KR102532456B1 - 독성이 제거되고 용해성과 발현량이 향상된 리신 백신 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 독성이 제거되고 용해성과 발현량이 향상된 리신 백신 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 독성이 제거되고 용해성과 발현량이 향상된 리신 백신 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
리신(Ricin)은 자연계에 존재하는 가장 위험한 독소 중 하나로 피마자 또는 아주까리(Castor Bean; Ricinus Communis)라고 불리는 식물의 씨에서 추출되는 것으로 0.001ｇ 정도의 소량으로도 성인을 사망에 이르게 할 수 있는 독성물질이다. 이 피마자 씨앗으로부터 추출되는 기름은 페인트, 윤활제, 광택제 등 산업용으로 주로 사용되기 때문에 많은 재배가 이루어지고 있어 이것의 부산물로써 리신의 위험성은 항상 존재하고 있다.
리신은 고도의 전문기술이나 많은 정제 비용이 필요하진 않기 때문에 개인이나 소규모 단체에서도 쉽게 추출하여 사용할 수 있어 생물 방어 분야에서 높은 위험성을 가지고 있다. 피마자 씨앗으로부터 추출하여 정제를 거치지 않은 미가공(crude) 형태의 리신 독소라 하더라도 어느 정도 독성을 가지고 있으며 추가적인 2차 정제과정을 거치면 순도 95% 이상의 리신 독소를 상대적으로 쉽게 얻을 수 있다. 또한 리신 독소는 단백질 특성상 열에 안정적이어서 냉장을 하지 않고도 보관할 수 있으며 분말(powder) 상태의 제조가 용이하여 에어로졸 형태로도 사용될 수 있고 음식이나 물에 넣는 등 다양한 방법으로 사용될 수 있다. 과거 리신을 생물무기로 사용하기 위한 시도가 있었고 특정인물을 암살하기 위한 용도로도 사용된 사례가 있기 때문에 이에 대한 지속적인 위험은 항상 존재하고 있고 대량의 사상자를 유발할 가능성도 배제할 수 없다. 또한 생물무기금지협약 규제 목록과 호주그룹의 수출통제 코어 리스트에 올라 있고 미국 질병통제센터는 카테고리 B 작용제로 규정하고 있다.
리신 독소(Ricin toxin; RT)는 독성 활성을 갖는 리신 A쇄 독소(Ricin Toxin A chain, 이하, 'RTA'라고도 함) 도메인과 세포결합부위인 리신 B쇄 독소(Ricin Toxin B chain, 이하, 'RTB'라고도 함) 도메인으로 구성된 이황화 결합된 헤테로다이머 당단백질(disulfide-linked heterodimeric glycoprotein)이다. RTA는 리보솜의 28S RNA에 있는 아데닌 4324를 특이적으로 절단하는 N-글리코시다제(N-glycosidase) 활성을 가지고 있어 세로 내 리보솜의 작용을 억제하여 단백질 합성을 위한 번역을 중단시켜 세포사멸에 이르게 한다. RTB는 모든 척추동물의 세포에서 발견되는 세포 표면에 존재하는 a-1,3 결합 갈락토오스(a-1,3-linked galactose, Gal)와 N-아세틸칼라토사민(N-acetylgalactosamine, GalNac) 잔기를 포함하는 당단백질(glycoprotein)이나 당지질(glycolipid)에 결합하는 갈락토스 특이적 렉틴(galactose-specific lectin)으로 RTA를 세포 내로 이동시키는 역할을 한다.
과거에는 리신 독소에 대한 백신으로써 톡소이드(toxoid)를 이용한 백신 개발이 시도되었다. 톡소이드 백신의 경우에는 독소 전체를 포함하고 있어 높은 항체 생성률과 방어률을 보일 수는 있으나 독성이 완전히 제거되지 않거나 폐 등에 심각한 부작용을 갖는 문제로 인해 현재는 이용되고 있지 않다.
이러한 문제점을 해결하기 위해 최근에는 유전자 재조합을 통해 실제 독성활성을 가지면서 중화항체 생성률이 높은 RTA에 아미노산 치환으로 독성을 제거한 형태의 백신이 개발되고 있다. RTA 독성활성 부위에는 아데닌과 결합하는데 중요한 역할을 하는 타이로신 80번(Y80), 아이소루신 172번(I172), 글루탐산 177번(E177), 알지닌 180번(R180)이 존재한다. 또한 RTA에는 단백질 합성저해에 의한 독성 외에도 허혈증을 유발시키는 아미노산 부위인 루신 74번(L74), 아스파라긴 75번(D75), 발린 76번(V76)이 밝혀져 있다. 이러한 아미노산 중 일부를 다른 아미노산으로 치환하여 아데닌과의 결합력을 떨어뜨리고 허혈증 유발을 억제하는 형태의 백신 개발이 오늘날 진행되고 있으며 미국의 경우에는 현재 임상시험 중에 있다.
유전자 재조합 방법을 이용해 개발 중인 대표적인 리신 백신으로는 Soligenix사에서 개발 중인 RiVAX와 미육군 전염병연구소(USAMRIID)에서 개발 중인 RVEc, 그리고 현재는 개발이 중단되었으나 한 때 개발되었던 영국 Warwick사의 Ricin-MPP 등이 있다. 리신 백신으로 RiVAX의 경우에는 RTA의 독성활성 부위에 존재하는 80번째의 타이로신을 알라닌(alanine)으로 치환하고 허혈증(Vascular Leak Syndrome, VLS)과 관련 있는 76번째의 발린(Valine)을 메티오닌(Methionine)으로 치환함으로써 리신 독성 및 허혈증을 제거한 것이다. 실제로 RiVAX는 리신을 주입, 섭취, 흡입 세 가지 방법으로 공격한 경우에 대해 약 10LD50까지 방어력을 갖는 것이 확인되었고 알루미늄 염(alum) 등 보조제(adjuvant)를 첨가하여 사용하는 등 여러 가지 방법을 통해 중화항체가 방어력을 높이기 위한 연구가 계속 진행되고 있다.
이러한 단백질 형태의 백신의 경우에는 방어효능이 매우 중요하지만 비임상, 임상시험 및 허가 후 실제 사용하기 위해 생산량과 정제효율 역시 매우 중요한 요소로 작용한다. 실제로 높은 방어 효능을 보이긴 하나 생산량이 낮은 문제점으로 인해 생산 및 정제 단가가 상승하여 대량으로 제조하기 어려워 개발이 중단되거나 설사 개발이 완료된다고 하더라도 높은 생산비용으로 인해 다수가 사용하기에 어려운 한계가 있다. 특히 다른 형태의 백신과 달리 단백질 백신은 발현균주나 백신의 구조 및 아미노산 구성에 따라 발현되는 양에 현저한 차이를 보이게 되고 이에 따라 고순도의 백신제형으로 만드는 정제 방법에 많은 영향을 주게 된다.
또한 한국 등록특허 제10-1855563호에 따른 R24 리신 백신의 경우 마우스 시험에서 독성은 없었으나 기니픽 시험에서 일부 독성이 확인되었다. 따라서 사람에게 사용할 경우에 위험성이 높을 수 있고 추후 임상시험에서 문제가 발생할 수 있으므로 이러한 문제점을 해결해야 할 필요성이 제기되었다.
이에, 본 발명자들은 R24 리신 백신에서 일부 아미노산을 변경함으로써 세포 독성 및 기니픽에 대한 독성이 제거되고 용해성과 발현량이 향상된 리신 백신을 개발하고 그 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은, 독성이 제거되고 용해성과 발현량이 향상된 리신 백신 및 이의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제(들)로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제(들)는 이하의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열에서 1번째부터 4번째까지 아미노산 및 189번째부터 263번째까지 아미노산이 제거된 RTA 단백질을 포함하는, 리신 백신을 제공한다.
상기 리신 백신은 75번째 및 80번째의 아미노산이 시스테인으로 치환된 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 서열번호 8로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 RTA 단백질을 포함하는, 리신 백신을 제공한다.
상기 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 RTA 단백질을 포함하는 백신은 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 RTA 단백질을 포함하는 백신에 비해 아데닌 결합에 의한 독성이 제거되고, 허혈증 유도가 억제되며, 세포 독성 및 기니픽에 대한 독성이 제거되고, 용해성 및 발현량이 향상된 것을 특징으로 한다.
상기 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 RTA 단백질을 포함하는 백신은 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 RTA 단백질을 포함하는 백신에 비해 세포 독성 및 기니픽에 대한 독성이 제거되고, 용해성 및 발현량이 향상된 것을 특징으로 한다.
상기 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 RTA 단백질을 포함하는 백신은 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 RTA 단백질을 포함하는 백신에 비해 용해성 및 발현량이 향상된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 전술한 RTA 단백질을 코딩하는 서열번호 4로 기재된 염기서열로 이루어진, DNA 단편을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 상기 DNA 단편을 포함하는, 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 상기 발현 벡터로 형질전환된, 형질전환 세포를 제공한다.
상기 형질전환 세포는 대장균을 형질전환 한 것 일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 상기 형질전환 세포를 배양하는 단계; 및 상기 형질전환 세포로부터 발현된 목적 단백질을 분리 및 정제하는 단계; 를 포함하는, 리신 백신의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 RTA 단백질; 및 약제학적으로 허용 가능한 담체; 를 포함하는, 리신 백신 조성물을 제공한다.
상기 리신 백신 조성물은 콜레라톡신, 알루미늄 하이드록사이드, 카보폴(carbopol), 광물성 오일 및 생분해성(biodegradable) 오일 중에서 선택되는 어느 1종 이상의 면역증강제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 리신 독소의 RTA 독성활성 부위에 존재하는 아미노산 중 아데닌과 결합에 중요한 부위인 80번 타이로신(Y80)과 허혈증을 유도하는 아미노산인 75번 아스파르트산(D75)을 시스테인(Cysteine, Cys)으로 치환하여 이황화결합(Disulfide bond) 형성을 유도함으로써 아데닌 결합에 의한 독성 활성을 제거함과 동시에 허혈증 유도를 억제하고 또한 리신 독소의 RTA 단백질의 구조안정성을 높이는 효과가 있고, 228번 이후의 아미노산을 제거하여 침전을 방지하는 효과가 있다.
또한 본 발명에 따르면, 상기 RTA 단백질에서 195번부터 227번까지의 아미노산(N195 - A227)을 추가로 제거하여 세포 독성 및 기니픽에 대한 독성을 제거하는 효과가 있다.
또한 본 발명에 따르면, 상기 RTA 단백질에서 1번부터 4번까지의 아미노산(I1 - K4) 및 189번에서 194번까지 아미노산(R189 - Y194)을 추가로 제거하여 용해성과 발현량을 향상시키는 효과가 있다.
또한 본 발명에 따르면, 상기와 같이 종래의 리신 백신의 문제점을 모두 해결하면서도 높은 항체가 및 우수한 중화능을 가지는 리신 백신을 제공하는 효과가 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1는 본 발명에 따른 일 실시예에 따른 야생형 리신 독소 및 리신 백신의 단백질 서열을 비교하여 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 리신 백신의 모식도, 유전자 서열 및 단백질 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 리신 백신의 삼차원 구조를 가상 시뮬레이션을 통해 모델링한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 야생형 리신 독소 및 리신 백신에 대하여 용해도를 예측한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 리신 백신을 친화도 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피로 정제한 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 리신 백신의 발현량을 분석한 것이고, 도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 리신 백신의 용해성을 분석한 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 야생형 리신 독소 및 리신 백신에 대한 세포독성을 비교하여 나타낸 것이다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따른 야생형 리신 독소 및 리신 백신의 마우스에 대한 항체가를 나타낸 것이고, 도 8b는 야생형 리신 독소 및 리신 백신의 기니픽에 대한 항체가를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 야생형 리신 독소 및 리신 백신을 기니픽에 투여한 후 형성된 항체의 세포 중화능을 측정한 결과를 나타낸 것이다[NC: 정상 세포(Normal Cell), NS: 정상 혈청(Normal Serum)].
도 10a는 본 발명의 일 실시예에 따른 리신 백신을 마우스에 투여한 후 리신 독소를 투여하여 중화능을 측정한 결과를 나타낸 것이고, 도 10b는 리신 백신을 기니픽에 투여한 후 리신 독소를 투여하여 중화능을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 리신 백신 R51 단백질(I1~Y194)을 코딩하는 DNA 서열을 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 리신 백신 R51-3 단백질(Q5~M188)을 코딩하는 DNA 서열을 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 리신 백신 R51 단백질(I1~Y194)의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 리신 백신 R51-3 단백질(Q5~M188)의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 리신 백신의 모식도, 유전자 서열 및 단백질 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 리신 백신의 삼차원 구조를 가상 시뮬레이션을 통해 모델링한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 야생형 리신 독소 및 리신 백신에 대하여 용해도를 예측한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 리신 백신을 친화도 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피로 정제한 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 리신 백신의 발현량을 분석한 것이고, 도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 리신 백신의 용해성을 분석한 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 야생형 리신 독소 및 리신 백신에 대한 세포독성을 비교하여 나타낸 것이다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따른 야생형 리신 독소 및 리신 백신의 마우스에 대한 항체가를 나타낸 것이고, 도 8b는 야생형 리신 독소 및 리신 백신의 기니픽에 대한 항체가를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 야생형 리신 독소 및 리신 백신을 기니픽에 투여한 후 형성된 항체의 세포 중화능을 측정한 결과를 나타낸 것이다[NC: 정상 세포(Normal Cell), NS: 정상 혈청(Normal Serum)].
도 10a는 본 발명의 일 실시예에 따른 리신 백신을 마우스에 투여한 후 리신 독소를 투여하여 중화능을 측정한 결과를 나타낸 것이고, 도 10b는 리신 백신을 기니픽에 투여한 후 리신 독소를 투여하여 중화능을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 리신 백신 R51 단백질(I1~Y194)을 코딩하는 DNA 서열을 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 리신 백신 R51-3 단백질(Q5~M188)을 코딩하는 DNA 서열을 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 리신 백신 R51 단백질(I1~Y194)의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 리신 백신 R51-3 단백질(Q5~M188)의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
이하 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것을 달성하는 방법은 첨부된 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다.
그러나 본 발명은 이하에 개시되는 실시예들에 의해 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
또한, 본 발명을 설명함에 있어 관련된 공지 기술 등이 본 발명의 요지를 흐리게 할 수 있다고 판단되는 경우 그에 관한 자세한 설명은 생략하기로 한다.
또한, 본 발명에서 사용되는 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, '구성된다', '이루어진다' 또는 '포함한다' 등의 용어는 명세서 상에 기재된 여러 구성 요소들, 또는 여러 단계 들을 반드시 모두 포함하는 것으로 해석되지 않아야 하며, 그 중 일부 구성 요소들 또는 일부 단계들은 포함되지 않을 수도 있고, 또는 추가적인 구성 요소 또는 단계들을 더 포함할 수 있는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명의 발현벡터는 본 발명의 기술 분야에서 알려진 통상의 방법을 이용할 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 형질전환 세포는 대장균을 형질전환 한 것이 바람직하나, 본 발명의 기술 분야에서 알려진 통상의 방법에 따라 실시할 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 백신 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라 약학적으로 허용되는 담체 및 또는 부형제를 이용하여 제제화됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수도 있다.
본 발명에서 '약학적으로 허용 가능한 담체'는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토소, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럼, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것이 아니다.
여기서, 상기 '약학적으로 허용 가능한 담체'란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다.
또한, 본 발명의 백신 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용 가능한 담체 및 부형제를 이용하여 제제화됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수도 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수도 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 리신 RTA 단백질의 삼차원 구조를 이용하여 설계 및 제작한 한국 등록특허 제10-1855563호에 따른 R24 리신 백신을 기초로 하여 세포 독성, 기니픽에 대한 독성을 제거하고, 용해성 및 발현량을 향상시킨 리신 백신이다.
먼저 RTA 리신 백신 설계를 위해 R24 백신과 동일한 방법으로 단백질 모델링 프로그램으로 독성 활성 부위를 예측하고 해당 아미노산 중 타이로신 80번(Y80)과 아스파라긴 75번(D75)을 이황화 결합가능 부위로 예측하여 가상의 백신 구조를 모델링하였다. 이를 바탕으로 용해도(solubility)를 예측하기 위한 프로그램을 이용해 본 발명에 따른 리신 백신을 설계하였다. 본 발명에서 리신 백신의 아미노산 종류 및 위치의 표시는 서열번호 5로 기재된 야생형 RTA단백질의 아미노산을 기준으로 한다.
백신의 설계를 위해 RTA의 아데닌 결합부위에 해당하는 아미노산을 정의하였다. 그 결과 타이로신 80번(Y80), 아이소루신 172번(I172), 글루탐산 177번(E177), 알지닌 180번(R180)을 찾을 수 있었다. 이 중 아데닌 결합 전, 후 구조를 비교함으로써 타이로신 80번(Y80)과 알지닌 180번(R180)이 아데닌 결합에 중요한 영향을 줄 것으로 예측할 수 있었다. 다음으로는 허혈증을 유도하는 아미노산인 루신 74번(L74), 아스파라긴 75번(D75), 발린 76번(V76)의 위치를 구조상에서 확인하였다.
백신의 발현 및 안정화 효율을 높이기 위하여 RTA 단백질 서열을 이용하여 이황화 결합유도 부위 및 침전유도 부위 예측을 진행하였다. 그 결과 타이로신 80번(Y80)과 아스파라긴 75번(D75)에 시스테인 돌연변이를 일으킴으로써 이황화 결합을 유도할 수 있을 것으로 예측되었다. 위 두 개의 아미노산은 독성활성과 허혈증 유도 부위의 아미노산을 포함할 뿐만 아니라 이황화 결합을 유도할 수 있기 때문에 백신의 구조적 안정성 유지에도 도움이 될 것으로 예측되었다. 그리고 RTA의 C 말단 부위에서 일부 아미노산의 경우 단백질 침전을 유도할 것으로 예측되어 세린 228번(S228) 이후의 아미노산을 제거한 형태의 R24를 설계하였다.
상기와 같이 제작된 리신 백신 R24는 아데닌 결합에 의한 독성 활성이 제거되고 허혈증 유도가 억제되는 효과가 있으나, 도 7에 나타난 것과 같이 세포 독성을 나타내고 도 10b에 나타난 것과 같이 기니픽 독성을 나타내는 문제점이 있다.
R24가 나타내는 세포 독성 및 기니픽 독성을 제거하기 위하여, 다수의 백신 후보를 준비하였다. 그 중 독성 제거 및 발현이 우수하고, 도 3의 3차원 가상 구조분석을 통해 백신의 전체적인 구조에 최소한의 영향을 미치는 것으로 선정하였다. 그 결과 N195 이후의 C 말단 아미노산을 제거한 형태의 R51을 설계하였다.
한편, 상기와 같이 제작된 R 51은 세포 독성 및 기니픽 독성은 제거되었으나 발현량이 적고 수용성이 낮은 점이 있다. 이를 극복하기 위한 추가 설계로 N말단과 C말단의 길이를 조절하는 방식으로 다양한 후보군을 준비하였다. 도 4의 용해도 예측 결과를 기반으로, 용해도 및 발현량 향상을 위하여 상기 R51에서 1-4(I1 - K4)번 및 189-194(R189 - Y194)번의 아미노산을 추가로 제거한 R51-3을 설계하였다.
아미노산 치환 및 단백질 발현 서열 조절시 현재까지 알려져 있는 중화항체 결합부위를 유지시키기 위하여 중화항체 결합 부위를 확인하고 백신 설계 시 이 부위에 구조적 영향을 미치지 않는지를 재확인하였다.
본 발명에 따른 백신은 상기 컴퓨터 시뮬레이션을 통해 확인한 모든 결과를 포함하며 실제 RTA 단백질과의 유사성과 단백질 구조형성의 안정성을 확인하기 위한 모델링을 시도하여 개발한 백신에 대한 가상의 삼차원 구조를 모델링하였다.
상기와 같이 제작된 백신의 단백질 서열을 기반으로 DNA를 합성하였고 히스티딘 표지 결합으로 발현시킬 수 있는 벡터에 클로닝하여 발현시켰다. 발현된 백신은 친화도 크로마토그래피와 크기 배제 크로마토그래피를 통해 순수분리 하였다. 이렇게 유전자 재조합 방법으로 얻은 백신을 시험관 내(in vitro), 생체 내(in vivo) 실험을 통해 중화항체 생성 및 리신독소에 대한 중화능 평가를 하였고 세포독성, 기니픽 독성이 제거되고, 용해도 및 발현량이 향상되는 것을 확인하였다.
본 발명에 따른 리신 백신의 용해도 및 발현량과 관련하여, 도 5, 도 6a 및 도 6b를 참조하면 R51은 수용성(soluble) 및 불용성(insoluble) 형태로 발현되나 R51-3은 불용성 없이 모두 수용성 형태로 발현되는 것을 알 수 있다. 또한 R51-3의 경우 R51 대비 약 3배 정도 많은 양이 수용성 형태로 발현되었다. 따라서, R51-3은 R51이 발현량이 적고 수용성이 낮은 점을 모두 극복한 것으로 나타났다.
본 발명에 따른 리신 백신의 세포 독성과 관련하여, 도 7을 참조하면 야생형인 RTA와 R24의 경우에는 세포 독성이 있는 것으로 나타났고, R51, R51-3 및 Rivax(미국에서 개발 중인 리신백신)의 경우에는 10 ug/ml(10,000 ng/ml)의 높은 농도에서도 세포 독성을 나타내지 않는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 리신 백신 R51, R51-3은 195번 이후의 C 말단 아미노산을(N195 - A227)을 제거함으로써 세포 독성이 제거됨을 알 수 있다.
본 발명에 따른 리신 백신의 항체가 및 중화능 평가와 관련하여, 도 8a 및 도 8b를 참조하면 마우스 실험에서는 R24에서 가장 높은 항체가를 보였으나 기니픽 실험에서는 R51-3에서 가장 높은 항체가를 나타내었다.
또한, 도 9는 기니픽에 리신 백신 투여 후 형성된 항체의 세포 중화능 시험 결과로, 리신 독소(RTX)만 처리한 세포는 5% 수준의 세포만 생존한 반면 본 발명에 따른 리신 백신을 투여한 혈청을 1% 수준으로 첨가한 세포의 경우에는 90% 수준으로 생존하여 우수한 중화능을 나타냄을 확인할 수 있다.
뿐만 아니라, 생체 내(in vivo) 리신 백신의 중화능 실험에 대한 도 10a 및 도 10b를 참조하면 마우스 실험에서는 리신 백신(R24, R51, R51-3) 모두 14일 후까지 100% 생존하는 것을 확인할 수 있었으나, 기니픽 실험에서는 R24는 10% 만 생존한 반면, R51 및 R51-3은 14일 후에도 100% 생존하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명에 따른 리신 백신 R51, R51-3은 C-말단(N195 - A227)을 제거함으로써 기니픽 독성이 제거될 뿐만 아니라, 높은 항체가 및 우수한 중화능을 나타냄을 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 리신 백신은 세포 독성 및 기니픽 독성이 제거되고, 용해성과 발현량이 향상되며, 높은 항체가 및 우수한 중화능을 나타냄을 확인하였다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 리신 백신의 설계
리신 독소의 RTA(Ricin Toxin A chain) 단백질에 대한 유전자 및 아미노산 서열을 분석하고 이를 이용하여 RTA 단백질의 3차원 구조를 가지고 독성활성부위를 예측하여 가상의 백신 구조를 설계하였다.
구체적으로 ExPASy 웹사이트(http://expasy.org/)를 이용하여 리신 독소의 RTA(Ricin Toxin A chain) 단백질에 대한 유전자 및 아미노산 서열을 분석하고, 분석한 서열을 이용하여 단백질 데이터 은행인 RCSB PDB(Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank)에서 수록된 리신의 3차 구조 파일인 PDB code로 1IFS와 2AAI를 얻어 구조 분석을 실시하였다.
이후, 3차원 구조 데이터베이스로부터 제공받은 RTA 단백질의 3차원 구조 정보는 3차원 분자 시각화 프로그램인 Discovery Studio 4.5 단백질 모델링 프로그램을 이용하여 도 1에 도시된 바와 같이 RTA 단백질의 아미노산 서열을 설정하고, RTA 단백질 내에 독성활성부위에 해당하는 염기서열 및 아미노산을 정의하였다.
이전 발명에 대한 등록특허 제10-1855563호에 기재된 바와 같이, 80번째의 타이로신(Y80)은 RTA 단백질의 독성활성부위(아데닌 결합 관련)이고, 75번째의 아스파트산(D75)은 허혈증을 유도하는 아미노산이나, 이 두 부위를 시스테인으로 치환함으로써 이황화결합 형성을 유도하여 아데닌 결합에 의한 독성 활성 및 허열증 유도를 억제하고 백신의 구조적 안정성 유지에 기여할 수 있다.
Discovery Studio 4.5 단백질 모델링 프로그램을 이용하여 리신 RTA 아미노산 서열 1-263번까지를 설정하고, 등록특허 제10-1855563호에 기재된 바와 같이 아스파라긴 75번(D75)과 타이로신 80번(Y80)을 시스테인으로 치환하고 침전을 유도하는 228번 이후의 아미노산을 제거하였고, 이를 R24로 하였다.
또한, R24가 가지고 있는 세포 독성 및 기니픽 독성을 제거하기 위해 설계한 20여개의 백신 후보 중 독성이 제거되고 발현이 잘 되는 것을 선정하였다. 이는 N195 이후의 C 말단 아미노산을 제거한 형태로서, 이를 R51로 하였다.
다음으로, R51은 세포 독성 및 기니픽 독성은 제거되었으나 발현량이 적고 수용성이 낮은 점을 극복하기 위해 추가 설계를 하였다. 추가 설계에서는 아미노산의 N말단과 C말단의 길이를 조절하는 방식으로 다양한 후보군을 설계하였다. 추가 설계시에는 수용성을 높이기 위한 목적을 달성하기 위해 웹프로그램 Protein-sol을 이용하여 분석하였다. 프로그램 분석결과 예측된 용해도(Predicted scaled solubility) 값이 0.45에 가까운 후보군을 선별(도 4 참조, 0.45보다 높은 값을 가질 경우 수용성이 높은 것으로 예측)하였다. 이는 상기 R51에서 1-4(I1 - K4)번 및 189-194(R189 - Y194)번의 아미노산을 추가로 제거한 것으로, 이를 R51-3으로 하였다.
야생형 리신 독소 RTA 단백질(I1~P263), 리신 백신 후보인 R24 단백질(I1~A227), R51 단백질(I1~Y194), R51-3 단백질(Q5~M188)를 코딩하는 DNA 서열을 상기 순서대로 서열번호 1, 2, 3, 4로 기재하였고, 서열번호 3 및 4의 DNA 서열에서 치환된 부위를 표시하기 위해 도 11 및 도 12로 나타내었다.
또한, 야생형 리신 독소 RTA 단백질(I1~P263), 리신 백신 후보인 R24 단백질(I1~A227), R51 단백질(I1~Y194), R51-3 단백질(Q5~M188)의 아미노산 서열을 상기 순서대로 서열번호 5, 6, 7, 8로 기재하였고, 서열번호 7 및 8의 아미노산 서열에서 치환된 부위를 표시하기 위해 도 13 및 도 14로 나타내었다.
도 11 내지 14에서 적색으로 표시한 부분은 아스파라긴 75번(D75)을 시스테인(C75)으로 치환한 것을 나타내었고 청색으로 표시한 부분은 타이로신 80번(Y80)을 시스테인(C75)으로 치환한 것을 나타내었다.
야생형 리신 독소 RTA 단백질(I1~P263), 리신 백신 후보인 R24 단백질(I1~A227), R51 단백질(I1~Y194), R51-3 단백질(Q5~M188)에 대하여 아래와 같이 실시하였다.
실시예 2: 리신 백신 발현 균주의 제조
실시예 1에서 준비된 리신 백신 유전자를 pET28a 발현벡터에 제한효소 NdeI과 NotI을 사용하여 삽입한 뒤 대장균(E.coli) BL21 균주에 클로닝하여 LB(Luria-Bertani) 배지(1% Tryptone, 0.5% Yeast Extract, 1% NaCl)에 kanamycin을 선별 항생제로 하여 최종 균주를 제작하였다.
실시예 3: 리신 백신 발현 및 정제
리신 백신이 클로닝 된 대장균 균주를 37℃에서 배양하여 O.D값이 0.3-0.4 사이에 위치하면 IPTG를 최종 0.5mM 농도로 넣고 온도를 25℃로 낮춘 뒤 다시 12시간 추가 배양하였다. 배양한 대장균을 모아 20mM Tris, 200mM NaCl pH 8.0 버퍼에 풀어준 뒤 초음파 처리(sonication)로 세포를 파쇄하여 상층액 만을 수득하였다. 여기서 얻은 상층액을 니켈(Ni-NTA) 컬럼을 이용하여 1차 정제를 시도하고 트롭빈을 처리하여 히스티딘 택을 제거한 뒤 크기 배제 크로마토그래피로 최종 정제를 수행하였다. 발현량의 경우 SDS-PAGE에 단백질을 로딩하여 전기영동법으로 리신 백신에 해당하는 단백질을 확인한 뒤, 해당 밴드의 intensity를 측정하여 상대 비교하였다.
도 5는 R51-3을 친화도 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피로 정제한 결과를 나타낸 것이다. 특히 Bio-analzer를 결과에 따르면 R51-3에 해당하는 밴드 외에 다른 밴드는 확인되지 않는 것으로 높은 순도로 정제하여 이후의 실험을 진행한 것을 알 수 있다.
도 5, 도 6a 및 도 6b를 참조하면, R51은 수용성(soluble) 및 불용성(insoluble) 형태로 발현되나 R51-3은 불용성 없이 모두 수용성 형태로 발현되는 것을 알 수 있다. 또한 R51-3의 경우 R51 대비 약 3배 정도 많은 양이 수용성 형태로 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 리신 백신의 세포독성 확인
리신 백신의 세포 독성을 확인하기 위해 Jurkat 세포주를 사용하였다. RPMI 배지(10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin)에서 배양한 세포를 2x104/well로 96웰 플레이트(well plate)에 준비하였다. 각각의 백신 후보물질을 0.2~10,000 ng/ml까지 처리하고 24시간 뒤 WST 용액 22.2ul/well을 추가로 넣어준 뒤 37℃에서 2시간 배양하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 7을 참조하면, RTA(야생형)와 R24의 경우에는 세포 독성이 확인되었고, R51, R51-3 및 Rivax(미국에서 개발 중인 리신백신)의 경우에는 10 ug/ml(10,000 ng/ml)의 높은 농도에서도 세포 독성을 나타내지 않는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 리신 백신의 항체가 측정
마우스 및 기니픽에서 리신 백신 투여 후 형성된 항체가를 측정하기 위해 96웰 플레이트에 항원 단백질을 코팅하고 4℃에서 반응시켰다. 다음 날 워시 버퍼로 세척 후 블로킹 버퍼를 처리하여 37℃에서 1시간 배양한 후, 항원이 코팅된 플레이트에 항체가 형성된 혈청을 순차적으로 희석하여 넣고 37℃에서 1시간 배양하였다. HRP가 표지된 2차 항체(Anti-mouse IgG 또는 Anti-Guinea pig IgG)를 웰 당 50ul씩 넣고 다시 37℃에서 1시간 배양한다. 워시 버퍼를 이용해 세척 후 발색 시약을 100ul씩 넣고 빛이 들어가지 않도록 하여 상온에서 30분간 반응시켰다. 각 웰에 3M 황산을 50ul씩 넣고 492nm에서 OD 값을 측정하였다.
도 8a 및 도 8b를 참조하면, 마우스 실험에서는 R24에서 가장 높은 항체가를 보였으나 기니픽 실험에서는 R51-3에서 가장 높은 항체가를 나타내었다.
실시예 6: 리신 백신의 독소 중화능 테스트
기니픽에서 리신백신 투여 후 형성된 항체의 세포 중화능 시험을 수행하기 위해 Jurkat 세포주를 사용하였다. RPMI 배지(10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin)에서 배양한 세포를 2x104/well로 96웰 플레이트에 준비한다. 각각의 백신 후보물질로 면역하여 획득한 혈청 1%와 2CD50의 리신 독소(RTX)를 ep-tube에서 미리 혼합한 뒤 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 준비해 둔 세포에 처리하여 37℃, CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. WST 용액 11.1ul/well을 추가로 넣어준 뒤 37℃에서 2시간 배양하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 9를 참조하면, 리신 독소(RTX)만 처리한 세포는 5% 수준의 세포만 생존한 반면 백신을 투여한 혈청을 1% 수준으로 첨가한 세포의 경우에는 90% 수준으로 생존하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7: 리신 백신의 동물 효능 평가
마우스의 경우, 7마리를 한 그룹으로 하여 각각의 리신 백신을 10ug/head 투여할 수 있도록 제조하고 근육주사를 통해 주입하였다. 백신은 0, 2, 4주 3회에 걸쳐 투여하고 7주차에 20LD50 수준의 리신 독소(RTX)를 투여하고 14일간 생존율을 관찰하였다.
기니픽의 경우, 10마리를 하나의 그룹으로 하여 각각의 리신 백신을 25ug/head 투여할 수 있도록 제조하고 근육주사를 통해 주입하였다. 백신은 0, 3, 6주 3회에 걸쳐 투여하고 7주차에 20LD50 수준의 리신독소(RTX)를 투여하고 14일간 생존율을 관찰하였다.
도 10a 및 도 10b를 참조하면, 마우스 실험에서는 리신 백신 후보 모두 14일 후까지 100% 생존하는 것을 확인할 수 있었으나, 기니픽 실험에서는 R24 리신 백신은 10%만 생존한 반면, R51 및 R51-3의 리신 백신은 14일 후에도 100% 생존하는 것을 확인할 수 있었다.
상기 실시예 1 내지 7의 결과로부터, 본 발명에 따른 리신 백신은 세포 독성 및 기니픽 독성이 제거되고, 용해성과 발현량이 향상되는 효과가 있음을 알 수 있다.
지금까지 독성이 제거되고 용해성과 발현량이 향상된 리신 백신 및 이의 제조방법에 관한 구체적인 실시예에 관하여 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서는 여러 가지 실시 변형이 가능함은 자명하다.
그러므로 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 안 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.
즉, 전술된 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술될 특허청구범위에 의하여 나타내어지고, 그 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<서열목록의 설명>
서열번호 1은 야생형 RTA 단백질(I1~P263)을 코딩하는 DNA 서열이다.
서열번호 2는 R24 단백질(I1~A227)을 코딩하는 DNA 서열이다.
서열번호 3은 R51 단백질(I1~Y194)을 코딩하는 DNA 서열이다.
서열번호 4는 R51-3 단백질(Q5~M188)을 코딩하는 DNA 서열이다.
서열번호 5는 야생형 RTA 단백질(I1~P263)의 아미노산 서열이다.
서열번호 6은 R24 단백질(I1~A227)의 아미노산 서열이다.
서열번호 7은 R51 단백질(I1~Y194)의 아미노산 서열이다.
서열번호 8은 R51-3 단백질(Q5~M188)의 아미노산 서열이다.
Claims (13)
- 삭제
- 삭제
- 서열번호 8로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 리신 A쇄 독소(Ricin Toxin A chain, RTA) 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는,
리신 백신.
- 제3항에 있어서,
서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 RTA 단백질을 포함하는 백신은
서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 RTA 단백질을 포함하는 백신에 비해 아데닌 결합에 의한 독성이 제거되고, 허혈증 유도가 억제되며, 세포 독성 및 기니픽에 대한 독성이 제거되고, 용해성 및 발현량이 향상된 것을 특징으로 하는,
리신 백신.
- 제3항에 있어서,
서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 RTA 단백질을 포함하는 백신은
서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 RTA 단백질을 포함하는 백신에 비해 세포 독성 및 기니픽에 대한 독성이 제거되고, 용해성 및 발현량이 향상된 것을 특징으로 하는,
리신 백신.
- 제3항에 있어서,
서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 RTA 단백질을 포함하는 백신은
서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 RTA 단백질을 포함하는 백신에 비해 용해성 및 발현량이 향상된 것을 특징으로 하는,
리신 백신.
- 제3항의 RTA 단백질을 코딩하는 서열번호 4로 기재된 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는,
DNA 단편.
- 제7항의 DNA 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는,
발현 벡터.
- 제8항의 발현 벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는,
형질전환 세포.
- 제9항에 있어서,
대장균을 형질전환 한 것을 특징으로 하는,
형질전환 세포.
- 제9항의 형질전환 세포를 배양하는 단계; 및
상기 형질전환 세포로부터 발현된 목적 단백질을 분리 및 정제하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는,
리신 백신의 제조방법.
- 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 리신 A쇄 독소(Ricin Toxin A chain, RTA) 단백질; 및
약학적으로 허용 가능한 담체; 를 포함하는 것을 특징으로 하는,
리신 백신 조성물.
- 제12항에 있어서,
콜레라톡신, 알루미늄 하이드록사이드, 카보폴(carbopol), 광물성 오일 및 생분해성(biodegradable) 오일 중에서 선택되는 어느 1종 이상의 면역증강제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는,
리신 백신 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220094422A KR102532456B1 (ko) | 2022-07-29 | 2022-07-29 | 독성이 제거되고 용해성과 발현량이 향상된 리신 백신 및 이의 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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Publications (1)
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| KR102532456B1 true KR102532456B1 (ko) | 2023-05-17 |
Family
ID=86547083
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| US20030181665A1 (en) * | 2002-02-27 | 2003-09-25 | Olson Mark A. | Ricin vaccine and methods of making and using thereof |
| KR20170059172A (ko) * | 2015-11-20 | 2017-05-30 | 국방과학연구소 | 돌연변이로 약독화된 rta 단백질로 이루어진 리신 백신 및 이의 제조방법 |
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2022
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Patent Citations (3)
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| KR101855563B1 (ko) | 2015-11-20 | 2018-05-04 | 국방과학연구소 | 돌연변이로 약독화된 rta 단백질로 이루어진 리신 백신 및 이의 제조방법 |
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