ID No：4）。

PCR产物连入ENTY载体克隆：利用博迈德生物的多功能DNA纯化回收试剂盒，对PCR产物进行回收，并使用pENTR/D-TOPO cloning kit试剂盒将克隆的基因与pENTR/D-TOPO载体相连，使用连接体系如下：PCR product 0.5-4μl，Salt solution 1μl，TOPO vetor 1μl，Sterilewater补至6μl体系。轻轻混合均匀，25℃连接过夜，此后进行DH5α转化，得到质粒pENTY-NtJAZ3。

质粒pENTY-NtJAZ3的小量提取：使用北京索莱宝公司质粒小提试剂盒，接菌至1-5mlLB/Kan培养基中培养过夜，次日离心13000rpm 1min收集菌体。加入250μL溶液Ⅰ（请先检查是否已加入RNaseA），振荡混匀后，加入250μl溶液Ⅱ，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解，加入350μl溶液Ⅲ，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。12000rpm离心10min，用移液器小心地将上清转移到吸附柱中（吸附柱加入收集管中），室温放置2分钟，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，加入500μl漂洗液（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱放入收集管中，重复一次，然后12000rpm空离2min。室温干燥，向吸附膜中央悬空滴加50μl经65℃水浴预热的H₂O，室温放置5min，12000rpm离心2min，得到质粒。

质粒pENTY-NtJAZ3的PCR鉴定：通过PCR对NtJAZ3的全长进行电泳鉴定，将得到有全长插入片段的阳性克隆，送公司进行测序，最终鉴定得到NtJAZ3基因ORF的全长序列。

3、茉莉素诱导NtJAZ3基因的表达

■NtJAZ3保守区序列分析

NtJAZ3保守区序列分析：对克隆得到的NtJAZ3蛋白进行序列比对和结构域分析，发现其N端含有保守的tify结构域（第93位至第98位氨基酸残基）和C末端含有Jas结构域（第158位至第176位氨基酸残基），与拟南芥JAZs蛋白的保守结构域相同。

■Real time-PCR引物设计

同一家族基因序列类似性比较高，因此根据NtJAZ3与其它NtJAZs的序列比对情况，挑取特异序列片段进行Real time-PCR引物设计，具体引物序列如下：

上游引物：5’-GGTTCCTTTGGAGATCTCAGC-3’（SEQ ID No：5）；

下游引物：5’-GACCGCCGTAGAATATCGTC-3’（SEQ ID No：6）。

同时，以尼古丁合成途径中的关键酶PMT在JA诱导处理下的表达情况为正对照，对其进行Real time-PCR的引物如下：

上游引物：5’-TATGCACACAGGCTGAAAGC-3’（SEQ ID No：7）；

下游引物：5’-AGTCAACTTCTGGCCCTTCA-3’（SEQ ID No：8）。

以Actin为内参，对其进行Real time-PCR的引物如下：

上游引物：5’-AGCACCTCTTAACCCGAAGG-3’（SEQ ID No：9）；

下游引物：5’-GGACAGTGTGGCTAACACCA-3’（SEQ ID No：10）。

■BY-2细胞不同时间下NtJAZ3的表达检测

取材：烟草BY-2悬浮细胞

时间：50μM MeJA处理0、0.5、2、6、12、24小时

Real-time PCR：使用Trizol Plant试剂盒（Invitrogen）提取总RNA，去DNA后逆转录为cDNA，将cDNA稀释5倍并保存于-20℃待用。在8联定量PCR管中加入10μL 2×ABI powerSYBR green PCR master mix，上、下游引物（10μM）和cDNA各1μL，加dd H₂O补足反应体系至20μL，混匀并短暂离心。将上述反应体系置于ABI 7500实时荧光定量PCR仪中，按标准流程进行PCR反应。循环条件为：50℃2min，94℃预变性10min；95℃变性15sec，60℃退火及延伸1min，40个循环；最后添加一个溶解曲线测定循环。反应结束后应用软件ABI 7500 Software v2.0分析实验结果。以尼古丁合成途径中的关键酶PMT为正对照，以ACTIN（GenBank:ACH69153.1）的表达为内参。结果如图1所示，用50μM MeJA处理烟草BY-2细胞，分别在0h、0.5h、2h、6h、12h和24h收集细胞材料，提取RNA，通过Real-timePCR发现NtJAZ3基因受茉莉素诱导而表达，并随着JA作用时间的延长，基因的表达量逐渐增加，在12h达到最大值，正对照PMT的表达量在受茉莉素处理后被显著诱导。

4、NtJAZ3基因沉默的转基因烟草细胞系的获得

■基因沉默trigger序列的克隆及测序

根据序列比对，在NtJAZ3的ORF框中选取特异性较高的片段（引物设计如下），以茉莉素处理2小时的样品材料为模板，进行PCR克隆，得到用作RNAi的DNA片段，连接ENTY载体并测序。将测序正确的基因沉默trigger序列利用Gateway LR Clonase Ⅱ Enzyme Mix试剂盒进行LR重组反应连接至双元载体pHZPRi-Hyg中形成RNAi载体NtJAZ3-RNAi。引物序列如下：

上游引物：5’-CACCATGGCATCATCGGAGATTGTGGA-3’（SEQ ID No：11）；

下游引物：5’-TTCTTTTCTCTAAAAACCTAGT-3’（SEQ ID No：12）。

应用农杆菌侵染法将构建好的NtJAZ3基因沉默转基因载体（NtJAZ3-RNAi）转入烟草BY-2悬浮细胞中。

5、转基因烟草细胞系的鉴定及尼古丁含量测定

■烟草转基因细胞系的分子鉴定

将农杆菌侵染后的BY-2悬浮细胞在潮霉素抗性培养基上筛选培养，待2-4周后，挑取抗性愈伤组织进行再筛选，之后进行悬浮培养及继代培养并通过RT-PCR及Real-time PCR的方法对转基因愈伤进行筛选鉴定，获得的阳性愈伤组织。具体操作为将筛选后的阳性愈伤组织进行悬浮细胞，并进行茉莉素处理，收集0hour和12hour样品提取RNA并逆转录为cDNA，通过Real-time PCR检测NtJAZ3的表达（图3），筛选得到转基因阳性细胞系。

■烟草转基因细胞系尼古丁含量检测

将筛选后的阳性愈伤组织进行悬浮细胞，并进行茉莉素处理，收集72h样品进行尼古丁含量的检测（图4），具体操作如下：-80℃冰箱取出收集保存的72h处理材料，放入液氮备用，液氮预冷钻头，用电钻将细胞研碎。取1.5ml离心管，称量约0.1~0.15g研碎的细胞放入，加入1.5mol/L的氢氧化钠1.25mL，再加入0.0002μg/ml的喹啉内标溶液20μL，超声波处理1min(总超声时间1min，超声2s，间隔8s，强度36%)。37℃孵育4h，取出加入5ml的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂（体积比3:1），震摇5min。静置，待分层。取下层有机相2.5ml于新离心管中，加入冰乙酸20μl，混匀。用氮气将有机相吹干，加入0.2ml二氯甲烷溶解待测物，漩涡混匀，2000rpm，5min离心，吸出溶液放入色谱管中待上机检测。

利用气质联用质谱分析技术（GC-MS）检测样品中尼古丁含量，结果表明，反义抑制NtJAZ3后尼古丁含量有很大幅度的降低（如图4所示），WT为烟草野生型BY-2细胞。

Claims

1.一种降低烟草尼古丁含量的方法，通过转基因技术干扰、沉默或敲除一烟草JAZ蛋白基因，获得尼古丁含量降低的烟草转化植株，其中所述烟草JAZ蛋白基因编码序列表中的SEQ ID No：1所示氨基酸序列的蛋白质。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述烟草JAZ蛋白基因的序列如序列表中SEQ IDNo：2所示。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，构建所述烟草JAZ蛋白基因的RNAi载体并转化烟草，获得尼古丁含量降低的转基因烟草。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述烟草JAZ蛋白基因的RNAi载体通过下述方法构建：以所述烟草JAZ蛋白基因的特异性核酸片段作为引导序列，将该特异性核酸片段以正反两个方向插入到植物表达载体中。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述烟草JAZ蛋白基因的特异性核酸片段是序列表中SEQ ID No：2的第1-499位核苷酸序列。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述烟草JAZ蛋白基因的RNAi载体中，两个插入方向相反的所述烟草JAZ蛋白基因特异性核酸片段由一段GUS基因序列隔开，并由CaMV35S启动子引导表达。