KR102539298B1

KR102539298B1 - 티모하이드로퀴논 함유 조성물 및 이들의 조제 방법

Info

Publication number: KR102539298B1
Application number: KR1020207020978A
Authority: KR
Inventors: 무하메드 마지드; 칼야남 나가브후스하남; 베나 바트
Original assignee: 새미-사빈사 그룹 리미티드
Priority date: 2017-12-27
Filing date: 2018-12-26
Publication date: 2023-06-02
Also published as: CN111542313A; US10881623B2; CA3087050C; CN111566218B; CA3087042A1; CN111542313B; JP2021508718A; AU2018397667A1; CN111566218A; US20190192447A1; AU2018397668B2; WO2019133588A1; AU2018397667B2; US10945969B2; ZA202004532B; KR20200100772A; AU2018397668A1; JP7012857B2; CA3087050A1; BR112020012333A2

Abstract

니겔라 사티바(Nigella sativa)의 종자로부터 단리된 활성 분자들을 혼합함으로써 제형화된, 티모퀴논, 헤데라게닌 및/또는 α-헤데린을 추가로 포함하는, 티모하이드로퀴논이 풍부한 조성물이 개시된다. 또한, 니겔라 사티바의 종자로부터의 생체활성 구성성분 티모하이드로퀴논, 티모퀴논의 단리를 위한 신규한 프로세스도 개시된다. 니겔라 사티바의 소비된 재료로부터의 α-헤데린 및 헤데라게닌의 단리를 위한 프로세스도 본원에 개시된다.

Description

티모하이드로퀴논 함유 조성물 및 이들의 조제 방법

관련 특허 출원에 대한 상호-참조

본 출원은 2017년 12월 27일에 출원된 미국 가특허 출원 제US62610565호의 우선권을 주장하는 비-가특허 출원이다.

본 발명의 배경

본 발명의 분야

본 발명은 일반적으로 티모하이드로퀴논(thymohydroquinone) 함유 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 니겔라 사티바(Nigella sativa)로부터의 티모하이드로퀴논 및 기타 활성물질(active)들의 단리를 위한 프로세스에 관한 것이다.

종래 기술분야의 설명

니겔라 사티바(Nigella sativa)는 Ayurveda, Unani 및 Siddha 의학 시스템에서 널리 사용되는 익히 알려져 있는 의학적 식물이다. 상기 식물은 치료학적 특성들을 나타내는 것으로 보고되어 있는 다수의 활성 성분들을 함유한다. 활성 성분들 중 몇몇은 티모퀴논, 티모하이드로퀴논, 디티모퀴논, p-시멘, 카르바크롤, 4-테르피네올, t-아네톨, 세스퀴테르펜, 롱기폴렌, α-피넨, 티몰, α-헤데린 및 헤데라게닌을 포함한다(Ahmad et al., A review on therapeutic potential of Nigella sativa: A miracle herb, Asian Pac J Trop Biomed. 2013; 3(5): 337-352).

니겔라 사티바로부터의 생체활성물질(bioactive)들의 단리에 대해 다양한 프로세스들이 보고되어 왔다:

1. Salea et al., Supercritical fluid carbon dioxide extraction of Nigella sativa (black cumin) seeds using taguchi method and full factorial design, Biochemical Compounds 2013, doi: 10.7243/2052-9341-1-1.

2. Venkatachallam et al., Chemical composition of Nigella sativa L. seed extracts obtained by supercritical carbon dioxide, J Food Sci Technol, 2010; 47(6):598-605.

3. Baharetha et al., Use of Nigella sativa Linn. Supercritical Carbon Dioxide Extract for Targeting the Angiogenesis Cascade, Med Aromat Plants 2016, 5(3) 1-12.

4. Baharetha et al., Proapoptotic and Antimetastatic Properties of Supercritical CO2 Extract of Nigella sativa Linn. Against Breast Cancer Cells, J Med Food, 2013;16(12): 20131121-1130.

그러나 상기 프로세스들은 비용이 많이 들고 시간이 소비되거나 또는 생체활성물질들의 수율이 낮아 산업적으로 실행불가능하다. 따라서, 생체활성물질들의 수율이 높으면서 경제적이고 또한 산업적으로 실행가능한 신규한 프로세스에 대한 기술적 요구가 존재한다. 본 발명은 니겔라 사티바로부터의 생체활성물질들의 단리에 관한 신규한 고수율의 프로세스를 개시함으로써 상기 과제를 해소한다.

본 발명의 주요 목적은 니겔라 사티바로부터의 생체활성물질의 단리를 위한 뻔하지 않고 산업적으로 적용가능한 프로세스를 개시하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 니겔라 사티바의 종자로부터 단리된 티모하이드로퀴논을 포함하는 조성물을 개시하는 것이다.

본 발명은 전술한 목적들을 충족시키고 추가로 관련된 이점들을 제공한다.

본 발명의 요약

본 발명은 니겔라 사티바의 종자로부터 단리된 활성 분자들을 혼합함으로써 제형화된, 티모퀴논, α-헤데린 및/또는 헤데라게닌을 추가로 포함하는, 티모하이드로퀴논이 풍부한 조성물을 개시한다. 본 발명은 또한 초임계 유체 추출(SCFE: supercritical fluid extraction)을 이용한 니겔라 사티바로부터의 생체활성 구성성분들 티모하이드로퀴논 및 티모퀴논의 단리를 위한 신규한 프로세스도 개시한다. 니겔라 사티바의 소비된 물질들로부터의 α-헤데린 및 헤데라게닌의 단리를 위한 프로세스도 본원에 개시된다.

본 발명의 기타 특징들 및 이점들은 본 발명의 원칙을 실시예의 방식으로 예증하는 하기 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용으로부터 명백해질 것이다.

바람직한 실시형태들의 설명

가장 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 니겔라 사티바의 종자로부터 단리된 STR#1로 나타내어지는 바와 같은 티모하이드로퀴논(thymohydroquinone)을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은:

a) 니겔라 사티바의 종자를 분말화하고, 1.5mm 메쉬(mesh)를 이용하여 분쇄하고, 자력 분리기를 통과시켜 거친 분말을 수득하는 단계;

b) 단계 a)의 상기 분말을 액체 CO₂를 이용하여 초임계 유체 추출(SCFE: super critical fluid extraction)시켜 3개의 분획(fraction)들: 저휘발성 화합물 - S1 분획, 고휘발성 화합물 - S2 분획 및 소비된 잔류물을 수득하는 단계;

c) 총 수율이 각각 S1 분획 중의 약 10 내지 40% 및 S2 분획 중의 약 1 내지 6%인 저휘발성 및 고휘발성 분획들 중의 화합물들을 기체 크로마토그래피를 이용하여 STR#2로 나타내어지는 바와 같은 티모퀴논(thymoquinone), STR#1로 나타내어지는 바와 같은 티모하이드로퀴논 및 유리 지방산으로서 동정하는 단계;

d) 단계 b)의 상기 소비된 잔류물을 60 내지 65℃에서 3시간 동안 교반하면서 5체적(volumes)의 에탄올로 추출하는 단계;

e) 단계 d)의 상기 에탄올 추출물을 여과 농축시켜 갈색을 띤 페이스트(paste)를 수득하는 단계;

f) 단계 e)의 상기 갈색을 띤 페이스트를 물에 용해시키고 3체적의 헥산으로 3회 분할하여 수성 분획 및 헥산(hexane) 분획을 수득하는 단계;

g) 단계 f)의 상기 수성 분획을 n-부탄올로 3회 분할하는 단계;

h) 단계 g)의 상기 n-부탄올 분획을 물로 켄칭(quenching)하여 총 용해된 고체를 20 내지 30%로 유지하면서 용매를 스트립오프(strip off)하는 단계;

i) 분무 건조시켜 HPLC에 의해 STR#3으로 나타내어지는 α-헤데린(CAS 번호 27013-91-8)으로서 동정되는 연한 갈색을 띤 분말을 건조 기준 0.001 내지 5%의 수율로 수득하는 단계;

j) 단계 c)의 상기 S2 분획을 단계 i)의 α-헤데린(α-hederin)과 혼합하여 티모하이드로퀴논, 티모퀴논, α-헤데린 및 유리 지방산을 포함하는 혼합물을 수득하는 단계;

k) 단계 j)의 상기 혼합물을 반응기 내에서 65 내지 70℃에서 30분 동안 교반하면서 에탄올에 용해시켜 균일한 혼합물을 수득하는 단계;

l) 단계 k)의 혼합물로부터 상기 에탄올을 진공 하에 스트립오프하고 여과하여 불용물을 제거하여 갈색을 띤 황색의 유성(oily) 액체를 수득하는 단계;

m) 단계 l)의 상기 혼합물에 안정화제 및 생체이용률 개선제를 부가하는 단계;

n) 단계 m)의 상기 혼합물을 정제, 캡슐, 연질 겔, 분말, 환제, 시럽, 로젠지(lozenge), 현탁제, 유제로 제형화하는 단계

를 포함하는 프로세스를 이용하여 조제되는, 조성물을 개시한다.

한 관련 실시형태에서, 상기 조성물은 약 0.1% 내지 5% w/w의 티모퀴논, 약 0.01% 내지 10% w/w의 티모하이드로퀴논, 약 20% 내지 95% w/w의 지방산, 약 0.001% 내지 3% w/w의 α-헤데린, 0.1% 내지 4.0% w/w의 안정화제 및 0.2% 내지 2% w/w의 생체이용률 개선제를 함유하도록 표준화된다. 다른 관련 실시형태에서, 상기 조성물 중의 상기 유리 지방산은 0.5% w/w 미만의 Ω3(오메가 3) 지방산, 40% 내지 70% w/w의 Ω6(오메가 6) 지방산 및 15% 내지 25% w/w의 Ω9(오메가 9) 지방산으로 구성된다. 다른 실시형태에서, 상기 안정화제는 로스마린산, 부틸화된 하이드록시아니솔(butylated hydroxyanisole), 부틸화된 하이드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene), 메타중아황산 나트륨(sodium metabisulfite), 프로필 갈레이트(propyl gallate), 시스테인(cysteine), 아스코르브산(ascorbic acid) 및 토코페롤(tocopherols)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한 관련 실시형태에서, 상기 안정화제는 바람직하게는 로스마린산이다. 또 다른 실시형태에서, 생체이용률 개선제는 피페린(piperine), 퀘르세틴(quercetin), 마늘 추출물, 생강 추출물 및 나린진(naringin)의 그룹으로부터 선택된다. 한 관련 실시형태에서, 상기 생체이용률 개선제는 바람직하게는 피페린이다.

다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 니겔라 사티바의 종자로부터 단리된 STR#1로 나타내어지는 바와 같은 티모하이드로퀴논을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은:

a) 니겔라 사티바의 종자를 분말화하고, 1.5mm 메쉬를 이용하여 분쇄하고, 자력 분리기를 통과시켜 거친 분말을 수득하는 단계;

b) 단계 a)의 상기 분말을 액체 CO₂를 이용하여 초임계 유체 추출(SCFE)시켜 3개의 분획들: 저휘발성 화합물 - S1 분획, 고휘발성 화합물 - S2 분획 및 소비된 잔류물을 수득하는 단계;

c) 총 수율이 각각 S1 분획 중의 약 10 내지 40% 및 S2 분획 중의 약 1 내지 6%인 S1 분획 및 S2 분획 중의 화합물들을 기체 크로마토그래피를 이용하여 STR#2로 나타내어지는 바와 같은 티모퀴논, STR#1로 나타내어지는 바와 같은 티모하이드로퀴논 및 유리 지방산으로서 동정하는 단계;

d) 단계 b)의 상기 소비된 잔류물을 60 내지 65℃에서 3시간 동안 교반하면서 5체적의 에탄올로 추출하는 단계;

e) 단계 d)의 상기 에탄올 추출물을 여과 농축시켜 갈색을 띤 페이스트를 수득하는 단계;

f) 단계 e)의 상기 갈색을 띤 페이스트를 물에 용해시키고 3체적의 헥산으로 3회 분할하여 수성 분획 및 헥산 분획을 수득하는 단계;

h) 단계 g)의 상기 n-부탄올 분획을 물로 켄칭하여 총 용해된 고체를 20 내지 30%로 유지하면서 용매를 스트립오프하는 단계;

i) 분무 건조시켜 HPLC에 의해 STR#3으로 나타내어지는 α-헤데린으로서 동정되는 연한 갈색을 띤 분말을 건조 기준 0.001 내지 5%의 수율로 수득하는 단계;

j) 단계 i)의 상기 분말을 2체적의 에탄올, 1.4체적의 2N HCl에 용해시키고 상기 혼합물을 5 내지 6시간 동안 교반하면서 50℃ 내지 60℃로 가열함으로써 온화하게(mild) 가수분해하는 단계;

k) 반응물로부터 상기 에탄올 분획을 스트립오프하여 에틸 아세테이트 분획을 수득하는 단계;

l) 상기 에틸 아세테이트 분획을 2%의 Na₂CO₃ 용액으로 세척하여 pH를 중화시키는 단계;

m) 상기 에틸 아세테이트 분획을 분리하고 농축시켜 HPLC에 의해 40 내지 70% 검정으로 STR#4로 나타내어지는 헤데라게닌(hederagenin)으로서 동정된 연한 갈색 분말을 수득하는 단계;

n) 단계 c)의 상기 S2 분획을 단계 m)의 헤데라게닌과 혼합하여 티모하이드로퀴논, 티모퀴논, 헤데라게닌 및 유리 지방산을 포함하는 혼합물을 수득하는 단계;

o) 단계 n)의 상기 혼합물을 반응기 내에서 65 내지 70℃에서 30분 동안 교반하면서 에탄올에 용해시켜 균일한 혼합물을 수득하는 단계;

p) 단계 o)의 혼합물로부터 상기 에탄올을 진공 하에 스트립오프하고 여과하여 불용물을 제거하여 갈색을 띤 황색의 유성 액체를 수득하는 단계;

q) 단계 p)의 상기 혼합물에 안정화제 및 생체이용률 개선제를 부가하는 단계;

r) 단계 q)의 상기 혼합물을 정제, 캡슐, 연질 겔, 분말, 환제, 시럽, 로젠지, 현탁제, 유제로 제형화하는 단계

한 관련 실시형태에서, 상기 조성물은 약 0.1% 내지 5% w/w의 티모퀴논, 약 0.01% 내지 10% w/w의 티모하이드로퀴논, 약 20% 내지 95% w/w의 지방산, 약 0.001% 내지 3% w/w의 헤데라게닌, 0.1% 내지 4.0% w/w의 안정화제 및 0.2% 내지 2% w/w의 생체이용률 개선제를 함유하도록 표준화된다. 다른 관련 실시형태에서, 상기 조성물 중의 상기 유리 지방산은 0.5% w/w 미만의 Ω3(오메가 3) 지방산, 40% 내지 70% w/w의 Ω6(오메가 6) 지방산 및 15% 내지 25% w/w의 Ω9(오메가 9) 지방산으로 구성된다. 다른 실시형태에서, 상기 안정화제는 로스마린산, 부틸화된 하이드록시아니솔, 부틸화된 하이드록시톨루엔, 메타중아황산 나트륨, 프로필 갈레이트, 시스테인, 아스코르브산 및 토코페롤로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한 관련 실시형태에서, 상기 안정화제는 바람직하게는 로스마린산이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 생체이용률 개선제는 피페린, 퀘르세틴, 마늘 추출물, 생강 추출물 및 나린진의 그룹으로부터 선택된다. 한 관련 실시형태에서, 상기 생체이용률 개선제는 바람직하게는 피페린이다.

또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 니겔라 사티바의 종자로부터 단리된 STR#1로 나타내어지는 바와 같은 티모하이드로퀴논을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은:

c) 총 수율이 각각 S1 분획 중의 약 10 내지 40% 및 S2 분획 중의 약 1 내지 6%인 저휘발성 및 고휘발성 분획들 중의 화합물들을 기체 크로마토그래피를 이용하여 STR#2로 나타내어지는 바와 같은 티모퀴논, STR#1로 나타내어지는 바와 같은 티모하이드로퀴논 및 유리 지방산으로서 동정하는 단계;

d) 단계 a)의 상기 분말을 에탄올로 추출하여 에탄올 추출물 및 소비된 재료를 수득하는 단계;

e) 단계 d)의 상기 소비된 재료를 60℃ 내지 70℃ 오븐 하에 건조시키고, 분쇄하고, 40# 메쉬로 이동시켜 니겔라 사티바의 탈지(deoiled) 분말을 수득하는 단계;

f) 단계 b)로부터 수득한 S2 분획의 2% 내지 5%를 단계 d)의 에탄올 추출물의 30% 내지 40% 및 단계 e)로부터의 탈지 분말의 50% 내지 70%와 혼합하여 티모하이드로퀴논, 티모퀴논, 및 유리 지방산을 포함하는 조성물을 수득하는 단계;

g) 단계 f)의 상기 조성물을 상기 제2 실시형태에서 언급된 프로세스의 단계 m)으로부터 수득한 STR#4로 나타내어지는 바와 같은 헤데라게닌의 0.001% 내지 1% 및/또는 단계 i)로부터 수득한 STR#3으로 나타내어지는 바와 같은 α-헤데린의 0.001% 내지 1%와 혼합하여 티모하이드로퀴논, 티모퀴논, 유리 지방산, α-헤데린 및/또는 헤데라게닌을 포함하는 조성물을 수득하는 단계;

h) 단계 g)의 상기 조성물에 안정화제 및 생체이용률 개선제를 부가하는 단계;

i) 단계 h)의 상기 혼합물을 정제, 캡슐, 연질 겔, 분말, 환제, 시럽, 로젠지, 현탁제, 유제로 제형화하는 단계

한 관련 실시형태에서, 상기 조성물은 약 0.1% 내지 5% w/w의 티모퀴논, 약 0.01% 내지 10% w/w의 티모하이드로퀴논, 약 20% 내지 95% w/w의 지방산, 약 0.001% 내지 3% w/w의 α-헤데린 및/또는 헤데라게닌, 0.1% 내지 4.0% w/w의 안정화제 및 0.2% 내지 2% w/w의 생체이용률 개선제를 함유하도록 표준화된다. 다른 관련 실시형태에서, 상기 조성물 중의 상기 유리 지방산은 0.5% w/w 미만의 Ω3(오메가 3) 지방산, 40% 내지 70% w/w의 Ω6(오메가 6) 지방산 및 15% 내지 25% w/w의 Ω9(오메가 9) 지방산으로 구성된다. 다른 실시형태에서, 상기 안정화제는 로스마린산, 부틸화된 하이드록시아니솔, 부틸화된 하이드록시톨루엔, 메타중아황산 나트륨, 프로필 갈레이트, 시스테인, 아스코르브산 및 토코페롤로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한 관련 실시형태에서, 상기 안정화제는 바람직하게는 로스마린산이다. 또 다른 실시형태에서, 생체이용률 개선제는 피페린, 퀘르세틴, 마늘 추출물, 생강 추출물 및 나린진의 그룹으로부터 선택된다. 한 관련 실시형태에서, 상기 생체이용률 개선제는 바람직하게는 피페린이다.

본 발명의 기술적 특징 및 기술적 효과를 포함하는 전술의 가장 바람직한 실시형태들은 본원의 하기 실증적 실시예를 통해 설명된다.

실시예 1: SCFE 추출에 의해 니겔라 사티바 로부터 활성 분자들을 단리하고 제형을 조제하기 위한 프로세스

본 발명은 니겔라 사티바의 종자로부터 단리된 티모하이드로퀴논 및 기타 생체활성물질을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 순서도 1은 니겔라 사티바의 종자로부터의 티모퀴논(TQ) 및 티모하이드로퀴논의 단리를 위한 프로세스를 제공한다:

순서도 1: 티모퀴논(TQ) 및 티모하이드로퀴논(THQ)을 단리하기 위한 프로세스

상기 프로세스는 각각 30% 및 3 내지 4%의 높은 총 수율로 TQ, THQ 및 유리 지방산을 함유하는 2개의 분획들을 초래한다. TQ, THQ의 함량은 상기 S2 분획 중에서 비례하여 높다.

상기 프로세스로부터 소비된 재료가 프로세싱되어 헤데라게닌 및 α-헤데린과 같은 추가의 구성성분들이 수득되었다. 순서도 2는 헤데라게닌 및 α-헤데린의 단리를 위한 프로세스를 제공한다.

순서도 2: 헤데라게닌 및 α-헤데린의 단리를 위한 프로세스

하기 순서도(순서도 3)는 티모퀴논, 티모하이드로퀴논, α-헤데린 또는 헤데라게닌을 함유하는 제형을 혼합하기 위한 프로세스를 기술한다.

순서도 3: 티모퀴논, 티모하이드로퀴논, α-헤데린 또는 헤데라게닌을 함유하는 제형

실시예 2: 에탄올 추출에 의해 니겔라 사티바 로부터 활성 분자들을 단리하고 제형을 조제하기 위한 프로세스

한 대안의 프로세스에서, 니겔라 사티바의 종자를 에탄올 추출하였고 SCFE 및 에탄올 추출 둘 다로부터 단리된 생체활성물질들로 조성물을 제형화하였다. 순서도 4는 니겔라 사티바로부터의 생체활성물질의 단리 프로세스를 기술한다.

순서도 4

표 1에 기술된 바와 같은 상기 프로세스로부터 단리된 활성물질들로부터 티모퀴논, 티모하이드로퀴논, α-헤데린 또는 헤데라게닌 및 유리 지방산을 함유하는 조성물이 혼합되었다.

실시예 3: 티모하이드로퀴논을 함유하는 조성물

상기 본원에 기술된 프로세스들로부터, 티모퀴논, 티모하이드로퀴논, 헤데라게닌 또는 α-헤데린 및 유리 지방산을 함유하는 하기 조성물이 제형화되었다. 표 2는 상이한 조성물들 및 개별 활성물질들의 농도를 기술한다. 상기 조성물들은 안정화제(로스마린산) 및 생체이용률 개선제(피페린)를 추가로 함유한다.

상기 조성물 중의 총 지방산은 기체 크로마토그래피를 이용하여 추가로 특성확인하였고, Ω3, 6, 9가 풍부한 것으로 관찰되었다. 그 결과는 표 3에 표로 나타낸다:

티모퀴논 및 티모하이드로퀴논은 흑색 종자 에센셜 오일의 두 가지 주요 구성성분이라는 것은 과학 분야에 익히 공지되어 있다. 티모하이드로퀴논은 티모퀴논의 환원된 형태이지만, 상기 분자의 화학적 및 생물학적 잠재력은 서로 상이하다. 상기 활성물질들의 항산화 및 항-염증성 잠재력에 대한 연구들은 티모하이드로퀴논이 티모퀴논보다 더 강력한 항산화 및 항-염증성 분자임을 나타냈다. 흑색 종자로부터의 생체활성물질을 단리하는데 사용되는 프로세스들의 대부분은 티모퀴논만이 풍부하다. 본 발명은 티모하이드로퀴논 함량이 증가된 조성물을 초래하는 신규한 프로세스를 보고한다.

가속화된 안정성 연구는 티모퀴논의 함량이 감소함에 따라 티모하이드로퀴논의 양이 점진적으로 증가함을 나타냈다.

가속화된 안정성 연구는 티모퀴논 함량의 감소에 따른 티모하이드로퀴논의 점진적 증가를 보여준다.

따라서, 티모하이드로퀴논이 풍부한 상기 조성물은 개선된 치료학적 잠재력을 나타낼 수 있고, 다수의 질환 및 장애의 관리를 위해 투여할 수 있다.

본 발명에 대한 기타 수정 및 변형은 전술한 개시 및 교시로부터 당업자들에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 소정 실시형태들만이 본원에 구체적으로 기술되어 있지만, 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 본 발명에 다수의 수정이 이루어질 수 있음이 명백해질 것이다.

Claims

니겔라 사티바(Nigella sativa)의 종자로부터 단리된 α-헤데린(α-hederin) 및 STR#1로 나타내어지는 바와 같은 티모하이드로퀴논(thymohydroquinone)을 포함하는 조성물의 제조방법로서, 상기 제조방법은:
a) 니겔라 사티바의 종자를 분말화하고, 1.5mm 메쉬(mesh)를 이용하여 분쇄하고, 자력 분리기를 통과시켜 거친 분말을 수득하는 단계;
b) 단계 a)의 상기 분말을 액체 CO₂를 이용하여 초임계 유체 추출(SCFE: super critical fluid extraction)시켜 3개의 분획(fraction)들: 저휘발성 화합물 - S1 분획, 고휘발성 화합물 - S2 분획 및 소비된 잔류물을 수득하는 단계;
c) 총 수율이 각각 S1 분획 중의 10 내지 40% 및 S2 분획 중의 1 내지 6%인 저휘발성 및 고휘발성 분획들 중의 화합물을, 기체 크로마토그래피를 이용하여 STR#2로 나타내어지는 바와 같은 티모퀴논(thymoquinone), STR#1로 나타내어지는 바와 같은 티모하이드로퀴논 및 유리 지방산으로 동정하는 단계;
d) 단계 b)의 상기 소비된 잔류물을 60 내지 65℃에서 3시간 동안 교반하면서 5체적(volumes)의 에탄올로 추출하는 단계;
e) 단계 d)의 에탄올 추출물을 여과 농축시켜 갈색을 띤 페이스트(paste)를 수득하는 단계;
f) 단계 e)의 상기 갈색을 띤 페이스트를 물에 용해시키고 3체적의 헥산(hexane)으로 3회 분할하여 수성 분획 및 헥산 분획을 수득하는 단계;
g) 단계 f)의 상기 수성 분획을 n-부탄올로 3회 분할하는 단계;
h) 단계 g)의 n-부탄올 분획을 물로 켄칭(quenching)하여 총 용해된 고체를 20 내지 30%로 유지하면서 용매를 스트립오프(strip off)하는 단계;
i) 분무 건조시켜, HPLC에 의해 STR#3으로 나타내어지는 α-헤데린(α-hederin)(CAS 번호 27013-91-8)으로 동정되는 연한 갈색을 띤 분말을, 건조 기준 0.001 내지 5%의 수율로 수득하는 단계;
j) 단계 c)의 상기 S2 분획을 단계 i)의 α-헤데린과 혼합하여 티모하이드로퀴논, 티모퀴논, α-헤데린 및 유리 지방산을 포함하는 혼합물을 수득하는 단계;
k) 단계 j)의 상기 혼합물을 반응기 내에서 65 내지 70℃에서 30분 동안 교반하면서 에탄올에 용해시켜 균일한 혼합물을 수득하는 단계;
l) 단계 k)의 혼합물로부터 상기 에탄올을 진공 하에 스트립오프하고 여과하여 불용물을 제거하여 갈색을 띤 황색의 유성(oily) 액체를 수득하는 단계;
m) 단계 l)의 상기 혼합물에 안정화제 및 생체이용률 개선제를 부가하는 단계;
n) 단계 m)의 상기 혼합물을 정제, 캡슐, 연질 겔, 분말, 환제, 시럽, 로젠지(lozenge), 현탁제, 유제로 제형화하는 단계
를 포함하는, 제조방법:

.
제1항에 있어서, 상기 조성물이 0.1% 내지 5% w/w의 티모퀴논, 0.01% 내지 10% w/w의 티모하이드로퀴논, 20% 내지 95% w/w의 지방산, 0.001% 내지 3% w/w의 α-헤데린, 0.1% 내지 4.0% w/w의 안정화제 및 0.2% 내지 2% w/w의 생체이용률 개선제를 함유하도록 표준화된, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 조성물 중의 상기 유리 지방산이 0.5% w/w 미만의 Ω3(오메가 3) 지방산, 40% 내지 70% w/w의 Ω6(오메가 6) 지방산 및 15% 내지 25% w/w의 Ω9(오메가 9) 지방산으로 구성된 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 안정화제가 로스마린산, 부틸화된 하이드록시아니솔(butylated hydroxyanisole), 부틸화된 하이드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene), 메타중아황산 나트륨(sodium metabisulfite), 프로필 갈레이트(propyl gallate), 시스테인(cysteine), 아스코르브산(ascorbic acid) 및 토코페롤(tocopherols)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 안정화제가 로스마린산이고, 상기 생체이용률 개선제가 피페린(piperine), 퀘르세틴(quercetin), 마늘 추출물, 생강 추출물 및 나린진(naringin)의 그룹으로부터 선택되는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 생체이용률 개선제가 피페린인 것인, 제조방법.
니겔라 사티바의 종자로부터 단리된 헤데라게닌(hederagenin) 및 STR#1로 나타내어지는 바와 같은 티모하이드로퀴논을 포함하는 조성물의 제조방법으로서, 상기 제조방법은:
a) 니겔라 사티바의 종자를 분말화하고, 1.5mm 메쉬를 이용하여 분쇄하고, 자력 분리기를 통과시켜 거친 분말을 수득하는 단계;
b) 단계 a)의 상기 분말을 액체 CO₂를 이용하여 초임계 유체 추출(SCFE)시켜 3개의 분획들: 저휘발성 화합물 - S1 분획, 고휘발성 화합물 - S2 분획 및 소비된 잔류물을 수득하는 단계;
c) 총 수율이 각각 S1 분획 중의 10 내지 40% 및 S2 분획 중의 1 내지 6%인 S1 분획 및 S2 분획 중의 화합물들을, 기체 크로마토그래피를 이용하여 STR#2로 나타내어지는 바와 같은 티모퀴논, STR#1로 나타내어지는 바와 같은 티모하이드로퀴논 및 유리 지방산으로 동정하는 단계;
d) 단계 b)의 상기 소비된 잔류물을 60 내지 65℃에서 3시간 동안 교반하면서 5체적의 에탄올로 추출하는 단계;
e) 단계 d)의 에탄올 추출물을 여과 농축시켜 갈색을 띤 페이스트를 수득하는 단계;
f) 단계 e)의 상기 갈색을 띤 페이스트를 물에 용해시키고 3체적의 헥산으로 3회 분할하여 수성 분획 및 헥산 분획을 수득하는 단계;
g) 단계 f)의 상기 수성 분획을 n-부탄올로 3회 분할하는 단계;
h) 단계 g)의 n-부탄올 분획을 물로 켄칭하여 총 용해된 고체를 20 내지 30%로 유지하면서 용매를 스트립오프하는 단계;
i) 분무 건조시켜, HPLC에 의해 STR#3으로 나타내어지는 α-헤데린으로 동정되는 연한 갈색을 띤 분말을, 건조 기준 0.001 내지 5%의 수율로 수득하는 단계;
j) 단계 i)의 상기 분말을 2체적의 에탄올, 1.4체적의 2N HCl에 용해시키고 상기 혼합물을 5 내지 6시간 동안 교반하면서 50℃ 내지 60℃로 가열함으로써 온화하게(mild) 가수분해하는 단계;
k) 반응물로부터 상기 에탄올 분획을 스트립오프하여 에틸 아세테이트 분획을 수득하는 단계;
l) 상기 에틸 아세테이트 분획을 2%의 Na₂CO₃ 용액으로 세척하여 pH를 중화시키는 단계;
m) 상기 에틸 아세테이트 분획을 분리하고 농축시켜, HPLC에 의해 40 내지 70% 검정으로 STR#4로 나타내어지는 헤데라게닌(hederagenin)으로 동정된 연한 갈색 분말을 수득하는 단계;
n) 단계 c)의 상기 S2 분획을 단계 m)의 헤데라게닌과 혼합하여 티모하이드로퀴논, 티모퀴논, 헤데라게닌 및 유리 지방산을 포함하는 혼합물을 수득하는 단계;
o) 단계 n)의 상기 혼합물을 반응기 내에서 65 내지 70℃에서 30분 동안 교반하면서 에탄올에 용해시켜 균일한 혼합물을 수득하는 단계;
p) 단계 o)의 혼합물로부터 상기 에탄올을 진공 하에 스트립오프하여 여과하여 불용물을 제거하여 갈색을 띤 황색의 유성 액체를 수득하는 단계;
q) 단계 p)의 상기 혼합물에 안정화제 및 생체이용률 개선제를 부가하는 단계;
r) 단계 q)의 상기 혼합물을 정제, 캡슐, 연질 겔, 분말, 환제, 시럽, 로젠지, 현탁제, 유제로 제형화하는 단계
를 포함하는, 제조방법:

.
제7항에 있어서, 상기 조성물이 0.1% 내지 5% w/w의 티모퀴논, 0.01% 내지 10% w/w의 티모하이드로퀴논, 20% 내지 95% w/w의 지방산, 0.001% 내지 3% w/w의 헤데라게닌, 0.1% 내지 4.0% w/w의 안정화제 및 0.2% 내지 2% w/w의 생체이용률 개선제를 함유하도록 표준화된, 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 조성물 중의 상기 유리 지방산이 0.5% w/w 미만의 Ω3(오메가 3) 지방산, 40% 내지 70% w/w의 Ω6(오메가 6) 지방산 및 15% 내지 25% w/w의 Ω9(오메가 9) 지방산으로 구성된 것인, 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 안정화제가 로스마린산, 부틸화된 하이드록시아니솔, 부틸화된 하이드록시톨루엔, 메타중아황산 나트륨, 프로필 갈레이트, 시스테인, 아스코르브산 및 토코페롤로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 안정화제가 로스마린산이고, 상기 생체이용률 개선제가 피페린, 퀘르세틴, 마늘 추출물, 생강 추출물 및 나린진의 그룹으로부터 선택되는 것인, 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 생체이용률 개선제가 피페린인 것인, 제조방법.
니겔라 사티바의 종자로부터 단리된, 헤데라게닌 및 α-헤데린 중 하나 이상; 및 STR#1로 나타내어지는 바와 같은 티모하이드로퀴논;을 포함하는 조성물의 제조방법으로서, 상기 제조방법은:
a) 니겔라 사티바의 종자를 분말화하고, 1.5mm 메쉬를 이용하여 분쇄하고, 자력 분리기를 통과시켜 거친 분말을 수득하는 단계;
b) 단계 a)의 상기 분말을 액체 CO₂를 이용하여 초임계 유체 추출(SCFE)시켜 3개의 분획들: 저휘발성 화합물 - S1 분획, 고휘발성 화합물 - S2 분획 및 소비된 잔류물을 수득하는 단계;
c) 총 수율이 각각 S1 분획 중의 10 내지 40% 및 S2 분획 중의 1 내지 6%인 저휘발성 및 고휘발성 분획들 중의 화합물들을, 기체 크로마토그래피를 이용하여 STR#2로 나타내어지는 바와 같은 티모퀴논, STR#1로 나타내어지는 바와 같은 티모하이드로퀴논 및 유리 지방산으로 동정하는 단계;
d) 단계 a)의 상기 분말을 에탄올로 추출하여 에탄올 추출물 및 소비된 재료를 수득하는 단계;
e) 단계 d)의 상기 소비된 재료를 60℃ 내지 70℃ 오븐 하에 건조시키고, 분쇄하고, 40# 메쉬로 이동시켜 니겔라 사티바의 탈지(deoiled) 분말을 수득하는 단계;
f) 단계 b)로부터 수득한 S2 분획의 2% 내지 5%를 단계 d)의 에탄올 추출물의 30% 내지 40% 및 단계 e)로부터의 탈지 분말의 50% 내지 70%와 혼합하여 티모하이드로퀴논, 티모퀴논, 및 유리 지방산을 포함하는 조성물을 수득하는 단계;
g) 단계 f)의 상기 조성물을 추가 성분과 혼합하여 티모하이드로퀴논, 티모퀴논, 유리 지방산, 및 추가 성분을 포함하는 조성물을 수득하는 단계로서, 상기 추가 성분은 제2항의 단계 m)으로부터 수득한 STR#4로 나타내어지는 바와 같은 헤데라게닌의 0.001% 내지 1%, 제2항의 단계 i)로부터 수득한 STR#3으로 나타내어지는 바와 같은 α-헤데린의 0.001% 내지 1%, 또는 이들의 조합인 것인, 단계;
h) 단계 g)의 상기 조성물에 안정화제 및 생체이용률 개선제를 부가하는 단계;
i) 단계 h)의 상기 혼합물을 정제, 캡슐, 연질 겔, 분말, 환제, 시럽, 로젠지, 현탁제, 유제로 제형화하는 단계
를 포함하는, 제조방법:

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제13항에 있어서, 상기 조성물이 0.1% 내지 5% w/w의 티모퀴논, 0.01% 내지 10% w/w의 티모하이드로퀴논, 20% 내지 95% w/w의 지방산, 0.001% 내지 3% w/w의 상기 추가 성분, 0.1% 내지 4.0% w/w의 안정화제 및 0.2% 내지 2% w/w의 생체이용률 개선제를 함유하도록 표준화된, 제조방법.
제13항에 있어서, 상기 조성물 중의 상기 유리 지방산이 0.5% w/w 미만의 Ω3(오메가 3) 지방산, 40% 내지 70% w/w의 Ω6(오메가 6) 지방산 및 15% 내지 25% w/w의 Ω9(오메가 9) 지방산으로 구성된 것인, 제조방법.
제13항에 있어서, 상기 안정화제가 로스마린산, 부틸화된 하이드록시아니솔, 부틸화된 하이드록시톨루엔, 메타중아황산 나트륨, 프로필 갈레이트, 시스테인, 아스코르브산 및 토코페롤로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 제조방법.
제13항에 있어서, 상기 안정화제가 로스마린산인 것인, 제조방법.
제13항에 있어서, 상기 생체이용률 개선제가 피페린, 퀘르세틴, 마늘 추출물, 생강 추출물 및 나린진의 그룹으로부터 선택되는 것인, 제조방법.
제13항에 있어서, 상기 생체이용률 개선제가 피페린인 것인, 제조방법.