KR102541582B1

KR102541582B1 - 13-ｏ-아세틸포볼을 포함하는 골질환 및 혈관석회화증 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR102541582B1
Application number: KR1020210055026A
Authority: KR
Inventors: 황기철; 임소연; 이세형; 김상우; 최정원
Original assignee: 가톨릭관동대학교산학협력단
Priority date: 2020-10-29
Filing date: 2021-04-28
Publication date: 2023-06-12
Also published as: KR20220057401A

Abstract

본 발명은 13-Ｏ-아세틸포볼을 유효성분으로 포함하는 골 질환 및 혈관 석회화증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로 상기 13-O-아세틸포볼은 대식세포의 파골세포로의 분화를 억제하고, 파골세포의 활성을 저해하며, 혈관 석회화를 억제하는 효과가 있으므로 상기 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

13-Ｏ-아세틸포볼을 포함하는 골질환 및 혈관석회화증 예방 또는 치료용 약학적 조성물{A PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING OF BONE RELATED DISEASE AND VASCULAR CALCIFICATION COMPRISING 13-O-ACETYLPHORBOL}

본 발명은 13-Ｏ-아세틸포볼을 유효성분으로 포함하는 골 질환 및 혈관 석회화증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

골다공증(osteoporosis)은 골 형성과 골 흡수의 평형이 깨져 뼈의 질량이 감소하고 뼈 조직의 미세구조의 퇴화로 골절 위험이 지속적으로 증가하는 질환으로 뼈를 구성하는 미네랄(특히 칼슘)과 기질이 감소한 상태이다. 골 미세구조 사이의 간격이 넓어지고 미세구조가 얇아져 조그만 충격에도 뼈가 쉽게 골절될 위험이 증가한다. 골다공증의 원인으로는 노령, 운동 부족, 저체중, 흡연, 저칼슘 식이, 폐경, 난소 절제 등이 알려져 있는데, 특히 여성은 폐경기에 이르면 호르몬 변화에 의해 골 감소가 급격히 진행된다.

또한, 폐경기 이후의 여성은 골다공증 외에도 혈관에 인산칼슘과 같은 무기질이 침착되어 혈관이 딱딱해지는 혈관 석회화(vascular calcification)가 나타난다. 혈관 석회화는 혈관의 경직도를 증가시켜 혈관 파열을 초래하고, 심혈관계 석회화는 고혈압, 심부전, 급성 관상동맥증후군과 판막 질환의 악화에 기여하며, 이로 인한 여러 가지 합병증(심장 돌연사, 심근 경색, 협심증 및 허혈성 심부전 등)을 유발한다. 하지만, 혈관 석회화의 정확한 기전은 아직까지 밝혀져 있지 않아 이에 대한 예방 및 치료제도 아직 개발되어 있지 않은 실정이다.

이에 본 발명자들은 골다공증과 혈관 석회화 모두에 유효한 효과를 나타내는 물질을 발굴하기 위하여 노력한 결과, 13-O-아세틸포볼이 이러한 효과를 갖는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

1. 대한민국 등록특허 제10-1502465호

본 발명의 목적은 골다공증과 같은 골 질환 및 혈관 석회화를 같이 치료할 수 있는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 골 관련 질환, 예를 들어 골다공증과 같은 질환에 치료 효과를 갖는 물질로 13-O-아세틸포볼을 발굴하였다. 구체적으로 대식세포에 파골세포 분화 유도물질인 RANKL(receptor activator of NK-κB ligand)을 처리하여 파골세포로의 분화를 유도하면서 상기 13-O-아세틸포볼을 같이 처리하자 대식세포의 파골세포로의 분화가 억제되는 것을 알 수 있었다 (도 4). 또한, 분화된 파골세포의 활성 또한 13-O-아세틸포볼에 의해 억제되었다 (도 4).

따라서, 본 발명의 일 양상은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1의 화합물은 13-O-아세틸포볼(13-O-acetylphobol; CAS 60857-08-1)로 프로스트라틴(prostratin) 또는 12-Deoxyphorbol-13-Acetate로도 알려져 있다.

본 발명에서, 상기 골 질환은 골다공증(osteoporosis), 치주 질환(periodontal disease), 골연화증 (osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골결손, 골위축(bone atrophy), 골괴사, 골절(fracture), 골용해(osteolysis), 골관절염(osteoarthritis) 및 골형성 부전증(osteogenesis imperfecta)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 골다공증일 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어, "골다공증"은 뼈를 구성하는 미네랄(특히 칼슘)과 기질이 감소하여 뼈 조직의 미세구조가 퇴화하고, 결과적으로 골절 위험이 지속적으로 증가하는 상태를 말한다. 파골 작용이 조골 작용보다 증가된 경우 골 재형성의 균형이 깨져서 발생하며, 원인으로는 칼슘 흡수 장애, 비타민 D 결핍, 약물 부작용, 운동 부족, 과음, 폐경, 우울증 등이 있다. 특히 여성의 경우 폐경기 이후 에스트로겐 분비량이 감소하면 활성산소가 세포에 축적되어 골 손실이 촉발되는 것으로 알려져 있다.

또한, 13-O-아세틸포볼은 파골세포 분화 및 활성화를 억제하는 효과 이외에 혈관 석회화 억제 효과도 나타낸다. 따라서, 상기 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 혈관 석회화 억제 효과를 추가로 가질 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.

경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 제조된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용 액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 이에 제한되는 것은 아니나, 화학식 1의 화합물은 1일 1회 내지 수회 투여 시, 체중 1 ㎏ 당 0.001 ㎎ 내지 200 ㎎, 바람직하게는 0.01 ㎎ 내지 100 ㎎, 보다 바람직하게는 0.2 ㎎ 내지 50 ㎎를 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양상은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

상기 식품 조성물은 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 동일한 성분을 사용하므로 이 둘 사이에 중복되는 내용은 명세서의 과도한 기재를 피하기 위하여 생략한다.

본 발명에서, 상기 식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽, 음료 또는 환의 형태로 제공될 수 있으며, 유효성분인 화학식 1로 표시되는 화합물 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 식품 조성물에 함유된 유효성분의 유효용량은 상기 약학 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 식품 조성물은 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로텍스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 및 합성 향미제를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분 외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

상기 기재한 바와 같이 13-O-아세틸포볼은 혈관 석회화 억제 효과도 가진다. 따라서, 본 발명의 다른 양상은 상기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 혈관 석회화증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

혈관 석회화(vascular calcification)는 혈관에 인산칼슘과 같은 무기질이 침착되어 혈관이 딱딱해지는 증상으로 혈관의 경직도를 증가시켜 혈관 파열을 초래한다. 특히, 심혈관계 석회화는 고혈압, 심부전, 급성 관상동맥증후군과 판막 질환의 악화에 기여하며, 이로 인한 여러 가지 합병증(심장 돌연사, 심근 경색, 협심증 및 허혈성 심부전 등)을 유발한다. 하지만, 혈관 석회화의 정확한 기전은 아직까지 밝혀져 있지 않아 이에 대한 예방 및 치료제도 아직 개발되어 있지 않은 실정이다.

상기 약학적 조성물은 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 동일한 성분을 사용하므로 이 둘 사이에 중복되는 내용은 명세서의 과도한 기재를 피하기 위하여 생략한다.

본 발명의 또 다른 양상은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 이용한 시험관내 파골세포 분화 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 RANKL 처리에 의하여 유도되는 대식세포의 파골세포로의 분화를 효과적으로 억제하였으므로 파골세포 분화 억제 용도로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 13-O-아세틸포볼은 대식세포의 파골세포로의 분화를 억제하고, 파골세포의 활성을 저해하며, 혈관 석회화를 억제하는 효과가 있으므로 골 질환 및/또는 혈관 석회화의 예방 또는 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 인간 동맥 평활근 세포에 석회화증을 유도하면서 13-O-아세틸포볼을 같이 처리한 후 세포 내 칼슘을 염색한 결과이다.
도 2는 인간 동맥 평활근 세포에 석회화증을 유도하면서 13-O-아세틸포볼을 같이 처리한 후 세포 내 실제 칼슘 농도를 정량한 결과이다.
도 3은 대식세포를 파골세포로 분화시키면서 13-O-아세틸포볼을 같이 처리한 후 TRAP을 염색한 결과(A) 및 한 세포에 3개 이상, 또는 10개 이상의 핵을 가지는 TRAP+ 파골세포의 비율(B)을 확인한 결과이다.
도 4는 대식세포를 파골세포로 분화시키면서 13-O-아세틸포볼을 같이 처리한 후 파골세포의 활성을 측정한 결과이다.
도 5는 인간 동맥 평활근 세포에 석회화증을 유도하면서 13-O-아세틸포볼 또는 올레산을 같이 처리한 후 세포 내 칼슘을 염색한 결과이다.
도 6은 인간 동맥 평활근 세포에 석회화증을 유도하면서 13-O-아세틸포볼 또는 올레산을 같이 처리한 후 세포 내 실제 칼슘 농도를 정량한 결과이다.
도 7은 도 3은 대식세포를 파골세포로 분화시키면서 13-O-아세틸포볼 또는 올레산을 같이 처리한 후 TRAP을 염색한 결과이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 혈관 석회화 억제 효과

동맥경화반 내에 존재하는 석회화증을 대상으로 13-O-아세틸포볼 (13-O-acetylphobol, prostratin; CAS 60857-08-1)의 영향을 다음과 같이 확인하였다. 석회화의 증가는 심혈관 질환의 증가와 연관이 있다.

동맥 내 병리학적 자극에 의해 석회화 세포로 분화할 수 있는 혈관세포인 인간 동맥 평활근 세포(human aortic smooth muscle cell)를 플레이트에 분주하고, 석회화 세포 분화배지(angiotensin II 포함)를 14일 동안 처리하였다. 13-O-아세틸포볼(0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1 및 2 ㎍/㎖)은 3일마다 처리하였다.

14일 후 칼슘을 염색할 수 있는 알리자린 레드(alizarin red)로 세포를 염색하여 석회화 정도를 확인하고, 10% 아세트산으로 염색된 알리자린 레드를 추출하여 농도를 측정하였다. 데이터는 평균±표준오차로 나타내었다. 그 결과, 13-O-아세틸포볼을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 13-O-아세틸포볼 처리군에서는 처리 농도에 의존적으로 석회화가 억제된 것을 확인할 수 있었다 (도 1).

또한, 세포 내 실제 칼슘 농도를 정량한 결과, 대조군과 비교하여 13-O-아세틸포볼 처리군에서는 처리 농도에 의존적으로 세포 내 칼슘 농도가 감소하는 것을 알 수 있었다 (도 2).

실시예 2: 파골세포 활성화 억제

2-1. TRAP 염색

48-웰 플레이트에 마우스 대식세포주인 RAW264.7 세포를 각 웰당 3x10³개씩 분주하고, 파골세포 분화 유도물질인 RANKL(receptor activator of NK-κB ligand)을 40 ng/㎖ 농도로 처리하여 분화를 유도하였다. 이후 2일마다 배지를 교체하면서 총 4일동안 배양하고, 배지를 교체할 때 13-O-아세틸포볼을 같이 처리하였다.

4일 후 분화된 세포를 고정액으로 상온에서 5분 동안 고정시키고 증류수로 여러 번 세척하였다. 타타르산 나트륨(sodium tartrate)과 산성 인산분해효소(acid phosphatase)의 기질 용액을 혼합하고, 상기 준비된 혼합액을 세포에 처리하여 파골세포 분화 마커인 TRAP(tartrate-resistant acid phosphate)을 염색하였다. 염색은 건조 방지를 위해 플레이트의 뚜껑을 덮은 뒤 37℃에서 15분 내지 45분 동안 진행하였다. 이후 염색약을 버리고 증류수로 3번 세척하여 반응을 중단시켰으며, 현미경으로 관찰한 뒤 사진을 찍어 이미지 J 프로그램으로 염색된 세포의 수를 계산하였다.

실험 결과, RANKL만 처리한 대조군과 비교하여 13-O-아세틸포볼 처리군에서는 파골세포의 분화가 억제된 것을 알 수 있었다 (도 3의 A). 구체적으로 파골세포의 활성은 뼈의 기질인 칼슘-포스페이트(calcium-phosphate)를 녹이는 것으로 판명하는데, 도 3의 A에서 갈색 중 하얀 구멍들이 파골세포가 활성화되어 기질을 녹여낸 것이다. RANKL 처리에 의해 늘어난 하얀색 구멍의 수 및 평균 면적이 13-O-아세틸포볼의 처리에 의해 감소하고 작아진 것을 알 수 있다.

또한, 파골세포는 다수의 핵을 가지는 것이 특징이므로 한 세포에 3개 이상(N≥3), 또는 10개 이상(N≥10)의 핵을 가지는 TRAP⁺ 파골세포의 비율을 계산하였다. 그 결과, RANKL만 처리한 대조군과 비교하여 13-O-아세틸포볼 처리군에서는 3개 이상(N≥3), 또는 10개 이상(N≥10)의 핵을 가지는 TRAP⁺ 파골세포의 비율이 현저히 감소하는 것을 확인하였다 (도 3의 B).

2-2. Pit assay

RAW264.7 세포가 RANKL 처리에 의해 파골세포로 분화되었을 때의 활성을 확인하기 위해 Bone resorption assay kit (CSR-BRA-48KIT, COSMOBIO)를 사용하였다. 구체적으로 칼슘-포스페이트 층을 함유한 뼈 모사 매트리스가 도포되어 있는 배양접시 위에 RAW264.7 세포를 분주하고, 파골세포 분화 유도물질인 RANKL을 40 ng/㎖ 농도로 처리하여 분화를 유도하였다. 이후 2일마다 배지를 교체하면서 총 4일동안 배양하고, 배지를 교체할 때 13-O-아세틸포볼을 같이 처리하였다. 6일 후 5% 차아염소산 나트륨(sodium hypochlorite)을 5분 동안 처리하여 배양접시에 붙어 있는 파골세포를 제거하였다. 배양접시는 물로 추가로 세척한 후 건조시키고, 각 웰의 사진을 찍은 후 파골세포가 뼈 모사 매트리스를 분해하여 형성된 분해 면적(pit area)을 이미지 J로 측정하였다. 상기 분해 면적은 파골세포의 활성과 비례한다.

측정 결과, RANKL만 처리한 대조군과 비교하여 13-O-아세틸포볼 처리군에서는 처리 농도 0.5 ㎍/㎖부터 유의미한 분해 면적 감소를 보이는 것을 확인하였다 (도 4).

비교예 1: 파골세포 활성 억제

13-O-아세틸포볼이 PKC (protein kinase C)의 활성화제로 알려져 있으므로 상기 실시예 1 및 2와 동일한 실험을 진행하여 다른 PKC 활성화제인 올레산(oleic acid)과 효과를 비교하였다.

그 결과, 13-O-아세틸포볼은 혈관 석회화를 억제하지만 올레산은 혈관 석회화 억제 효과가 없는 것을 확인할 수 있었다 (도 5). 세포 내 칼슘 농도 또한 올레산 처리에 의해서는 유의미한 변화가 없는 것을 알 수 있었다 (도 6).

또한, TRAP을 염색하여 파골세포 활성을 확인한 결과 동일한 처리 농도에서 13-O-아세틸포볼은 파골세포의 활성을 억제하지만 올레산은 효과가 없는 것을 확인할 수 있었다 (도 7).

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 골 질환은 골다공증, 치주 질환, 골연화증, 골감소증, 골결손, 골위축, 골괴사, 골절, 골용해, 골관절염 및 골형성 부전증으로 이루어진 군에서 선택되는, 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
[화학식 1]
제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 대식세포의 파골세포로의 분화 또는 파골세포의 활성을 억제하는, 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 혈관 석회화증의 예방 또는 치료 효과를 추가로 나타내는, 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물로서,
상기 골 질환은 골다공증, 치주 질환, 골연화증, 골감소증, 골결손, 골위축, 골괴사, 골절, 골용해, 골관절염 및 골형성 부전증으로 이루어진 군에서 선택되는, 골 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
[화학식 1]
하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 혈관 석회화증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
[화학식 1]
제5항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 혈관 세포 내의 칼슘 농도를 감소시키는, 혈관 석회화증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 혈관 석회화증의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
[화학식 1]