KR102538723B1 - 자기 면역 질환 치료용 항체 - Google Patents

자기 면역 질환 치료용 항체 Download PDF

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다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
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Abstract

신규 항체를 제공하는 것. 인간 LAG-3 의 도메인 3 에 결합하여, 하기 (ii) 내지 (v) 에 기재된 성질 중 1 개 이상, 그리고 (i) 및 (vi) 에 기재된 성질을 갖는, 모노클로날 항체 또는 그 결합 단편 : (i) 인·비트로 ADCC 활성을 갖는다 ; (ii) 저푸코오스 형태로, 인·비보에서 LAG-3 양성 세포수를 저감시킨다 ; (iii) 저푸코오스 형태로, 인·비보로 실험적 자기 면역성 뇌척수염을 억제한다 ; (iv) 인간 활성화 T 세포에 결합한다 ; (v) 그 항체 또는 그 결합 단편 존재하에서, 인간 LAG-3 과 인간 주요 조직 적합 유전자 복합체 클래스 II 분자는 결합한다 ; 및 (vi) 그 항체 또는 그 결합 단편 존재하에서, 인간 LAG-3 은 인간 T 세포 억제 기능을 발휘한다.

Description

자기 면역 질환 치료용 항체{ANTIBODY FOR TREATING AUTOIMMUNE DISEASES}
본 발명은, 항체, 그 결합 단편, 항체 또는 그 결합 단편을 포함하는 분자, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 항체 또는 그 결합 단편의 제조 방법, 이러한 제조 방법에 의해 얻어지는 항체 또는 그 결합 단편, 항체 또는 그 결합 단편을 포함하는 조성물, 항체 또는 그 결합 단편을 포함하는 의약 조성물, 자기 면역 질환 등 LAG-3 양성 세포에 관련되는 질환의 치료 또는 예방을 위한 그 의약 조성물, 이러한 질환의 치료 또는 예방을 위한 항체 또는 그 결합 단편의 사용, 항체 또는 그 결합 단편을 투여하는 공정을 포함하는 이러한 질환의 치료 방법 등에 관한 것이다.
T 임파구 (T 세포) 는, 면역 응답에 있어서 중심적인 역할을 하고 있는 세포이고, 다양한 항원에 대처하기 위해, 생체 내에는 1000 만 내지 10 억 클론이라고도 하는 여러 가지 항원 특이성을 갖는 T 세포가 존재하고 있다. 체내에 항원이 침입하면, 그러한 방대한 T 세포의 레퍼토리 중 극히 한정된 항원 특이적인 클론만이 증식·활성화되어, 사이토카인 산생이나 세포 장해 활성 등을 통하여 생체 방어에 작용한다. 자기 면역 질환에 있어서는, 어떠한 자기의 항원에 대한 비정상적인 면역 응답이 발단이 되어, 여러 가지 병태가 형성된다고 생각되고 있다. 이와 같은 상황에 있어서도, 항원 특이성을 갖지 않는 대부분의 다른 클론은, 증식·활성화되지 않고 휴지 상태에 있다. 그 때문에, 활성화 T 세포만을 선택적으로 제거할 수 있으면, 다른 항원 특이성을 갖는 대부분의 T 세포에 영향을 주는 일 없이, 특이적으로 면역을 억제하는 것이 가능해져, 자기 면역 질환, 이식물의 거절, 알레르기성 질환 등에 대한 유용한 치료법 혹은 예방법이 될 수 있다. 한편, 제어성 T 세포 등 면역계를 부 (負) 로 제어하는 T 세포가 주로 활성화되어 있는 상황에서는, 이것을 제거함으로써, 악성 종양, 만성 감염증 등에 대한 유용한 치료법 혹은 예방법이 될 수 있다.
LAG-3 (CD223) 은, 면역 글로블린 슈퍼 패밀리에 속하는 1 회 막관통형의 분자이고, 활성화 T 세포에 거의 선택적으로 발현하는 것이 알려져 있는 분자이다 (비특허문헌 1). 래트 동종 이계 심장 이식 모델에, 래트 LAG-3 분자에 대한 보체 의존성 세포 상해 (CDC) 활성을 갖는 토끼 항혈청을 투여하면, 이식편 중의 LAG-3 양성 세포가 감소하여, 이식편이 거절될 때까지의 기간이 약간 연장되는 것이 보고되고 있다 (비특허문헌 2). 또, 개코원숭이에 교차성을 갖고, 항체 의존성 세포 매개 세포 상해 (ADCC) 활성을 나타내는 항인간 LAG-3 키메라 항체 A9H12 가, 그 용량 반응성은 불명확하면서, 개코원숭이의 지연형 과민 반응을 억제하는 것 (비특허문헌 3), 그 인간화 항체가 제조된 것 (특허문헌 2) 도 보고되고 있다.
LAG-3 은, 주요 조직 적합 유전자 복합체 (MHC) 클래스 II 분자에 결합함으로써, T 세포에 어떠한 억제성의 시그널을 전달하여, T 세포의 기능을 부로 제어하는 것이 알려져 있다 (비특허문헌 1). LAG-3 과 MHC 클래스 II 분자의 결합에는, LAG-3 의 세포 외의 4 개의 면역 글로블린형 도메인 중, N 말단의 도메인 1 및 2 가 중요하다고 생각할 수 있으며 (비특허문헌 4), 또 이 LAG-3 을 개재한 T 세포 기능의 억제는, PD-1 분자 등을 개재한 다른 T 세포 기능을 억제하는 시그널과 협동적으로 발휘되는 것도 보고되고 있다 (비특허문헌 5). 실제로, LAG-3 의 T 세포 억제 기능을 저해함으로써 면역 세포의 기능을 활발하게 하여, 암세포를 공격하는 새로운 암치료법의 개발이 최근 활발히 이루어지고 있다 (비특허문헌 6 및 7). 그 때문에, ADCC 활성 등에 의해 LAG-3 양성 세포를 제거하는 LAG-3 항체를 자기 면역 질환에 적용하는 경우, LAG-3 본래의 T 세포 억제 기능을 저해하는 활성을 갖지 않는 항체인 편이, 면역계가 비정상적으로 활성화되어 자기 면역 질환이 오히려 악화되어 버리는 리스크가 없어, 보다 바람직하다고 생각된다. 상기 서술한 CDC 활성을 갖는 항래트 LAG-3 토끼 항혈청 및 ADCC 활성을 나타내는 항인간 LAG-3 키메라 항체 A9H12 (IMP731 : 특허문헌 1 및 2) 는 모두, LAG-3 양성 세포의 제거는 완전하지 않고 (비특허문헌 2 및 3), 제거되고 남은 T 세포의 비정상적인 반응에 의한 부반응의 가능성 및 자기 면역 질환의 억제에 대한 부의 영향이 상정된다.
미국 특허 출원 공개 2011/0070238 A1호 국제 공개 2014/140180호
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공지된 항 LAG-3 항체가 갖는 여러 가지 성질 또는 리스크가 개선, 해소 또는 저감된 신규한 항 LAG-3 항체 등을 제공하는 것.
본 발명은,
(1)
인간 LAG-3 의 도메인 3 에 결합하여, 하기 (ii) 내지 (v) 에 기재된 성질 중 1 개 이상, 그리고 (i) 및 (vi) 에 기재된 성질을 갖는, 모노클로날 항체 또는 그 결합 단편 :
(i) 인·비트로 ADCC 활성을 갖는다 ;
(ii) 저푸코오스 형태로, 인·비보에서 LAG-3 양성 세포수를 저감시킨다 ;
(iii) 저푸코오스 형태로, 인·비보에서 실험적 자기 면역성 뇌척수염을 억제한다 ;
(iv) 인간 활성화 T 세포에 결합한다 ;
(v) 그 항체 또는 그 결합 단편 존재하에서, 인간 LAG-3 과 인간 주요 조직 적합 유전자 복합체 클래스 II 분자는 결합한다 ; 및
(vi) 그 항체 또는 그 결합 단편 존재하에서, 인간 LAG-3 은 인간 T 세포 억제 기능을 발휘한다,
(2)
(ii) 및/또는 (iii) 에 기재된 성질을 갖는, (1) 에 기재된 항체 또는 그 결합 단편,
(3)
(ii) 내지 (v) 에 기재된 성질을 모두 갖는, (1) 또는 (2) 에 기재된 항체 또는 그 결합 단편,
(4)
키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인, (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 결합 단편,
(5)
서열 번호 50 또는 도 65 로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 CDRL1, 서열 번호 51 또는 도 66 으로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 CDRL2 및 서열 번호 52 또는 도 67 로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고 서열 번호 47 또는 도 62 로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 CDRH1, 서열 번호 48 또는 도 63 으로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 CDRH2 및 서열 번호 49 또는 도 64 로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 결합 단편,
(6)
인간화 항체인, (4) 또는 (5) 에 기재된 항체 또는 그 결합 단편,
(7)
서열 번호 28 또는 도 43 으로 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 제 68 번의 위치에 상당하는 아미노산이 Gly 이거나 또는 Ala 로 치환되고, 제 103 번의 위치에 상당하는 아미노산이 Asn 이거나 또는 Asp 로 치환되어 이루어지는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬, 그리고 서열 번호 32 또는 도 47 로 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 제 21 번의 위치에 상당하는 아미노산이 Asp 이거나 또는 Asn 으로 치환되고, 제 31 번의 위치에 상당하는 아미노산이 Leu 이거나 또는 Met 로 치환되고, 제 33 번의 위치에 상당하는 아미노산이 Ala 이거나 또는 Ile 로 치환되고, 제 41 번의 위치에 상당하는 아미노산이 Ile 이거나 또는 Met 로 치환되고, 제 58 번의 위치에 상당하는 아미노산이 Gln 이거나 또는 Lys 로 치환되고, 제 63 번의 위치에 상당하는 아미노산이 Ala 이거나 또는 Ser 로 치환되고, 제 80 번의 위치에 상당하는 아미노산이 Ser 이거나 또는 Asp 로 치환되고, 제 85 번의 위치에 상당하는 아미노산이 Ser 이거나 또는 Gly 로 치환되고, 제 87 번의 위치에 상당하는 아미노산이 Ser 이거나 또는 Tyr 로 치환되고, 제 98 번의 위치에 상당하는 아미노산이 Leu 이거나 또는 Val 로 치환되고, 제 103 번의 위치에 상당하는 아미노산이 Phe 이거나 또는 Ala 로 치환되고, 제 105 번의 위치에 상당하는 아미노산이 Thr 이거나 또는 Phe 로 치환되고, 제 124 번의 위치에 상당하는 아미노산이 Val 이거나 또는 Leu 로 치환되고, 제 126 번의 위치에 상당하는 아미노산이 Ile 이거나 또는 Leu 로 치환되어 이루어지는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬을 포함하여 이루어지는 (6) 에 기재된 항체 또는 그 결합 단편,
(8)
경사슬 가변 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 32, 34, 36, 38 및 40 으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열의 제 21 번 아미노산 내지 제 129 번 아미노산을 포함하고, 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 28 및 30 으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열의 제 20 번 아미노산 내지 제 140 번 아미노산을 포함하는, (6) 또는 (7) 에 기재된 항체 또는 그 결합 단편,
(9)
경사슬의 아미노산 서열이 서열 번호 32, 34, 36, 38 및 40 으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열의 제 21 번 아미노산 내지 제 234 번 아미노산을 포함하고, 중사슬의 아미노산 서열이 서열 번호 28 및 30 으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열의 제 20 번 아미노산 내지 제 470 번 아미노산을 포함하는, (6) 내지 (8) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 결합 단편,
(10)
하기 [i] 내지 [x] 으로 이루어지는 군에서 선택되는, (6) 내지 (9) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 결합 단편 :
[i] 서열 번호 30 (도 45) 의 아미노산 번호 20 내지 470 으로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 및 서열 번호 34 (도 49) 의 아미노산 번호 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 경사슬을 포함하는 항체 또는 그 결합 단편 ;
[ii] 서열 번호 28 (도 43) 의 아미노산 번호 20 내지 470 으로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 및 서열 번호 32 (도 47) 의 아미노산 번호 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 경사슬을 포함하는 항체 또는 그 결합 단편 ;
[iii] 서열 번호 30 (도 45) 의 아미노산 번호 20 내지 470 으로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 및 서열 번호 36 (도 51) 의 아미노산 번호 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 경사슬을 포함하는 항체 또는 그 결합 단편 ;
[iv] 서열 번호 28 (도 43) 의 아미노산 번호 20 내지 470 으로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 및 서열 번호 34 (도 49) 의 아미노산 번호 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 경사슬을 포함하는 항체 또는 그 결합 단편 ;
[v] 서열 번호 28 (도 43) 의 아미노산 번호 20 내지 470 으로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 및 서열 번호 36 (도 51) 의 아미노산 번호 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 경사슬을 포함하는 항체 또는 그 결합 단편 ;
[vi] 서열 번호 28 (도 43) 의 아미노산 번호 20 내지 470 으로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 및 서열 번호 38 (도 53) 의 아미노산 번호 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 경사슬을 포함하는 항체 또는 그 결합 단편 ;
[vii] 서열 번호 28 (도 43) 의 아미노산 번호 20 내지 470 으로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 및 서열 번호 40 (도 55) 의 아미노산 번호 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 경사슬을 포함하는 항체 또는 그 결합 단편 ;
[viii] 서열 번호 30 (도 45) 의 아미노산 번호 20 내지 470 으로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 및 서열 번호 32 (도 47) 의 아미노산 번호 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 경사슬을 포함하는 항체 또는 그 결합 단편 ;
[ix] 서열 번호 30 (도 45) 의 아미노산 번호 20 내지 470 으로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 및 서열 번호 38 (도 53) 의 아미노산 번호 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 경사슬을 포함하는 항체 또는 그 결합 단편 ; 및
[x] 서열 번호 30 (도 45) 의 아미노산 번호 20 내지 470 으로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 및 서열 번호 40 (도 55) 의 아미노산 번호 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 경사슬을 포함하는 항체 또는 그 결합 단편,
(11)
(10) 에 기재된 항체 또는 그 결합 단편이 포함하는 경사슬 가변 영역과 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열과, 각각과 95 ％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역과 중사슬 가변 영역을 포함하여 이루어지는, (1) 에 기재된 항체 또는 그 결합 단편,
(12)
(10) 에 기재된 항체 또는 그 결합 단편이 포함하는 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 또는 그것에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 제 1 핵산 분자와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 제 2 핵산 분자가 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코드되는 경사슬 가변 영역 아미노산 서열, 및 (10) 에 기재된 항체 또는 그 결합 단편이 포함하는 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 또는 그것에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 제 3 핵산 분자와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 제 4 핵산 분자가 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코드되는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는, (1) 에 기재된 항체 또는 그 결합 단편,
(13)
하기 (i) 또는 (ii) 에 기재된 성질을 갖는, (1) 에 기재된 항체 또는 그 결합 단편 :
(i) (10) 에 기재된 항체 또는 그 결합 단편이 인식하는 인간 LAG-3 의 도메인 3 상의 부위에 결합한다 ;
(ii) (10) 에 기재된 항체 또는 그 결합 단편과, 인간 LAG-3 의 도메인 3 에 대한 결합에 있어서 경합한다,
(14)
저푸코오스 형태인, (1) 내지 (13) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 결합 단편,
(15)
(1) 내지 (14) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 결합 단편을 포함하는 분자,
(16)
(1) 내지 (14) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 결합 단편의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자,
(17)
(16) 에 기재된 핵산 분자를 포함하는 벡터,
(18)
(16) 에 기재된 핵산 분자 또는 (17) 에 기재된 벡터를 포함하는 세포,
(19)
(1) 내지 (14) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 결합 단편을 생산하는 세포,
(20)
(18) 또는 (19) 에 기재된 세포를 배양하는 공정을 포함하여 이루어지는, (1) 내지 (14) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 결합 단편의 제조 방법,
(21)
(20) 기재된 방법에 의해 조제된, 항체 또는 그 결합 단편,
(22)
(1) 내지 (14) 및 (21) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 결합 단편, 또는 (15) 에 기재된 분자를 포함하는 조성물,
(23)
(1) 내지 (14) 및 (21) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 결합 단편, 또는 (15) 에 기재된 분자를 포함하는 의약 조성물,
(24)
자기 면역 질환의 치료 또는 예방을 위한, (23) 에 기재된 의약 조성물,
(25)
자기 면역 질환이, 결합 조직·근골격계의 자기 면역 질환, 혈액계의 자기 면역 질환, 소화기계의 자기 면역 질환, 신경계의 자기 면역 질환, 시각계의 자기 면역 질환, 혈관계의 자기 면역 질환, 표피계의 자기 면역 질환, 호흡기계의 자기 면역 질환, 내분비계의 자기 면역 질환, 자기 면역성 간염 및 면역 이상에 의한 신염 (腎炎) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개 또는 2 개 이상인, (24) 에 기재된 의약 조성물,
(26)
결합 조직·근골격계의 자기 면역 질환이 관절 류머티즘, 경직성 척추염, 전신성 홍반성 낭창, 강피증, 다발성 근염, 피부 근염, 봉입체 근염, 및 면역 개재성 괴사성 미오패치 등의 특발성 염증성 근질환으로 이루어지는 군에서, 혈액계의 자기 면역 질환이 재생 불량성 빈혈 및 특발성 혈소판 감소성 자반병으로 이루어지는 군에서, 소화기계의 자기 면역 질환이 크론병 및 궤양성 대장염으로 이루어지는 군에서, 신경계의 자기 면역 질환이 다발성 경화증 및 중증 근무력증으로 이루어지는 군에서, 시각계의 자기 면역 질환이 포도막염, 각막염 및 쇼그렌 증후군으로 이루어지는 군에서, 혈관계의 자기 면역 질환이 베체트병 및 베게너 육아종증으로 이루어지는 군에서, 표피계의 자기 면역 질환이 건선, 천포창, 스티분스·존슨 증후군 및 백반으로 이루어지는 군에서, 호흡기계의 자기 면역 질환이 만성 폐색성 폐질환 및 간질성 폐렴으로 이루어지는 군에서, 그리고 내분비계의 자기 면역 질환이 1 형 당뇨병, 자기 면역 갑상선염, 바세도우병 및 하시모토병으로 이루어지는 군에서, 각각 선택되는 1 개 또는 2 개 이상인, (25) 에 기재된 의약 조성물,
(27)
이식물의 거절의 치료 또는 예방을 위한, (23) 에 기재된 의약 조성물,
(28)
이식물의 거절이, 심장, 신장, 간장, 골수 및 피부로 이루어지는 군에서 선택되는 장기 혹은 조직으로부터의 이식에 대한 거절 반응 및 숙주대이식편 반응, 그리고/또는 골수, 말초혈 및 제대혈로 이루어지는 군에서 선택되는 조혈 세포의 이식에 의해 일어나는 이식편대숙주병인, (27) 에 기재된 의약 조성물,
(29)
엽산 대사 길항제, 칼시뉴린 저해제, 부신 피질 스테로이드제, 항흉선 세포 글로블린제, 핵산 대사 길항제, 핵산 합성 저해제, 세포 표면 항원을 표적으로 하는 생물 제제, 사이토카인 혹은 사이토카인 수용체를 표적으로 하는 생물 제제, 대량 면역 글로블린 정주 요법, 및 혈장 교환 요법으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개 또는 2 개 이상과 조합하여 이루어지는, (24) 내지 (28) 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물, 및
(30)
알레르기성 질환, 악성 종양 및/또는 만성 감염증의 치료 또는 예방을 위한, (23) 에 기재된 의약 조성물,
등에 관한 것이다.
본 발명이 제공하는 항체, 그 결합 단편, 그것들을 포함하는 분자, 그것들을 포함하는 의약 조성물 등은, ADCC 활성, LAG-3 양성 세포수 저감 활성, 실험적 자기 면역성 뇌척수염 억제 활성, 인간 활성화 T 세포 결합 활성 등을 가짐과 함께, 그 존재하에 있어서도, 인간 LAG-3 과 인간 주요 조직 적합 유전자 복합체 클래스 II 분자가 결합하는, 인간 LAG-3 은 인간 T 세포 억제 기능을 발휘하는 등의 특징을 갖고, 자기 면역 질환 등의 LAG-3 양성 세포에 관련되는 질환의 치료 및/또는 예방에, 바람직하게는 저푸코오스 형태에 있어서 사용될 수 있다.
도 1 은, 래트 항 LAG-3 항체 (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 및 rLA1264) 의 LAG-3 을 발현하는 인간 PHA blast 에 대한 결합 활성을 플로우 사이토메트리법에 의해 검증한 도면. 세로축은 플로우 사이토메트리법에 의해 측정된 평균 형광 강도를 나타낸다.
도 2 는, 래트 항 LAG-3 항체 (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 및 rLA1264) 의 ADCC 활성을 나타낸 도면. 인간 LAG-3 발현 293T-lacZ 세포를 표적 세포, 인간 PBMC 를 이펙터 세포로서 사용하였다.
도 3A 는, 래트 항 LAG-3 항체 (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 및 rLA1264) 의 LAG-3/MHC 클래스 II 결합 시험에 있어서의 저해 활성을 나타낸 도면. 네거티브 컨트롤 (Negative control) 로는 래트 IgG2b 를, 포지티브 컨트롤 (Positive control) 로는 별도로 제조한 LAG-3 의 도메인 1 을 인식하는 래트 항 LAG-3 항체를 각각 사용하였다. 항체는 모두 10 ㎍/㎖ 로 평가하였다.
도 3B 는, 공지된 항체인 인간 키메라화 항 LAG-3 항체 IMP731 이 LAG-3/MHC 클래스 II 결합 시험에 있어서 저해 활성을 나타내는 것을 나타낸 도면. 시판되는 마우스 항인간 LAG-3 항체인 17B4 도 저해 활성을 나타냈다.
도 4 는, 래트 항 LAG-3 항체 (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 및 rLA1264) 의 293T-hLAG-3/Raji 세포 접착 시험에 있어서의 저해 활성을 나타낸 도면. 네거티브 컨트롤로는 래트 IgG2b 를, 포지티브 컨트롤로는 실시예 2)-6 에서 제조한 LAG-3 의 도메인 1 을 인식하는 래트 항 LAG-3 항체 (클론 6D7) 를 각각 사용하였다. 항체는 모두 10 ㎍/㎖ 로 평가하였다.
도 5A 는, 래트 항 LAG-3 항체 (rLA204, rLA212 및 rLA225) 의 인간 LAG-3 결합 에피토프를 플로우 사이토메트리법에 의해 검증한 도면. 세로축은 플로우 사이토메트리법에 의해 측정된 평균 형광 강도를 나타낸다. 포지티브 컨트롤로서 사용한 항 FLAG 항체의 결합도 아울러 나타낸다. 항체는 모두 10 ㎍/㎖ 로 평가하였다.
도 5B 는, 선행 기술의 항체인 인간 키메라화 항 LAG-3 항체 IMP731 의 인간 LAG-3 결합 에피토프를 플로우 사이토메트리법에 의해 검증한 도면. 세로축은 플로우 사이토메트리법에 의해 측정된 평균 형광 강도를 나타낸다. 항혈청 (Antiserum) 은, 실시예 1)-1 의 면역한 래트로부터 얻은 항혈청을 500 배 희석으로 사용하였다. 다른 항체는 모두 10 ㎍/㎖ 로 평가하였다. 6D7 은, 실시예 2)-6 에서 제조한 LAG-3 의 도메인 1 을 인식하는 래트 항 LAG-3 항체이다.
도 6 은, 인간 키메라화 항 LAG-3 항체 cLA212 의 인간 LAG-3 발현 293T-lacZ 세포에 대한 결합 활성을 플로우 사이토메트리법에 의해 검증한 도면. 세로축은 플로우 사이토메트리법에 의해 측정된 평균 형광 강도를 나타낸다.
도 7 은, 인간화 항 LAG-3 항체의 결합능을 해리 정수로서 나타내는 도면.
도 8 은, 10 종류의 인간화 항 LAG-3 항체 및 인간 키메라화 항 LAG-3 항체 cLA212 의 인간 LAG-3 발현 293T-lacZ 세포에 대한 결합 활성을 플로우 사이토메트리법에 의해 검증한 도면. 세로축은 플로우 사이토메트리법에 의해 측정된 평균 형광 강도를 나타낸다.
도 9 는, 10 종류의 인간화 항 LAG-3 항체 및 인간 키메라화 항 LAG-3 항체 cLA212 의 ADCC 활성을 나타낸 도면. 인간 LAG-3 발현 293T-lacZ 세포를 표적 세포, 인간 PBMC 를 이펙터 세포로서 사용하였다.
도 10 은, 인간화 항 LAG-3 항체 hLA212_H3/L2 및 인간 키메라화 항 LAG-3 항체 IMP731 의 LAG-3 의 T 세포 억제 기능에 대한 영향을 검토한 도면. 각각의 항체 존재하에서 인간 PBMC 를 SEB 로 4 일간 자극했을 때의 배양 상청에 대한 IL-2 산생을 측정하였다. 항체는 모두 10 ㎍/㎖ 로 평가하였다.
도 11 은, 인간화 항 LAG-3 항체 hLA212_H4/L2 의 인간 LAG-3 발현 293T-lacZ 세포에 대한 결합 활성을 플로우 사이토메트리법에 의해 검증한 도면. 세로축은 플로우 사이토메트리법에 의해 측정된 평균 형광 강도를 나타낸다.
도 12 는, 인간화 항 LAG-3 항체 hLA212_H4/L2 의 ADCC 활성을 나타낸 도면. 인간 LAG-3 발현 293T-lacZ 세포를 표적 세포, 인간 PBMC 를 이펙터 세포로서 사용하였다.
도 13 은, 인간 LAG-3/인간 FcγRIIIA 더블 트랜스제닉 마우스에 있어서의 인간 LAG-3 의 발현이, 마우스 LAG-3 의 발현과 일치하고 있는 것을 나타내는 도면. 인간 LAG-3/인간 FcγRIIIA 더블 트랜스제닉 마우스 (Tg) 및 컨트롤의 야생형 마우스 (Non-Tg) 의 말초혈로부터 얻은 백혈구를 Con A 로 자극하여 얻은 활성화 T 세포에 있어서의 인간 및 마우스 LAG-3 의 발현을 플로우 사이토메트리법 (다중 염색) 에 의해 검토하였다. 해석을 위해서 CD3 양성 T 세포에 게이트를 가한 결과를 나타낸다. 또한 그래프의 4 분할은, 인간 및 마우스 LAG-3 에 대한 염색 항체를 포함하지 않는 샘플을 사용하여 설정하였다.
도 14 는, 인간화 항 LAG-3 항체 hLA212_H4/L2 의 in vivo 에 있어서의 LAG-3 발현 세포에 대한 디플리션 (depletion) 활성을 나타낸 도면. 세로축은, 인간 LAG-3/인간 FcγRIIIA 더블 트랜스제닉 마우스에 항체 및 Con A 를 투여한 2 일 후의 말초혈의 T 세포에 있어서의 인간 LAG-3 양성률을 나타낸다. 항체는 30 ㎎/㎏ 의 용량으로, Con A 투여의 직전에 복강 내 투여하였다.
도 15 는, 인간화 항 LAG-3 항체 hLA212_H4/L2 가 인·비보 (in vivo) 에 있어서 자기 면역 질환 모델을 억제하는 활성을 갖는 것을 나타내는 도면. 인간 LAG-3/인간 FcγRIIIA 더블 트랜스제닉 마우스에 EAE 를 유도하고, 인간화 항 LAG-3 항체 hLA212_H4/L2 혹은 컨트롤 항체를 투여한 마우스에 있어서의 EAE 의 임상 스코어를 시간 경과적으로 나타낸다. 항체는 모두 30 ㎎/㎏ 의 용량으로 감작일 및 그 7 일 후에 정맥 내 투여하였다.
도 16 은, rLA204 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 1)
도 17 은, rLA204 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 2)
도 18 은, rLA204 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 3)
도 19 는, rLA204 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 4)
도 20 은, rLA212 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 5)
도 21 은, rLA212 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 6)
도 22 는, rLA212 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 7)
도 23 은, rLA212 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 8)
도 24 는, rLA225 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 9)
도 25 는, rLA225 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 10)
도 26 은, rLA225 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 11)
도 27 은, rLA225 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 12)
도 28 은, rLA869 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 13)
도 29 는, rLA869 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 14)
도 30 은, rLA869 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 15)
도 31 은, rLA869 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 16)
도 32 는, rLA1264 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 17)
도 33 은, rLA1264 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 18)
도 34 는, rLA1264 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 19)
도 35 는, rLA1264 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 20)
도 36 은, 인간 경사슬 분비 시그널 및 인간 κ 사슬 정상 영역의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 21)
도 37 은, 인간 중사슬 분비 시그널 및 인간 IgG1 정상 영역의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 22)
도 38 은, cLA212 항체의 중사슬의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 23)
도 39 는, cLA212 항체의 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 24)
도 40 은, cLA212 항체의 경사슬의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 25)
도 41 은, cLA212 항체의 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 26)
도 42 는, hLA212 항체의 중사슬 H2 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 27)
도 43 은, hLA212 항체의 중사슬 H2 의 아미노산 서열 (서열 번호 28)
도 44 는, hLA212 항체의 중사슬 H3 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 29)
도 45 는, hLA212 항체의 중사슬 H3 의 아미노산 서열 (서열 번호 30)
도 46 은, hLA212 항체의 경사슬 L1 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 31)
도 47 은, hLA212 항체의 경사슬 L1 의 아미노산 서열 (서열 번호 32)
도 48 은, hLA212 항체의 경사슬 L2 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 33)
도 49 는, hLA212 항체의 경사슬 L2 의 아미노산 서열 (서열 번호 34)
도 50 은, hLA212 항체의 경사슬 L3 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 35)
도 51 은, hLA212 항체의 경사슬 L3 의 아미노산 서열 (서열 번호 36)
도 52 는, hLA212 항체의 경사슬 L4 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 37)
도 53 은, hLA212 항체의 경사슬 L4 의 아미노산 서열 (서열 번호 38)
도 54 는, hLA212 항체의 경사슬 L5 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 39)
도 55 는, hLA212 항체의 경사슬 L5 의 아미노산 서열 (서열 번호 40)
도 56 은, rLA204 항체의 중사슬 CDRH1 의 아미노산 서열 (서열 번호 41)
도 57 은, rLA204 항체의 중사슬 CDRH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 42)
도 58 은, rLA204 항체의 중사슬 CDRH3 의 아미노산 서열 (서열 번호 43)
도 59 는, rLA204 항체의 경사슬 CDRL1 의 아미노산 서열 (서열 번호 44)
도 60 은, rLA204 항체의 경사슬 CDRL2 의 아미노산 서열 (서열 번호 45)
도 61 은, rLA204 항체의 경사슬 CDRL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 46)
도 62 는, rLA212 항체의 중사슬 CDRH1 의 아미노산 서열 (서열 번호 47)
도 63 은, rLA212 항체의 중사슬 CDRH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 48)
도 64 는, rLA212 항체의 중사슬 CDRH3 의 아미노산 서열 (서열 번호 49)
도 65 는, rLA212 항체의 경사슬 CDRL1 의 아미노산 서열 (서열 번호 50)
도 66 은, rLA212 항체의 경사슬 CDRL2 의 아미노산 서열 (서열 번호 51)
도 67 은, rLA212 항체의 경사슬 CDRL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 52)
도 68 은, rLA225 항체의 중사슬 CDRH1 의 아미노산 서열 (서열 번호 53)
도 69 는, rLA225 항체의 중사슬 CDRH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 54)
도 70 은, rLA225 항체의 중사슬 CDRH3 의 아미노산 서열 (서열 번호 55)
도 71 은, rLA225 항체의 경사슬 CDRL1 의 아미노산 서열 (서열 번호 56)
도 72 는, rLA225 항체의 경사슬 CDRL2 의 아미노산 서열 (서열 번호 57)
도 73 은, rLA225 항체의 경사슬 CDRL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 58)
도 74 는, rLA869 항체의 중사슬 CDRH1 의 아미노산 서열 (서열 번호 59)
도 75 는, rLA869 항체의 중사슬 CDRH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 60)
도 76 은, rLA869 항체의 중사슬 CDRH3 의 아미노산 서열 (서열 번호 61)
도 77 은, rLA869 항체의 경사슬 CDRL1 의 아미노산 서열 (서열 번호 62)
도 78 은, rLA869 항체의 경사슬 CDRL2 의 아미노산 서열 (서열 번호 63)
도 79 는, rLA869 항체의 경사슬 CDRL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 64)
도 80 은, rLA1264 항체의 중사슬 CDRH1 의 아미노산 서열 (서열 번호 65)
도 81 은, rLA1264 항체의 중사슬 CDRH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 66)
도 82 는, rLA1264 항체의 중사슬 CDRH3 의 아미노산 서열 (서열 번호 67)
도 83 은, rLA1264 항체의 경사슬 CDRL1 의 아미노산 서열 (서열 번호 68)
도 84 는, rLA1264 항체의 경사슬 CDRL2 의 아미노산 서열 (서열 번호 69)
도 85 는, rLA1264 항체의 경사슬 CDRL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 70)
도 86 은, 프라이머 RG2AR3 (서열 번호 71)
도 87 은, 프라이머 RKR5 (서열 번호 72)
도 88 은, 프라이머 3.3-F1 (서열 번호 73)
도 89 는, 프라이머 3.3-R1 (서열 번호 74)
도 90 은, 프라이머 212H-F (서열 번호 75)
도 91 은, 프라이머 212H-R (서열 번호 76)
도 92 는, 프라이머 212L-F (서열 번호 77)
도 93 은, 프라이머 212L-R (서열 번호 78)
도 94 는, 올리고 뉴클레오티드 LAG-3-H1 (서열 번호 79)
도 95 는, 올리고 뉴클레오티드 LAG-3-H2 (서열 번호 80)
도 96 은, 올리고 뉴클레오티드 LAG-3-H3 (서열 번호 81)
도 97 은, 올리고 뉴클레오티드 LAG-3-H4 (서열 번호 82)
도 98 은, 올리고 뉴클레오티드 LAG-3-H5 (서열 번호 83)
도 99 는, 올리고 뉴클레오티드 LAG-3-H6 (서열 번호 84)
도 100 은, 인간 LAG-3 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 85)
도 101 은, 인간 LAG-3 의 아미노산 서열 (서열 번호 86)
1. 정의
본 발명에 있어서, 「유전자」 란, 단백질의 아미노산을 코드하는 뉴클레오티드 서열이 포함되는 핵산 분자 또는 그 상보 사슬을 의미하고, 예를 들어, 단백질의 아미노산을 코드하는 뉴클레오티드 서열 또는 그 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 올리고 뉴클레오티드, DNA, mRNA, cDNA, cRNA 등은 「유전자」 의 의미에 포함된다. 이러한 유전자는 1 본쇄, 2 본쇄 또는 3 본쇄 이상의 뉴클레오티드이고, DNA 사슬과 RNA 사슬의 회합체, 1 개의 뉴클레오티드 사슬 상에 리보뉴클레오티드 (RNA) 와 디옥시리보뉴클레오티드 (DNA) 가 혼재되는 것 및 그러한 뉴클레오티드 사슬을 포함하는 2 본쇄 또는 3 본쇄 이상의 뉴클레오티드도 「유전자」 의 의미에 포함된다. 본 발명의 「LAG-3 유전자」 로는, 예를 들어, LAG-3 단백질의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열이 포함되는 DNA, mRNA, cDNA, cRNA 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「뉴클레오티드」 와「핵산」 및 「핵산 분자」 는 동일한 의미이고, 예를 들어, DNA, RNA, 프로브, 올리고 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 프라이머 등도 그들의 의미에 포함된다. 이러한 뉴클레오티드는 1 본쇄, 2 본쇄 또는 3 개 이상의 사슬로 이루어지는 뉴클레오티드이고, DNA 사슬과 RNA 사슬의 회합체, 1 개의 뉴클레오티드 사슬 상에 리보뉴클레오티드 (RNA) 와 디옥시리보뉴클레오티드 (DNA) 가 혼재되는 것 및 그러한 뉴클레오티드 사슬을 포함하는 2 본쇄 또는 3 개 이상의 사슬의 회합체도 「뉴클레오티드」 의 의미에 포함된다.
본 발명에 있어서, 「폴리펩티드」, 「펩티드」 및 「단백질」 은 동일한 의미이다.
본 발명에 있어서, 「항원」 을 「면역원」 의 의미에 사용하는 경우가 있다.
본 발명에 있어서, 「세포」 에는, 동물 개체에서 유래하는 각종 세포, 계대 배양 세포, 초대 배양 세포, 세포주, 재조합 세포 및 미생물 등도 포함된다.
본 발명에 있어서는, LAG-3 과 결합하는 항체 및 LAG-3 을 인식하는 항체를, 모두 「항 LAG-3 항체」 라고 표기하거나 또는 「LAG-3 항체」 라고 약기하는 경우가 있다. 항 LAG-3 항체에는, 모노클로날 항체, 키메라화 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라 항체 등이 포함된다.
본 발명에 있어서의 「항체의 결합 단편」 이란, 원래의 항체가 발휘하는 기능의 적어도 일부를 발휘하는 항체 단편을 의미한다. 「항체의 결합 단편」 으로는, 예를 들어, Fab, F(ab')2, scFv, Fab', 1 본쇄 면역 글로블린 등을 들 수 있지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다. 이러한 항체의 결합 단편은, 항체 단백질의 전체 길이 분자를 파파인, 펩신 등의 효소로 처리함으로써 얻어진 것에 더하여, 재조합 유전자를 사용하여 적당한 숙주 세포에 있어서 산생된 재조합 단백질이어도 된다.
본 발명에 있어서, 항체가 결합하는 「부위」, 즉 항체가 인식하는 「부위」 란, 항체가 결합 또는 인식하는 항원상의 부분 펩티드 또는 부분 고차 구조를 의미한다. 본 발명에 있어서는, 이러한 부위를 에피토프, 항체의 결합 부위라고도 부른다. 본 발명의 항 LAG-3 항체가 결합 또는 인식하는 LAG-3 단백질상의 부위로는, LAG-3 단백질상의 부분 펩티드 또는 부분 고차 구조 등을 예시할 수 있다.
항체 분자의 중사슬 및 경사슬에는 각각 3 지점의 상보성 결정 영역 (CDR : Complemetarity determining region) 이 있는 것이 알려져 있다. 상보성 결정 영역은, 초가변 영역 (hypervariable domain) 이라고도 불리고, 항체의 중사슬 및 경사슬의 가변 영역 내에 있고, 1 차 구조의 변이성이 특히 높은 부위이고, 중사슬 및 경사슬의 폴리펩티드 사슬의 1 차 구조상에 있어서, 통상, 각각 3 지점으로 분리되어 있다. 본 발명에 있어서는, 항체의 상보성 결정 영역에 대해, 중사슬의 상보성 결정 영역을 중사슬 아미노산 서열의 아미노 말단측으로부터 CDRH1, CDRH2, CDRH3 이라고 표기하고, 경사슬의 상보성 결정 영역을 경사슬 아미노산 서열의 아미노 말단측으로부터 CDRL1, CDRL2, CDRL3 이라고 표기한다. 이들 부위는 입체 구조 상에서 서로 근접하여, 결합하는 항원에 대한 특이성을 결정하고 있다. 중사슬 가변 영역 아미노산 서열 중의 CDRH1 내지 CDRH3 이외의 부분을 프레임 워크 (Framework Region : 이하 FR) 라고 부르고, 아미노 말단으로부터 CDRH1 의 앞까지, CDRH1 의 다음으로부터 CDRH2 의 앞까지, CDRH2 의 다음으로부터 CDRH3 의 앞까지, 및 CDRH3 의 다음으로부터 카르복실 말단까지를, 각각 FRH1 내지 FRH4 라고 부른다. 동일하게, 경사슬 가변 영역 아미노산 서열 중의 CDRL1 내지 CDRL3 이외의 부분도 FR 이고, 아미노 말단으로부터 CDRL1 의 앞까지, CDRL1 의 다음으로부터 CDRL2 의 앞까지, CDRL2 의 다음으로부터 CDRL3 의 앞까지, 및 CDRL3 의 다음으로부터 카르복실 말단까지를, 각각 FRL1 내지 FRL4 라고 부른다. 즉, 중사슬 및 경사슬의 가변 영역 (의 아미노산 서열) 에 있어서는, FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4 및 FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4 의 순서로 아미노 말단측으로부터 카르복실 말단을 향하여 연속적으로 나열되어 있다.
본 발명에 있어서, 「항체 변이체」 란, 원래의 항체가 갖는 아미노산 서열에 있어서 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 (이하, 「변이」 라고 총칭한다) 하여 이루어지는 아미노산 서열을 갖고, 또한 본 발명의 LAG-3 단백질에 결합하는 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 항체 변이체에 있어서의 변이 아미노산의 수는, 1 개, 1 내지 2 개, 1 내지 3 개, 1 내지 4 개, 1 내지 5 개, 1 내지 6 개, 1 내지 7 개, 1 내지 8 개, 1 내지 9 개, 1 내지 10 개, 1 내지 12 개, 1 내지 15 개, 1 내지 20 개, 1 내지 25 개, 1 내지 30 개, 1 내지 40 개 또는 1 내지 50 개이다. 이러한 항체 변이체도 본 발명의 「항체」 에 포함된다.
본 발명에 있어서, 「1 내지 수 개」 에 있어서의 「수 개」 란, 3 내지 10 개를 가리킨다.
본 발명의 항체가 발휘하는 활성·성질로는, 예를 들어, 생물적 활성, 이화학적 성질 등을 들 수 있고, 구체적으로는, 각종 생물 활성, 항원이나 에피토프에 대한 결합 활성, 제조나 보존시에 있어서의 안정성, 열안정성 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는」 이란, 5 × SSC 를 포함하는 용액 중에서 65 ℃ 에서 하이브리다이제이션을 실시하고, 이어서 2 × SSC - 0.1 ％ SDS 를 포함하는 수용액 중에서 65 ℃ 에서 20 분간, 0.5 × SSC - 0.1 ％ SDS 를 포함하는 수용액 중에서 65 ℃ 에서 20 분간, 그리고 0.2 × SSC - 0.1 ％ SDS 를 포함하는 수용액 중에서 65 ℃ 에서 20 분간, 각각 세정하는 조건 또는 그것과 동등한 조건으로 하이브리다이즈하는 것을 의미한다. SSC 란 150 mMNaCl - 15 mM 시트르산나트륨의 수용액이고, n × SSC 는 n 배 농도의 SSC 를 의미한다.
본 발명에 있어서 「세포 상해」 란, 어떠한 형태로, 세포에 병리적인 변화를 가져오는 것을 가리키고, 직접적인 외상에 그치지 않고, DNA 의 절단이나 염기의 2 량체의 형성, 염색체의 절단, 세포 분열 장치의 손상, 각종 효소 활성의 저하 등 모든 세포의 구조나 기능상의 손상을 의미한다.
본 발명에 있어서 「세포 상해 활성」 이란 상기 세포 상해를 일으키는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서 「항체 의존성 세포 상해 활성」 이란, 「antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) 활성」 을 가리키고, NK 세포 등이 항체를 통하여 표적 세포를 상해하는 작용 활성을 의미한다.
본 발명에 있어서, 「숙주대이식편 반응」 이란, 장기 이식 후에 관찰되는 피이식자의 면역 항진 상태 및 그에 의한 이식 장기의 상해를 말한다.
본 발명에 있어서, 「이식편대숙주병」 이란, 조혈 세포 이식 후의 이식 세포에 의한 피이식자에 대한 면역적 공격에 의해 발증하는 증상을 말한다.
2. 항원 단백질
(2-1) 특성
LAG-3 단백질 (이하 간단히 「LAG-3」 이라고 기재한다) 은 막관통형 수용체 단백질로, 면역 글로블린형 도메인 (IgD1 내지 4) 로 이루어지는 리간드 결합 부위를 포함하는 세포 외 영역, I 형 1 회 막관통 영역, 및 세포내 영역으로 구성되어 있다. LAG-3 은 CD223 과 동일한 의미이다.
본 발명에 있어서, LAG-3 은 척추 동물 유래, 바람직하게는 포유 동물 유래이고, 보다 바람직하게는 인간 유래이다.
LAG-3 단백질은 이하의 성질을 갖는다.
(i) 항원 제시 세포상의 주요 조직 적합 유전자 복합체 (MHC) 클래스 II 분자에 결합한다.
(ii) MHC 클래스 II 분자에 결합하고, 당해 분자를 발현하는 T 세포에 억제성의 시그널을 전달하고, 그 T 세포의 기능을 부로 제어한다.
(iii) 본 발명에 있어서 LAG-3 단백질은, 다음의 (a) 내지 (d) 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열 (이하, 「LAG-3 아미노산 서열」 이라고 한다) 을 포함하여 이루어지거나, LAG-3 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열로 이루어지거나, 또는 LAG-3 아미노산 서열로 이루어진다 :
(a) 서열 번호 86 (도 101) 으로 나타내는 아미노산 서열 ;
(b) 서열 번호 86 (도 101) 으로 나타내는 아미노산 서열과 80 ％ 이상, 82 ％ 이상, 84 ％ 이상, 86 ％ 이상, 88 ％ 이상, 90 ％ 이상, 92 ％ 이상, 94 ％ 이상, 96 ％ 이상, 98 ％ 이상 또는 99 ％ 이상의 서열 동일성을 나타내고 또한 MHC 클래스 II 분자 결합 활성을 갖는 폴리펩티드의 아미노산 서열 ;
(c) 서열 번호 86 (도 101) 으로 나타내는 아미노산 서열에 있어서 1 내지 50 개, 1 내지 45 개, 1 내지 40 개, 1 내지 35 개, 1 내지 30 개, 1 내지 25 개, 1 내지 20 개, 1 내지 15 개, 1 내지 10 개, 1 내지 8 개, 1 내지 6 개, 1 내지 5 개, 1 내지 4 개, 1 내지 3 개, 1 혹은 2 개, 또는 1 개의 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는 삽입하여 이루어지고 또한 MHC 클래스 II 분자 결합 활성을 갖는 폴리펩티드의 아미노산 서열 ; 및
(d) 서열 번호 86 (도 101) 으로 나타내는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 (핵산 분자) 와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드 (핵산 분자) 가 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코드되고, 또한 MHC 클래스 II 분자 결합 활성을 갖는 폴리펩티드의 아미노산 서열.
(b) 내지 (d) 에 기재된 어느 하나에 기재된 폴리펩티드는, MHC 클래스 II 분자 결합 활성에 더하여, LAG-3 이 갖는 다른 활성을 가지고 있어도 된다.
(iv) 본 발명의 LAG-3 단백질은, 척추 동물, 바람직하게는 포유 동물, 보다 바람직하게는 마우스, 래트 등 설치류 및 인간, 보다 한층 바람직하게는 인간, 래트 또는 마우스의 LAG-3 을 발현하고 있는 세포, 조직 또는 암조직, 이러한 조직 유래의 세포, 이러한 세포의 배양물 등으로부터 얻을 수 있다.
LAG-3 은, 생체 내에서는 염증 부위의 활성화 T 세포 등에 발현이 관찰되고, 정상 조직의 세포에 있어서는 거의 발현하고 있지 않거나 또는 발현 레벨이 매우 낮다.
본 발명의 LAG-3 단백질은 천연형 (비재조합형) 및 재조합형 중 어느 것이어도 된다. 또, 담체나 태그 등 다른 펩티드나 단백질과의 융합물도 LAG-3 단백질의 의미에 포함된다. 또한 PEG 등의 폴리머 부가를 포함하는 화학 수식, 및/또는 당 사슬 수식을 포함하는 생물학적 수식이 이루어진 것도 LAG-3 단백질의 의미에 포함된다. 또, LAG-3 단백질 단편도 본 발명의 LAG-3 단백질의 의미에 포함된다. LAG-3 단백질 단편 중 상기 (i) 및/또는 (ii) 에 기재된 성질을 구비한 것을 LAG-3 단백질 결합 단편이라고 부른다.
(2-2) 항원 유전자
본 발명에 있어서 LAG-3 유전자는, 다음의 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열 (이하, 「LAG-3 유전자 서열」 이라고 한다) 을 포함하여 이루어지거나, LAG-3 유전자 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 또는 LAG-3 유전자 서열로 이루어진다 :
(a) 서열 번호 86 (도 101) 으로 나타내는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 ;
(b) 서열 번호 86 (도 101) 으로 나타내는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 (핵산 분자) 와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고 또한 MHC 클래스 II 분자 결합 활성을 갖는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드 (핵산 분자) 가 갖는 뉴클레오티드 서열 ; 및
(c) 서열 번호 86 (도 101) 으로 나타내는 아미노산 서열에 있어서 1 내지 50 개, 1 내지 45 개, 1 내지 40 개, 1 내지 30 개, 1 내지 25 개, 1 내지 20 개, 1 내지 15 개, 1 내지 10 개, 1 내지 8 개, 1 내지 6 개, 1 내지 5 개, 1 내지 4 개, 1 내지 3 개, 1 혹은 2 개, 또는 1 개의 염기가 치환, 결실, 부가 또는 삽입하여 이루어지는 아미노산 서열을 코드하고 또한 MHC 클래스 II 분자 결합 활성을 갖는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열.
(b) 또는 (c) 에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코드되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는, MHC 클래스 II 분자 결합 활성에 더하여, LAG-3 이 갖는 다른 활성을 가지고 있어도 된다.
LAG-3 유전자의 발현 및 발현량의 측정은, LAG-3 유전자의 전사 산물 및 LAG-3 단백질 중 어느 것을 지표로 해도 되고, 전자는 RT-PCR 법, 노던 블롯·하이브리다이제이션법 등에 의해, 후자는 플로우 사이토메트리, 웨스턴 블로팅법, 면역 조직 염색법 등의 면역 어세이법 등에 의해, 각각 측정할 수 있다.
(2-3) 항원 단백질의 조제
본 발명의 LAG-3 단백질은, 동물 조직 (체액을 포함한다), 그 조직 유래의 세포 혹은 그 세포 배양물로부터의 정제 및 단리, 유전자 재조합, 인비트에서 번역, 화학 합성 등에 의해 조제할 수 있다.
(2-3-1) 비재조합형 LAG-3 의 정제, 단리
비재조합형 LAG-3 단백질은, LAG-3 을 발현하고 있는 세포로부터 정제, 단리할 수 있다. LAG-3 을 발현하고 있는 세포로는 (2-1) 의 (iv) 에 기재된 것을 예시할 수 있지만, 비재조합형 LAG-3 단백질의 유래는 그것들에 한정되는 것은 아니다.
이러한 조직, 세포, 세포 배양물 등으로부터의 정제·단리는 당업자에게 주지된 분획, 크로마토그래피 등의 수법을 조합함으로써 실시할 수 있다.
(2-3-2) 재조합형 LAG-3 단백질의 조제
본 발명의 LAG-3 단백질은, 재조합형으로서도 조제할 수 있다. 즉, LAG-3 단백질 또는 LAG-3 단백질 단편의 아미노산 서열을 코드하는 유전자를 숙주 세포에 도입하고, 이러한 세포의 배양물로부터 LAG-3 단백질을 회수할 수 있다. 또, 아미노 말단 (N 말) 및/또는 카르복시 말단 (C 말) 이 천연형과 동일한 분자 뿐만 아니라, 분비 시그널, 세포 내 국재화 시그널, 어피니티 정제용 태그, 파트너 펩티드와의 융합 단백질로서 발현시킬 수도 있다. 이러한 재조합 세포 배양물로부터의 LAG-3 단백질의 정제, 단리는, (2-3-1) 에 기재된 비재조합형 LAG-3 단백질의 정제, 단리에 기재된 분획, 크로마토그래피 등의 조작을 적절히 조합함으로써 실시할 수 있다. 또, LAG-3 단백질 함유 용액은, 겔 여과나 Centriprep 등의 농축 장치로 버퍼 교환 및/또는 농축할 수 있다.
(2-3-3) 인비트로 번역
본 발명의 LAG-3 단백질은 인비트로 번역에 의해서도 조제할 수 있다. 이러한 번역법으로는, 전사 및 번역에 필요한 효소, 기질 그리고 에너지 물질을 포함하는 무세포 번역계를 이용한 방법이면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 로슈·다이아그노스틱스사 제조의 래피드 트랜슬레이션 시스템 (RTS) 을 이용하는 방법을 들 수 있다.
(2-3-4) 화학 합성
본 발명의 LAG-3 단백질은 화학 합성에 의해서도 조제할 수 있다. 화학 합성법으로는, 예를 들어, Fmoc 합성법, Boc 합성법 등의 펩티드 고상 합성법을 들 수 있다.
3. 항체
(3-1) 항체의 분류
본 발명의 항체는, 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체 중 어느 것이어도 된다. 본 발명의 모노클로날 항체로는, 비인간 동물 유래의 항체 (비인간 동물 항체), 인간 유래의 항체 (인간 항체), 키메라화 항체 (「키메라 항체」 라고도 한다), 인간화 항체 등을 들 수 있다.
비인간 동물 항체로는, 포유류, 조류 등의 척추 동물에서 유래하는 항체 등을 들 수 있다. 포유류 유래의 항체로는, 마우스 항체, 래트 항체 등 설치류 유래의 항체 등을 들 수 있다. 조류 유래의 항체로는, 닭 항체 등을 들 수 있다. 항인간 LAG-3 래트 모노클로날 항체로는, rLA204, rLA212, rLA225, 4LA869, rLA1264 등을 들 수 있다.
키메라화 항체로는, 비인간 동물 항체 유래의 가변 영역과 인간 항체 (인간 면역 글로블린) 정상 영역을 결합하여 이루어지는 항체 등을 들 수 있지만, 그것에 한정되는 것은 아니다. 비인간 동물 항체 유래의 가변 영역과 인간 항체 정상 영역이 결합하여 이루어지는 키메라화 항체로는, 전술한 래트 모노클로날 항체 rLA204, rLA212, rLA225, 4LA869 또는 rLA1264 유래의 중사슬 및 경사슬 가변 영역, 그리고 인간 중사슬 및 경사슬 정상 영역을 갖는 것 (각각 「cLA204」, 「cLA212」, 「cLA225」, 「cLA869」 또는 「cLA1264」 라고 부른다) 등을 들 수 있다.
인간화 항체로는, 비인간 동물 항체의 가변 영역 중의 CDR 을 인간 항체 (인간 면역 글로블린의 가변 영역) 에 이식한 것, CDR 에 더하여 비인간 동물 항체의 FR 의 서열도 일부 인간 항체에 이식한 것, 그들 중 어느 비인간 동물 항체 유래의 1 개 또는 2 개 이상의 아미노산을 인간형 또는 다른 아미노산으로 치환한 것 등을 들 수 있지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다. 비인간 동물 항체의 가변 영역 중의 CDR 로는, 전술한 rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 또는 rLA1264 유래의 중사슬 가변 영역 중의 CDRH1 내지 CDRH3 및 경사슬 가변 영역 중의 CDRL1 내지 CDRL3 을 예시할 수 있고, rLA212 유래의 중사슬 가변 영역 중의 CDRH1 내지 CDRH3 및 경사슬 가변 영역 중의 CDRL1 내지 CDRL3 을 포함하는 인간화 항체로는, hLA212_H2/L1 내지 H2/L5, hLA212_H3/L1 내지 H3/L5, hLA212_H4/L2 등을 들 수 있다.
인간 항체로는, 본 발명의 항원을 인식하는 항체이면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 본 발명의 항체의 CDR 을 갖는 항체와 동일한 부위에 결합하는 인간 항체, 전술한 비인간 동물 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 등 중 어느 1 개와 LAG-3 상에서 동일한 부위에 결합하는 인간 항체, 이러한 어느 항체와 LAG-3 에 대한 결합에 있어서 경합하는 항체 등을 예시할 수 있다.
본 발명에 있어서의 항체는, LAG-3 에 결합하는 활성을 가지고 있으면, 복수의 상이한 항체에서 유래하는 부분으로 구성되는 항체이어도 되고, 예를 들어, 복수의 상이한 항체 사이에서 중사슬 및/또는 경사슬을 교환한 것, 중사슬 및/또는 경사슬의 전체 길이를 교환한 것, 가변 영역만 또는 정상 영역만을 교환한 것, CDR 의 전부 또는 일부만을 교환한 것 등을 들 수 있다. 키메라화 항체의 중사슬 가변 영역과 경사슬 가변 영역은, 상이한 본 발명의 항체에서 유래해도 된다. 인간화 항체의 중사슬 및 경사슬의 가변 영역 중의 CDRH1 내지 CDRH3 그리고 CDRL1 내지 CDRL3 은, 2 종 또는 그 이상의 본 발명의 항체에서 유래해도 된다. 인간 항체의 중사슬 및 경사슬의 가변 영역 중의 CDRH1 내지 CDRH3 그리고 CDRL1 내지 CDRL3 은, 2 종 또는 그 이상의 본 발명의 항체가 갖는 CDR 의 조합이어도 된다. 그러한 복수의 상이한 항체에서 유래하는 부분으로 구성되는 항체 또는 그 결합 단편은, 이하에 기재되는 (3-2), (3-3) 및 (3-8), 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 내지 (3-7) 의 1 개 이상, 보다 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 및/또는 (3-5), 보다 한층 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 및 (3-5), 나아가 보다 한층 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 및 (3-5) 그리고 (3-6) 및/또는 (3-7), 최적으로는 (3-2) 내지 (3-8) 모두에 기재된 성질, 기능, 활성 등을 각각 갖는다.
본 발명의 모노클로날 항체의 아이소타입은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 등의 IgG, IgM, IgA1, IgA2 등의 IgA, IgD, IgE 등을 들 수 있고, 바람직하게는 IgG 및 IgM 을 들 수 있다. 모노클로날 항체의 아이소타입 및 서브 클래스는, 예를 들어, 옥털로니 (Ouchterlony) 법, Enzyme-linked immuno-sorbent assay : 이하, 「ELISA」 라고 한다) 법, Radio immunoassay (이하, 「RIA」 라고 한다) 법 등으로 결정할 수 있는, 시판되는 동정용의 키트 (마우스 타이퍼 키트 : 바이오래드사 제조, RAT MONOCLONAL ANTIBODY ISOTYPING TEST KIT : serotec 사 등) 도 이용할 수 있다.
(3-2) 항체의 결합 특이성
본 발명의 항체는 LAG-3 단백질을 인식한다. 바꿔 말하면, 본 발명의 항체는 LAG-3 단백질에 결합한다. 이러한 항체는 「항 LAG-3 항체」 라고도 표기된다. 또, 본 발명의 바람직한 항체는 LAG-3 단백질을 특이적으로 인식한다. 바꿔 말하면, 본 발명의 바람직한 항체는 LAG-3 단백질에 특이적으로 결합한다 (이상, 종합하여 항체의 「LAG-3 결합 활성」 이라고 한다). 또한 본 발명의, 보다 바람직한 항체는 LAG-3 단백질의 세포 외 영역에 특이적으로 결합하고, 보다 한층 바람직한 항체는 LAG-3 단백질이 갖는 면역 글로블린형 도메인 (이하, 「Ig 형 도메인」 이라고 한다) 에 특이적으로 결합하고, 나아가 보다 한층 바람직한 항체는 이러한 Ig 형 도메인 3 에 특이적으로 결합한다.
본 발명에 있어서 「특이적인 인식」, 즉 「특이적인 결합」 이란, 비특이적인 흡착이 아닌 결합을 의미한다. 결합이 특이적인지 여부의 판정 기준으로는, 예를 들어, 해리 정수 (Dissociation Consitant : 이하, 「KD 라고 한다」) 를 들 수 있다. 본 발명의 바람직한 항체의 LAG-3 단백질에 대한 KD 값은 1 × 10-5 이하, 5 × 10-6 이하, 2 × 10-6 이하 또는 1 × 10-6 이하, 보다 바람직하게는 5 × 10-7 이하, 2 × 10-7 이하 또는 1 × 10-7 이하, 보다 한층 바람직하게는 5 × 10-8 이하, 2 × 10-8 이하 또는 1 × 10-8 이하, 나아가 보다 한층 바람직하게는 5 × 10-9 이하, 2 × 10-9 이하 또는 1 × 10-9 이하, 최적으로는 5 × 10-10 이하, 2 × 10-10 이하 또는 1 × 10-10 이하이다.
본 발명에 있어서의 항원과 항체의 결합은, ELISA 법, RIA 법, Surface Plasmon Resonance (이하, 「SPR」 이라고 한다) 해석법 등에 의해 측정 또는 판정할 수 있다. SPR 해석에 사용하는 기기로는, BIAcoreTM (GE 헬스 케어사 제조), ProteOnTM (BioRad 사 제조), SPR-NaviTM (BioNavis 사 제조), SpreetaTM (Texas Instruments 사 제조), SPRi-PlexIITM (호리바사 제조), Autolab SPRTM (Metrohm 사 제조) 등을 예시할 수 있다. 세포 표면 상에 발현하고 있는 항원과 항체의 결합은, 플로우 사이토메트리, Cell ELISA 법 등에 의해 측정할 수 있다.
(3-3) 항체의 세포 상해 활성
본 발명의 항 LAG-3 항체는, 그 어느 양태에 있어서, 항체 의존성 세포 상해 (ADCC) 활성을 갖고, 바람직하게는 인·비트로에서 ADCC 활성을 갖고, 보다 바람직하게는 LAG-3 을 발현하는 T 세포에 대해 ADCC 활성을 갖는다. 본 발명의 항 LAG-3 항체는, ADCC 활성에 더하여, 보체 의존성 세포 상해 (CDC) 활성 및/또는 항체 의존성 세포 매개 식활성 (ADCP) 활성을 가지고 있어도 된다.
ADCC 활성은 공지된 방법에 의해 측정할 수 있다. ADCC 활성의 측정에는, 목적으로 하는 항원을 발현하는 세포 (표적 세포) 와, 그 표적 세포를 살상하는 이펙터 세포가 사용된다. 이펙터 세포는 Fcγ 수용체를 통하여, 표적 세포에 결합한 항체의 Fc 영역을 인식한다. Fcγ 수용체로부터 전달되는 시그널에 의해, 이펙터 세포가 표적 세포를 살상한다. 인간 유래의 Fc 영역을 갖는 항체의 ADCC 활성을 측정하는 경우, 이펙터 세포로서 인간 NK 세포가 사용된다. 인간 NK 세포는 인간 말초혈 단핵구 (PMBC) 로부터 공지된 방법에 의해 조제할 수 있다. 혹은 PBMC 를 그대로 이펙터 세포로서 사용할 수도 있다.
(3-4) 항체의 인·비보 LAG-3 양성 세포수 저감 활성
본 발명의 항체는, 그 어느 양태에 있어서, LAG-3 양성 세포수를 저감시키고, 바람직하게는 인·비보 (in vivo) 에서 LAG-3 양성 세포수를 저감시키고, 보다 바람직하게는 저푸코오스 형태로, 인·비보 (in vivo) 에서 LAG-3 양성 세포수를 저감시킨다.
LAG-3 양성 세포에는, LAG-3 을 강제 발현시킨 세포, 자극에 의해 LAG-3 발현이 유도된 세포 등이 포함되지만, LAG-3 을 발현하고 있는 세포이면 그것들에 한정되지 않는다.
LAG-3 양성 세포수는 정법, 예를 들어, 플로우 사이토메트리에 의해 카운트할 수 있다.
본 발명에 있어서 「저푸코오스 형태」 란, (i) 어느 항체 또는 그 결합 단편에 결합하고 있는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 중의 푸코오스 (푸코오스 잔기) 의 양이, 원래 (친 (親)) 의 항체 또는 그 결합 단편에 결합하고 있는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 중의 푸코오스 (푸코오스 잔기) 의 양보다 적은 형태, (ii) 어느 항체 또는 그 결합 단편에 결합하고 있는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 중의 푸코오스 (푸코오스 잔기) 의 양이, 천연에 있어서 항체 또는 그 결합 단편에 결합하고 있는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 중의 푸코오스 (푸코오스 잔기) 의 양보다 적은 형태, 또는 (iii) 어느 항체 혹은 그 결합 단편에 결합하고 있는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 중의 푸코오스 (푸코오스 잔기) 또는 푸코오스 (푸코오스 잔기) 를 포함하는 당 사슬이, 물리적 또는 화학적인 분석 (바람직하게는 질량 분석) 에 있어서 검출 한계 이하인 형태를 의미한다. 어느 개변된 항체 또는 그 결합 단편에 결합하고 있는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 중의 푸코오스 (푸코오스 잔기) 의 양이, 이러한 개변 전과 비교하여 적은 경우, 이러한 개변된 항체 또는 그 결합 단편은 「저푸코오스 형태」 에 있다고 해석된다. 후술하는 본 발명의 인간화 항체의 수식체 hLA212_H4/L2도, 저푸코오스 형태에 있는 항체의 일 양태이다. 저푸코오스 형태에 있는 항체 또는 결합 단편은, 저푸코오스 형태에 없는 것에 비해, Fcγ 수용체 IIIA 에 대한 친화성이 높고, ADCC 활성이 강하다.
(3-5) 항체의 인·비보 실험적 자기 면역성 뇌척수염 억제 활성
본 발명의 항체는, 그 어느 양태에 있어서, 뇌척수염 억제 활성을 갖고, 바람직하게는 인·비보 (in vivo) 에서 실험적 자기 면역성 뇌척수염 억제 활성을 갖고, 보다 바람직하게는 저푸코오스 형태로, 인·비보 (in vivo) 에서 실험적 자기 면역성 뇌척수염 억제 활성을 갖는다.
본 발명에 있어서, 실험적 자기 면역성 뇌척수염은, 중추 신경의 미엘린 구성 단백질의 하나인 MOG (Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein) 유래의 펩티드를 Freund's Adjuvant 와 함께 마우스에 주사함으로써 야기하는 뇌척수염을 의미한다.
실험적 자기 면역성 뇌척수염 억제 활성은, 마비의 정도를 반영한 임상 스코어를 거쳐 경일적 (經日的) 으로 관찰함으로써 측정할 수 있다. 임상 스코어는, 예를 들어 이하와 같이 설정할 수 있다 : 스코어 0 : 무증상, 스코어 1 : 꼬리의 탈력, 스코어 2 : 보행 이상·정향 반사 소실, 스코어 3 : 뒷다리 마비, 스코어 4 : 앞다리의 부분 마비, 스코어 5 : 사망 또는 안락살.
(3-6) 항체의 인간 활성화 T 세포 결합 활성
본 발명의 항체는, 그 어느 양태에 있어서, 인간 활성화 T 세포에 결합하고, 바람직하게는 LAG-3 양성 인간 활성화 T 세포에 결합한다.
항체와 활성화 인간 활성화 T 세포의 결합은, 예를 들어, 플로우 사이토메트리법에 의해 측정 또는 검출할 수 있다.
(3-7) 항체의 존재하에서 인간 LAG-3 과 인간 MHC 클래스 II 분자는 결합한다.
본 발명의 어느 양태에서는, 항체의 존재하에 있어서, 인간 LAG-3 과 인간 MHC 클래스 II 분자는 결합할 수 있거나, 또는 본 발명의 항체는, 인간 LAG-3 과 인간 MHC 클래스 II 분자의 결합을 저해하지 않는다.
LAG-3 분자의 세포 외 영역과 IgG 의 Fc 부분의 융합 단백질의, 내인성으로 MHC 클래스 II 분자를 고발현하는 Raji 세포에 대한 결합은, 예를 들어, 플로우 사이토메트리법에 의해 측정 또는 검출함으로써 평가할 수 있다.
(3-8) 항체의 존재하에서 인간 LAG-3 은 인간 T 세포 억제 기능을 발휘한다
또 다른 양태에 있어서, 본 발명의 항체의 존재하에서, 인간 LAG-3 은 인간 T 세포 억제 기능을 발휘한다.
본 발명에 있어서 「T 세포 억제 기능」 이란, T 세포를 자극했을 때에 산생되는 사이토카인량의 감소 또는 억제를 의미한다.
인간 LAG-3 에 의한 T 세포 억제 기능은, 예를 들어 인간 T 세포를 자극하여 LAG-3 발현을 유도했을 때에 산생되는 사이토카인을 정량함으로써 측정할 수 있다.
본 발명에 있어서, 인간 T 세포의 자극은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 특이 항원, 항 CD3 항체, 항 CD3 항체와 항 CD28 항체의 조합, 슈퍼 항원, 다른 도너 유래의 세포에 의한 자극, 바람직하게는 Staphylococcal Enterotoxin B, MHC 의 상이한 다른 도너 유래의 세포에 의한 자극 등을 들 수 있다.
사이토카인으로는, 예를 들어, 활성화 T 세포로부터 산생되는 사이토카인, 바람직하게는 각종 인터류킨 및 인터페론, 보다 바람직하게는 인터류킨 2 (IL-2) 및 인터페론 γ 등을 들 수 있다.
(3-9) 모노클로날 항체
본 발명은 항 LAG-3 모노클로날 항체 및 그 결합 단편을 제공한다. 모노클로날 항체에는, 래트 항체, 마우스 항체, 토끼 항체, 닭 항체, 어류 항체 등의 비인간 동물 유래의 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 그들의 결합 단편, 그들의 수식체 등이 포함된다. 이 중, 래트 모노클로날 항체의 예로는, rLA204, rLA212, rLA225, rLA869, rLA1264 등을 들 수 있다.
rLA204 는 실시예 1 에 기재된 방법에 의해 얻어진 항인간 LAG-3 래트 모노클로날 항체이다. rLA204 의 중사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1 (도 16) 에, 아미노산 서열은 서열 번호 2 (도 17) 에 기재되어 있다. rLA204 의 경사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 3 (도 18) 에, 아미노산 서열은 서열 번호 4 (도 19) 에 기재되어 있다. rLA204 의 CDRH1 의 아미노산 서열은 서열 번호 41 (도 56) 에, CDRH2 의 아미노산 서열은 서열 번호 42 (도 57) 에, CDRH3 의 아미노산 서열은 서열 번호 43 (도 58) 에, CDRL1 의 아미노산 서열은 서열 번호 44 (도 59) 에, CDRL2 의 아미노산 서열은 서열 번호 45 (도 60) 에, CDRL3 의 아미노산 서열은 서열 번호 46 (도 61) 에 각각 기재되어 있다.
rLA212 는 실시예 1 에 기재된 방법에 의해 얻어진 항인간 LAG-3 래트 모노클로날 항체이다. rLA212 의 중사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 5 (도 20) 에, 아미노산 서열은 서열 번호 6 (도 21) 에 기재되어 있다. rLA212 의 경사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 7 (도 22) 에, 아미노산 서열은 서열 번호 8 (도 23) 에 기재되어 있다. rLA212 의 CDRH1 의 아미노산 서열은 서열 번호 47 (도 62) 에, CDRH2 의 아미노산 서열은 서열 번호 48 (도 63) 에, CDRH3 의 아미노산 서열은 서열 번호 49 (도 64) 에, CDRL1 의 아미노산 서열은 서열 번호 50 (도 65) 에, CDRL2 의 아미노산 서열은 서열 번호 51 (도 66) 에, CDRL3 의 아미노산 서열은 서열 번호 52 (도 67) 에 각각 기재되어 있다.
rLA225 는 실시예 1 에 기재된 방법에 의해 얻어진 항인간 LAG-3 래트 모노클로날 항체이다. rLA225 의 중사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 9 (도 24) 에, 아미노산 서열은 서열 번호 10 (도 25) 에 기재되어 있다. rLA225 의 경사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 11 (도 26) 에, 아미노산 서열은 서열 번호 12 (도 27) 에 기재되어 있다. rLA225 의 CDRH1 의 아미노산 서열은 서열 번호 53 (도 68) 에, CDRH2 의 아미노산 서열은 서열 번호 54 (도 69) 에, CDRH3 의 아미노산 서열은 서열 번호 55 (도 70) 에, CDRL1 의 아미노산 서열은 서열 번호 56 (도 71) 에, CDRL2 의 아미노산 서열은 서열 번호 57 (도 72) 에, CDRL3 의 아미노산 서열은 서열 번호 58 (도 73) 에 기재되어 있다.
rLA869 는 실시예 1 에 기재된 방법에 의해 얻어진 항인간 LAG-3 래트 모노클로날 항체이다. rLA869 의 중사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 13 (도 28) 에, 아미노산 서열은 서열 번호 14 (도 29) 에 기재되어 있다. rLA869 의 경사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 15 (도 30) 에, 아미노산 서열은 서열 번호 16 (도 31) 에 기재되어 있다. rLA869 의 CDRH1 의 아미노산 서열은 서열 번호 59 (도 74) 에, CDRH2 의 아미노산 서열은 서열 번호 60 (도 75) 에, CDRH3 의 아미노산 서열은 서열 번호 61 (도 76) 에, CDRL1 의 아미노산 서열은 서열 번호 62 (도 77) 에, CDRL2 의 아미노산 서열은 서열 번호 63 (도 78) 에, CDRL3 의 아미노산 서열은 서열 번호 64 (도 79) 에 기재되어 있다.
rLA1264 는 실시예 1 에 기재된 방법에 의해 얻어진 항인간 LAG-3 래트 모노클로날 항체이다. rLA1264 의 중사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 17 (도 32) 에, 아미노산 서열은 서열 번호 18 (도 33) 에 기재되어 있다. rLA1264 의 경사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 19 (도 34) 에, 아미노산 서열은 서열 번호 20 (도 35) 에 기재되어 있다. rLA1264 의 CDRH1 의 아미노산 서열은 서열 번호 65 (도 80) 에, CDRH2 의 아미노산 서열은 서열 번호 66 (도 81) 에, CDRH3 의 아미노산 서열은 서열 번호 67 (도 82) 에, CDRL1 의 아미노산 서열은 서열 번호 68 (도 83) 에, CDRL2 의 아미노산 서열은 서열 번호 69 (도 84) 에, CDRL3 의 아미노산 서열은 서열 번호 70 (도 85) 에 기재되어 있다.
본 발명의 항체 변이체에는, 바람직하게는, 단백질의 분해 혹은 산화에 대한 감수성의 저하, 생물 활성의 개선, 항원 결합능의 개선, 또는 이화학적 성질 혹은 기능적 성질의 부여 등이 이루어지고 있다. 그러한 항체 변이체의 예로서, 항체가 갖는 아미노산 서열에 있어서 1 또는 2 이상, 바람직하게는 1 내지 수 개의 아미노산이 보존적 아미노산 치환된 아미노산 서열을 갖는 항체를 들 수 있다. 보존적 아미노산 치환이란, 아미노산 측사슬에 관련이 있는 아미노산 그룹 내에서 생기는 치환이다.
바람직한 아미노산 그룹은 이하와 같다 : 산성 그룹 = 아스파르트산, 글루탐산 ; 염기성 그룹 = 리신, 아르기닌, 히스티딘 ; 비극성 그룹 = 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판 ; 및 비대전극성 패밀리 = 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신. 다른 바람직한 아미노산 그룹은 다음과 같다 : 지방족 하이드록시 그룹 = 세린 및 트레오닌 ; 아미드 함유 그룹 = 아스파라긴 및 글루타민 ; 지방족 그룹 = 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신 ; 그리고 방향족 그룹 = 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신. 이러한 항체 변이체에 있어서의 아미노산 치환은, 원래 (친) 의 항체가 갖는 항원 결합 활성을 저하시키지 않는 범위에서 실시하는 것이 바람직하다.
단백질 중에 포함되는 아스파르트산은, 그 C 말측에 연결하는 아미노산이 작은 측사슬을 갖는 경우에는 이성화에 의해 이소아스파르트산으로 변환되기 쉽고, 한편, 아스파라긴의 경우에는 탈아미드화에 의해 아스파르트산으로 변환되기 쉽고, 또한 이성화에 의해 이소아스파르트산으로 변환될 가능성이 있다. 그러한 이성화나 탈아미드화가 진행되면, 단백질의 안정성에 영향이 생길 수 있다. 그래서, 이러한 이성화나 탈아미드화를 회피하기 위해, 단백질 중의 아스파르트산이나 아스파라긴 혹은 그것들에 인접하는 아미노산 등을 다른 아미노산으로 치환할 수 있다. 이러한 아미노산 치환이 이루어진 항체 변이체는, 원래의 항체가 갖는 항원 결합 활성을 유지하고 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 또는 rLA1264 가 갖는 아미노산 서열에 있어서 보수적 아미노산 치환이 이루어진 아미노산 서열을 갖는 항체 변이체, 그리고 rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 또 rLA1264 는 유래의 CDRH1 내지 CDRH3 및 CDRL1 내지 CDRL3 중 어느 아미노산 서열에 있어서 보수적 아미노산 변이가 이루어진 아미노산 서열을 갖는 그 CDR 을 포함하는 마우스 항체, 래트 항체, 키메라화 항체, 인간화 항체, 인간 항체 등도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 또 rLA1264 유래의 CDRH1 내지 CDRH3 및 CDRL1 내지 CDRL3 중 어느 1 개 또는 2 개 이상의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 수 개, 바람직하게는 1 내지 3 개, 보다 바람직하게는 1 또는 2 개, 최적으로는 1 개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되어 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 CDRH1 내지 CDRH3 및 CDRL1 내지 CDRL3 을 포함하는 항체의 변이체이며, 또한 인간 LAG-3 에 결합하는 것은, 본 발명의 항체의 변이체에 포함된다.
또, 복수의 항체에서 유래하는 CDRH1 내지 CDRH3 및 CDRL1 내지 CDRL3 을 갖는 항체도 항체 변이체에 포함된다. 그러한 변이체의 예로서, CDRH3 만 있는 항체에서 유래하고, CDRH1 및 CDRH2 그리고 CDRL1 내지 CDRL3 은 다른 항체에서 유래하는 항체 변이체를 들 수 있다.
본 발명에 있어서는 항체 변이체도 「항체」 에 포함된다.
본 발명의 항체의 정상 영역으로는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 인간의 질환을 치료 또는 예방하기 위한 본 발명의 항체로는, 바람직하게는 인간 항체의 것이 사용된다. 인간 항체의 중사슬 정상 영역으로는, 예를 들어, Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4, Cμ, Cδ, Cα1, Cα2, Cε 등을 들 수 있다. 인간 항체의 경사슬 정상 영역으로는, 예를 들어, Cκ, Cλ 등을 들 수 있다.
(3-10) 키메라 항체
본 발명의 항 LAG-3 키메라화 항체 또는 그 결합 단편은, (3-2), (3-3) 및 (3-8), 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 내지 (3-7) 의 1 개 이상, 보다 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 및/또는 (3-5), 보다 한층 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 및 (3-5), 나아가 보다 한층 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 및 (3-5) 그리고 (3-6) 및/또는 (3-7), 최적으로는 (3-2) 내지 (3-8) 모두에 기재된 성질, 기능, 활성 등을 각각 갖는다.
본 발명의 래트-인간 키메라화 항체로서 예시되는 cLA212 의 중사슬 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열 그리고 경사슬 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은, 서열 번호 23, 24, 25 및 26 (도 38, 39, 40 및 41) 에 각각 나타낸다. 중사슬의 뉴클레오티드 서열에 있어서의 뉴클레오티드 번호 1 내지 57, 그리고 중사슬의 아미노산 서열에 있어서의 아미노산 번호 1 내지 19 는, 시그널 서열이고, 통상 대부분의 성숙 중사슬의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열에는 각각 포함되지 않는다. 동일하게, 경사슬의 뉴클레오티드 서열에 있어서의 뉴클레오티드 번호 1 내지 60, 그리고 경사슬의 아미노산 서열에 있어서의 아미노산 번호 1 내지 20 은, 시그널 서열이고, 통상 대부분의 성숙 경사슬의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열에는 각각 포함되지 않는다.
랜트-인간 키메라 항체인 cLA204, cLA225, cLA869 및 cLA1264 에 대해서는 다른 지점에 기재되어 있다.
(3-11) 항체의 결합 단편
본 발명은 하나의 양태로서, 본 발명의 항 LAG-3 항체의 결합 단편을 제공한다. 항체의 결합 단편이란, 그 항체가 갖는 기능의 적어도 일부를 유지하는 단편을 의미한다. 이러한 항체의 기능으로는, 일반적으로는, 항원 결합 활성, 항원의 활성을 조절하는 활성, 항체 의존성 세포 장해 (ADCC) 활성 등을 들 수 있다. 본 발명의 바람직한 항 LAG-3 항체의 결합 단편은, (3-2), (3-3) 및 (3-8), 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 내지 (3-7) 의 1 개 이상, 보다 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 및/또는 (3-5), 보다 한층 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 및 (3-5), 나아가 보다 한층 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 및 (3-5) 그리고 (3-6) 및/또는 (3-7), 최적으로는 (3-2) 내지 (3-8) 모두에 기재된 성질, 기능, 활성 등을 각각 갖는다.
항체의 결합 단편으로는, 그 항체가 갖는 활성의 적어도 일부를 유지하고 있는 그 항체의 단편이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, Fab, F(ab')2, Fv, 중사슬 및 경사슬의 Fv 를 적당한 링커로 연결시킨 싱글 체인 Fv(scFv), diabody (diabodies), 선상 항체, 및 항체 단편으로 형성된 다특이성 항체, F(ab')2 를 환원 조건하에서 처리한 항체의 가변 영역의 1 가의 단편인 Fab' 등을 들 수 있지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다. 링커 부분을 보유하는 scFv 와 같이, 본 발명의 항체의 단편 이외의 부분을 포함하는 분자도, 본 발명의 항체의 결합 단편의 의미에 포함된다.
항체 단백질의 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단의 아미노산이 1 내지 수 개 또는 그 이상을 결실하여 이루어지고, 또한 그 항체가 갖는 기능의 적어도 일부를 유지하고 있는 분자도, 항체의 결합 단편의 의미에 포함된다. 예를 들어, 포유류 배양 세포에서 생산되는 항체의 중사슬의 카르복실 말단의 리신 잔기가 결실하는 것이 알려져 있고 (Journal of Chromatography A, 705 : 129-134 (1995)), 또, 동일하게 중사슬 카르복실 말단의 글리신, 리신의 2 아미노산 잔기가 결실하고, 새롭게 카르복실 말단에 위치하는 프롤린 잔기가 아미드화되는 것이 알려져 있다 (Analytical Biochemistry, 360 : 75-83 (2007)). 그러나, 이들 중사슬 서열의 결실 및 수식은, 항체의 항원 결합능 및 이펙터 기능 (보체의 활성화나 항체 의존성 세포 상해 작용 등) 에는 영향을 미치지 않는다. 그러한 항체의 결합 단편의 수식체도, 본 발명의 항체 혹은 그 결합 단편, 또는 그 수식체 (후술) 에 포함된다.
본 발명의 항체 또는 그 결합 단편은, 적어도 2 종류의 상이한 항원에 대해 특이성을 갖는 다특이성 항체이어도 된다. 다특이성 항체는, 2 종류의 상이한 항원에 결합하는 이중 특이성 항체 (bispecific antibody) 에 한정되지 않고, 3 종 이상의 상이한 항원에 대해 특이성을 갖는 항체도 본 발명의 「다특이성 항체」 의 의미에 포함된다.
본 발명의 다특이성 항체는, 전체 길이 항체 또는 그 결합 단편이어도 된다 (예를 들어, F(ab')2 이중 특이성 항체). 이중 특이성 항체는 2 종류의 항체의 중사슬과 경사슬 (HL 쌍) 을 결합시켜 제조할 수도 있다. 또, 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마를 2 종류 이상 융합시키고, 이중 특이성 항체 산생 융합 세포를 제조함으로써도 얻을 수 있다 (Millstein et al., Nature (1983) 305, p.537-539). 다특이적 항체도 동일한 방법에 의해 조제할 수 있다.
본 발명의 항체의 하나의 양태는, 1 본쇄 항체 (이하, 「scFv」 라고 한다) 이다. scFv 는, 항체의 중사슬 V 영역과 경사슬 V 영역을 폴리펩티드의 링커로 연결함으로써 얻어진다 (Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113, Rosenburg 및 Moore 편, Springer Verlag, New York, p.269-315 (1994), Nature Biotechnology (2005), 23, p.1126-1136). 또, 2 개의 scFv 를 폴리펩티드 링커로 결합시켜 제조되는 BiscFv 를 이중 특이성 항체로서 사용할 수 있다. 또한 3 개 이상의 scFv 로부터 MultiscFv 도 다특이성 항체로서 사용할 수 있다.
본 발명에는, 항체의 중사슬 및 경사슬의 전체 길이 서열을 적절한 링커를 사용하여 연결한 1 본쇄 이뮤노글로블린 (single chain immunoglobulin) 이 포함된다 (Lee, H-S, et. al., Molecular Immunology (1999) 36, p.61-71 ; Shirrmann, T. et. al., mAbs (2010), 2, (1) p.1-4). 이와 같은 1 본쇄 이뮤노글로블린은 2 량체화함으로써, 본래는 4 량체인 항체와 유사한 구조와 활성을 유지하는 것이 가능하다. 또, 본 발명의 항체는, 단일 중사슬 가변 영역을 갖고, 경사슬 서열을 갖지 않는 항체이어도 된다. 이와 같은 항체는, 단일 도메인 항체 (single domain antibody : sdAb) 또는 나노바디 (nanobody) 라고 불리고 있고, 항원 결합능이 유지되어 있는 것이 보고되고 있다 (Muyldemans S. et. al., Protein Eng. (1994)7(9), 1129-35, Hamers-Casterman C. et. al., Nature (1993) 363 (6428) 446-8). 이들 항체도, 본 발명에 있어서의 항체의 기능성 단편의 의미에 포함된다.
(3-12) 인간화 항체 및 인간 항체
본 발명은 그 하나의 양태에 있어서, 인간화 항체 또는 그 결합 단편을 제공한다.
본 발명의 바람직한 인간화 항 LAG-3 항체 또는 그 결합 단편은, (3-2), (3-3) 및 (3-8), 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 내지 (3-7) 의 1 개 이상, 보다 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 및/또는 (3-5), 보다 한층 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 및 (3-5), 나아가 보다 한층 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 및 (3-5) 그리고 (3-6) 및/또는 (3-7), 최적으로는 (3-2) 내지 (3-8) 모두에 기재된 성질, 기능, 활성 등을 각각 갖는다.
본 발명의 바람직한 인간화 항체의 예로는, 이하의 A 내지 E 에 기재한 바와 같이, rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 또는 rLA1264 의 중사슬의 CDRH1 내지 CDRH3 및 경사슬의 CDRL1 내지 CDRL3 을 갖는 인간화 항체 등을 들 수 있다.
(A. rLA204 항체의 중사슬의 CDRH1 내지 CDRH3 및 경사슬의 CDRL1 내지 CDRL3 을 갖는 인간화 항체)
본 발명의 인간화 항 LAG-3 항체 또는 그 결합 단편으로는, 예를 들어, 서열 번호 41 (도 56) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 42 (도 57) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 43 (도 58) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 가변 영역을 갖는 중사슬, 그리고 서열 번호 44 (도 59) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 45 (도 60) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 46 (도 61) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 가변 영역을 갖는 경사슬로 이루어지고, 본 발명의 LAG-3 단백질을 인식하는 인간화 항체 혹은 그 결합 단편, 또는 그 변이체 등을 들 수 있다.
(B. rLA212 항체의 중사슬의 CDRH1 내지 CDRH3 및 경사슬의 CDRL1 내지 CDRL3 을 갖는 인간화 항체)
또, 다른 인간화 항 LAG-3 항체 또는 그 결합 단편으로는, 예를 들어, 서열 번호 47 (도 62) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 48 (도 63) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 49 (도 64) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 가변 영역을 갖는 중사슬, 그리고 서열 번호 50 (도 65) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 51 (도 66) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 52 (도 67) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 가변 영역을 갖는 경사슬로 이루어지고, 본 발명의 LAG-3 단백질을 인식하는 인간화 항체 혹은 그 결합 단편, 또는 그 변이체 등을 들 수 있다.
(C. rLA225 항체의 중사슬의 CDRH1 내지 CDRH3 및 경사슬의 CDRL1 내지 CDRL3 을 갖는 인간화 항체)
또한, 다른 인간화 항 LAG-3 항체 또는 그 결합 단편으로는, 예를 들어, 서열 번호 53 (도 68) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 54 (도 69) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 55 (도 70) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 가변 영역을 갖는 중사슬, 그리고 서열 번호 56 (도 71) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 57 (도 72) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 58 (도 73) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 가변 영역을 갖는 경사슬로 이루어지고, 본 발명의 LAG-3 단백질을 인식하는 인간화 항체 혹은 그 결합 단편, 또는 그 변이체 등을 들 수 있다.
(D. rLA869 항체의 중사슬의 CDRH1 내지 CDRH3 및 경사슬의 CDRL1 내지 CDRL3 을 갖는 인간화 항체)
또한, 다른 인간화 항 LAG-3 항체 또는 그 결합 단편으로는, 예를 들어, 서열 번호 59 (도 74) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 60 (도 75) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 61 (도 76) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 가변 영역을 갖는 중사슬, 그리고 서열 번호 62 (도 77) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 63 (도 78) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 64 (도 79) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 가변 영역을 갖는 경사슬로 이루어지고, 본 발명의 LAG-3 단백질을 인식하는 인간화 항체 혹은 그 결합 단편, 또는 그 변이체 등을 들 수 있다.
(E. rLA1264 항체의 중사슬의 CDRH1 내지 CDRH3 및 경사슬의 CDRL1 내지 CDRL3 을 갖는 인간화 항체)
또한, 다른 인간화 항 LAG-3 항체 또는 그 결합 단편으로는, 예를 들어, 서열 번호 65 (도 80) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 66 (도 81) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 67 (도 82) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 가변 영역을 갖는 중사슬, 그리고 서열 번호 68 (도 83) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 69 (도 84) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 70 (도 85) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 가변 영역을 갖는 경사슬로 이루어지고, 본 발명의 LAG-3 단백질을 인식하는 인간화 항체 혹은 그 결합 단편, 또는 그 변이체 등을 들 수 있다.
본 발명의 바람직한 인간화 항체에는, 상기 A 내지 E 에 기재된 것이 포함되고, 보다 바람직한 인간화 항체의 예로는 hLA212_H2/L1 내지 hLA212_H2/L5, hLA212_H3/L1 내지 hLA212_H3/L5 및 hLA212_H4/L2 (아래의 [i] 내지 [x] 참조) 를 들 수 있지만, 그것들에 한정되는 것은 아니며, 예를 들어, hLA212_H2/L1 내지 hLA212_H2/L5, hLA212_H3/L1 내지 hLA212_H3/L5 및 hLA212_H4/L2 중 어느 하나의 인간화 항체의 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬, 그리고 hLA212_H2/L1 내지 hLA212_H2/L5, hLA212_H3/L1 내지 hLA212_H3/L5 및 hLA212_H4/L2 중 어느 하나의 인간화 항체의 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬을 포함하여 이루어지는 항체도, 본 발명의 보다 바람직한 인간화 항체에 포함된다.
[i]
[i 의 1] hLA212_H3/L2 는 실시예 6 에 있어서 얻어진 인간화 항체이다. 당해 항체의 중사슬의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 29 (도 44) 의 뉴클레오티드 번호 58 내지 1410 (중 가변 영역은 58 내지 420) 을, 아미노산 서열은 서열 번호 30 (도 45) 의 아미노산 번호 20 내지 470 (중 가변 영역은 20 내지 140) 을, 경사슬의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 33 (도 48) 의 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 (중 가변 영역은 61 내지 387) 를, 아미노산 서열은 서열 번호 34 (도 49) 의 아미노산 번호 21 내지 234 (중 가변 영역은 21 내지 129) 를, 각각 포함하고 있다. 그 항체는 본 발명의 의약 조성물, 치료 또는 예방의 방법, 치료 또는 예방을 위한 사용 등에 적합한 물성 (데이터로 나타내지 않음), (3-2), 및 (3-3) 에 기재된 LAG-3 결합 활성 및 인·비트로 ADCC 활성 활성을 갖고 또한 (3-8) 에 기재된 성질 즉 그 항체 존재하에서 인간 LAG-3 은 인간 T 세포 억제 기능을 발휘하고 (실시예 참조), (3-4) 내지 (3-7) 에 기재된 활성, 성질 등을 가지고 있는 것은, 예를 들어, 실시예에 기재된 방법에 의해 평가할 수 있다.
[i 의 2] hLA212_H4/L2 는, 실시예 8 에 있어서 얻어진, 당 사슬 수식이 조절된 인간화 항체이고, 저푸코오스 형태에 있는 hLA212_H3/L2 의 하나이다. 당해 항체의 중사슬의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 29 (도 44) 의 뉴클레오티드 번호 58 내지 1410 (중 가변 영역은 58 내지 420) 을, 아미노산 서열은 서열 번호 30 (도 45) 의 아미노산 번호 20 내지 470 (중 가변 영역은 20 내지 140) 을, 경사슬의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 33 (도 48) 의 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 (중 가변 영역은 61 내지 387) 를, 아미노산 서열은 서열 번호 34 (도 49) 의 아미노산 번호 21 내지 234 (중 가변 영역은 21 내지 129) 를, 각각 포함하고 있다. 그 항체는 본 발명의 의약 조성물, 치료 또는 예방의 방법, 치료 또는 예방을 위한 사용 등에 적합한 물성 (데이터로 나타내지 않음), (3-2) 내지 (3-5) 에 기재된 LAG-3 결합 활성, 인·비트로 ADCC 활성, 인·비보 LAG3-양성 세포수 저감 활성, 그리고 인·비보 실험적 자기 면역성 뇌척수염 억제 활성을 갖고 (실시예 참조), (3-6) 에 기재된 인간 활성화 T 세포 결합 활성을 가지고 있는 것, (3-7) 및 (3-8) 에 기재된 성질 즉 그 항체의 존재하에서 인간 LAG-3 이 소정의 활성을 나타내는 것은, 예를 들어, 실시예에 기재된 방법에 의해 평가할 수 있다.
[ii] hLA212_H2/L1 은 실시예 6 에 있어서 얻어진 인간화 항체이다. 당해 항체의 중사슬의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 27 (도 42) 의 뉴클레오티드 번호 58 내지 1410 (중 가변 영역은 58 내지 420) 을, 아미노산 서열은 서열 번호 28 (도 43) 의 아미노산 번호 20 내지 470 (중 가변 영역은 20 내지 140) 을, 경사슬의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 31 (도 46) 의 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 (중 가변 영역은 61 내지 387) 를, 아미노산 서열은 서열 번호 32 (도 47) 의 아미노산 번호 21 내지 234 (중 가변 영역은 21 내지 129) 를, 각각 포함하고 있다. 그 항체는 본 발명의 의약 조성물, 치료 또는 예방의 방법, 치료 또는 예방을 위한 사용 등에 적합한 물성 (데이터로 나타내지 않음), (3-2) 및 (3-3) 에 기재된 LAG-3 결합 활성 및 인·비트로 ADCC 활성을 갖고 (실시예 참조), (3-4) 내지 (3-8) 에 기재된 활성, 성질 등을 가지고 있는 것은, 예를 들어, 실시예에 기재된 방법에 의해 평가할 수 있다.
[iii] hLA212_H3/L3 은 실시예 6 에 있어서 얻어진 인간화 항체이다. 당해 항체의 중사슬의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 29 (도 44) 의 뉴클레오티드 번호 58 내지 1410 (중 가변 영역은 58 내지 420) 을, 아미노산 서열은 서열 번호 30 (도 45) 의 아미노산 번호 20 내지 470 (중 가변 영역은 20 내지 140) 을, 경사슬의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 35 (도 50) 의 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 (중 가변 영역은 61 내지 387) 를, 아미노산 서열은 서열 번호 36 (도 51) 의 아미노산 번호 21 내지 234 (중 가변 영역은 21 내지 129) 를, 각각 포함하고 있다. 그 항체는 본 발명의 의약 조성물, 치료 또는 예방의 방법, 치료 또는 예방을 위한 사용 등에 적합한 물성 (데이터로 나타내지 않음), (3-2) 및 (3-3) 에 기재된 LAG-3 결합 활성 및 인·비트로 ADCC 활성을 갖고 (실시예 참조), (3-4) 내지 (3-8) 에 기재된 활성, 성질 등을 가지고 있는 것은, 예를 들어, 실시예에 기재된 방법에 의해 평가할 수 있다.
[iv] hLA212_H2/L2 는 실시예 6 에 있어서 얻어진 인간화 항체이다. 당해 항체의 중사슬의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 27 (도 42) 의 뉴클레오티드 번호 58 내지 1410 (중 가변 영역은 58 내지 420) 을, 아미노산 서열은 서열 번호 28 (도 43) 의 아미노산 번호 20 내지 470 (중 가변 영역은 20 내지 140) 을, 경사슬의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 33 (도 48) 의 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 (중 가변 영역은 61 내지 387) 를, 아미노산 서열은 서열 번호 34 (도 49) 의 아미노산 번호 21 내지 234 (중 가변 영역은 21 내지 129) 를, 각각 포함하고 있다. 그 항체는 본 발명의 의약 조성물, 치료 또는 예방의 방법, 치료 또는 예방을 위한 사용 등에 적합한 물성 (데이터로 나타내지 않음), (3-2) 및 (3-3) 에 기재된 LAG-3 결합 활성 및 인·비트로 ADCC 활성을 갖고 (실시예 참조), (3-4) 내지 (3-8) 에 기재된 활성, 성질 등을 가지고 있는 것은, 예를 들어, 실시예에 기재된 방법에 의해 평가할 수 있다.
[v] hLA212_H2/L3 은 실시예 6 에 있어서 얻어진 인간화 항체이다. 당해 항체의 중사슬의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 27 (도 42) 의 뉴클레오티드 번호 58 내지 1410 (중 가변 영역은 58 내지 420) 을, 아미노산 서열은 서열 번호 28 (도 43) 의 아미노산 번호 20 내지 470 (중 가변 영역은 20 내지 140) 을, 경사슬의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 35 (도 50) 의 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 (중 가변 영역은 61 내지 387) 를, 아미노산 서열은 서열 번호 36 (도 51) 의 아미노산 번호 21 내지 234 (중 가변 영역은 21 내지 129) 를, 각각 포함하고 있다. 그 항체는 본 발명의 의약 조성물, 치료 또는 예방의 방법, 치료 또는 예방을 위한 사용 등에 적합한 물성 (데이터로 나타내지 않음), (3-2) 및 (3-3) 에 기재된 LAG-3 결합 활성 및 인·비트로 ADCC 활성을 갖고 (실시예 참조), (3-4) 내지 (3-8) 에 기재된 활성, 성질 등을 가지고 있는 것은, 예를 들어, 실시예에 기재된 방법에 의해 평가할 수 있다.
[vi] hLA212_H2/L4 는 실시예 6 에 있어서 얻어진 인간화 항체이다. 당해 항체의 중사슬의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 27 (도 42) 의 뉴클레오티드 번호 58 내지 1410 (중 가변 영역은 58 내지 420) 을, 아미노산 서열은 서열 번호 28 (도 43) 의 아미노산 번호 20 내지 470 (중 가변 영역은 20 내지 140) 을, 경사슬의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 37 (도 52) 의 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 (중 가변 영역은 61 내지 387) 를, 아미노산 서열은 서열 번호 38 (도 53) 의 아미노산 번호 21 내지 234 (중 가변 영역은 21 내지 129) 를, 각각 포함하고 있다. 그 항체는 본 발명의 의약 조성물, 치료 또는 예방의 방법, 치료 또는 예방을 위한 사용 등에 적합한 물성 (데이터로 나타내지 않음), (3-2) 및 (3-3) 에 기재된 LAG-3 결합 활성 및 인·비트로 ADCC 활성을 갖고 (실시예 참조), (3-4) 내지 (3-8) 에 기재된 활성, 성질 등을 가지고 있는 것은, 예를 들어, 실시예에 기재된 방법에 의해 평가할 수 있다.
[vii] hLA212_H2/L5 는 실시예 6 에 있어서 얻어진 인간화 항체이다. 당해 항체의 중사슬의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 27 (도 42) 의 뉴클레오티드 번호 58 내지 1410 (중 가변 영역은 58 내지 420) 을, 아미노산 서열은 서열 번호 28 (도 43) 의 아미노산 번호 20 내지 470 (중 가변 영역은 20 내지 140) 을, 경사슬의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 39 (도 54) 의 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 (중 가변 영역은 61 내지 387) 를, 아미노산 서열은 서열 번호 40 (도 55) 의 아미노산 번호 21 내지 234 (중 가변 영역은 21 내지 129) 를, 각각 포함하고 있다. 그 항체는 본 발명의 의약 조성물, 치료 또는 예방의 방법, 치료 또는 예방을 위한 사용 등에 적합한 물성 (데이터로 나타내지 않음), (3-2) 및 (3-3) 에 기재된 LAG-3 결합 활성 및 인·비트로 ADCC 활성을 갖고 (실시예 참조), (3-4) 내지 (3-8) 에 기재된 활성, 성질 등을 가지고 있는 것은, 예를 들어, 실시예에 기재된 방법에 의해 평가할 수 있다.
[viii] hLA212_H3/L1 은 실시예 6 에 있어서 얻어진 인간화 항체이다. 당해 항체의 중사슬의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 29 (도 44) 의 뉴클레오티드 번호 58 내지 1410 (중 가변 영역은 58 내지 420) 을, 아미노산 서열은 서열 번호 30 (도 45) 의 아미노산 번호 20 내지 470 (중 가변 영역은 20 내지 140) 을, 경사슬의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 31 (도 46) 의 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 (중 가변 영역은 61 내지 387) 를, 아미노산 서열은 서열 번호 32 (도 47) 의 아미노산 번호 21 내지 234 (중 가변 영역은 21 내지 129) 를, 각각 포함하고 있다. 그 항체는 본 발명의 의약 조성물, 치료 또는 예방의 방법, 치료 또는 예방을 위한 사용 등에 적합한 물성 (데이터로 나타내지 않음), (3-2) 및 (3-3) 에 기재된 LAG-3 결합 활성 및 인·비트로 ADCC 활성을 갖고 (실시예 참조), (3-4) 내지 (3-8) 에 기재된 활성, 성질 등을 가지고 있는 것은, 예를 들어, 실시예에 기재된 방법에 의해 평가할 수 있다.
[ix] hLA212_H3/L4 는 실시예 6 에 있어서 얻어진 인간화 항체이다. 당해 항체의 중사슬의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 29 (도 44) 의 뉴클레오티드 번호 58 내지 1410 (중 가변 영역은 58 내지 420) 을, 아미노산 서열은 서열 번호 30 (도 45) 의 아미노산 번호 20 내지 470 (중 가변 영역은 20 내지 140) 을, 경사슬의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 37 (도 52) 의 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 (중 가변 영역은 61 내지 387) 를, 아미노산 서열은 서열 번호 38 (도 53) 의 아미노산 번호 21 내지 234 (중 가변 영역은 21 내지 129) 를, 각각 포함하고 있다. 그 항체는 본 발명의 의약 조성물, 치료 또는 예방의 방법, 치료 또는 예방을 위한 사용 등에 적합한 물성 (데이터로 나타내지 않음), (3-2) 및 (3-3) 에 기재된 LAG-3 결합 활성 및 인·비트로 ADCC 활성을 갖고 (실시예 참조), (3-4) 내지 (3-8) 에 기재된 활성, 성질 등을 가지고 있는 것은, 예를 들어, 실시예에 기재된 방법에 의해 평가할 수 있다.
[x] hLA212_H3/L5 는 실시예 6 에 있어서 얻어진 인간화 항체이다. 당해 항체의 중사슬의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 29 (도 44) 의 뉴클레오티드 번호 58 내지 1410 (중 가변 영역은 58 내지 420) 을, 아미노산 서열은 서열 번호 30 (도 45) 의 아미노산 번호 20 내지 470 (중 가변 영역은 20 내지 140) 을, 경사슬의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 39 (도 54) 의 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 (중 가변 영역은 61 내지 387) 를, 아미노산 서열은 서열 번호 40 (도 55) 의 아미노산 번호 21 내지 234 (중 가변 영역은 21 내지 129) 를, 각각 포함하고 있다. 그 항체는 본 발명의 의약 조성물, 치료 또는 예방의 방법, 치료 또는 예방을 위한 사용 등에 적합한 물성 (데이터로 나타내지 않음), (3-2) 및 (3-3) 에 기재된 LAG3-결합 활성 및 인·비트로 ADCC 활성을 갖고 (실시예 참조), (3-4) 내지 (3-8) 에 기재된 활성, 성질 등을 가지고 있는 것은, 예를 들어, 실시예에 기재된 방법에 의해 평가할 수 있다.
상기 [i] 내지 [x] 등에 있어서, (3-4) 및 (3-5) 에 기재된 활성은, 바람직하게는 저푸코오스 형태에 있어서 평가할 수 있다.
본 발명에 있어서 「물성」 이란, 본 발명의 항체 및 그 결합 단편 등의 모노로서의 안정성을 의미하고, 공지된 지표를 사용하여 평가할 수 있다. 모노로서의 안정성으로서 열안정성, 보존 안정성 등을 들 수 있고, 그들의 지표로는 서모그램으로부터 도출되는 Tm 값, 보존 조건하 또는 가속 열화 조건하에서의 항원 결합 활성의 변화 또는 시간 경과적 변화 등을 들 수 있다.
또, hLA212 항체_H4/L2 를 실시예 10 의 인간 LAG-3/인간 FcγRIIIA 더블 트랜스제닉 마우스에 단회 투여한 결과, 체중 감소, 그 밖의 현저한 독성 소견은 관찰되지 않았다. 이와 같이 본 발명의 인간화 항체는, LAG-3 양성 세포에 관련되는 질환 (다른 지점에서 정의되고 있다) 의 치료 또는 예방의 방법, 이러한 치료 또는 예방을 위한 사용, 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물 등에 적합한 안전성을 구비하고 있다.
상기 서술한 본 발명의 보다 바람직한 인간화 항 LAG-3 항체 및 그 결합 단편 중, 보다 한층 바람직한 것은 hLA212_H3/L2, hLA212_H2/L1, hLA212_H3/L3, hLA212_H3/L6 및 hLA212_H4/L2 이다.
본 발명의 보다 바람직한 인간화 항 LAG-3 항체의 범위에 포함되는 hLA212_H2/L1 내지 H2/L5, hLA212_H3/L1 내지 H3/L5 및 hLA212_H4/L2 등은, 중사슬의 아미노산 서열 중 FRL1 내지 FRL4 에 있어서, 1 내지 수 개, 바람직하게는 1 또는 2 개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬, 그리고 경사슬의 아미노산 서열 중 FRH1 내지 FRH4 에 있어서, 1 개 이상, 바람직하게는 1 내지 14 개 중 임의의 개수의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함할 수 있다.
이러한 인간화 항체의 보다 바람직한 경사슬에 있어서는, FRL1 의 제 1 번 아미노산 즉 성숙 가변 영역의 제 1 번 아미노산 (서열 번호 32 또는 도 47 의 제 21 번의 위치에 상당하는 아미노산) 이 Asp 또는 Asn 이고, FRL1 의 제 11 번 아미노산 즉 성숙 가변 영역의 제 11 번 아미노산 (서열 번호 32 또는 도 47 의 제 31 번의 위치에 상당하는 아미노산) 이 Leu 또는 Met 이고, FRL1 의 제 13 번 아미노산 즉 성숙 가변 영역의 제 13 번 아미노산 (서열 번호 32 또는 도 47 의 제 33 번의 위치에 상당하는 아미노산) 이 Ala 또는 Ile 이고, FRL1 의 제 21 번 아미노산 즉 성숙 가변 영역의 제 21 번 아미노산 (서열 번호 32 또는 도 47 의 제 41 번의 위치에 상당하는 아미노산) 이 Ile 또는 Met 이고, FRL2 의 제 4 번 아미노산 즉 성숙 가변 영역의 제 38 번 아미노산 (서열 번호 32 또는 도 47 의 제 58 번의 위치에 상당하는 아미노산) 이 Gln 또는 Lys 이고, FRL2 의 제 9 번 아미노산 즉 성숙 가변 영역의 제 43 번 아미노산 (서열 번호 32 또는 도 47 의 제 63 번의 위치에 상당하는 아미노산) 이 Ala 또는 Ser 이고, FRL3 의 제 4 번 아미노산 즉 성숙 가변 영역의 제 60 번 아미노산 (서열 번호 32 또는 도 47 의 제 80 번의 위치에 상당하는 아미노산) 이 Ser 또는 Asp 이고, FRL3 의 제 9 번 아미노산 즉 성숙 가변 영역의 제 65 번 아미노산 (서열 번호 32 또는 도 47 의 제 85 번의 위치에 상당하는 아미노산) 이 Ser 또는 Gly 이고, FRL3 의 제 11 번 아미노산 즉 성숙 가변 영역의 제 67 번 아미노산 (서열 번호 32 또는 도 47 의 제 87 번의 위치에 상당하는 아미노산) 이 Ser 또는 Tyr 이고, FRL3 의 제 22 번 아미노산 즉 성숙 가변 영역의 제 78 번 아미노산 (서열 번호 32 또는 도 47 의 제 98 번의 위치에 상당하는 아미노산) 이 Leu 또는 Val 이고, FRL3 의 제 27 번 아미노산 즉 성숙 가변 영역의 제 83 번 아미노산 (서열 번호 32 또는 도 47 의 제 103 번의 위치에 상당하는 아미노산) 이 Phe 또는 Ala 이고, FRL3 의 제 29 번 아미노산 즉 성숙 가변 영역의 제 85 번 아미노산 (서열 번호 32 또는 도 47 의 제 105 번의 위치에 상당하는 아미노산) 이 Thr 또는 Phe 이고, FRL4 의 제 7 번 아미노산 즉 성숙 가변 영역의 제 104 번 아미노산 (서열 번호 32 또는 도 47 의 제 124 번의 위치에 상당하는 아미노산) 이 Val 또는 Leu 이고, FRL4 의 제 9 번 아미노산 즉 성숙 가변 영역의 제 106 번 아미노 (서열 번호 32 또는 도 47 의 제 126 번의 위치에 상당하는 아미노산 )이 Ile 또는 Leu 이다.
이러한 인간화 항체의 보다 바람직한 중사슬에 있어서는, FRH2 의 제 14 번 아미노산 즉 성숙 가변 영역의 제 49 번 아미노산 (서열 번호 28 또는 도 43 의 제 68 번의 위치에 상당하는 아미노산) 이 Gly 또는 Ala 이고, FRH3 의 제 25 번 아미노산 즉 성숙 가변 영역의 제 84 번 아미노산 (서열 번호 28 또는 도 43 의 제 103 번의 위치에 상당하는 아미노산) 이 Asn 또는 Asp 이다.
본 발명의 rLA204, rLA212, rLA225, rLA869, rLA1264, cLA204, cLA212, cLA225, cLA869 및 rLA1264, 그리고 인간화 hLA212_H2/L1 내지 hLA212_H2/L5, hLA212_H3/L1 내지 hLA212_H3/L5 및 hLA212_H4/L2 중 어느 하나에 기재된 항체의 중사슬 및/또는 경사슬의 전체 길이 또는 가변 영역의 아미노산 서열 각각 80 ％ 이상, 82 ％ 이상, 84 ％ 이상, 86 ％ 이상, 88 ％ 이상, 90 ％ 이상, 92 ％ 이상, 94 ％ 이상, 96 ％ 이상, 98 ％ 이상 또는 99 ％ 이상의 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 및/또는 경사슬을 포함하고, 또한 LAG-3 에 결합하는 항체 또는 그 결합 단편도 본 발명에 포함된다. 이러한 서열 동일성은, 바람직하게는 94 ％ 이상, 보다 바람직하게는 96 ％ 이상, 보다 한층 바람직하게는 98 ％ 이상, 최적으로는 99 ％ 이상이다. 또, 그들의 항체 또는 그 결합 단편은, (3-2), (3-3) 및 (3-8), 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 내지 (3-7) 의 하나 이상, 보다 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 및/또는 (3-5), 보다 한층 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 및 (3-5), 나아가 보다 한층 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 및 (3-5) 그리고 (3-6) 및/또는 (3-7), 최적으로는 (3-2) 내지 (3-8) 모두에 기재된 성질, 기능, 활성 등을 각각 갖는다.
2 종류의 아미노산 서열간의 동일성 혹은 상동성은, Blast algorithm version 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), 「Gapped BLAST and PSI-BLAST : a new generation of protein database search programs」, Nucleic Acids Res.25 : 3389-3402) 의 디폴트 파라미터를 사용함으로써 결정할 수 있다. Blast algorithm 은, 예를 들어, 인터넷으로 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ 에 액세스함으로써도 사용할 수 있다.
본 발명의 rLA204, rLA212, rLA225, rLA869, rLA1264, cLA204, cLA212, cLA225, cLA869, 및 cLA1264, 그리고 hLA212_H2/L1 내지 hLA212_H2/L5, hLA212_H3/L1 내지 hLA212_H3/L5 및 hLA212_H4/L2 중 어느 하나에 기재된 항체의 중사슬 및/또는 경사슬의 전체 길이 또는 가변 영역의 아미노산 서열에 있어서 각각 1 내지 50 개, 1 내지 45 개, 1 내지 40 개, 1 내지 35 개, 1 내지 30 개, 1 내지 25 개, 1 내지 20 개, 1 내지 15 개, 1 내지 10 개, 1 내지 8 개, 1 내지 6 개, 1 내지 5 개, 1 내지 4 개, 1 내지 3 개, 1 혹은 2 개, 또는 1 개의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입하여 이루어지는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 및/또는 경사슬을 포함하고, 또한 LAG-3 에 결합하는 항체 또는 그 결합 단편도, 본 발명에 포함된다. 이러한 아미노산 변이는 바람직하게는 치환이고, 변이되는 아미노산의 개수는 바람직하게는 1 내지 5 개, 보다 바람직하게는 1 내지 4 개, 보다 한층 바람직하게는 1 내지 3 개, 나아가 보다 한층 바람직하게는 1 내지 2 개, 최적으로는 1 개이다. 또, 그들의 항체 또는 그 결합 단편은, (3-2), (3-3) 및 (3-8), 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 내지 (3-7) 의 1 개 이상, 보다 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 및/또는 (3-5), 보다 한층 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 및 (3-5), 나아가 보다 한층 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 및 (3-5) 그리고 (3-6) 및/또는 (3-7), 최적으로는 (3-2) 내지 (3-8) 모두에 기재된 성질, 기능, 활성 등을 각각 갖는다.
본 발명의 rLA204, rLA212, rLA225, rLA869, rLA1264, cLA204, cLA212, cLA225, cLA869 및 cLA1264, 그리고 hhLA212_H2/L1 내지 hLA212_H2/L5, hLA212_H3/L1 내지 hLA212_H3/L5 및 hLA212_H4/L2 중 어느 하나에 기재된 항체의 중사슬 및/또는 경사슬의 전체 길이 또는 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 뉴클레오티드와 각각 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 뉴클레오티드가 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코드되는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 및/또는 경사슬을 포함하고, 또한 LAG-3 에 결합하는 항체 또는 그 결합 단편도, 본 발명에 포함된다. 그들의 항체 또는 그 결합 단편은, (3-2), (3-3) 및 (3-8), 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 내지 (3-7) 의 1 개 이상, 보다 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 및/또는 (3-5), 보다 한층 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 및 (3-5), 나아가 보다 한층 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 및 (3-5) 그리고 (3-6) 및/또는 (3-7), 최적으로는 (3-2) 내지 (3-8) 모두에 기재된 성질, 기능, 활성 등을 각각 갖는다.
본 발명은 다른 하나의 양태에 있어서, 인간 항체 또는 그 결합 단편을 제공한다. 본 발명의 인간 항체 또는 그 결합 단편은, LAG-3 에 결합하는 인간 유래의 항체 또는 그 결합 단편이면 특별히 한정되는 것은 아니지만, (3-2), (3-3) 및 (3-8), 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 내지 (3-7) 의 1 개 이상, 보다 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 및/또는 (3-5), 보다 한층 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 및 (3-5), 나아가 보다 한층 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 및 (3-5) 그리고 (3-6) 및/또는 (3-7), 최적으로는 (3-2) 내지 (3-8) 모두에 기재된 성질, 기능, 활성 등을 각각 갖는다.
(3-13) 에피토프에 결합하는 항체
본 발명이 제공하는 항체와 「동일한 부위에 결합하는 항체」 도 본 발명의 항체에 포함된다. 어느 항체와 「동일한 부위에 결합하는 항체」 란, 그 항체가 인식하는 항원 분자상의 부위에 결합하는 다른 항체를 의미한다. 제 1 항체가 결합하는 항원 분자상의 부분 펩티드 또는 부분 입체 구조에 제 2 항체가 결합하면, 제 1 항체와 제 2 항체는 동일한 부위에 결합한다고 판정할 수 있다. 또, 제 1 항체의 항원에 대한 결합에 대해 제 2 항체가 경합하는, 즉, 제 2 항체가 제 1 항체와 항원의 결합을 방해하는 것을 확인함으로써, 구체적인 결합 부위의 펩티드 서열 또는 입체 구조가 결정되어 있지 않아도, 제 1 항체와 제 2 항체가 동일한 부위에 결합한다고 판정할 수 있다. 또한 제 1 항체와 제 2 항체가 동일한 부위에 결합하고, 또한 제 1 항체가 그 존재하에서도 LAG-3 이 T 세포 억제 기능을 발휘하는 등 본 발명의 항체의 하나의 양태에 특징적인 효과를 갖는 경우, 제 2 항체도 동일한 활성을 가질 개연성은 매우 높다. 따라서, 제 1 항 LAG-3 항체가 결합하는 부위에 제 2 항 LAG-3 항체가 결합하면, 제 1 항체와 제 2 항체가 LAG-3 단백질상의 동일한 부위에 결합한다고 판정할 수 있다. 또, 제 1 항 LAG-3 항체의 LAG-3 단백질에 대한 결합에 대해 제 2 항 LAG-3 항체가 경합하는 것을 확인할 수 있으면, 제 1 항체와 제 2 항체가 LAG-3 단백질상의 동일한 부위에 결합하는 항체로 판정할 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체가 인식하는 LAG-3 단백질상의 부위에 결합하는 항체도 본 발명에 포함된다. 그러한 항체 및 그 결합 단편은, (3-2), (3-3) 및 (3-8), 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 내지 (3-7) 의 1 개 이상, 보다 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 및/또는 (3-5), 보다 한층 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 및 (3-5), 나아가 보다 한층 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 및 (3-5) 그리고 (3-6) 및/또는 (3-7), 최적으로는 (3-2) 내지 (3-8) 모두에 기재된 성질, 기능, 활성 등을 각각 갖는다.
항체의 결합 부위는, 면역 어세이법 등 당업자에게 주지된 방법에 의해 결정할 수 있다. 예를 들어, 항원의 아미노산 서열을 C 말 또는 N 말부터 적절히 깎아서 이루어지는 일련의 펩티드를 제조하고, 그것들에 대한 항체의 반응성을 검토하여, 대략적인 인식 부위를 결정한 후에, 추가로 짧은 펩티드를 합성하여 그들의 펩티드에 대한 항체의 반응성을 검토함으로써, 결합 부위를 결정할 수 있다. 항원 단편 펩티드는, 유전자 재조합, 펩티드 합성 등의 기술을 사용하여 조제할 수 있다.
항체가 항원의 부분 고차 구조에 결합 또는 인식하고 있는 경우, 이러한 항체의 결합 부위는, X 선 구조 해석을 사용하여, 당해 항체에 인접하는 항원상의 아미노산 잔기를 특정함으로써 결정할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 그 단편 및 항원 또는 그 단편을 결합시켜 결정화하고, 구조 해석을 실시함으로써, 항체와 상호 작용 거리를 갖는 항원상의 아미노산 잔기를 특정할 수 있다. 상호 작용 거리는 8 Å 이하이고, 바람직하게는 6 Å 이하이고, 보다 바람직하게는 4 Å 이하이다. 그러한 항체와의 상호 작용 거리를 갖는 아미노산 잔기는 1 개 또는 그 이상에서 항체의 항원 결합 부위 (에피토프) 를 구성할 수 있다. 이러한 아미노산 잔기가 2 개 이상인 경우, 각 아미노산은 1 차 서열 상에서 서로 인접하고 있지 않아도 된다.
본 발명의 항체의 에피토프는, 인간 LAG-3 또는 그 아미노산 서열 중에 존재한다. 이러한 에피토프에 결합하거나, 이러한 에프토프에 대한 결합에 있어서 본 발명의 항체와 경합하거나, 또는 이러한 아미노산 잔기와 상호 작용 거리를 갖는 항체, 그 결합 단편 또는 그 수식체도, 본 발명의 항체, 그 결합 단편 또는 그 수식체에 포함된다.
(3-14) 항체의 수식체
본 발명은, 항체 또는 그 결합 단편의 수식체를 제공한다. 본 발명의 항체 또는 그 결합 단편의 수식체란, 본 발명의 항체 또는 그 결합 단편에 화학적 또는 생물학적인 수식이 실시되어 이루어지는 것을 의미한다. 화학적인 수식체에는, 아미노산 골격에 대한 화학 부분의 결합, N- 결합 또는 O- 결합 탄수화물 사슬의 화학 수식체 등이 포함된다. 생물학적인 수식체에는, 번역 후 수식 (예를 들어, N- 결합 또는 O- 결합에 대한 당 사슬 부가, N 말 또는 C 말의 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성화, 메티오닌의 산화) 된 것, 원핵 생물 숙주 세포를 사용하여 발현시킴으로써 N 말에 메티오닌 잔기가 부가된 것 등이 포함된다. 또, 본 발명의 항체 또는 항원의 검출 또는 단리를 가능하게 하기 위해서 표지된 것, 예를 들어, 효소 표지체, 형광 표지체, 어피니티 표지체도 이러한 수식물의 의미에 포함된다. 이와 같은 본 발명의 항체 또는 그 결합 단편의 수식물은, 원래의 본 발명의 항체 또는 그 결합 단편의 안정성 및 혈중 체류성의 개선, 항원성의 저감, 이러한 항체 또는 항원의 검출 또는 단리 등에 유용하다.
화학적 수식체에 포함되는 화학 부분으로는, 폴리에틸렌글리콜, 에틸렌글리콜/프로필렌글리콜 코폴리머, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐알코올 등의 수용성 폴리머를 예시할 수 있다.
생물학적인 수식체로는, 효소 처리나 세포 처리 등에 의해 수식이 실시된 것, 유전자 재조합에 의해 태그 등 다른 펩티드가 부가된 융합체, 그리고 내인성 또는 외래성의 당 사슬 수식 효소를 발현하는 세포를 숙주로 하여 조제된 것 등을 들 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그 결합 단편에 결합하고 있는 당 사슬 수식을 조절하는 것 (글리코실화, 탈푸코오스화 등) 에 의해, 항체 의존성 세포 상해 활성을 증강시키는 것이 가능하다. 항체의 당 사슬 수식의 조절 기술로는, 예를 들어, WO99/54342, WO00/61739, WO02/31140 등에 기재된 방법이 알려져 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 항체의 수식체에는 당해 당 사슬 수식이 조절된 항체도 포함된다.
이러한 수식은, 항체 또는 그 결합 단편에 있어서의 임의의 위치에, 또는 원하는 위치에 있어서 실시되어도 되고, 1 개 또는 2 개 이상의 위치에 동일 또는 2 종 이상의 상이한 수식이 이루어져도 된다.
본 발명에 있어서 「항체 단편의 수식체」 는 「항체의 수식체의 단편」 도 그 의미에 포함하는 것이다.
본 발명에 있어서는 항체의 수식체, 그 결합 단편의 수식체를, 간단히 「항체」, 「항체의 결합 단편」 이라고 부르는 경우가 있다.
전술한 바와 같이, hLA212_H4/L2 는 실시예 8 에 있어서 얻어진, 당 사슬 수식이 조절된 인간화 항체이다. 그 인간화 항체도, 본 발명의 항체에 포함된다.
이상과 같은 본 발명의 항체, 그 결합 단편, 및 그 수식체는, 바람직하게는, 본 발명의 의약 조성물, 치료 또는 예방의 방법, 치료 또는 예방을 위한 사용 등에 적합한 물성, 체내 동태, 혈중 체류성, 안전성 등을 갖는다.
4. 항체의 제조 방법
(4-1) 하이브리도마를 사용하는 방법
본 발명의 항 LAG-3 항체는, 콜러와 밀스테인의 방법 (Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, p.495-497, Kennet, R. ed., Monoclonal Antibody, p.365-367, Prenum Press, N. Y. (1980)) 에 따라, LAG-3 단백질 또는 그 가용형 폼으로 면역한 동물의 비장으로부터 항 LAG-3 항체의 산생 세포를 단리하고, 그 세포와 미엘로마 세포를 융합시킴으로써 하이브리도마를 수립하고, 이러한 하이브리도마의 배양물로부터 모노클로날 항체를 취득할 수 있다.
(4-1-1) 항원의 조제
항 LAG-3 항체를 제조하기 위한 항원은, 본 발명의 다른 부분에 기재된 천연형 또는 재조합형의 LAG-3 단백질의 조제법 등에 따라 취득할 수 있다. 그와 같이 하여 조제할 수 있는 항원으로는, LAG-3 단백질 혹은 그 적어도 6 개의 연속된 부분 아미노산 서열을 포함하는 것으로 이루어지는 LAG-3 단백질 단편, 또는 그것들에 임의의 아미노산 서열이나 담체가 부가된 유도체 등 (이하, 종합하여 「LAG-3 항원」 이라고 부른다) 을 들 수 있다.
재조합형 LAG-3 항원은, LAG-3 항원이 갖는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열이 포함되는 유전자를 숙주 세포에 도입하고, 그 세포의 배양물로부터 그 항원을 회수함으로써, 조제할 수 있다. 이러한 재조합형 항원은, 면역 글로블린의 Fc 영역 등 다른 단백질과의 융합 단백질이어도 된다. 또, LAG-3 항원의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열이 포함되는 유전자를 인·비트로 (in vitro) 번역계에 의해 무세포계에 있어서 얻어지는 LAG-3 항원도 재조합형 LAG-3 항원에 포함된다. 비재조합형 LAG-3 항원은, LAG-3 을 발현하고 있는 세포 등으로부터 정제, 단리할 수 있다.
그 존재하에서도 LAG-3 의 T 세포 기능 억제 기능이 발휘되거나, 혹은 LAG-3 의 T 세포 기능 억제 기능을 억제 또는 저해하지 않는 항 LAG-3 모노클로날 항체를 취득하기 위해, 바람직한 면역원으로서 예를 들어, 면역 글로블린형 도메인 1 및 2 를 결실시킨 LAG-3 변이체를 사용할 수 있다.
(4-1-2) 항 LAG-3 모노클로날 항체의 제조
모노클로날 항체의 제조는, 통상, 하기와 같은 공정을 거친다.
(a) 항원을 조제하는 공정,
(b) 항체 산생 세포를 조제하는 공정,
(c) 골수종 세포 (이하, 「미엘로마」 라고 한다) 를 조제하는 공정,
(d) 항체 산생 세포와 미엘로마를 융합시키는 공정,
(e) 목적으로 하는 항체를 산생하는 하이브리도마군을 선별하는 공정, 및
(f) 단일 세포 클론을 얻는 공정 (클로닝).
필요에 따라 추가로, (g) 하이브리도마의 배양 공정, 하이브리도마를 이식한 동물의 사육 공정 등, (h) 모노클로날 항체의 생물 활성의 측정 공정·판정 공정 등이 더해진다.
이하, 모노클로날 항체의 제조법을 상기 공정을 따라 상세히 서술하지만, 그 항체의 제조법은 이것에 제한되지 않고, 예를 들어 비세포 이외의 항체 산생 세포를 사용할 수도 있다.
(a) 항원의 정제
상기 (2-3) 에 기재된 LAG-3 단백질의 조제법에 준한다.
(b) 항체 산생 세포를 조제하는 공정
공정 (a) 에서 얻어진 항원과, 프로인드의 완전 또는 불완전 아쥬반트, 또는 칼리 명반과 같은 보조제를 혼합하고, 면역원으로서 실험 동물에 면역한다. 실험 동물은 공지된 하이브리도마 제조법에 사용되는 동물을 지장없이 사용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 마우스, 래트, 염소, 양, 소, 말 등을 사용할 수 있다. 단, 적출한 항체 산생 세포와 융합시키는 미엘로마 세포의 입수 용이성 등의 관점에서, 마우스 또는 래트를 피면역 동물로 하는 것이 바람직하다.
또, 실제로 사용하는 마우스 및 래트의 계통은 특별히 제한은 없고, 마우스의 경우에는, 예를 들어, A, AKR, BALB/c, BALB/cAnNCrj, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB, 129 등이, 래트의 경우에는, 예를 들어, Wistar, Low, Lewis, Spraque, Daweley, ACI, BN, Fischer 등을 사용할 수 있다.
이들 마우스 및 래트는 예를 들어 닛폰 클레아, 닛폰 찰스 리버 등 실험 동물 사육 판매업자로부터 입수할 수 있다.
이 중, 후술하는 미엘로마 세포와의 융합 적합성을 감안하면, 마우스에서는 BALB/c 계통이, 래트에서는 Wistar 및 Low 계통이 피면역 동물로서 특히 바람직하다.
또, 항원의 인간과 마우스에서의 상동성을 고려하여, 자기 항체를 제거하는 생체 기구를 저하시킨 마우스, 즉 자기 면역 질환 마우스를 사용하는 것도 바람직하다.
또한, 이들 마우스 또는 래트의 면역시의 주령은, 바람직하게는 5 내지 12 주령, 더욱 바람직하게는 6 내지 8 주령이다.
LAG-3 단백질로 동물을 면역하기 위해서는, 예를 들어, Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol.I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Spigfield, Illinois (1964) 등의 방법을 사용할 수 있다.
항체가의 측정법으로는, 예를 들어, RIA 법, ELISA 법 등의 면역 어세이를 들 수 있지만, 그들의 방법에 한정되는 것은 아니다.
면역된 동물로부터 분리된 비장 세포 또는 림프구에서 유래하는 항체 산생 세포는, 예를 들어, Kohleret al., Nature (1975) 256, p.495, ; Kohler et al., Eur. J. Immnol. (1977) 6, p.511,; Milstein et al., Nature (1977), 266, p.550, ; Walsh, Nature, (1977) 266, p.495,) 등의 공지된 방법에 따라 조제할 수 있다.
비장 세포의 경우에는, 비장을 세절 (細切) 하여 세포를 스테인리스 메시로 여과한 후, 이글 최소 필수 배지 (MEM) 등에 부유시켜 항체 산생 세포를 분리하는 일반적 방법을 채용할 수 있다.
(c) 미엘로마를 조제하는 공정
세포 융합에 사용하는 미엘로마 세포에는 특별한 한정은 없고, 공지된 세포주로부터 적절히 선택하여 사용할 수 있지만, 융합 세포로부터 하이브리도마를 선택할 때의 편리성을 고려하여, 그 선택 수속이 확립되어 있는 HGPRT (Hipoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase) 결손주, 즉 마우스 유래의 X63-Ag8 (X63), NS1-ANS/1 (NS1), P3X63-Ag8.Ul (P3Ul), X63-Ag8.653 (X63.653), SP2/0-Ag14 (SP2/0), MPC11-45.6TG1.7 (45.6TG), FO, S149/5XXO, BU.1 등, 래트 유래의 210.RSY3.Ag.1.2.3 (Y3) 등, 인간 유래의 U266AR (SKO-007), GM1500·GTG-A12 (GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2 (HMy2), 8226AR/NIP4-1 (NP41) 등을 사용하는 것이 바람직하다. 이들 HGPRT 결손주는 예를 들어, American Type Culture Collection (ATCC) 등으로부터 입수할 수 있다.
이들 세포주는, 적당한 배지, 예를 들어 8-아자구아닌 배지 [RPMI-1640 배지에 글루타민, 2-메르캅토에탄올, 겐타마이신, 및 우태아 혈청 (이하 「FBS」 라고 한다) 을 첨가한 배지에 8-아자구아닌을 첨가한 배지], 이스코브 개변 둘베코 배지 (Iscove's Modified Dulbecco's Medium ; 이하 「IMDM」 이라고 한다), 또는 둘베코 개변 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle Medium ; 이하 「DMEM」 이라고 한다) 로 계대 배양하지만, 세포 융합의 3 내지 4 일 전에 정상 배지 [예를 들어, 10 ％ FBS 를 포함하는 ASF104 배지 (아지노모토 (주) 사 제조)] 로 계대 배양하고, 융합 당일에 2 × 107 이상의 세포수를 확보해 둔다.
(d) 항체 산생 세포와 미엘로마 세포를 융합시키는 공정
항체 산생 세포와 미엘로마 세포의 융합은, 공지된 방법 (Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol.I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Spigfield, Illinois (1964) 등) 에 따라, 세포의 생존률을 극도로 저하시키지 않을 정도의 조건하에서 실시할 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜 등의 고농도 폴리머 용액 중에서 항체 산생 세포와 미엘로마 세포를 혼합하는 화학적 방법, 전기적 자극을 이용하는 물리적 방법 등을 사용할 수 있다.
(e) 목적으로 하는 항체를 산생하는 하이브리도마군을 선별하는 공정
세포 융합에 의해 얻어지는 하이브리도마의 선택 방법은 특별히 제한은 없지만, 통상 HAT (히포크산틴·아미노프테린·티미딘) 선택법 (Kohler et al., Nature (1975) 256, p.495 ; Milstein et al., Nature (1977) 266, p.550) 이 사용된다. 이 방법은, 아미노프테린에서 생존할 수 없는 HGPRT 결손주의 미엘로마 세포를 사용하여 하이브리도마를 얻는 경우에 유효하다. 즉, 미융합 세포 및 하이브리도마를 HAT 배지에서 배양함으로써, 아미노프테린에 대한 내성을 가진 하이브리도마만을 선택적으로 잔존시키고, 또한 증식시킬 수 있다.
(f) 단일 세포 클론을 얻는 공정 (클로닝)
하이브리도마의 클로닝법으로는, 예를 들어, 메틸셀룰로오스법, 연 (軟) 아가로오스법, 한계 희석법 등의 공지된 방법을 사용할 수 있지만 (예를 들어, Barbara, B. M. and Stanley, M. S. : Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company, San Francisco (1980) 참조), 바람직하게는 한계 희석법이다.
(g) 하이브리도마의 배양 공정, 하이브리도마를 이식한 동물의 사육 공정
선택된 하이브리도마를 배양함으로써, 모노클로날 항체를 산생할 수 있지만, 바람직하게는 원하는 하이브리도마를 클로닝하고 나서 항체의 산생에 제공한다.
이러한 하이브리도마가 산생하는 모노클로날 항체는, 그 하이브리도마의 배양물로부터 회수할 수 있다. 또, 그 모노클로날 항체 유전자가 도입된 세포의 배양물로부터 재조합 항체로서 회수할 수도 있다. 또한 동 계통의 마우스 (예를 들어, 상기의 BALB/cAnNCrj), 혹은 Nu/Nu 마우스의 복강 내에 하이브리도마를 주사하고, 그 하이브리도마를 증식시킴으로써, 그 복수로부터 회수할 수도 있다.
(h) 모노클로날 항체의 생물 활성의 측정 공정·판정 공정
각종 생물 시험을 목적에 따라 선택하고, 적용할 수 있다.
(4-2) 세포 면역법
천연형의 LAG-3 단백질을 발현하는 세포, 재조합형 LAG-3 단백질 또는 그 단편을 발현하는 세포 등을 면역원으로서 사용함으로써, 상기의 하이브리도마법에 의해 항 LAG-3 항체를 조제할 수 있다.
LAG-3 을 발현하고 있는 세포는, 1 × 105 내지 1 × 109 개, 바람직하게는 1 × 106 내지 1 × 108 개, 보다 바람직하게는 0.5 내지 2 × 107 개, 보다 한층 바람직하게는 1 × 107 개를 1 회의 면역에 사용하지만, LAG-3 단백질의 발현량에 따라 면역에 제공하는 세포수를 바꿀 수 있다. 이러한 면역원은, 일반적으로는 복강 내에 투여하지만, 피내 등에 투여할 수도 있다. 하이브리도마의 제조 수법으로는 (4-1-2) 에 기재된 방법을 적용할 수 있다.
(4-3) 유전자 재조합
본 발명의 항체는, 그 중사슬 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열이 포함되는 뉴클레오티드 (중사슬 뉴클레오티드) 및 그 경사슬 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열이 포함되는 뉴클레오티드 (경사슬 뉴클레오티드), 또는 이러한 중사슬 뉴클레오티드가 삽입된 벡터 및 경사슬 뉴클레오티드가 삽입된 벡터를 숙주 세포에 도입하고, 그 세포를 배양한 후 그 배양물로부터 이러한 항체를 회수함으로써 조제할 수 있다. 하나의 벡터에 중사슬 뉴클레오티드 및 경사슬 뉴클레오티드가 삽입되어 있어도 된다.
숙주 세포로는, 원핵 세포 또는 진핵 세포를 사용할 수 있다. 진핵 세포를 숙주로서 사용하는 경우, 동물 세포, 식물 세포, 진핵 미생물을 사용할 수 있다.
동물 세포로는, 예를 들어, 포유류 유래의 세포, 즉, 원숭이 유래의 COS 세포 (Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p.175-182, ATCC CRL-1650), 마우스 선유아 세포 NIH3T3 (ATCC No.CRL-1658), 마우스 NS0 세포주 (ECACC), 차이니즈·햄스터 난소 세포 (CHO 세포, ATCC CCL-61), 그 디하이드로 엽산 환원 효소 결손주 (CHOdhfr- : Urlaub, G. and Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1980) 77, p.4126-4220), CHOK1SV (Lonza Biologics), 닭 등 조류 유래의 세포, 곤충 유래의 세포 등을 들 수 있다.
또, 항체 등의 단백질의 당 사슬 수식을 조절하도록 개변된 세포도 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 중, 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 결합하고 있는 푸코오스를 줄이거나 또는 없애도록 개변된 CHO 세포를 사용하여 항체 등을 발현시키면, 저푸코오스화 또는 탈푸코오스화한 항체 (항체의 수식체라고도 부른다) 를 조제하는 것이 가능하다 (WO00/61739호, WO02/31140호 등).
진핵 미생물로는, 예를 들어, 효모 등을 들 수 있다.
원핵 세포로는, 예를 들어, 대장균, 고초균 등을 들 수 있다.
본 발명의 항체 (각종 동물 유래의 모노클로날 항체, 래트 항체, 마우스 항체, 키메라화 항체, 인간화 항체, 인간 항체 등) 를 분비시키기 위한 시그널 펩티드로는, 당해 항체와 동종, 동 타입 및 동 서브타입 항체의 분비 시그널, 그리고 당해 항체 자체의 분비 시그널에 한정되는 것은 아니며, 다른 타입 혹은 서브타입 항체의 분비 시그널, 또는 다른 진핵 생물종 혹은 원핵 생물 유래의 단백질의 분비 시그널이면, 임의의 것을 선택하여 이용할 수 있다.
(4-4) 인간화 항체의 디자인법 및 조제법
인간화 항체로는, 비인간 동물 항체의 CDR 만이 인간 유래의 항체에 삽입되는 항체 (Nature (1986) 321, p.522-525 참조), CDR 이식법에 의해 CDR 의 서열에 더하여 일부의 프레임 워크의 아미노산 잔기도 인간 항체에 이식한 항체 (WO90/07861호, US6972323호 참조), 그들 중 어느 것에 있어서의 비인간 동물 항체의 1 개 또는 2 개 이상의 아미노산이 인간형의 아미노산으로 치환되어 이루어지는 항체 등을 들 수 있지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다.
(4-5) 인간 항체의 조제법
본 발명의 항체로는, 추가로 인간 항체를 들 수 있다. 항 LAG-3 인간 항체란, 인간 유래의 항체의 아미노산 서열로 이루어지는 항 LAG-3 항체를 의미한다. 항 LAG-3 인간 항체는, 인간 항체의 중사슬과 경사슬의 유전자를 포함하는 인간 게놈 DNA 단편을 갖는 인간 항체 산생 마우스를 사용한 방법 (Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, p.133-143,; Kuroiwa, Y. et. al., Nuc. Acids Res. (1998) 26, p.3447-3448 ; Yoshida, H. et. al., Animal Cell Technology : Basic and Applied Aspects vol.10, p.69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999. ; Tomizuka, K. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, p.722-727 등을 참조.) 에 의해 취득할 수 있다.
인간 항체 산생 동물은, 구체적으로는, 비인간 포유 동물의 내재성 면역 글로블린 중사슬 및 경사슬의 유전자좌 (座) 가 파괴되고, 대신에 효모 인공 염색체 (Yeast artificial chromosome, YAC) 벡터 등을 통하여 인간 면역 글로블린 중사슬 및 경사슬의 유전자좌가 도입된 재조합 동물, 그들의 동물끼리를 교배시킴으로써 만들어진 재조합 동물 중 어느 것이어도 된다.
또, 유전자 재조합 기술에 의해, 그러한 인간 항체의 중사슬 및 경사슬의 각각을 코드하는 cDNA, 바람직하게는 그 cDNA 를 포함하는 벡터에 의해 진핵 세포를 형질 전환하고, 유전자 재조합 인간 모노클로날 항체를 산생하는 형질 전환 세포를 배양함으로써, 이 항체를 배양 상청 중에서 얻을 수도 있다.
여기서, 숙주로는 예를 들어 진핵 세포, 바람직하게는 CHO 세포, 림프구나 미엘로마 등의 포유 동물 세포를 사용할 수 있다.
또, 인간 항체 라이브러리에서 선별한 파지 디스플레이 유래의 인간 항체를 취득하는 방법 (Wormstone, I. M. et. al, Investigative Ophthalmology ＆ Visual Science. (2002) 43(7), p.2301-2308 ; Carmen, S. et. al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1(2), p.189-203 ; Siriwardena, D. et. al., Opthalmology (2002) 109(3), p.427-431 등 참조.) 도 알려져 있다.
예를 들어, 인간 항체의 가변 영역을 1 본쇄 항체 (scFv) 로서 파지 표면에 발현시키고, 항원에 결합하는 파지를 선택하는 파지 디스플레이법 (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p.1105-1116) 을 사용할 수 있다.
항원에 결합함으로써 선택된 파지의 유전자를 해석함으로써, 항원에 결합하는 인간 항체의 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 결정할 수 있다.
항원에 결합하는 scFv의 DNA 서열이 분명해지면, 당해 서열을 갖는 발현 벡터를 제조하고, 적당한 숙주에 도입하고 발현시킴으로써 인간 항체를 취득할 수 있다 (WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438, WO95/15388, Annu. Rev. Immunol (1994) 12, p.433-455, Nature Biotechnology (2005) 23(9), p.1105-1116).
(4-6) 항체의 결합 단편의 조제법
1 본쇄 항체를 제조하는 방법은 당 기술 분야에 있어서 주지된 바이다 (예를 들어, 미국 특허 제4,946,778호, 미국 특허 제5,260,203호, 미국 특허 제5,091,513호, 미국 특허 제5,455,030호 등을 참조). 이 scFv 에 있어서, 중사슬 가변 영역과 경사슬 가변 영역은, 콘주게이트를 만들지 않는 링커, 바람직하게는 폴리펩티드 링커를 통하여 연결된다 (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988), 85, p.5879-5883). scFv 에 있어서의 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역은, 동일한 항체에서 유래해도 되고, 다른 항체에서 유래해도 된다.
가변 영역을 연결하는 폴리펩티드 링커로는, 예를 들어 12 내지 19 잔기로 이루어지는 임의의 1 본쇄 펩티드가 사용된다.
scFv 를 코드하는 DNA 는, 상기 항체의 중사슬 또는 중사슬 가변 영역을 코드하는 DNA, 및 경사슬 또는 경사슬 가변 영역을 코드하는 DNA 중, 그들의 서열 중 전부 또는 원하는 아미노산 서열을 코드하는 DNA 부분을 주형으로 하고, 그 양단을 규정하는 프라이머쌍을 사용하여 PCR 법에 의해 증폭시키고, 이어서, 추가로 폴리펩티드 링커 부분을 코드하는 DNA, 및 그 양단이 각각 중사슬, 경사슬과 연결되도록 규정하는 프라이머쌍을 조합하여 증폭시킴으로써 얻어진다.
scFv 를 코드하는 DNA 를 사용하여, 그 DNA 를 함유하는 발현 벡터, 및 그 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포를 통상적인 방법에 따라 조제할 수 있고, 또, 그 숙주 세포를 배양함으로써, 통상적인 방법에 따라 이러한 배양물로부터 그 scFv 를 회수할 수 있다.
그 밖의 항체의 결합 단편도, 상기 방법에 준하여 그 결합 단편을 코드하는 유전자를 취득하여 세포에 도입하고, 그 세포의 배양물로부터 그 결합 단편을 회수함으로써, 얻을 수 있다.
본 발명의 항체는, 다량화하여 항원에 대한 친화성을 높인 것이어도 된다. 다량화하는 항체로는, 1 종류의 항체이어도 되고, 동일한 항원의 복수의 에피토프를 인식하는 복수의 항체이어도 된다. 항체를 다량화하는 방법으로는, IgG CH3 도메인과 2 개의 scFv 의 결합, 스트렙토아비딘과의 결합, 헬릭스-턴-헬릭스 모티프의 도입 등을 들 수 있다.
본 발명의 항체는, 아미노산 서열이 상이한 복수 종류의 항 LAG-3 항체의 혼합물, 즉 폴리클로날 항체이어도 된다. 폴리클로날 항체로는, 예를 들어, CDR 의 일부 또는 전부가 상이한 복수 종류의 항체의 혼합물을 들 수 있다. 그러한 폴리클로날 항체는, 상이한 항체의 산생 세포를 혼합 배양하고, 그 배양물로부터 회수할 수 있다 (WO2004/061104호). 또, 별개로 조제한 항체를 혼합할 수도 있다. 또한 폴리클로날 항체의 하나의 양태인 항혈청은, 동물을 원하는 항원으로 면역하고, 정법에 따라, 그 동물로부터 혈청을 회수함으로써 조제할 수 있다.
항체의 수식물로서, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 등의 각종 분자와 결합한 항체를 사용할 수도 있다.
본 발명의 항체는, 추가로 이들 항체와 다른 약제가 콘주게이트를 형성하고 있는 것 (Immunoconjugate) 이어도 된다. 이와 같은 항체의 예로는, 그 항체가 방사성 물질이나 약리 작용을 갖는 화합물과 결합하고 있는 것을 들 수 있다 (Nature Biotechnology (2005) 23, p.1137-1146).
또한, (3-11), (3-14), (4-6) 등에 예시 또는 기재되는 본 발명의 항체, 그 결합 단편, 그들의 수식물은, 「본 발명의 항체 또는 그 결합 단편을 포함하는 분자」 라고도 불린다.
(4-7) 항체의 정제
얻어진 항체는, 균일해질 때까지 정제할 수 있다. 항체의 분리, 정제는 통상적인 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법을 사용하면 된다.
예를 들어 크로마토그래피 칼럼, 필터, 한외 여과, 염석, 투석, 조제용 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동, 등전점 전기 영동 등을 적절히 선택, 조합하면, 항체를 분리, 정제할 수 있지만 (Strategies for Protein Purification and Charcterization : A Laboratoy Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996) ; Antibodies : A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), 이들에 한정되는 것은 아니다.
크로마토그래피로는, 어피니티 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등을 들 수 있다.
이들 크로마토그래피는, HPLC 나 FPLC 등의 액상 크로마토그래피를 사용하여 실시할 수 있다.
어피니티 크로마토그래피에 사용하는 칼럼으로는, 프로테인 A 칼럼, 프로테인 G 칼럼, 항원 칼럼 등을 들 수 있다.
프로테인 A 칼럼으로는, 예를 들어, Hyper D (폴사 제조, POROS (어플라이드시스템즈사 제조), Sepharose F. F. (GE 헬스 케어사 제조) 등을 들 수 있다.
또 항원을 고정화시킨 담체를 사용하여, 항원에 대한 결합성을 이용하여 항체를 정제할 수도 있다.
(4-8) 항체를 코드하는 뉴클레오티드·재조합 벡터·재조합 세포
본 발명은, 본 발명의 항체 혹은 그 결합 단편 또는 그 수식체를 코드하는 뉴클레오티드 (「항체 유전자」 라고 한다), 그 유전자가 삽입된 재조합 벡터, 그 유전자 또는 벡터가 도입된 세포 (「항체 유전자 도입 세포」 라고 한다), 그 밖의 본 발명의 항체 혹은 결합 단편 또는 그 수식체를 산생하는 세포 (「항체 산생 세포」 라고 한다) 도 제공한다.
본 발명의 항체 유전자는, 바람직하게는, 다음의 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열 (이하, 「항체 유전자 서열」 이라고 한다) 을 포함하여 이루어지거나, 항체 유전자 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 또는 항체 유전자 서열로 이루어진다 :
(a) 래트 항체 rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 및 rLA1264, 그들의 중사슬 및 경사슬의 정상 영역의 인간 항체로 치환한 키메라체인 cLA204, cLA212, cLA225, cLA869 및 cLA1264, 그리고 그들의 인간화 항체인 hLA212_H2/L1 내지 hLA212_H2/L5 및 hLA212_H3/L1 내지 hLA212_H3/L5 중 어느 하나의 항체의 중사슬 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열과 경사슬 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열의 조합 ;
(b) 래트 항체 rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 및 rLA1264, 그들의 중사슬 및 경사슬의 정상 영역의 인간 항체로 치환한 키메라체인 cLA204, cLA212, cLA225, cLA869 및 cLA1264, 그리고 그들의 인간화 항체인 hLA212_H2/L1 내지 hLA212_H2/L5 및 LA212_H3/L1 내지 hLA212_H3/L5 중 어느 하나의 항체의 CDRH1 내지 CDRH3 을 포함하는 중사슬의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열과 CDRL1 내지 CDRL3 을 포함하는 경사슬의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열의 조합 ;
(c) 래트 항체 rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 및 rLA1264, 그들의 중사슬 및 경사슬의 정상 영역의 인간 항체로 치환한 키메라체인 cLA204, cLA212, cLA225, cLA869 및 cLA1264, 그리고 그들의 인간화 항체인 hLA212_H2/L1 내지 hLA212_H2/L5 및 hLA212_H3/L1 내지 hLA212_H3/L5 중 어느 하나의 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열과 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열의 조합 ;
(d) (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고 또한 LAG-3 에 결합하는 항체의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 ; 및
(e) (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 내지 50 개, 1 내지 45 개, 1 내지 40 개, 1 내지 30 개, 1 내지 25 개, 1 내지 20 개, 1 내지 15 개, 1 내지 10 개, 1 내지 8 개, 1 내지 6 개, 1 내지 5 개, 1 내지 4 개, 1 내지 3 개, 1 혹은 2 개, 또는 1 개의 염기가 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입하여 이루어지는 아미노산 서열을 코드하고 또한 LAG-3 에 결합하는 항체의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 ;
(d) 또는 (e) 에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코드되는 아미노산 서열을 갖는 항체는, (3-2), (3-3) 및 (3-8), 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 내지 (3-7) 의 1 개 이상, 보다 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 및/또는 (3-5), 보다 한층 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 및 (3-5), 나아가 보다 한층 바람직하게는 그것들에 더하여 (3-4) 및 (3-5) 그리고 (3-6) 및/또는 (3-7), 최적으로는 (3-2) 내지 (3-8) 모두에 기재된 성질, 기능, 활성 등을 각각 갖는다.
단, 본 발명의 항체 유전자는, 상기 (a) 내지 (e) 에 기재된 것에 한정되지 않는다.
본 발명은, (4-3) 에 기재된 바와 같이, 본 발명의 항체 유전자 도입 세포를 배양하는 공정, 및 그 배양물로부터 항체 혹은 그 결합 단편 또는 그 수식체를 회수하는 공정을 포함하는 항체 혹은 그 결합 단편 또는 그 수식체의 제조 방법도 제공한다. 이러한 제조 방법에 의해 얻어진 항체 혹은 그 결합 단편 또는 그 수식체도, 본 발명에 포함된다.
5. 의약 조성물
본 발명은 항 LAG-3 항체 혹은 그 결합 단편 또는 그 수식체를 포함하는 의약 조성물을 제공한다.
본 발명의 의약 조성물은, LAG-3 양성의 활성화 T 세포, 즉 이펙터 T 세포, 메모리 T 세포 혹은 제어성 T 세포에 의해 야기되거나 또는 증악화되는 각종 질환 (이하, 「LAG-3 양성 세포에 관련되는 질환」 이라고 한다), 특히 자기 면역 질환, 이식물의 거절, 알레르기성 질환, 악성 종양, 그리고 만성 감염증 등의 치료 및/또는 예방에 유용하다.
이러한 치료 또는 예방의 대상이 되는 질환의 야기 또는 증악화의 원인으로는, 여러 가지 유전 요인 및 환경 요인 (약제, 식사, 광선 등을 포함한다) 혹은 그것들이 복합적으로 작용한 것 등을 예시할 수 있다.
이러한 자기 면역 질환으로는, 결합 조직·근골격계의 자기 면역 질환으로서 관절 류머티즘, 경직성 척추염, 전신성 홍반성 낭창, 강피증, 다발성 근염, 피부 근염, 봉입체 근염, 면역 개재성 괴사성 미오패치를 포함하는 특발성 염증성 근질환 등, 혈액계의 자기 면역 질환으로서 재생 불량성 빈혈, 특발성 혈소판 감소성 자반병 등, 소화기계의 자기 면역 질환으로서 크론병, 궤양성 대장염 등, 신경계의 자기 면역 질환으로서 다발성 경화증, 중증 근무력증 등, 시각계의 자기 면역 질환으로서 포도막염, 각막염, 쇼그렌 증후군 등, 혈관계의 자기 면역 질환으로서 베체트병, 베게나 육아종증 등, 표피계 자기 면역 질환으로서 건선, 천포창, 스티분스·존슨 증후군, 백반 등, 호흡계의 자기 면역 질환으로서 만성 폐색성 폐질환, 간질성 폐렴 등, 내분비계의 자기 면역 질환으로서 1 형 당뇨병, 자기 면역 갑상선염, 바세도우병, 하시모토병 등, 그 밖의 자기 면역성 간염, 면역 이상에 의한 신염 등을 예시할 수 있고, 바람직하게는 질환 부위 및/또는 림프 조직에 있어서 LAG-3 양성 세포가 존재하고 있는 그들의 질환을 들 수 있다.
이식물의 거절로는, 심장, 신장, 간장, 골수, 피부 등의 장기 혹은 조직의 이식에 대한 거절 반응 및 숙주대이식편 반응, 골수, 말초혈, 제대혈 등의 조혈 세포의 이식에 의해 일어나는 이식편대숙주병 등을 들 수 있고, 바람직하게는 거절에 관련되는 부위 및/또는 림프 조직에 있어서 LAG-3 양성 세포가 존재하고 있는 그들의 반응, 증상, 질환 등을 예시할 수 있다.
알레르기성 질환으로는, 아토피성 피부염, 천식, 아나필락시, 아나필락시형 반응, 음식 알레르기, 비염, 중이염, 약물 반응, 곤충 자상 반응, 식물 반응, 라텍스 알레르기, 결막염, 두드러기, 접촉성 피부염 등을 예시할 수 있고, 바람직하게는 질환 부위 및/또는 림프 조직에 있어서 LAG-3 양성 세포가 존재하고 있는 그들의 질환을 들 수 있다.
악성 종양으로는, 유방암, 폐암, 피부암 (멜라노마를 포함한다), 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 골수 이형성 증후군, 글리오마, 간장암, 대장암, 위암, 췌장암, 신장암, 전립선암, 두경부암, 자궁경암, 자궁내막암, 난소암, 골육종, 연부 조직 육종, 소화관 간질 종양 등을 예시할 수 있고, 바람직하게는 LAG-3 양성 세포가 존재하고 있는 그들의 암, 악성 종양 등을 들 수 있다.
만성 감염증으로는, 세균, 바이러스, 진균 그 밖의 미생물에 의한 감염증 등을 들 수 있고, 바람직하게는 LAG-3 양성 세포가 존재하고 있는 그들의 질환을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 질환의 치료 또는 예방에는, 이러한 질환, 바람직하게는 LAG-3 단백질을 발현하고 있는 개체에 있어서의 이러한 질환의 발증의 예방, 증악화 또는 진행의 억제 또는 저해, 이러한 질환으로 이환된 개체가 나타내는 1 개 또는 2 개 이상의 증상의 경감, 증악화 혹은 진행의 억제 또는 관해 (寬解), 2 차성 질환의 치료 또는 예방 등이 포함되지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 의약 조성물에는, 치료 또는 예방에 유효한 양의 항 LAG-3 항체 또는 그 항체의 결합 단편과 약학상 허용되는 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 보존제 및/또는 보조제를 함유시킬 수 있다.
「치료 또는 예방에 유효한 양」 이란, 특정한 질환, 투여 형태 및 투여 경로에 대해 치료 또는 예방 효과를 발휘하는 양을 의미하고, 「약리학적으로 유효한 양」 과 동일한 의미이다.
본 발명의 의약 조성물에는, pH, 침투압, 점도, 투명도, 색, 등장성, 무균성, 그 조성물 또는 그것에 포함되는 항체의 안정성, 용해성, 서방성, 흡수성, 침투성, 제형, 강도, 성상, 형상 등을 변화시키거나, 유지하거나, 유지 (保持) 하거나 하기 위한 물질 (이하, 「제제용의 물질」 이라고 한다) 을 함유시킬 수 있다. 제제용의 물질로는, 약리학적으로 허용되는 물질이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 비독성 또는 저독성인 것은, 제제용의 물질이 바람직하게 구비하는 성질이다.
제제용의 물질로서 예를 들어, 이하의 것을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다 ; 글리신, 알라닌, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신 등의 아미노산류, 항균제, 아스코르브산, 황산나트륨 또는 아황산수소나트륨 등의 항산화제, 인산, 시트르산, 붕산 버퍼, 탄산수소나트륨, 트리스-염산 (Tris-Hcl) 용액 등의 완충제, 만니톨이나 글리신 등의 충전제, 에틸렌디아민사아세트산 (EDTA) 등의 킬레이트제, 카페인, 폴리비닐피롤리딘, β-시클로덱스트린이나 하이드록시프로필-β-시클로덱스트린 등의 착화제, 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린 등의 증량제, 단당류, 이당류나 글루코오스, 만노오스나 덱스트린 등의 다른 탄수화물, 착색제, 향미제, 희석제, 유화제나 폴리비닐피롤리딘 등의 친수 폴리머, 저분자량 폴리펩티드, 염 형성 카운터 이온, 염화벤즈알코늄, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 페네틸알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로렉시딘, 소르브산 또는 과산화수소 등의 방부제, 글리세린, 프로필렌글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜 등의 용매, 만니톨 또는 소르비톨 등의 당 알코올, 현탁제, PEG, 소르비탄에스테르, 폴리소르비테이트 20 이나 폴리소르비테이트 80 등 폴리소르비테이트, 트리톤 (triton), 트로메타민 (tromethamine), 레시틴 또는 콜레스테롤 등의 계면 활성제, 수크로오스나 소르비톨 등의 안정화 증강제, 염화나트륨, 염화칼륨, 만니톨이나 소르비톨 등의 탄성 증강제, 수송제, 희석제, 부형제, 및/또는 약학상의 보조제.
이들 제제용 물질의 첨가량은, 항 LAG-3 항체 혹은 그 결합 단편 또는 그 수식체의 중량에 대하여 0.001 내지 1000 배, 바람직하게는 0.01 내지 100 배, 보다 바람직하게는 0.1 내지 10 배이다.
항 LAG-3 항체 혹은 그 결합 단편 또는 그 수식체를 리포솜 중에 함유시킨 이뮤노리포솜, 항체와 리포솜이 결합하여 이루어지는 항체 수식체 (미국 특허 제6214388호 등) 를 함유하는 의약 조성물도, 본 발명의 의약 조성물에 포함된다.
부형제나 담체는, 통상 액체 또는 고체이고, 주사용의 물, 생리 식염수, 인공 뇌척수액, 그 밖의, 경구 투여 또는 비경구 투여용의 제제에 사용되는 물질이면 특별히 한정되지 않는다. 생리 식염수로는, 중성의 것, 혈청 알부민을 포함하는 것 등을 들 수 있다.
완충제로는, 의약 조성물의 최종 pH 가 7.0 내지 8.5 가 되도록 조제된 Tris 버퍼, 동일하게 4.0 내지 5.5 가 되도록 조제된 아세트산 버퍼, 동일하게 5.0 내지 8.0 이 되도록 조제된 시트르산 버퍼, 동일하게 5.0 내지 8.0 이 되도록 조제된 히스티딘 버퍼 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은, 고체, 액체, 현탁액 등이다. 동결 건조 제제를 들 수 있다. 동결 건조 제제를 성형하기 위해서는, 수크로오스 등의 부형제를 사용할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물의 투여 경로로는, 경장 투여, 국소 투여 및 비경구 투여 중 어느 것이어도 되고, 예를 들어, 정맥내 투여, 동맥내 투여, 근육내 투여, 피내 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 경피 투여, 골내 투여, 관절내 투여 등을 들 수 있다.
이러한 의약 조성물의 조성은, 투여 방법, 항체의 LAG-3 단백질 결합 친화성 등에 따라 결정할 수 있다. 본 발명의 항 LAG-3 항체 혹은 그 결합 단편 또는 그 수식체의 LAG-3 단백질에 대한 친화성이 높을수록 (KD 값이 낮을수록), 적은 투여량으로 그 약효를 발휘할 수 있다.
본 발명의 항 LAG-3 항체의 투여량은, 약리학적으로 유효한 양이면 한정되지 않고, 개체의 종, 질환의 종류, 증상, 성별, 연령, 지병, 그 항체의 LAG-3 단백질 결합 친화성 또는 그 생물 활성, 그 밖의 요소에 따라 적절히 결정할 수 있지만, 통상, 0.01 내지 1000 ㎎/㎏, 바람직하게는 0.1 내지 100 ㎎/㎏ 을, 1 내지 180 일간에 1 회, 또는 1 일 2 회 혹은 3 회 이상 투여할 수 있다.
의약 조성물의 형태로는, 주사제 (동결 건조 제제, 점적제를 포함한다), 좌제, 경비형 흡수제제, 경피형 흡수제제, 설하제, 캡슐, 정제, 연고제, 과립제, 에어 졸제, 환제, 산제, 현탁제, 유제, 점안제, 생체 매립형 제제 등을 예시할 수 있다.
항 LAG-3 항체 혹은 그 결합 단편 또는 그 수식체를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물은 다른 의약과 동시에 또는 별개로 투여할 수 있다. 예를 들어, 다른 의약을 투여한 후에 항 LAG-3 항체 또는 그 항체의 결합 단편을 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물을 투여하거나, 이러한 의약 조성물을 투여한 후에, 다른 의약을 투여하거나, 또는 당해 의약 조성물과 다른 의약을 동시에 투여해도 된다.
본 발명의 의약 조성물과 조합하여 사용되는 다른 의약으로는, 예를 들어, 엽산 대사 길항제, 칼시뉴린 저해제, 부신 피질 스테로이드제, 항흉선 세포 글로블린제, 핵산 대사 길항제, 핵산 합성 저해제, 세포 표면 항원을 표적으로 하는 생물 제제, 또는 사이토카인 혹은 사이토카인 수용체를 표적으로 하는 생물 제제 등을 들 수 있고, 그것들은 자기 면역 질환 및/또는 이식물의 거절의 치료 또는 예방을 위해서 바람직하다. 그것들 다른 의약으로는, 엽산 대사 길항제인 메토트렉세이트 (Methotrexate), 칼시뉴린 저해제인 사이클로스포린 (Cyclosporin), 타크로리무스 (Taclorims), 부신 피질 스테로이드제인 메틸프레드니솔론 (Methylprednisolone), 프레드니솔론 (Prednisolone), 핵산 합성 저해제인 시클로포스파미드 (Cyclophosphamide), 아자시오프린 (Azathioprine), 항흉선 세포 글로블린제인 제트블린 (Zetbulin), 림포글로블린 (Lymphoglobuline), 치모글로블린 (Thymoglobulin), 핵산 대사 길항제인 미코페놀레이트 모페틸 (Mycophenolate mofetil), 세포 표면 항원을 표적으로 하는 생물 제제인 알렘투주마브 (Alemtuzumab), 리투시맵 (Rituximab), 아바타셉트 (Abatacept), 데노수맙 (Denosumab), 사이토카인 혹은 사이토카인 수용체를 표적으로 하는 생물 제제인 아달리무맙 (Adalimumab), 인플릭시맵 (Infliximab), 에타너셉트 (Etanercept), 토실리주맙 (Tocilizumab) 등을 예시할 수 있다. 또, 본 발명의 의약 조성물은, 대량 면역 글로블린 정주 요법 (IVIg), 혈장 교환 요법 등과 병용하여 자기 면역 질환 및/또는 이식물의 거절의 치료 또는 예방에 사용할 수도 있다. 그것들 다른 의약 및 요법은, 자기 면역 질환 및 이식물의 거절 이외의 질환의 치료 또는 예방에 있어서도 본 발명의 의약 조성물과 조합할 수 있다.
악성 종양의 치료 또는 예방에 있어서 본 발명의 의약 조성물과 조합할 수 있는 의약 및 요법으로는, 항암제, 예를 들어, 각종 분자 표적약, 화학 요법제, 방사선 요법, 항 PD-1 항체, 항 PD-L1 항체, 항 CTLA-4 항체를 비롯한 각종 암 면역 요법제 등을 들 수 있다.
이들 다른 의약 및 요법은, 1 종류인 경우도 있고, 2, 3 혹은 그 이상의 종류를 투여하거나 또는 받을 수도 있다. 그것들을 종합하여 본 발명의 의약 조성물과 「다른 의약과의 병용」 또는 「다른 의약과의 조합」 이라고 부르고, 본 발명의 항체, 그 결합 단편 혹은 그 수식체에 더하여 다른 의약을 포함하거나 또는 다른 요법과 조합하여 사용되는 본 발명의 의약 조성물도 「다른 의약과의 병용」 또는 「다른 의약과의 조합」 의 양태로서 본 발명에 포함된다.
본 발명은 자기 면역 질환 등 LAG-3 양성 세포에 관련되는 질환의 치료 방법 또는 예방 방법, 그 질환의 치료용 또는 예방용 의약 조성물을 조제하기 위한 본 발명의 항체의 사용, 그 질환의 치료 또는 예방을 위한 본 발명의 항체의 사용도 제공한다. 본 발명의 항체를 포함하는 치료용 또는 예방용 키트도 본 발명에 포함된다.
6. 시약
본 발명의 항체 혹은 그 결합 단편 또는 그 수식체는, 시약으로서도 유용하다. 이러한 시약은, 상기 서술한 검사 또는 진단용, 연구용 및 그 밖의 용도로 사용된다.
실시예
이하, 실시예에 있어서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되지 않는다.
또한, 하기 실시예에 있어서 유전자 조작에 관한 각 조작은 특별히 명시가 없는 한, 「몰레큘러 클로닝 (Molecular Cloning)」 (Sambrook, J., Fritsch, E. F. 및 Maniatis, T. 저, Cold SpringHarbor Laboratory Press 로부터 1989년 발간) 에 기재된 방법 및 그 밖의 당업자가 사용하는 실험서에 기재된 방법에 의해 실시하거나, 또는 시판되는 시약이나 키트를 사용하는 경우에는 시판품의 지시서에 따라 실시하였다.
실시예 1. 래트 항인간 LAG-3 항체의 제조
1)-1 면역
인간 LAG-3 (서열 번호 86 : 도 101) 의 세포 외의 4 개의 면역 글로블린형 도메인 중 N 말단으로부터 1 및 2 번째 (23-262 번의 영역) 를 결실시킨 변이체를 pcDNA3.1 (Life Technologies 사) 에 클로닝한 발현 플라스미드 pcDNA3.1-hLAG-3_D3D4 를, EndoFree Plasmid Giga Kit (QIAGEN 사) 를 사용하여 대량 조제하였다. WKY/Izm 래트의 암컷 (닛폰 SLC 사) 양다리 하퇴부를 Hyaluronidase (Sigma 사) 로 전처리 후, 동 부위에 pcDNA3.1-hLAG-3_D3D4 를 근주 (筋注) 하였다. 계속해서, ECM830 (BTX 사) 을 사용하고, 2 니들 전극을 사용하여, 동 부위에 인비보 일렉트로포레이션을 실시하였다. 2 주에 한 번, 동일한 인비보 일렉트로포레이션을 합계 3 혹은 5 회 반복한 후, 래트의 림프절을 채취하여 하이브리도마 제조에 사용하였다.
1)-2 하이브리도마 제조
림프절 세포 혹은 비장 세포와 마우스 미엘로마 SP2/0-ag14 세포를 Hybrimune Hybridoma Production System (Cyto Pulse Sciences 사 제조) 을 사용하여 전기 세포 융합하고, ClonaCell-HY Selection Medium D (StemCell Technologies 사 제조) 에 희석시켜 배양하였다. 출현한 하이브리도마 콜로니를 회수함으로써 모노클론 하이브리도마를 제조하였다. 회수된 각 하이브리도마 콜로니를 배양하고, 얻어진 하이브리도마 배양 상청을 사용하여 항 LAG-3 항체 산생 하이브리도마의 스크리닝을 실시하였다.
1)-3 Cell-ELISA 법에 의한 항체 스크리닝
HEK293 세포에, Lipofectamine 2000 (Life Technologies 사 제조) 을 사용하여, pcDNA3.1 에 인간 혹은 필리핀원숭이의 LAG-3 을 클로닝하여 제조한 발현 플라스미드 (pcDNA3.1/hLAG-3 및 pcDNA3.1/cynoLAG-3) 혹은 컨트롤의 플라스미드를 도입하고, 96 구멍 마이크로 플레이트 (Corning 사 제조) 로, 10 ％ FBS 함유 DMEM 배지 중에서 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 하룻밤 배양하였다. 배양 상청을 제거 후, 하이브리도마 배양 상청을 첨가하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 웰 중의 세포를 5 ％ FBS 함유 PBS 로 1 회 세정 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 로 500 배로 희석시킨 래빗에서 생산된 항래트 IgG-페록시다아제 항체 (Anti-Rat IgG-Peroxidase antibody produced in rabbit) (Sigma 사 제조) 을 첨가하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 웰 중의 세포를 5 ％ FBS 함유 PBS 로 5 회 세정한 후, OPD 발색액 (OPD 용해액 (0.05 M 시트르산 3 나트륨, 0.1 M 인산수소 2 나트륨·12 물 pH4.5) 에 o-페닐렌디아민 2 염산염 (와코우 순약사 제조), H2O2 를 각각 0.4 ㎎/㎖, 0.6 ％ (v/v) 가 되도록 용해) 을 25 ㎕/웰로 첨가하였다. 가끔 교반하면서 발색 반응을 실시하고, 1 M HCl 을 25 ㎕/웰을 첨가하여 발색 반응을 정지시킨 후, 플레이트 리더 (ENVISION : PerkinElmer 사) 로 490 ㎚ 의 흡광도를 측정하였다. 세포막 표면 상에 발현하는 LAG-3 에 특이적으로 결합하는 항체를 산생하는 하이브리도마를 선택하기 위해, LAG-3 유전자를 포함하지 않는 컨트롤의 플라스미드를 도입한 HEK293 세포와 비교하여, LAG-3 발현 벡터 도입 HEK293 세포쪽에서 보다 높은 흡광도를 나타내는 배양 상청을 산생하는 하이브리도마를 항 LAG-3 항체 산생 양성으로서 선택하였다.
1)-4 플로우 사이토메트리에 의한 항체 스크리닝
실시예 1)-3 의 Cell-ELISA 에서 양성으로 판정된 하이브리도마가 산생하는 항체가, 보다 생리적인 LAG-3 발현 세포인 PHA (phytohemagglutinin) 활성화 인간 T 세포 (PHA blast) 에 결합하는 것을, 플로우 사이토메트리법에 의해 추가로 확인하였다. 인간 PBMC 를 2 ㎍/㎖ 의 PHA (Sigma 사 제조) 로 3 일간 자극한 세포에 대해 하이브리도마 배양 상청을 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 30 분간 반응시켰다. FACS 버퍼 (PBS, 0.1 ％ BSA, 0.1 ％ 아지화나트륨) 로 세정한 후, LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit-near-IR fluorescent reactive dye (Invitrogen 사 제조) 를 포함하는 FACS 버퍼로 200 배로 희석시킨 항래트 IgG PE콘주게이트 (Anti-Rat IgG PE conjugate (Jackson ImmunoResearch Laboratories 사 제조)) 등의 2 차 항체를 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 30 분간 가만히 정지시켰다. FACS 버퍼로 세정한 후, 1 내지 2 ％ 파라포름알데히드 함유 PBS 에 재현탁하고, 플로우 사이토미터 (CantoII : BD 사 제조 혹은 FC500 : BeckmanCoulter 사 제조) 로 검출을 실시하였다. 데이터 해석은 FlowJo (TreeStar 사 제조) 로 실시하였다. LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit-near-IR fluorescent reactive dye 양성의 사세포를 게이트로 제외한 후, 생세포의 형광 강도의 히스토그램을 제조하였다.
1)-5 ADCC 어세이에 의한 스크리닝
1)-5-1 표적 세포의 제조
pLenti6/V5-GW/lacZ, 및 ViraPowerTM Packaging Mix (Invitorogen 사) 를 첨부 프로토콜에 따라 293FT 세포 (Invitrogen 사) 에 트랜스펙션함으로써, β-갈락토시다아제 유전자를 발현하는 재조합 렌티바이러스를 제조하였다. 얻어진 재조합 렌티바이러스를 ViraPower Lentiviral Expression Systems (Invitrogen 사) 의 프로토콜에 따라 293T 세포에 감염시키고, 10 ㎍/㎖ 의 블라스티사이딘 (Invitrogen 사) 으로 바이러스 감염 세포를 선택함으로써, β-갈락토시다아제의 안정 발현주를 취득하였다. 이 β-갈락토시다아제를 안정 발현하는 293T 세포 (이하 293T-lacZ 로 표기) 에, 인간 LAG-3 전체 길이의 발현 플라스미드를 Lipofectamine 2000 (Invitrogen 사 제조) 을 사용하여 도입하고, 1 일간 배양한 후, TrypLExpress (Invitrogen 사 제조) 를 사용하여 박리·회수하였다. 5 ％ FBS 를 포함하는 페놀 레드 불함유 RPMI1640 (이하 「ADCC 용 배지」 라고 약기한다) 으로 2 회 세정하고, 생세포수를 트리판 블루 색소 배제 시험으로 계측하고, ADCC 용 배지에서 1 × 105 세포/㎖ 가 되도록 재현탁한 것을 표적 세포로서 사용하였다.
1)-5-2 이펙터 세포의 조제
인간 말초혈로부터 피콜 원심 분리로 PBMC 를 분리하고, ADCC 용 배지에서 생세포 밀도로 1.2 × 106 세포/㎖ 가 되도록 현탁한 것을, 이펙터 세포로서 사용하였다.
1)-5-3 ADCC 어세이
하이브리도마 배양 상청 50 ㎕/웰을 포함하는 96 구멍 U 바닥 마이크로 플레이트에, 1)-5-1 의 표적 세포를 50 ㎕/웰 첨가하고, 4 ℃ 에서 30 분간 가만히 정지시켰다. ADCC 용 배지 150 ㎕/웰을 첨가하여 교반한 후, 실온에서 1200 rpm × 5 분간 원심하고, 상청 200 ㎕/웰을 제거하였다. 거기에, 1)-5-2 의 이펙터 세포를 125 ㎕/웰 첨가하고, 실온에서 1200 rpm × 5 분간 원심 후, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 하룻밤 배양하였다. 다음날, 상청 50 ㎕ 를 흑색 플레이트 (Corning 사 제조) 에 회수하고, β-Glo 어세이 시스템 (Promega 사 제조) 용액 50 ㎕ 를 첨가하고, 발광량을 플레이트 리더 (ENVISION : PerkinElmer 사 제조) 로 측정하였다. ADCC 활성에 의한 세포 용해율은 다음 식으로 산출하였다.
세포 용해율 (％) = (A - B)/(C - B) × 100
A : 샘플 웰의 카운트
B : 자연 방출 (항체 비첨가 웰) 카운트의 평균값 (n = 3). 항체 첨가시에 ADCC 용 배지를 50 ㎕ 첨가하였다. 그 이외에는 샘플 웰과 동일한 조작을 실시하였다.
C : 최대 방출 (표적 세포를 계면 활성제로 용해시킨 웰) 카운트의 평균값 (n = 3). 항체 첨가시 및 이펙터 세포 첨가시에 ADCC 용 배지를 50 ㎕ 및 75 ㎕ 각각 첨가하였다. 측정시에는, 세포를 포함하는 웰에 175 ㎕ 의 β-Glo 어세이 시스템 용액을 첨가하여 혼화하고, 그 중 100 ㎕ 분을 흑색 플레이트에 첨가하고 측정을 실시하였다.
1)-6 LAG-3/MHC 클래스 II 결합 시험에 의한 스크리닝
기보 (旣報) (비특허문헌 8) 에 준하여 실시하였다. 즉, 96 구멍 U 바닥 마이크로 플레이트에 10 ％ FBS 를 포함하는 RPMI1640 으로 25 nM 으로 희석시킨 LAG-3-Fc (R ＆ D Systems 사 제조) 를 20 ㎕/웰 첨가하고, 거기에 하이브리도마 배양 상청 20 ㎕/웰을 첨가하여 교반하고, 4 ℃ 에서 20 분간 가만히 정지시켰다. 거기에 내인성으로 MHC 클래스 II 분자를 고발현하는 Raji 세포를 10 ㎕/웰 (2.5 × 105 세포/웰) 첨가하여 교반하고, 4 ℃ 에서 추가로 30 분간 가만히 정지시켰다. 세포를 PBS 혹은 FACS 버퍼로 2 회 세정한 후, FACS 버퍼로 200 배로 희석시킨 항인간 IgG PE 콘주게이트 (Anti-Human IgG PE conjugate (Jackson ImmunoResearch Laboratories 사 제조)) 를 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 20 분간 가만히 정지시켰다. 세포를 PBS 혹은 FACS 버퍼로 세정한 후, 1 내지 2 ％ 파라포름알데히드 함유 PBS 에 재현탁하고, 플로우 사이토미터 (CantoII : BD 사 제조 혹은 FC500 : BeckmanCoulter 사 제조) 로 검출을 실시하였다. 데이터 해석은 FlowJo (TreeStar 사 제조) 로 실시하고, 저해율은 다음 식으로 산출하였다.
저해율 (％) = 100 - (A - B)/(C - B) × 100
A : 샘플 웰의 평균 형광 강도
B : 백그라운드의 평균 형광 강도. LAG-3-Fc 및 항체 첨가시에 배지를 각각 20 ㎕ 첨가하였다. 그 이외에는 샘플 웰과 동일한 조작을 실시하였다.
C : 최대 결합의 평균 형광 강도. 항체 첨가시에 배지를 20 ㎕ 첨가하였다.
1)-7 모노클로날 항체의 정제
래트 항인간 LAG-3 모노클로날 항체는, 하이브리도마 배양 상청으로부터 정제하였다. 즉, 먼저 PBS 로 평형화한 ProteinG 칼럼 (GE 헬스 케어사 제조) 에 하이브리도마의 배양 상청을 어플라이하였다. PBS 로 칼럼을 세정한 후, 0.1 M 글리신/염산 수용액 (pH2.7) 으로 용출하고, 항체가 포함되는 획분을 모았다. 모은 획분에 1 M Tris-HCl (pH9.0) 을 첨가하고 pH7.0 ∼ 7.5 로 조제한 후에, Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (분획 분자량 UF30K, Sartorius 사 제조) 으로 PBS 에 대한 버퍼 치환을 실시함과 함께 항체의 농축을 실시하고, 항체 농도를 2 ㎎/㎖ 이상으로 조제하였다. 마지막으로 Minisart-Plus filter (Sartorius 사 제조) 로 여과하고, 정제 샘플로 하였다.
실시예 2. 래트 항인간 LAG-3 항체 (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 및 rLA1264) 의 in vitro 평가
2)-1 취득 래트 항 LAG-3 항체 (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 및 rLA1264) 의 인간 활성화 T 세포에 대한 결합성
실시예 1)-7 에 기재된 방법에 의해, 정제한 래트 항인간 LAG-3 항체 rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 및 rLA1264 의, 인간 활성화 T 세포에 대한 결합성을 검토하였다. 도 1 에 나타내는 바와 같이, 이들 래트 항인간 LAG-3 항체는 모두 in vitro 활성화 인간 T 세포로서 조제한 PHA blast 에 농도 의존적으로 결합하였다.
2)-2 취득 래트 항 LAG-3 항체 (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 및 rLA1264) 의 ADCC 활성
정제한 래트 항인간 LAG-3 항체 rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 및 rLA1264 의 ADCC 활성을, 이하의 방법에 의해 검토하였다. 항체 용액 50 ㎕/웰을 포함하는 96 구멍 U 바닥 마이크로 플레이트에, 실시예 1)-5-1 의 표적 세포 (이하, 293T-lacZ/hLAG-3 세포로 기재) 를 50 ㎕/웰 첨가하고, 4 ℃ 에서 30 분간 가만히 정지시켰다. 거기에, 실시예 1)-5-2 와 같이 조제한 이펙터 세포 (단, 2 × 106 세포/㎖ 가 되도록 현탁한 것) 를 75 ㎕/웰 첨가하고, 실온에서 1200 rpm × 5 분간 원심 후, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 하룻밤 배양하였다. 다음날, 상청 50 ㎕ 를 흑색 플레이트 (Corning 사 제조) 에 회수하고, β-Glo 어세이 시스템 (Promega 사 제조) 용액 50 ㎕ 를 첨가하고, 발광량을 플레이트 리더 (ENVISION : PerkinElmer 사 제조) 로 측정하였다. ADCC 활성에 의한 세포 용해율은 다음 식으로 산출하였다.
세포 용해율 (％) = (A - B)/(C - B) × 100
A : 샘플 웰의 카운트
B : 자연 방출 (항체 비첨가 웰) 카운트의 평균값 (n = 3). 항체 첨가시에 ADCC 용 배지를 50 ㎕ 첨가하였다. 그 이외에는 샘플 웰과 동일한 조작을 실시하였다.
C : 최대 방출 (표적 세포를 계면 활성제로 용해시킨 웰) 카운트의 평균값 (n = 3). 항체 첨가시 및 이펙터 세포 첨가시에 ADCC 용 배지를 50 ㎕ 및 75 ㎕ 각각 첨가하였다. 측정시에는, 세포를 포함하는 웰에 175 ㎕ 의 β-Glo 어세이 시스템 용액을 첨가하여 혼화하고, 그 중 100 ㎕ 분을 흑색 플레이트에 첨가하고 측정을 실시하였다.
도 2 에 나타내는 바와 같이, 이들 래트 항인간 LAG-3 항체는 모두, 인간 LAG-3 발현 세포에 대해 농도 의존적인 in vitro ADCC 활성을 나타냈다. 이에 대하여, 인간 LAG-3 유전자를 트랜스펙트하지 않은 293T-lacZ 세포에 대해서는, 이들 항체는 ADCC 활성을 나타내지 않고, 작용은 특이적이었다.
2)-3 취득 래트 항 LAG-3 항체 (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 및 rLA1264) 의 LAG-3/MHC 클래스 II 결합 시험에 있어서의 저해 활성의 검토
실시예 1)-6 에 기재된 LAG-3/MHC 클래스 II 결합 시험에 의해, 정제한 항 LAG-3 항체 (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 및 rLA1264) 가, LAG-3 과 그 리간드로 보고되어 있는 MHC 클래스 II 분자의 결합을 저해하는 활성을 갖는가를 검토하였다. 그 결과, 도 3A 에 나타내는 바와 같이 이들 5 클론의 항체는 모두, LAG-3/MHC 클래스 II 결합 시험에 있어서 거의 저해 활성을 나타내지 않고, LAG-3 의 T 세포 억제 기능 발휘에 필요하다고 생각되고 있는 MHC 클래스 II 분자와의 결합에 영향을 미치지 않는 것이 분명해졌다. 이에 대하여 도 3B 에 나타내는 바와 같이, 선행 기술의 항체인 인간 키메라화 항 LAG-3 항체 IMP731 (특허문헌 1) 은, LAG-3/MHC 클래스 II 결합 시험에 있어서 농도 의존적으로 강력한 저해 활성을 나타냈다.
2)-4 취득 래트 항 LAG-3 항체 (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 및 rLA1264) 의 293T-hLAG-3/Raji 세포 접착 시험에 있어서의 저해 활성의 검토
실시예 2)-3 에 기재된 LAG-3/MHC 클래스 II 결합 시험에 있어서는, LAG-3-Fc 에 대한 항 LAG-3 항체의 결합에 수반하는 입체 장해에 의해, Raji 세포에 대한 LAG-3-Fc 의 결합을 검출하기 위한 2 차 항체 항인간 IgG PE 콘주게이트 (Anti-Human IgG PE conjugate) 의 결합이 저해되고, 실제로는 항체가 LAG-3/MHC 클래스 II 결합을 직접 저해하고 있지 않음에도 불구하고 외관상, 낮은 형광 강도를 나타내는 가능성을 완전히 배제할 수는 없다. 그래서 검출용의 2 차 항체를 사용하지 않는 평가계로서, 이하와 같은 293T-hLAG-3/Raji 세포 접착 시험계를 구축하고, 항체의 평가를 실시하였다.
293T 세포에 Lipofectamine 2000 (Life Technologies 사 제조) 을 사용하여, 인간 LAG-3 발현 플라스미드 pcDNA3.1/hLAG-3 을 도입하고, BioCoat Poly-D-Lysine 코트 96 구멍 마이크로 플레이트 (BD 사 제조) 에 파종하고 하룻밤 배양하였다. 한편, Raji 세포를 배지 (10 ％ FBS 함유 RPMI1640) 중에서 형광 색소의 BCECF-AM (Dojindo 사 제조, 10 μM 으로 사용) 으로 37 ℃ 에서 1 시간 표지하고, 세정 후, 1.6 × 106 세포/㎖ 가 되도록 배지에 현탁하였다. 트랜스펙션 후 하룻밤 배양한 세포 (293T-hLAG-3 세포) 의 배지를 제거하고, 50 ㎕/웰의 배지 및 25 ㎕/웰의 항체 용액을 첨가하고, 37 ℃ 에서 30 분간 프리인큐베이션하였다. 그 후, BCECF-AM 표지한 Raji 세포를 25 ㎕/웰 첨가하고, 900 rpm 으로 30 초간 원심한 후, 37 ℃ 에서 1 시간 인큐베이션하였다. 반응 후, 배지에서 2 내지 3 회 웰을 세정하여 비접착 세포를 제거하고, 0.1 ％ NP-40 을 포함하는 Tris 버퍼 (25 mM, pH8.0) 100 ㎕/웰로 세포를 용해시키고, 웰의 형광 강도를 플레이트 리더 (ENVISION : PerkinElmer 사 제조) 로 측정하였다. 저해율은 다음 식으로 산출하였다.
저해율 (％) = 100 - (A - B)/(C - B) × 100
A : 샘플 웰의 형광 강도
B : 백그라운드의 형광 강도. Raji 세포 및 항체 첨가시에 배지를 첨가하였다. 그 이외에는 샘플 웰과 동일한 조작을 실시하였다.
C : 최대 결합의 형광 강도. 항체 첨가시에 배지를 첨가하였다.
그 결과, 도 4 에 나타내는 바와 같이 정제 래트 항 LAG-3 항체 rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 및 rLA1264 는 모두, 293T-hLAG-3/Raji 세포 접착 시험에 있어서 거의 저해 활성을 나타내지 않아, LAG-3 의 T 세포 억제 기능 발휘에 필요하다고 생각되고 있는 MHC 클래스 II 분자와의 결합에 영향을 미치지 않는 것이 더욱 지지되었다. 이에 대하여 선행 기술의 항체인 인간 키메라화 항 LAG-3 항체 IMP731 (특허문헌 1) 은, 본 시험에 있어서 10 ㎍/㎖ 의 농도에서 저해율 90 ％ 로 강력한 저해 활성을 나타냈다.
2)-5 취득 래트 항 LAG-3 항체 (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 및 rLA1264) 의 에피토프의 동정
래트 항 LAG-3 항체 rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 및 rLA1264 는, LAG-3 의 세포 외 영역에 존재하는 4 개의 면역 글로블린형 도메인 중 N 말단으로부터 1 및 2 번째 (이하, 각각 도메인 1 및 2 로 표기) 를 결실시킨 변이체를 면역원으로서 제조한 항체이므로, 남는 N 말단으로부터 3 및 4 번째 (이하, 각각 도메인 3 및 4 로 표기) 중 어느 도메인에 이들 항체가 결합하는가를 분명히 할 목적으로, 도메인 3 과 4, 혹은 도메인 4 만을 발현시킨 세포에 대한 취득 래트 항 LAG-3 항체의 결합을 플로우 사이토메트리에 의해 검토하였다.
N 말단에 FLAG 태그 서열 (DYKDDDDK) 을 부가한 인간 LAG-3 의 도메인 3 이하 (263-525) 혹은 도메인 4 이하 (353-525) 인 발현 플라스미드 (모두 pcDNA3.1 에 클로닝) 를 Lipofectamine 2000 (Life Technologies 사 제조) 을 사용하여 HEK293T 세포에 도입하고, 1 일간 배양한 후에 회수하고, 실시예 1)-4 에 기재된 방법으로 플로우 사이토메트리에 의해, 항체의 결합성을 검토하였다. 그 결과, 도 5A 에 나타내는 바와 같이, 정제 래트 항 LAG-3 항체 rLA204, rLA212 및 rLA225 는 모두, 도메인 3 및 4 를 포함하는 컨스트럭트를 발현시킨 세포에는 결합한 것에 대해, 도메인 4 만을 포함하는 컨스트럭트를 발현시킨 세포에는 결합하지 않았다. 이들 결과로부터, 취득 래트 항 LAG-3 항체 rLA204, rLA212 및 rLA225 는 모두, LAG-3 세포 외 영역에 존재하는 4 개의 면역 글로블린형 도메인 중 도메인 3 에 결합하는 것이 분명해졌다.
하이브리도마 배양 상청을 사용한 동일한 실험으로부터, 취득 래트 항 LAG-3 항체 rLA869 및 rLA1264 도, 도메인 3 에 결합하는 것이 분명하게 되어 있다.
동일한 방법으로 선행 기술의 항체인 인간 키메라화 항인간 LAG-3 항체 IMP731 의 결합 도메인을 검토한 결과를 도 5B 에 나타낸다. 도 5A 의 2 종류의 컨스트럭트에 더하여, N 말단에 FLAG 태그 서열 (DYKDDDDK) 을 부가한 인간 LAG-3 의 도메인 2 이하 (인간 LAG-3 아미노산 서열/서열 번호 86, 도 101 의 아미노산 번호 173-525), 및 인간 LAG-3 의 전체 길이의 발현 플라스미드도 사용하였다 (모두 pcDNA3.1 을 사용하여 구축 ; 인간 LAG-3 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 85, 도 100 에 기재되어 있다). IMP731 및 실시예 2)-6 에서 제조한 래트 항인간 LAG-3 항체 클론 6D7 은 모두, 전체 길이의 인간 LAG-3 을 발현한 세포에는 결합했지만, 도메인 1 이 빠진 변이체 (FLAG-D2D3D4, FLAG-D3D4, FLAG-D4) 에는 결합하지 않고, 도메인 1 에 결합하는 것이 분명해졌다. 즉, LAG-3 세포 외 영역에 존재하는 4 개의 면역 글로블린형 도메인 중 도메인 3 에 결합하는 취득 래트 항 LAG-3 항체 rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 및 rLA1264 는, 도메인 1 에 결합하는 IMP731 과는 상이한 에피토프를 인식하는 것이 분명해졌다.
2)-6 정제 LAG-3 단백질을 면역원으로 한 래트 항인간 LAG-3 항체의 취득
실시예 1)-1 과는 다른 면역 방법으로서, 정제 LAG-3 단백질을 면역원으로 하여 래트 항인간 LAG-3 항체의 취득을 실시하였다. 인간 LAG-3 의 세포 외 영역 (1-450) 의 C 말단에 His 태그를 부가한 단백질을 Freund's Complete Adjuvant (와코우 순약사 제조) 와 혼합 (체적비로 1 : 2) 하여 에멀션으로 한 것을 8 주령의 WKY/Izm 래트의 암컷 (닛폰 SLC 사) 의 미근부 (尾根部) 에 1 마리당 200 ㎍ 투여하였다. 3 주 후에 항원 단백질만을 미근부에 1 마리당 200 ㎍ 투여하고, 또한 그 2 주 후에 림프절을 채취하여, 실시예 1)-2 의 방법에 의해 하이브리도마를 제조하였다. 실시예 1)-3 및 1)-4 등의 방법으로 스크리닝을 실시하고, 얻어진 모노클로날 항체의 에피토프를 실시예 2)-5 의 방법에 의해 해석한 결과, 평가한 클론의 58 ％ 가 LAG-3 세포 외 영역에 존재하는 4 개의 면역 글로블린형 도메인 중 도메인 1 에, 26 ％ 가 도메인 2 에 결합하여, N 말단에 가까운 부분에 대한 모노클로날 항체가 우선적으로 취득된 것이 분명해졌다. 그 중에서 플로우 사이토메트리로 인간 활성화 T 세포 (PHA blast) 에 강하게 결합하는 클론의 상당수는, 클론 6D7 을 포함하여, LAG-3 의 도메인 1 에 결합하고, 그것들은 모두 실시예 2)-3 에 기재된 LAG-3/MHC 클래스 II 결합 시험에서 강한 저해 활성을 나타냈다. 이 결과는, LAG-3 과 MHC 클래스 II 분자의 결합에는, LAG-3 의 세포 외의 4 개의 면역 글로블린형 도메인 중, N 말단의 도메인 1 및 2 가 중요하다는 지금까지의 지견 (비특허문헌 4) 과 잘 일치하는 것이며, LAG-3 과 MHC 클래스 II 분자의 결합을 저해하지 않는, 즉 LAG-3 의 T 세포 억제 기능을 저해하지 않는 항체를 취득하기 위해서는, 실시예 1)-1 과 같은 면역 방법의 연구를 하여 모노클로날 항체를 제조할 필요가 있는 것을 나타내고 있다.
실시예 3. 래트 항인간 LAG-3 항체 (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 및 rLA1264) 의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열의 결정
3)-1 rLA204 의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열의 결정
3)-1-1 rLA204 산생 하이브리도마로부터의 총 RNA 의 조제
rLA204 의 가변 영역을 포함하는 cDNA 를 증폭시키기 위해, rLA204 산생 하이브리도마로부터 TRIzol Reagent (Ambion 사) 를 사용하여 총 RNA 를 조제하였다.
3)-1-2 cDNA (5'-RACE-Ready cDNA) 의 합성
cDNA(5'-RACE-Ready cDNA) 의 합성은 실시예 3)-1-1 에서 조제한 총 RNA 의 약 1 ㎍ 을 사용하여, SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (Clontech 사) 를 사용하여 실시하였다.
3)-1-3 5'-RACE PCR 에 의한 rLA204 의 중사슬 가변 영역을 포함하는 cDNA 의 증폭과 서열의 결정
rLA204 의 중사슬 유전자의 가변 영역의 cDNA 를 PCR 로 증폭시키기 위한 프라이머로서, UPM (Universal Primer A Mix : SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 에 부속), 및 5'-CTCCAGAGTTCCAGGTCACGGTGACTGGC-3' (RG2AR3 ; 서열 번호 71) 의 서열을 갖는 올리고 뉴클레오티드를 사용하였다. UPM 은 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (Clontech 사) 에 부속된 것을 사용하고, RG2AR3 은 데이터베이스의 래트 중사슬의 정상 영역의 서열로부터 설계하였다.
이 프라이머의 조합과, 실시예 3)-1-2 에서 합성한 cDNA(5'-RACE-Ready cDNA) 를 주형으로 한 5'-RACE PCR 에 의해 rLA204 의 중사슬의 가변 영역을 포함하는 cDNA 를 증폭시켰다. PCR 은, Polymerase 로서 KOD-Plus- (TOYOBO 사) 를 사용하고, SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (Clontech 사) 의 매뉴얼에 따라, 터치다운 PCR 프로그램으로 실시하였다.
5'-RACE PCR 로 증폭시킨 중사슬의 가변 영역을 포함하는 cDNA 를 MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN 사) 를 사용하여 정제 후, Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen 사) 를 사용하여 클로닝하고, 클로닝한 중사슬의 가변 영역을 포함하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열의 시퀀스 해석을 실시하였다.
시퀀스 프라이머로서, 데이터베이스의 래트 중사슬의 정상 영역의 서열로부터 설계한 5'-CTCCAGAGTTCCAGGTCACGGTGACTGGC-3' (RG2AR3 ; 서열 번호 71) 의 서열을 갖는 올리고 뉴클레오티드, 및 NUP (Nested Universal Primer A : SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 에 부속) 를 사용하였다.
결정된 rLA204 의 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 1 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 2 에 나타냈다.
3)-1-4 5'-RACE PCR 에 의한 rLA204 의 경사슬 가변 영역을 포함하는 cDNA 의 증폭과 서열의 결정
rLA204 의 경사슬 유전자의 가변 영역의 cDNA 를 PCR 로 증폭시키기 위한 프라이머로서, UPM (Universal Primer A Mix : SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 에 부속), 및 5'-TCAGTAACACTGTCCAGGACACCATCTC-3' (RKR5 ; 서열 번호 72) 의 서열을 갖는 올리고 뉴클레오티드를 사용하였다. UPM 은 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (Clontech 사) 에 부속된 것을 사용하고, RKR5 는 데이터베이스의 래트 경사슬의 정상 영역의 서열로부터 설계하였다.
이 프라이머의 조합과, 실시예 3)-1-2 에서 합성한 cDNA(5'-RACE-Ready cDNA) 를 주형으로 한 5'-RACE PCR 에 의해 rLA204 의 경사슬의 가변 영역을 포함하는 cDNA 를 증폭시켰다. PCR 은, Polymerase 로서 KOD-Plus- (TOYOBO 사) 를 사용하고, SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (Clontech 사) 의 매뉴얼에 따라, 터치다운 PCR 프로그램으로 실시하였다.
5'-RACE PCR 로 증폭시킨 경사슬의 가변 영역을 포함하는 cDNA 를 MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN 사) 를 사용하여 정제 후, Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen 사) 를 사용하여 클로닝하고, 클로닝한 경사슬의 가변 영역을 포함하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열의 시퀀스 해석을 실시하였다.
시퀀스 프라이머로서, 데이터베이스의 래트 경사슬의 정상 영역의 서열로부터 설계한 5'-TCAGTAACACTGTCCAGGACACCATCTC-3' (RKR5 ; 서열 번호 72) 의 서열을 갖는 올리고 뉴클레오티드, 및 NUP (Nested Universal Primer A : SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 에 부속) 를 사용하였다.
결정된 rLA204 의 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 3 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 4 에 나타냈다.
3)-2 rLA212 의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열의 결정
실시예 3)-1 과 동일한 방법으로 서열을 결정하였다.
결정된 rLA212 의 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 5 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 6 에 나타냈다. 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 7 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 8 에 나타냈다.
3)-3 rLA225 의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열의 결정
실시예 3)-1 과 동일한 방법으로 서열을 결정하였다.
결정된 rLA225 의 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 9 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 10 에 나타냈다. 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 11 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 12 에 나타냈다.
3)-4 rLA869 의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열의 결정
실시예 3)-1 과 동일한 방법으로 서열을 결정하였다.
결정된 rLA869 의 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 13 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 14 에 나타냈다. 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 15 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 16 에 나타냈다.
3)-5 rLA1264 의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열의 결정
실시예 3)-1 과 동일한 방법으로 서열을 결정하였다.
결정된 rLA1264 의 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 17 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 18 에 나타냈다. 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 19 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 20 에 나타냈다.
실시예 4. 인간 키메라화 항인간 LAG-3 항체 (cLA212) 의 제조
4)-1 키메라 및 인간화 항체 경사슬 발현 벡터 pCMA-LK 의 구축
플라스미드 pcDNA3.3-TOPO/LacZ (Invitrogen 사) 를 제한 효소 XbaI 및 PmeI 로 소화하여 얻어지는 약 5.4 kb 의 프래그먼트와, 서열 번호 21 에 나타내는 인간 경사슬 분비 시그널 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을, In-Fusion Advantage PCR 클로닝 키트 (Clontech 사) 를 사용하여 결합하여, pcDNA3.3/LK 를 제조하였다.
pcDNA3.3/LK 를 주형으로 하여, 하기 프라이머 세트로 PCR 을 실시하고, 얻어진 약 3.8 kb 의 프래그먼트를 인산화 후 셀프 라이게이션함으로써 CMV 프로모터의 하류에 시그널 서열, 클로닝 사이트, 및 인간 경사슬 정상 영역을 갖는 키메라 및 인간화 항체 경사슬 발현 벡터 pCMA-LK 를 구축하였다.
프라이머 세트
5'-TATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGC-3' (3.3-F1 ; 서열 번호 73)
5'-GCTATGGCAGGGCCTGCCGCCCCGACGTTG-3' (3.3-R1 ; 서열 번호 74)
4)-2 키메라 및 인간화 항체 IgG1 타입 중사슬 발현 벡터 pCMA-G1 의 구축
pCMA-LK 를 XbaI 및 PmeI 로 소화하여 경사슬 분비 시그널 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 제거한 DNA 단편과, 서열 번호 22 에 나타내는 인간 중사슬 시그널 서열 및 인간 IgG1 정상 영역의 아미노산을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을, In-Fusion Advantage PCR 클로닝 키트 (Clontech 사) 를 사용하여 결합하여, CMV 프로모터의 하류에 시그널 서열, 클로닝 사이트, 인간 IgG1 중사슬 정상 영역을 갖는 키메라 및 인간화 항체 IgG1 타입 중사슬 발현 벡터 pCMA-G1 을 구축하였다.
4)-3 cLA212 중사슬 발현 벡터의 구축
실시예 3)-2 에서 얻어진 rLA212 의 중사슬의 가변 영역을 포함하는 cDNA 를 템플릿으로 하여, KOD-Plus- (TOYOBO 사) 와 하기의 프라이머 세트로 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 를 포함하는 DNA 단편을 증폭시키고, 키메라 및 인간화 IgG1 타입 중사슬 발현 벡터 pCMA-G1 을 제한 효소 BlpI 로 절단한 지점에 In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (Clontech 사) 를 사용하여 삽입함으로써, cLA212 중사슬 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-G1/cLA212」 라고 명명하였다. cLA212 중사슬의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 23 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 24 에 나타냈다.
cLA212 중사슬용 프라이머 세트
5'-CCAGATGGGTGCTGAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGG-3' (212H-F ; 서열 번호 75)
5'-CTTGGTGGAGGCTGAGCTGACTGTGACCATGACTCCTTGGCCCCAG-3' (212H-R ; 서열 번호 76)
4)-4 cLA212 경사슬 발현 벡터의 구축
실시예 3)-2 에서 얻어진 rLA212 의 경사슬의 가변 영역을 포함하는 cDNA 를 템플릿으로 하여, KOD-Plus- (TOYOBO 사) 와 하기의 프라이머 세트로 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 를 포함하는 DAN 단편을 증폭시키고, 키메라 및 인간화 경사슬 발현 범용 벡터 pCMA-LK 를 제한 효소 BsiWI 로 절단한 지점에 In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (Clontech 사) 를 사용하여 삽입함으로써, cLA212 의 경사슬 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-LK/cLA212」 라고 명명하였다. cLA212 의 경사슬의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 25 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 26 에 나타냈다.
cLA212 경사슬용 프라이머 세트
5'-ATCTCCGGCGCGTACGGCAACATTGTGATGACCCAGTCTCCCAAATCC-3' (212L-F ; 서열 번호 77)
5'-GGAGGGGGCGGCCACAGCCCGTTTCAGTTCCAGCTCGGTCCCAGC-3' (212L-R ; 서열 번호 78)
4)-5 cLA212 의 생산
FreeStyle 293F 세포 (Invitrogen 사) 는 매뉴얼에 따라, 계대, 배양을 실시하였다. 대수 증식기의 1.2 × 109 개의 FreeStyle 293F 세포 (Invitrogen 사) 를 3L Fernbach Erlenmeyer Flask (CORNING 사) 에 파종하고, FreeStyle293 expression medium (Invitrogen 사) 으로 희석시키고 2.0 × 106 세포/㎖ 로 조제한 후에, 37 ℃, 8 ％ CO2 인큐베이터 내에서 90 rpm 으로 1 시간 진탕 배양하였다. Polyethyleneimine (Polyscience #24765) 1.8 ㎎ 을 Opti-Pro SFM 배지 (Invitrogen 사) 20 ㎖ 에 용해시키고, 다음으로 NucleoBond Xtra (TaKaRa 사) 를 사용하여 조제한 H 사슬 발현 벡터 (0.24 ㎎) 및 L 사슬 발현 벡터 (0.36 ㎎) 를 20 ㎖ 의 Opti-Pro SFM 배지 (Invitrogen 사) 에 첨가하였다. Polyethyleneimine/Opti-Pro SFM 혼합액 20 ㎖ 에, 발현 벡터/Opti-Pro SFM 혼합액 20 ㎖ 를 첨가하고 천천히 교반하고, 추가로 5 분간 방치한 후에 FreeStyle 293F 세포에 첨가하였다. 37 ℃, 8 ％ CO2 인큐베이터에서 4 시간, 90 rpm 으로 진탕 배양 후에 600 ㎖ 의 EX-CELL VPRO 배지 (SAFC Biosciences 사), 18 ㎖ 의 GlutaMAX I (GIBCO 사), 및 30 ㎖ 의 Yeastolate Ultrafiltrate (GIBCO 사) 를 첨가하고, 37 ℃, 8 ％ CO2 인큐베이터에서 7 일간, 90 rpm 으로 진탕 배양하고 얻어진 배양 상청을 Disposable Capsule Filter (Advantec #CCS-045-E1H) 로 여과하였다.
pCMA-G1/cLA212 와 pCMA-LK/cLA212 의 조합에 의해 취득된 rLA212 의 인간 키메라 항체를 「cLA212」 라고 명명하였다.
4)-6 cLA212 의 정제
실시예 4)-5 에서 얻어진 배양 상청으로부터 항체를 rProtein A 어피니티 크로마토그래피 (4 - 6 ℃ 하) 로 정제하였다. rProtein A 어피니티 크로마토그래피 정제 후의 버퍼 치환 공정은 4 - 6 ℃ 하에서 실시하였다. 최초로 배양 상청을 PBS 로 평형화한 MabSelectSuRe (GE 헬스 케어사 제조) 가 충전된 칼럼에 어플라이하였다. 배양액이 칼럼에 모두 들어간 후, 칼럼 용량 2 배 이상의 PBS 로 칼럼을 세정하였다. 다음으로 2 M 아르기닌 염산염 용액 (pH4.0) 으로 용출하고, 항체가 포함되는 획분을 모았다. 그 획분을 투석 (Thermo Scientific 사, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 에 의해 HBSor (25 mM 히스티딘/5 ％ 소르비톨, pH6.0) 로의 액 치환을 실시하였다. 마지막으로 Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (분획 분자량 UF10K, Sartorius 사, 4 ℃ 하) 에서 농축하고, IgG 농도를 2 ㎎/㎖ 이상으로 조제하여 정제 샘플로 하였다. 마지막으로 Minisart-Plus filter (Sartorius 사) 로 여과하고, 정제 샘플로 하였다.
4)-7 인간 키메라화 항 LAG-3 항체 (cLA212) 의 항원 결합 활성
293T-lacZ 세포 (실시예 1)-5-1 에 기재) 에 대해, Lipofectamine 2000 (Invitrogen 사 제조) 을 사용하여, 인간 LAG-3 의 발현 플라스미드 pcDNA3.1-hLAG-3 을 도입하고, 1 일간 배양한 후, 플로우 사이토메트리에 사용하였다. 플로우 사이토메트리는, 실시예 1)-4 에 기재된 방법에 준하여 실시하고, 단 2 차 항체는 FACS 버퍼로 200 배로 희석시킨 항인간 IgG PE 콘주게이트 (Anti-Human IgG PE conjugate (Jackson ImmunoResearch Laboratories 사 제조)) 를 사용하였다. 도 6 에 나타내는 바와 같이, 인간 키메라화 항 LAG-3 항체 cLA212 는, 농도 의존적으로 인간 LAG-3 발현 293T-lacZ 세포에 결합하여, 키메라화에 의해서도 결합 활성을 유지하고 있는 것이 분명해졌다.
실시예 5. 래트 항인간 LAG-3 항체 (rLA212) 의 인간화 버젼 (hLA212) 의 설계
5-1 래트 항인간 LAG-3 항체 rLA212 의 인간화 항체 디자인
5)-1-1 rLA212 의 가변 영역의 분자 모델링
rLA212 의 가변 영역의 분자 모델링은, 호몰로지 모델링으로서 공지된 방법 (Methods in Enzymology, 203, 121-153,(1991)) 에 의해 실행되었다. Protein Data Bank (Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007)) 에 등록되어 있는 인간 면역 글로블린의 가변 영역의 1 차 서열 (X 선 결정 구조로부터 유도되는 삼차원 구조가 입수 가능하다) 을, 실시예 3)-2 에서 결정된 rLA212 의 가변 영역과 비교하였다. 결과적으로 2GHW 와 2ARJ 가 rLA212 의 중사슬과 경사슬의 가변 영역에 대해 가장 높은 서열 동일성을 갖는 것으로 선택되었다. 프레임 워크 영역의 삼차원 구조는, rLA212 의 중사슬 및 경사슬에 대응하는 2GHW 와 2ARJ 의 좌표를 조합하여, 「프레임 워크 모델」 을 얻음으로써 제조되었다. 이어서, 각각의 CDR 에 대한 대표적인 컨퍼메이션이 프레임 워크 모델에 도입되었다. 마지막으로, 에너지의 점에서 rLA212 의 가변 영역의 가능성이 있는 분자 모델을 얻기 위해, 불리한 원자간 접촉을 제거하기 위한 에너지 계산을 실시하였다. 상기 순서를, 시판되는 단백질 입체 구조 해석 프로그램 Discovery Studio (Accelrys 사 제조) 를 사용하여 실시하였다.
5)-1-2 인간화 항인간 LAG-3 항체 hLA212 에 대한 아미노산 서열의 설계
인간화 항인간 LAG-3 항체 hLA212 의 구축을, CDR 그래프팅 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)) 으로서 일반적으로 공지된 방법에 의해 실시하였다. 억셉터 항체는, 프레임 워크 영역 내의 아미노산 동일성에 기초하여 선택되었다.
rLA212 의 프레임 워크 영역의 서열을, KABAT et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) 에 있어서 기정되는 인간의 서브 그룹·컨센서스 서열이나 Germline 서열의 프레임 워크 영역과 비교하였다. 결과적으로, 중사슬에 대해서는 인간 gamma 사슬 서브 그룹 3 의 컨센서스 서열이, 경사슬에 대해서는 인간 kappa 사슬 서브 그룹 1 의 컨센서스 서열이, 그 프레임 워크 영역에 있어서 높은 서열 동일성을 갖는 것에서 기인하여, 억셉터로서 선택되었다. 억셉터에 대한 프레임 워크 영역의 아미노산 잔기를, rLA212 에 대한 아미노산 잔기와 정렬시켜, 상이한 아미노산이 사용되는 위치를 동정하였다. 이들 잔기의 위치는, 실시예 5)-1-1 에서 구축된 rLA212 의 삼차원 모델을 사용하여 분석되고, 그리고 억셉터 상에 그래프팅되어야 할 도너 잔기가, Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)) 에 의해 부여되는 기준에 의해 선택되었다. 선택된 몇 개의 도너 잔기를 억셉터 항체에 이입함으로써, 인간화 hLA212 의 서열을 이하의 실시예에 기재되도록 구축하였다.
5)-2 rLA212 중사슬의 인간화
5)-2-1 인간화 hLA212_H2 타입 중사슬
서열 번호 24 에 나타내는 키메라 cLA212 의 중사슬 중 가변 영역 부분의 아미노산 번호 16 째의 아르기닌을 글리신으로, 아미노산 번호 19 째의 리신을 아르기닌으로, 아미노산 번호 42 째의 트레오닌을 글리신으로, 아미노산 번호 43 째의 아르기닌을 리신으로, 아미노산 번호 49 째의 알라닌을 글리신으로, 아미노산 번호 84 째의 아스파르트산을 아스파라긴으로, 아미노산 번호 88 째의 세린을 알라닌으로, 아미노산 번호 93 째의 트레오닌을 발린으로, 아미노산 번호 115 째의 발린을 트레오닌으로, 아미노산 번호 116 째의 메티오닌을 류신으로 치환함에 따라 설계된 인간화 hLA212 중사슬을 「인간화 hLA212_H2 타입 중사슬」 (「hLA212_H2」 라고 부르는 경우도 있다) 이라고 명명하였다.
인간화 hLA212_H2 타입 중사슬의 아미노산 서열은, 서열표의 서열 번호 28 에 기재되어 있다. 서열 번호 28 의 아미노산 서열의 1 내지 19 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열, 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열, 141 내지 470 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열이, 각각 시그널 서열, 중사슬 가변 영역, 중사슬 정상 영역에 상당한다. 서열 번호 28 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열은, 서열표의 서열 번호 27 에 기재되어 있다. 서열 번호 27 의 뉴클레오티드 서열의 1 내지 57 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열, 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열, 421 내지 1410 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열이, 각각 시그널 서열, 중사슬 가변 영역 서열, 중사슬 정상 영역 서열을 코드하고 있다. 서열 번호 27 의 뉴클레오티드 서열 및 서열 번호 28 의 아미노산 서열은, 각각 도 42 및 43 에도 기재되어 있다.
5)-2-2 인간화 hLA212_H3 타입 중사슬
서열 번호 24 에 나타내는 키메라 cLA212 의 중사슬 중 가변 영역 부분의 아미노산 번호 16 째의 아르기닌을 글리신으로, 아미노산 번호 19 째의 리신을 아르기닌으로, 아미노산 번호 42 째의 트레오닌을 글리신으로, 아미노산 번호 43 째의 아르기닌을 리신으로, 아미노산 번호 88 째의 세린을 알라닌으로, 아미노산 번호 93 째의 트레오닌을 발린으로, 아미노산 번호 115 째의 발린을 트레오닌으로, 아미노산 번호 116 째의 메티오닌을 류신으로 치환함에 따라 설계된 인간화 hLA212 중사슬을 「인간화 hLA212_H3 타입 중사슬」 (「hLA212_H3」 이라고 부르는 경우도 있다) 이라고 명명하였다.
인간화 hLA212_H3 타입 중사슬의 아미노산 서열은, 서열표의 서열 번호 30 에 기재되어 있다. 서열 번호 30 의 아미노산 서열의 1 내지 19 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열, 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열, 141 내지 470 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열이, 각각 시그널 서열, 중사슬 가변 영역, 중사슬 정상 영역에 상당한다. 서열 번호 30 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열은, 서열표의 서열 번호 29 에 기재되어 있다. 서열 번호 29 의 뉴클레오티드 서열의 1 내지 57 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열, 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열, 421 내지 1410 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열이, 각각 시그널 서열, 중사슬 가변 영역 서열, 중사슬 정상 영역 서열을 코드하고 있다. 서열 번호 29 의 뉴클레오티드 서열 및 서열 번호 30 의 아미노산 서열은, 각각 도 44 및 45 에도 기재되어 있다.
5)-3 rLA212 경사슬의 인간화
5)-3-1 인간화 hLA212_L1 타입 경사슬
서열 번호 26 에 나타내는 키메라 cLA212 의 경사슬 중 가변 영역 부분의 아미노산 번호 1 째의 아스파라긴을 아스파르트산으로, 아미노산 번호 3 째의 발린을 글루타민으로, 아미노산 번호 9 째의 리신을 세린으로, 아미노산 번호 11 째의 메티오닌을 류신으로, 아미노산 번호 13 째의 이소류신을 알라닌으로, 아미노산 번호 21 째의 메티오닌을 이소류신으로, 아미노산 번호 22 째의 아스파라긴을 트레오닌으로, 아미노산 번호 38 째의 리신을 글루타민으로, 아미노산 번호 43 째의 세린을 알라닌으로, 아미노산 번호 60 째의 아스파르트산을 세린으로, 아미노산 번호 63 째의 트레오닌을 세린으로, 아미노산 번호 65 째의 글리신을 세린으로, 아미노산 번호 67 째의 티로신을 세린으로, 아미노산 번호 76 째의 아스파라긴을 세린으로, 아미노산 번호 78 째의 발린을 류신으로, 아미노산 번호 80 째의 알라닌을 프롤린으로, 아미노산 번호 83 째의 알라닌을 페닐알라닌으로, 아미노산 번호 85 째의 페닐알라닌을 트레오닌으로, 아미노산 번호 100 째의 알라닌을 글루타민으로, 아미노산 번호 103 째의 글루탐산을 리신으로, 아미노산 번호 104 째의 류신을 발린으로, 아미노산 번호 106 째의 류신을 이소류신으로, 아미노산 번호 109 째의 알라닌을 트레오닌으로 치환함에 따라 설계된 인간화 hLA212 경사슬을 「인간화 hLA212_L1 타입 경사슬」 (「hLA212_L1」 이라고 부르는 경우도 있다) 이라고 명명하였다.
인간화 hLA212_L1 타입 경사슬의 아미노산 서열은, 서열표의 서열 번호 32 에 기재되어 있다. 서열 번호 32 의 아미노산 서열의 1 내지 20 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열, 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열, 130 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열이, 각각 시그널 서열, 경사슬 가변 영역, 경사슬 정상 영역에 상당한다. 서열 번호 32 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열은, 서열표의 서열 번호 31 에 기재되어 있다. 서열 번호 31 의 뉴클레오티드 서열의 1 내지 60 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열, 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열, 388 내지 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열이, 각각 시그널 서열, 경사슬 가변 영역 서열, 경사슬 정상 영역 서열을 코드하고 있다. 서열 번호 31 의 뉴클레오티드 서열 및 서열 번호 32 의 아미노산 서열은, 각각 도 46 및 47 에도 기재되어 있다.
5)-3-2 인간화 hLA212_L2 타입 경사슬
서열 번호 26 에 나타내는 키메라 cLA212 의 경사슬 중 가변 영역 부분의 아미노산 번호 1 째의 아스파라긴을 아스파르트산으로, 아미노산 번호 3 째의 발린을 글루타민으로, 아미노산 번호 9 째의 리신을 세린으로, 아미노산 번호 11 째의 메티오닌을 류신으로, 아미노산 번호 13 째의 이소류신을 알라닌으로, 아미노산 번호 21 째의 메티오닌을 이소류신으로, 아미노산 번호 22 째의 아스파라긴을 트레오닌으로, 아미노산 번호 38 째의 리신을 글루타민으로, 아미노산 번호 60 째의 아스파르트산을 세린으로, 아미노산 번호 63 째의 트레오닌을 세린으로, 아미노산 번호 65 째의 글리신을 세린으로, 아미노산 번호 76 째의 아스파라긴을 세린으로, 아미노산 번호 78 째의 발린을 류신으로, 아미노산 번호 80 째의 알라닌을 프롤린으로, 아미노산 번호 83 째의 알라닌을 페닐알라닌으로, 아미노산 번호 85 째의 페닐알라닌을 트레오닌으로, 아미노산 번호 100 째의 알라닌을 글루타민으로, 아미노산 번호 103 째의 글루탐산을 리신으로, 아미노산 번호 104 째의 류신을 발린으로, 아미노산 번호 106 째의 류신을 이소류신으로, 아미노산 번호 109 째의 알라닌을 트레오닌으로 치환함에 따라 설계된 인간화 hLA212 경사슬을 「인간화 hLA212_L2 타입 경사슬」 (「hLA212_L2」 라고 부르는 경우도 있다) 이라고 명명하였다.
인간화 hLA212_L2 타입 경사슬의 아미노산 서열은, 서열표의 서열 번호 34 에 기재되어 있다. 서열 번호 34 의 아미노산 서열의 1 내지 20 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열, 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열, 130 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열이, 각각 시그널 서열, 경사슬 가변 영역, 경사슬 정상 영역에 상당한다. 서열 번호 34 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열은, 서열표의 서열 번호 33 에 기재되어 있다. 서열 번호 33 의 뉴클레오티드 서열의 1 내지 60 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열, 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열, 388 내지 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열이, 각각 시그널 서열, 경사슬 가변 영역 서열, 경사슬 정상 영역 서열을 코드하고 있다. 서열 번호 33 의 뉴클레오티드 서열 및 서열 번호 34 의 아미노산 서열은, 각각 도 48 및 49 에도 기재되어 있다.
5)-3-3 인간화 hLA212_L3 타입 경사슬
서열 번호 26 에 나타내는 키메라 cLA212 의 경사슬 중 가변 영역 부분의 아미노산 번호 3 째의 발린을 글루타민으로, 아미노산 번호 9 째의 리신을 세린으로, 아미노산 번호 11 째의 메티오닌을 류신으로, 아미노산 번호 13 째의 이소류신을 알라닌으로, 아미노산 번호 21 째의 메티오닌을 이소류신으로, 아미노산 번호 22 째의 아스파라긴을 트레오닌으로, 아미노산 번호 63 째의 트레오닌을 세린으로, 아미노산 번호 76 째의 아스파라긴을 세린으로, 아미노산 번호 78 째의 발린을 류신으로, 아미노산 번호 80 째의 알라닌을 프롤린으로, 아미노산 번호 83 째의 알라닌을 페닐알라닌으로, 아미노산 번호 100 째의 알라닌을 글루타민으로, 아미노산 번호 103 째의 글루탐산을 리신으로, 아미노산 번호 104 째의 류신을 발린으로, 아미노산 번호 106 째의 류신을 이소류신으로, 아미노산 번호 109 째의 알라닌을 트레오닌으로 치환함에 따라 설계된 인간화 hLA212 경사슬을 「인간화 hLA212_L3 타입 경사슬」 (「hLA212_L3」 이라고 부르는 경우도 있다) 이라고 명명하였다.
인간화 hLA212_L3 타입 경사슬의 아미노산 서열은, 서열표의 서열 번호 36 에 기재되어 있다. 서열 번호 36 의 아미노산 서열의 1 내지 20 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열, 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열, 130 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열이, 각각 시그널 서열, 경사슬 가변 영역, 경사슬 정상 영역에 상당한다. 서열 번호 36 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열은, 서열표의 서열 번호 35 에 기재되어 있다. 서열 번호 35 의 뉴클레오티드 서열의 1 내지 60 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열, 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열, 388 내지 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열이, 각각 시그널 서열, 경사슬 가변 영역 서열, 경사슬 정상 영역 서열을 코드하고 있다. 서열 번호 35 의 뉴클레오티드 서열 및 서열 번호 36 의 아미노산 서열은, 각각 도 50 및 51 에도 기재되어 있다.
5)-3-4 인간화 hLA212_L4 타입 경사슬
서열 번호 26 에 나타내는 키메라 cLA212 의 경사슬 중 가변 영역 부분의 아미노산 번호 1 째의 아스파라긴을 아스파르트산으로, 아미노산 번호 3 째의 발린을 글루타민으로, 아미노산 번호 9 째의 리신을 세린으로, 아미노산 번호 22 째의 아스파라긴을 트레오닌으로, 아미노산 번호 60 째의 아스파르트산을 세린으로, 아미노산 번호 63 째의 트레오닌을 세린으로, 아미노산 번호 65 째의 글리신을 세린으로, 아미노산 번호 67 째의 티로신을 세린으로, 아미노산 번호 76 째의 아스파라긴을 세린으로, 아미노산 번호 80 째의 알라닌을 프롤린으로, 아미노산 번호 83 째의 알라닌을 페닐알라닌으로, 아미노산 번호 85 째의 페닐알라닌을 트레오닌으로, 아미노산 번호 100 째의 알라닌을 글루타민으로, 아미노산 번호 103 째의 글루탐산을 리신으로, 아미노산 번호 109 째의 알라닌을 트레오닌으로 치환함에 따라 설계된 인간화 hLA212 경사슬을 「인간화 hLA212_L4 타입 경사슬」 (「hLA212_L4」 라고 부르는 경우도 있다) 이라고 명명하였다.
인간화 hLA212_L4 타입 경사슬의 아미노산 서열은, 서열표의 서열 번호 38 에 기재되어 있다. 서열 번호 38 의 아미노산 서열의 1 내지 20 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열, 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열, 130 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열이, 각각 시그널 서열, 경사슬 가변 영역, 경사슬 정상 영역에 상당한다. 서열 번호 38 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열은, 서열표의 서열 번호 37 에 기재되어 있다. 서열 번호 37 의 뉴클레오티드 서열의 1 내지 60 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열, 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열, 388 내지 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열이, 각각 시그널 서열, 경사슬 가변 영역 서열, 경사슬 정상 영역 서열을 코드하고 있다. 서열 번호 37 의 뉴클레오티드 서열 및 서열 번호 38 의 아미노산 서열은, 각각 도 52 및 53 에도 기재되어 있다.
5)-3-5 인간화 hLA212_L5 타입 경사슬
서열 번호 26 에 나타내는 키메라 cLA212 의 경사슬 중 가변 영역 부분의 아미노산 번호 3 째의 발린을 글루타민으로, 아미노산 번호 9 째의 리신을 세린으로, 아미노산 번호 22 째의 아스파라긴을 트레오닌으로, 아미노산 번호 63 째의 트레오닌을 세린으로, 아미노산 번호 76 째의 아스파라긴을 세린으로, 아미노산 번호 80 째의 알라닌을 프롤린으로, 아미노산 번호 100 째의 알라닌을 글루타민으로, 아미노산 번호 103 째의 글루탐산을 리신으로, 아미노산 번호 109 째의 알라닌을 트레오닌으로 치환함에 따라 설계된 인간화 hLA212 경사슬을 「인간화 hLA212_L5 타입 경사슬」 (「hLA212_L5」 라고 부르는 경우도 있다) 이라고 명명하였다.
인간화 hLA212_L5 타입 경사슬의 아미노산 서열은, 서열표의 서열 번호 40 에 기재되어 있다. 서열 번호 40 의 아미노산 서열의 1 내지 20 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열, 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열, 130 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열이, 각각 시그널 서열, 경사슬 가변 영역, 경사슬 정상 영역에 상당한다. 서열 번호 40 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열은, 서열표의 서열 번호 39 에 기재되어 있다. 서열 번호 39 의 뉴클레오티드 서열의 1 내지 60 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열, 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열, 388 내지 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열이, 각각 시그널 서열, 경사슬 가변 영역 서열, 경사슬 정상 영역 서열을 코드하고 있다. 서열 번호 39 의 뉴클레오티드 서열 및 서열 번호 40 의 아미노산 서열은, 각각 도 54 및 55 에도 기재되어 있다.
5)-4 중사슬 및 경사슬의 조합에 의한 인간화 hLA212 의 설계
인간화 hLA212_H2 타입 중사슬 및 인간화 hLA212_L1 타입 경사슬로 이루어지는 항체를 설계하여 「인간화 hLA212_H2/L1」 (「hLA212_H2/L1」 이라고 부르는 경우도 있다) 이라고 명명하였다. 인간화 hLA212_H2 타입 중사슬 및 인간화 hLA212_L2 타입 경사슬로 이루어지는 항체를 설계하여 「인간화 hLA212_H2/L2」 (「hLA212_H2/L2」 라고 부르는 경우도 있다) 라고 명명하였다. 인간화 hLA212_H2 타입 중사슬 및 인간화 hLA212_L3 타입 경사슬로 이루어지는 항체를 설계하여 「인간화 hLA212_H2/L3」 (「hLA212_H2/L3」 이라고 부르는 경우도 있다) 이라고 명명하였다. 인간화 hLA212_H2 타입 중사슬 및 인간화 hLA212_L4 타입 경사슬로 이루어지는 항체를 설계하여 「인간화 hLA212_H2/L4」 (「hLA212_H2/L4」 라고 부르는 경우도 있다) 라고 명명하였다. 인간화 hLA212_H2 타입 중사슬 및 인간화 hLA212_L5 타입 경사슬로 이루어지는 항체를 설계하여 「인간화 hLA212_H2/L5」 (「hLA212_H2/L5」 라고 부르는 경우도 있다) 라고 명명하였다. 인간화 hLA212_H3 타입 중사슬 및 인간화 hLA212_L1 타입 경사슬로 이루어지는 항체를 설계하여 「인간화 hLA212_H3/L1」 (「hLA212_H3/L1」 부르는 경우도 있다) 이라고 명명하였다. 인간화 hLA212_H3 타입 중사슬 및 인간화 hLA212_L2 타입 경사슬로 이루어지는 항체를 설계하여 「인간화 hLA212_H3/L2」 (「hLA212_H3/L2」 라고 부르는 경우도 있다) 라고 명명하였다. 인간화 hLA212_H3 타입 중사슬 및 인간화 hLA212_L3 타입 경사슬로 이루어지는 항체를 설계하여 「인간화 hLA212_H3/L3」 (「hLA212_H3/L3」 이라고 부르는 경우도 있다) 이라고 명명하였다. 인간화 hLA212_H3 타입 중사슬 및 인간화 hLA212_L4 타입 경사슬로 이루어지는 항체를 설계하여 「인간화 hLA212_H3/L4」 (「hLA212_H3/L4」 라고 부르는 경우도 있다) 라고 명명하였다. 인간화 hLA212_H3 타입 중사슬 및 인간화 hLA212_L5 타입 경사슬로 이루어지는 항체를 설계하여 「인간화 hLA212_H3/L5」 (「hLA212_H3/L5」 라고 부르는 경우도 있다) 라고 명명하였다. 이상에 의해 설계한 항체는, 실시예 6 에 준하여 제조하고, 실시예 7 및 실시예 8 에 준하여 평가할 수 있다.
실시예 6. 인간 키메라화 항 LAG-3 항체 cLA212 의 인간화 항체 (hLA212) 의 발현 및 정제
6)-1 hLA212 의 중사슬 발현 벡터의 구축
6)-1-1 hLA212_H2 타입 중사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 27 에 나타내는 hLA212_H2 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드호 36 내지 437 에 나타내는 hLA212_H2 의 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사 Strings DNA Fragments). 합성한 DNA 단편을, 키메라 및 인간화 항체 IgG1 타입 중사슬 발현 벡터 pCMA-G1 을 제한 효소 BlpI 로 절단한 지점에 In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (Clontech 사) 를 사용하여 삽입함으로써 hLA212_H2 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA/hLA212_H2」 라고 명명하였다.
6)-1-2 hLA212_H3 타입 중사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 29 에 나타내는 hLA212_H3 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 36 내지 437 에 나타내는 hLA212_H2 의 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사 Strings DNA Fragments). 실시예 6)-1-1 과 동일한 방법으로 hLA212_H3 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA/hLA212_H3」 이라고 명명하였다.
6)-2 hLA212 의 경사슬 발현 벡터의 구축
6)-2-1 hLA212_L1 타입 경사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 31 에 나타내는 hLA212_L1 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 37 내지 402 에 나타내는 hLA212_L1 의 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사 Strings DNA Fragments). 합성한 DNA 단편을, 키메라 및 인간화 항체 경사슬 발현 벡터 pCMA-LK 를 제한 효소 BsiWI 로 절단한 지점에 In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (Clontech 사) 를 사용하여 삽입함으로써 hLA212_L1 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA/hLA212_L1」 이라고 명명하였다.
6)-2-2 hLA212_L2 타입 경사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 33 에 나타내는 hLA212_L2 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 37 내지 402 에 나타내는 hLA212_L2 의 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사 Strings DNA Fragments). 실시예 6)-2-1 과 동일한 방법으로 hLA212_L2 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA/hLA212_L2」 라고 명명하였다.
6)-2-3 hLA212_L3 타입 경사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 35 에 나타내는 hLA212_L3 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 37 내지 402 에 나타내는 hLA212_L3 의 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사 Strings DNA Fragments). 실시예 6)-2-1 과 동일한 방법으로 hLA212_L3 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA/hLA212_L3」 이라고 명명하였다.
6)-2-4 hLA212_L4 타입 경사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 37 에 나타내는 hLA212_L4 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 37 내지 402 에 나타내는 hLA212_L4 의 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사 Strings DNA Fragments). 실시예 6)-2-1 과 동일한 방법으로 hLA212_L4 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA/hLA212_L4」 라고 명명하였다.
6)-2-5 hLA212_L5 타입 경사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 39 에 나타내는 hLA212_L5 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 37 내지 402 에 나타내는 hLA212_L5 의 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사 Strings DNA Fragments). 실시예 6)-2-1 과 동일한 방법으로 hLA212_L5 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA/hLA212_L5」 라고 명명하였다.
6)-3 hLA212 항체의 조제
6)-3-1 hLA212 항체의 생산
실시예 4)-5 와 동일한 방법으로 생산하였다. 즉, pCMA/hLA212_H2 와 pCMA/hLA212_L1 의 조합에 의해, hLA212_H2/L1 을 취득하였다. pCMA/hLA212_H2 와 pCMA/hLA212_L2 의 조합에 의해, hLA212_H2/L2 를 취득하였다. pCMA/hLA212_H2 와 pCMA/hLA212_L3 의 조합에 의해, hLA212_H2/L3 을 취득하였다. pCMA/hLA212_H2 와 pCMA/hLA212_L4 의 조합에 의해, hLA212_H2/L4 를 취득하였다. pCMA/hLA212_H2 와 pCMA/hLA212_L5 의 조합에 의해, hLA212_H2/L5 를 취득하였다. pCMA/hLA212_H3 과 pCMA/hLA212_L1 의 조합에 의해, hLA212_H3/L1 을 취득하였다. pCMA/hLA212_H3 과 pCMA/hLA212_L2 의 조합에 의해, hLA212_H3/L2 를 취득하였다. pCMA/hLA212_H3 과 pCMA/hLA212_L3 의 조합에 의해, hLA212_H3/L3 을 취득하였다. pCMA/hLA212_H3 과 pCMA/hLA212_L4 의 조합에 의해, hLA212_H3/L4 를 취득하였다. pCMA/hLA212_H3 과 pCMA/hLA212_L5 의 조합에 의해, hLA212_H3/L5 를 취득하였다.
6)-3-2 hLA212 항체의 정제
6)-3-1 에서 얻어진 배양 상청을, 실시예 4)-6 과 동일한 방법으로 정제하였다.
실시예 7. 인간화 항인간 LAG-3 항체 (hLA212) 의 in vitro 평가
7)-1 인간화 항인간 LAG-3 항체 (hLA212) 의 Biacore 에 의한 항원 결합 활성 측정
인간 LAG-3 의 세포 외의 4 개의 면역 글로블린형 도메인 중 N 말단으로부터 3 및 4 번째 (263 - 450 번의 영역) 의 부분의 C 말단에 His 태그를 부가한 단백질 LAG-3_D3D4-HiS 를, FreeStyle 293F 세포 (Invitrogen 사) 에 발현시켰다. 얻어진 배양 상청을 버퍼 치환 (20 mM HEPES, 300 mM NaCl, pH7.5) 하고, HisTrap HP 칼럼 (GE 헬스 케어사) 추가로 Superdex75 칼럼 (GE 헬스 케어사) 을 사용하여, 인간 LAG-3_D3D4-His 단백질을 정제하였다. 최종 버퍼는 PBS 로 하였다.
항체와 항원 (LAG-3_D3D4-His) 의 해리 정수 측정은, Biacore T200 (GE 헬스 케어사) 을 사용하여, 고정화시킨 항인간 IgG (Fc) 항체 (Human Antibody Capture kit, GE 헬스 케어사) 에 항체를 리간드로서 포착 (캡처) 하고, 항원을 아날라이트로서 측정하는 캡처법으로 실시하였다. 항인간 IgG (Fc) 항체는, 센서 칩 CM5 (GE 헬스 케어사) 에 아민 커플링법으로 약 1000 RU 를 목표로 공유 결합시켰다. 레퍼런스 셀에도 동일하게 고정화시켰다. 러닝 버퍼로서 HBS-EP+ (10 mM HEPES pH7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05 ％ Surfactant P20) 를 사용하였다. 항인간 IgG (Fc) 항체를 고정화시킨 칩 상에, 항체를 약 1 분간 첨가한 후, 항원의 희석 계열 용액 (0.06 - 20 nM) 을 유속 90 ㎕/분으로 300 초간 첨가하고, 계속 3600 초간의 해리상을 모니터하였다. 재생 용액으로서, 3 M 염화마그네슘 용액을 유속 10 ㎕/분으로 30 초간 첨가하였다. 데이터의 해석에는, 분석 소프트웨어 (Biacore T200 Evaluation Software, version 1.0) 의 1 : 1 결합 모델을 사용하여, 결합 속도 정수 ka, 해리 속도 정수 kd 및 해리 정수 (KD ; KD = kd/ka) 를 산출하였다. 해리 정수는 도 7 에 나타나 있다.
7)-2 인간화 항인간 LAG-3 항체 (hLA212) 의 플로우 사이토메트리에 의한 인간 LAG-3 발현 세포에 대한 결합성의 검토
293T-lacZ 세포 (실시예 1)-5-1 에 기재) 에 대해, Lipofectamine 2000 (Invitrogen 사 제조) 를 사용하여, 인간 LAG-3 의 발현 플라스미드 pcDNA3.1/hLAG-3 을 도입하고, 1 일간 배양한 후, 플로우 사이토메트리에 사용하였다. 플로우 사이토메트리는, 실시예 1)-4 에 기재된 방법에 준하여 실시하고, 단 2 차 항체는 FACS 버퍼로 200 배로 희석시킨 항인간 IgG PE 콘주게이트 (Anti-Human IgG PE conjugate (Jackson ImmunoResearch Laboratories 사 제조)) 를 사용하였다. 도 8 에 나타내는 바와 같이, 10 클론의 인간화 항인간 LAG-3 항체 (hLA212_H2/L1, hLA212_H2/L2, hLA212_H2/L3, hLA212_H2/L4, hLA212_H2/L5, hLA212_H3/L1, hLA212_H3/L2, hLA212_H3/L3, hLA212_H3/L4,및 hLA212_H3/L5) 는 모두, 인간 키메라화 항 LAG-3 항체 cLA212 와 동일한 정도로, 농도 의존적인 인간 LAG-3 발현 293T-lacZ 세포에 대한 결합성을 나타내고, 인간화에 의해서도 결합 활성을 유지하고 있는 것이 분명해졌다.
7)-3 인간화 항인간 LAG-3 항체 (hLA212) 의 ADCC 활성
실시예 2)-2 에 기재된 방법에 의해, 인간화 항인간 LAG-3 항체 (hLA212) 의 ADCC 활성을 검토하였다. 그 결과, 도 9 에 나타내는 바와 같이, 10 클론의 인간화 항인간 LAG-3 항체 (hLA212_H2/L1, hLA212_H2/L2, hLA212_H2/L3, hLA212_H2/L4, hLA212_H2/L5, hLA212_H3/L1, hLA212_H3/L2, hLA212_H3/L3, hLA212_H3/L4, 및 hLA212_H3/L5) 는 모두, 인간 키메라화 항 LAG-3 항체 cLA212 와 거의 동일한 정도로, 농도 의존적인 인간 LAG-3 발현 293T-lacZ 세포에 대한 ADCC 활성을 나타내고, 인간화에 의해서도 ADCC 활성을 유지하고 있는 것이 분명해졌다.
7)-4 인간화 항인간 LAG-3 항체 hLA212_H3/L2 의 LAG-3 의 T 세포 억제 기능에 대한 영향의 검토
LAG-3 은, MHC 클래스 II 분자에 결합함으로써, T 세포에 어떠한 억제성의 시그널을 전달하여, T 세포의 기능을 부로 제어하는 것이 알려져 있다 (비특허문헌 1). LAG-3 과 MHC 클래스 II 분자의 결합에는, LAG-3 의 세포 외의 4 개의 면역 글로블린형 도메인 중, N 말단의 도메인 1 및 2 가 중요하다고 생각되고 있다 (비특허문헌 4). 실시예 1 의 방법으로 취득한 5 클론의 래트 항인간 LAG-3 항체 (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 및 rLA1264) 는 모두 도메인 3 을 인식하고, LAG-3/MHC 클래스 II 결합 시험 및 293T-hLAG-3/Raji 세포 접착 시험에서 저해 활성을 나타내지 않았는 데에 대해, 선행 기술의 항체인 인간 키메라화 항인간 LAG-3 항체 IMP731 은 도메인 1 을 인식하고, LAG-3/MHC 클래스 II 결합 시험 및 293T-hLAG-3/Raji 세포 접착 시험으로 강력한 저해 활성을 나타낸 것을 실시예 2 에 있어서 분명하게 하였다. 이들의 결과로부터, 실시예 1 의 방법으로 취득한 클론 및 그것에서 유래하는 인간화 항인간 LAG-3 항체는 LAG-3 본래의 T 세포 억제 기능에 영향을 미치지 않는 데에 대해, IMP731 은 그것을 저해하는 것이 상정되었다. 이러한 점을 실험적으로 확인하기 위해, 기보 (비특허문헌 9) 에 준하여, 인간화 항인간 LAG-3 항체 hLA212_H3/L2 의 LAG-3 의 T 세포 억제 기능에 대한 영향을 검토하였다. 인간 말초혈로부터 피콜 원심 분리로 분리한 PBMC 를, 2 × 105 세포/웰로 96 구멍 마이크로 플레이트에 파종하고, 항체를 첨가한 후, 37 ℃ 에서 30 분간 프리인큐베이션하였다. 거기에 SEB (Staphylococcal Enterotoxin B, Sigma 사 제조) 를 최종 농도 1 ng/㎖ 가 되도록 첨가하고, 4 일간 배양했을 때의 배양 상청 중의 IL-2 농도를 Human IL-2 Immunoassay kit (PerkinElmer 사 제조) 에 의해 정량하였다. 그 결과, 도 10 에 나타내는 바와 같이, 제조한 인간화 항인간 LAG-3 항체 hLA212_H3/L2 는 거의 IL-2 산생에 영향을 미치지 않았는 데에 대해, IMP731 은 IL-2 산생을 증가시켰다. 즉, 당초의 예측과 같이, 제조한 인간화 항인간 LAG-3 항체 hLA212_H3/L2 는 LAG-3 의 T 세포 억제 기능에 영향을 미치지 않는 데에 대해, IMP731 은 이것을 저해함으로써, 반대로 면역계를 활성화시켜 버리는 리스크가 있는 것이 분명해졌다.
실시예 8. 당 사슬 수식이 조절된 인간화 항체의 조제
서열 번호 30 (도 45) 으로 나타내는 아미노산 서열의 아미노산 번호 20 내지 470 을 포함하는 중사슬, 및 서열 번호 34 (도 49) 로 나타내는 아미노산 서열의 아미노산 번호 21 내지 234 를 포함하는 경사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 항체를, 공지된 방법에 따라, 그 항체 단백질에 결합하는 당 사슬 수식을 탈푸코오스화함으로써 조절하여, 얻어진 항체를 hLA212_H4/L2 라고 명명하였다. 당해 수식체를 질량 분석에 제공한 결과, 푸코오스를 함유하는 H 사슬의 피크는 검출 한계 이하였다. 본 발명에 있어서는, hLA212_H4/L2 와 같이 당 사슬 수식이 조절된 항체도 「항체」 또는 「항체의 수식체」 라고 부른다.
실시예 9. 인간화 항인간 LAG-3 항체 hLA212_H4/L2 의 in vitro 평가
9)-1 인간화 항인간 LAG-3 항체 hLA212_H4/L2 의 LAG-3 발현 세포에 대한 결합 활성
실시예 7)-2 에 기재된 방법에 의해 인간 LAG-3 을 발현시킨 293T-lacZ 세포에 대한, 인간화 항인간 LAG-3 항체 hLA212_H4/L2 의 결합을 플로우 사이토메트리에 의해 검토하였다. 그 결과, 도 11 에 나타내는 바와 같이, hLA212_H4/L2 의 농도 의존적인 결합이 관찰되었다.
9)-2 인간화 항인간 LAG-3 항체 hLA212_H4/L2 의 in vitro ADCC 활성
실시예 7)-2 에 기재된 방법에 의해, 인간화 항인간 LAG-3 항체 hLA212_H4/L2 의 in vitro ADCC 활성을 평가하였다. 그 결과, 도 12 에 나타내는 바와 같이, hLA212_H4/L2 는 인간 LAG-3 발현 293T-lacZ 세포에 대해 농도 의존적인 ADCC 활성을 나타냈다. 이에 대해, 인간 LAG-3 을 발현시키지 않은 293T-lacZ 세포에 대해서는, ADCC 활성을 나타내지 않았다.
실시예 10. 인간 LAG-3/인간 FcγRIIIA 더블 트랜스제닉 마우스의 제조
인간화 항인간 LAG-3 항체 hLA212_H4/L2 는, 실시예 9 에 나타내는 바와 같이 인간 LAG-3 에는 결합하지만, 설치류의 LAG-3 에는 교차하지 않는 것이 분명하게 되어 있다. 그래서 hLA212_H4/L2 의 in vivo 에서의 평가를 가능하게 하기 위해, 인간 LAG-3 을 마우스 LAG-3 의 발현 조절 기구를 이용하여 생리적으로 발현시킨 BAC (Bacterial Atrificial Chromosome) 트랜스제닉 마우스를 제조하는 것으로 하였다. 또, hLA212_H4/L2 와 같은 당 사슬 수식의 조절에 의해 ADCC 활성이 증강되기 위해서는, 인간 FcγRIIIA 가 필요하고 (Junttila, T. T., et al., Cancer Res., vol.70 (No.11) : pp4481-9 (2010)), 기보 (비특허문헌 10) 에 준하여 인간 FcγRIIIA 유전자를 포함하는 BAC 도 아울러 도입하는 것으로 하였다.
10)-1 Red/ET 반응을 사용한 재조합 BAC 발현 벡터의 컨스트럭션
대장균 내에서의 능동형 상동 재조합 반응인 Red/ET Recombination Technology (Zhang Y et al, A new logic for DNA engineering using recombination in E. Coli., Nature 20 (1998) 123-128) 를 이용하여, 인간 LAG-3 RecBAC 의 재조합 BAC 클론을 구축하였다.
인간 LAG-3 및 마우스 LAG-3 유전자좌를 각각 포함하는 BAC 게놈 클론, RP11-101F21 및 RP23-30O1 을 입수하였다. 아래의 표에 나타낸 바와 같이, 인간 LAG-3 유전자의 인트론 5 의 서열, 인간 LAG-3 유전자의 번역 개시 코돈으로부터 종지 코돈까지의 게놈 DNA 서열의 양단의 서열, 및 마우스 BAC 클론의 LAG-3 유전자의 번역 개시 코돈으로부터 종지 코돈까지의 게놈 DNA 서열의 3' 측 말단, 5' 측 말단을 대장균 내에서의 능동형 상동 재조합 반응을 위한 키 서열로 하였다.
LAG-3-H1 인간 LAG-3 유전자의 개시 코돈 부근의 서열
[5'] ATGTGGGAGGCTCAGTTCCTGGGCTTGCTGTTTC[3'] (서열 번호 79)
LAG-3-H2 인간 LAG-3 유전자의 종지 코돈 부근의 서열
[5'] GCCCGAGCCCGAGCCCGAGCCGGAGCAGCTCTGA[3'] (서열 번호 80)
LAG-3-H3 Rpsl-kan 삽입 사이트, 5' 측
[5'] GAGTATGTGTTGACTGGTTGATAACTATCG[3'] (서열 번호 81)
LAG-3-H4 Rpsl-kan 삽입 사이트, 3' 측
[5'] GCCATGACAGATTAGCCATGTCTGCAGCAC[3'] (서열 번호 82)
LAG-3-H5 마우스 LAG-3 유전자의 5' UTR
[5'] CAGGACCTTTTTCTAACCTCCCTTGGAGGGCTGGGGAGGCCCGGGCCATAGAGGAG[3'] (서열 번호 83)
LAG-3-H6 마우스 LAG-3 유전자의 3' UTR
[5'] CCTGGAGCCGAGGCAGCCAGCAGGTCTCAGCAGCTCCGCCCGCCCGCCCGCCCGCC[3'] (서열 번호 84)
먼저, 인간 BAC 클론의 LAG-3 유전자의 인트론 5 에 포지티브/네거티브 셀렉션 마커 카세트 (Rpsl-kan) 를 삽입하기 위해, LAG-3-H3 서열, Rpsl-kaN, 및 LAG-3-H4 서열을 탠덤하게 연결한 DNA 프래그먼트를, LA-Taq (다카라 바이오) 를 사용한 PCR 에 의해 구축하였다 (LAG-3 Rpsl-Kan 브레이크인 프래그먼트). Red/ET 반응의 능력을 갖는 대장균주에, LAG-3 유전자좌를 포함하는 인간 BAC 클론과 LAG-3 Rpsl-Kan 브레이크인 프래그먼트를 도입하고, 이 호스트 대장균 내에서 Red/ET 반응을 유도하고, 클로람페니콜 내성, 또한 카나마이신 내성의 콜로니를 픽업함으로써, LAG-3 Rpsl-kan 브레이크인 프래그먼트를 LAG-3 유전자좌의 인트론 5 에 삽입한 재조합 BAC 클론을 스크리닝하였다 (인간 LAG-3 인터메디에이트 (Intermediate)). 그리고 이 인간 LAG-3 인터메디에이트로부터, Rpsl-kan 카세트를 삽입한 인간 LAG-3 유전자의 게놈 DNA 서열을 플라스미드 벡터에 서브 클로닝하기 위해, H2-H6-SacBpBluescript-H5-H1 을 탠덤하게 연결한 DNA 카세트를 구축하였다 (LAG-3 프리트랜스퍼 플라스미드). 상기와 동일한 방법으로, Red/ET 반응의 능력을 갖는 대장균주에, 인간 LAG-3 인터메디에이트와 함께, 직사슬화된 LAG-3 프리트랜스퍼 플라스미드를 도입하고, 이 호스트 대장균 내에서 Red/ET 반응을 유도하여 암피실린 및 카나마이신 내성 콜로니를 픽업함으로써, Rpslkan 카세트를 삽입한 인간 LAG-3 유전자의 게놈 DNA 서열을 갖는 플라스미드를 스크리닝하였다 (인간 LAG-3 트랜스퍼 플라스미드).
다음으로, 제한 효소 반응에 의해, 이 인간 LAG-3 트랜스퍼 플라스미드로부터, 마우스 게놈 서열에서 유래하는 H5 서열과 H6 서열을 양단에 갖고, Rpsl-kan 카세트를 삽입한 인간 LAG-3 유전자의 게놈 DNA 서열을 플라스미드 벡터로부터 잘라내었다 (인간 LAG-3 트랜스퍼 프래그먼트). 상기와 동일한 방법으로, Red/ET 반응의 능력을 갖는 대장균주에, 마우스 LAG-3BAC 클론과 함께, 인간 LAG-3 트랜스퍼 프래그먼트를 도입하고, 이 호스트 대장균 내에서 Red/ET 반응을 유도하여 클로람페니콜, 및 카나마이신 내성 콜로니를 픽업함으로써, 마우스 LAG-3 유전자의 번역 개시 코돈으로부터 정지 코돈까지의 게놈 DNA 서열을, 인간 LAG-3 트랜스퍼 프래그먼트의 번역 개시 코돈으로부터 정지 코돈까지의 게놈 DNA 서열로 정확하게 치환한 마우스 LAG-3/인간 LAG-3 유전자의 재조합 BAC 클론을 스크리닝하였다 (마우스 LAG-3/인간 LAG-3 RecBACIntermediate).
마지막으로, 인간 LAG-3 유전자좌의 인트론 5 서열을 PCR 로 증폭시키고, 네거티브 셀렉션에 의해 인간 LAG-3 유전자의 인트론 5 에 삽입한 Rpsl-Kan 을 제거하기 위한 DNA 서열로 하였다 (인간 LAG-3 리페어 프래그먼트). 상기와 동일한 방법으로, Red/ET 반응의 능력을 갖는 대장균주에 마우스 LAG-3/인간 LAG-3 RecBAC 인터메디에이트와 함께, 인간 LAG-3 리페어 프래그먼트를 도입하고, 이 호스트 대장균 내에서 Red/ET 반응을 유도하여 클로람페니콜, 및 스트렙토마이신 내성 콜로니를 픽업함으로써, 마우스 LAG-3 유전자의 번역 개시 코돈으로부터 정지 코돈까지의 게놈 DNA 서열을, 인간 LAG-3 유전자의 번역 개시 코돈으로부터 정지 코돈까지의 게놈 DNA 서열로 정확하게 치환한 마우스 LAG-3/인간 LAG-3 유전자의 재조합 BAC 클론의 구축을 실시하였다 (인간 LAG-3 RecBAC). 시퀀스 해석에 의해, Red/ET 반응에서 접합한 H1 ∼ H6 의 게놈 DNA 서열을 확인하였다.
10)-2 고순도 BAC DNA 프래그먼트의 정제
인간 LAG-3 RecBAC 유전자 발현 컨스트럭트인 재조합 BAC 클론에 의해 형질 전환한 DH10B 셀을, 클로람페니콜을 포함하는 LB 아가 배지 상에서 클로닝하고, 그 싱글 콜로니를 픽업하여 액체 배지에서 일주야 진탕 배양하였다.
인간 LAG-3 RecBAC 유전자 발현 컨스트럭트를, 일부 개변한 아베들의 방법 (Exp Anim. 2004 53(4) : 311-20. Establishment of an efficient BAC transgenesis protocol and its application to functional characterization of the mouse Brachyury locus. Abe K, Hazama M, Katoh H, Yamamura K, Suzuki M.) 에 따라, 인간 LAG-3 RecBAC 재조합 BAC 클론을 플라스미드 추출 키트 (마키리나겔사, Nucleobond BAC100 키트) 를 사용하여 정제하고, PI-SceI 를 첨가하고 37 ℃, 16 시간 반응시켜 다이제스천을 실시하였다.
직사슬화된 인간 LAG-3 RecBAC 재조합 BAC 클론을 1 ％ SeaKem GTG 아가로오스 겔 (다카라 바이오) 에 어플라이하고, 펄스 필드 전기 영동 장치 (바이오래드, CHEF DR-II) 에 의해, 6 v/㎝, 0.1 - 40 sec, 15 hr, 14 ℃ 의 조건으로 전기 영동을 실시하였다. 샘플의 일부를 가이드 마커로 하여 UV 트랜스일루미네이터에 의해 가시화함으로써, 아가로오스 겔 중에서 분리한 직사슬화된 인간 LAG-3 RecBAC 재조합 BAC 클론을 UV 조사하는 일 없이, 면도기로 잘라내었다. 얻어진 장사슬 DNA 단편을 전기 용출법에 의해 아가로오스 겔로부터 추출하고, 마이크로인젝션용으로 조제한 TE 버퍼로, 4 ℃, 2 시간 투석하였다. 정제한 DNA 단편을 펄스 필드 전기 영동에 어플라이하고, 보다 장사슬 DNA 단편이 분단되는 일 없이 고도로 정제되어 있는 것을 확인함과 함께, NanoDrop 분광 광도계 (아사히 테크노글래스사) 에 의해 그 DNA 농도를 결정하였다. 이 DNA 단편의 용액을 0.5 ng/㎕ 가 되도록 희석시켜 트랜스제닉 마우스 작출용의 발현 컨스트럭트의 용액을 조제하였다.
10-3) C57BL/6J 마우스배 마이크로인젝션
자성 C57BL/6J 마우스에 PMSG 및 hCG 를 투여하여 과배란을 야기하고, 동 계통의 웅성 마우스와 교배한 후, 수정란을 채취하였다.
마이크로머니퓰레이터를 사용하여, C57BL/6J 마우스의 전핵기배의 웅성핵에, 정제한 인간 LAG-3 RecBAC/인간 FcγR BAC 발현 컨스트럭트를 직접 주입하였다. 이 DNA 주입배를 위임신 (僞姙娠) 야기한 수배자 (受胚雌) 마우스의 난관에 이식하였다.
10-4) 파운더의 서던 스크리닝
인간 LAG-3 RecBAC/인간 FcγR BAC 발현 컨스트럭트를 주입한 C57BL/6J 마우스 수정란으로부터 자연 분만에 의해 얻은 산자 (産子) 를 이유까지 보육하였다. 인간 LAG-3 RecBAC/인간 FcγR BAC 트랜스제닉 마우스, 파운더 후보 개체를 3 주령에서 이유하고, 개체 식별을 위한 이표 (耳標) 를 붙인 후에, 미부 (尾部) 조직을 생검하여 해석에 제공할 때까지 -80 ℃ 로 보관하였다.
-80 ℃ 에서 보존해 둔 인간 LAG-3 RecBAC/인간 FcγR BAC 트랜스제닉 마우스의 후보 개체의 미부 조직을 실온에서 융해시키고, 1 ％ SDS (와코우 순약), 1 ㎎/㎖ 액티나아제 E (카켄 제약) 및 0.15 ㎎/㎖ 프로테나아제 K (머크) 를 포함하는 라이시스 버퍼를 첨가하고, 55 ℃ 에서 16 시간 진탕하여 조직을 가용화하였다. 페놀 추출, 및 페놀/클로로포름 추출을 실시하여, 조직으로부터 가용화된 게놈 DNA 에 결합하는 단백질을 제거하였다. 게놈 DNA 에 혼재되는 RNA 를 RNase A (Sigma 사) 에 의해 분해한 후, 이소프로판올 침전에 의해 고분자 게놈 DNA 를 석출하였다. 석출한 게놈 DNA 를 70 ％ 에탄올로 세정하고 바람 건조시킨 후, 50 ㎕ 의 TE 에 재용해시켰다.
각 검체로부터 조제한 게놈 DNA 용액의 DNA 농도를 흡광법에 의해 결정하고, 각 검체의 DNA 농도의 값으로부터 DNA 5 ㎍ 에 상당하는 게놈 DNA 용액의 용량을 산출하였다.
각 검체로부터 조제한 게놈 DNA, 양성 대조 DNA (마이크로인젝션에 사용한 발현 컨스트럭트를 첨가한 컨트롤 마우스의 게놈 DNA), 및 음성 대조 DNA (컨트롤 마우스의 게놈 DNA) 에 제한 효소를 첨가하고, 37 ℃, 16 시간의 반응을 실시하였다. 생성한 게놈 DNA 의 단편을 이소프로판올 침전에 의해 석출하고, 70 ％ 에탄올로 세정하고 바람 건조시킨 후, TE 에 재용해시켰다. 이들 게놈 DNA 단편을 1.2 ％ 의 아가로오스 겔에 어플라이하여 전기 영동하고, 아가로오스 겔 중에 분리한 게놈 DNA 단편을 UV 트랜스일루미네이터에 의해 가시화하여, 스케일과 함께 사진 촬영하였다.
이 아가로오스 겔을 0.25 N 염산에 담그고 10 분간 천천히 진탕한 후, 0.4 N 수산화나트륨에 담그고 추가로 10 분간 천천히 진탕하였다. 0.4 N 수산화나트륨을 사용한 캐필러리법에 의해, 아가로오스 겔 중에 분리한 게놈 DNA 단편을, 실온에서 16 시간, 나일론 멤브레인 (Hybond-XL ; GE 헬스 케어사) 에 트랜스퍼하였다. 게놈 DNA 단편을 트랜스퍼한 나일론 멤브레인을 2 × SSC 에 담그고 10 분간 천천히 진탕한 후에 바람 건조시키고, 하이브리다이제이션에 사용할 때까지 실온에서 보존하였다.
DNA 라벨화 키트 (Megaprime DNA Labelling System ; GE 헬스 케어사) 를 사용하여, 랜덤 프라임법에 의해 DNA 프래그먼트를 [32P] 라벨하였다. 세파덱스 스핀 칼럼 (ProbeQuant G-50 Micro Columns ; GE 헬스 케어사) 을 사용하여 [32P] 라벨화한 프래그먼트를 정제하여, [32P] 라벨화 프로브로 하였다.
게놈 DNA 단편을 트랜스퍼한 나일론 멤브레인을 하이브리다이제이션 버퍼에 넣고, 65 ℃ 에서 1 시간 프리인큐베이트하였다. 그 후, 95 ℃, 5 분간 가열하고, 직후에 5 분간 빙랭하고 변성한 [32P] 라벨화 프로브를 첨가하고, 65 ℃ 에서 4 시간 인큐베이트하였다. 인큐베이션 종료 후에 나일론 멤브레인을 취출하고, 0.1 ％ SDS, 0.5 × SSC 로 65 ℃ 에서 약 15 분간 세정하였다. 서베이 미터로 멤브레인에 결합한 프로브에서 유래하는 방사 활성을 모니터하고, 방사 활성이 거의 일정해질 때까지 이 세정을 반복하였다.
세정한 멤브레인을 사란 랩으로 덮고, 암실 내에서 X 선 필름 (BioMax MS ; 코닥) 을 겹쳐 오토래디오그래피 카세트에 넣었다. 4 ℃ 에서 1 주간 감광한 후에 X 선 필름을 현상하였다. 인간 LAG-3 RecBAC/인간 FcγR BAC 발현 컨스트럭트에서 유래하는 특이적인 시그널을 오토래디오그래피로 검출하고, [32P] 라벨화 프로브와의 하이브리다이제이션에 의한 특이적인 시그널을 가져오는 개체를, 인간 LAG-3 RecBAC/인간 FcγR BAC 트랜스제닉 마우스, 파운더 개체로서 동정하였다.
10-5) F1 마우스의 작출 및 번식
파운더 개체의 후대 동물을 얻고 제노타이핑을 실시하여, Tg 마우스의 계통화를 실시하였다. 서던 해석에서 동정한 Tg 마우스·파운더와 야생형 C57BL/6J 마우스를 체외 수정 또는 자연 교배하여, F1 개체를 작출하였다. 제노타이핑에 의해 F1 개체에 트랜스진을 전달하고, 계통화된 라인을, 야생형 C57BL/6J 마우스와의 체외 수정 또는 자연 교배에 의한 번식에 제공하고, 제노타이핑에 의해 인간 LAG-3 및 인간 FcγRIIIA 가 모두 헤테로로 도입되어 있는 마우스를 실험에 사용하였다.
10-6) 인간 LAG-3/인간 FcγRIIIA 더블 트랜스제닉 마우스의 페노타이프의 확인
취득한 인간 LAG-3/인간 FcγRIIIA 더블 트랜스제닉 마우스에 있어서의 도입한 유전자의 발현을 플로우 사이토메트리법에 의해 검토하였다. 마우스의 미정맥으로부터 말초혈을 헤파린 처리 헤마토크리트 모세관에 채혈하고, PharmLyse (BD 사 제조) 에 의해 적혈구를 용혈하여 백혈구를 얻었다. 그 일부를 플로우 사이토메트리법에 의한 인간 FcγRIIIA 의 발현 해석에 사용하고, 나머지에 대해서는 LAG-3 의 발현을 유도하기 위해 2 ㎍/㎖ Concanavalin A (Con A : Sigma 사) 를 포함하는 배지에서 3 일간 자극하여 활성화 T 세포를 얻었다. 후자에 대해, PE 표지 항마우스 LAG-3 항체 (BD 사 제조), ATTO647 표지 항인간 LAG-3 항체 (EnzoLifeSciences 사 제조), FITC 표지 항마우스 CD3 항체 (BD 사 제조), 및 LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit-near-IR fluorescent reactive dye (Invitrogen 사 제조) 를 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 30 분간 가만히 정지시켰다. 또한, 네거티브 집단의 위치의 동정에 사용하기 위해, PE 표지 항마우스 LAG-3 항체 및 ATTO647 표지 항인간 LAG-3 항체를 포함하지 않는 컨트롤도 제조하고, 동일하게 처리하였다. FACS 버퍼로 세정한 후, 1 ％ 파라포름알데히드 함유 PBS 에 재현탁하고, 플로우 사이토미터 (CantoII : BD 사 제조) 로 검출을 실시하였다. 데이터 해석은 FlowJo (TreeStar 사 제조) 로 실시하였다. LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit-near-IR fluorescent reactive dye 양성의 사세포를 게이트로 제외한 후, 생세포를 해석 대상으로 하였다. 그 결과, 도 13 에 나타내는 바와 같이, 컨트롤의 야생형 마우스 유래의 Con A 활성화 T 세포에는, 마우스 LAG-3 의 발현만이 관찰되고 인간 LAG-3 의 발현은 관찰되지 않았던 데에 대해, 인간 LAG-3/인간 FcγRIIIA 더블 트랜스제닉 마우스 유래의 Con A 활성화 T 세포에는 마우스 LAG-3 및 인간 LAG-3 의 발현이 모두 관찰되고, 또한 개개의 세포를 나타내는 도트 플롯의 도트는 거의 대각선 상에 분포하고 있었다. 또한, 활성화시키지 않은 휴지 상태의 T 세포에는 마우스 LAG-3 및 인간 LAG-3 중 어느 발현도 거의 관찰되지 않았다. 이들의 결과로부터, 제조한 인간 LAG-3/인간 FcγRIIIA 더블 트랜스제닉 마우스에 있어서는, BAC 트랜스제닉이라는 수법을 사용함으로써 당초 계획한 바와 같이, 인간 LAG-3 이 내인성의 마우스 LAG-3 의 발현 패턴에 따라 발현하는 것이 분명해졌다. 또, 인간 FcγRIIIA 에 대해서는, 제조한 인간 LAG-3/인간 FcγRIIIA 더블 트랜스제닉 마우스의 말초혈 NK 세포 (CD3-DX5+) 의 약 47 ％ 에 발현이 관찰되어, 기보 (비특허문헌 10) 와 동일한 결과가 확인되었다.
실시예 11. 인간화 항인간 LAG-3 항체 hLA212_H4/L2 의 in vivo 평가
11-1) 인간화 항인간 LAG-3 항체 hLA212_H4/L2 의 LAG-3 양성 세포 제거 활성
실시예 10 의 인간 LAG-3/인간 FcγRIIIA 더블 트랜스제닉 마우스를 사용하여, 취득한 인간화 항인간 LAG-3 항체 hLA212_H4/L2 가 in vivo 에 있어서 LAG-3 양성 세포를 제거하는 활성을 갖는가를 검토하였다. 인간 LAG-3/인간 FcγRIIIA 더블 트랜스제닉 마우스의 복강 내에 인간화 항인간 LAG-3 항체 hLA212_H4/L2 (30 ㎎/㎏) 혹은 용매를 투여한 직후에, 폴리클로날한 T 세포 활성화 작용을 갖는 Con A (Sigma 사 제조) 를 15 ㎎/㎏ 의 용량으로 정맥내 투여하였다. 그 2 일 후에 채혈한 혈액으로부터 PharmLyse (BD 사 제조) 에 의해 적혈구를 용혈하여 백혈구를 얻고, 플로우 사이토메트리에 사용하였다. 백혈구를 FcBlock (BD 사 제조) 와 반응시킨 후, PE 표지 항마우스 LAG-3 항체 (BD 사 제조), ATTO647 표지 항인간 LAG-3 항체 (EnzoLifeSciences 사 제조), FITC 표지 항마우스 CD3 항체 (BD 사 제조), 및 LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit-near-IR fluorescent reactive dye (Invitrogen 사 제조) 를 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 30 분간 가만히 정지시켰다. 또한, 네거티브 집단의 위치의 동정에 사용하기 위해, PE 표지 항마우스 LAG-3 항체 및 ATTO647 표지 항인간 LAG-3 항체를 포함하지 않는 컨트롤도 제조하고, 동일하게 처리하였다. FACS 버퍼로 세정한 후, 1 ％ 파라포름알데히드 함유 PBS 에 재현탁하고, 플로우 사이토미터 (CantoII : BD 사 제조) 로 검출을 실시하였다. 데이터 해석은 FlowJo (TreeStar 사 제조) 로 실시하였다. LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit-near-IR fluorescent reactive dye 양성의 사세포를 게이트로 제외한 후, 생세포를 해석 대상으로 하였다. CD3 양성 T 세포에 있어서의 인간 LAG-3 양성률을 산출한 결과, 도 14 에 나타내는 바와 같이, 무처치의 인간 LAG-3/인간 FcγRIIIA 더블 트랜스제닉 마우스의 말초혈 T 세포에 있어서는 인간 LAG-3 양성 세포가 거의 관찰되지 않는 데에 대해, 폴리클로날한 T 세포 활성화 작용을 갖는 Con A 투여에 의해, 항체 비투여군에서는 말초혈 T 세포 중 평균 24 ％ 가 인간 LAG-3 양성이 되었다. 이에 대해, hLA212_H4/L2 를 투여한 Con A 투여 마우스에서는, 말초혈 T 세포에 있어서의 인간 LAG-3 양성률이 분명하게 저하되어 있었다. 동일한 경향은, 비장에 있어서의 T 세포, 및 Con A 를 투여한 다음날의 말초혈 T 세포에서도 관찰되고 있고, 또 마우스 LAG-3 및 다른 활성화 마커인 CD69 의 양성률에서 보아도 동일한 결과였다. 이들 결과로부터, 취득한 인간화 항인간 LAG-3 항체 hLA212_H4/L2 가 in vivo 에 있어서 LAG-3 양성 세포를 제거하는 활성을 갖는 것이 분명해졌다.
11-2) T 세포 의존성 자기 면역 질환 모델에 대한 인간화 항인간 LAG-3 항체 hLA212_H4/L2 의 활성
LAG-3 양성 세포를 in vivo 에 있어서 제거하는 활성을 갖는 인간화 항인간 LAG-3 항체 hLA212_H4/L2 가, 자기 면역 질환의 치료에 유용한지의 여부를 분명히 할 목적으로, 대표적인 T 세포 의존성의 자기 면역 질환 (다발성 경화증) 모델인 EAE (실험적 자기 면역성 뇌척수염) 모델 (비특허문헌 11) 에 대한 약효를 검토하였다.
중추 신경의 미엘린을 구성하는 단백질의 하나인 MOG (Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein) 유래의 펩티드 (아미노산 35 - 55, 펩티드 연구소) 를 4 ㎎/㎖ 의 농도로 생리 식염수에 용해시킨 것을, 8 ㎎/㎖ 의 Killed Mycobacterium Tuberculosis H37Ra (BD 사 제조) 를 첨가한 Freund's Incomplete Adjuvant (와코우 순약사 제조) 와 등량 혼합하여 에멀션으로 하였다. 이것을 제 0 일에, 인간 LAG-3/인간 FcγRIIIA 더블 트랜스제닉 마우스의 양 옆구리에 50 ㎕ 씩 피하 주사하고, 또한 생리 식염수로 희석시킨 백일해 독소 0.2 ㎍ 을 정맥내 투여함으로써 EAE 를 유도하였다. 그 후, EAE 의 임상 스코어를 이하와 같이 경일적으로 관찰하였다. 즉, 스코어 0 : 무증상, 스코어 1 : 꼬리의 탈력, 스코어 2 : 보행 이상·정향 반사 소실, 스코어 3 : 뒷다리 마비, 스코어 4 : 앞다리의 부분 마비, 스코어 5 : 사망 또는 안락살. 인간화 항인간 LAG-3 항체 hLA212_H4/L2 및 컨트롤 항체는, 제 0 일 및 제 7 일에 각각 30 ㎎/㎏ 의 용량으로 정맥내 투여하였다. 그 결과, 도 15 에 나타내는 바와 같이, 인간화 항인간 LAG-3 항체 hLA212_H4/L2 투여군에서는 컨트롤 항체 투여군에 비해, EAE 의 임상 스코어의 평균값이 관찰 기간 중 50 ％ 이하로 억제되어 있었다. 또한 hLA212_H4/L2 투여군에서는 EAE 진행에 수반하는 체중 감소도 억제되어 있었다. 이들 결과로부터, LAG-3 양성 세포를 in vivo 에 있어서 제거하는 활성을 갖는 인간화 항인간 LAG-3 항체 hLA212_H4/L2 는, 대표적인 T 세포 의존성의 자기 면역 질환 모델인 EAE 를 억제하는 것이 분명해져, 인간의 자기 면역 질환의 치료약이 될 수 있는 것이 나타났다.
본 발명의 항체, 그 결합 단편 등은 자기 면역 질환 등의 LAG-3 양성 세포에 관련되는 질환의 치료 및/또는 예방에 유용하다.
서열표 프리텍스트
서열 번호 1 : rLA204 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (도 16)
서열 번호 2 : rLA204 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열 (도 17)
서열 번호 3 : rLA204 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (도 18)
서열 번호 4 : rLA204 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열 (도 19)
서열 번호 5 : rLA212 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (도 20)
서열 번호 6 : rLA212 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열 (도 21)
서열 번호 7 : rLA212 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (도 22)
서열 번호 8 : rLA212 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열 (도 23)
서열 번호 9 : rLA225 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (도 24)
서열 번호 10 : rLA225 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열 (도 25)
서열 번호 11 : rLA225 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (도 26)
서열 번호 12 : rLA225 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열 (도 27)
서열 번호 13 : rLA869 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (도 28)
서열 번호 14 : rLA869 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열 (도 29)
서열 번호 15 : rLA869 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (도 30)
서열 번호 16 : rLA869 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열 (도 31)
서열 번호 17 : rLA1264 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열 (도 32)
서열 번호 18 : rLA1264 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열 (도 33)
서열 번호 19 : rLA1264 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (도 34)
서열 번호 20 : rLA1264 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열 (도 35)
서열 번호 21 : 인간 경사슬 분비 시그널 및 인간 κ 사슬 정상 영역의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (도 36)
서열 번호 22 : 인간 중사슬 분비 시그널 및 인간 IgG1 정상 영역의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (도 37)
서열 번호 23 : cLA212 항체의 중사슬의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (도 38)
서열 번호 24 : cLA212 항체의 중사슬의 아미노산 서열 (도 39)
서열 번호 25 : cLA212 항체의 경사슬의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (도 40)
서열 번호 26 : cLA212 항체의 경사슬의 아미노산 서열 (도 41)
서열 번호 27 : hLA212 항체의 중사슬 H2 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (도 42)
서열 번호 28 : hLA212 항체의 중사슬 H2 의 아미노산 서열 (도 43)
서열 번호 29 : hLA212 항체의 중사슬 H3 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (도 44)
서열 번호 30 : hLA212 항체의 중사슬 H3 의 아미노산 서열 (도 45)
서열 번호 31 : hLA212 항체의 경사슬 L1 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (도 46)
서열 번호 32 : hLA212 항체의 경사슬 L1 의 아미노산 서열 (도 47)
서열 번호 33 : hLA212 항체의 경사슬 L2 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (도 48)
서열 번호 34 : hLA212 항체의 경사슬 L2 의 아미노산 서열 (도 49)
서열 번호 35 : hLA212 항체의 경사슬 L3 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (도 50)
서열 번호 36 : hLA212 항체의 경사슬 L3 의 아미노산 서열 (도 51)
서열 번호 37 : hLA212 항체의 경사슬 L4 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (도 52)
서열 번호 38 : hLA212 항체의 경사슬 L4 의 아미노산 서열 (도 53)
서열 번호 39 : hLA212 항체의 경사슬 L5 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (도 54)
서열 번호 40 : hLA212 항체의 경사슬 L5 의 아미노산 서열 (도 55)
서열 번호 41 : rLA204 항체의 중사슬 CDRH1 의 아미노산 서열 (도 56)
서열 번호 42 : rLA204 항체의 중사슬 CDRH2 의 아미노산 서열 (도 57)
서열 번호 43 : rLA204 항체의 중사슬 CDRH3 의 아미노산 서열 (도 58)
서열 번호 44 : rLA204 항체의 경사슬 CDRL1 의 아미노산 서열 (도 59)
서열 번호 45 : rLA204 항체의 경사슬 CDRL2 의 아미노산 서열 (도 60)
서열 번호 46 : rLA204 항체의 경사슬 CDRL3 의 아미노산 서열 (도 61)
서열 번호 47 : rLA212 항체의 중사슬 CDRH1 의 아미노산 서열 (도 62)
서열 번호 48 : rLA212 항체의 중사슬 CDRH2 의 아미노산 서열 (도 63)
서열 번호 49 : rLA212 항체의 중사슬 CDRH3 의 아미노산 서열 (도 64)
서열 번호 50 : rLA212 항체의 경사슬 CDRL1 의 아미노산 서열 (도 65)
서열 번호 51 : rLA212 항체의 경사슬 CDRL2 의 아미노산 서열 (도 66)
서열 번호 52 : rLA212 항체의 경사슬 CDRL3 의 아미노산 서열 (도 67)
서열 번호 53 : rLA225 항체의 중사슬 CDRH1 의 아미노산 서열 (도 68)
서열 번호 54 : rLA225 항체의 중사슬 CDRH2 의 아미노산 서열 (도 69)
서열 번호 55 : rLA225 항체의 중사슬 CDRH3 의 아미노산 서열 (도 70)
서열 번호 56 : rLA225 항체의 경사슬 CDRL1 의 아미노산 서열 (도 71)
서열 번호 57 : rLA225 항체의 경사슬 CDRL2 의 아미노산 서열 (도 72)
서열 번호 58 : rLA225 항체의 경사슬 CDRL3 의 아미노산 서열 (도 73)
서열 번호 59 : rLA869 항체의 중사슬 CDRH1 의 아미노산 서열 (도 74)
서열 번호 60 : rLA869 항체의 중사슬 CDRH2 의 아미노산 서열 (도 75)
서열 번호 61 : rLA869 항체의 중사슬 CDRH3 의 아미노산 서열 (도 76)
서열 번호 62 : rLA869 항체의 경사슬 CDRL1 의 아미노산 서열 (도 77)
서열 번호 63 : rLA869 항체의 경사슬 CDRL2 의 아미노산 서열 (도 78)
서열 번호 64 : rLA869 항체의 경사슬 CDRL3 의 아미노산 서열 (도 79)
서열 번호 65 : rLA1264 항체의 중사슬 CDRH1 의 아미노산 서열 (도 80)
서열 번호 66 : rLA1264 항체의 중사슬 CDRH2 의 아미노산 서열 (도 81)
서열 번호 67 : rLA1264 항체의 중사슬 CDRH3 의 아미노산 서열 (도 82)
서열 번호 68 : rLA1264 항체의 경사슬 CDRL1 의 아미노산 서열 (도 83)
서열 번호 69 : rLA1264 항체의 경사슬 CDRL2 의 아미노산 서열 (도 84)
서열 번호 70 : rLA1264 항체의 경사슬 CDRL3 의 아미노산 서열 (도 85)
서열 번호 71 : 프라이머 RG2AR3 (도 86)
서열 번호 72 : 프라이머 RKR5 (도 87)
서열 번호 73 : 프라이머 3.3-F1 (도 88)
서열 번호 74 : 프라이머 3.3-R1 (도 89)
서열 번호 75 : 프라이머 212H-F (도 90)
서열 번호 76 : 프라이머 212H-R (도 91)
서열 번호 77 : 프라이머 212L-F (도 92)
서열 번호 78 : 프라이머 212L-R (도 93)
서열 번호 79 : 올리고 뉴클레오티드 LAG-3-H1 (도 94)
서열 번호 80 : 올리고 뉴클레오티드 LAG-3-H2 (도 95)
서열 번호 81 : 올리고 뉴클레오티드 LAG-3-H3 (도 96)
서열 번호 82 : 올리고 뉴클레오티드 LAG-3-H4 (도 97)
서열 번호 83 : 올리고 뉴클레오티드 LAG-3-H5 (도 98)
서열 번호 84 : 올리고 뉴클레오티드 LAG-3-H6 (도 99)
서열 번호 85 : 인간 LAG-3 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (도 100)
서열 번호 86 : 인간 LAG-3 의 아미노산 서열 (도 101)
SEQUENCE LISTING <110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED <120> Antibodies for Treating Autoimmune Diseases <130> FP1712 <150> JP2016-175491 <151> 2016-09-08 <160> 86 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 366 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1)..(366) <400> 1 gag gta gag ctg gtg gag tct ggg ggc ggc tta gtg cag cct gga agg 48 Glu Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 tcc atg aaa ctc tcc tgt gca gcc tca gga ttc act ttc aga acc tat 96 Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr 20 25 30 ggc atg gcc tgg gtc cgc cag gct cca acg aag ggt ctg gag tgg gtc 144 Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca tcc att agt act ggt ggt ggt agc act tac tat cgc gac tcc gtg 192 Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cga ttc act atc tcc aga gat aat gca aaa agc acc cta tac 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg gac agt ctg agg tct gag gac acg gcc act tat tac tgt 288 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 aca aca gat cta att aac tac ccg ggt ata ggg ggg ttt gct ttc tgg 336 Thr Thr Asp Leu Ile Asn Tyr Pro Gly Ile Gly Gly Phe Ala Phe Trp 100 105 110 ggc caa ggc act ctg gtc act gtc tct tca 366 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 122 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 2 Glu Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr 20 25 30 Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Asp Leu Ile Asn Tyr Pro Gly Ile Gly Gly Phe Ala Phe Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 327 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1)..(327) <400> 3 aac att gtg atg acc cag tct ccc aaa tcc atg tcc ata tca gta gga 48 Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Ile Ser Val Gly 1 5 10 15 gac agg gtc acc atg aac tgc aag gcc agt cag aat gtg tat aat aat 96 Asp Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Tyr Asn Asn 20 25 30 ata gcc tgg tat caa cag aag cca ggg aaa tct cct aaa ctg ttg atc 144 Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac tat gca tct aac cgg tac act ggg gtc cct gat cgc ttc aca ggc 192 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 agt ggc tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc cat agt gtg caa gct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile His Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 gaa gat gca gcc ttt tat tac tgt cag cgt ctt tac aat tct cct ccg 288 Glu Asp Ala Ala Phe Tyr Tyr Cys Gln Arg Leu Tyr Asn Ser Pro Pro 85 90 95 acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa ttg aaa cgg gct 327 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala 100 105 <210> 4 <211> 109 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 4 Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Ile Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Tyr Asn Asn 20 25 30 Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile His Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Phe Tyr Tyr Cys Gln Arg Leu Tyr Asn Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala 100 105 <210> 5 <211> 363 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 5 gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc tta gtg cag cct gga agg 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tca gga ttc act tac cgt agc tat 96 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Tyr Arg Ser Tyr 20 25 30 gtc atg gcc tgg gtc cgc cag gct cca acg agg ggt ctg gag tgg gtc 144 Val Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Arg Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca tcc att agt act ggt ggt ggt aac act tac tat cga gac tcc gtg 192 Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cga ttc act atc tcc aga gat aat gca aag aac acc cta tac 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 cta caa atg gac agt ctg agg tct gag gac acg gcc act tat tac tgt 288 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca gaa gac atg agt aat tcg gga tac ggg ctc ttt gat tac tgg ggc 336 Ala Glu Asp Met Ser Asn Ser Gly Tyr Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 caa gga gtc atg gtc aca gtc tcc tca 363 Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 121 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 6 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Tyr Arg Ser Tyr 20 25 30 Val Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Arg Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Glu Asp Met Ser Asn Ser Gly Tyr Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 7 <211> 327 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1)..(327) <400> 7 aac att gtg atg acc cag tct ccc aaa tcc atg tcc ata tca gta gga 48 Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Ile Ser Val Gly 1 5 10 15 gac agg gtc acc atg aac tgc aag gcc ggt cag aat gtg gat aat aat 96 Asp Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ala Gly Gln Asn Val Asp Asn Asn 20 25 30 ata gcc tgg tat caa aag aaa cca ggg cag tct cct aaa ctg ttg atc 144 Ile Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac tat gca tct aac cgg aac act ggg gtc cct gat cgc ttc aca ggc 192 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 ggt gga tat ggg aca gat ttc act ctc acc atc aat agt gtg caa gct 240 Gly Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 gaa gat gca gcc ttt tat tac tgt cag cgt att tcc aat tct ccg tac 288 Glu Asp Ala Ala Phe Tyr Tyr Cys Gln Arg Ile Ser Asn Ser Pro Tyr 85 90 95 acg ttt ggc gct ggg acc gag ctg gaa ctg aaa cgg gct 327 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Glu Leu Glu Leu Lys Arg Ala 100 105 <210> 8 <211> 109 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 8 Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Ile Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ala Gly Gln Asn Val Asp Asn Asn 20 25 30 Ile Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Gly Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Phe Tyr Tyr Cys Gln Arg Ile Ser Asn Ser Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Glu Leu 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tac ggt tgg ttt act tac tgg ggc 336 Ala Arg Pro Pro Tyr Gly Tyr Asn Tyr Gly Trp Phe Thr Tyr Trp Gly 100 105 110 caa ggc act ctg gtc act gtc tct tca 363 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 121 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Pro Tyr Gly Tyr Asn Tyr Gly Trp Phe Thr Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 11 <211> 327 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1)..(327) <400> 11 gac atc cag atg aca cag tct cca gct tcc ctg tct gca tct ctg gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gaa act gtc acc atc gaa tgt cga gca agt gag gac att cac aat ggt 96 Glu Thr Val Thr Ile Glu Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile His Asn Gly 20 25 30 tta gta tgg tat cag cag aag cca ggg aaa tct cct cag ctc ctg atc 144 Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 tat aat gca aat agt atg cat act ggg gtc cca tca cgg ttc agt ggc 192 Tyr Asn Ala Asn Ser Met His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggt aca cag tat tct ctc aag ata aac agc ctg cag tct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 gaa gat gtc gca agt tat ttc tgt caa cag tat tac aat tat cct cgg 288 Glu Asp Val Ala Ser Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Pro Arg 85 90 95 acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa ttg aaa cgg gct 327 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala 100 105 <210> 12 <211> 109 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 12 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Glu Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile His Asn Gly 20 25 30 Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Asn Ser Met His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Ser Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala 100 105 <210> 13 <211> 369 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1)..(369) <400> 13 gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc tta gtg cag cct gga agg 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tca gga ttc act tat cgt acc tat 96 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Tyr Arg Thr Tyr 20 25 30 gtc atg gcc tgg gtc cgc cag ggt cca acg cag ggt ctg gag tgg gtc 144 Val Met Ala Trp Val Arg Gln Gly Pro Thr Gln Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca tcc att agt act ggt ggt gtt agc act tat tat cga gac tcc gtg 192 Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cga ttc act atc tcc aga gat aat gca aaa aac acc cta tac 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ttg caa atg gac agt ctg agg tct gag gac acg gcc act tat tac tgt 288 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aaa gac atg ttg aat ggt tat aac tct cag ggg ctt ttt gat tac 336 Ala Lys Asp Met Leu Asn Gly Tyr Asn Ser Gln Gly Leu Phe Asp Tyr 100 105 110 tgg ggc caa gga gtc atg gtc aca gtc tcc tca 369 Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 14 <211> 123 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 14 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Tyr Arg Thr Tyr 20 25 30 Val Met Ala Trp Val Arg Gln Gly Pro Thr Gln Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Met Leu Asn Gly Tyr Asn Ser Gln Gly Leu Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 15 <211> 327 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1)..(327) <400> 15 aac att gtg atg acc cag tct ccc aaa tcc atg tcc ata tca gtg gga 48 Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Ile Ser Val Gly 1 5 10 15 gac agg gtc acc atg aac tgc agg gcc agt cag aat gtg gat aat act 96 Asp Arg Val Thr Met Asn Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Asp Asn Thr 20 25 30 ata gcc tgg tat caa cag aaa cca ggg cag tct cct aaa ctg ttg atc 144 Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac ttt gca tct gac cgg tac act ggg gtc cct gat cgc ttc aca ggc 192 Tyr Phe Ala Ser Asp Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 ggt gga tat ggg aca gat ttc act ctc acc atc aat agt gtg caa gct 240 Gly Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 gaa gat gca gcc ttt tat tac tgt cag cgt att tac aat tct cca ctc 288 Glu Asp Ala Ala Phe Tyr Tyr Cys Gln Arg Ile Tyr Asn Ser Pro Leu 85 90 95 acg ttc ggt tct ggg acc aag ctg gag atc aga cgg gct 327 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg Arg Ala 100 105 <210> 16 <211> 109 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 16 Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Ile Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Met Asn Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Asp Asn Thr 20 25 30 Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Ala Ser Asp Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Gly Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Phe Tyr Tyr Cys Gln Arg Ile Tyr Asn Ser Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg Arg Ala 100 105 <210> 17 <211> 357 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <400> 17 gag gtg cag ctg gtg gaa tct ggg gga ggc tta gtg cag cct gga agg 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tca gga ttc act ttc agt tcc tat 96 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 tac atg gcc tgg gtc cgc cag gct cca acg aag ggt ctg gag tgg gtc 144 Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca tac atc agt aat ggt ggt tat agc act tac tat cga gac tcc gtg 192 Ala Tyr Ile Ser Asn Gly Gly Tyr Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cga ttc act atc tcc aga gaa aat gca aaa agc acc ctt tac 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg gac agt ctg agg tct gag gac acg gcc act tat tac tgt 288 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 aca atc aca gat cat tcg ggg tac agg ttt act tac tgg ggc caa ggc 336 Thr Ile Thr Asp His Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 act ctg gtc act gtc tct 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Asn Ser Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Lys Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala 100 105 <210> 21 <211> 449 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 gcctccggac tctagagcca ccatggtgct gcagacccag gtgttcatct ccctgctgct 60 gtggatctcc ggcgcgtacg gcgatatcgt gatgattaaa cgtacggtgg ccgccccctc 120 cgtgttcatc ttccccccct ccgacgagca gctgaagtcc ggcaccgcct ccgtggtgtg 180 cctgctgaat aacttctacc ccagagaggc caaggtgcag tggaaggtgg acaacgccct 240 gcagtccggg aactcccagg agagcgtgac cgagcaggac agcaaggaca gcacctacag 300 cctgagcagc accctgaccc tgagcaaagc cgactacgag aagcacaagg tgtacgcctg 360 cgaggtgacc caccagggcc tgagctcccc cgtcaccaag agcttcaaca ggggggagtg 420 ttaggggccc gtttaaacgg gggaggcta 449 <210> 22 <211> 1132 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 gcctccggac tctagagcca ccatgaaaca cctgtggttc ttcctcctgc tggtggcagc 60 tcccagatgg gtgctgagcc aggtgcaatt gtgcaggcgg ttagctcagc ctccaccaag 120 ggcccaagcg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggcgg cacagccgcc 180 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaacccgtga ccgtgagctg gaactcaggc 240 gccctgacca gcggcgtgca caccttcccc gctgtcctgc agtcctcagg actctactcc 300 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 360 gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac 420 aaaactcaca catgcccacc ctgcccagca cctgaactcc tggggggacc ctcagtcttc 480 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 540 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 600 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccc cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgg 660 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 720 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggc 780 cagccccggg aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 840 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 900 gagagcaatg gccagcccga gaacaactac 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tgc gag gtg acc cac cag ggc ctg agc tcc ccc 672 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 gtc acc aag agc ttc aac agg ggg gag tgt 702 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 38 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 38 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser 20 25 30 Ile Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Lys Ala Gly Gln Asn 35 40 45 Val Asp Asn Asn Ile Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ser Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Val Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Ile Ser 100 105 110 Asn Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly 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ccc ggc cag tcc ccc 192 Val Asp Asn Asn Ile Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ser Pro 50 55 60 aag ctg ctg atc tac tac gcc agc aac cgg aac acc ggc gtg ccc gac 240 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly Val Pro Asp 65 70 75 80 aga ttt tcc ggc gga ggc tac ggc acc gac ttc acc ctg aca atc agc 288 Arg Phe Ser Gly Gly Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 agc gtg cag ccc gag gac gcc gcc ttc tac tac tgt cag cgg atc agc 336 Ser Val Gln Pro Glu Asp Ala Ala Phe Tyr Tyr Cys Gln Arg Ile Ser 100 105 110 aac agc ccc tac acc ttc ggc cag ggc acc aag ctg gaa ctg aag cgt 384 Asn Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 115 120 125 acg gtg gcc gcc ccc tcc gtg ttc atc ttc ccc ccc tcc gac gag cag 432 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 ctg aag tcc ggc acc gcc tcc gtg gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tac 480 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 ccc aga gag gcc aag gtg cag tgg aag 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atctccggcg cgtacggcaa cattgtgatg acccagtctc ccaaatcc 48 <210> 78 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 78 ggagggggcg gccacagccc gtttcagttc cagctcggtc ccagc 45 <210> 79 <211> 34 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 79 atgtgggagg ctcagttcct gggcttgctg tttc 34 <210> 80 <211> 34 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 80 gcccgagccc gagcccgagc cggagcagct ctga 34 <210> 81 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 81 gagtatgtgt tgactggttg ataactatcg 30 <210> 82 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 82 gccatgacag attagccatg tctgcagcac 30 <210> 83 <211> 56 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 83 caggaccttt ttctaacctc ccttggaggg ctggggaggc ccgggccata gaggag 56 <210> 84 <211> 56 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 84 cctggagccg aggcagccag caggtctcag cagctccgcc cgcccgcccg cccgcc 56 <210> 85 <211> 1575 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1575) <400> 85 atg tgg gag gct cag ttc ctg 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ctg gat gag cgc ggc cgg cag 384 Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln 115 120 125 cgc ggg gac ttc tcg cta tgg ctg cgc cca gcc cgg cgc gcg gac gcc 432 Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala 130 135 140 ggc gag tac cgc gcc gcg gtg cac ctc agg gac cgc gcc ctc tcc tgc 480 Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys 145 150 155 160 cgc ctc cgt ctg cgc ctg ggc cag gcc tcg atg act gcc agc ccc cca 528 Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro 165 170 175 gga tct ctc aga gcc tcc gac tgg gtc att ttg aac tgc tcc ttc agc 576 Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser 180 185 190 cgc cct gac cgc cca gcc tct gtg cat tgg ttc cgg aac cgg ggc cag 624 Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln 195 200 205 ggc cga gtc cct gtc cgg gag tcc ccc cat cac cac tta gcg gaa agc 672 Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser 210 215 220 ttc ctc ttc ctg ccc caa 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gaa cag cag ctc aat gcc act gtc aca ttg gca atc atc aca 1056 Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr 340 345 350 gtg act ccc aaa tcc ttt ggg tca cct gga tcc ctg ggg aag ctg ctt 1104 Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu 355 360 365 tgt gag gtg act cca gta tct gga caa gaa cgc ttt gtg tgg agc tct 1152 Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser 370 375 380 ctg gac acc cca tcc cag agg agt ttc tca gga cct tgg ctg gag gca 1200 Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala 385 390 395 400 cag gag gcc cag ctc ctt tcc cag cct tgg caa tgc cag ctg tac cag 1248 Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln 405 410 415 ggg gag agg ctt ctt gga gca gca gtg tac ttc aca gag ctg tct agc 1296 Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser 420 425 430 cca ggt gcc caa cgc tct ggg aga gcc cca ggt gcc ctc cca gca ggc 1344 Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly 435 440 445 cac ctc ctg ctg ttt ctc atc ctt ggt gtc ctt tct ctg ctc ctt ttg 1392 His Leu Leu Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Ser Leu Leu Leu Leu 450 455 460 gtg act gga gcc ttt ggc ttt cac ctt tgg aga aga cag tgg cga cca 1440 Val Thr Gly Ala Phe Gly Phe His Leu Trp Arg Arg Gln Trp Arg Pro 465 470 475 480 aga cga ttt tct gcc tta gag caa ggg att cac cct ccg cag gct cag 1488 Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu Gln Gly Ile His Pro Pro Gln Ala Gln 485 490 495 agc aag ata gag gag ctg gag caa gaa ccg gag ccg gag ccg gag ccg 1536 Ser Lys Ile Glu Glu Leu Glu Gln Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro 500 505 510 gaa ccg gag ccc gag ccc gag ccc gag ccg gag cag ctc 1575 Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Gln Leu 515 520 525 <210> 86 <211> 525 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp 1 5 10 15 Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val 20 25 30 Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile 35 40 45 Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln 50 55 60 His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu 65 70 75 80 Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro 85 90 95 Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly 100 105 110 Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln 115 120 125 Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala 130 135 140 Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys 145 150 155 160 Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro 165 170 175 Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser 180 185 190 Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln 195 200 205 Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser 210 215 220 Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly 225 230 235 240 Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn 245 250 255 Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala 260 265 270 Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val 275 280 285 Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly 290 295 300 Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu 305 310 315 320 Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His 325 330 335 Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr 340 345 350 Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu 355 360 365 Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser 370 375 380 Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala 385 390 395 400 Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln 405 410 415 Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser 420 425 430 Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly 435 440 445 His Leu Leu Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Ser Leu Leu Leu Leu 450 455 460 Val Thr Gly Ala Phe Gly Phe His Leu Trp Arg Arg Gln Trp Arg Pro 465 470 475 480 Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu Gln Gly Ile His Pro Pro Gln Ala Gln 485 490 495 Ser Lys Ile Glu Glu Leu Glu Gln Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro 500 505 510 Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Gln Leu 515 520 525

Claims (30)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 서열 번호 50 으로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 CDRL1, 서열 번호 51 로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 CDRL2 및 서열 번호 52 로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고 서열 번호 47 로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 CDRH1, 서열 번호 48 로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 CDRH2 및 서열 번호 49 로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지고, 인간 LAG-3 의 도메인 3 에 결합하는, 모노클로날 항체 또는 그 결합 단편.
  6. 제 5 항에 있어서,
    인간화 항체인, 모노클로날 항체 또는 그 결합 단편.
  7. 제 6 항에 있어서,
    서열 번호 28 로 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 제 68 번의 위치에 상당하는 아미노산이 Gly 이거나 또는 Ala 로 치환되고, 제 103 번의 위치에 상당하는 아미노산이 Asn 이거나 또는 Asp 로 치환되어 이루어지는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬, 그리고 서열 번호 32 로 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 제 21 번의 위치에 상당하는 아미노산이 Asp 이거나 또는 Asn 으로 치환되고, 제 31 번의 위치에 상당하는 아미노산이 Leu 이거나 또는 Met 로 치환되고, 제 33 번의 위치에 상당하는 아미노산이 Ala 이거나 또는 Ile 로 치환되고, 제 41 번의 위치에 상당하는 아미노산이 Ile 이거나 또는 Met 로 치환되고, 제 58 번의 위치에 상당하는 아미노산이 Gln 이거나 또는 Lys 로 치환되고, 제 63 번의 위치에 상당하는 아미노산이 Ala 이거나 또는 Ser 로 치환되고, 제 80 번의 위치에 상당하는 아미노산이 Ser 이거나 또는 Asp 로 치환되고, 제 85 번의 위치에 상당하는 아미노산이 Ser 이거나 또는 Gly 로 치환되고, 제 87 번의 위치에 상당하는 아미노산이 Ser 이거나 또는 Tyr 로 치환되고, 제 98 번의 위치에 상당하는 아미노산이 Leu 이거나 또는 Val 로 치환되고, 제 103 번의 위치에 상당하는 아미노산이 Phe 이거나 또는 Ala 로 치환되고, 제 105 번의 위치에 상당하는 아미노산이 Thr 이거나 또는 Phe 로 치환되고, 제 124 번의 위치에 상당하는 아미노산이 Val 이거나 또는 Leu 로 치환되고, 제 126 번의 위치에 상당하는 아미노산이 Ile 이거나 또는 Leu 로 치환되어 이루어지는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬을 포함하여 이루어지는, 모노클로날 항체 또는 그 결합 단편.
  8. 제 6 항에 있어서,
    경사슬 가변 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 32, 34, 36, 38 및 40 으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열의 제 21 번 아미노산 내지 제 129 번 아미노산을 포함하고, 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 28 및 30 으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열의 제 20 번 아미노산 내지 제 140 번 아미노산을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 그 결합 단편.
  9. 제 6 항에 있어서,
    경사슬의 아미노산 서열이 서열 번호 32, 34, 36, 38 및 40 으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열의 제 21 번 아미노산 내지 제 234 번 아미노산을 포함하고, 중사슬의 아미노산 서열이 서열 번호 28 및 30 으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열의 제 20 번 아미노산 내지 제 470 번 아미노산을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 그 결합 단편.
  10. 제 6 항에 있어서,
    하기 [i] 내지 [x] 으로 이루어지는 군에서 선택되는, 모노클로날 항체 또는 그 결합 단편 :
    [i] 서열 번호 30 의 아미노산 번호 20 내지 470 으로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 및 서열 번호 34 의 아미노산 번호 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 경사슬을 포함하는 항체 또는 그 결합 단편 ;
    [ii] 서열 번호 28 의 아미노산 번호 20 내지 470 으로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 및 서열 번호 32 의 아미노산 번호 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 경사슬을 포함하는 항체 또는 그 결합 단편 ;
    [iii] 서열 번호 30 의 아미노산 번호 20 내지 470 으로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 및 서열 번호 36 의 아미노산 번호 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 경사슬을 포함하는 항체 또는 그 결합 단편 ;
    [iv] 서열 번호 28 의 아미노산 번호 20 내지 470 으로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 및 서열 번호 34 의 아미노산 번호 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 경사슬을 포함하는 항체 또는 그 결합 단편 ;
    [v] 서열 번호 28 의 아미노산 번호 20 내지 470 으로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 및 서열 번호 36 의 아미노산 번호 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 경사슬을 포함하는 항체 또는 그 결합 단편 ;
    [vi] 서열 번호 28 의 아미노산 번호 20 내지 470 으로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 및 서열 번호 38 의 아미노산 번호 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 경사슬을 포함하는 항체 또는 그 결합 단편 ;
    [vii] 서열 번호 28 의 아미노산 번호 20 내지 470 으로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 및 서열 번호 40 의 아미노산 번호 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 경사슬을 포함하는 항체 또는 그 결합 단편 ;
    [viii] 서열 번호 30 의 아미노산 번호 20 내지 470 으로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 및 서열 번호 32 의 아미노산 번호 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 경사슬을 포함하는 항체 또는 그 결합 단편 ;
    [ix] 서열 번호 30 의 아미노산 번호 20 내지 470 으로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 및 서열 번호 38 의 아미노산 번호 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 경사슬을 포함하는 항체 또는 그 결합 단편 ; 및
    [x] 서열 번호 30 의 아미노산 번호 20 내지 470 으로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 및 서열 번호 40 의 아미노산 번호 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 경사슬을 포함하는 항체 또는 그 결합 단편.
  11. 제 5 항에 있어서,
    서열 번호 28 의 아미노산 번호 20 내지 470 으로 이루어지는 아미노산 서열과 99 ％ 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 중사슬; 그리고 서열 번호 32 의 아미노산 번호 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열과 94 % 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 경사슬을 포함하여 이루어지는, 모노클로날 항체 또는 그 결합 단편.
  12. 제 5 항에 있어서,
    제 10 항에 기재된 항체 또는 그 결합 단편이 포함하는 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 또는 그것에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 제 1 핵산 분자와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 제 2 핵산 분자가 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코드되는 경사슬 가변 영역 아미노산 서열, 및 제 10 항에 기재된 항체 또는 그 결합 단편이 포함하는 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 또는 그것에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 제 3 핵산 분자와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 제 4 핵산 분자가 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코드되는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 그 결합 단편.
  13. 삭제
  14. 제 5 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    탈푸코오스 형태인, 모노클로날 항체 또는 그 결합 단편.
  15. 제 5 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 결합 단편 및 약제를 포함하는 콘주게이트.
  16. 제 5 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 결합 단편의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  17. 제 16 항에 기재된 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  18. 제 16 항에 기재된 핵산 분자 또는 제 16 항에 기재된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 단리된 세포.
  19. 제 5 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 결합 단편을 생산하는 단리된 세포.
  20. 제 5 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 결합 단편의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자 또는 제 5 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 결합 단편의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 세포, 또는 제 5 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 결합 단편을 생산하는 세포를 배양하는 공정을 포함하여 이루어지는, 제 5 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 결합 단편의 제조 방법.
  21. 제 20 항에 기재된 방법에 의해 조제된, 항체 또는 그 결합 단편.
  22. 삭제
  23. 제 5 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 결합 단편, 또는 제 5 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 결합 단편 및 약제를 포함하는 콘주게이트를 포함하는 의약 조성물로서, 자기 면역 질환, 이식물의 거절, 알레르기성 질환, 악성 종양 및/또는 만성 감염증의 치료 또는 예방을 위한, 의약 조성물.
  24. 제 23 항에 있어서,
    자기 면역 질환의 치료 또는 예방을 위한, 의약 조성물.
  25. 제 24 항에 있어서,
    자기 면역 질환이, 결합 조직·근골격계의 자기 면역 질환, 혈액계의 자기 면역 질환, 소화기계의 자기 면역 질환, 신경계의 자기 면역 질환, 시각계의 자기 면역 질환, 혈관계의 자기 면역 질환, 표피계의 자기 면역 질환, 호흡기계의 자기 면역 질환, 내분비계의 자기 면역 질환, 자기 면역성 간염 및 면역 이상에 의한 신염으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개 또는 2 개 이상인, 의약 조성물.
  26. 제 25 항에 있어서,
    결합 조직·근골격계의 자기 면역 질환이 관절 류머티즘, 경직성 척추염, 전신성 홍반성 낭창, 강피증, 다발성 근염, 피부 근염, 봉입체 근염, 및 면역 개재성 괴사성 미오패치 또는 특발성 염증성 근질환으로 이루어지는 군에서, 혈액계의 자기 면역 질환이 재생 불량성 빈혈 및 특발성 혈소판 감소성 자반병으로 이루어지는 군에서, 소화기계의 자기 면역 질환이 크론병 및 궤양성 대장염으로 이루어지는 군에서, 신경계의 자기 면역 질환이 다발성 경화증 및 중증 근무력증으로 이루어지는 군에서, 시각계의 자기 면역 질환이 포도막염, 각막염 및 쇼그렌 증후군으로 이루어지는 군에서, 혈관계의 자기 면역 질환이 베체트병 및 베게너 육아종증으로 이루어지는 군에서, 표피계의 자기 면역 질환이 건선, 천포창, 스티분스·존슨 증후군 및 백반으로 이루어지는 군에서, 호흡기계의 자기 면역 질환이 만성 폐색성 폐질환 및 간질성 폐렴으로 이루어지는 군에서, 그리고 내분비계의 자기 면역 질환이 1 형 당뇨병, 자기 면역 갑상선염, 바세도우병 및 하시모토병으로 이루어지는 군에서, 각각 선택되는 1 개 또는 2 개 이상인, 의약 조성물.
  27. 제 23 항에 있어서,
    이식물의 거절의 치료 또는 예방을 위한, 의약 조성물.
  28. 제 27 항에 있어서,
    이식물의 거절이, 심장, 신장, 간장, 골수 및 피부로 이루어지는 군에서 선택되는 장기 혹은 조직으로부터의 이식에 대한 거절 반응 및 숙주대이식편 반응, 그리고/또는 골수, 말초혈 및 제대혈로 이루어지는 군에서 선택되는 조혈 세포의 이식에 의해 일어나는 이식편대숙주병인, 의약 조성물.
  29. 제 24 항에 있어서,
    엽산 대사 길항제, 칼시뉴린 저해제, 부신 피질 스테로이드제, 항흉선 세포 글로블린제, 핵산 대사 길항제, 핵산 합성 저해제, 세포 표면 항원을 표적으로 하는 생물 제제, 사이토카인 혹은 사이토카인 수용체를 표적으로 하는 생물 제제, 대량 면역 글로블린 정주 요법, 및 혈장 교환 요법으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개 또는 2 개 이상과 조합하여 이루어지는, 의약 조성물.
  30. 제 23 항에 있어서,
    알레르기성 질환, 악성 종양 및/또는 만성 감염증의 치료 또는 예방을 위한, 의약 조성물.
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