KR102508313B1 - 신규 판토에아 속 pl-1 균주 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세균 범용 정족수감지 신호분자(autoinducer-2, AI-2)를 억제하는 활성을 갖는 판토에아 속(Pantoea sp.) PL-1 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 신규 분리한 판토에아 속 PL-1 균주에 관한 것이다.
인구증가와 도시화로 인해 물 소비가 증가하고 있고, 보다 엄격해지는 수질규제로 인해 기존의 생물학적 처리공정에 분리막을 적용한 분리막 생물반응기(MBR, membrane bioreactor)가 개발되었다.
MBR 공정은 시스템에 적용하는 분리막의 세공크기(수㎜~수십㎛)와 막표면 전하에 따라 원수 및 하·폐수 중에 존재하는 처리대상물질을 분리 및 제거할 수 있는 고도처리 공정이다. MBR 공정은 분리막에 의해 기존 활성슬러지 공법보다 완벽한 고·액 분리가 가능하며, 반응조 내에 높은 활성 미생물 농도를 유지할 수 있어 질산화의 효율을 증가시키고 슬러지 체류시간이 증가하여 슬러지 발생량이 줄어드는 효과가 있고, 안정적인 운영이 가능하다는 장점이 있다.
그러나, MBR은 반응조 내에서 하폐수 내의 오염원 및 미생물과 직접 접촉하기 때문에 필연적으로 분리막 오염(membrane fouling)현상이 발생할 수 있는 문제점이 있다. 분리막 생물반응기(MBR) 공정의 운전이 진행됨에 따라 반응조 내부에 존재하는 세균, 곰팡이, 조류(algae) 등과 같은 미생물들이 분리막 표면에서 부착성장(attached growth)을 시작하여 최종적으로는 수십 마이크로미터 내외의 두께를 가지는 바이오필름(biofilm, 이하 생물막)을 형성하며 표면을 덮게 된다. 이러한 생물막은 물의 유속을 감소시켜 분리막의 여과 성능을 저하시키는 여과 저항(filtration resistance)을 발생시키고, 최종적으로는 투수도 감소, 분리막의 세정주기 및 수명 단축, 여과에 필요한 에너지 소비량 증가 등 분리막 공정의 여과 성능을 저하시킴으로써 분리막 생물반응기 공정의 경제성을 악화시키는 문제점이 있다. 이를 해결하기 위해, 종래에는 응집제 및 흡착제 등 첨가제(additives) 투입에 의한 전처리 방법, 분리막을 역세척(back washing)하는 방법, 화학약품(NaOCl 등)을 이용하여 세척하는 방법 등이 제안되었으나. 이러한 방법들은 2차 오염 물질을 발생시키고 취급 및 운전이 용이하지 않으며, 막 오염 현상을 근본적으로 막을 수 없는 문제점이 있다.
생물막 형성에 있어, 미생물간의 정족수감지(quorum sensing, QS)가 핵심적인 역할을 하기 때문에 수생 세균 간 신호전달체계인 정족수감지 신호를 차단(quorum quenching, QQ) 할 수 있다면 분리막 표면에 형성되는 생물막 형성을 억제할 수 있다. 지금까지 알려진 정족수감지(QS) 신호분자에는 그람음성 세균에서만 사용되는 N-acylhomoserine lactone (AHL or HSL)과 그람양성 세균에서만 유효한 autoinducer (oligo)peptide (AIP)가 알려져 있으며 범용 신호분자로써 그람음성 세균와 그람양성 세균에서 공통적으로 사용되는 autoinducer-2 (AI-2)가 알려져 있다. 4,5-디하이드록시-2,3-펜탄디온(4,5-dihydroxy-2,3-pentandione, DPD)는 AI-2의 전구체 물질로 이것이 자발적인 고리화 반응으로 AI-2로 최종 전환된다. AI-2는 LuxS 유전자에 의해 합성되는데, 약 500종 이상의 세균에서 관찰되었으며 녹농균의 경우, 그람음성 세균으로 LuxS 유전자가 없어 AI-2를 만들지 않지만 AI-2를 감지하여 독성 물질의 생성을 증가시키는 것으로 알려져 있다.
다양한 미생물의 집합체인 생물반응조 내부의 미생물 집락의 특성상 분리막 생물반응기 장치 또는 공정에서의 분리막 표면의 생물오염 발생에서는 그람음성 세균 및 그람양성 세균의 정족수감지 기작이 모두 관여하고 있을 수밖에 없으므로, 종래와 같은 그람음성 세균에만 적용될 수 있는 신호분자와 관련된 생물막 형성 억제 기술(AHL QQ)보다는 그람음성 세균 및 그람양성 세균에 공통적으로 적용될 수 있는 신호분자와 관련된 생물막 형성 억제 기술(AI-2 QQ), 이를 위한 미생물의 발굴 및 이를 응용한 분리막 수처리 장치와 공정의 개발이 요구되고 있다.
따라서, 종래 기술의 문제점을 극복하기 위해서는 반응조 내 미생물의 특성, 특히 분리막 표면에서 세균 범용 정족수 감지 신호분자 AI-2를 감소시켜 생물막 형성, 생물오염을 제어하는 측면으로 접근할 수 있는 새로운 기술의 개발이 필요한 실정이다.
- 선행문헌 1: Genbank Accession No.OP0565751(20220730)
- 선행문헌 2: 한국 공개특허공보 제2018-0098843호(20180905)
- 선행문헌 1: Genbank Accession No.OP0565751(20220730)
- 선행문헌 2: 한국 공개특허공보 제2018-0098843호(20180905)
이에 본 발명은 그람음성 세균 및 그람양성 세균에 공통으로, 즉 세균의 범용 정족수감지 기작에 의한 생물막 형성을 효과적으로 억제할 수 있는 신규 미생물(Pantoea sp. PL-1), 상기 미생물을 고정시킨 담체 및 이를 이용한 분리막 수처리 장치/공정을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 판토에아 속(Pantoea sp.) PL-1(수탁번호: KCTC 15113BP) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 상기 균주 또는 이의 배양물이 고정된 담체를제공한다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 피처리수를 수용하는 반응조, 수처리용 분리막 모듈 및 상기 반응조 내부에 배치된 상기 균주가 고정된 담체를 포함하는 분리막 수처리 장치를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 측면은, 수처리용 미생물 및 피처리수를 포함하는 반응조에 상기 균주를 접종하여 분리막에 의한 여과를 실시하는 여과 단계; 또는 상기 담체의 존재 하에 분리막에 의해 피처리수를 여과하는 단계;를 포함하는 분리막 수처리 공정을 제공한다.
본 발명의 판토에아 속(Pantoea sp.) PL-1 균주는 그람음성 세균과 그람양성 세균에서 공통적으로 사용되는 범용신호인 AI-2 신호분자를 감소시키는 활성이 우수하여, 생물오염 또는 생물막의 형성을 효과적으로 억제할 수 있다.
따라서, 상기 균주를 분리막 생물반응기(membrane bioreactor, MBR) 등과 같은 수처리 공정에 적용하면 생물반응조 내부의 다양한 종류의 미생물에 의한 분리막 표면의 생물오염을 보다 효과적으로 억제시킴으로써 수처리 공정의 효율을 더욱 향상시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 판토에아 속 PL-1 균주의 16S rRNA로 시퀀싱하여 계통분류한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 판토에아 속 PL-1 균주를 투과전자현미경(TEM)으로 관찰한 것이다.
도 3은 본 발명의 판토에아 속 PL-1 균주의 DPD (AI-2 신호분자) 농도를 감소시키는 활성을 측정한 결과이다.
도 4는 본 발명의 판토에아 속 PL-1 균주를 배양함에 따라 DPD (AI-2 신호분자)의 농도가 감소함을 보여주는 결과이다.
도 5는 본 발명의 판토에아 속 PL-1 균주와 기존 DKY-1 균주의 펠렛(pellet)에서 DPD (AI-2 신호분자) 농도를 감소시키는 활성을 측정하여 비교한 결과이다.
도 6은 본 발명의 판토에아 속 PL-1 균주와 DKY-1 균주의 상등액(supernatant) 부분에서 DPD (AI-2 신호분자) 농도를 감소시키는 활성을 측정하여 비교한 결과이다.
도 2는 본 발명의 판토에아 속 PL-1 균주를 투과전자현미경(TEM)으로 관찰한 것이다.
도 3은 본 발명의 판토에아 속 PL-1 균주의 DPD (AI-2 신호분자) 농도를 감소시키는 활성을 측정한 결과이다.
도 4는 본 발명의 판토에아 속 PL-1 균주를 배양함에 따라 DPD (AI-2 신호분자)의 농도가 감소함을 보여주는 결과이다.
도 5는 본 발명의 판토에아 속 PL-1 균주와 기존 DKY-1 균주의 펠렛(pellet)에서 DPD (AI-2 신호분자) 농도를 감소시키는 활성을 측정하여 비교한 결과이다.
도 6은 본 발명의 판토에아 속 PL-1 균주와 DKY-1 균주의 상등액(supernatant) 부분에서 DPD (AI-2 신호분자) 농도를 감소시키는 활성을 측정하여 비교한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1.
신규 판토에아 속 PL-1 균주
본 발명의 일 측면은 신규 판토에아 속(Pantoea sp.) 균주를 제공한다.
상기 본 발명의 상기 신규 균주는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 16S rRNA를 포함하는 판토에아 속(genus) 균주일 수 있고, 특히, 판토에아 속 PL-1 균주일 수 있다. 상기 판토테아 속 PL-1 균주는 2022년 10월 4일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 KCTC 15113BP로 기탁된 것이다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서 투과전자현미경(Transmission electron microscope, TEM)으로 관찰한 결과, 상기 본 발명의 PL-1 균주는 장경이 1.25 내지 1.34 ㎛인 크기를 가지는 것으로 확인되었다(도 2 참조).
상기 판토에아 속 PL-1 균주는 정족수감지(QS)에 관여하는 신호분자 중 AI-2 신호분자를 감소시키는 활성을 가진다.
상기 정족수감지(QS)는 세균의 독특한 신호전달 체계로서, 주변의 다른 세균들이 분비하는 신호물질의 농도를 인식해 자기 개체군의 규모가 얼마나 되는지 평가하는 과정을 의미한다. 구체적으로, 상기 정족수감지는 각각의 개별 세포가 생육 중에 분비하는 특정한 신호분자의 농도에 의해 세균의 집단적 행동 양식이 결정되는 일련의 세포밀도-의존성 유전자 발현 조절 메커니즘을 말한다. 세균은 화학물질을 생육이 진행됨에 따라 어떤 특정한 세포 밀도에 도달하게 되는 상황인 소위 정족수(quorum)에 이르게 되면, 저밀도 상황에서의 세포에서는 관찰되지 않는 특정한 형질이 집단적으로 유도 발현되고, 이로 인해 세포의 증식이 촉진될 수 있다. 특히, 정족수에 이르게 되면 미생물의 부착과 생물막의 형성에 필요한 유전자의 발현을 유도하여, 생물막을 형성할 수 있다.
상기 정족수감지에 관여하는 신호분자는 그람음성 및 그람양성 세균에 공통적으로 적용되는 정족수감지 신호분자인 AI(autoinducer, 오토인듀서)일 수 있고, 구체적으로 AI-2일 수 있다. 상기 AI-2는 하기와 같은 반응식에 의해 4,5-디하이드록시-2,3-펜탄디온(4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione, DPD)으로부터 자발적으로 전환될 수 있다.
[반응식]
상기 AI-2는 그람음성 및 그람양성 세균에 공통적으로 적용되는 정족수감지 신호분자로서, S-아데노실메티오닌(S-adenosylmethionine)에서 3단계의 효소반응을 거쳐 생성된 DPD로부터 자발적 반응으로 만들어지는 환형 퓨라논(cyclic furanone) 계열의 유도체를 말한다. 가장 많이 알려진 AI-2는 비브리오 하베이(Vibrio harveyi)의 푸라노실 보레이트 디에스테르(furanosyl borate diester) 분자이다. AI-2의 전구체로서 DPD는 LuxS 효소에 의해 S-리보실호모시스테인(S-ribosylhomocysteine)이 호모시스테인(homocysteine)으로 대사되는 과정에 만들어진다. DPD는 500종 이상의 세균에 존재하는 LuxS에 의해 합성되고, DPD가 서로 다른 DPD 유도체로 빠르게 상호 변환되고, 이에 의해 AI-2는 이종간 커뮤니케이션을 위한 수단으로 이용된다.
본 발명의 판토에아 속 PL-1 균주는 정족수감지에 관여하는 신호분자, 특히 AI-2 농도를 감소시키는 활성을 갖는다. 구체적으로, 본 발명의 Pantoea sp. PL-1 균주는 상기 AI-2의 전구체인 DPD의 농도를 감소시킴으로써, DPD가 AI-2로 전환되는 양을 감소시킬 수 있다. 결국, 본 발명의 판토에아 속 PL-1 균주가 DPD의 농도를 감소시킴으로써 AI-2의 농도도 감소되게 되고, 그 결과 상기 AI-2에 의한 동종 및 이종 세균간의 신호전달이 교란 또는 차단될 수 있다.
한편, 본 발명의 판토에아 속 PL-1 균주가 나타내는 상기와 같은 AI-2 감소 효과에 따라, 미생물들에 의해 생성되는 생물막의 형성을 억제할 수 있다. 상술한 바와 같이, 상기 생물막(biofilm)은 물과 오랜 기간 접촉되어 있는 환경에서 초기에 고체 표면에 미생물이 부착되고, 부착된 미생물이 분비하는 단백질, 당 그리고 지방으로 구성된 교차 결합된 점액층이 형성된 것을 의미한다. 세균에 의해 생성되는 세포외고분자(extracellular polymeric substance, EPS)에는 polysaccharide, protein, lipid, 세포 외 DNA (extracellular DNA, eDNA) 등으로 구성되어 있다. a미생물의 정족수감지 시스템은 미생물의 부착과 생물막의 형성과정의 특정한 단계에서 필요한 유전자의 발현을 유도하는 핵심적인 기능을 하므로, 상기 균주는 정족수감지 신호분자를 억제함으로써, 세균간의 신호전달 체계를 차단하고, 생물막 형성을 저해하는 활성이 있다. 특히, 그람음성 및 그람양성 세균에 공통적으로 적용되는 AI-2 신호분자를 억제함으로써 다양한 미생물이 집합되어 있는 생물막의 형성을 효과적으로 억제할 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명의 PL-1 균주의 펠렛(pellet)을 DPD가 포함된 배지에 넣고 배양시켰을 때 DPD의 농도가 약 67.7% 정도 감소되었고, 상기 PL-1 균주의 배양 상등액(supernatant)을 DPD와 반응시켰을 때, DPD의 농도가 약 28.6% 정도 감소됨을 확인하였다. 상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 판토에아 속 PL-1은 DPD의 농도를 감소시키는 활성을 갖는 물질을 발현 및 분비하고, 이를 통해 AI-2의 농도를 감소시키는 효과가 우수함을 확인하였다(도 3 참조). 또한, 본 발명의 판토에아 속 PL-1 균주와 DPD의 반응 시간이 증가함에 따라 DPD 농도 감소 효과가 크게 나타남을 확인하였다(도 4 참조). 또한, AI-2 신호분자 억제활성이 있는 아시네토박터 속(Acinetobacter sp.) DKY-1 균주보다 AI-2 신호분자를 감소시키는 활성이 더 우수함을 확인하였다(도 5 및 도 6 참조). 특히, 펠렛(pellet) 실험에서 본 발명의 판토에아 속 PL-1 균주는 아세니토박터 속 (Acinetobacter sp.) DKY-1 균주 보다 속도상수(rate constant, k) 기준 약 6배, 상등액(supernatant) 실험에서는 PL-1 균주가 DKY-1 균주보다 약 1.4배 이상 AI-2를 억제하는 활성이 더 우수함을 확인하였다.
위와 같이, 본 발명의 판토에아 속(Pantoea sp.) PL-1 균주는 AI-2의 농도를 효과적으로 감소시킴으로써, 정족수 감지에 의해 유도되는 생물막의 형성까지 효과적으로 방지할 수 있다.
2. 판토에아 속 PL-1균주가 고정된 담체
본 발명의 다른 측면은 상기 PL-1 균주 또는 상기 균주의 배양물이 고정화된 담체를 제공한다.
상기 담체 내부에 생물막 형성 억제용 미생물이 '고정'된다는 것은 상기 투과성 담체의 매트릭스 내부의 공간에 생물막 형성 억제용 미생물이 부착(adhesion), 포괄(entrapment), 캡슐화(encapsulation), 포집(collection), 담지(supporting)되는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 통상적으로 미생물을 담체에 고정될 수 있는 방법이라면 제한없이 이용될 수 있다.
상기 균주의 배양물은 상기 판토에아 속 PL-1 균주를 배양하여 수득되는 것으로, 상기 균주의 세포를 포함하는 배양액 자체이거나, 또는 이로부터 세포를 제거하여 수득된 배양 상층액일 수 있으며, 또한 이들의 여과물, 농축물 또는 건조물일 수 있다. 상기 세포가 제거된 배양액은 PL-1 균주에 의해 생산, 분비되는 성분, 예컨대 대사산물을 포함하며 이에 따라 그람양성 및 그람음성 균의 정족수 감지 신호분자를 감소, 억제 또는 분해하는 활성을 갖는 것일 수 있다.
상기 담체는 수중 폭기에 의해 유동성을 갖는 투과성 담체일 수 있다. 투과성 담체의 재질은 담체 내외를 통한 물질 전달이 가능하고 수중폭기 조건에서 분리막 표면과 접촉하여도 분리막 표면이 손상되지 않는다면, 투과성 담체의 기계적 강도, 가요성 등에 특별한 제한 없이 사용할 수 있다. 예컨대 다소 딱딱한 재질을 사용해도 되고 수중의 유체 흐름 속에서 자유롭게 휘어지면서도 복원력이 있는 가요성의 재질을 사용할 수도 있다. 보다 강한 폭기 조건에서 분리막 표면의 손상을 최소화하면서도 생물막의 물리적 탈리를 극대화하기 위해서는 가요성의 재질을 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 투과성 담체는 친수성의 고분자로 이루어진 하이드로겔을 주성분으로 포함하는 것을 사용할 수 있고, 보다 구체적으로 하이드로겔은 알지네이트계, PVA계, 폴리에틸렌글리콜계, 폴리우레탄계나 이들의 복합체를 포함할 수 있으며, 상기와 같은 재질의 투과성 담체를 사용함으로써 담체 내외를 통한 물질 전달이 보다 용이해질 뿐만 아니라 강한 수중 폭기 조건에서 분리막 표면과 접촉하는 경우에도 분리막 표면의 손상을 방지할 수 있다.
상기 담체에는 이러한 친수성 고분자 이외에도 기계적 강도를 증가시키기 위하여 그래핀옥사이드(GO), 탄소나노튜브(CNT) 등과 같은 탄소계 첨가제를 첨가할 수 있고, 내부 접착력을 향상시키기 위하여 폴리도파민계 고분자, 폴리노르에피네프린계 고분자 등의 생체모방형(bio-inspired) 접착성 고분자 첨가제를 더 첨가할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 담체는 내부의 화학적 가교 결합을 통하여 3차원 망상 구조를 갖는 것일 수 있다. 상기와 같이 3차원 망상 구조를 갖는 경우, 본 발명의 PL-1 균주를 화학적 가교 결합 사이에 포획시켜서 담체 내부에서 지속적으로 성장할 수 있다. 예컨대, 알지네이트계 고분자는 천연 담체로서 사용 가능한 대표적인 친수성 고분자 물질로서, 염화칼슘 용액 내에서 화학적인 결합인 가교를 통해서 물질 전달에 대한 저항을 최소화하는 망상형 구조로 고형물을 형성하게 된다. 이로써 생물막 형성 억제용 미생물뿐만 아니라 상기 미생물에 의해 생산된 효소 역시 고정화하는 것도 가능하고, 생체적합성(biocompatibility)이 우수하여 수처리용 미생물이 존재하는 반응조 내에서 사용하기 적합하며, 가격이 저렴하여 경제성이 높으면서 인체에 무해하다는 장점이 있다.
상기 담체는 본 발명의 상기 PL-1 균주가 고정되어 있고, 수처리 반응조 내의 피처리수로부터 고밀도로 분리하여 배치할 수 있으면서 상기 균주의 생장 및 활성에 관련되는 산소, 영양분, 대사물질 등의 유출입을 가능하게 하도록 적절한 투과성을 갖는 것이라면 특별한 제한은 없지만, 구형, 기둥형(원기둥형, 중공성 기둥형을 포함), 시트형 등과 같이 분리막 모듈의 종류에 관계없이 내부에 고정화된 균주가 외부의 피처리수 및 분리막 표면과 실질적으로 접촉하는 면적(담체 부피 당 표면적)이 충분히 크게 확보된 형태를 채용할 수 있다.
상기 담체는 구형, 시트형 또는 기둥형일 수 있다. 그러나 이에 한정되지 않고 상기 담체의 형태는 생물막 형성 억제용 미생물의 피처리수 및 분리막 표면과의 실질적인 접촉 면적(구체적으로, 담체 부피 당 표면적)을 증대시키기 위한 형태라면 제한없이 해당할 수 있다. 본 발명의 한 구현예로서의 기둥형(columnar) 투과성 담체의 경우에는, 본 발명의 균주가 기둥형 투과성 담체(매트릭스)의 내부에 배치됨으로써 균주가 외부의 피처리수와 접촉하는 면적을 증가시켜서 생물막 형성의 억제 작용을 보다 개선시킬 수 있으며, 나아가 투과성 담체가 분리막 표면과 접촉하는 면적을 증가시켜서 수중 폭기 중의 유동성에 분리막 표면의 생물막 탈리에 의한 막오염 저감 효과를 더욱 개선시킬 수 있다.
상기 기둥형 담체는 중심축이 직선 또는 이에 근사한 딱딱한 모양뿐만 아니라 중심축이 곡선인 구불구불한 모양의 담체를 모두 포함하는 것이고, 또한 중심축에 수직인 단면 모양이 원 모양인 원기둥형(circular columnar) 담체뿐만 아니라 단면 모양이 다각형 모양인 다각기둥형(polygonal columnar) 담체를 모두 포함하는 것이며, 아울러 원기둥형 담체는 중심축에 수직인 단면이 진원의 모양인 담체뿐만 아니라 타원 또는 이에 유사한 모양인 담체를 모두 포함한다. 상기 기둥형 투과성 담체의 구체적인 형태로서는, 내부 단면이 꽉 찬(비-중공성인(non-hollow)) 기둥형 투과성 담체이어도 되고, 내부 단면의 적어도 일부가 비어 있는 중공성인(hollow) 기둥형 투과성 담체이어도 된다. 중공성 기둥형 담체의 경우에는, 길이 방향의 외측 표면(쉘측) 외에도 길이 방향의 내측 표면(루멘측)을 통해서도 생물막 형성 억제용 미생물이 외부의 피처리수와 접촉될 수 있어서, 담체 부피 당 표면적을 더욱 향상시킬 수 있어서 추가적인 생물막 형성 억제 효과를 달성할 수 있다.
상기 담체가 시트형(sheet-like)인 경우에는, 생물막 형성 억제용 미생물이 얇은 시트형(또는 판상)의 투과성 담체(매트릭스)의 내부에 배치되어서 생물막 형성 억제용 미생물 고정화 칼럼을 형성함으로써 생물막 형성 억제용 미생물의 피처리수와의 접촉 면적을 더욱 증가시키면서도, 고형의 물리적 형태의 유지가 용이하여서 분리막 표면과의 넓은 접촉 면적을 실질적으로 확보할 수 있는 장점이 있다. 또한, 시트(또는 판) 모양으로 형성되어서 분리막 표면의 생물막의 탈리의 기회가 증대되고, 투과성 담체 간의 엉키는 현상을 억제할 수 있다. 아울러 중공사 분리막 모듈을 채용한 분리막 수처리 공정의 경우 개별 중공사의 사이에 투과성 담체가 끼워져 버려 유동성을 상실하게 되는 문제를 대폭 저감시킬 수 있으므로, 보다 효율적인 생물막 형성 억제 작용의 효과를 달성할 수 있다.
상기와 같은 담체를 이용하는 경우, 상기 담체 내부에 고정화된 본 발명의 PL-1 균주의 생물막 억제 활성이 극대화되어 생물막 형성이 효과적으로 저해될 수 있다.
상기 본 발명의 균주가 고정된 담체는 본 발명의 PL-1 균주 외에도 정족수감지 신호분자를 억제하는 효소 또는 미생물을 더 포함할 수 있다. 예컨대 상기 효소는 락토나제(lactonase), 아실라제(acylase) 등일 수 있고, 상기 미생물은 로도코쿠스 BH4 (Rhodococcus sp. BH4), 아시네토박터 DKY-1 (Acinetobacter sp. DKY-1), 슈도모나스(Pseudomonas sp. Li4-2, Pseudomonas sp. 1A1), 바실러스(Bacillus methylotrophicus와 Bacillus amyloliquefaciens), 칸디다 알비칸스(Candida albicans TUP1/TUP1), 아쓰로박터(Arthrobacter sp. MP1-2), 델프티마(Delftia sp. Le2-5) 및 랄스토니아(Ralstonia sp. XJ12B) 균주 등 일 수 있으나 이에 한정되지 않고 정족수감지 신호분자를 억제하는 효소 또는 미생물은 제한 없이 더 포함될 수 있다.
3.
수처리 장치 및 수처리 공정
또한, 본 발명의 다른 측면은 피처리수를 수용하는 반응조, 수처리용 분리막 모듈 및 상기 반응조 내부에 배치된 상기 생물막 형성 억제용 미생물 고정화 칼럼을 포함하는 분리막 수처리 장치를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 측면은, 수처리용 미생물 및 피처리수를 포함하는 반응조에 본 발명의 PL-1 균주를 접종하여 분리막에 의한 여과를 실시하는 여과 단계; 또는 반응조 내에 배치된 상기 생물막 형성 억제용 미생물 고정화 칼럼의 존재 하에 분리막에 의해 피처리수를 여과하는 단계;를 포함하는 분리막 수처리 공정을 제공한다.
본 발명의 분리막 생물반응기 수처리 장치/공정에 적용할 수 있는 분리막 모듈로서는 생물막 오염의 억제 또는 완화를 통하여 투수도를 향상시킬 수 있는 일반적인 수처리용 분리막 모듈이라면 특별한 제한은 없이 적용될 수 있다. 또한, 본 발명의 생물막 형성 억제용 미생물 및 상기 미생물의 고정화 칼럼이 적용되는 분리막 수처리 장치/공정은 반응조 내부의 수많은 종류의 수처리용 미생물 등에 의해 분리막 표면에 생물막이 형성되는 분리막 생물반응기(MBR) 장치/공정뿐만 아니라, 피처리수에 존재하는 미생물로 인하여 분리막 표면에 생물막이 형성되는 정밀여과막 장치/공정, 한외여과막 장치/공정와 같은 통상의 분리막 수처리 장치/공정 외에 나노여과 장치/공정, 역삼투 여과 장치/공정 등의 고도 수처리장치/공정일 수 있다.
본 발명의 PL-1 균주 또는 상기 균주가 고정화된 칼럼을 분리막 수처리 공정에 적용하면, 미생물의 정족수 감지 신호분자를 분해하여 분리막 표면에서의 생물막 형성을 억제하는 기작 등에 의하여 분리막 오염(생물오염)을 억제하여 분리막 여과 성능을 개선시킬 수 있고, 장기간 안정적으로 수처리 공정을 운전할 수 있으며, 특히 생물막 오염 방지가 매우 중요한 대규모 엔지니어링 시스템에 적합하게 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.
신규 판토에아 속 균주의 분리 및 동정
광주환경공단의 호기성 활성 슬러지(activated sludge) 시료를 채취하였다. 그 후 채취한 시료에서 AI-2 정족수감지 억제 활성을 갖는 미생물을 분리하기 위해, AI-2의 전구체인 4,5-디히드록시-2,3-펜탄디온(DPD)가 유일한 탄소원으로 포함된 제한배지에서 증균 배양하여 미생물들을 분리하였다. 이중 대표적인 우점 균주를 분리하여, 코스모진텍(cosmogenetech) 사에 16S rDNA 유전자 염기서열분석을 의뢰하여 분자생물학적으로 동정하였다.
동정 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 상기 균주는 판토에아(Pantoea) 속 균주와 상동성이 99% 이상인 것으로 확인되어, 판토에아 속으로 분류되었다. 본 발명자들은 상기 균주를 판토에아(Pantoea) 속 PL-1으로 명명하였다. 상기 본 발명의 판토에아(Pantoea) 속 PL-1균주는 2022년 10월 04일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여, KCTC 15113BP호로 수탁번호를 부여받았다.
또한, 상기 PL-1 균주의 형태학적으로 동정하기 위하여, 투과전자현미경(transmission electron microscope, TEM)을 이용하여 관찰하였다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, PL-1 균주는 1.25 내지 1.34 μm 크기의 긴 원형의 균주임을 확인하였다.
신규 판토에아 속 균주의 미생물 정족수 감지 억제 활성 측정
본 발명의 PL-1 균주가 미생물의 정족수 감지를 억제하는지 확인하기 위해, 정족수감지 신호분자로 알려진 AI-2를 유도하는 DPD를 분해하는 활성을 측정하였다.
구체적으로, 본 발명의 PL-1 균주를 12시간 이상 배양한 후 원심분리를 통해 상등액(supernatant, Sup)과 50 mM Tris-HCl로 세척하여 상등액을 완전히 제거한 펠렛(pellet)을 얻었다. 상등액은 다시 0.45 μm 시린지필터로 여과하였다. 상기 상등액과 펠렛에 각각 DPD를 첨가한 후 30℃ 배양기에서 배양하고, 배양시간에 따른 시료를 채취하였다. 채취한 배양시간별 시료와 2,3-디아미노나프탈렌(DAN)을 1:1의 비율로 섞어준 뒤, 항온수조에서 90℃ 40분간 반응시키고, 각 시료에 대해 고성능액체크로마토그래피(High-performance liquid chromatography, HPLC)로 분석하였다. 펠렛의 대조군으로는 DPD에 균주를 첨가하지 않은 것으로 하였고, 상등액의 대조군으로는 상등액과 동일한 부피의 LB 액체배지를 DPD에 넣은 것으로 준비하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 대조군의 경우 DPD 농도가 감소하지 않았으나, 상기 PL-1 균주의 펠렛(pellet)을 넣은 실험군에서는 DPD가 약 67.7% 정도 유의미하게 감소하였고, PL-1 균주의 상등액(supernatant, Sup.)을 넣은 실험군에서는 DPD의 농도가 약 28.6%정도 감소됨을 확인하였다. 또한, 도 3에 나타난 바와 같이, 상기 PL-1 균주가 배양됨에 따라 DPD의 농도가 지속적으로 감소하여, 상기 PL-1 균주는 AI-2의 전구체인 DPD를 분해하는 활성이 있음을 확인하였다.
신규 판토에아 속 균주의 미생물 정족수 감지 억제 활성의 우수성
본 발명의 PL-1 균주가 미생물 정족수 감지를 억제하는 활성이 우수한지 확인하기 위해, 종래 AI-2 억제하는 활성을 갖는다고 알려진 아시네토박터 속(Acinetobacter sp.) DKY-1 균주와 비교하였다.
구체적으로, AI-2를 감소시키는 활성은 균주의 펠렛(pellet)과 상등액(supernatant)로 나누어서 실험하였다. 상기 PL-1 균주는 초기 접종 후 약 12시간 정도 배양한 것으로 펠렛과 상등액을 준비하였다. 그러나 DKY-1의 경우, 균주의 펠렛은 초기 접종 후 약 12시간 정도 배양한 것으로, 상등액은 72시간 배양한 상등액에서 활성이 크다고 알려져 있어 72시간 배양한 후의 균주의 상등액으로 준비하였으며, 상기 실시예 2와 같은 방법으로 각 균주의 AI-2 감소 활성을 측정하였다.
그 결과, 종래 알려진 DKY-1 균주의 경우, 총 3시간(180분)의 반응시간 동안 DPD 농도가 펠렛은 약 17% 정도, 상등액 부분은 약 22% 감소된 것을 확인하였다. 이에 반해 본 발명의 PL-1 균주의 경우, 도 3 및 도 4에 나타난 바와 같이 동일조건에서 펠렛이 약 68%, 상등액이 약 29% 정도 DPD를 감소시키는 것으로 확인되었다. 이와 같은 실험 결과를 속도상수(rate constant, k(h-1))로 계산한 결과, 도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 PL-1 균주는 종래 알려진 DKY-1 균주보다 AI-2를 감소시키는 활성이 펠렛에서 약 6배, 상등액에서 약 1.4배 더 우수한 것으로 확인되었다.
이러한 실험 결과로부터, DKY-1 균주의 경우, 종래 알려진 바와 같이 펠렛보다 상등액에서 AI-2 감소 활성이 더 큰 것으로 AI-2를 감소시키는 물질을 세포 외로 분비하는 exo-type임을 알 수 있었다. 이에 반해, 본 발명의 PL-1 균주는 펠렛 및 상등액 부분 모두 DKY-1 균주보다 AI-2 감소 활성이 우수한 것으로 확인되어, AI-2 감소 활성물질을 세포 내에 축적하는 endo-type 성질과 세포 외로 분비하는 exo-type에 모두 해당하고, 특히 endo-type의 성질이 뚜렷이 나타난다는 점에서 DKY-1 균주와 상이함을 알 수 있었다.
Claims (15)
- 수탁번호 KCTC 15113BP로 기탁된 판토에아 속(Pantoea sp.) PL-1 균주.
- 청구항 1에 있어서,
상기 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 서열을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 것인 균주. - 청구항 1에 있어서,
상기 균주는 그람음성 및 그람양성의 세균의 정족수감지 신호분자를 감소시키는 활성을 갖는 것이고,
상기 정족수감지 신호분자는 4,5-디하이드록시-2,3-펜탄디온(4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione, DPD)인 것인 균주. - 삭제
- 청구항 1에 있어서,
상기 균주는 생물막 형성을 억제하는 활성을 갖는 것인 균주. - 청구항 1의 균주 또는 상기 균주의 배양물이 고정된 담체.
- 청구항 6에 있어서,
상기 담체는 수중 폭기에 의해 유동성을 갖는 투과성인 것인 담체. - 청구항 7에 있어서,
상기 담체는 하이드로겔을 포함하는 것인 담체. - 청구항 8에 있어서,
상기 하이드로겔은 알지네이트계, PVA계, 폴리에틸렌글리콜계 및 폴리우레탄계로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 고분자를 포함하는 것인 담체. - 청구항 6에 있어서,
상기 담체는 판상의 탄소계 첨가제를 더 포함하는 것인 담체. - 청구항 6에 있어서,
상기 담체는 내부의 화학적 가교 결합을 통하여 3차원 망상 구조를 갖는 담체. - 청구항 6에 있어서,
상기 담체는 생체모방형 접착성 고분자 첨가제를 더 포함하는 담체. - 피처리수를 수용하는 반응조, 수처리용 분리막 모듈 및 상기 반응조 내부에 배치된 청구항 6의 담체를 포함하는 분리막 수처리 장치.
- 수처리용 미생물 및 피처리수를 포함하는 반응조에 청구항 1의 균주를 접종하여 분리막에 의한 여과를 실시하는 여과 단계;를 포함하는 분리막 수처리 공정.
- 수처리용 미생물 및 피처리수를 포함하는 반응조 내에 배치된 청구항 6의 담체 존재 하에 피처리수를 분리막에 의해 여과하는 단계;를 포함하는 분리막 수처리 공정.
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2022
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