KR102522163B1 - 인공 데스메막 - Google Patents

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안겔라 구터무트
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프라운호퍼-게젤샤프트 추어 푀르더룽 데어 안게반텐 포르슝 에.파우.
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Abstract

본 발명은 각막 내피 조직을 합성하기 위한 방법 및 수단에 관한 것으로서, 인체 또는 동물체 외부의 단리된 세포로부터 각막 내피의 생성을 가능하게 하는 구조화된 인공 구조물에 대한 것이다.

Description

인공 데스메막
본 발명은 포유동물 안구의 각막 내피 조직을 제조하기 위한 방법 및 수단에 관한 것으로서, 신체 외부의 단리된 세포로부터 각막 내피의 형성을 가능하게 하는 구조화된 인공 구조물을 제공한다.
안구 각막의 투명도는 적절한 시력에 필수이다. 무엇보다도, 그것은 온전한 내피 조직 (각막 내피)을 필요로 한다. 각막의 뒤쪽에 있는 이 단층 내피는 각막의 주요 층인 간질을 구분하는 무세포 기저막인 소위 Lamina limitans posterior descementi 또는 데스메막과 직접 접촉하여 있다. 건강한 각막의 데스메막은 기본적으로 VIII형 콜라겐과 라미닌으로 구성된다. 그것은 내피 세포의 구조에 상응하는 규칙적인 공간 구조를 가지고 있다. 내피는 데스메막을 가로지르는 간질을 적극적으로 배액하여 보수력과 부종 형성 및 이에 따른 코로나의 불투명성을 예방한다.
인간의 각막 내피 세포는 G1-단계에서 정지하고 생체 내에서 제한된 증식능 만을 나타낸다. 그것이 분열할 수 없다는 것은 각막 손상의 경우 염증 과정이나 기계적 외상으로 인한 것일 뿐만 아니라 자연적인 노화 과정으로 인해 내피의 회복 불가능한 파괴가 발생할 수 있으며 최악의 경우 각막 혼탁으로 인해 시력이 완전히 상실될 수 있음을 의미한다. 죽은 내피 세포가 옆의 것으로 대체되더라도, 내피 세포의 견고성 및 기능을 보장하기 위해 더 커지고 틈으로 이동하게 된다. 하지만 이러한 복구 메카니즘은 매우 제한적이다.
각막의 내피 세포 소실은 의료 조치에 의해 제한적으로만 치료될 수 있다. 흔히 사용되는 방법은 소위 천공 각막 이식에서 손상된 각막 전체를 기증 각막으로 대체하는 것이다. 그러나 만성적 건성안, 각막 혈관화 및 최악의 경우 외래 기증물의 거부와 같이 눈의 복구 결여 또는 감소를 초래하는 임상적 합병증이 종종 발생한다.
이러한 전체 대체 외에, 손상된 내피를 그의 데스메막과 함께 국소 제거 (Descemetorhexis)한 후, 각막 내피와 부착된 데스메막으로 구성된 판상 이식물 및 후측 간질의 작은 부분을 기증자 각막에서 수령자의 전방 내로 도입하는 방법이 현재 확립되었다. 이러한 특정 이식을 통해 이식의 일반적인 위험과 수술 부작용이 전체 이식에 대해 감소된다. 그러나 아직 해결되지 않은 기술적인 문제가 여전히 있다.
이러한 각막 조직의 동종 이식과 관련한 일반적인 문제는 내피 세포의 소실이다. 기증자 안구에서 표본 기술, 사용된 저장 방식 및 영양 매질, 운송 및 궁극적으로 기증 조직의 수술 전후 조작은 항상 이식에서 정도의 차이가 있긴 하지만 내피 세포의 현저한 소실로 이어진다. 외래 조직의 면역 반응 변성 이외에, 이러한 요인들은 이식된 내피 조직을 기능이 없게 만들고 재활하지 못하게 하여 일차 이식 실패로 이어질 수 있다.
본 발명의 목적은 각막 내피 조직의 임상적 보수에서 이러한 단점을 극복하는 것이다. 특히, 동종 이식의 공지된 단점뿐만 아니라, 특히 외래 기증 조직에서 내피 세포의 세포사 문제가 감소되어야 한다.
본 발명은 공지된 이식의 전술한 단점을 극복한 신규 생물학적 내피 이식물, 즉 새로운 인공 데스메막을 기반으로 하여 단리된 세포로부터의 조직 배양물에서 드노보로 생성될 수 있는 각막 내피 조직의 제조를 위한 방법 및 수단을 제공한다.
본 발명자들은 놀랍게도 단리된 만능 또는 다능성 줄기세포가 건강한 각막에 존재하는 데스메막을 특이적으로 복제하여 높은 세포 밀도를 갖는 새로운 기능성 각막 내피 조직을 형성하는 특별한 인공 구조물에 의해 자극될 수 있을 뿐 아니라, 본 발명의 인공 데스메 구조물 자체가 손실된 각막 내피의 기능을 완전히 대체하기 위해 환자의 눈에 이식될 수 있음을 발견했다.
따라서, 본 발명은 시험관 내에서 각막 내피 조직을 형성하기 위해 생물학적 세포, 특히 다능성 또는 만능 세포의 기계적 신호전달 분화를 지원하거나 가능하게 하는데 특히 적합한 인공 데스메 구조물을 제공한다.
이론에 구애됨이 없이, 본 발명에 따른 데스메 구조물에 단리된 세포의 시딩 후, 이들 세포의 기계적 신호전달 분화 및 이에 따른 기능성 각막 내피 조직의 형성이 일어난다. 이로써, 수령자 자신의 세포, 특히 다능성 세포 또는 만능 세포가 사용될 수 있다. 따라서, 수령자 자신의 세포로 구성된 인공 각막 이식이 제공될 수 있고, 조직의 시험관 내 배양 시 적합한 배양 측정에 의해, 가능한 수술 전 또는 수술 후 세포사를 보충할 수 있도록 세포 수 및 세포 밀도가 선택될 수 있다. 이식 후, 이식된 내피 조직의 기능은 영구적으로 유지되고 완전한 영구 복구가 이루어질 수 있다.
본 발명에 따라, 데스메 구조물은 실질적으로 구형인 돔 모양의 기본체로 이루어지며, 표면상의 이 기본체의 오목면 (캐비티) 상에 벌집 구조가 형성된다. 기본체의 표면을 공간적으로 벌집 모양으로 패터닝하는 것은 적절한 미세 구조화 방법에 의해 생성될 수 있다.
본 발명의 문맥에서, "칼롯형" 또는 "구형"은 좁은 의미의 구형 부분을 배제하지 않고, 반각형 또는 세미 돔형, 예컨대 회전 타원체, 회전 포물면 및 그 중간 형태를 비롯해 본질적으로 상기 형태에 대응하는 형태 및 형상을 포함한다. 본 발명에 따라, 인공 데스메 구조물은 특히 구조물에 의해 또는 구조물과 함께 형성되는 이식물이 이식되는 각막 형태에 상응하는 형상을 갖는다.
특히, 그와 같은 벌집 구조는 바람직하게는 벌집 형태로 갭 없이 배열된, 반복적인 기하학적 기본 요소 또는 벌집으로 구성되도록 설계되며, 각각의 허상 기본 요소는 중심 함몰부와, 인접한 기본 요소에 대한 한계를 짓는 측면 웹을 가진다. 바람직하게는, 웹 높이, 및 따라서 중심 함몰부의 깊이는 0.3 내지 1 ㎛이다. 웹 폭은 바람직하게는 1 내지 8 ㎛이다. 이들 웹에 의해 둘러싸인 중심 함몰부의 폭은 바람직하게는 10 내지 20 ㎛이다.
바람직하게는, 기본 요소들은 각각 육각형의 기본 형상을 가지며, 따라서 고전적인 벌집 구조를 형성한다. 다른 구체예에서, 반복적인 기본 요소들의 기본 형태는 원형 또는 실질적으로 원형이다. 다른 변형예에서, 기본 형상은 본질적으로 직사각형 또는 정사각형이다. 다른 변형예에서, 기본 형상은 일반적으로 다각형이다. 바람직하게는, 상이한 수의 모서리, 바람직하게는 5 내지 9개의 모서리를 갖는 다각형이 교대된다. 이들 벌집 구조체는 특히 바람직하게는 육각형 및 오각형으로 구성된다.
특정 변형예에서, 벌집 구조는 엄격하게 규칙적이며, 즉, 본질적으로 균일하고 바람직하게는 본질적으로 동일한 기본 요소들로 구성된다. 대안적이고 바람직한 변형예에서, 벌집 구조는 불규칙적이다. 즉, 허상 기본 요소들은 각각 상이한 크기 및/또는 상이한 개별 형상을 가지며, 기본 요소들의 크기는 바람직하게는 벌집 구조에 (준)-확률적으로 분포된다. 따라서, 6 내지 약 24개의 근본적인 기본 요소 그룹의 평균 크기는 일정하게 유지된다. 이 경우, 전술한 바람직한 크기 범위를 초과하지 않는다.
웹, 즉 기본 요소들의 측벽은 각각 바람직하게는 기본체의 구조화된 표면의 기저면에 수직하게 배치되는 것이 바람직하다. 대안적인 변형예에서, 기본 요소의 측벽은 원추형으로 그의 함몰부의 바닥에 수렴한다. 이 목적을 위해, 측벽의 두께가 함몰부의 바닥쪽으로 증가되도록 특히 제공된다. 따라서, 함몰부는 다각형 각뿔 밑둥, 또는 실질적으로 원형 단면의 경우에, 원뿔대의 형상을 에워싼다.
일 변형예에서, 반각으로부터 돌출된 원주 에지가 제공된다. 이것은 구조화될 필요가 없다. 이것은 미세 구조화 동안과 다른 한편으로 세포 배양 시 데스메 구조물의 사용 동안에 데스메 구조물의 조작을 돕기 위해 사용된다. 필요한 경우, 세포 배양 단계 완료 후 또는 데스메 구조물의 삽입 전에 경계부를 이식물의 일부로 분리할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 데스메 구조물은 생물학적 또는 생체 적합성 중합체를 함유하고, 바람직하게는 전체가 그것으로 구성된다. 생물학적 또는 생체 적합성 중합체는 바람직하게는 기계적으로 탄성이고 가요성이다. 대안적인 변형예에서, 이는 본질적으로 비탄성이지만 가요성이다.
생물학적 또는 생체 적합성 중합체의 선택을 위해, 데스메 구조물이 시험관 내 이식물의 일부로 안구에 이식되는 경우, 수술 후에 고유 데스메막의 물리화학적 기능을 대체할 수 있다는 것이 적절하다. 이것은 특히 수양액을 간질로부터 능동적 펌핑 내피 조직으로 통과시키는 투과성 (수동 확산)을 포함한다. 이 확산은 특히 재료 구성 요소의 극성을 선택하고/거나 다공성 또는 천공된 구조체 (분자체)를 사용함으로써 가능하다.
또한, 인공 데스메 구조물은 이식 후 부분적으로 또는 완전히 재흡수성이도록 제공된다. 이 경우 고유 기저막의 기능을 발휘하는 잔류 구조는 잔존하지만, 반면에 데스메 구조물에서 특히 이식물의 기계적 안정화를 위한 재료는 이식 직후에 재흡수 가능하다. 이는 또한 수술 후 인공 데스메 구조에서 기저막이 형성되도록 한다.
생물학적 또는 생체 적합성 중합체의 기계적 성질은 고유 데스메막의 기계적 성질이 달성되는 방식으로 선택되도록 또한 제공된다. 특히, 조직 배양 시 시험관 내에서 단리된 세포로부터 드노보 각막 내피 조직을 기계적 신호전달로 형성되게 하고, 다른 한편으로 수령자의 눈에 이식하는 동안 수술 전후 충분한 안정성을 보장하기 위해 데스메 구조물의 기계적 강성이 필요하다. 일 변형예에서, 구조물의 기계적 특성은 시험관 배양 동안 및/또는 수술 후에 변경된다. 이 목적을 위해, 조성물은 상이한 재흡수를 나타내거나 내피 세포와 상호 작용하는 다수의 성분 중에서 선택된다.
구조물의 생체 적합성 중합체(들)는 완전히 또는 부분적으로 합성 유래일 수 있다. 이들은 공지된 방식으로 기능화될 수 있고, 특히 접착-지지 단백질 또는 펩티드와 결합될 수 있다.
중합체는 바람직하게는 콜라겐 또는 콜라겐 혼합물을 포함하거나, 바람직하게는 이로 구성된다. 바람직한 콜라겐은 I형 및/또는 II형 콜라겐이다. VIII형 및/또는 IV형 콜라겐이 특히 바람직하다. 대안적으로, 이들의 혼합물이 바람직하다. 바람직하게는 라미닌이 추가로 함유된다. 바람직하게는 피브로넥틴이 추가로 포함된다. 생화학적으로, 고유 데스메막은 주로 IV형 및 VIII형 콜라겐, 피브로넥틴 및 라미닌으로 구성된다. 이들 세포 외 기질 성분은 바람직하게는 표준화 방법에 따라, 바람직하게는 재조합적으로 생성되는 것이 바람직하다. 성분들의 혼합비는 인공 구조물의 기공 크기, 및 따라서 고유 데스메막의 확산 가능성이 달성되도록 조정된다. 천연 나노구조를 가지는 콜라겐 또는 콜라겐 혼합물이 바람직하게 사용된다. 이것은 본 발명에 따른 데스메 구조물의 미세 구조화의 기계적 신호전달 효과를 높이고, 단리된 세포의 내피 조직으로의 분화를 가속화하고 안정화시킨다.
부가적으로 또는 대안적으로, 생체 재료는 어린 또는 성체의 동물 또는 인체 고유 데스메막으로부터 공지된 재조합적으로 생산된 단백질을 함유하거나 그로 구성된다. 단백질은 이종계 또는 동종이계일 수 있다. 재조합적으로 생산된 인간 콜라겐 또는 콜라겐 혼합물이 바람직하다. 대안적으로 또는 부가적으로, 데스메 구조물은 실크 단백질을 함유하거나 이로 구성된다. 일 변형예에서, 구조물은 비-생물학적 기원의 생체 적합성 중합체를 함유하거나 이들로만 구성된다.
다른 변형예에서, 데스메 구조물의 재료는 합성 중합체 및 엘라스토머, 예컨대 실리콘 엘라스토머 또는 PMMA, 폴리에틸렌, 폴리아미드, PVA 뿐만 아니라 관능화 중합체, 공중합체 및 공중합체들이다. 감열성 또는 열 반응성 중합체, 특히 N-이소프로필아크릴아미드, 또한 그의 변형체 또는 유도체뿐만 아니라 N,N-디에틸아크릴아미드 (PDEAAm), N-비닐카프로락탐 (PVCL) 등이 특히 바람직하다.
바람직하게는, 적어도 상기 합성 중합체의 표면은, 예를 들어 그 자체로 공지된 방식으로 배양된 생물학적 세포와의 상용성을 이루기기 위해 중합체의 코팅 또는 화학적 또는 물리적 처리에 의해 관능화된다. 중합체는 라미닌 및/또는 피브로넥틴과의 플라즈마 멸균 공정에 의해, 또는 수소 결합을 통해 세포-접착 단백질에 의해 연결될 수 있다. 중합체는 화학적 커플링 (예: EDC/NHS 반응)에 의해 제조될 수 있고, 접착 촉진 단백질 (상기 참조)에 공유 결합될 수 있다.
본 발명에 따라, 데스메 구조물은 미세 구조화에 의해 제조된다. 이들은 바람직하게는 포토리소그래피 구조화 방법, 광분해 절삭, 마이크로기계식 절삭, 몰딩 및 성형으로부터 선택된다.
미세 구조화는 바람직하게는 재료 제거에 의해 원하는 벌집 구조를 조각 내기 위해 소위 절삭 공정에 의해 수행된다. 레이저 기반 방법 (광분해 절삭)이 바람직하다. 레이저에 의한 직접 구조화의 경우, 집속 레이저 빔이 구성 요소 표면으로 향하고, 그에 의해 입사된 레이저 광선의 에너지가 에지 근처의 흡수에 의해 열에너지로 변환된다. 여기에서의 변환 효율은 레이저 파장, 표면 조도, 입사각 및 온도의 함수로서 재료의 흡수 정도에 의해 결정된다. 반대로, 광선 에너지는 화학 결합을 직접 파괴할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 재료의 제거는 고체에서 액체로 그리고 최종적으로 기체 상태로의 재료 내에서의 상전이를 포함한다. 모든 경우에, 집속 레이저 빔 영역에서, 재료는 입자 및/또는 재료 용융물의 형태로 제거된다. 펄스 레이저의 경우, 이것은 특히 주로 회전 포물면 ("우물")의 형태로, 레이저 펄스 당 단일 기하를 생성한다.
인접 구조의 생성은 작업편 표면 위 레이저 빔의 적절한 이동에 의해 이루어진다. 이것은 바람직하게는 고속 모터를 통해 작동되는 하나 이상의 이동 가능한 미러를 포함하는 소위 레이저 스캐너의 도움으로 구현된다. 달성 가능한 구조 크기, 구조 정확성 및 정확도 면에서 제거의 질은 레이저원의 적절한 선정으로 선택될 수 있다. 레이저 광 파장, 출력 (펄스 레이저의 경우 단일 펄스 에너지) 및 광원의 빔 품질이 결정적이다.
바람직한 대안적인 미세 구조화 방법은 기계적 칩-제거 공정, 특히 미정질 라인 도구를 이용한 다이아몬드 미세-래싱 (diamond micro-lathing)이다. 서브 마이크로미터 범위의 구조 치수는 특수 기계 기술과 매우 예리한 공구의 조합으로 생성될 수 있다. 이 범위의 구조 치수는 소위 초정밀 기술을 기반으로 한다. 이 목적을 위해, 단결정 다이아몬드 공구가 바람직하며, 경도 및 선명도에 의해, 그리고 정확한 절단에 의해 원하는 구조가 생성될 수 있게 한다. 이러한 래싱 공정에서 초정밀 부품의 생산은 바람직하게는 회전 대칭 표면의 생산으로 제한된다. 소위 비-원형 가공으로 확장하여 회전축에 대해 대칭이 아닌 표면 및 구조를 교대로 생성할 수도 있다.
대안적으로, 데스메 구조물을 미세 구조화하기 위한 바람직한 접근법은 본 발명에 따른 벌집 구조체가 재료를 도포한 후에 기본체 상에 국부적인 재료 축적 또는 재료 경화에 의해 형성되는 소위 생성 방법이다. 바람직한 방법은 2-광자 리소그래피, 간섭 리소그래피 및 그레이스케일 리소그래피이다.
2-광자 리소그래피 (two-photon lithography, 2PL)는 2-광자 흡수 (2PA)의 물리적 효과를 기반으로 하며 3차원 구조가 150 nm의 횡 분해능과 400 nm의 축 분해능으로 제조될 수 있도록 한다. 파장이 780 nm인 펨토초 파이버 레이저의 광대 빔이 도립 현미경 렌즈에서 결합되어 액체 감광성 중합체에 초점을 맞춘다. 레이저가 집중되고 펄스화되기 때문에 초점 내에서 2-광자 흡수가 가능할 정도로 충분히 초점 강도가 높다. 해당 영역에서 적외선 대신에 파장 390 nm의 자외선이 방출된다. 구조물의 기본체의 구성 성분으로서의 액상 감광제는 에너지 자외선에 의한 노광 동안에만 가교 결합을 하여, 2-광자 흡수가 일어나는 영역에서 기본체 상에 경화되고 벌집 구조가 형성될 수 있다.
간섭 리소그래피의 경우, 2-빔 또는 멀티-빔 간섭이 감광 표면에 대응 간섭 패턴을 이미지화하고 저장하기 위해 사용된다. 이 목적을 위해, 레이저 빔 (아르곤 이온 레이저)이 확대되고 (예를 들어, 빔 스플리터 큐브에 의해) 2 개의 부분 빔들로 분할된다. 이들은 특정 각도에서 거울 (평면 또는 오목 거울)과 중첩되어 특정 격자 상수를 갖는 스트라이프 패턴이 사용되는 파장뿐만 아니라 이 각도의 함수로 발생하게 된다. 벌집 구조는 반복적 적용에 의해, 특히 기본체의 회전 후에 형성될 수 있다.
그레이스케일 리소그래피는 감광성 중합체에서 노광에 의해 패턴이 저장되는 마스크의 노광에 기초한다. 마스크 상에 다른 회색 음영에 의해 상이한 구조 깊이가 실현된다. 마스크 뒤에는, 마스크 상의 회색 톤 분배에 해당하는 강도 분포가 형성된다. 포지티브 레지스트를 사용하면 가장 깊은 구조가 되며, 여기서 강도가 가장 높다. 네거티브 레지스트의 경우 이 관계는 반대가 된다.
생물학적 또는 생체 적합성 및 이식 가능한 데스메 구조물의 제조에 특히 바람직한 것은 엠보싱 또는 주조 공정 및 이들의 조합으로서, 여기서는 원하는 데스메 구조물의 네거티브 형태 (주형)가 먼저 바람직하게는 중합체 물질에서 상기 언급한 바와 같은 절삭 또는 생성 방법에 의해 제조되고, 이후에 데스메 구조물 자체가 사전 제조된 다이 상의 포지티브 몰드로서 주조 및/또는 엠보싱에 의해 생물학적 또는 생체 적합성 중합체로부터 제조된다. 이 바람직한 2 단계 공정을 통해 미세 구조화가 물리적 미세 구조화 공정에 직접 적용할 수 없는 생물학적 또는 생체 적합성 중합체에서도 발생할 수 있다. 몰딩은 특히 경화 또는 중합 공정에 적용되는 모든 생체 재료를 위한 것이며, 즉 겔형 또는 고체 상태가 액체의 쏟을 수 있는 응집 상태로부터 경화에 의해 얻어진다. 몰딩 공정에서는, 네거티브 몰드에서 경화되거나 (주조), 네거티브 몰드가 재료로 눌러진다 (엠보싱). 생물학적 기원의 순수한 생체 재료 이외에, 본원에 기술된 합성 중합체가 또한 성형을 위해 제공된다.
본 발명은 또한 적어도 다음 단계를 포함하는, 인공 데스메 구조물의 제조 방법을 제공한다: (1.) 중합체 기본체를 제공하고, (2.) 미세 구조화 방법의 수단에 의해 기본체의 표면에 3차원 벌집 구조를 형성하는 단계. 상기 방법은 바람직하게는 포토리소그래피 구조화, 광분해 절삭, 마이크로 기계 절삭, 몰딩 및 성형으로부터 선택된다.
바람직하게는, 공간적 벌집 구조를 형성하는 단계는 다음을 포함한다: (2.1) 미세 구조화 공정에 의해 벌집 구조의 네거티브 형태 (다이)를 생성한 다음, (2.2) 생성된 네거티브 형태로 주조 또는 엠보싱함으로써 생체 적합성 또는 생물학적 중합체에서 최종 벌집 구조를 형성하는 단계.
본 발명에 따라, 본원에서 설명된 인공 데스메 구조물은 개별 세포로부터 내피 조직을 재생하기 위해 인체 또는 동물체 외부에서 "조직 공학" 접근법에 사용된다. 따라서, 본 발명은 또한 시험관 내에서 특히 간엽, 전구체 또는 줄기세포를 각막 내피 조직으로 기계적 신호전달에 의해 분화시키기 위한 인공 데스메 구조물의 용도에 관한 것이다.
각막 내피 조직이 데스메 구조물 상에 본 발명에 따라 드노보로 형성되는 세포는 바람직하게는 진핵 세포 전구체 세포, 특히 성체 줄기세포, 배아 줄기세포 및 유도된 다능성 줄기세포이다. 중간엽 세포, 특히 바람직하게는 중간엽 줄기세포가 바람직하다. 이들은 바람직하게는 수령자의 조직으로부터 분리된다. 이 목적을 위해, 성체 줄기세포는 바람직하게는 환자의 자가 지방 조직으로부터 최소 침윤적으로 제거된다.
시험관 내 분화를 위해, 세포를 본 발명에 따른 데스메 구조물의 구조화된 표면 상에 시딩하여 배양한다. 시딩된 세포 밀도는 바람직하게는 적어도 5×105/cm2이다. 시험관 내에서 세포의 분화를 지원하기 위해, 종국에 본 발명에 따른 미세 구조화된 데스메 구조물상에 세포의 기계적 신호전달을 지원하는 공지된 화학적 인자를 적용하는 것이 또한 가능하다. 그러나, 특히, 세포의 분화는 독점적으로 본 발명에 따른 인공 데스메 구조물의 미세 구조화에 대한 기계적 신호전달에 의해 일어나도록 제공된다. 따라서 얻은 드노보 각막 내피 조직은 화학적 또는 다른 물리적인 분화 인자에 의해 실질적으로 영향을 받지 않으며, 한편으로는 분화를 안정화시키고, 다른 한편으로는 이들 세포의 사망률 또는 수술 후 임의의 탈분화를 감소시킨다.
따라서, 본 발명은 또한 단리된 생물학적 세포로부터 드노보 각막 내피 이식물을 제조하는 방법에 관한 것으로서, (1) 단리된 생물학적 세포를 인공 데스메 구조물과 접촉시키는 단계, (2) 데스메 구조물 상에서 상기 세포를 배양하는 단계로서, 이에 의해 각막 내피 세포의 내피 세포로 세포 분화가 일어나는 단계, 및 (3) 시험관 내 각막 내피 이식물로서의 인공 데스메막으로서 본 발명에 따른 데스메 구조물을 사용하여 드노보 각막 내피로 분화된 조직을 수득하는 단계를 포함한다.
따라서, 이 변형예에서, 인공 데스메 구조물은 내피로 분화된 세포와 함께 환자에서 각막의 내피 결함을 치료하기 위한 이식물로 사용된다. 이 변형예에서, 전술한 생체 재료가 데스메이어 구조물에 대한 재료로서 바람직하다.
본 발명의 또 다른 구체예는 시험관 내 조직 이식물로서 그 위에 형성된 각막 내피 조직과 함께 인공 데스메 구조물을 제공하는 것이다. 후자는 손상된 각막 내피 조직의 기능을 대체하기 위해 수령인의 눈인, 척추 동물의 눈, 특히 포유동물의 눈, 특히 인간의 눈에 이식할 수 있다. 따라서 본 발명은 또한 인공 데스메 구조물 및 단리된 세포로 구성된 각막 내피 조직을 함유하는 시험관 내 이식물을 제공한다. 본 발명에 따른 데스메 구조물에 부착된 분화된 드노보 각막 내피 조직은 조립형 시험관 내 이식물로서 사용될 수 있고, 공지된 수술 기술, 특히 DMEK (데스메막 내피 각막 이식) 또는 DMAEK (데스메막 자동화 내피 각막 이식)에 의해 수령자의 눈에 편입될 수 있다.
또한, 본 발명은 단리된 생물학적 세포로부터 드노보 각막 내피 이식물을 제조하는 방법을 제공하며, 이 방법은 (1) 단리된 생물학적 세포를 인공 데스메 구조물과 접촉시키는 단계, (2) 데스메 구조물 상에서 상기 세포를 배양하는 단계로서, 이에 의해 각막 내피 세포의 내피 세포로 세포 분화가 일어나는 단계, (3) 본 발명에 따른 데스메 구조물상에 드노보 각막 내피로 분화된 조직을 수득하는 단계, 및 (4) 데스메 구조물로부터 각막 내피 조직을 분리하고, 시험관 내 각막 내피 이식물로서 단리된 각막 내피 조직을 수득하는 단계를 포함한다.
따라서, 이의 대안적인 변형예에서, 시딩된 세포의 내피 조직으로의 분화 후에, 그로부터 다시 분리할 수 있고, 분리된 내피 조직을 환자 각막의 내피 결함을 수리하기 위한 이식물로서 활용할 수 있다.
인공 데스메 구조물로부터 내피 조직의 분리는 시험관 내 조직 배양으로부터 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다. 여기에는 용매 효소, 세제 등의 적용이 포함된다. 아큐타제 (Accutase)와 같은 온화한 효소로 세포를 처리하는 것이 제공된다. 기질에 대한 내피 세포의 접착을 중재하는 접착 단백질의 파괴 외에도, 조직의 기능적 완전성을 손상시키는 내피 세포 간의 "밀착 접합 (tight junctions)" 파괴를 방지하는 것이 필요하다.
대안적으로 또는 부가적으로, 데스메 구조물의 표면이 적어도 내피 세포와의 접촉 면상에 특정적으로 코팅 또는 기능화되어 접착 인자의 형성을 감소시키고 분리를 용이하게 하는 것이 바람직하다.
특히 바람직한 변형예에서, 데스메틱 구조물의 합성 중합체는, 대안적으로 또는 부가적으로, 본원에 기재된 감열성 또는 열 반응성 중합체, 바람직하게는 N-이소프로필아크릴아미드이다. 이러한 물질에서, 기질, 즉 데스메 구조물로부터의 내피 세포의 부착 또는 분리는 온도를 통해 제어될 수 있다. 내피 세포의 분리를 위해, 배양/분화 단계의 완료 후 내피 세포를 갖는 데스메 구조물은 바람직하게는 약 20 ℃ 이하의 저온으로 된다. 그 결과, 감열성 기질은 상태 변화를 겪고, 이는 전체적으로 내피 조직의 분리를 초래하거나, 또는 이를 상당히 지원한다.
따라서, 본 발명은 시험관 내 조직 이식물로서 시험관 내에서 형성된 각막 내피 조직을 추가로 제공한다. 이것은 손상된 각막 내피 조직의 기능을 대체하기 위해 수령인의 눈인, 척추 동물의 눈, 특히 포유동물의 눈, 특히 인간의 눈에 이식할 수 있다. 따라서 본 발명은 또한 단리된 드노보 세포로 구성된 각막 내피 조직으로 이루어진 시험관 내 이식물을 제공한다. 단리된 드노보 각막 내피 조직은 공지된 수술 기술, 특히 DMEK (데스메막 내피 각막 이식) 또는 DMAEK (데스메막 자동화 내피 각막 이식)에 의해 수령자의 눈에 편입될 수 있다.
본 발명이 다음의 도면 및 특정 구체예에 대한 실시예를 참조하여 보다 상세하게 설명된다.
도면은 데스메 구조물의 구조를 예시적으로 개략적으로 도시한다. 도 1 및 도 2에서, 변수들은 정밀하게 나타내지 않았다. 반대로, 벌집 모양의 구조물은 구조물의 전체 크기와 관련하여 수 배 확대되어 도시되었다. 도 1은 본 발명에 따른 돔형 데스메 구조물의 오목면 (12)의 평면도를 도시한다. 도 2는 도 1에 따른 데스메 구조물의 단면도를 도시한다. 구조의 공간성을 설명하기 위해, 도 1의 벌집 구조는 원근법에 따라서 가장자리쪽으로 기울어져 있다. 데스메 구조물은 돔 또는 반각 형태의 기본체 (10)를 가지며, 돔의 대응하는 볼 반경은 수령자 눈의 각막 반경에 맞게 조정된다. 마이크로 구조의 벌집 구조는 허상 반복 기본 요소들 (20)로 구성되며, 이들은 각각 중앙 함몰부 (22) 및 포지티브 웹 (24)으로 형성된 측면 경계를 갖는다. 데스메 구조물의 도시된 구체예에서, 돔형 구조체 (10)의 오목면 (12)의 표면에는 각각 함몰부 (22) 및 측면 웹 (24)을 갖는 반복적인 기본 요소들 (20)로 이루어진 벌집 구조가 제공된다. 도시된 구체예에서, 원주형의 실질적으로 매끄러운 에지 (14)가 돔형 기본체 (10)의 상부 에지 상에 형성된다.
실시예 1 : 인공 데스메 구조물의 제조
1. 매트릭스의 리소그래피 생성
1.1 2-광자 리소그래피
2-광자 리소그래피 (2PL)는 2-광자 흡수 (2PA)의 물리적 효과를 기반으로 하며 3차원 구조가 150 nm의 횡 분해능과 400 nm의 축 분해능으로 제조될 수 있도록 한다. 파장이 780 nm인 펨토초 파이버 레이저의 광대 빔이 도립 현미경 렌즈에서 결합되고 그에 의해 액체 및 감광성 중합체에 초점을 맞춘다. 레이저가 집중되고 펄스화되기 때문에 초점 내에서 2-광자 흡수가 가능할 정도로 충분히 초점 강도가 높다. 해당 영역에서 적외선 대신에 파장 390 nm의 자외선이 방출된다. 액체 광중합체는 에너지성 UV 선에 의한 노광 동안에만 가교 결합을 하여, 2-광자 흡수가 일어나는 영역에서 액체 중합체가 경화된다.
초점에 대한 감광성 중합체의 이동으로 IP-Dip, IP-L, IP-G, OrmoComp, AR-P3120, SU8과 같은 임의의 중합체 구조가 생성될 수 있다. 최종 현상 단계에서 노광으로부터 노광되지 않은 재료를 용매에 용해시켜 구조물을 얻는다.
2-광자 리소그래피의 4 가지 변형이 있으며, 각각은 관련 구조를 생성하는 데 사용될 수 있다.
a) 종래의 방법에서, 레이저 빔은 유리판을 통해 감광성 중합체 내로 집속된다. 또한 현미경 렌즈와 유리판을 사용하여 중합체에 레이저 광량을 주입하여 해상도를 극대화한다. 대물 렌즈의 작동 거리는 이 방법의 변형예에서 최대 구조 높이를 제한하다. 구조는 기판의 상부로부터 구성된다.
b) 딥-인 레이저 리소그래피 (DiLL)는 또한 금속 또는 실리콘과 같은 불투명한 기판의 사용을 허용한다. 여기서, 레이저 빔은 기판의 아래면에 집속되고, 감광성 중합체는 현미경 대물 렌즈와 기판 사이에 위치하며, 동시에 침지 매체 (immersion medium)로서 작용한다. 구조는 기판의 바닥으로부터 구성된다. 압전 제어로 인한 최대 구조물 높이는 300 μm이다. 현미경 렌즈의 z 드라이브를 사용하면 훨씬 더 높은 구조물을 실현할 수 있다.
c) 세 번째 변형은 공기 렌즈의 사용이다. 이 원리는 기존 공정의 원리와 동일하지만 침지 오일을 사용하지 않는다.
d) 갈보 스캐너를 기반으로 하는 추가 기능을 사용하면 여러 초점을 사용하는 동시 쓰기가 쓰기 속도를 최대 200배 향상시킬 수 있다.
2PL로 제작되는 구조물은 먼저 프로그래밍되어야 한다. 이를 위해 GWL 프로그래밍 언어를 사용하는 Describe® 소프트웨어 (다른 시스템의 경우 또한 Matlab®)를 사용할 수 있거나, 또는 해당 구조를 .stl-파일로 프로그래밍한 다음 Nanoslicer® 프로그램으로 전송할 수 있다. 감광성 중합체는 세포 분화를 위한 물질로 적합하지 않기 때문에, 데스메막의 역 구조가 준비되고 적절한 물질로 형성된다. 실리콘 고무 또는 인간 또는 동물 콜라겐이 사용된다. 이에 따라, 직경과 높이가 다른 육각형 너브가 생성되고 임의로 배열된다.
구조물을 생성하는 절차는 다음과 같다:
· 접착제 (Fixogum®)로 시험편 홀더에 기판을 고정한다.
· 각각의 광중합체를 기판의 상면 (종래 공정 및 공기 렌즈용) 또는 하면 (DiLL 공정용)에 각각 투하한다.
· 기존 방법의 경우에는, 추가적으로 기판의 하면에 침지 오일을 도포한다.
· 2PL 장치에서 샘플을 가지는 샘플 홀더를 고정시킨다.
· 구조의 프로그래밍에 따라 쓰기를 시작하면 샘플이 프로그래밍된 구조에 따라 레이저 초점에 대해 이동한다.
1.2 간섭 리소그래피
간섭 리소그래피의 경우, 2-빔 또는 멀티-빔 간섭이 감광 표면에 대응 간섭 패턴을 이미지화하고 저장하기 위해 사용된다. 이 목적을 위해, 레이저 빔 (아르곤 이온 레이저)이 확대되고 (예를 들어, 빔 스플리터 큐브에 의해) 2 개의 부분 빔들로 분할된다. 이들은 특정 각도에서 거울 (평면 또는 오목 거울)과 중첩되어 특정 격자 상수를 갖는 스트라이프 패턴이 사용되는 파장뿐만 아니라 이 각도의 함수로 발생하게 된다.
간섭 패턴에 위치하는 감광성 샘플은 기판 (금속, 실리콘, 유리)으로 구성되며, 그 위에 광 중합체의 매끄러운 층이 스핀 코팅 (층 두께, 스핀 사이클)에 의해 침착된다. 여기서, 포지티브 또는 네거티브 래커가 사용될 수 있는데, 네거티브 래커는 노광되는 부위를 가교 결합시킨다. 포지티브 래커의 경우, 중합체의 비노광 부분이 구조를 형성한다.
스트라이프 형태의 간섭 패턴을 중합체 층에 저장하기 위해, 샘플 (레지스트 층을 갖는 기판)을 간섭 패턴으로 노광한다. 후속 현상 단계 (포지티브 레지스트의 경우)는 그 층으로부터 노광된 중합체를 방출한다. 이 방법으로 육각 너브를 생성하려면 동일한 샘플을 간섭 패턴으로 세 번 노광해야 하며, 샘플은 각 노광 후에 60 ° 회전된다. 현상 단계 후, 플라스틱으로 구성된 육각 너브가 사용되며, 이는 다른 재료에서 데스메 구조의 인상을 위해 사용될 수 있다. 절차는 다음과 같다: 광중합체로 기판을 코팅하는 단계; 중합체에 따라 샘플을 "핫 플레이트"에서 베이킹하는 단계; 광학 장치에서 간섭 패턴의 위치에 샘플을 위치시키는 단계; 샘플을 간섭 패턴에 3회 노광시키는 단계; 각 노광 후에 샘플을 동일한 방향으로 60 °회전시키는 단계; 및 상응하는 현상조에서 샘플을 현상하는 단계.
1.3 그레이스케일 리소그래피
그레이스케일 리소그래피는 감광성 중합체에서 노광에 의해 패턴이 저장되는 마스크의 노광에 기초한다. 마스크 상에 다른 회색 음영에 의해 상이한 구조 깊이가 실현된다. 마스크 뒤에는, 마스크 상의 회색 톤 분배에 해당하는 강도 분포가 형성된다. 포지티브 레지스트를 사용하면 가장 깊은 구조가 되며, 여기서 강도가 가장 높다. 네거티브 레지스트의 경우 이 관계는 반대가 된다.
그레이스케일 리소그래피에 의해 역전된 데스메 구조를 생성하기 위해서는 구조를 그레이톤으로 맵핑한 마스크를 설계해야 한다. 포지티브 레지스트 재료를 사용하는 경우, 육각형의 윤곽은 밝고 중심 쪽으로 더 어둡다. 네거티브 레지스트 재료를 사용하면 마스크상의 육각형은 중간이 밝고 바깥쪽으로 점점 어두워진다. 마스크의 평면 조명을 보장하기 위해, 이것은 광대 집속 레이저 빔에서 광학 축에 수직으로 위치한다. 초점을 맞추면 마스크가 샘플에 대해 축소되어 구조의 크기가 원본과 동일하게 된다. 여기서, 절차는 다음과 같다: 광중합체로 기판을 코팅하는 단계; 중합체에 따라, 샘플을 "핫 플레이트"에서 베이킹하는 단계; 광학 장치에서 간섭 패턴의 위치에 샘플을 위치시키는 단계; 확장 직후 그레이톤 마스크를 초월하는 광대 집속 레이저 빔에 샘플을 노광시키는 단계; 및 샘플을 해당 현상제에서 현상하는 단계.
2. 최종 생물학적 데스메 구조물의 형성
재료의 특성은 세포 분화에 매우 중요하기 때문에, 리소그래피적으로 생성된 구조는 연질 물질로 형성되고 - 실리콘 고무 또는 동물 또는 인간 콜라겐이 사용된다 - 재생된 데스메 구조가 그 재료에서 형성된다. 생체 적합성 물질로부터 이식 가능한 데스메 구조물을 생성하기 위해, 주조 가능한 콜라겐 조성물이 사용되며, 패턴화된 중합체 몰드가 먼저 생성된다.
실시예 2: 시험관 내 각막 내피 조직의 제조
지방 조직으로부터 제거되어 단리된 중간엽 줄기세포를 실시예 1에 따라 제조된 인공 데스메 구조물 위에 적어도 5×105 세포/cm2의 세포 밀도로 시딩한다. 균일한 분포 및 부착을 위해 구조물을 궤도상으로 진탕하였다.
완전한 접착 후, 막을 생물 반응기 (37 ℃, 5% CO2, 100% 상대 습도)에 클램핑하고, 줄기세포가 완전히 분화되어 각막 내피 세포의 기능이 달성될 때까지 (내피 세포 특이적 마커 또는 기능 검사에 의해) 배양한다. 배양 기간은 특이적 줄기세포의 분화율에 좌우된다. 배양에는 10% 혈청 및 1% 항균제가 함유된 기초 배지를 사용한다.
배양이 완료되면 데스메 구조물에서 완전히 분화된 드노보 각막 내피 조직을 얻는다. 이 조직은 데스메 구조물에 부착하고 데스메 구조물과 함께 수령자의 눈에서 각막 내피 결함을 복구하기 위한 시험관 내 이식물을 형성한다.

Claims (14)

  1. 오목면 (12)에 벌집 구조가 형성된 돔형 기본체 (10)로부터 형성되는, 생물학적 세포를 드노보 각막 내피 조직으로 기계적 신호전달에 의해 분화시키기 위한 인공 데스메 구조물.
  2. 제1항에 있어서, 벌집 구조가 중앙 함몰부 (22) 및 측면 웹 (24)를 갖는 반복적인 기본 요소들 (20)로부터 형성되고, 여기서 웹 높이는 0.3 내지 1 ㎛이고, 웹 폭은 1 내지 8 ㎛이며, 웹에 의해 둘러싸인 중심 함몰부의 폭은 각각 10 내지 20 ㎛인, 구조물.
  3. 제2항에 있어서, 벌집 구조가 실질적으로 동일한 크기의 반복적인 기본 요소들 (20)로부터 형성된, 구조물.
  4. 제2항에 있어서, 벌집 구조가 상이한 크기들의 반복적인 기본 요소들 (20)로부터 형성된, 구조물.
  5. 제2항에 있어서, 기본 요소들 (20)이 각각 육각형의 기본 형상을 갖는, 구조물.
  6. 제1항에 있어서, 생체 적합성 중합체로 구성된, 구조물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 데스메 구조물 및 단리된 세포로부터 형성된 각막 내피 조직을 포함하는 시험관 내 이식물.
  8. - 중합체 기본체를 제공하는 단계,
    - 포토리소그래피 구조화 방법, 광분해 절삭, 마이크로기계식 절삭, 몰딩 및 성형으로부터 선택되는 미세 구조화 방법에 의해 기본체의 표면에 공간적 벌집 구조를 형성하는 단계,
    를 포함하는, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 인공 데스메 구조물을 제조하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 공간적 벌집 구조의 형성이
    - 상기 미세 구조화 공정 중 하나에 의해 벌집 구조의 네거티브 형태를 생성하고,
    - 생성된 네거티브 형태로 주조 또는 엠보싱함으로써 생체 적합성 또는 생물학적 중합체에 벌집 구조를 형성하는 단계,
    를 포함하는 방법.
  10. 중간엽 줄기세포를 각막 내피 조직으로 기계적 신호전달에 의해 분화시키기 위해, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 인공 데스메 구조물을 사용하는 방법.
  11. - 단리된 생물학적 세포를 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 인공 데스메 구조물과 접촉시키는 단계,
    - 데스메 구조물에서 세포를 배양하여 세포를 각막 내피의 내피 세포로 분화시키는 단계,
    - 데스메 구조물에 의해 드노보 각막 내피로 분화된 조직을 시험관 내 각막 내피 이식물로서 수득하는 단계,
    를 포함하는, 단리된 드노보 생물학적 세포로부터 시험관 내 각막 내피 이식물의 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    - 데스메 구조물로부터 드노보 각막 내피로 분화된 조직을 분리하고, 시험관 내 각막 내피 이식물로서 단리된 각막 내피를 수득하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  13. 제11항에 있어서, 단리된 생물학적 세포가 중간엽 줄기세포인, 방법.
  14. 제11항에 따른 방법에 의해 제조된 시험관 내 각막 내피 이식물.
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