KR102537101B1

KR102537101B1 - 스쿠알렌을 포함하는 나노 에멀젼 조성물, 이를 포함하는 화장료 조성물 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR102537101B1
Application number: KR1020200141177A
Authority: KR
Inventors: 김예진; 김태현; 조희경; 김인영; 성낙준; 유광호; 김영호
Original assignee: 주식회사 메가코스
Priority date: 2020-10-28
Filing date: 2020-10-28
Publication date: 2023-05-30
Also published as: KR20220056515A

Abstract

본 발명은 전체 유상부 총 중량에 대하여 20 중량% 초과의 스쿠알렌을 포함하는 나노 에멀젼 조성물, 이를 포함하는 화장료 조성물 및 이의 제조 방법을 제공한다. 상기 나노 에멀젼 조성물은 자유 라디칼을 소거하고, 타입 I 프로콜라겐 단백질의 발현을 증가시키며, MMP-1 단백질의 발현을 억제하고, 엘라스타제(elastase) 활성 저해능을 가져서, 피부 미백, 피부 탄력 증진, 주름 예방, 주름 개선 및 피부 보습 등의 효과를 나타낸다.

Description

스쿠알렌을 포함하는 나노 에멀젼 조성물, 이를 포함하는 화장료 조성물 및 이의 제조 방법{NANO EMULSION COMPOSITION COMPRISING Squalene, COSMETIC COMPOSITION COMPRISING THE SAME, AND METHOD FOR PREPARING SAME}

본 발명은 스쿠알렌을 포함하는 나노 에멀젼 조성물, 이를 포함하는 화장료 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 스쿠알렌의 안정성을 높이는 동시에, 자유 라디칼 소거능, 세포 생존율, 엘라스타제(elastase) 저해능, MMP-1 저해능 및 콜라겐 분해 효소(collagenase) 저해능이 우수하여 피부 미백, 피부 탄력 증진, 주름 예방, 주름 개선 및 피부 보습 효과가 우수한 나노 에멀젼 조성물 및 이를 포함하는 화장료 조성물과 이의 제조 방법에 관한 것이다.

스쿠알렌(squalene)은 일반적으로 상어의 간에서 얻을 수 있는 트리테르페노이드(triterpenoid)계 불포화 탄화수소로, 스테로이드(steroid), 호파노이드(hopanoid), 트리터펜(triterpenes) 생합성 과정의 중간체라고 할 수 있다.

스쿠알렌은 1916년에 처음으로 상어의 간유에서 분리되었다. 하지만 스쿠알렌은 식물의 씨앗과 기름, 담수어에도 존재하며 인간도 하루에 약 1g을 생산한다고 보고되어 있다. 일반적으로 스쿠알렌은 다양한 기능을 가지고 있어 음식, 화장품, 건강식품, 제약 산업에서 사용되고 있다.

상어뿐만 아니라 종려나무의 열매와 올리브에도 스쿠알렌이 포함되어 있는데, 일반적으로 올리브는 400~450mg/100g의 스쿠알렌을 포함하며, 고품질의 올리브는 700mg/100g을 가지고 있다.

그동안 상어의 간유와 식물 기름이 스쿠알렌의 주된 원천이었지만, 최근에는 미생물의 발효 과정을 이용하여 스쿠알렌을 생산하고 있다.

스쿠알렌의 IUPAC명은 2, 6, 10, 15, 19, 23-hexamethyltetracosa-2, 6, 10, 14, 18, 22-hexaene이다. 탄소 30개와 수소 50개의 분자로 이루어져있다.

스쿠알렌은 분자량에 비해 어는점(-60℃)이 낮고 부동성인 정밀 기계유. 가스 크로마토그래피의 고정상용 액체와 화장품 원료로 사용된다. 특히 화장품 산업에서의 스쿠알렌은 피부 표면 지질의 구성 성분으로 약 13%를 차지하고 있고, 피부 친화성이 매우 뛰어나며 도포 시 잔여감 없이 깊이 흡수되는 천연 물질 중 하나이다.

또한, 6개의 이중결합을 가진 고도의 불포화탄화수소로 환원력이 강해 활성산소와 결합하여 세포의 산화 및 손상을 예방해 주어 건강유지와 증진에 기여한다. 콜레스테롤의 생합성에 아주 중요한 선구 물질로써, 상처 치유의 능력, 항산화 효능 및 콜라겐을 증가시켜 피부 노화 현상인 주름 발생을 완화해 주는 기능이 있다.

고령화 사회에 접어들면서 항노화(안티에이징) 트렌드가 빠르게 확산되고 관련 제품에 대한 수요가 폭발적으로 급증하고 있어 안티에이징에 탁월한 효과를 가진 스쿠알렌의 다양한 용도에 효율적으로 사용하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.

특히, 스쿠알렌은 용해도 및 안정성이 낮아서 다양한 제품 제조에 많은 제약이 따르는 실정이다. 따라서, 스쿠알렌의 용해도의 향상과 더불어 공기, 수분, 빛에 의한 변취 및 변색 등에 관여되는 스쿠알렌의 안정성 향상이 함께 요구되고 있다.

한국등록특허 제10-1884083호(등록일: 2018.07.25)

본 발명의 목적은 나노 에멀젼 형태로 스쿠알렌의 용해도와 안정성을 향상시키고, 온도변화, 빛, 공기 등에 의하여 색상, 제형안정성, 변취 등의 경시변화를 최소화하는 동시에 산폐 현상의 발생을 억제함으로써 보다 안정적으로 사용할 수 있는 피부 미백, 피부 탄력 증진, 주름 예방, 주름 개선 및 피부 보습 등의 효과가 우수한 나노 에멀젼 조성물과 이를 포함하는 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 이러한 나노 에멀젼 조성물 및 이를 포함하는 화장료 조성물의 효과적인 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 일 실시예는 전체 유상부 총 중량에 대하여 10~40 중량%의 스쿠알렌을 포함하는 나노 에멀젼 조성물을 제공할 수 있다.

한편, 상기 나노 에멀젼 조성물은 식물성 비이온 계면활성제를 추가로 포함하고, 상기 식물성 비이온 계면활성제는 폴리글리세릴-10올리에이트(polyglyxeryl-10 oleate) 및 수크로오스다이스테아레이트(sucrose distearate) 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.

또한, 상기 나노 에멀젼 조성물은 세틸에틸헥사노에이트(cetylethyl Hexanoate) 및 토코페릴아세테이트(Tocopheryl acetate) 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.

상기 스쿠알렌은 발효 스쿠알렌을 포함할 수 있다.

상기 나노 에멀젼 조성물의 비중이 0.8~1,1이고, pH가 4.5~8.5이며, 평균 입자 크기가 50~300 nm일 수 있다.

한편, 상기 나노 에멀젼 조성물은 자유 라디칼을 소거하고, 타입 I 프로콜라겐 단백질의 발현을 증가시키며, MMP-1 단백질의 발현을 억제하고, 엘라스타제(elastase) 활성 저해능을 가질 수 있다.

상기 나노 에멀젼 조성물은 피부 주름 예방 또는 개선용 효과를 가질 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 일 실시예에 따르면 식물성 비이온 계면활성제 및 연화제를 용해하는 제 1 단계;

안정화제를 첨가하여 교반하는 제 2 단계;

스쿠알렌을 첨가하고 냉각시키는 제 3 단계; 및

호모게나이저로 나노 에멀젼을 제조하는 제 4 단계를 포함하고,

상기 식물성 비이온 계면활성제는 폴리글리세릴-10올리에이트(polyglyxeryl-10 oleate) 및 수크로오스다이스테아레이트(sucrose distearate) 중 어느 하나 이상인,

나노 에멀젼 조성물의 제조방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 나노 에멀젼 조성물을 포함하는 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 화장료 조성물을 포함하는 화장품을 제공할 수 있으며, 상기 화장품은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 앰플, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 비비크림, 씨씨크림, 립크림, 립스틱, 바다이로션, 바다이클린저, 아이크림, 파운데이션 및 이들이 하나 이상 조합된 화장품 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 나노 에멀젼 조성물 및 이를 포함하는 화장료 조성물은 스쿠알렌의 용해도와 안정성을 동시에 향상시킬 수 있다.

이를 통해서 공기, 온도변화, 빛, 수분 등의 일상 환경에서 색상, 제형안정성, 재형변화, 변취 등의 경시변화로 인해 변질되기 쉬운 스쿠알렌을 안정적으로 피부 조직에 제공할 수 있다.

또한, 상기 나노 에멀젼 조성물은 자유 라디칼을 소거하고, 타입 I 프로콜라겐 단백질의 발현을 증가시키며, MMP-1 단백질의 발현을 억제하고, 엘라스타제(elastase) 활성 저해능을 가져서, 피부 미백, 피부 탄력 증진, 주름 예방, 주름 개선 및 피부 보습 등의 효과를 나타낸다.

도 1은 실시예의 나노 에멀젼(A), 0.1% 희석 수용액(B) 및 1% 희석 수용액(C)의 사진이다.
도 2는 실시예의 나노 에멀젼의 0.1% 희석 수용액(B) 및 1% 희석 수용액(C)의 입자의 크기를 측정한 입도분석 결과이다.
도 3는 스쿠알렌(SQ), 발효 스쿠알렌(F-SQ), 스쿠알렌 나노 에멀젼(MF-SQ) DPPH 자유 라디칼 제거 활성 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 스쿠알렌 나노 에멀젼(MF-SQ) 및 MF-SQ 적용 제재의 장기 안정성측정 결과를 나타낸 그래프이다.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 연구한 결과, 스쿠알렌을 과량 첨가하여 형성된 안정화된 나노 에멀젼 조성물을 제조하였다.

과량의 스쿠알렌을 나노 에멀젼화하여 용해도와 안정성을 높이고, 외부 환경 변화에 따른 변취를 억제하고, 피부 미백, 피부 탄력 증진, 주름 예방, 주름 개선 및 피부 보습 등의 효과가 우수한 나노 에멀젼 조성물을 제조하여 본 발명을 완성하게 되었다. 이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 나노 에멀젼 조성물은 전체 유상부 총 중량에 대하여 10~40 중량%의 스쿠알렌을 포함할 수 있다.

바람직하게는 폴리글리세릴-10올리에이트(polyglyxeryl-10 oleate) 및 수크로오스다이스테아레이트(sucrose distearate)가 함께 사용될 수 있고, 식물성 비이온 계면활성제의 함량은 전체 유상부 총 중량에 대하여 적게는 10 중량%, 많게는 50 중량% 이하일 수 있다. 40 중량% 이상, 50 중량% 이하일 수 있다.

상기 폴리글리세릴-10올리에이트와 수크로오스다이스테아레이트의 함량비는 2 : 1일 수 있다. 보다 상세하게는 폴리글리세릴-10올리에이트가 28 중량%, 수크로오스다이스테아레이트가 14 중량%일 때 가장 안정한 나노에멀젼이 생성된다.

상기 식물성 비이온 계면활성제는 식물 유래의 비이온 계면활성제로 화학합성 계면활성제들에 비하여 인체에 안전하면서도 생분해가 가능하여 환경 보호에 도움이 될 수 있다.

폴리글리세릴-10올리에이트는 통상 글리세린을 올리브유에 다량 포함된 불포화 지방산인 올레인산(oleaic Acid)과 에스테르 결합시켜서 제조되는 식물성 비이온 계면활성제로 담갈색의 점조액상이다. 폴리글리세릴-10올리에이트는 장시간에 걸쳐 피부의 수분량을 유지시킬 수 있다.

또한, 수크로오스다이스테아레이트는 통상 코코넛이나 팜오일을 가수분해하여 얻은 스테아린산과 수크로오스를 에스테르 결합시켜서 제조되는 식물성 비이온 계면활성제로 피부에 컨디셔닝을 부여하고, 피부결을 유연하고 부드럽게 개선시킬 수 있다.

폴리글리세릴-10올리에이트와 수크로오스다이스테아레이트을 적절히 혼합하여 사용하면, 물에 분산되었을 때 다중층의 라멜라 형태의 자기 조직체가 형성될 수 있다. 이러한 라멜라 형태는 피부 최외각층인 각질층의 라멜라 구조와 유사하여 피부와의 친화력을 증가시켜서 피부 침투성을 강화시킬 수 있다.

또한, 상기 나노 에멀젼 조성물은 세틸에틸헥사노에이트(cetylethyl Hexanoate) 및 토코페릴아세테이트(tocopheryl acetate) 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 구체적으로는 10~40 중량%의 세틸에틸헥사노에이트 및 0.05~ 0.3 중량%의 토코페릴아세테이트(tocopheryl acetate)를 혼용으로 사용할 수 있다. 여기에 스쿠알렌을 10~40 중량%를 혼합할 수 있으며, 이들의 총합이 30 ~ 75 중량%로 이루어진 조성물일 수 있다.

바람직하게는 세틸에틸헥사노에이트 및 토코페릴아세테이트를 모두 포함할 수 있다.

세틸에틸헥사노에이트는 연화제로 전체 유상부 총 중량에 대하여 20 중량% 이상, 50 중량% 이하 포함될 수 있다. 세틸에틸헥사노에이트는 세틸 알코올과 2-에틸헥사노익산를 에스테르화하여 제조되고, 끈적임이 없이 잘 퍼지고 낮은 응고점을 가진다. 무색-미황색의 투명 액체로 기능성 성분의 피부 흡수를 돕고, 피부결을 유연하게 하며, 피부를 보호해주고, 수분 손실을 막아주는 역할을 할 수 있다. 상기 세틸에틸헥사노에이트는 연화제 (혹은 유연제)로써 사용될 수 있고, 이 원료 대신에 에칠헥실팔미테이트, 카프릭/카프릴릭트리글리세라이드의 에스테르형 오일류, 하이드로제네이티드폴리데센을 포함하여 화장품 원료로 사용되고 있는 하이드로카본 오일류를 단독 혹은 혼합하여 사용될 수 있다.

또한, 토코페릴아세테이트는 안정화제로 전체 유상부 총 중량에 대하여 0.05 중량% 이상, 0.3 중량% 이하 포함될 수 있다.

토코페릴아세테이트는 지용성 비타민인 토코페롤(비타민 E)과 아세틱산의 아세틸화를 통해서 제조되고, 순수한 토코페롤의 대안 물질로 널리 사용되고 있다.

세포막을 구성하는 불포화 지방산의 산화를 억제시키는 항산화 성분으로, 피부노화 및 각종 병리적 현상을 지연, 예방시키는 효능이 알려져 있다. 또한, 비타민 C와 함께 사용할 때의 시너지 효과 및 피부 보습 효과도 알려져 있다.

이외에도 전체 나노 에멀젼 제조시 물이 전체 나노 에멀젼 조성물 총 중량에 대하여 0.5 중량%에서 7 중량% 이하로 포함될 수 있다. 제조된 나노 에멀젼은 물을 포함하는 다양한 매체에 농도를 조절하여 균일하게 분산될 수 있다.

또한, 상기 나노 에멀젼 조성물의 상기 스쿠알렌은 발효 스쿠알렌을 포함할 수 있다. 발효 스쿠알렌은 미생물의 발효 과정을 이용하여 얻어진 스쿠알렌이다.

한편, 상기 나노 에멀젼 조성물의 비중이 0.8~1.1 이고, pH가 4.5~8.5이며, 평균 입자 크기가 50~300 nm일 수 있다.

이러한 나노 에멀젼 조성물의 비중, pH 등은 화장료로 사용하기에 적합한 수준이다.

상기 나노 에멀젼 조성물의 자유 라디칼을 소거할 수 있고, 타입 I 프로콜라겐 단백질의 발현을 증가시키며, MMP-1 단백질의 발현을 억제할 수 있다.

타입 I 프로콜라겐은 세포외기질의 대부분을 구성하는 타입 I 콜라겐(collagen type I)을 합성하는 주재료로, 프로콜라겐의 증가는 피부의 결합력과 탄력성에 관여함으로써 주름 개선에 영향을 미친다.

또한, MMP는 아연 의존 엔도페티다제(zinc-dependent endopeptidase)로 엘라스틴, 콜라겐 등의 세포외기질(extracellular matrix; ECM) 단백질의 감소에 관여하는 효소로, UVB나 TNF-α와 같은 외부 자극에 의해 발현이 조절된다. 그 중에서도 MMP-1은 광노화에 중요한 역할을 하며, 콜라겐 1, 2, 3, 5형을 분해함으로써 피부 노화에 영향을 미친다.

따라서, 상기 나노 에멀젼 조성물은 MMP-1 단백질의 발현을 억제하여 피부 노화 개선의 효과를 나타낼 수 있다.

더불어, 상기 나노 에멀젼 조성물은 엘라스타제(elastase)의 활성을 저해시킬 수 있다.

엘라스타제는 세포외기질에 풍부하게 존재하며 피부 탄력에 중요한 역할을 하고 진피층의 3~4%를 차지하는 탄력섬유인 엘라스틴(elastin)을 분해하는 효소이다.

상기 나노 에멀젼 조성물은 엘라스타제의 활성을 저해하여, 피부의 탄력성을 높이고, 피부 주름 생성을 억제시킬 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 일 실시예에 따르면, 식물성 비이온 계면활성제 및 연화제를 용해하는 제 1 단계;

안정화제를 첨가하여 교반하는 제 2 단계;

스쿠알렌을 첨가하고 냉각시키는 제 3 단계; 및

상기 식물성 비이온 계면활성제는 폴리글리세릴-10올리에이트 및 수크로오스다이스테아레이트 중 어느 하나 이상인,

나노 에멀젼 조성물의 제조방법을 제공할 수 있다.

상기 제 1 단계는 50~80℃의 온도에서 반응이 진행될 수 있고, 연화제로는 세틸에틸헥사노에이트가 사용될 수 있다.

상기 제 2 단계는 30~50℃의 온도에서 반응이 진행될 수 있고, 안정화제로는 토코페릴아세테이트가 사용될 수 있다.

또한, 상기 제 3 단계의 냉각 온도는 20~40℃일 수 있고, 상기 스쿠알렌은 발효 스쿠알렌일 수 있다.

상기 제 4 단계의 호모게나이저는 고압분사 호모게나이저일 수 있고, 1,000~50,000psi, 10~40℃의 반응 압력 및 반응 온도 하에서 반응할 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 화장료 조성물을 포함하는 화장품을 제공할 수 있으며, 화장품은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 앰플, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 비비크림, 씨씨크림, 립크림, 립스틱, 바다이로션, 바다이클린저, 아이크림, 파운데이션 및 이들이 하나 이상 조합된 화장품 등 현재 고안되었거나, 앞으로 고안될 수 있는 모든 제형의 화장품에 다양하게 적용할 수 있다.

이하, 본 발명을 일 실시 형태를 다음 실시예 및 실험예를 통하여 더욱 상세히 설명하겠다. 다만, 본 발명이 다음 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예] 스쿠알렌 나노 에멀젼의 제조방법

스쿠알렌 나노 에멀젼의 제조방법을 하기 표 1에 나타낸 조성표를 사용하여 제조하였다. 여기에 사용된 계면활성제는 MIZOAN CleanEmul-7300로 폴리글리세릴-10올리에이트(polyglyxeryl-10 oleate)와 수크로오스다이스테아레이트(sucrose distearate)가 혼합된 원료를 사용하였다.

스쿠알렌을 함유하는 나노 에멀젼은 제조방법은 하기 표 1의 성분 및 조성으로 하기의 순서를 따라 제조하였다.

1) A상과 B상을 계량하여 60~70℃에서 가온 용해하였다.

2) 45℃까지 냉각하여 C상을 첨가하여 교반하였다. 이것은 열에 약하므로 최대한 낮은 온도(40~45℃)에서 첨가하였다.

3) D상을 첨가하여 혼합하고, 30℃까지 냉각하였다.

4) 고압분사 호모게나이저 (high pressure homogenizer)에 10,000psi, 20~30℃, 나노셀 (nano-cell)에 3~5회 통과하여 제조하였다.

5) 투명한 나노 에멀젼이 되면 제조를 완료하였다. 고압으로 통과에 따른 마찰 온도의 증가를 방지하기 위하여 냉각 순환이 장착된 장비를 사용하여 제조에 적용하였다.

	성분	함량 (wt%)	비고
(A)	MIZOAN CleanEmul-7300	42.000	계면활성제 (Surfactant)
(B)	세틸에틸헥사노에이트 (cetylethyl hexanoate)	35.900	연화제(Emollient)
(C)	토코페릴아세테이트(tocopheryl acetate)	0.100	안정화제 (Stabilizer)
(D)	발효 스쿠알렌	20.000	활성 물질 (active)
(E)	D. I. Water	2.000	용매 (solvent)
전체		100.000

상기 실시예에 따라 제조된 발효 스쿠알렌을 봉입한 나노 에멀젼에 대하여 일반 특성을 측정하여 하기 표 2에 나타내었다.

제조된 스쿠알렌 나노 에멀젼의 외관은 형성된 맑고 투명한 무색의 액체로 스쿠알렌의 고유한 냄새가 있었고, 비중은 0.928, pH는 5.82였다.

과량의 스쿠알렌이 안정하게 봉입이 된 것을 확인할 수 있었고, 중금속은 검출되지 않았으며, 미생물의 범위는 화장품 규격에 적합하다는 것을 알 수 있었다.

	측정 결과
외관	투명
냄새	스쿠알렌 고유 냄새
색상	무색
비중 (Sepecific Gravity)	0.928
pH	5.82
스쿠알렌 함량	20.05
중금속 함량	Pb, As 미검출
미생물	1000 CFU/mL 이하

제조된 스쿠알렌 나노 에멀젼의 최종 생성물과 수용액화(물에 희석된 스쿠알렌 나노 에멀젼)한 시료를 도 1에 나타내었다. 각각 스쿠알렌 나노 에멀젼의 최종 생성물(A), 스쿠알렌 나노 에멀젼을 0.1% 농도로 희석한 수용액(B) 및 스쿠알렌 나노 에멀젼을 1% 농도로 희석한 수용액(C)을 나타낸다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 스쿠알렌 나노 에멀젼은 투명하고 안정한 상태로 존재하며(A), 이를 정제수에 넣어 희석할 경우에 미세한 유화형 마이셀로 전상이 일어나기 때문에 색상을 띄게 된다(B 및 C).

외관상으로는 스쿠알렌 나노 에멀젼을 0.1% 농도로 희석한 수용액(B)가 스쿠알렌 나노 에멀젼을 1% 농도로 희석한 수용액(C)보다 더 푸른빛을 띠는데 이것으로 농도가 더 묽어서 나타나는 현상이라고 생각된다.

스쿠알렌 나노 에멀젼의 0.1% 희석 용액과 1% 희석 용액을 가지고 입경 분포를 측정한 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2a는 0.1% 농도로 희석한 시료이며, 도 2b는 1% 농도로 희석한 시료를 입자측정기로 측정한 결과이다.

스쿠알렌 나노 에멀젼의 0.1% 희석 용액의 평균입경분포는 134.8 nm이었으며, 표준편차는 33.60이었고, 1% 희석 용액을 의 평균입경분포는 131.2 nm이었으며, 표준편차는 39.70이었다.

입경분포의 그래프가 좁은 피크로 나타나서, 균일한 입경의 스쿠알렌 나노 에멀젼이 형성된 것을 확인할 수 있었다.

[실험예 1] 항산화 특성 측정

항산화 측정에 사용된 표준 시약인 2,2-다이페닐-1-파이크릴하이드라진 (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, DPPH) 라디칼(radical) 소거 능력은 Blois의 방법에 준하여 측정하였으며, 이를 통해 시료 간의 항산화 능력을 평가하였다. 96 well plate에 0.2 mM DPPH 용액과 시료를 첨가하여 암실에서 30분간 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로써 L-아스코르브산(L-ascorbic acid, L-AA)를 사용하였다. 평가하는 수식은 하기 식(1)에 나타내었다.

저해율(%)=(1-실험군의 흡광도/대조군의 흡광도)×100 (1)

식(1)에 나타낸 바와 같이 Beer Lambert 법칙에 맞도록 하기 위하여 실험군의 흡광도에 대조군의 흡광도를 나누어 얻은 값을 1로 빼 줌으로써 흡광도를 통하여 항산화 능력을 계산하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 스쿠알렌 (Squalene; SQ), 발효스쿠알렌 (Fermented squalene; F-SQ), 스쿠알렌 나노에멀젼(MF-SQ) 및 L-아스코르브산의 DPPH 라디칼 소거 능력을 측정하였고, 이를 통해서 이들이 가지는 항산화 능력을 확인할 수 있었다.

SQ은 용해도가 좋지 않아 다른 시료와 동일한 농도에서 비교가 불가능하여 용해가 되는 최고농도에서 비교하였다. 그 결과, F-SQ과 MF-SQ은 250 ppm에서 각각 80.72%, 81.5%로, 93.05%를 나타낸 L-아스코르브산과 마찬가지로 높은 수준의 항산화능을 보였다.

즉, 용해도가 낮은 SQ의 단점을 해소한 MF-SQ의 높은 항산화능을 확인할 수 있었다.

[실험예 2] 세포 독성 측정

세포 독성 측정에 사용된 세포주 및 세포 배양 방법을 하기와 같다.

Neonatal Human Dermal Fibroblasts (NHDF-Neo)는 Lonza (Morrisville, NC, USA)에서 분양 받아 사용하였으며 10% fetal bovine serum (FBS) (Gibco, USA), 1% penicillin-streptomycin (Sigma, USA)를 첨가한 Dulbecco’s modification of eagle’s medium (DMEM) (Corning, USA)을 배지로 하여 37℃, 5% CO₂조건 하에서 배양하였으며, 시료 처리 시 FBS를 제외한 무혈청 배지를 사용하였다.

세포 독성 측정은 NHDF-Neo 세포를 96 well plate에 1×10⁴cells/well이 되도록 분주하여 24 h 동안 배양한 후 각 시료(스쿠알렌(SQ) 및 스쿠알렌 나노 에멀젼(MF-SQ))를 농도별 (0, 2.5, 5, 10 ppm)로 첨가하였다. 24 h 배양 후 각 well에 MTT solution (5 mg/mL in PBS)을 20 μL씩 첨가한 후 37℃, 5% CO₂조건에서 3 h 동안 반응시켰다. 반응 완료 후 상등액을 흡인(suction)하고 DMSO를 분주하여 불용성 포마잔(formazan)을 용해시켰다. 이후 ELISA reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였으며 세포 생존율(%)은 하기 식(2)에 나타내었다.

생존율(%) = (실험군의 흡광도/대조군의 흡광도)×100% (2)

NHDF-Neo 세포에 SQ 및 MF-SQ의 시료를 농도별 (2.5, 5, 10 ppm)로 처리했을 때, 전 구간에서 독성이 나타나지 않았다.

또한, SQ 및 MF-SQ은 10 ppm 농도에서 각각 121.2% 및 129.9%의 세포 생존율을 나타내어, 117.5%의 세포생존율을 나타낸 L-아스코르브산보다 세포 생존율이 높은 것을 확인하였다.

즉, 스쿠알렌을 나노 에멀젼화함으로써, 세포 생존율을 향상시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.

[실험예 3] 엘라스타제 (Elastase) 활성 측정

스쿠알렌(SQ) 및 스쿠알렌 나노에멀젼(MF-SQ)의 엘라스타제 활성을 측정하기 위해 NHDF-Neo 세포를 이용하였다. 60 mm 페트리 접시(petri dish)에 세포를 분주 및 배양하여 필요한 만큼의 세포를 얻었다. 이후 배지를 제거하고 DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)로 세척한 후, 0.1% triton X-100이 포함된 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 8.0)를 가하여 단백질을 추출하였다.

이 용액을 4℃에서 3,000 rpm으로 20분간 원심분리 하여 얻은 상등액을 엘라스타제 효소액으로 하여 BCA kit (Thermo, USA)를 이용해 단백질량을 정량 하였다. 엘라스타제 효소액을 각 well 당 100 μg의 단백질량이 되도록 하여 96 well에 분주하고 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 8.0), 50 mM STANA, 시료를 첨가하여 37℃에서 90분간 반응시켰다. 양성 대조군으로써 phosphoramidon을 사용하였고, 반응 종결 후 ELISA reader를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 엘라스타제 활성(%)은 하기 식(3)에 의하여 나타내었다.

엘라스타제 활성(%): (실험군의 흡광도/대조군의 흡광도)×100 (3)

측정 결과, SQ 및 MF-SQ을 NHDF-Neo 세포에서 추출한 엘라스타제 효소액과 반응시켰을 때, 10 ppm 농도에서 모두 8.7%의 동일한 수준의 저해율을 나타내었다.

즉, 스쿠알렌을 나노 에멀젼화하여도 엘라스타제 저해능을 그대로 유지할 수 있음을 확인할 수 있었다.

[실험예 4] 타입 I 프로콜라겐 (Procollagen type I) C-펩타이드(C-peptide) 생합성 측정

세포 배양액 내의 콜라겐(collagen) 생합성량을 측정하기 위해 NHDF-Neo 세포를 12 well plate에 1×10 cells/well이 되도록 분주하여 24 h 동안 배양한 후 무혈청 배지에 시료를 희석한 후 첨가하였다. 24 h 반응 후, 각 well의 배양액을 수거하여 3,000 rpm에서 5 min 간 원심분리하여 얻은 상등액으로 콜라겐 생합성량을 측정하였다. 콜라겐 생합성량 측정에는 Procollagen type I C-peptide EIA kit (TaKaRa, Japan)가 사용되었다.

측정한 결과, 스쿠알렌(SQ) 및 스쿠알렌 나노에멀젼(MF-SQ)의 타입 I 프로콜라겐의 생합성능은 10 ppm 농도에서 각각 5%, 3.5%로 나타나서, 모두 콜라겐 생성에 일정 수준으로 기여할 수 있음을 확인하였다.

[실험예 5] Matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) 생성량 측정

세포 배양액 내의 MMP-1 생성량을 측정하기 위해 Human total MMP-1 Duoset (R&D Systems, USA)을 사용하였다.

먼저 NHDF-Neo 세포를 12 well plate에 1×10 cells/well이 되도록 분주하여 24 h 동안 배양한 후, 배지를 제거하여 DPBS로 세척하고 DPBS를 plate에 얇게 깐 상태에서 30 mJ/cm²UVB를 조사하였다. UVB 조사 후 무혈청 배지에 희석한 시료와 TNF-α (10 ng/mL)를 동시 처리하여 24 h 반응시켰다.

이때, TNF-α는 NHDF-Neo 세포에 자극을 더 주기 위하여 첨가하였다. 이후 각 well의 배양액을 수거하여 3,000 rpm에서 5 min 간 원심분리하여 얻은 상등액을 이용하여 MMP-1 생성량을 측정하였다.

외부 자극으로 인해 손상된 NHDF-Neo 세포에 SQ 및 MF-SQ 처리했을 때 MMP-1의 발현이 줄어드는 정도를 측정함으로써 시료가 가지는 주름 개선 효과를 알 수 있다.

NHDF-Neo 세포에 UVB (30 mJ/cm²)조사 및 TNF-α (10 ng/mL) 처리했을 때 MMP-1의 생성량이 34.4% 증가하였고 스쿠알렌(SQ) 및 스쿠알렌 나노에멀젼(MF-SQ)을 처리하였을 때 각각 1.55%, 31.79% 감소하였다.

이러한 결과를 통해서 스쿠알렌을 나노 에멀젼화함으로써 UVB 등의 외부자극에 의해 증가한 MMP-1의 감소량을 대폭 감소시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.

[실험예 6] 장기안정성 측정

스쿠알렌 나노에멀젼(MF-SQ)과 이를 적용한 에센스 제형에서 스쿠알렌의 HPLC 분석을 통해 장기안정도(6개월)를 확인하였다. 스쿠알렌은 25℃, 50℃ 조건에서 25주차에 70% 잔류하였으며, MF-SQ는 26주차에 80% 이상 함량이 유지됨을 확인하였다(도 4a).

또한, 도 4b에 나타낸 바와 같이, MF-SQ을 적용한 제형은 4℃, 25℃, 50℃ 모두 12주 경과 후에도 80% 이상이 정량 분석되어, MF-SQ이 스쿠알렌을 안정화시는데 크게 기여하는 것을 확인할 수 있었다.

이상 본 발명의 실시예 및 실험예들을 참조하여 설명하였지만, 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 상기 내용을 바탕을 본 발명의 범주 내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.

Claims

전체 유상부 총 중량에 대하여 10~40 중량%의 스쿠알렌을 포함하고,
식물성 비이온 계면활성제를 포함하며,
세틸에틸헥사노에이트(cetylethyl hexanoate) 및 토코페릴아세테이트(tocopheryl acetate)를 포함하고,
상기 식물성 비이온 계면활성제는 폴리글리세릴-10올리에이트(polyglyxeryl-10 oleate) 및 수크로오스다이스테아레이트(sucrose distearate)를 포함하며,
평균 입자 크기가 50~300 nm인,
나노 에멀젼 조성물.
제1항에 있어서,
상기 스쿠알렌은 발효 스쿠알렌을 포함하는,
나노 에멀젼 조성물.
제1항에 있어서,
비중이 0.8~1,1이고,
pH가 4.5~8.5인,
나노 에멀젼 조성물.
제1항에 있어서,
자유 라디칼을 소거하고, 타입 I 프로콜라겐 단백질의 발현을 증가시키며, MMP-1 단백질의 발현을 억제하고, 엘라스타제(elastase) 활성 저해능을 가지며, 피부 주름 예방 또는 개선용 효과를 가지는,
나노 에멀젼 조성물.
식물성 비이온 계면활성제 및 연화제를 용해하는 제 1 단계;
안정화제를 첨가하여 교반하는 제 2 단계;
스쿠알렌을 첨가하고 냉각시키는 제 3 단계; 및
호모게나이저로 나노 에멀젼을 제조하는 제 4 단계를 포함하고,
상기 식물성 비이온 계면활성제는 폴리글리세릴-10올리에이트(polyglyxeryl-10 oleate) 및 수크로오스다이스테아레이트(sucrose distearate)를 포함하며,
상기 연화제는 세틸에틸헥사노에이트를 포함하고,
상기 안정화제는 토코페릴아세테이트를 포함하며,
제조된 나노 에멀젼의 평균 입자 크기가 50~300 nm인,
나노 에멀젼 조성물의 제조방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 나노 에멀젼 조성물을 포함하는 화장료 조성물을 포함하는 화장품에 있어서,
상기 화장품은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 앰플, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 비비크림, 씨씨크림, 립크림, 립스틱, 바다이로션, 바다이클린저, 아이크림, 파운데이션 및 이들이 하나 이상 조합된 화장품 군에서 선택되는 어느 하나인 화장품.