KR102538957B1 - 백선피, 형개, 사상자, 녹두, 목단피, 고삼, 대황, 및 지부자 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 자극완화용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 백선피, 형개, 사상자, 녹두, 목단피, 고삼, 대황, 및 지부자 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 자극완화용 화장료 조성물에 관한 것으로, 염증 발생 관련 유전자들의 발현을 감소시켜 항염 효능이 뛰어나고, 산화적 스트레스에 따른 세포의 산화를 억제하는 항산화능 효과가 우수하다.

Description

백선피, 형개, 사상자, 녹두, 목단피, 고삼, 대황, 및 지부자 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 자극완화용 화장료 조성물{A cosmetic composition for alleviating skin irritation comprising Dictamnus Dasycarpus Root, Schizonepeta Tenuifolia, Cnidium Monnieri Fruit, Phaseolus Radiatus Seed, Paeonia Suffruticosa Root, Sophora Flavescens Root, Rheum Palmatum Root and Kochia Scoparia Fruit extracts as an active ingredient}

본 발명은 백선피, 형개, 사상자, 녹두, 목단피, 고삼, 대황, 및 지부자 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 자극완화용 화장료 조성물에 관한 것으로, 염증 발생 관련 유전자들의 발현을 감소시켜 항염 효능이 뛰어나고, 산화적 스트레스에 따른 세포의 산화를 억제하는 항산화능 효과가 우수하다.

피부는 외부 환경으로부터 인체를 보호하고, 내부의 수분 및 유용 성분이 밖으로 유출되는 것을 막아주는 장벽 기능, 체온조절 기능, 배설 기능 등 다양한 생리적 기능을 담당하고 있는 중요한 기관이다.

그러나 간혹 피부 세포의 활성이 저하되고 피부 상태가 악화되는 현상이 일어날 수 있는데, 이는 피부에 사용되는 화장품 성분들이 피부 상재균에 의해 독성이 강한 물질로 분해되어 피부에 자극을 일으키고 염증을 유발시킬 수 있기 때문이다.

화장품은 피부에 아름다움을 부여하는 목적으로 사용되어 왔으며, 이는 다양한 성분들의 복합체이다. 화장품의 구성성분은 크게 수용성 성분, 지용성 성분, 수용성 성분과 지용성 성분을 혼합시켜주는 유화제, 유통과정과 사용과정에서 부패를 방지하기 위한 방부 보존제 및 심미적 만족감을 더욱 충족하기 위한 향 등으로 구성되어 있다.

이러한 구성 원료들은 개개인에 따라서 피부 자극 정도가 매우 상이하다. 동일한 화장품이라도 사용하는 소비자의 생활 패턴, 피부 상태 등에 따라서 트러블의 정도가 매우 다르게 나타난다. 하지만 화장품은 불특정 다수가 사용하는 제품으로 사용하는 소비자한테 트러블이 발생하면 매우 곤란하다.

Actas Dermosifiliogr. 2016;107(4):329-336에 의하면 매년 화장품에 의한 피부 알러지 반응 보고가 상승하는 추세이다. 특히 다양한 화장품의 구성성분 중에서 방부 보존제, 향, 헤어 염색제 등의 순서로 알러지 발생률이 높게 나타나고 있다. 이 외에도 환경 오염과 같은 외부 스트레스 등에 의해서도 피부 트러블이 증가하는 추세이다.

또한 강한 열과 자외선 하에서 장기간 야외 활동을 하게 되면 피부가 붉게 반응을 하는 현상이 발생한다. 이러한 이유로 화장품에는 과거부터 피부 자극원으로부터 피부를 보호하기 위하여 다양한 성분으로 알란토인, 베타인, 판테놀 등을 사용하고 있기도 하다.

상기와 같은 요인들에 의한 피부 트러블을 개선하고 항산화 효과가 있는 물질을 사용하여 화장품의 원료로 사용하고자 하는 연구들이 계속되어 왔다. 이러한 제품군이나 이를 구성하고 있는 원료에는 필수적으로 자극완화용 천연 소재가 필요하다.

이에 본 발명자들은 백선피(Dictamnus Dasycarpus Root), 형개(Schizonepeta Tenuifolia), 사상자(Cnidium Monnieri Fruit), 녹두(Phaseolus Radiatus Seed), 목단피(Paeonia Suffruticosa Root), 고삼(Sophora Flavescens Root), 대황(Rheum Palmatum Root), 및 지부자(Kochia Scoparia Fruit)로부터 유래된 화장료용 천연 복합 추출물을 개발하였다.

국내공개특허 제2017-0137552호(공개일 2017.12.13.) 국내등록특허 제10-2116816호(등록일 2020.05.25.) 국내등록특허 제10-1996315호(등록일 2019.06.28.) 국내등록특허 제10-1799776호(등록일 2017.11.15.) 국내등록특허 제10-2961622호(등록일 2019.12.26.)

전선홍 외 2인, "LPS로 유도된 RAW 264.7 대식세포주에서 내소황륜탕의 항염증 기전 및 항산화 효능 연구", 한방안이비인후피부과학회지 제33권 제2호(2020년 5월), p100-111. 김철환 외 7인, "LPS로 유도된 RAW 264.7 대식세포의 염증반응에서 MAPK 신호경로 조절을 통한 지칭개 에탄올 추출물의 항염증 효과", Korean J. Plant Res., 34(1) : 23-30(2021). 이동훈 외 5인, "LPS로 활성화된 Raw 264.7 Cells에서 고삼 뿌리 추출물의 항염증과 항산화 효과", 대한의진균학회지, 제15권 제2호 2010, p39~50.

본 발명의 목적은 피부 또는 트러블 개선에 우수한 효과를 발휘하면서도 천연물로부터 유래되어 안전성이 확보되는 복합 추출물을 유효성분으로 하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여, 백선피, 형개, 사상자, 녹두, 목단피, 고삼, 대황, 및 지부자 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 자극완화용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 백선피 추출물, 형개 추출물, 사상자 추출물, 녹두 추출물, 목단피 추출물, 고삼 추출물, 대황 추출물, 및 지부자 추출물의 혼합 중량비는 1: 0.5~5; 0.5~5; 0.5~5; 0.5~5; 0.5~5; 0.5~5; 0.5~5 범위인 것을 특징으로 한다.

상기 백선피 추출물, 형개 추출물, 사상자 추출물, 녹두 추출물, 목단피 추출물, 고삼 추출물, 대황 추출물, 및 지부자 추출물은 화장료 조성물의 전체 중량에 대해서 0.1~15.0 중량%을 포함한다.

상기 조성물은 염증성 매개체인 산화질소(nitric oxide, NO) 및 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2, PGE2)의 생성을 억제하는 것을 특징으로 한다.

상기 조성물은 iNOS와 COX-2의 발현을 감소시키고, 사이토카인(IL-1β, IL-6, TNF-α)의 mRNA 발현을 감소시키는 것을 특징으로 한다.

상기 조성물은 산화적 스트레스에 의한 세포손상을 억제하는 것을 특징으로 한다.

상기 조성물은 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 및 파우더로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 피부 자극완화용 화장료 조성물은 인체에 안전한 식물 복합 추출물로서, 백선피, 형개, 사상자, 녹두, 목단피, 고삼, 대황, 및 지부자 추출물을 함유하여 염증 발생 관련 유전자들의 발현을 감소시켜 항염 효능이 뛰어나고, 산화적 스트레스에 따른 세포의 산화를 억제하는 항산화능 효과가 우수하다.

또한 대식세포 활성을 차단하여 염증 인자의 생산을 억제할 수 있어 피부 자극을 줄이고 향상된 가려움증 완화 및 아토피 피부염의 개선 작용을 나타내는 효과가 있다.

또한 천연 식물소재로부터 추출된 혼합물을 사용하므로, 독성 및 그에 따른 부작용이 적다.

도 1은 RAW 264.7 대식세포에서의 NO 생성량, PGE2 생성량 및 세포 생존력 변화를 비교한 항염 효능 평가 그래프이다.
도 2는 RAW 264.7 대식세포에서의 TNF-α, COX-2, IL-1β, 및 iNOS 생성 변화를 비교한 항염 효능 평가 그래프이다.
도 3는 RAW 264.7 대식세포에서의 IL-6 생성 변화를 비교한 항염 효능 평가 그래프이다.
도 4는 RAW 264.7 대식세포에서의 p-IkB의 발현 감소 및 NF-kB 핵 이동 억제를 비교한 항염 효능 평가 그래프이다.
도 5는 과산화지질(MDA)의 양 변화를 비교한 항산화능 평가 그래프이다.

이하에는, 본 발명을 상세히 설명한다.

일 측면에서 본 발명의 화장료 조성물은 백선피(Dictamnus Dasycarpus Root), 형개(Schizonepeta Tenuifolia), 사상자(Cnidium Monnieri Fruit), 녹두(Phaseolus Radiatus Seed), 목단피(Paeonia Suffruticosa Root), 고삼(Sophora Flavescens Root), 대황(Rheum Palmatum Root), 및 지부자(Kochia Scoparia Fruit)의 추출물로부터 유래된 복합 추출물을 포함하고 있다.

백선피는 운향과의 백선(Dictamnus dasycarpus Turcz)의 뿌리껍질을 의미한다. 백선의 선(鮮)은 양의 냄새를 뜻한다. 이 약초의 뿌리가 흰색이고 양의 누린내를 풍기기 때문에 붙여진 이름이다. 백선피는 습열로 인한 피부발진, 피부 미란, 습진, 풍진, 가려움증, 알레르기성 피부염, 신경성 피부염과 급성간염으로 인한 황달, 습열성 하지마비에 쓰며 해수, 인후건조, 번갈에도 사용할 수 있으며, 약리작용으로 해열작용과 피부진균 억제 작용이 알려져 있어 피부 장벽 항상성 회복, 과민성 억제, 아토피 개선효과가 있다.

형개는 Schizonepeta tenuifolia Briquet(꿀풀과 Labiatae)의 꽃이삭으로, 전초를 약재로 이용한다. 약효는 해열작용이 있어서 감기 초기의 발한·해열 목적으로 사용하고, 인후염·피부질환·중풍 등에 빈용 되고 있으며, 까맣게 볶아 쓰면 지혈작용이 있어 자궁출혈·코피·대변출혈·토혈·소변출혈 등에 응용한다. 아토피 피부염, 습진 및 부스럼 개선효과가 있다.

사상자(Cnidium Monnieri Fruit)는 산형과(Umbelliferae) 식물인 벌사상자(Cnidium monieri (L.) Cuss.)의 과실이다. 신장기능을 강화하는 데 사용하고, 피부습진, 알레르기성 피부염 및 진물 등에 치료효과가 있다.

녹두(Phaseolus Radiatus Seed)는 콩과(Leguminosae)식물인 녹두(Phaseolus radiatus L.)의 종자를 말한다. 녹두는 몸에 쌓인 노폐물을 해독하며 열을 내리고 피로하거나 입술이 마르고 헐었을 때 먹으면 효과적이다. 또 녹두에는 필수아미노산과 불포화지방산이 풍부하게 들어 있어 소화를 돕는다. 게다가 배뇨 작용도 뛰어나 해독작용 후 걸러진 유해 배설물이 소변을 통해 빨리 배설되는 것을 돕는다.

목단피(또는 모란뿌리)는 작약과의 모란(Paeonia suffruticosa Andrews)의 뿌리껍질로 만든 약재이다. 혈열로 인한 생리불순, 생리통, 멍들었을 때, 토혈, 코피, 반점이 나타나는 증상, 허열로 인해 뼛골이 쑤시는 증상, 혈압상승, 어혈제거, 타박상, 소염진통, 종기치료, 맹장염초기 등에 사용하며 가슴답답증을 없애준다. 약리작용으로 진통, 진정, 해열, 항경련, 항염증, 항혈전, 항알레르기, 위액분비억제, 자궁점막충혈, 항균작용 등이 보고되었다.

고삼(Sophora flavescens root)은 맛이 몹시 쓰기 때문에 붙여진 이름이다. 약효성분으로는 마트린이 함유되어 있으며, 동물실험에서는 해열작용과 이뇨효과가 인정되었다. 건위작용이 있어서 위장염·장염·세균성 이질에 목향·감초와 같이 달여서 복용하면 치유된다. 또 피부의 화농증과 습진에도 유효하며, 부인의 외음부에 가려움증이 심할 때도 달여서 환부를 세척하여 치료한다. 즉 여드름성 피부개선 및 피부 염증완화 효과가 있다.

대황(Rheum palmatum)은 마디풀과의 다년생 초본으로, 산골짜기의 습지나 냇가에서 자생하거나 재배한다. 뿌리(root)는 장타원형이며 황갈색으로 매우 단단하고 특이한 냄새가 나며 약간 쓰다. 한방에서는 기원전부터 소염성의 하제로 쓰고 있으며, 여러 가지 처방에 배합하여 사용하고 있다. 주성분은 안트라키논 유도체와 그 배당체 및 타닌 등이다. 소량을 섭취하면 건위작용을 나타내고, 다량의 경우는 완하제로 상습 변비나 소화불량에 좋으며, 민간약으로는 화상에 쓰기도 한다. 따라서 항염증 효과는 물론이고 자외선에 의한 피부 개선 효과가 있다.

그리고 지부자(Kochia Scoparia Fruit)는 명아주과(Chenopodiaceae)에 속하는 댑싸리(Kochia scoparia Schrader)의 열매이다. 쓰고 차가운 성질로 하초의 습열을 청리하여 소변을 따라 배출시킨다. 습열로 인한 림병, 소변불리 뿐만 아니라, 피부의 습진, 습창, 몸 전체의 소양감 등에 응용한다.

본 발명자들은 상기 추출물의 모두가 피부염 완화 및 개선에 유익한 생물학적 활성을 가지며, 상기 추출물 중 2 이상의 복합 추출물, 바람직하게는 백선피 추출물, 형개 추출물, 사상자 추출물, 녹두 추출물, 목단피 추출물, 고삼 추출물, 대황 추출물, 및 지부자 추출물의 8가지 복합 추출물은 상호 시너지적 생물학적 활성을 가짐을 발견하였다.

본 발명에 있어서, 용어 "추출물"은 상기 추출처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.

상기 추출물에는 각각의 식물을 설명하며 특정된 부위 외에도 그의 잎, 줄기, 나무껍질, 뿌리, 꽃 또는 꽃눈, 과실, 종자, 수액 및 전체 식물이 포함될 수 있다.

상기 추출물을 제조하기 위하여, 통상의 기술자는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 용매 추출법에 의할 수 있다. 식물 전체 또는 임의의 부분을 분쇄한 다음(예를 들어, 블렌더), 추출 용매를 처리하여, 용매 추출물을 수득할 수 있다. 분쇄 전에 건조 과정(예를 들어, 40 내지 70℃에서 15 내지 50시간 동안의 건조)을 거친 다음 분쇄할 수도 있다. 또한, 용매 추출물은 감압 증류 및 동결건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

상기 사용되는 추출 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물; 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올 등의 C1 내지 C4의 저급 알코올; 글리세린, 부틸렌글라이콜, 프로필렌글라이콜 등의 다가 알코올; 및 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 아세톤, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르, 디클로로메탄 등의 탄화수소계 용매; 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게, 물, 저급알코올을 단독으로 사용하거나 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다. 상기 용매를 사용하여 1회 이상 추출하여 용매 추출물을 제조할 수 있으며, 상기 용매 추출물을 감압 증류한 후 동결건조 또는 분무 건조하여 얻은 건조 추출물을 제조할 수 있다.

상기 추출 용매의 양은 이용되는 추출 용매의 종류에 따라 다양할 수 있으나, 예를 들어 대상 식물의 건조 중량에 대하여 1 내지 20배, 또는 5 내지 20배로 사용할 수 있다.

이외에도, 당해 기술분야에 공지된 다양한 추출 공정, 예를 들어, 온침(maceration), 인퓨전(infusion), 퍼콜레이션(percolation), 소화, 전즙(decoction), 고온 연속 추출(hot continuous extraction), 수성-알코올성 추출, 역류 추출, 마이크로파 보조 추출, 초음파 추출, 초임계 유체 추출, 조직편 추출(phytonic extract) (예를 들어, 하이드로-플루오로-카본 용매) 등) 등을 선택하여 사용할 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.

일 구현예로, 상기 백선피 추출물은 백선피를 건조 분쇄하고 15~30℃에서 7~15일 동안 에탄올에 침적시키거나, 70~100 ℃에서 5~20 시간동안 에탄올에 침적시켜 추출하고, 감압 농축한 것을 사용한다. 나머지 다른 천연 추출물들도 동일한 조건에서 제조될 수 있다.

일 구현예로, 본 발명의 복합 추출물은 상기 방법으로 추출된 백선피, 형개, 사상자, 녹두, 목단피, 고삼, 대황, 지부자를 1: 0.5~5; 0.5~5; 0.5~5; 0.5~5; 0.5~5; 0.5~5; 0.5~5 중량비 범위내에서 혼합하여 제조될 수 있다.

일 구현예로, 본 발명은 상기 8가지 천연 추출물을 적절한 비율로 혼합하여 제조된 복합 추출물에 관한 것으로, 이는 대식세포 활성을 차단하여 염증 인자의 생산을 억제할 수 있어 피부 자극을 줄이고 향상된 가려움증 완화 및 아토피 피부염의 개선 작용을 나타내는 효과가 있다.

일반적으로 염증반응은 외부의 물리적 자극이나 화학적으로 유해한 물질 등에 의해 발생되는 조직 손상에 대한 방어반응으로, 생체내의 세포 및 조직이 외부에서 받은 자극을 국소화 시켜 손상된 부위를 정상적으로 회복하고 유지하려는 생체의 방어기전이다. 주로 통증, 발열, 기능 상실 등과 증상이 나타난다.

과도한 염증 반응 시 면역을 담당하는 세포가 활성화되는데, 대표적으로 대식세포가 있다. 대식세포는 동물 체내 모든 조직에 분포하며 침입한 세균 등을 잡아 소화시키고, 활성화된 대식세포는 체내 유입된 염증의 원인을 인식해 nitric oxide (NO)와 같은 염증 매개체 및 tumor necrosis factor-α(TNF-α), Inter-leukin-1β(IL-1β), Inter-leukin-6(IL-6)와 같은 pro-inflammatory cytokines 등의 염증 매개물질을 생성한다.

피부 자극은 일종의 염증반응이다. 그러므로 피부 염증 메커니즘에 관여하는 상기의 다양한 펙터들을 확인함으로써 항염효과와 자극완화 효과를 확인할 수 있다.

또한, 본 발명의 복합 추출물은 항산화 효과가 있다.

상기 항산화는 세포내 대사 또는 자외선의 영향으로 인한 산화적 스트레스에 따라 반응성이 높은 자유 라디칼(free radical) 또는 활성산소종(reactive oxygen species;ROS)에 의한 세포의 산화를 억제하는 것을 말하며, 자유 라디칼 또는 활성산소종을 제거하여 이로 인한 세포의 손상이 감소되는 것을 포함한다.

본 발명자들은 본 발명에 따른 복합 추출물을 처리하여 과산화지질(MDA, Malondialdehyde) 농도를 측정한 결과, MDA 양이 본 발명의 복합 추출물 농도에 의존하여 낮아짐을 확인할 수 있었다. 이로써, 본 발명에 따른 조성물은 우수한 항산화 효과를 나타냄을 확인하였다.

생체내 ROS의 형성이 증가된 상태인 산화적 스트레스에 의해 세포내 구성성분인 단백질, 지질 및 DNA 성분이 기능적으로 손상될 수 있으므로, 이는 노화 또는 염증과 같은 질환의 원인이 된다. 즉 산화적 스트레스에 의한 세포손상을 억제할 수 있는 항산화능이 우수하고 독성도 없는 천연 복합 추출물이 제조될 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 발명을 용이하게 실시할 수 있을 정도로 상세하게 설명하기 위한 것이지, 이로 인해 본 발명의 기술적인 사상 및 범주가 한정되는 것을 의미하지는 않는다.

실시예 1. 본 발명의 복합 추출물 제조

백선피, 형개, 사상자, 녹두, 목단피, 고삼, 대황, 지부자 각 10g을 깨끗한 물로 세척하고 서늘한 그늘에서 건조시킨 후, 분쇄기를 이용하여 분쇄하고 이를 70% 에탄올 1.0kg에 넣고 65±5℃에서 8시간 동안 환류시켜 추출한다. 추출액을 여과하여 천연물을 제거한다. 여액에 정제수 1.0kg을 첨가 후 65℃에서 감압농축기를 이용하여 에탄올을 모두 제거 후 농축액이 1.0kg이 될 때까지 추가로 농축한다. 농축액에 부틸렌글라이콜 1.0kg을 넣고 혼합하기 위하여 교반한다. 혼합 후 실온에서 24시간 동안 방치한다. 이 복합 추출물을 여과하여 사용하였다. 성상은 진한 노란색 액체이다.

실시예 2. 복합 추출물의 항염 효과 확인

우선 RAW 264.7 뮤린 대식세포주(murine macrophage)는 한국 세포주 은행(Korea Cell Line Bank)에서 구입하여, 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 100U/ml의 페니실린(penicillin) 및 100mg/ml의 스트렙토 마이신(streptomycin)이 함유된 둘베코-모디파이드 이글 미디엄(Dulbecco-modified Eagle medium, DMEM, Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)을 이용하여 37℃ 및 5% CO₂의 조건에서 배양하였다. 아래 실험 결과는 3회 반복 측정 후 평균±표준편차로 그래프에 나타냈으며, 시료가 포함되지 않은 대조구와 비교하여 Student t-test로 p<0.05수준에서 검정하였다.

(1) NO 생성 억제 실험

RAW 264.7 세포에서 염증성 지표인 nitric oxide (NO)의 함량을 측정하기 위해 농도별 상기 복합 추출물을(0.01%, 0.025%, 0.05%, 0.1%, 0.25%, 0.5%) 처리하고 24시간 배양하였다. 이후 Griess reagent (Sigma, USA)와 상층액을 동일한 비율로 하여 상온에서 반응시키고 microplate spectrophotometer를 이용하여 540㎚에서 흡광도 측정을 하였다.

그 결과, 농도에 매우 의존적으로 NO 생성이 억제되었으며, 0.25%에서는 급격히 감소됨을 알 수 있다(도 1 참조). 막대 그래프의 크기가 작아질수록 염증 수치가 낮아지므로 통증 및 가려움증에 대한 완화 효과가 있다.

(2) PGE2 생성 억제 실험

상기 복합 추출물의 PGE2 생성을 측정하기 위해 ELISA kit (abcam, UK)를 사용하여 측정하였다. RAW 264.7 세포를 6 well-plate에 6×10⁵ cells/well로 분주하고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. 이후 상층액을 걷어내고 복합 추출물을 농도별(0.01%, 0.025%, 0.05%, 0.1%, 0.25%, 0.5%)로 처리하고 24시간 반응시켰다. 이후 상층액을 수집하여 원심 분리 후 ELISA kit의 방법대로 진행하였으며, 최종적으로 450㎚에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 농도에 매우 의존적으로 PGE2 생성이 억제되었으며, 0.1%에서는 급격히 감소되고 0.5%에서는 거의 억제됨을 알 수 있다(도 1 참조). 막대 그래프의 크기가 작아질수록 염증 수치가 낮아지므로 통증 및 가려움증에 대한 완화 효과가 있다.

(3) MTT assay 실험

세포 독성을 측정하기 위해 MTT assay를 실시하였다. RAW 264.7 세포를 96 well plate에 7×10⁴ cells/well로 분주하고 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 24시간 배양하였다. 이후 상층액을 걷어내고 상기 복합 추출물을 농도별(0.01%, 0.025%, 0.05%, 0.1%, 0.25%, 0.5%)로 처리하고 24시간 반응시켰다. 이후 3-(4,5-dime-thylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)를 처리하고 4시간 반응시켰으며, dimethyl sulfoxide(DMSO)를 넣고 반응시킨 후 microplate spectrophotometer를 이용하여 570㎚에서 흡광도 측정을 하였다.

그 결과, RAW 264.7 대식세포의 세포 생존율은 농도에 따라 크게 변화가 없음을 확인할 수 있었고, 특히 0.05%까지는 독성이 거의 없고 0.5%인 경우에도 85%라는 높은 생존율을 보여주고 있다(도 1 참조).

(4) Real-time PCR 실험

RAW 264.7 대식세포에서 상기 복합 추출물의 항염증 관련 유전자들의 mRNA 발현 수준을 확인하기 위해 5×10⁵ cells/well 농도로 6 well-plate에 분주하고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. 이후 상등액을 걷어내고 복합 추출물을 농도별(0.01%, 0.1%, 0.25%, 0.5%)로 처리하고 다시 24시간 반응시켰다.

Trizol reagent(Ambion, USA)를 사용하여 RNA를 추출하였고, diethylpyrocarbonate (DEPC treated-water; Sigma, USA)로 용해하고 정량하였다. cDNA 합성 kit(Revertra ACE-α-;Toyobo, Japan)를 사용해 정량된 RNA를 cDNA로 합성 후 Tagman master mix(Thermo-fisher, USA) 10㎕, 멸균수 4㎕, primer 1㎕, cDNA 5㎕를 혼합하여 실시간으로 중합반응을 수행하였다.

RAW 264.7 세포의 TNF-α, COX-2, IL-1β, 및 iNOS의 mRNA 발현 수준을 확인한 결과, TNF-α를 포함한 4개 염증관련 인자 모두가 농도 의존적으로 감소하였다. 이러한 억제효과는 복합 추출물의 항염증 효능이 매우 뛰어남을 의미한다(도 2 참조). 특히 COX-2 경우는 다른 인자들에 비해 상대적으로 낮은 농도인 0.1%에서 급격한 발현감소가 나타났으며, 이는 주로 발열, 부종 및 홍반 등의 염증 반응을 감소시키는 데에 효과가 있다.

(5) IL-6 ELISA assay 실험

상기 복합 추출물의 항염증 효과를 보기 위하여, pro-inflammatory cytokine(IL-6) 분비량 변화를 ELISA 방법으로 측정하였다. 상기의 대식 세포를 24 well plate에 1×10⁵ cells/mL/well의 세포수가 되도록 분주하여 37°C, 5% CO₂ 배양 기에서 18시간 배양하였다. PMA(50 nM, phorbol 2-myristate 13-acetate)와 A23187(1μM, Calcium Ionophore)의 자극 하에 복합 추출물을 농도별(0.01%, 0.1%, 0.25%, 0.5%)로 처리한 후 24시간 동안 배양시켰다. 얼음 위에서 반응을 종결시킨 후 배양 상층액 중에서의 IL-6 양을 ELISA kit을 사용하여 반응시킨 다음 microplate reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 농도 의존적으로 IL-6의 분비(또는 생성)가 강하게 감소되므로 이는 항염 효능이 뛰어남을 의미한다(도 3 참조). 일반적으로 IL-6은 발열 및 급성 염증반응을 매개하는 단백질이며, 아토피나 건선 등 각종 피부질환을 일으키는 원인으로 알려져 있다. 또한 이에 대한 억제는 외부로부터의 다양한 자극(UV, 항원 등)에 의해 발생될 수 있는 피부자극을 감소 시켜 주기도 한다.

(6) 웨스턴 블롯(Western blot) 실험

RAW 264.7 대식세포에서 복합 추출물의 항염증 및 항산화 관련 유전자들의 단백질 발현 수준을 확인하기 위해 1×10⁶ cells/well로 6 well-plate에 분주하고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. 24시간 후 상등액을 걷어내고 LPS (1㎍/㎖)와 복합 추출물을 농도별 (0.1%, 0.25%, 0.5%)로 처리하고 24시간 배양하였다. 상등액을 걷어내고 PBS로 2-3회 세척 후 Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail kit(Thermo fisher, USA)를 첨가한 RIPA Lysis and Extraction Buffer (Thermo fisher, USA)로 세포를 용해시켰다. 그 후 20분간 4℃, 12,000 rpm의 조건으로 원심 분리하고 단백질을 얻었다. 추출된 단백질을 BCA assay(Thermo fisher, USA)로 정량 하였고, 정량 된 단백질을 10% polyacrylamide gel에 loading하고 전기영동 시켰다. Gel을 membrane으로 transfer하고 5%의 skim milk로 50분-1시간 동안 blocking한 후 1차 항체와 over night하였다. 그 후 Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST)로 5분 단위로 3회 반복 세척한 후, 2차 항체와 2시간 동안 반응시킨 다음 단백질 발현을 확인하였다.

그 결과, 염증 발생 관련 p-IkB의 발현을 감소시킴으로써, 이를 통해 염증 발생 관련 전사인자인 NF-kB가 활성화하는데 필요한 p65의 유리를 억제하고 있음을 확인하였다(도 4 참조). 농도가 0.1%에서 0.5%로 높아질수록 p-IkB와 NF-kB 밴드의 색이 엷어지고 있고 이는 염증 완화 효과가 있다는 것을 의미한다.

일반적으로 NF-kB는 염증반응 조절, 면역체계 조절, 세포고사, 세포증식, 상피세포의 분화 등에 관여하는 단백질군(p50, p52, RelA(p65), RelB, c-Rel, v-Rel로 구성)으로 다양한 유전자들의 발현을 조절하며 세포내의 신호전달 체계의 중심축을 이루고 있는 중요한 인자이다.

실시예 3. 복합 추출물의 항산화능 효과 확인

지질의 과산화 측정은 생체조직의 산화적 손상 결과를 측정하는 대표적인 지표이다. 여기서 과산화지질이라고 불리는 MDA(Malondialdehyde)는 지질과 활성산소의 결합이 심화되어 발생하며, 불포화지방산의 이중결합에 분자상의 산소가 직접 결합한 물질이 생기는 것을 일컫는다. 이는 체내에 많은 양의 free radical을 생성함으로써, 생체막계에 상해를 주고, 효소, 단백, 호르몬, 비타민 등을 역가 감소 혹은 변성시켜서 세포의 기능 저하나 괴사를 야기하는 부작용을 일으킨다.

또한 과산화지질은 아토피 환자에게 절대적으로 필요한 감마리놀산이나 알파리놀산의 생성을 돕는 효소를 방해하는 강력한 면역 억제 역할을 함으로써, 피부의 보습효과를 떨어뜨린다. 그리고 피부장벽을 이루는 구성요소인 세라마이드에도 지질의 구성이 매우 중요하게 인식됨으로써, 지질 과산화에 의한 피부장벽내 지질의 불균형을 막아주는 역할도 피부 장벽 개선에 매우 중요하다.

본 발명에서는 TBA(thiobarbituric acid) 측정법을 채택하였으며, 이는 각종 생체막의 과산화반응 결과 생성되는 free malondialdehyde(MDA)를 TBA와 반응시켜 생성물을 측정하는 것이다. 상기 복합 추출물을 농도별(0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.25%, 0.5%, 1%, 2%)로 수행한 결과, 복합추출물의 농도가 증가할수록 MDA 양도 감소하는 결과를 얻었다(도 5 참조). 이는 복합추출물의 항산화 능력에 의하여 지질의 과산화를 줄일 수 있음을 의미한다.

또한 본 발명은 실시예 1의 방법으로 제조된 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 또는 피부 자극완화용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 복합 추출물은 화장료 조성물의 전체 중량에 대해서 0.1~15.0중량% 함유되며, 더욱 바람직하게는 0.5~10.0중량% 함유되는 것이 좋다. 특히 토너, 젤 또는 미스트 등 가용화 제품에는 0.5~1.0중량%, 크림 같은 유화 제품에는 1.0~2.0중량%, 아토피 또는 가려움 전용 제품에는 1.0~10.0중량%, 헤어 제품에는 1.0~3.0중량%가 함유되는 것이 적합하다.

본 발명의 화장료 조성물은, 상기 유효성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 필요에 따라 글리세린, 에틸렌글리콜, 부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 프로판디올, 1,2-헥산디올, 펜틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 메칠프로판디올, 에틸헥실글리세린 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

이상에서 본 발명은 실시예를 중심으로 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.

Claims (7)

1. 백선피, 형개, 사상자, 녹두, 목단피, 고삼, 대황, 및 지부자 추출물 8개만을 유효성분으로 이루어지고,
   상기 추출물들은 70% 에탄올에 넣고 65℃에서 8시간 동안 환류시켜 추출한 후 여과하고, 다시 정제수를 첨가 후 65℃에서 감압농축기를 이용하여 에탄올을 제거하고, 추가 농축한 액에 부틸렌글라이콜을 넣고 혼합 교반한 후 실온에서 24시간 방치하여 얻어진 진한 노란색 액체이고,
   상기 백선피 추출물, 형개 추출물, 사상자 추출물, 녹두 추출물, 목단피 추출물, 고삼 추출물, 대황 추출물, 및 지부자 추출물의 혼합 중량비는 1: 1: 1: 1: 1: 1: 1: 1 범위이고,
   상기 백선피 추출물, 형개 추출물, 사상자 추출물, 녹두 추출물, 목단피 추출물, 고삼 추출물, 대황 추출물, 및 지부자 추출물은 화장료 조성물의 전체 중량에 대해서 상기 8개 복합추출물로서 0.5~10.0 중량%을 포함하는,
   피부 자극완화용 화장료 조성물
2. 삭제
3. 삭제
4. 청구항 1에 있어서,
   상기 조성물은 염증성 매개체인 산화질소(nitric oxide, NO) 및 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2, PGE2)의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 피부 자극완화용 화장료 조성물
5. 청구항 1에 있어서,
   상기 조성물은 iNOS와 COX-2의 발현을 감소시키고, 사이토카인(IL-1β, IL-6, TNF-α)의 mRNA 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 피부 자극완화용 화장료 조성물
6. 청구항 1에 있어서,
   상기 조성물은 산화적 스트레스에 의한 세포손상을 억제하는 것을 특징으로 하는 피부 자극완화용 화장료 조성물
7. 삭제

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