KR102518936B1 - 베타-아드레날린성 수용체에 특이적인 pet용 추적자 - Google Patents

베타-아드레날린성 수용체에 특이적인 pet용 추적자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 베타-아드레날린성 수용체에 특이적인 양전자 방출 단층촬영(PET)용 추적자(tracer) 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하며, 베타-아드레날린성 수용체, 특히 베타 1-아드레날린성 수용체(β1-adrenergic receptor)를 선택적으로 표적화하는 베타 1-아드레날린성 수용체 검출용 PET 추적자 및 이의 제조방법, 및 상기 베타 1-아드레날린성 수용체 검출용 PET 추적자를 포함하는 심장 질환의 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 18F 동위원소에 의해 방사성 표지된 화학식 1의 비소프롤롤 화합물을 생체세포 또는 조직의 β-아드레날린성 수용체, 특히 β1-아드레날린성 수용체(β1-AR) 검출용 PET 추적자로 이용하면, 심장 질환 환자의 심장 조직에서 β1-AR를 선택적으로 표적화할 수 있고, β1-AR를 매우 선택적이고 높은 민감도로 검출할 수 있으므로, 심장 질환의 조기 진단을 위해 유용하게 사용할 수 있다.

Description

베타-아드레날린성 수용체에 특이적인 PET용 추적자{Tracer for PET Specific to beta-adrenergic receptor}
본 발명은 베타-아드레날린성 수용체에 특이적인 양전자 방출 단층촬영(PET: Positron emission tomography)용 추적자(tracer) 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하며, 베타-아드레날린성 수용체, 특히 베타 1-아드레날린성 수용체(β1-adrenergic receptor)를 선택적으로 표적화하는 베타 1-아드레날린성 수용체 검출용 PET 추적자 및 이의 제조방법, 및 상기 베타 1-아드레날린성 수용체 검출용 PET 추적자를 포함하는 심장 질환의 진단용 조성물에 관한 것이다.
단백질 패밀리의 동형체(isoform)는 아미노산 서열 상동성과 구조적 상동성을 공유한다. 약물 발굴에 있어서, 표적 단백질의 상동성 동형체에 대한 선도 화합물의 뚜렷한 선택성은 독성이 적은 후보물질을 발굴할 수 있는 중요한 요소이다. 또한, 신약 발굴 중에 후보물질의 선택성을 향상시키는 것은 충분한 안전성을 제시하는 후보물질의 성공적인 임상 개발을 위한 필수 프로세스이다. β-아드레날린성 수용체(β-adrenoceptor; β-AR)를 포함한 여러 단백질은 조직에서 다른 동형체 집단을 보여, 동형체를 구별하는 선택적 약물을 조작할 수 있는 기회를 제공한다. 그러나, 여러 동형체 중 하나에 대한 약물 선택성 평가는 현재까지 시험관내(in vitro) 접근 방식으로 제한되었으며, 약물 후보물질의 동형체 선택성을 생체내(in vivo)에서 평가할 수 있는 기술적 방법이 필요하다. 양전자 방출 단층촬영(PET; Positron Emission Tomography)은 방사성 동위원소 표지 약물의 생체내 검출을 위한 비-침습적 기술이다. PET는 다양한 질병의 진단 이미징에 널리 사용되며, 표지된 약물의 생체내 분포에 대한 정보도 제공한다.
β-아드레날린성 수용체는 심장, 폐 및 뇌와 같은 기관에 뚜렷하게 존재하는 G-단백질 결합 수용체이다. β-AR의 두 가지 주요 하위 유형 중 β1-AR은 주로 심장, 신장 및 대뇌 피질에서 발견되는 반면, β2-AR은 주로 폐, 위장관, 간, 자궁, 혈관 평활근, 골격근, 및 소뇌 피질에서 발견된다(Mineman KP et.al., Mol Pharmacol., 16(1):21-33, 1979). β1-AR은 주로 고혈압, 심부전, 허혈, 비대성 심근병증, 및 확장성 심근병증과 같은 다양한 심장 질환의 병태 생리와 관련이 있다(Michel MC et.al., Hypertension, 16(2):107-120, 1990). 비-선택적 β-차단제, 예컨대 프로프라놀롤이 여전히 심혈관 질환 치료에 사용되고 있지만, 심장에서 β1-AR이 우세하기 때문에 선택적 β1-차단제, 예컨대 비소프롤롤이 주로 임상 환경에서 사용되고 있다. 특이적 β-AR 동형체에 대한 β-차단제의 선택성은 시험관내 조사를 통해 잘 확립되었다(Baker JG. et.al., Br J Pharmacol., 160(5):1048-1061, 2010). 그러나, 특이적 β-AR 동형체에 대한 β-차단제 선택성의 생체내 프로파일링 기술은 아직 포괄적으로 보고되지 않았다. PET는 심장과, 폐를 포함하는 다른 말초 평활근에 있는 β-AR 동형체의 상이한 집단으로 인해 β-AR 동형체와 그 차단제 사이의 상호작용을 생체내에서 평가하는 데 유용한 도구가 될 수 있다.
한편, 비소프롤롤은 합성 β1-AR 차단제로, 이의 선택성은 β2-AR보다 β1-AR에 대해 약 100배 더 높다(Hieble JP. et.al., J Med Chem., 38(18):3415-3444, 1995). 이상적인 약동학적 특성으로 인해, (±)-비소프롤롤은 높은 β1-AR 선택성을 보유하여, β1-AR 밀도 측정을 위한 PET 이미징제 개발을 위한 리간드로서의 잠재력을 나타낸다. 그러나, 심장 내부 β1-AR 밀도의 선택적 정량화를 위한 이미징 방사성 추적자(radiotracer) 개발에 대한 연구는 제한적이다. 현재까지, 비소프롤롤을 방사성 리간드로 사용하는 PET 이미징제의 개발에 대한 연구는 (S)-[11C]비소프롤롤 (11C, t1/2 = 20.4분) 단 하나만 보고되었으며, 이는 중추 β1-AR을 표적으로 한다(Soloviev DV. et.al., Neurochem Int., 38(2):169-180, 2001).
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 β-AR 동형체, 특히 β1-AR에 대한 β-차단제의 생체내 선택성 및 효능을 결정하기 위한 검증 도구로 새로운 PET 추적자를 개발하고자 하였다. 본 발명자들은 선택적 β1-AR 차단제로, 11C보다 우수한 붕괴 특성을 가진 18F 동위원소(t1/2 = 109.7분, 더 짧은 평균 양전자 범위)에 의해 방사성 표지된 비소프롤롤-기반 PET 추적자인 (±)-[18F]비소프롤롤 (화합물 1)을 개발하였다. (±)-[18F]비소프롤롤 추적자에 대한 생체외(ex vivo) 생체분포 및 흡수 연구를 Balb/c 정상 마우스에서 수행하여 심장 내부 β1-AR에 대한 β1-차단제의 선택성 및 효능을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
Mineman KP et.al., Mol Pharmacol., 16(1):21-33, 1979 Michel MC et.al., Hypertension, 16(2):107-120, 1990 Baker JG. et.al., Br J Pharmacol., 160(5):1048-1061, 2010 Hieble JP. et.al., J Med Chem., 38(18):3415-3444, 1995 Soloviev DV. et.al., Neurochem Int., 38(2):169-180, 2001
본 발명의 하나의 목적은 [18F]비소프롤롤 화합물을 포함하는 β-아드레날린성 수용체(β-adrenoceptor) 검출을 위한 PET용 추적자 및 이의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 PET용 추적자를 포함하는 심장 질환의 진단용 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 PET용 추적자를 이용한 심장 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 [18F]비소프롤롤 화합물을 포함하는 β-아드레날린성 수용체 검출을 위한 PET용 추적자 및 이의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 PET용 추적자를 포함하는 심장 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 PET용 추적자를 이용한 심장 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 18F 동위원소에 의해 방사성 표지된 화학식 1의 비소프롤롤 화합물을 생체세포 또는 조직의 β-아드레날린성 수용체, 특히 β1-아드레날린성 수용체(β1-AR) 검출용 PET 추적자로 이용하면, 심장 질환 환자의 심장 조직에서 β1-AR를 선택적으로 표적화할 수 있어, 보다 효과적으로 심장 질환의 진단에 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물을 포함하는 PET용 추적자는 β-아드레날린성 수용체, 특히 β1-AR를 매우 선택적이고 높은 민감도로 검출할 수 있어, 심장 질환의 조기 진단을 위해 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 (A) 비방사성 [F]비소프롤롤 및 (B) 방사성 표지된 [18F]비소프롤롤의 합성 과정을 개략적으로 나타낸 도이다. 여기에서, 반응 조건 및 시약은 다음과 같다: A. 비방사성 [F]비소프롤롤의 합성; (a) Dowex　 50WX8 수지, IPA, rt, 69%; (b) K2CO3, 에피클로히드린, CH3CN, 환류, 69%; (c) DL-알라니놀, CH3OH, 환류, 97%; (d) Boc2O, CH2Cl2, rt, 93%; (e) TBSCl, 이미다졸, CH2Cl2, rt, 77%; (f) NaH, 톨루엔, rt, 28%; (g) TBAF, THF, rt 89%; (h) TsCl, TEA, DMAP, CH2Cl2, rt, 92%; (i) 2.2.2-크립탄드, KF, CH3CN, 100℃, 61%; (j) LiAlH4, THF, rt, 73%; B. 방사성 표지된 [18F]비소프롤롤의 합성; (k) 2.2.2-크립탄드, 18F, CH3CN, 100℃, 61%; (l) LiAlH4, THF, rt, 73%.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 LiAlH4에 의한 탈보호 후 (±)-[18F]비소프롤롤의 정제 결과를 나타낸 도이다. 구체적으로, (A) (±)-[18F]비소프롤롤의 정제를 위한 방사성-HPLC(high pressure liquid chromatography) 크로마토그램 결과 및 (B) (±)-[18F]비소프롤롤의 정제를 위한 HPLC 크로마토그램 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 (±)-[18F]비소프롤롤 (화합물 1) 주사 후 5분, 30분, 90분 및 120분째에 Balb/c 마우스에서 (±)-[18F]비소프롤롤 (화합물 1)의 생체분포 결과를 나타낸 도이다. 구체적으로, (A) 다양한 기관에서 (±)-[18F]비소프롤롤의 생체외 분포 결과를 나타낸 막대 그래프 및 (B) 혈액, 심장, 폐 및 뇌에서 (±)-[18F]비소프롤롤 분포를 나타낸 꺾은선형 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 (±)-[18F]비소프롤롤 (화합물 1) 주사 후 30분째 및 120분째에 정상 Balb/c 마우스에서 (±)-[18F]비소프롤롤 (화합물 1)과 비표지된 (±)-비소프롤롤의 경쟁 분석 결과를 나타낸 도이다. 구체적으로, (A) (±)-비소프롤롤로 전처리된 Balb/c 마우스에서 다양한 기관에서 (±)-[18F]비소프롤롤의 생체외 분포 결과를 나타낸 막대 그래프, (B) (±)-비소프롤롤을 전처리하지 않은 Balb/c 마우스에서 (±)-[18F]비소프롤롤의 기관-대비-혈액(organ-to-blood) 비율을 나타낸 그래프, 및 (C) (±)-비소프롤롤을 전처리한 Balb/c 마우스에서 (±)-[18F]비소프롤롤의 기관-대비-혈액 비율을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하며, 베타-아드레날린성 수용체, 특히 베타 1-아드레날린성 수용체(β1-adrenergic receptor, β1-AR)를 선택적으로 표적화한 β1-AR 검출용 PET 추적자 및 이의 제조방법, 및 상기 β1-AR 검출용 PET 추적자를 포함하는 심장 질환의 진단용 조성물에 관한 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 [18F]비소프롤롤 화합물을 포함하는 β-아드레날린성 수용체(β-adrenoceptor) 검출을 위한 PET용 추적자를 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112021047970970-pat00001
본 명세서에서 사용된 용어, "β-아드레날린성 수용체(β-adrenoceptor, β-AR)"는 심장, 폐 및 뇌와 같은 기관에 뚜렷하게 존재하는 G-단백질 결합 수용체로, β-AR는 β1-AR 및 β2-AR 두 가지 주요 하위 유형이 있다. β1-AR은 주로 심장, 신장 및 대뇌 피질에서 발견되는 반면, β2-AR은 주로 폐, 위장관, 간, 자궁, 혈관 평활근, 골격근, 및 소뇌 피질에서 발견되는 것으로 알려져 있다. 또한, β1-AR은 주로 고혈압, 심부전, 허혈, 비대성 심근병증, 및 확장성 심근병증과 같은 다양한 심장 질환의 병태 생리와 관련이 있는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "비소프롤롤(bisoprolol)"은 교감신경의 베타-1 아드레날린성 수용체(β1-adrenoceptor; β1-AR)를 선택적으로 억제하여 심근 수축력과 심장 박동수를 감소시키는 약물로, 혈압을 낮추고 심장의 부담을 줄여주므로 고혈압, 협심증 치료에 사용되며, 만성 심부전의 치료에도 사용된다.
본 발명에 있어서, 상기 비소프롤롤은 18F 동위원소에 의해 방사성 표지된 하기 화학식 1의 화학 구조를 갖는 화합물로서, β-아드레날린성 수용체(β-adrenoceptor; β-AR), 특히 β1-아드레날린성 수용체(β1-AR)를 선택적으로 표적화하는 β1-AR 검출용 PET 추적자(tracer)로 이용 가능하다:
[화학식 1]
Figure 112021047970970-pat00002
본 명세서에서 사용된 용어, "양전자 방출 단층촬영(Positron Emission Tomography, PET)은 핵의학 검사 방법 중 하나로, 방사성 동위원소 표지 약물의 생체내 검출을 위한 비-침습적 기술이다. 구체적으로, PET는 양전자를 방출하는 방사성 동위원소를 결합한 의약품을 혈액 속에 주입하고 촬영하는 방법으로 체내에서의 동위원소의 분포를 알아보는 것이다. PET는 다양한 질병의 진단 이미징에 널리 사용되며, 표지된 약물의 생체내 분포에 대한 정보도 제공한다.
표적 단백질 패밀리의 다양한 동형체에 대한 약물의 선택성은 종종 독성 측면에서 중요하다. 통상적으로, 약물 또는 후보물질 선택성은 시험관내 분석에 의해 평가되지만, 생체내 조사는 현재 부족하다. 양전자 방출 단층촬영(PET)을 사용하면 방사성 표지된 약물의 생체내 분포를 비-침습적으로 결정할 수 있으며, 이는 약물 선택성에 관한 생체내 데이터를 제공할 수 있다. β1- 및 β2-아드레날린성 수용체(β-AR)를 모두 억제하는 비-선택적 β-차단제인 프로프라놀롤의 발견 이후, β2-AR 억제와 관련된 단점을 극복하기 위해 비소프롤롤을 포함한 다양한 선택적 β1- 차단제가 개발되었다. 개념 증명으로, 심장 및 말초 평활근이 β1-AR 및 β2-AR의 뚜렷한 집단을 보여주기 때문에, β1-AR에 대한 선택적 β-차단제로서 비소프롤롤의 선택성과 효능을 이해하기 위해 생체내 PET 연구를 수행하였다. 18F 표지된 비소프롤롤 (1, [18F]비소프롤롤)의 생체분포는 주사 후 늦은 시점에서 다른 β-AR이 풍부한 기관과 비교하여 심장에서 흡수가 유지되는 것을 보여주었다. 비표지된 비소프롤롤을 사용한 경쟁적 차단 분석은 어떤 기관에서도 [18F]비소프롤롤 흡수를 억제하지는 않았지만, 심장 및 뇌와 같은 β1-AR이 풍부한 기관에서 두 가지 다른 시점 사이에 방사능의 현저하게 빠른 손실을 나타내었다. 더욱이, 기관-대비-혈액 비율은 배설이 느리고, 심장 내부에 [18F]비소프롤롤의 더 우수한 축적을 나타내었다. 종합적으로, 생체외 생체분포 및 차단 연구는 심장에서 β1-AR을 표적으로 하는 선택적 억제제로서 비소프롤롤의 생체내 분포 패턴을 더 잘 이해할 수 있는 통찰력 있는 증거를 제시하고, 약물 선택성을 평가하기 위한 생체내 기술로서 PET의 가능성을 제공하였다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, β-아드레날린성 수용체 검출을 위한 PET용 추적자인 화학식 1로 표시되는 [18F]비소프롤롤 화합물의 생체분포는 주사 후 늦은 시점에서 다른 β-AR이 풍부한 기관과 비교하여 심장에서 흡수가 유지됨을 확인하였다. 또한, 심장 내부에 [18F]비소프롤롤의 더 우수한 축적을 나타냄을 확인하였다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 a) 18F-불소와 아세토니트릴 중의 [2.2.2]-크립탄드를 혼합한 혼합물을 85℃ 내지 95℃ 온도에서 질소 가스로 건조하는 단계; b) 상기 a) 단계의 혼합물에 아세토니트릴 중의 화학식 9
Figure 112021047970970-pat00003
의 화합물 용액을 첨가한 반응 혼합물을 90℃ 내지 110℃에서 10분 내지 30분 동안 가열한 다음 실온으로 냉각시는 단계; 및 c) 상기 b) 단계의 반응 혼합물을 질소 가스로 건조하여 용매를 제거한 후, 테트라히드로푸란(THF)에 용해된 리튬 알루미늄 하이드라이드(LiAlH4)를 첨가하여 실온에서 10분 내지 20분 동안 반응시키는 단계;를 포함하는, 하기 화학식 1로 표시되는 β-아드레날린성 수용체 검출을 위한 PET용 추적자의 제조방법을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112021047970970-pat00004
본 발명에 있어서, 상기 PET용 추적자는 β1-아드레날린성 수용체(β1-AR)를 표적으로 하는 화학식 1로 표시되는 [18F]비소프롤롤 기반 화합물로, (±)-비소프롤롤의 18F-표지를 위한 전구체 (화학식 9)를 사용하여 18F 음이온과의 친핵성 치환 반응을 통해 방사성 표지된 (±)-[18F]비소프롤롤 (화합물 1)을 합성할 수 있다. 18F 음이온에 의한 친핵성 치환 및 LiAlH4를 사용한 개환에 의한 후속 탈보호는 최종 [18F]-PET 추적자 (화합물 1)를 최종 생성할 수 있다.
상기 최종 생성물인 [18F]비소프롤롤 (화합물 1)을 역상 반-분취(semi-preparative) HPLC로 정제한 결과, 15%의 방사성 화학적 수율, > 98%의 방사성 화학적 순도 및 > 3.4 GBq/μmol의 특이적 활성을 나타내었다 (표 1 참조).
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 PET용 추적자를 포함하는 심장 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
전술한 바와 같이, PET용 추적자는 β1-아드레날린성 수용체(β1-AR)를 표적으로 하는 화학식 1로 표시되는 [18F]비소프롤롤 기반 화합물로, 생체분포는 주사 후 늦은 시점에서 다른 β-AR이 풍부한 기관과 비교하여 심장에서 흡수가 유지되고, 심장 내부에 [18F]비소프롤롤의 더 우수한 축적을 나타냄을 확인한 바, 심장 질환에 유용하게 활용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 심장 질환은 이에 제한되지는 않으나, 고혈압, 심부전, 허혈, 비대성 심근병증, 및 확장성 심근병증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 PET용 추적자를 이용한 심장 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
전술한 바와 같이, 상기 PET용 추적자는 심장의 β1-아드레날린성 수용체(β1-AR)를 표적으로 하는 화학식 1로 표시되는 [18F]비소프롤롤 기반 화합물로, 이에 제한되지는 않으나, 심장 내부의 β1-AR 양을 측정함으로써 수행될 수 있다.
이상의 본 발명의 목적들, 다른 목적들, 특징들 및 이점들은 첨부된 도면과 관련된 이하의 바람직한 실시예들을 통해서 쉽게 이해될 것이다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 통상의 기술자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다.
참조예 1. 시약 및 실험기구
합성 과정에서 사용된 모든 시약은 Sigma-Aldrich, Combi-Block, Acros, TCI, Alfa Aesar 및 대정으로부터 구입하였으며, 추가 정제없이 사용하였다. 반응에 사용된 무수 용매는 Inert technology (Amesbury, MA, USA)의 PureSolv Micro Multi Unit 용매 정제 시스템을 사용하여 정제하고, 모든 반응은 질소 분위기하에서 수행하였다. 반응 완료는 실리카겔 플레이트 (Kiesegel 60 F254, Merck)를 사용한 박층 크로마토그래피로 확인하였다. 합성된 모든 화합물은 실리카겔 (ZEOprep 60 40~63 ㎛)이 충진된 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 1H NMR 및 13C 스펙트럼은 JEOL JNM-ECZ400s/L1 (400 MHz) 분광기로 측정하였으며, NMR 용매로는 CDCl3 또는 DMSO-d 6를 사용하였다. 화학적 이동(chemical shift)은 ppm(parts per million)으로 표시하였으며, 결합 상수(coupling constant)는 Hz 단위로 표시하였다. 화학적 이동은 CDCl3 중 테트라메틸실란(δ= 0 ppm)을 내부 표준으로서 참조하였다. 13C NMR 스펙트럼은 동일한 NMR 분광기를 사용하여 얻었으며, 화학적 이동은 CDCl3 중 77.0 ppm 또는 DMSO-d 6 중 39.5 ppm에서의 삼중선(triplet)에 대한 중심선을 기준으로 ppm 단위로 나타내었다.
실시예 1. (±)-[F]비소프롤롤의 합성
(±)-비소프롤롤의 18F-표지를 위한 전구체 (9)는 하기 [반응식 1]에 나타낸 바와 같이 합성하였다. 상업적으로 입수가능한 4-(히드록시메틸)페놀과 2-이소프로폭시에탄올로부터의 벤질 알코올 및 페놀 알코올의 결과로 일어나는 알킬화에 뒤이어, 에피클로로히드린을 첨가하여, 중간체 4를 얻었다. 에폭사이드 4의 개환 반응은 DL-알라니놀을 첨가하여 아미노 알코올 중간체 5를 생성하도록 수행되었으며, 이후 유리-NH의 Boc-보호에 이어 tert-부틸디메틸실릴 클로라이드 (TBSCl)를 사용한 1차 알코올의 선택적 보호로 2차 알코올 6을 생성하였다. 18F-표지 후 2차 아민 및 알코올의 원-팟(one-pot) 탈보호를 위해, 2차 알코올은 수소화 나트륨을 사용하여 옥사졸리디논 7을 형성하도록 환화되었다. 18F-표지를 위한 전구체 9는 테트라-n-부틸암모늄 플루오라이드 (TBAF)를 사용하여 TBS기를 탈보호한 다음, 토실 클로라이드를 사용하여 유리 하이드록실기의 토실화(tosylation)에 의해 생성되었다. 18F-표지, 옥사졸리디논기의 탈보호 및 HPLC 정제는 비방사성 화합물을 사용하여 확립되었다. 이후, 전구체 9는 18F 음이온과의 친핵성 치환 반응을 통해 방사성 표지된 (±)-[18F]비소프롤롤 (화합물 1)을 합성하는 데 사용되었다. 18F 음이온에 의한 친핵성 치환 및 LiAlH4를 사용한 개환에 의한 후속 탈보호는 최종 [18F]-PET 추적자 (화합물 1)를 제공하였다(하기 [반응식 2] 참조). 최종 생성물인 [18F]비소프롤롤 (화합물 1)을 역상 반-분취(semi-preparative) HPLC로 정제하였으며 (도 2), 15%의 방사성 화학적 수율, > 98%의 방사성 화학적 순도 및 > 3.4 GBq/μmol의 특이적 활성을 나타내었다 (표 1 참조).
[반응식 1] 비방사성 [F]비소프롤롤의 합성
Figure 112021047970970-pat00005
상기 [반응식 1]에 나타난 화합물들의 합성과정을 하기에서 보다 상세하게 설명하기로 한다.
실시예 1-1. 화합물 3의 합성
4-((2-이소프로폭시에톡시)메틸)페놀 (3)
Figure 112021047970970-pat00006
Dowex 50WX8 수지 (4.02 g, 20.14 mmol)를 28 mL의 이소프로폭시에탄올에 녹인 4-(히드록시메틸)페놀 (2.11 g, 16.11 mmol)의 혼합물에 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 여과하여 수지를 제거하고, 생성물은 CH2Cl2로 세척하여 분리하였다. 유기 여과액을 물 (5×45 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시켰다. 건조된 유기층을 회전 증발기로 농축시켰다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (EA:헥산 = 1:4)로 잔류물을 정제하여 화합물 3 (2.346 g, 69%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.37 (s, 1H), 7.10 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.71 (dd, J = 11.4, 2.7 Hz, 2H), 4.32 (s, 2H), 3.49-3.55 (m, 1H), 3.45 (s, 4H), 1.05 (d, J = 5.9 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6) δ 156.78, 129.36, 128.60, 114.91, 71.96, 70.83, 69.01, 66.76, 22.04. ESI-MS: m/z = 209.20 (M - H)-.
실시예 1-2. 화합물 4의 합성
2-((4-((2-이소프로폭시에톡시)메틸)페녹시)메틸)옥시란 (4)
Figure 112021047970970-pat00007
CH3CN (36 mL) 중 화합물 3 (2.5 g, 11.89 mmol) 및 K2CO3 (3.3 g, 23.78 mmol)의 용액에 에피클로로히드린 (2.2 g, 23.777 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 85℃에서 12시간 동안 환류시켰다. 반응 완료 후, 용매를 증발로 제거하였으며, 조 물질(crude)을 EtOAc (2×50 mL)에 넣고 물 (2×45 mL)로 세척하였다. 조합한 유기층을 Na2SO4 상에서 건조하고 농축시켰다. 실리카겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (CH2Cl2:MeOH = 50:1)를 이용하여 조 잔류물로부터 화합물 4 (2.17 g, 69%)를 분리하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.22-7.28 (m, 2H), 6.91-6.96 (m, 2H), 4.39 (s, 2H), 4.30 (dd, J = 11.9, 3.2 Hz, 1H), 3.77-3.84 (m, 1H), 3.52 (q, J = 6.1 Hz, 1H), 3.47 (s, 4H), 3.30 (q, J = 3.1 Hz, 1H), 2.83 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 2.69 (q, J = 2.6 Hz, 1H), 1.06 (d, J = 5.9 Hz, 7H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6) δ 157.42, 130.59, 129.15, 128.99, 114.70, 113.99, 71.43, 70.62, 68.94, 68.72, 66.54, 49.50, 43.54, 21.84. ESI-MS: m/z = 265.23 (M - H)-.
실시예 1-3. 화합물 5의 합성
2-((2-히드록시-3-(4-((2-이소프로폭시에톡시)메틸)페녹시) 프로필) 아미노)프로판-1-올 (5)
Figure 112021047970970-pat00008
MeOH (9 mL) 중 화합물 4 (1.5 g, 5.64 mmol)의 교반된 용액에 DL-알라니놀 (2.89 g, 37.76 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 72℃에서 2시간 30분 동안 환류시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하였다. 실리카겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (CH2Cl2:MeOH = 5:1)를 수행하여 화합물 5 (1.85 g, 97%)를 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.21 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.89 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 4.99 (s, 1H), 4.51 (s, J = 12.8 Hz, 1H), 4.38 (s, 2H), 3.89-3.94 (m, 1H), 3.82-3.87 (m, 2H), 3.50-3.56 (m, 1H), 3.48 (s, J = 5.9 Hz, 4H), 3.16-3.30 (m, 3H), 2.54-2.65 (m, 2H), 1.06 (d, J = 5.9 Hz, 6H), 0.89 (dd, J = 6.4, 4.6 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6) δ 157.46, 129.77, 129.29, 114.05, 71.65, 70.94, 68.95, 68.15, 66.71, 28.09, 22.35. ESI-MS: m/z = 364.20 (M + Na)+.
실시예 1-4. 화합물 6의 합성
Tert -부틸(1-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)프로판-2-일)(2-히드록시-3-(4-((2-이소프로폭시에톡시)메틸)페녹시)프로필)카르바메이트 (6)
Figure 112021047970970-pat00009
무수 CH2Cl2 (3 mL) 중 BOC2O (4.09 g, 18.74 mmol) 용액을 무수 CH2Cl2 (12 mL) 중 화합물 5 (1.6 g, 4.69 mmol) 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. TLC에서 반응 완료 후, 반응 혼합물을 CH2Cl2 (30 mL)로 희석하고, H2O (2×50 mL)로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 농축시켰다. 실리카겔 플래시 컬럼 크로마토그래피 (CH2Cl2:MeOH = 15:1)로 조 잔류물을 정제하여 tert-부틸(2-히드록시-3-(4-((2-이소프로폭시에톡시)메틸)페녹시)프로필)(1-히드록시프로판-2-일)카르바메이트(1.92 mg, 93%)를 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ δ 7.22 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.87 (dd, J = 8.7, 2.7 Hz, 2H), 5.33-5.14 (m, 1H), 4.77-4.84 (m, 1H), 4.38 (s, 2H), 3.65-4.04 (m, 4H), 3.44-3.58 (m, 6H), 3.33-3.42 (m, 2H), 2.99-3.17 (m, 1H), 1.37 (d, J = 2.7 Hz, 9H), 1.09 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 1.06 (d, J = 6.4 Hz, 6H), 0.96-1.02 (m, 2H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6) δ 157.46, 129.77, 129.29, 114.05, 71.65, 70.94, 68.95, 68.15, 66.71, 28.09, 22.35. ESI-MS: m/z = 440.05 (M - H)-.
CH2Cl2 (5 mL) 중 TBSCl (0.7 g, 4.49 mmol) 용액을 무수 CH2Cl2 (10 mL) 중 tert-부틸(2-히드록시-3-(4-((2-이소프로폭시에톡시)메틸)페녹시)프로필)(1-히드록시프로판-2-일)카르바메이트 (1.8 g, 4.08 mmol) 및 이미다졸 (0.84 g, 12.24 mmol)의 혼합물에 질소 환경 하에서 적가하였다. 반응 혼합물을 질소 분위기 하에서 12시간 동안 실온에서 교반한 다음, 반응을 H2O (20 mL)로 급랭(quench)시키고, 생성물은 CH2Cl2 (2×20 mL)로 추출하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시켰으며, 여과하고 감압 하에서 농축시켰다. 생성물 분리를 위해 실리카겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc:헥산 = 1:1)로 잔류물을 정제하여 화합물 6 (1.74 g, 77%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.22 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.85 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 2H), 5.02 (t, J = 4.6 Hz, 1H), 4.38 (s, 2H), 3.96 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 3.86-3.91 (m, 1H), 3.69-3.82 (m, 3H), 3.48-3.56 (m, 2H), 3.47 (s, 4H), 3.31 (s, 2H), 1.36 (s, 9H), 1.10 (q, J = 3.2 Hz, 3H), 1.06 (d, J = 5.9 Hz, 6H), 0.83 (s, 9H), -0.00 (d, J = 3.7 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6) δ 158.14, 130.16, 128.88, 113.99, 71.80, 70.78, 69.18, 68.13, 67.98, 66.71, 49.38, 28.07, 25.70, 21.99, 17.83, -5.40. ESI-MS: m/z = 556.11 (M + H)+.
실시예 1-5. 화합물 7의 합성
3-(1-(( Tert -부틸디메틸실릴)옥시)프로판-2-일)-5-((4-((2-이소프로폭시에톡시)메틸)페녹시)메틸)옥사졸리딘-2-온 (7)
Figure 112021047970970-pat00010
화합물 6 (1.5 g, 2.7 mmol)을 23 mL의 톨루엔에 용해시키고, NaH (0.23 g, 5.81 mmol)를 질소 환경 하에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하고 2시간 동안 110℃로 가열하였다. 조 물질을 EtOAc (2×30 mL)로 추출하고, 물 (1×30 mL)로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 여과하였으며, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc:헥산 = 1:2)로 생성물을 분리하여 화합물 7 (0.36 g, 28%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.24 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.89-6.93 (m, 2H), 4.79-4.86 (m, 1H), 4.39 (s, 2H), 4.02-4.18 (m, 2H), 3.80 (m, 1H), 3.56-3.69 (m, 3H), 3.52 (q, J = 6.1 Hz, 1H), 3.47 (s, 4H), 3.34-3.41 (m, 1H), 1.08 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.06 (d, J = 6.4 Hz, 6H), 0.83-0.86 (m, 9H), 0.02-0.04 (m, 6H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6) δ 157.54, 157.46, 156.61, 156.53, 131.05, 130.99, 129.19, 129.15, 114.20, 114.17, 71.58, 71.55, 71.07, 71.04, 70.82, 69.12, 68.62, 68.45, 66.72, 63.82, 49.98, 49.92, 42.19, 42.01, 40.12, 39.91, 39.70, 39.50, 39.29, 39.08, 38.87, 25.70, 22.03, 17.80, 17.76, 13.78, 13.66, -5.44, -5.51, -5.58. ESI-MS: m/z = 504.32 (M + Na)+.
실시예 1-6. 화합물 8의 합성
3-(1-히드록시프로판-2-일)-5-((4-((2-이소프로폭시에톡시)메틸)페녹시)메틸)옥사졸리딘-2-온 (8)
Figure 112021047970970-pat00011
무수 THF (2.5 mL) 중 화합물 7 (0.11 g, 0.23 mmol)의 용액에 TBAF (0.46 mL, THF 중 1.0 M, 0.46 mmol)를 0℃ 질소 하에서 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음 H2O로 급랭(quench)시켰다. 반응 용매를 진공 하에서 증발시켰으며, 잔류물을 EtOAc (2×5 mL)에 넣고, 물 (2×10 mL)로 세척하였으며 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 유기층을 여과하여 Na2SO4 상에서 제거하고 농축하였으며, 실리카겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc:헥산 = 2:1)로 조 물질을 정제하여 화합물 8 (75 mg, 89%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.24 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.90-6.94 (m, 2H), 4.78-4.86 (m, 2H), 4.41 (d, J = 15.1 Hz, 2H), 4.12-4.18 (m, 1H), 4.07 (q, J = 5.6 Hz, 1H), 3.70-3.80 (m, 1H), 3.65 (td, J = 8.9, 2.9 Hz, 1H), 3.54 (td, J = 12.2, 6.1 Hz, 1H), 3.48 (s, 4H), 3.33-3.42 (m, 2H), 3.31 (s, 2H), 1.05 (t, J = 5.7 Hz, 9H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6) δ 157.55, 156.70, 130.99, 129.17, 114.21, 71.58, 71.02, 70.80, 69.13, 68.73, 66.71, 62.30, 62.28, 50.39, 41.98, 41.56, 22.02, 13.97, 13.78. ESI-MS: m/z = 390.27 (M + Na)+.
실시예 1-7. 화합물 9의 합성
2-(5-((4-((2-이소프로폭시에톡시)메틸)페녹시)메틸)-2-옥소옥사졸리딘-3-일)프로필 4-메틸 벤젠설포네이트 (9)
Figure 112021047970970-pat00012
3 mL의 CH2Cl2에 녹인 화합물 8 (70 mg, 0.19 mmol)의 교반된 용액에 TEA (39 mg, 0.38 mmol), DMAP (2 mg) 및 TsCl (56 mg, 0.29 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반한 다음 H2O (10 mL)로 반응 중단시키고, CH2Cl2 (2×50 mL)로 추출하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시켰으며, 여과하고 농축하였다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc:헥산 = 2:1)로 조 생성물을 정제하여 화합물 9 (92 mg, 92%)를 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.79 (t, J = 8.5 Hz, 2H), 7.46 (dd, J = 23.1, 8.0 Hz, 2H), 7.24 (q, J = 4.6 Hz, 2H), 6.90 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 4.71-4.86 (m, 1H), 4.40 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 3.98-4.16 (m, 5H), 3.40-3.65 (m, 6H), 3.34-3.23 (m, 1H), 2.39 (d, J = 16.9 Hz, 3H), 1.05-1.10 (m, 9H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6) δ 157.46, 157.44, 156.32, 156.28, 145.11, 145.06, 132.11, 131.05, 131.03, 130.21, 130.18, 129.16, 129.14, 127.59, 127.56, 114.21, 71.57, 71.22, 71.14, 70.80, 70.18, 70.11, 69.13, 68.43, 68.33, 66.71, 47.52, 47.43, 41.84, 41.61, 22.01, 21.08, 21.05, 13.43, 13.27. ESI-MS: m/z = 520.38 (M - H)-.
실시예 1-8. 화합물 2의 합성
1-((1-플루오로프로판-2-일)아미노)-3-(4-((2-이소프로폭시에톡시)메틸)페녹시)프로판-2-올 (2)
Figure 112021047970970-pat00013
화합물 9 (100 mg, 0.19 mmol)를 5 mL의 CH3CN에 용해시켰다. 이후, 상기 용액에 [2.2.2]-크립탄드 (81 mg, 0.21 mmol) 및 KF (56 mg, 0.96 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 100℃에서 20분 동안 교반하였다. 조 물질을 EtOAc (2×10 mL)로 추출하고, 물 (1×10 mL)로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시켰으며, 여과하고 농축하였다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc:헥산 = 1:4)로 생성물을 분리하여 중간체 (43 mg, 61%)를 얻었다. 중간체 (5 mg, 0.014 mmol)를 무수 THF (0.7 mL)에 용해시키고, 상기 용액에 LAH 분말 (5.4 mg, 0.14 mmol)을 질소 하에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. 반응 완료 후, LAH를 0℃에서 10분 동안 황산나트륨 데카하이드레이트 (25 mg)로 급랭(quench)시켰다. 황산나트륨 데카하이드레이트를 여과하여 제거하고 용매를 진공 하에서 증발시켰다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (CH2Cl2:MeOH = 20:1)로 잔류물을 정제하여 화합물 2 (3.3 mg, 73%)를 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.21 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.89 (dd, J = 8.9, 2.5 Hz, 2H), 4.38 (s, 2H), 4.31 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 4.19 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 3.83-3.94 (m, 2H), 3.50-3.56 (m, 1H), 3.47 (s, 4H), 2.81-2.90 (m, 1H), 2.61-2.70 (m, 2H), 1.06 (d, J = 5.9 Hz, 6H), 0.98 (dd, J = 6.4, 1.4 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6) δ 163.34, 158.35, 130.40, 129.19, 114.15, 71.89, 71.03, 70.83, 69.31, 68.54, 66.94, 52.64, 52.38, 49.95, 22.24. ESI-MS: m/z = 342.73 (M - H)-.
실시예 2. (±)-[ 18 F]비소프롤롤의 합성
[반응식 2] 방사성 불소화(radiofluorination): 방사성 표지된 [18F]비소프롤롤의 합성
Figure 112021047970970-pat00014
상기 [반응식 2]에 나타난 방사성 표지된 [18F]비소프롤롤의 합성과정을 하기에서 보다 상세하게 설명하기로 한다.
실시예 2-1. 화합물 9의 방사성 표지
단계 Ⅰ: 3-(1-플루오로프로판-2-일)-5-((4-((2-이소프로폭시에톡시)메틸)페녹시)메틸)옥사졸리딘-2-온 (중간체)의 합성
Figure 112021047970970-pat00015
[2.2.2]-크립탄드 (0.81 mg, 0.0021 mmol) 및 KF (0.6 mg, 0.0095 mmol)를 CH3CN (0.5 mL) 중 화합물 9 (1 mg, 0.0019 mmol) 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 스크류 캡으로 덮은 다음 100℃에서 20분 동안 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 조 물질을 주사기 필터를 통해 여과하고, MeOH로 세척하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, MeOH (5 mL)에 용해시켰다. 조 물질 정제를 위한 RP-HPLC 방법은 용출 이동상으로서 0.1% TFA v/v를 포함하는 CH3CN:H2O (20:80 v/v)를 사용하여 처음 시작 10분 동안 수행한 후, 0.1% TFA v/v를 포함하는 CH3CN:H2O (80:20 v/v)를 사용하여 10분 동안 더 수행하였다. 이때, RP-HPLC는 유속 1 mL/분, UV 파장 225 nm 조건으로 실시하였다.
단계 Ⅱ: 1-((2-플루오로에틸)아미노)-3-(4-((2-이소프로폭시에톡시)메틸)페녹시)프로판-2-올 ((±)-[F]비소프롤롤)의 합성
하기 최종 생성물인 [18F]비소프롤롤에 대한 탈보호 반응을 나타내었다.
Figure 112021047970970-pat00016
방사성 표지 반응의 중간체 (2 mg, 0.0054 mmol)를 무수 THF (0.5 mL)에 용해시키고, 질소 하에서 LAH 분말 (2.2 mg, 0.054 mmol)을 첨가하였다. 혼합물은 스크류 캡으로 덮고, 실온에서 5분 동안 교반하였다. 반응 완료 후, LAH를 0℃에서 10분 동안 황산나트륨 데카하이드레이트 (10 mg)로 제거하였다. 반응 혼합물을 여과하고 CH2Cl2로 세척하였으며, 용매를 회전 증발기에서 제거하였다. 혼합물을 주사기 필터를 통해 여과하고, MeOH로 세척하였다. 조 물질 정제를 위한 RP-HPLC 방법은 용출 이동상으로서 0.1% TFA v/v를 포함하는 CH3CN:H2O (20:80 v/v)를 사용하여 처음 시작 20분 동안 수행한 후, 0.1% TFA v/v를 포함하는 CH3CN:H2O (80:20 v/v)를 사용하여 10분 동안 더 수행하였다. 이때, RP-HPLC는 유속 1 mL/분, UV 파장 225 nm 조건으로 실시하였다.
실험예 1. (±)-[ 18 F]비소프롤롤에 대한 방사성 표지
18F-불소(18F-fluoride)는 전남대학교 화순 병원 (분자 탐침 개발 혁신 센터)의 PET traceTM cyclotron (GE Healthcare) 상에서 18O(p,n)18F 반응을 통해 생성하였다. 18F-불소는 아세토니트릴 중 Kryptofix　 2.2.2와 함께 90℃에서 질소 가스로 건조하였다. 잔류물은 아세토니트릴에서 공비증류하여 2번 더 건조시켰다. 상기 혼합물에 아세토니트릴 (1.0 mL) 중 전구체 9 (4 mg) 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 100℃에서 20분 동안 가열한 다음 냉각시켰다. N2 건조하여 용매를 제거한 후, 0.6 mL의 테트라히드로푸란에 용해된 5.4 mg의 리튬 알루미늄 하이드라이드를 바이알에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 용액을 N2 가스로 증발시키고, 1 mL의 MeOH를 첨가하였다. 용액을 FG 필터를 통해 통과시키고, MeOH로 용리시켰다. 여과액을 반-분취 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼 시스템에 주입하여 정제하였다. 방사성 생성물의 식별을 위해, 수집된 HPLC 분획물을 (±)-[F]비소프롤롤과 함께 주입하였다 (도 2). 이동상은 80% 용매 A (물 중 0.1% TFA) 및 20% 용매 B (아세토니트릴)로 시작하여, 10분에 20% 용매 A 및 80% 용매 B를 이용하여 농도 구배를 형성하고, 20분에 80% 용매 A 및 20% 용매 B를 이용하여 이동시키고 이를 40분 동안 유지하였다. 이때, 유속은 3 mL/분, 체류 시간(Rt)은 18.16분이었다.
하기 표 1에 PET 추적자의 방사화학 특성을 나타내었다.
PET 추적자 투여량(MBq) 특이적 활성(GBq/μmol) 방사화학 수율 방사화학 순도
(±)-[18F]비소프롤롤(1) 7.4 3.7 15% > 98%
실험예 2. 생체분포(biodistribution) 평가
방사성 추적자(radiotracer)의 농도-시간 과정은 관심있는 조직에서 특정 분포를 평가하는 데 매우 중요하다. β-AR 수용체가 있는 기관에서 본 발명에 따른 PET 추적자의 분포 패턴을 평가하고자, 5-6 주령의 정상 Balb/c 마우스에서 (±)-[18F]비소프롤롤의 생체외 생체분포 연구를 수행하였다. 동물 관리, 동물 실험 및 안락사는 전남대학교 동물 연구위원회와 실험 동물 관리 및 사용 가이드에 승인된 프로토콜에 따라 수행하였다.
구체적으로, 생체분포 연구는 7.4 MBq의 (±)-[18F]비소프롤롤을 Balb/c 정상 마우스 (5-6 주령)에 정맥 주사(i.v. injection) 한 후, 5분, 30분, 90분 및 120분째에 수행하였다. (±)-[18F]비소프롤롤을 Balb/c 마우스에 정맥주사 (7.4 MBq)로 투여한 다음, 심장, 폐, 간, 비장, 위, 장, 신장, 췌장, 근육, 뇌 및 피부를 포함한 다양한 기관에서 흡수 신호를 감지하고, 도 3의 A 및 표 2에 나타낸 바와 같이, 주사 후(post-injection; p.i) 5분, 30분, 90분 및 120분의 시간 간격으로 수확하였다.
(±)-[18F]비소프롤롤 (화합물 1)은 주사 후 5분의 초기 시점에 간, 비장, 위, 장, 신장 및 췌장과 같은 기관, 즉 복부 부위에서 높은 흡수를 나타내었으며, 장을 제외하고 시간이 지남에 따라 감소하였다. 처음에, 심장, 폐 및 뇌와 같은 β-아드레날린성 말단이 풍부한 기관에서도 높은 신호 강도를 나타내었으나, 폐 및 뇌는 시간이 지남에 따라 감소된 방사능을 보였다. 반면, 심장의 방사능은 초기에 감소하였지만 시간-활성 곡선에 나타낸 바와 같이 주사 후 90분 내지 120분의 마지막 시점에서 유지되었다 (도 3의 B 및 표 2 참조). 심장에서, 흡수는 주사 후 90분째에 1.66±0.12% 주사 용량 (ID)/g이었고, 주사 후 120분째에 1.68±0.59% ID/g로 유지되었다. 골(bone)에서, 점차적으로 증가된 방사능은 자유 18F의 흡수에 기인한 것일 수 있다.
하기 표 2에 다양한 기관에서 측정한 (±)-[18F]비소프롤롤 (화합물 1)의 방사능 % ID/g를 계산하여 나타내었다.
% ID/g
5분 30분 90분 120분
혈액 8.16±1.86 6.03±0.37 1.69±0.09 1.12±0.25
심장 12.36±5.82 6.37±0.71 1.66±0.12 1.68±0.59
폐 25.62±12.5 10.13±2.12 2.23±0.54 1.88±0.54
간 35.56±9.86 32.25±11.66 7.98±3.9 4.92±0.58
비장 21.06±5.02 9.85±3.66 2.34±0.41 1.76±0.43
위 16.17±8 24.94±4.1 6.84±2.59 6.1±5.35
장 16.14±4.58 31.35±10.37 35.72±9.39 28.41±17.48
신장 36.03±9.22 28.93±2.68 7.28±1.82 3.88±0.73
췌장 27.97±8.24 12.22±3.1 2.45±0.11 1.69±0.44
정상 근육 9.19±3.81 4.91±0.46 1.83±1.11 1.09±0.4
뼈 6.82±1.96 10.74±0.68 19.82±6.05 17.58±2.69
뇌 11.09±8.86 3.45±0.7 1.19±0.08 0.84±0.34
피부 8.06±3.1 5.87±0.66 2.54±0.9 1.33±0.28
차단 연구의 경우, 비소프롤롤 (0.75 mg/0.1 mL) 주사 후 30분 및 120분째에 생체분포 연구를 수행하였다. 마우스에서 혈액 및 기관(organ)을 추출하여 무게를 측정하고, 감마 카운터를 사용하여 기관 방사능을 계산하였다. % ID/g를 얻기 위해, 방사능 측정은 조직의 무게와 주사된 방사능의 양으로 표준화하였다.
구체적으로, PET 추적자의 수용체에 대한 특이적 결합은 비표지된 길항제인 (±)-비소프롤롤을 사용하는 경쟁 분석으로 차단 연구를 수행하여 조사할 수 있다. β-AR가 풍부한 기관에서 (±)-[18F]비소프롤롤의 흡수 능력을 확인하기 위해, Balb/c 마우스에 비표지된 (±)-비소프롤롤 750 μg을 전처리한 다음 (±)-[18F]비소프롤롤을 주사하였다. (±)-[18F]비소프롤롤 흡수의 억제는 주사 후 30분 및 120분째에 경쟁 차단 연구에서 어떠한 기관에서도 관찰되지 않았다 (도 4 및 표 3 참조). 그러나, 놀랍게도 (±)-비소프롤롤로 전처리한 후 2개의 상이한 시점 (30분 및 120분) 간의 방사능 변화는 유망한 결과를 보여주었다. 주사 후 120분째에, 심장 및 뇌를 포함한 β1-AR가 풍부한 기관은 각각 6%와 10%의 방사능 손실 (추적자의 빠른 배설)을 보인 반면, β2-AR가 풍부한 기관은 유지되거나 증가된 방사능 (추적자의 느린 배설)을 나타내었다. 이는 β2-AR의 경우와 비교하여 심장과 뇌에서 비소프롤롤에 의한 β1-AR의 선택적 억제를 시사한다.
PET 추적자에 의한 방사능의 기관-대비-혈액(organ-to-blood) 비율은 1) 미처리 및 2) 비표지된 (±)-비소프롤롤로 전처리된 두 사례 연구 모두에 대해 계산하였다. 미처리의 경우, (±)-[18F]비소프롤롤의 축적은 간, 신장 및 췌장을 제외한 모든 기관에서 더 우수하였으며, 기관-대비-혈액 비율이 주사 후 30분에서 120분까지 증가하였다 (도 4의 B). β1-AR가 풍부한 기관 중에서 심장의 경우 기관-대비-혈액 비율이 폐 및 뇌와 같은 다른 기관과 비교시 주사 후 30분에서 120분까지 강도가 급증함을 보였으며, 이는 심장에서 혈액으로의 배설이 더 느리다는 것을 시사한다. 그러나, (±)-비소프롤롤로 차단 후 기관-대비-혈액 비율이 위 및 장을 제외한 심장을 포함한 모든 기관에서 감소를 나타내었다. 심장의 경우, 비표지된 (±)-비소프롤롤로 전처리시에 기관-대비-혈액 비율이 감소하고, 미처리시에 증가하였으며, 이는 심장 내부의 β1-AR에서 (±)-[18F]비소프롤롤의 축적을 나타낸다.
하기 표 3에 (±)-비소프롤롤에 의해 β-AR가 차단된 다양한 기관에서 측정한 (±)-[18F]비소프롤롤 (화합물 1)의 방사능 % ID/g를 계산하여 나타내었다.
% ID/g
30분 120분
혈액 6.88±0.91 1.62±0.09
심장 9.7±1.4 1.99±0.14
폐 17.48±2.54 3.29±0.47
간 31.43±8.54 7.07±0.91
비장 15.01±2.61 3.44±0.37
위 23.83±5.35 6.43±0.63
장 22.71±3.43 13.31±3.28
신장 38.88±5.89 7.48±0.14
췌장 18.8±5.51 3.36±0.48
정상 근육 7.03±0.84 1.16±0.17
골 5.12±1.19 8.45±2.22
뇌 9.41±1.66 1.31±0.47
피부 7.51±0.51 1.58±0.16
수용체를 표적으로 하는 리간드의 조직-특이적 국소화는 PET를 사용한 생체내 연구에 의해 검증될 수 있다. 모델 연구로서, 본 발명자들은 PET를 사용하여 심장 내부의 β1-AR을 표적으로 하는 선택적 β-차단제, (±)-[18F]비소프롤롤을 기반으로 방사성 추적자의 선택적 국소화를 검증하였다. 생체외(ex vivo) 생체분포 및 차단 연구를 포함한, (±)-[18F]-비소프롤롤에 대한 생체내 연구는 방사성 추적자가 주로 심장에서 β1-AR가 있는 기관에서 더 우수한 분포 및 축적을 가짐을 시사하였다.
결론적으로, 본 발명자들은 새로운 18F 방사성 표지된 β1-차단제, (±)-[18F]비소프롤롤을 성공적으로 고안 및 합성하고, β1-AR을 표적으로 하는 비소프롤롤의 선택성에 대한 생체내 또는 생체외 평가에 대한 잠재력을 평가하였다. 또한, 심장 내부의 β1-AR에 대한 선택적이고 효율적인 PET 추적자로서의 잠재력을 조사하였다. Balb/c 마우스의 생체외 생체분포 (±)-[18F]비소프롤롤은 다른 기관과 비교하여 주사 후 90분에서 120분까지의 시점에서 심장에 유지된 방사능을 나타내었다. 비방사성 (±)-비소프롤롤을 사용한 전처리는 (±)-[18F]비소프롤롤의 흡수를 억제하지는 않았다. 하지만, 심장과 같은 β1-AR 우세 기관에서 (±)-[18F]비소프롤롤의 배설이 더 빨라진 반면, 다른 β2-AR 우세 기관은 추적자의 배설이 더 느림을 보여주었다. 비표지된 (±)-비소프롤롤로 전처리를 하거나 전처리하지 않은 기관-대비-혈액 비율의 차이는 (±)-[18F]비소프롤롤이 다른 β1-AR 기관과 비교시 심장에 양호한 축적을 나타냄을 보여주었다. 이러한 맥락에서 수행된 (±)-[18F]비소프롤롤의 PET 연구는 표적 단백질의 특정 동형체의 생체내 선택성 프로파일링에 대한 유망한 검증 모델이 될 것이다. 또한, 본 연구는 심장의 β1-AR을 표적으로 하는 새로운 매우 선택적이고 효율적인 PET 추적자를 고안하는 데 도움이 될 수 있다.

Claims (8)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. a) 18F-불소와 아세토니트릴 중의 [2.2.2]-크립탄드를 혼합한 혼합물을 85℃ 내지 95℃ 온도에서 질소 가스로 건조하는 단계;
    b) 상기 a) 단계의 혼합물에 아세토니트릴 중의 화학식 9
    Figure 112021047970970-pat00018
    의 화합물 용액을 첨가한 반응 혼합물을 90℃ 내지 110℃에서 10분 내지 30분 동안 가열한 다음 실온으로 냉각시는 단계; 및
    c) 상기 b) 단계의 반응 혼합물을 질소 가스로 건조하여 용매를 제거한 후, 테트라히드로푸란(THF)에 용해된 리튬 알루미늄 하이드라이드(LiAlH4)를 첨가하여 실온에서 10분 내지 20분 동안 반응시키는 단계;를 포함하는
    하기 화학식 1로 표시되는 β-아드레날린성 수용체 검출을 위한 PET용 추적자의 제조방법:
    [화학식 1]
    Figure 112021047970970-pat00019
  8. 제7항에 있어서, 상기 PET용 추적자는 β1-아드레날린성 수용체(β1-AR)를 표적으로 하는 화학식 1로 표시되는 [18F]비소프롤롤 기반 화합물인 것인, 화학식 1로 표시되는 β-아드레날린성 수용체 검출을 위한 PET용 추적자의 제조방법.
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