KR102531591B1

KR102531591B1 - 센티페드그라스 추출물을 함유하는 자외선 차단용 조성물 및 이를 포함하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102531591B1
Application number: KR1020210002118A
Authority: KR
Inventors: 정병엽; 배형우; 강성희; 이성범; 이승식; 김태훈; 김미연
Original assignee: 한국원자력연구원
Priority date: 2021-01-07
Filing date: 2021-01-07
Publication date: 2023-05-15
Also published as: KR20220099801A; CN116710045A; EP4275674A1; US20240074965A1; WO2022149870A1

Abstract

본 발명은 센티페드그라스 추출물을 함유하는 자외선 차단용 조성물 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 센티페드그라스(Centipede grass, Eremochloa ophiuroides) 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는, 자외선 차단용 조성물; 및 상기 자외선 차단용 조성물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

센티페드그라스 추출물을 함유하는 자외선 차단용 조성물 및 이를 포함하는 화장료 조성물{Composition for UV protection comprising extract of Eremochloa ophiuroides and cosmetic composition comprising the same}

본 발명은 센티페드그라스 추출물을 함유하는 자외선 차단용 조성물 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 자외선 차단 효과가 전혀 알려지지 않은 센티페드그라스(Centipede grass, Eremochloa ophiuroides) 의 추출물을 이용하여 효과적으로 자외선을 차단할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.

최근 화학 성분에 대한 이슈 증가로 화장품 구매 시 전성분을 확인하거나 저자극 천연 성분을 선호하는 소비자가 증가하고 있다. 이에 따라 화장품 시장도 화학 물질을 배제한 천연 유래의 성분들로 대체되고 있으며 이를 적용한 화장품이 출시되고 있다. 특히 자외선 차단제는 자외선 차단 소재 대부분이 화학 물질로, 피부 발진 등 여러 가지 심각한 부작용의 발생이 보고되고 있으므로 천연물질로의 대체가 가장 시급하다고 할 수 있다. 더욱이 환경 오염으로 인한 오존층 파괴, 야외 활동 증가 및 과도한 노출 시 주름, 색소침착, 탄력 저하 등의 피부노화, 일광화상, 홍반, 흑화, 피부암 등의 유발 가능성이 알려짐에 따라 자외선 차단의 중요성이 커지고 있다.

일반적으로 자외선(Ultraviolet Ray, UV)은 성층권의 오존에 의하여 완전히 흡수되는 UVC(200-290 nm), 대부분이 오존층에 의하여 흡수되지만 일부는 지표면에 도달하는 UVB(290-320 nm) 및 오존층에 흡수되지 않는 다른 종류의 자외선에 비하여 긴 파장을 가지는 UVA(320-400 nm)로 이루어진다. UVA는 피부를 붉게 만들면서 피부 면역 체계에 작용하여 피부 노화에 의한 장기적 피부 손상을 일으킬 수 있는 것으로 알려져 있다. UVB는 피부를 태우고 피부 조직으로 침투하여 단시간에 화상을 일으킬 수 있으며, 피부암 발생의 주요 원인으로 알려져 있다. 그리고 UVC는 자외선 중 파장이 가장 짧고 에너지가 높아 유전적 변이를 일으키고 심각한 피부손상을 유발하지만, 거의 대부분 오존층에 의해 차단되어 지표면에 도달하지 않는다고 알려져 있다.

자외선 차단제는 이러한 유해 자외선으로부터 피부를 보호하기 위해 피부에 바르는 제품으로, 자외선을 흡수하거나 산란시킬 수 있는 유기 또는 무기 자외선 차단 소재를 사용하여 피부가 자외선에 과도하게 노출되는 것을 막아준다. 그러나 기존의 유기 자외선 차단 소재는 구성성분 자체가 유기계 화합물이라 민감성 피부의 경우 특정 화학성분으로 인해 자극성 피부염 증상을 일으킬수 있다. 또한, 무기 자외선 차단 소재는 넓은 영역의 자외선 차단이 가능하나, 분산 및 용해가 어려워 백화 현상이 나타나므로, 많은 양을 사용하는데 한계가 있으며, 사용감도 좋지 않다는 문제가 있다. 한편, 한국등록특허 제KR 10-2092595호는 클로렐라 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선 차단용 화장료 조성물을 개시하고 있으나, 클로렐라 추출물의 SPF 차단 지수는 약 15.3으로 평가되었고 1 mg/mL 이상의 농도에서는 인간각질형성세포주(human keratinocyte cell line, HaCaT cells)의 세포 생존율을 급격하게 감소시킨다고 개시하고 있다.

따라서, 지표면에 도달하는 자외선 중에서 UVA보다 파장이 짧고 에너지가 높아 심각한 피부손상을 유발하는 UVB에 대하여 우수한 차단 효과를 나타내는 천연 소재를 발견하는 경우 관련 분야에서 유용하게 적용될 수 있을 것으로 기대된다.

이에 본 발명의 한 측면은 우수한 자외선 차단 효과를 갖는 천연 식물 추출물을 포함하는 자외선 차단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명의 자외선 차단용 조성물을 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 견지에 의하면, 센티페드그라스(Centipede grass, Eremochloa ophiuroides) 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는, 자외선 차단용 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 견지에 의하면, 상기 본 발명의 자외선 차단용 조성물을 포함하는 화장료 조성물이 제공된다.

본 발명에 의하면 여러 부작용이 보고되고 있는 합성 UV 차단제 성분에 비하여 독성이 없는 천연물인 센티페드그라스 추출물을 이용하여 280~320 nm의 파장영역을 갖는 UVB를 효과적으로 차단할 수 있으므로, 본 발명의 센티페드그라스 추출물은 새로운 자외선 차단제로써의 활용이 가능하여, 이를 유효성분으로 포함하는 자외선 차단용 조성물로 유용하게 사용될 수 있으며, 다양한 용도의 외용 화장료 조성물에 있어서 종래 합성 자외선 차단 성분을 대체할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 센티페드그라스 열수 추출물의 흡광도 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 센티페드그라스 열수 추출물의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 센티페드그라스 열수 추출물 내 총 페놀류(a) 및 총 플라보노이드류(b) 함량을 녹차 추출물과 비교하여 나타낸 것이다. (p < 0.001)
도 4는 UVB 조사 후 섬유아세포의 활성 변화를 나타낸 것이다.
도 5는 센티페드그라스 열수 추출물의 UVB 보호효과 측정 인비트로(in vitro) 실험 모식도를 나타낸 것으로, 도 5(a)는 사시도, 도 5(b)는 단면도를 나타낸 것이다.
도 6은 센티페드그라스 열수 추출물의 UVB 보호 효과를 나타낸 것이다. (p < 0.001)

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 형태를 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 의하면, 센티페드그라스(Centipede grass, Eremochloa ophiuroides) 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선 차단용 조성물이 제공된다. 센티페드그라스는 생육이 늦은 난지형 잔디로서 뗏장을 형성하며 포복 생장을 하는 다년생 잔디이다. 벼(Poaceae)과에 속하며, 학명은 에레모클로아 오피우로이데스(Eremochloa ophiuroides) (Munro) Hack이며, 주로 중국과 동아시아, 인도차이나, 미국 북동부, 메소아메리카와 캐러비안 지역에 분포하고 있으며, 각종 토양 조건에 폭 넓게 잘 적응되지만, 특히 습하며 산성토양 및 비옥도가 낮은 사질 토양에서 잘 견딘다. 본 발명은 상기 센티페트그라스의 지상부, 즉 바람직하게는 잎을 사용한다.

본 발명에 의해 획득되는 상기 센티페드그라스 추출물은 상기 크로로겐산(Chlorogenic acid), 오리엔틴(Orientin), 이소오리엔틴(Isoorientin), 람노실이소오리엔틴(Rhamnosylisoorientin), 데람노실메이신(Derhamnosylmaysin), 메이신(Maysin), 루테올린(Luteolin) 및 이레모네틴(Eremonetin) 중 적어도 하나를 포함하는 것으로, 바람직하게는 이들 모두를 포함하는 것이다.

본 발명의 상기 센티페드그라스 잎 추출물은 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출한 것이며, 저급 알코올은 예를 들어 에탄올, 메탄올 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 1,3-부틸렌글리콜과 같은 다가알코올을 포함하는 것이다. 바람직하게 본 발명의 상기 센티페드그라스 잎 추출물은 열수 추출물인 것이다.

보다 상세하게, 본 발명의 추출물 획득을 위해 사용되는 추출방법으로는 침지 추출, 진탕 추출, 열수 추출 또는 환류 추출등을 이용할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 예를 들어 상기 추출 용매를 센티페드그라스 잎 1 kg 기준으로 1 내지 50 L의 양을 첨가하여 추출할 수 있으며, 4 내지 30 L의 양을 첨가하여 추출하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 추출 온도는 4 내지 150℃, 예를 들어 10 내지 120℃, 25 내지 100℃, 또는 50 내지 120 ℃인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않으며, 추출 시간은 2 내지 5일인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 아울러, 추출 회수는 1 내지 3회인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 예를 들어 열수 추출물은 50 ℃내지 120 ℃, 바람직하게는 50 ℃ 이상 내지 100 ℃ 미만의 온도에서 1시간 내지 24시간 동안 침지함으로써 추출을 수행하여 획득될 수 있다.

한편, 본 발명에 있어서 센티페드그라스 잎 추출물은 액상으로 추출되어 그 자체로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 추출물은 1회 이상의 여과를 거친 후 사용될 수 있고, 또한 상기 추출물은 농축 혹은 건조하여 사용할 수 있다. 예를 들어 상기 여과는 와트만 필터 종이 0.2 내지 8 μm, 예를 들어 0.2 내지 0.5 μm 기공 사이즈(pore size)의 시린지 필터 또는 이들의 조합을 이용할 수 있다. 또한, 예를 들어 상기 농축은 감압농축일 수 있으나 이에 한정하지 않으며, 또한 상기 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조 등에 의해 수행될 수 있으나 이에 한정하지 않는다.

따라서, 본 발명에 있어서 "유효성분으로 함유하는"은 추출물 자체, 이의 농축물, 이의 건조물 등을 모두 포함하는 것이다.

본 발명에 의해 획득되는 상기 자외선 차단용 조성물은 UVB 차단용인 것으로, UVB에 대하여 우수한 차단 효과를 나타내는 것이다.

본 발명의 또 다른 견지에 의하면, 상기 본 발명의 자외선 차단용 조성물을 포함하는 화장료 조성물이 제공된다.

상기 본 발명의 화장료 조성물은 자외선 차단용 화장료 조성물에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 상기 자외선 차단용 조성물은 다양한 용도의 화장용 조성물에 첨가제로 사용될 수 있다.

이때, 상기 화장료 조성물은 상기 자외선 차단용 조성물을 전체 화장료 조성물의 중량을 기준으로 0.1 중량% 내지 2 중량%, 예를 들어 0.5 중량% 내지 1.5 중량%, 바람직하게는 1 중량%를 함유하는 것일 수 있으며, 다만 본 발명의 자외선 차단용 조성물에 포함된 센티페드그라스(Centipede grass, Eremochloa ophiuroides) 추출물의 농도, 및 액상 또는 건조 분말 등의 형태에 따라 화장료 조성물에 포함되는 센티페드그라스 추출물의 함유량은 다양할 수 있는 것으로, 상기 범위에 제한되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물은, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은 본 발명의 센티페드그라스 추출물에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.

이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예

1. 센티페드그라스(Centipedegrass) 추출물의 제조

(1) 센티페드그라스 에탄올 추출물의 제조

센티페드그라스 종자를 정읍에 위치한 한국원자력연구원 첨단방사선연구소의 포장에서 증식하여 센티페드그라스 잎 시료를 채취하였다. 채취한 잎 시료는 20~24 ℃에서 일주일간 자연건조 후, 105 ℃에서 24시간 동안 건조시켜 시료 내 수분함량을 측정하였다. 채취한 잎 시료의 수분함량(Water Content, WC) 측정 공식은 하기 [식 1]과 같다.

[식 1]

· WC(Water Contents, %) = 수분함량

· SW₁(Sample Weight, g) = 자연건조 전 측정한 센티페드그라스 잎 시료의 무게

· SW₂(Dried Sample Weight, g) = 20~24 ℃에서 일주일간 자연건조 및 105 ℃에서 24시간 동안 건조 후 측정한 센티페드그라스 잎 시료의 무게

상기 [식 1]을 통해 측정된 센티페드그라스 잎 시료 내 수분함량은 8.93 ± 0.48%로 측정되었다. 건조된 센티페드그라스 잎 250 g에 80% 에탄올(EtOH) 2 L를 첨가하고 상온에서 3일간 침지시켜 얻은 추출물을 와트만 거름종이(Whatman filter papers, No. 2, 110 mm)를 이용하여 2회 여과하였다. 이후에 0.45 μm 시린지 필터(syringe filter)를 이용하여 1회 여과하여 센티페드그라스 에탄올 추출물을 수득하였다.

(2) 센티페드그라스 메탄올 추출물의 제조

센티페드그라스 종자를 한국원자력연구원 첨단방사선연구소의 포장에서 증식하여 센티페드그라스 잎 시료를 채취하였다. 상기 1.(1)과 동일한 과정으로 건조된 센티페드그라스 잎 250 g에 80% 메탄올(MeOH) 2 L를 첨가하고 상온에서 3일간 침지시켜 얻은 추출물을 와트만 거름종이(Whatman filter papers, No. 2, 110 mm)를 이용하여 2회 여과하였다. 이후에 0.45 μm 시린지 필터(syringe filter)를 이용하여 1회 여과하여 센티페드그라스 메탄올 추출물을 수득하였다.

(3) 센티페드그라스 열수 추출물의 제조

센티페드그라스 종자를 한국원자력연구원 첨단방사선연구소의 포장에서 증식하여 센티페드그라스 잎 시료를 채취하였다. 상기 1.(1)과 동일한 과정으로 건조된 센티페드그라스 잎 250 g에 물 5 L를 첨가하여 90 ℃에서 6시간 이상 침지시켜 얻은 추출물을 와트만 거름종이(Whatman filter papers, No. 2, 110 mm)를 이용하여 2회 여과하였다. 이후에 0.45 μm 시린지 필터(syringe filter)를 이용하여 1회 여과하여 센티페드그라스 열수 추출물을 수득하였다.

(4) 센티페드그라스 물 추출물의 제조

센티페드그라스 종자를 한국원자력연구원 첨단방사선연구소의 포장에서 증식하여 센티페드그라스 잎 시료를 채취하였다. 상기 1.(1)과 동일한 과정으로 건조된 센티페드그라스 잎 250 g에 물 2 L를 첨가하여 상온에서 3일간 침지시켜 얻은 추출물을 와트만 거름종이(Whatman filter papers, No. 2, 110 mm)를 이용하여 2회 여과하였다. 이후에 0.45 μm 시린지 필터(syringe filter)를 이용하여 1회 여과하여 센티페드그라스 물 추출물을 수득하였다.

(5) 센티페드그라스 1,3-부틸렌글리콜 추출물의 제조

센티페드그라스 종자를 한국원자력연구원 첨단방사선연구소의 포장에서 증식하여 센티페드그라스 잎 시료를 채취하였다. 상기 1.(1)과 동일한 과정으로 건조된 센티페드그라스 잎 250 g을 70% 1,3-부틸렌글리콜 2 L를 첨가하여 상온에서 24시간 동안 침지시켜 얻은 추출물을 와트만 거름종이(Whatman filter papers, No. 2, 110 mm)를 이용하여 2회 여과하였다. 이후에 0.45 μm 시린지 필터(syringe filter)를 이용하여 1회 여과하여 센티페드그라스 1,3-부틸렌글리콜 추출물을 수득하였다.

2. 열수 추출물의 밀도 및 추출 수율 확인

(1) 센티페드그라스 열수 추출물의 밀도 측정

본 발명의 센티드그라스 열수 추출물의 밀도(Density, ρ)를 측정하기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.

① 동일한 부피의 삼각플라스크(초자류; 300 mL) 5개를 초음파 세척 후, 105 ℃에서 24시간 동안 완전 건조한다.

② 상기 ①의 삼각플라스크(초자류; 300 mL) 5개를 충분히 식힌 후, 각각의 무게를 측정한다.

③ 상기 ②의 삼각플라스크에 상기 1.(3)에서 수득한 센티페드그라스 열수 추출물을 100 mL씩 넣은 후, 105 ℃에서 24시간 동안 완전 건조한다.

④ 상기 ③에서 완전 건조된 삼각플라스크의 무게를 재측정한다.

⑤ 상기 과정을 통해 측정된 무게를 하기 [식 2]에 대입하여 밀도를 계산한다.

[식 2]

· ρ(Density, g/L) = 센티페드그라스 열수추출물의 밀도

· FW₁(Flask Weight, g) = 완전 건조된 삼각플라스크의 무게

· FW₂(Flask & Sample Weight, g) = 105 ℃에서 24시간 동안 건조된 센티페드그라스 열수 추출물이 들어있는 완전 건조된 삼각플라스크의 무게

· SV(Sample Volume, L) = 센티페드그라스 열수추출의 부피(100 mL)

그 결과, 상기 [식 2]를 통해 계산된 센티페드그라스 열수 추출물의 밀도는 6.4 ± 0.1 mg/mL로 측정되었다.

(2) 센티페드그라스 열수 추출물의 추출 수율 측정

본 발명의 센티드그라스 열수 추출물의 추출 수율(Extraction Yield)은 하기 [식 3]을 이용하여 계산하였다.

[식 3]

· EY(Extraction Yield, %) = 추출수율

· ESW₁(Non-extracted Sample Weight, g) = 열수 추출에 사용된 건조된 센티페드그라스 잎 시료의 무게

· ESW₂(Extracted Sample Weight, g) = 열수 추출 후에 105 ℃에서 24시간 동안 완전 건조 후 측정한 센티페드그라스 열수 추출물의 무게

그 결과, 상기 [식 3]을 통해 계산된 센티페드그라스 열수 추출물의 추출 수율은 9.04%로 측정되었다.

3. 센티페드그라스(Centipedegrass) 추출물의 인비트로( in vitro ) SPF 측정

290 내지 320 nm 파장의 UVB에 대한 센티페드그라스 추출물의 자외선 차단능을 확인하기 위하여 자외선 차단지수(Sun Protection Factor; SPF)를 측정하였다.

본 실험에서의 SPF 측정은 RM Sayre 등의 방법(RM Sayre, et al. A comparison of in vivo and in vitro testing of sunscreening formulas. Photochemistry and photobiology, 1979, 29(3), pp. 559-566)을 참조하였다. 본 발명에서 사용된 인비트로(In vitro) SPF측정 공식은 하기 [식 4]과 같다.

[식 4]

· CF = 보정계수(Correction Factor) = 10

· EE(λ) = 각 파장 λ 에서 태양 복사의 홍반(Erythema) 효과

· I(λ) = 파장 λ 에서의 태양광 강도

· Abs(λ) = 각 파장 λ 에서 측정된 샘플의 흡광도

여기서 EE × I 값은 하기 표 1의 값을 적용하였다.

파장 (nm)	EE × I (normalized)
290	0.0150
295	0.0817
300	0.2874
305	0.3278
310	0.1864
315	0.0839
320	0.0180
Total	1.0000

상기 1.에서 수득한 각각의 센티페드그라스 추출물들의 SPF 측정을 다음과 같이 실시하였다.

① 상기 1.에서 수득한 각각의 센티페드그라스 추출물들을 최종적으로 10 mg/mL, 5 mg/mL, 2.5 mg/mL, 1 mg/mL, 0,5 mg/mL 그리고 0.1 mg/mL이 되도록 각 용매를 이용하여 희석하였다.

② 상기 ①의 용액(100 μL)을 96-well black plate에 넣고 230 nm부터 400 nm까지 5 nm 간격으로 분광광도계(Tecan, Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 추출물의 흡광도를 측정하였다. 상기 1.에서 추출에 사용한 각 용매(80% 에탄올, 80% 메탄올, 물 및 70% 1,3-부틸렌글리콜)를 기준(블랭크, blank)으로 사용하였다(하기 표 2에서 '각 용매'에 해당함).

③ 상기 ②에서 측정된 흡광도를 상기 [식 4]와 표 1에 대입하여 계산한 인비트로(in vitro) SPF 값을 아래 표 2에 나타내었다.

각각의 센티페드그라스 추출물의 인비트로(in vitro)SPF 측정치

추출 용매	농도(mg/mL)
추출 용매	10	5	2.5	1	0.5	0.1	각 용매	Blank
에탄올	19.86	12.71	5.58	3.18	1.44	1.30	1.73	1.36
메탄올	17.91	11.43	4.03	2.98	1.31	1.23	1.16	1.36
열수	38.05	38.28	37.49	22.04	11.75	1.76	1.27	1.36
물	21.63	15.36	9.81	4.98	1.98	1.36	1.20	1.36
1,3-부틸렌글리콜	14.20	8.23	4.11	2.86	1.43	1.31	1.27	1.36

* 상기 표 2에서 blank는 비어있는 웰(well)을 의미하는 것이다.

상기 1.(1)에서 수득한 센티페드그라스 추출물들의 SPF 측정 결과, 상기 1.(1)에서 수득한 센티페드그라스 에탄올 추출물(10 mg/mL)은 UVB를 약 94.9% 차단하고, 상기 1.(2)에서 수득한 센티페드그라스 메탄올 추출물(10 mg/mL)은 UVB를 약 94.4% 차단하고, 상기 1.(3)에서 수득한 센티페드그라스 열수 추출물(10 mg/mL)은 UVB를 약 97.3% 차단하고, 상기 1.(4)에서 수득한 센티페드그라스 물 추출물(10 mg/mL)은 UVB를 약 95.4% 차단하고, 그리고 상기 1.(5)에서 수득한 센티페드그라스 1,3-부틸렌글리콜 추출물(10 mg/mL)은 UVB를 약 92.9% 차단하는 것으로 확인되었다.

이와 같이 센티페드그라스 추출물은 다양한 추출 용매에서 모두 우수한 UVB 차단 효과를 나타내는 것으로 확인되었으며, 특히 상기 1.(3)에서 수득한 센티페드그라스 열수 추출물의 UVB 차단 효과가 다른 용매를 사용한 경우에 비하여 더욱 우수하였다. 도 1은 상기 1.(3)에서 수득한 센티페드그라스 열수 추출물의 UV 파장대 흡광도 측정 결과를 나타낸 것이다.

4. 센티페드그라스(Centipedegrass) 열수 추출물의 성분 분석

본 발명의 센티드그라스 열수 추출물의 성분을 분석하기 위하여 HPLC분석을 수행하였다. 구체적으로, Agilient Technologies 1200 series HPLC에 20 μL의 시료 용액(상기 1.(3)에서 수득한 센티페드그라스 열수 추출물)을 주입하고, 1% 포름산 수용액(용액 A) 및 100% 메탄올(용액 B)로 구성된 이동상을 사용하였다. 상기 이동상을 복합 공정(combined step) 및 30분 동안 100:0(용액 A:B)에서 50:50의 직선 구배로, 이어서 60분 동안 50:50에서 0:100의 직선 구배로 분획물 성분을 용출시켰다. 유속은 0.5 μL/min이고 용출된 화합물은 360 nm의 파장에서 탐지하였다.

그 결과, 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이 상기 1.(3)에서 수득한 센티페드그라스 열수 추출물에서 크로로겐산(Chlorogenic acid), 오리엔틴(Orientin), 이소오리엔틴(Isoorientin), 람노실이소오리엔틴(Rhamnosylisoorientin), 데람노실메이신(Derhamnosylmaysin), 메이신(Maysin), 루테올린(Luteolin) 및 이레모네틴(Eremonetin)의 단일 물질 8종을 확인하였으며, 그 함량은 하기 표 3과 같다.

성분	크로로겐산	오리엔틴	이소오리엔틴	람노실이소오리엔틴	데람노실메이신	메이신	루테올린	이레모네틴
μg/g	67.6	7.3	54.0	137.5	157.4	107.2	34.1	85.6

* 상기 표 3의 함량은 추출물 1mg 당 각 성분의 함량을 μg으로 나타낸 것이다.

5. 센티페드그라스 열수 추출물 내 총 페놀류 및 총 플라보노이드류 함량 측정

(1) 센티페드그라스 열수 추출물 내 총 페놀류 함량 측정

페놀류 화합물은 플라보노이드(flavonoids), 안토시아닌(anthocyanins), 탄닌(tannins), 카테킨(catechins), 이소플라본(isoflavones), 리그난(lignans), 레스베라트롤(resveratrols) 등을 총칭하며, 식물계에 널리 분포되어 있다. 페놀류에 존재하는 다수의 히드록실기(-OH)는 여러 화합물과 쉽게 결합하는 특성을 가지고 있어 항산화 및 항염 효과가 뛰어나다고 알려져 있다. 따라서, 상기 1.(3)에서 수득한 센티페드그라스 열수 추출물의 항산화 효능을 알아보기 위하여 센티페드그라스 열수 추출물 내 총 페놀류 함량을 측정하였다. 총 페놀류 함량은 폴린 시약(Folin-reagent)이 페놀성 화합물에 의해 환원되어 몰리브덴 청색으로 발색되는 원리를 이용하여 측정하였다.

구체적으로, 표준물질은 갈산(gallic acid)을 사용하여 0-100 μg/mL 농도로 제조한 후 상기 센티페드그라스 열수 추출물과 동일한 방법으로 분석하여 얻은 표준 검량선을 기준으로 센티페드그라스 열수 추출물의 폴리페놀 함량을 당량으로 계산하였다. 센티페드그라스 열수 추출물은 Folin-Ciocalteau’s phenol reagent 시약을 혼합하여 실온에서 빛을 차단하여 1시간 동안 반응시켰다. 이후에, 96-well plate 200 μL씩 분주한 후 분광광도계(Tecan, Mannedorf, Switzerland)를 사용하여 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 건조된 센티페드그라스 열수 추출물 1 g에서 용출되는 총 페놀류의 함량을 갈산 기준으로 측정하였다.

그 결과, 도 3(a)에서 확인할 수 있는 바와 같이 상기 1.(3)에서 수득한 센티페드그라스 열수 추출물 내 총 페놀류 함량은 117.0 ± 2.3 mg GAE/g으로 대조군으로 사용된 녹차 추출물(66.7 ± 1.3 mg GAE/g)보다 유의하게 높은 것으로 측정되었다.

(2) 센티페드그라스 열수 추출물내 총 플라보노이드류 함량 측정

플라보노이드(flavonoids)는 페놀류에 속하는 성분으로, 플라보노이드의 C6-C3-C6를 기본골격으로 폴리페놀과 같이 식물의 잎, 꽃, 과실, 줄기 및 뿌리 등 거의 모든 부위에 함유되어있다. 플라보노이드는 페놀류와 마찬가지로 항염, 항산화 효과가 있다고 알려져 있다. 따라서, 상기 1.(3)에서 수득한 센티페드그라스 열수 추출물의 항산화 효능을 알아보기 위하여 센티페드그라스 열수 추출물 내 총 플라보노이드류 함량을 측정하였다.

구체적으로, 상기 센티페드그라스 열수 추출물과 메탄올을 1:9의 비율로 혼합하여 만들어진 혼합물 500 μL에 10% Al(NO₃)₃와 1 M KCH₃CO₂를 각각 100 μL씩 첨가하였다. 상기 혼합물에 메탄올을 4.3 mL 첨가한 후 실온에서 40 분간 반응시킨 후 분광광도계를 사용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 센티페드그라스 열수 추출물 내 총 플라보노이드류 함량은 케르세틴(Quercetin)을 사용해 상기 절차와 동일한 방법으로 그려진 표준곡선에 대조하여 함량을 확인하였다.

그 결과, 도 3(b)에서 확인할 수 있는 바와 같이 상기 1.(3)에서 수득한 센티페드그라스 열수 추출물 내 총 플라보노이드류 함량은 133.8 ± 2.1 mg CE/g으로 대조군으로 사용된 녹차 추출물(56.2 ± 0.5 mg GAE/g)보다 유의하게 높은 것으로 측정되었다.

6. 섬유아세포에서 센티페드그라스(Centipedegrass) 열수 추출물의 UVB 보호 효과 분석

상기 1.(3)에서 수득한 본 발명의 센티페드그라스 열수 추출물이 섬유아세포(Human, fibroblast)에서 UVB에 대한 보호 효과가 있는지 여부를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

(1) 섬유아세포주 배양

본 발명의 센티페드그라스 열수 추출물의 UVB 보호 효과를 확인하기 위하여 섬유아세포를 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank; KCLB)에서 구입하였다. 상기 섬유아세포(CCD-986SK, Human)는 100 U/mL의 페니실린(penicillin) 및 100 μg/mL의 스트렙토마이신(streptomysin)과 함께 10% FBS(fetal bovine serum)이 포함된 IMDM(Isocove’s modified Dulbecco’s medium)에 배양하였으며, 37 ℃ 및 5% CO₂ 배양환경을 유지하였다.

(2) UVB의 세포독성 평가

센티페드그라스 열수 추출물의 UVB 보호 효과를 평가하기 위하여, 섬유아세포에서 UVB의 세포독성을 평가하였다.

구체적으로, 상기 6.(1)에서 배양한 섬유아세포(1×10⁴ cells/well)를 96-well plate에 분주하여 10% FBS가 포함된 배양액에서 6시간 동안 배양하였다. 상기 세포를 FBS 미포함 배양액으로 처리한 후 밤새(overnight) 배양하였다. 이후에 다양한 세기(1, 5, 10, 15, 20, 25, 30 mJ/cm²)의 UVB를 조사한 후 24시간 동안 추가 배양하였다. 이후에, 모든 배양액을 제거한 후 PBS(phosphate buffer saline)로 1회 세척하고, 100 μg/mL의 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]가 포함된 배양액에 37 ℃에서 3시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 세포들은 PBS로 1회 세척하였으며, 100 μL의 DMSO(dimethyl sulfoxide)로 용해시켰다. 세포 내 보라색 포르마잔(formazan)은 infinite M200(TECAN, Mannedorf, Switzerland)을 이용하여 540 nm의 흡광도에서 정량하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 UBV가 1 및 5 mJ/cm² 세기로 조사된 섬유아세포 활성도는 107.6 ± 3.8 및 97.6 ± 4.6%로 대조군과 유의한 차이가 없었다. 반면에, 10, 15, 20, 25 및 30 mJ/cm² 세기로 조사된 섬유아세포 활성도는 80.1 ± 1.6, 75.2 ± 3.8, 72.2 ± 2.9, 69.4 ± 5.2 및 25.0 ± 9.5%로 조사 세기에 비례하여 유의적으로 감소하였다.

(3) 섬유아세포 배양조건 변화에 대한 인비트로( in vitro ) SPF 측정

본 발명의 센티페드그라스 열수 추출물의 UBV 보호효과가 섬유아세포의 배양조건(배양액의 종류 및 용량)에 의존한다는 사실을 배제하기 위하여 세포배양액의 종류 및 용량 변화에 대한 SPF 값을 측정/비교하였다.

구체적으로, 세포배양액의 종류 및 용량 변화에 대한 SPF 측정은 다음과 같이 실시하였다.

① 상기 1.(3)에서 수득한 센티페드그라스 열수 추출물을 96-well black plate에 각각 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200 μL 씩 넣고 230 nm부터 400 nm까지 5 nm 간격으로 분광광도계를 이용하여 추출물의 흡광도를 측정하였다.

② PBS를 96-well black plate에 각각 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200 μL씩 넣고 230 nm부터 400 nm까지 5 nm 간격으로 분광광도계를 이용하여 추출물의 흡광도를 측정하였다.

③ 상기 6.(1)에서 조성한 100 U/mL의 페니실린(penicillin) 및 100 μg/mL의 스트렙토마이신(streptomysin)과 함께 10% FBS(fetal bovine serum)이 포함된 IMDM(Isocove’s modified Dulbecco’s medium)을 96-well black plate에 각각 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200 μL 씩 넣고 230 nm부터 400 nm까지 5 nm 간격으로 분광광도계를 이용하여 추출물의 흡광도를 측정하였다.

④ 상기 ①~③에서 측정된 흡광도를 상기 [식 4]과 표 1에 대입하여 계산한 인비트로(in vitro) SPF 값은 아래 표 4에 나타내었다.

세포배양액 종류 및 용량 변화에 대한 인비트로(In vitro) SPF 측정치

배양액 종류	용량(μL)
배양액 종류	20	40	60	80	100	120	140	160	180	200
열수 추출물	2.3	24.1	36.4	37.2	36.6	36.9	36.8	36.2	35.8	36.6
PBS	1.3	1.3	1.3	1.3	1.4	1.3	1.4	1.4	1.4	1.4
IMDM	1.3	1.4	1.6	1.8	2.0	2.1	2.3	2.5	2.6	2.8

그 결과, 상기 표 4에 나타낸 바와 같이 상기 1.(3)에서 수득한 센티페드그라스 열수 추출물과 PBS는 용량 변화에 대한 SPF 값의 변화가 관찰되지 않았다. 반면에, IMDM은 용량이 증가함에 따라서 SPF 값이 1.3에서 2.8까지 증가하였다. IMDM의 UBV차단 효율은 용량에 비례적으로 23.1%에서 64.3%까지 증가하였다. 따라서, IMDM은 자체적으로 UVB 차단 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

(4) 섬유아세포에서의 UVB 보호 효과 분석

본 발명의 상기 1.(3)에서 수득한 센티페드그라스 열수 추출물이 UVB가 조사된 섬유아세포에서 보호 효과를 나타내는지 여부를 확인하기 위하여, 아넥신 V(Annexin V) 분석 통하여 세포사(apoptosis) 비율을 측정하였다.

도 5는 본 실험과정을 요약한 UVB 조사실험 모식도로 도 5(a)는 사시도, 5(b)는 단면도를 나타낸 것이다. 구체적으로, 상기 6.(1)에서 배양한 섬유아세포(1×10⁶ cells/well)를 6-well plate에 분주하여 10% FBS가 포함된 배양액에서 37 ℃ 및 5% CO₂ 조건 하에 밤새(overnight) 배양하였다. 이후에, 모든 배양액을 제거한 후 PBS(phosphate buffer saline)로 1회 세척한 후 다시 PBS 1 mL을 처리하고, 1 mL의 DW 또는 본 발명의 센티페드그라스 추출물이 담긴 또 다른 6-well plate를 상기 섬유아세포가 배양된 6-well plate 위에 겹쳐서 5B와 같이 배치하였다. 상기 6-well plate 에 배양된 섬유아세포는 하기와 같이 3개의 그룹으로 분류하였다.

① 대조군(그룹 1)

- 상층 6-well plate: 1 mL의 DW가 담겨 있음

- 하층 6-well plate: 1 mL의 PBS에 섬유아세포가 위치해 있음

- 30 mJ/cm² UVB 조사: 상/하층 6-well plate 호일로 감싸져 있어 UVB가 차폐된 상태

② UVB 조사 실험군(그룹 2)

- 상층 6-well plate: 1 mL의 DW가 담겨 있음

- 하층 6-well plate: 1 mL의 PBS에 섬유아세포가 위치해 있음

- 30 mJ/cm² UVB 조사

③ UVB 조사 및 센티페드그라스 열수 추출물 실험군(그룹 3)

- 상층 6-well plate: 1 mL의 센티페드그라스 열수 추출물(1 mg/mL)이 담겨 있음

- 하층 6-well plate: 1 mL의 PBS에 섬유아세포가 위치해 있음

- 30 mJ/cm² UVB 조사

상기 각 실험군의 세포에 30 mJ/cm²세기의 UVB를 조사한 다음, 모든 배양액을 제거한 후 FBS 미포함 배양액으로 처리하여 37 ℃ 및 5% CO₂ 조건 하에 24시간 동안 배양하였다. 이후에 모든 배양액을 제거한 후 PBS로 1회 세척하고, 각 웰에 500 μL의 트립신(trypsin)을 처리하여 3000 rpm에서 3분간 원심분리하여 모든 세포(pellet)를 수득하였다. 상기 과정을 통해 수득한 섬유아세포를 아넥신 V/PI 어세이 키트(Annexin V/PI assay kit) (Muse Annexin V and Dead Cell Assay kits, MCH100105; EMD millipore, Billerica, MA USA)를 이용하여 염색한 후, Muse^TM 세포 분석기(cell analyzer)(Muse 1.1.2; EMD millipore, Billerica, MA USA)를 이용하여 사멸한(apoptotic) 세포를 정량적으로 분석하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 30 mJ/cm²세기의 UVB가 조사된 그룹 2의 섬유아세포에서는 총 51.2 ± 5.7%의 세포자멸사가 유도되었다. 반면 상기 1.(3)에서 수득한 센티페드그라스 열수 추출물(1 mg/mL)에 의해 UVB가 차폐된 그룹 3의 섬유아세포에서는 15.3 ± 6.2%로 세포자멸사가 유의하게 감소한 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 센티페드그라스 열수 추출물은 조사된 UVB를 효과적으로 차단함으로서 섬유아세포의 생존율을 증가시킨다는 것을 확인하였다.

이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

Claims

센티페드그라스(Centipede grass, Eremochloa ophiuroides) 잎 열수 추출물을 유효성분으로 함유하며,
상기 센티페드그라스 잎 열수 추출물은 크로로겐산(Chlorogenic acid), 오리엔틴(Orientin), 이소오리엔틴(Isoorientin), 람노실이소오리엔틴(Rhamnosylisoorientin), 데람노실메이신(Derhamnosylmaysin), 메이신(Maysin), 루테올린(Luteolin) 및 이레모네틴(Eremonetin)를 포함하는, 자외선 차단용 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 열수 추출물은 90 ℃ 내지 120 ℃의 온도에서 1시간 내지24시간 동안 열수 추출되어 획득되는, 자외선 차단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 센티페드그라스 잎 열수 추출물은 센티페드그라스 잎 1 kg 기준 1 내지 50 L의 추출 용매를 사용하여 획득된 것인, 자외선 차단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 자외선 차단용 조성물은 자외선 A 및 자외선 B 차단용인, 자외선 차단용 조성물.
제1항 및 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 자외선 차단용 조성물을 포함하는 화장료 조성물.
제8항에 있어서, 상기 자외선 차단용 조성물을 전체 화장료 조성물의 중량을 기준으로 0.1 중량% 내지 2 중량% 함유하는, 화장료 조성물.