KR102093432B1

KR102093432B1 - 층 구조의 정족수 억제 담체의 조성 및 제조방법과 이를 이용한 생물오염의 제어

Info

Publication number: KR102093432B1
Application number: KR1020180105620A
Authority: KR
Inventors: 추광호
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2018-09-04
Filing date: 2018-09-04
Publication date: 2020-03-25
Also published as: KR20200027381A

Abstract

본 발명은 층 구조를 가진 정족수 억제 담체, 담체의 제조방법 및 이를 이용한 생물오염 제어에 관한 것으로, 상세하게는 생물자극물질을 포함하는 내부 층과 정족수 억제 미생물을 포함하는 외부 층으로 이루어진 층 구조의 정족수 억제 담체와 이의 제조방법 및 생물오염 제어에 이용하는 방법에 관한 것이다.
분리막 생물반응기, 하폐수 고도처리 및 담수화 등의 분야에서 생물오염의 제어 방법에 이용할 수 있으며, 우수한 정족수 억제 미생물의 성장 및 활성을 가져 효과적으로 미생물의 신호분자 물질을 분해하는 담체를 제공한다.

Description

층 구조의 정족수 억제 담체의 조성 및 제조방법과 이를 이용한 생물오염의 제어{The composition and preparation method of quorum quenching media of core-shell structure for anti-biofouling strategy}

본 발명은 층 구조를 가진 정족수 억제 담체, 담체의 제조방법 및 이를 이용한 생물오염 제어에 관한 것으로, 상세하게는 생물자극물질을 포함하는 내부 층과 정족수 억제 미생물을 포함하는 외부 층으로 이루어진 층 구조의 정족수 억제 담체와 이의 제조방법 및 생물오염 제어에 이용하는 방법에 관한 것이다.

근래에 종래의 물리화학적 또는 생물학적 수처리 공정에 대한 대안으로서 생물학적 수처리 반응기(생물반응조)에 막분리 공정을 결합한 분리막 생물반응기 공정이 최근에 활발히 연구되고 있으며, 실제 공정에도 널리 적용되고 있다.

분리막 생물반응기 (membrane bioreactor, MBR) 공정이란 일반적인 활성 슬러지 공법 (conventional activated sludge, CAS)에 분리막 공정을 결합하여 각각의 장점을 극대화한 것으로, MBR 공정은 기존의 활성 슬러지 공법에 비해서 설비 면적이 좁으며 외부 충격 부하에도 안정적으로 운전하여 높은 수질의 여과수를 얻을 수 있고 또한 자동화에 용이하므로, 다국적 기업 및 국내 대기업들도 사업에 참여하고 있다.

그러나 MBR 공정은 운전이 진행됨에 따라 반응기 내부에 존재하는 박테리아, 곰팡이, 조류(algae) 등과 같은 미생물들이 분리막 표면에서 부착성장(attached growth)을 시작하여, 수십 마이크로미터 내외의 두께를 가지는 막(film), 즉 생물막(biofilm)을 형성하며 표면을 덮게 되며, 이로 인해 분리막이 오염되는 문제를 지니고 있다. 생물막은 분리막의 여과 성능을 저하시키고 에너지 소모를 가중시키며, 여과수량이 감소하거나 분리막의 세정주기 및 수명이 단축되는 등의 문제로 인해 분리막 생물반응기 공정의 경제성을 악화시킨다.

이와 같은 문제 해결을 위해 다양한 물리적 방법과 화학적 방법이 연구되어 왔다. 대표적인 분리막 표면의 생물막 저감 기술의 물리적인 방법으로는 폭기를 통한 전단력 증가에 의한 생물막 탈리 유도와 역세척을 통한 생물막 탈리 등의 방법이 있으며, 화학적인 방법으로는 입자 크기를 증가시키기 위한 고분자 응집제의 주입 혹은 분리막 표면의 친수성을 증가시키기 위한 개질 등의 방법이 있다.

하지만, 이러한 연구들은 미생물의 생장에 필요한 수분과 양분이 어디에나 존재하는 수처리 공정의 특성과 분리막의 여과 방향으로 폐수가 유동하다는 점 및일단 형성되면 외부의 물리·화학적 충격에 높은 내성을 가지는 생물막 자체의 특성상 지금까지 만족할 만한 수준의 해결책이 되지 못하고 있다. 따라서, 생물막 오염 현상의 근본적인 해결을 위해서는 미생물의 특성에 대한 이해와 이를 바탕으로 한 생물학적 접근법이 절실한 실정이다.

미생물들은 온도, pH, 양분 등 여러 가지 주위 환경의 변화에 반응하여 특정 신호분자를 합성하고 이를 세포 외로 배출/흡수하는 방법으로 주변의 세포 밀도를 인지한다. 세포 밀도가 증가하여 이러한 신호분자의 농도가 일정수준에 이르게 되면 특정 유전자의 발현이 시작되고 그 결과 미생물 집단의 생리현상이 조절 (group behavior regulation)되는데, 이를 정족수 감지 (quorum sensing) 현상 이라고 하며, 일반적으로 세포의 밀도가 높은 환경 하에서 발생한다. 이러한 정족수 감지 현상으로 미생들은 독성 (virulence), 생물막 형성 (biofilm formation), 접합 (conjugation), 포자 형성 (sporulation) 등의 집단 행동을 나타낸다.

이러한 정족수 감지 현상 억제 (quorum quenching) 방법은 생물막 오염의 주요 원인인 미생물간의 신호전달 물질을 억제하여 군집(미생물 층)을 형성하는 것을 차단함으로써 생물막 오염의 본질적인 원인을 파악하고 이를 해결하기 위한 가장 효율적인 방안으로서 각광받고 있다.

이에 따라, 대한민국 공개 특허 10-2016-0011058호에서는 호모세린 락톤(AHL) 분해효소(생물막 형성 억제 효소)를 생산하는 것을 특징으로 하며 우수한 정족수 인식 차단활성을 갖는 신규 미생인 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(bacillus amyloliquefaciens) LBA-6와 이의 이용방법을 개시하고 있으나, 정족수 인식 차단활성을 갖는 미생물의 장시간 사용을 위한 방안이 개시되어 있지 않다.

KR 10-2016-0011058 KR 10-1625891

상기 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 정족수 억제 미생물의 생존 시간, 성장 및 활성을 높여 줄수 있는 생물자극물질을 포함하는 내부 층과 정족수 억제 미생물을 포함하는 외부 층으로 구성된 층 구조의 정족수 억제 담체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 상기 담체의 제조방법 및 담체를 이용한 생물오염 제어 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 과제을 해결하기 위하여 본 발명은,

정족수 억제 담체에 있어서,

생물자극물질을 포함하는 내부 층 및 정족수 억제 미생물을 포함하는 외부 층으로 이루어진 것을 특징으로 하는 층 구조의 정족수 억제 담체를 제공한다.

상기 생물자극물질은 감마-카르로락톤, 젖산, 휴믹물질, 아미노산류, 단백질류 및 해조류 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 생물자극물질을 포함한다.

상기 정족수 억제 미생물은 로도코쿠스 BH4 (Rhodococcus sp. BH4), 아세니토박터 DKY-1 (Acinetobacter sp. DKY-1), 수도모나스(Pseudomonas sp. Li4-2, Pseudomonas sp. 1A1), 바실러스(Bacillus methylotrophicus와 Bacillus amyloliquefaciens), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 아쓰로박터(Arthrobacter sp. MP1-2), 델프티마(Delftia sp. Le2-5) 및 랄스토니아(Ralstonia sp. XJ12B)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 정족수 억제 미생물을 포함한다.

상기 내부 층은 폴리술폰, 알지네이트, 플루오르화폴리비닐리덴, 폴리우레탄, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함한다.

상기 외부 층은 폴리비닐알코올, 알지네이트 및 폴리에틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함한다.

담체는 구형, 평판형 및 막대형 중 하나의 형태로 제조한다.

상기 다른 과제을 해결하기 위하여 본 발명은,

생물자극물질을 포함하는 내부 층을 제조하는 단계;

정족수 억제 미생물을 포함하는 외부 층을 제조하는 단계; 및

상기 외부 층으로 상기 내부 층을 코팅하는 단계;를

포함하는 것을 특징으로 하는 층 구조의 정족수 억제 담체 제조방법을 제공한다.

상기 내부 층은 생물자극물질인 감마-카르로락톤, 젖산, 휴믹물질, 아미노산류, 단백질류 및 해조류 추출물 중에서 선택되는 하나 이상의 물질 및 폴리술폰, 알지네이트, 플루오르화폴리비닐리덴, 폴리우레탄, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌 중에서 선택되는 하나 이상의 물질을 포함한다.

상기 외부 층은 정족수 억제 미생물은 로도코쿠스 BH4 (Rhodococcus sp. BH4), 아세니토박터 DKY-1 (Acinetobacter sp. DKY-1), 수도모나스(Pseudomonas sp. Li4-2, Pseudomonas sp. 1A1), 바실러스(Bacillus methylotrophicus와 Bacillus amyloliquefaciens), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 아쓰로박터(Arthrobacter sp. MP1-2), 델프티마(Delftia sp. Le2-5) 및 랄스토니아(Ralstonia sp. XJ12B)중에서 선택되는 하나 이상의 미생물 및 폴리비닐알코올, 알지네이트 및 폴리에틸렌글리콜 중에서 선택되는 하나 이상의 물질을 포함한다.

상기 또 다른 과제을 해결하기 위하여 본 발명은,

상기 담체를 이용하는 것을 특징으로 하는 생물오염 제어 방법을 제공한다.

상기 생물오염 제어 방법은 분리막 생물반응기 분야 및 하폐수 고도처리·담수화 분야에서 적용 가능하다.

본 발명은 생물자극물질을 포함하는 내부 층과 정족수 억제 미생물을 포함하는 외부 층으로 구성된 층 구조의 정족수 억제 담체를 제공함으로써 내부 층의 생물자극물질로 인해 외부 층의 정족수 억제 미생물의 성장 및 활성이 높아지고 오래 유지되어 미생물의 신호분자 물질을 분해하는데 우수한 효과가 있다.

또한, 분리막 생물반응기 및 하폐수 고도처리·담수화 등의 분야에서 상기 층 구조의 정족수 억제 담체를 이용하여 효율적이고 지속가능한 생물오염 제어가 가능하다.

도 1은 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 따라 각각 글루코즈와 생물자극물질을 첨가한 배지에서 미생물을 배양하였을때 OD₆₀₀값을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 따라 각각 글루코즈와 생물자극물질을 첨가한 배지에서 배양한 미생물의 정족수 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 따라 제조된 담체의 내부 층에서의 생물자극물질의 방출 기간을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 담체 내 생물자극물질과 정족수 억제 미생물의 유무에 따른 분리막 생물반응기에서의 막 오염 제거 활성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 시간의 흐름에 따른 분리막 오염지표를 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리막 오염지표의 값이 증가되는 시간을 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 정족수 억제 미생물을 포함하며, 사용되지 않은 담체의 외부 층을 나타낸 현미경 사진이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 정족수 억제 미생물 및 생물자극물질을 포함하며, 사용되지 않은 담체의 외부 층을 나타낸 현미경 사진이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 정족수 억제 미생물을 포함하며, 사용된 담체의 외부 층을 나타낸 현미경 사진이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 정족수 억제 미생물 및 생물자극물질을 포함하며, 사용된 담체의 외부 층을 나타낸 현미경 사진이다.

이하 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 정족수 억제 담체에 있어서, 생물자극물질을 포함하는 내부 층 및 정족수 억제 미생물을 포함하는 외부 층으로 이루어진 것을 특징으로 하는 층 구조의 정족수 억제 담체를 제공한다.

생물자극물질은 감마-카르로락톤, 젖산, 휴믹물질, 아미노산류, 단백질류 및 해조류 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 생물자극물질을 포함한다.

일반적인 생물자극물질은 정족수 억제 미생물 뿐만아니라 다른 어떤 미생물에도 영향을 미쳐 그 성장과 활성을 높인다. 그에 따라 더 많은 부가 비용과 생물자극물질의 투여가 필요하다.

그러나 본 발명에서는 생물자극물질은 담체의 내부 층 포함되어 있으며, 장시간 천천히 방출 조절이 가능하도록 하여 오랜시간 동안 정족수 억제 미생물이 생명을 연장하고 성장하며 활발하게 활동할 수 있도록 설계되어 있다. 생물자극물질을 조밀한 고분자로 설계된 코어 내부에 포함하고 방출을 제어하여, 정족수 억제 역할의 미생물의 성장과 활성을 효율적이고 지속적으로 높일 수 있다.

본 발명에 적용 가능한 생물자극물질은 정족수 억제 미생물의 생명과 성장 및 활성을 높일 수 있다면 어떤 종류라도 사용할 수 있다. 또한, 층 구조의 담체 내부에 포함하여 정족수 억제 미생물의 자극에 사용할 수 있으며, 구체적으로는 감마-카르로락톤, 젖산, 휴믹물질, 아미노산류, 단백질류 및 해조류 추출물과 같은 생물자극물질을 사용할 수 있다.

특히, 감마-카르로락톤은 락톤분해효소에 의해 분해되어 생물동화에 작용함으로써 미생물의 성장을 촉진하는 것으로 알려져있다.

정족수 억제 미생물은 로도코쿠스 BH4 (Rhodococcus sp. BH4), 아세니토박터 DKY-1 (Acinetobacter sp. DKY-1), 수도모나스(Pseudomonas sp. Li4-2, Pseudomonas sp. 1A1), 바실러스(Bacillus methylotrophicus와 Bacillus amyloliquefaciens), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 아쓰로박터(Arthrobacter sp. MP1-2), 델프티마(Delftia sp. Le2-5) 및 랄스토니아(Ralstonia sp. XJ12B)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 정족수 억제 미생물을 포함한다.

본 발명에 적용 가능한 정족수 억제 미생물은 생물막 형성을 억제하는 효소를 생산하거나 정족수 감지 기작에 사용되는 신호분자 또는 신호전달 물질을 분해하는 정족수 감지 억제 효소를 생산할 수 있다면 어떤 종류라도 사용할 수 있다.

구체적으로는 로도코쿠스 BH4 (Rhodococcus sp. BH4), 아세니토박터 DKY-1 (Acinetobacter sp. DKY-1), 수도모나스(Pseudomonas sp. Li4-2, Pseudomonas sp. 1A1), 바실러스(Bacillus methylotrophicus와 Bacillus amyloliquefaciens), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 아쓰로박터(Arthrobacter sp. MP1-2), 델프티마(Delftia sp. Le2-5) 및 랄스토니아(Ralstonia sp. XJ12B)와 같은 정족수 억제 미생물을 사용할 수 있다.

로도코쿠스 BH4는 정족수 감지 기작에 이용되는 신호전달 물질 중 하나인 아실 호모세린 락톤(AHL)의 효소적 분해를 통해 신호물질을 무력화시킴으로써 미생물에 의한 생물막 형성을 저해할 수 있다.

아세니토박터 DKY-1는 미생물 종 간의 정족수 감지에 이용되는 제 2유형 신호전달물질(autoinducer-2)를 분해하는 화학물질을 생성하여 세포 외로 배출시켜 정족수 기작을 방해한다고 알려져 있다.

담체의 내부 층은 폴리술폰, 알지네이트, 플루오르화폴리비닐리덴, 폴리우레탄, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 것을 특징으로 한다.

알지네이트는 미생물 세포, 식물 및 포유동물 세포와 같은 여러 종류의 세포를 고정화하기 위한 응고제로 널리 이용되고 있다. 또한, 친수성 천연 고분자를 주성분으로 포함하는 담체 물질로 염화칼슘 용액 내에서 화학적인 결합인 가교를 통해서 물질전달에 대한 저항을 최소화하는 망상형 구조로 고형물을 형성하게 된다. 이로써 생물막 형성 억제 미생물 뿐만 아니라 상기 미생물에 의해 생산된 효소 역시 고정화하는 것도 가능하며, 생체적 합성 (biocompatibility)이 우수하여서 수처리용 미생물이 존재하는 반응조 내에서 사용하기 적합하며, 가격이 저렴하여 경제성이 높으면서 인체에 무해하다는 점에서도 바람직하다.

폴리술폰(PSf)은 술포닐기(-SO2-), 에테르기(-O-), 이소프로필리덴기(-C(CH3)2-)가 벤젠고리에 결합된 구조로 중합된 고분자 화학물로, 고온에서 단단하고, 질기며 투명한 속성을 유지한다. 온도에 대한 수축 팽창이 안정적이며, 끓는 물 또는 150℃의 기온 또는 증기 열에 대해서는 0.1% 이하의 크기 변화를 갖는다. 높은 온도에 대한 열저항 능력이 있어, 다른 방염 처리 없이 높은 열에서 그 강도를 유지할 수 있는 방염제 역할을 한다.

담체의 외부 층은 폴리비닐알코올, 알지네이트 및 폴리에틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 것을 특징으로 한다.

폴리비닐알코올(PVA)은 수용성 중합체로 물에는 잘 녹지만 보통의 유기용매에는 녹지 않는 특성이 있어, 오일 탱크의 내부 피복 등의 특수한 용도로도 사용된다. 일반적으로는 절연 필름이나 접착제등의 재료로 사용되며 결합제, 점도증가제 및 피막형성제로서도 사용된다.

담체는 구형, 평판형 및 막대형 중 하나의 형태로 제조하는 것을 특징으로 한다. 상기 담체는 각각 생물자극물질을 포함하는 외부 층과 정족수 억제 미생물을 포함하는 외부 층으로 이루어진 담체로서의 구조를 가질 수 있다면 어떤 형태든 제조할 수 있다. 구체적으로는 구형, 평판형 및 막대형으로 제조 할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 생물자극물질을 포함하는 내부 층을 제조하는 단계; 정족수 억제 미생물을 포함하는 외부 층을 제조하는 단계; 및 상기 외부 층으로 상기 내부 층을 코팅하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 층 구조의 정족수 억제 담체 제조방법을 제공한다.

정족수 억제 담체를 제조하기 위하여 담체의 내부 층에 생물자극물질을 감싸고 방출을 조절할 수 있으며, 외부 층에 정족수 억제 미생물을 포함할 수 있다면, 담체의 구성 성분으로 고분자 물질, 단분자 물질 및 화합물 등 어떤 종류라도 사용할 수 있으며, 담체를 제조하는 어떤 방법이라도 이용할 수 있다.

담체 내부 층은 생물자극물질인 감마-카르로락톤, 젖산, 휴믹물질, 아미노산류, 단백질류 및 해조류 추출물 중에서 선택되는 하나 이상의 물질 및 폴리술폰, 알지네이트, 플루오르화폴리비닐리덴, 폴리우레탄, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌 중에서 선택되는 하나 이상의 물질을 포함한다.

담체 외부 층은 정족수 억제 미생물은 로도코쿠스 BH4 (Rhodococcus sp. BH4), 아세니토박터 DKY-1 (Acinetobacter sp. DKY-1), 수도모나스(Pseudomonas sp. Li4-2, Pseudomonas sp. 1A1), 바실러스(Bacillus methylotrophicus와 Bacillus amyloliquefaciens), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 아쓰로박터(Arthrobacter sp. MP1-2), 델프티마(Delftia sp. Le2-5) 및 랄스토니아(Ralstonia sp. XJ12B) 중에서 선택되는 하나 이상의 미생물 및 폴리비닐알코올, 알지네이트 및 폴리에틸렌글리콜 중에서 선택되는 하나 이상의 물질을 포함한다.

감마-카프로락톤은 생물자극능력이 우수하고, 폴리술폰은 밀집된 구조를 형성하여 생물자극 물질을 천천히 제어 방출하며, 알지네이트는 미생물과의 친화성이 매우 우수하고, 폴리비닐알코올은 응결된 친수성 고분자 구조가 보다 안정되게 유지되도록 도와준다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 담체를 이용하는 것을 특징으로 하는 생물오염 제어 방법을 제공한다.

생물오염 제어 방법은 분리막 생물반응기 분야 및 하폐수 고도처리·담수화 분야에서 적용 가능하다. 본 발명에서의 생물오염 제어 방법은 미생물 및 여러 생물에 의한 환경오염의 악화가 심화됨에 따라 오염을 제거하고 처리할 수 있는 모든 방법들에 적용될 수 있으며, 구체적으로 분리막 생물반응기 분야, 하폐수 고도처리·담수화 분야, 관망 및 설비 생물오염 분야에 적용될 수 있다.

하폐수 고도처리·담수화 분야에서 하폐수 고도처리는 생활하수 또는 산업폐수 내에 있는 오염물질을 제거하는 과정을 의미하며, 환경 문제를 최소화하거나 처리도니 물을 재이용하기 위해 사용된다. 하폐수를 처리하기 위해서는 1차, 2차 및 3차 처리 과정을 거치는데, 고도처리는 3차 처리를 의미하며, 처리 대상 물질에 따라 급속여과, 활성탄, 막분리, 오존산화 시설, 염소 주입, 이온교환 및 인 제거시설 등 다양한 시설과 과정을 거친다.

담수화는 생활용수나 공업용수로 직접 사용하기 힘든 바닷물로부터 염분을 포함한 용해물질을 제거하여 순도 높은 음용수, 생활용수 및 공업용수 등을 얻어내는 일련의 수처리 과정이다.

이하 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 가에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

<실시예>

실시예 1. 생물자극물질이 정족수 억제 미생물에 미치는 영향

생물자극물질인 감마-카프로락톤(GCL)의 정족수 억제 미생물인 로도코쿠스 BH4에 미치는 영향을 알아보기 위하여 감마-카프로락톤(GCL) (1 g/L)을 첨가한 M9 minimal (MM) 배지에 로도코쿠스 BH4를 접종하여 7 일간 30℃에서 200 ppm의 속도로 교반하면서 배양하였다.

이하 명세서 상의 기재를 용이하게 하기 위하여 감마-카프로락톤은 GCL로, 로도코쿠스 BH4는 BH4로 명명한다.

비교예 1. 생물자극물질이 아닌 물질이 정족수 억제 미생물에 미치는 영향

생물자극물질이 아닌 글루코즈를 이용하여 정족수 억제 미생물인 BH4에 미치는 영향을 알아보기 위하여 글루코즈(1 g/L)를 첨가한 M9 minimal (MM) 배지에 BH4를 접종하여 7 일간 30℃에서 200 ppm의 속도로 교반하면서 배양하였다.

실시예 2. 생물자극물질에 의해 자극된 미생물의 정족수 억제 활성

GCL에 의해 자극된 BH4의 정족수 억제 활성을 확인하기 위하여 실시예 1과 동일하게 배양한 후 원심분리하여 상등액은 버리고 펠렛만 모아 OD₆₀₀값 1의 Tris-HCL 버퍼(pH 7, 50 nM)에 희석하였다. 이 현탁액에 동일한 부피의 N-octanoyl-homoserine lactone (C8-HSL)(400 nM)를 첨가하여 최종적으로 농도를 200 nM에 맞췄으며, OD₆₀₀값은 0.5로 조정하였다. BH4와 C8-HSL의 혼합물을 30℃에서 200 rpm의 속도로 교반한 후 정족수 억제 활성의 지표로서 C8-HSL의 농도를 확인하였다.

C8-HSL은 분리막 생물반응기 시스템의 주요 신호분자 중 하나로 알려져 있으므로 본 발명에서 미생물의 정족수 억제 활성을 확인하는데 이용되었다.

비교예 2. 생물자극물질이 아닌 물질에 의해 자극된 미생물의 정족수 억제 활성

GCL에 의해 자극된 BH4의 정족수 억제 활성을 확인하기 위하여 비교예 1과 동일한 방법으로 BH4를 배양한 후, 실시예 2와 같은 방법으로 C8-HSL의 농도를 확인하였다.

실시예 3. 층 구조의 정족수 억제 담체 제조

생물자극물질을 감싸고 방출을 조절할 수 있도로 고안된 정족수 억제 담체를 제조하기 위하여 몇 가지 고분자 재료를 사용하여 세 가지의 담체를 제조하였다.

이하 명세서 상의 기재를 용이하게 하기 위하여 세 가지의 담체를 각각 A, B, C로 명명하며, 담체 각각의 내부 층으로만 형성된 형태를 코어 A, 코어 B 및 코어 C로 명명한다.

A의 내부 층(코어 A)은 알지네이트 용액(4 % w/v)에 GCL(10 % w/v)를 첨가하여 교반한 후 혼합물을 CaCl₂ 용액(3 % w/v)에 노즐을 이용하여 한 방울씩 떨어뜨려 형성하고 마지막으로 탈이온수에서 세척과정을 거쳤다.

젖은 상태의 A를 N-methyl-2-pyrrolidone (NMP) 용매에 녹인 폴리술폰(10 %, 15 %, 또는 20 % w/v) 용액에 넣은 후 부드럽게 교반하면서 응고시키고 탈 이온수에 한 시간 동안 담궜다 건져내어 알지네이트 담체의 겉에 폴리술폰을 코팅한 코어 B를 제조하였다.

코어 C는 NMP 용매에 녹인 폴리술폰(10 %, 15 %, 또는 20 % w/v) 용액에 GCL(10 % w/v)을 첨가하여 교반한 후 혼합물을 탈이온수에 한 방울씩 떨어뜨려 한 시간 동안 부드럽게 교반하면서 응고시켜 제조하였다. 담체의 내부 층의 평균 직경은 약 2 mm였다.

이후 A, B 및 C의 내부 층에 정족수 억제 미생물을 포함하는 외부 층을 형성하였다.

정족수 억제 미생물인 BH4를 포함하는 외부 층은 이전의 세포 캡슐화 방법에 기초하여 제조되었다. 앞서 제조한 코어 A, B 및 C를 10 % w/w 폴리비닐알코올, 1 % w/w 알지네이트 및 20 % w/w BH4의 고형분 덩어리의 혼합물에 롤링한 후, 하이드로겔 층으로 코팅된 코어를 7:4 몰비의 붕산/CaCl₂와 함께 가교 용액에 침지시켜 외부 층을 형성하였다. 이어 0.2 M의 Na₂SO₄용액에 담체를 침지시켜 더욱 안정화시켰다.

실시예 4. 생물자극물질 또는 정족수 억제 미생물의 포함 유무에 따른 담체 제조

생물자극물질과 정족수 억제 미생물의 유무에 따른 정족수 억제 활성의 차이를 비교하기 위하여 상기 실시예 3과 같은 방법으로 네 가지 담체(Bead)를 제조하였다.

하기 표 1에 따라 담체의 내부 층과 외부 층에 각각 GCL과 BH4의 포함 유무를 달리하여 GCL과 BH4이 정족수 억제 활성에 미치는 영향을 알아보았다.

실시예 5. 담체의 분리막 생물반응기 막 오염 제거 활성 측정

이하 명세서 상의 기재를 용이하게 하기 위해 분리막 생물반응기를 MBR로 명명한다.

작업량이 2 L인 세 가지 실험실 규모의 MBR를 제작하였으며, MBR에 담체를 0.5 %의 부피비로 적재하였다. MBR1은 담체가 적재되지 않은 상태로 작동하였으며, MBR2 및 MBR3은 작동 단계마다 다른 담체를 첨가하였다.

1 단계에서는 MBR1 내지 3 모두 담체를 적재하지 않았으며, 2 단계에서는 MBR2에 상기 표 1의 Bead 1을 첨가하고 MBR3에 상기 표 1의 Bead 3을 첨가하였다. 3 단계에서는 MBR2에 상기 표 1의 Bead 3을 첨가하고 MBR3에 상기 표 1의 Bead 4를 첨가하였다. 4 단계에서는 MBR 2 및 3에 각각 상기 표 1의 Bead2 및 4를 첨가하였다. 상기 과정은 표 2에 나타내었다.

각각의 MBR에는 매일 4℃에 저장된 합성 폐수가 공급되었으며, MBR의 볼륨을 2 L로 유지할 수 있도록 센서를 사용한 공급 펌프를 사용하였다.

실시예 6. 분리막 오염지표(transmembrane pressure, TMP) 확인

MBR에서 담체의 정족수 억제 효능을 확인하기 위하여 막오염의 지연 정도를 알 수 있는 분리막 오염지표인 transmembrane pressure (TMP)를 측정하였다. TMP는 디지털 압력 변환기(ZSE 40F, SMC, Japan) 및 디지털 멀티미터(M-3850D, Metex, Korea)를 이용하여 컴퓨터에 기록하였다.

실시예 7. 담체의 정족수 억제 효과 지속성 확인

담체 내부 층의 GCL의 유무에 따른 담체 외부 층의 BH4의 생존력을 confocal laser scanning microscope (CLSM)을 이용하여 확인하였다.

또한, MBR에서 약 39일 동안 사용된 담체와 제조되어 막 오염 제거에 사용하지 않은 담체, 두 가지의 조건을 더 추가하여 총 네 가지 경우의 수에서 BH4의 생존력을 확인하였다.

<평가 및 결과>

결과 1. 생물자극물질에 따른 정족수 억제 미생물의 활성 측정 결과

실시예 1 내지 2 및 비교예 1 내지 2에 따라 생물자극물질인 GCL과 생물자극물질이 아닌 글루코즈가 각각 정족수 억제 미생물의 성장 및 정족수 억제 활성 즉, 신호분자의 감소에 미치는 영향을 확인한 결과를 도 1 및 2에 도시하였다.

도 1에서 OD₆₀₀은 600 nm의 파장에서 측정한 흡광도(optical density)값을 나타낸다. 이 OD₆₀₀값이 클수록 미생물의 성장과 활성이 높아진다는 것을 의미한다. 도 1에서 GCL을 첨가한 배지에서 배양한 미생물 배양액의 OD₆₀₀값이 글루코즈를 첨가한 배지에서 배양한 미생물 배양액의 OD₆₀₀값 보다 2배 이상 높은 것으로 나타났다. 즉, GCL이 미생물의 성장과 활성을 촉진시키는데 영향을 미친 것으로 나타났다.

도 2에서 C8-HSL의 농도가 낮을수록 미생물의 정족수 억제 활성이 높다는 것을 의미한다. 200 nM의 C8-HSL을 컨트롤로 하여 시간에 따른 C8-HSL의 농도를 측정한 결과, GCL이 첨가된 배지에서 C8-HSL의 농도가 가장 많이 감소된 것으로 나타났다.

결과 2. 담체의 내부 층의 구성 성분에 따른 생물자극물질 방출 결과

담체의 내부 층을 구성하는 재료에 따라 A, B 및 C로 명명하였으며, 각각의 내부 층으로만 형성된 형태를 코어 A, 코어 B 및 코어 C로 명명하였다.

실시예 3에 따라 미생물이 포함된 외부 층으로 감싼 완전한 형태의 담체 A, B 및 C를 제조하기 전 생성된 코어 A, B 및 C의 생물자극방출 활성을 확인하였으며, 그 결과를 도 3에 도시하였다.

도 3에서 칼슘 이온과 함께 응고된 알지네이트 담체(코어 A)는 5일 동안 GCL을 방출하였고, 알지네이트 담체 겉을 폴리술폰으로 코팅한 담체(코어 B)는 폴리술폰의 농도가 높아짐에 따라 최소 516일에서 최대 2038일 동안 GCL을 방출하였으며, 폴리술폰 담체(코어 C)는 폴리술폰의 농도가 높아짐에 따라 최소 440일에서 최대 902일 동안 GCL을 방출하였다.

결과 3. 담체 내 생물자극물질과 정족수 억제 미생물의 유무에 따른 MBR에서의 막 오염 제거 활성 측정 결과

실시예 3 내지 5에 따라, 담체 내 GCL과 BH4의 포함 여부에 따른 MBR에서의 정족수 억제 활성 즉, 막 오염 제거 활성을 확인하였으며, 그 결과는 도 4 및 5에 나타내었다.

도 4에서 1 단계는 MBR에 담체가 모두 첨가되어있지 않아 C8-HSL (mg/L)의 농도가 거의 비슷한 모습을 나타내었으며, 2 단계에서는 BH4를 포함하는 담체가 첨가된 MBR3에서 C8-HSL (mg/L)의 농도가 감소하는 모습을 나타내었다. 또한, 3 단계에서는 BH4를 포함하는 담체가 첨가된 MBR2에서 C8-HSL (mg/L)의 농도가 감소하였으며, BH4와 GCL을 모두 포함하는 담체가 첨가된 MBR3에서 그보다 더 낮은 C8-HSL (mg/L)의 농도를 나타내었다. 마지막으로, 4 단계에서 GCL을 포함하는 담체가 첨가된 MBR2에서 C8-HSL (mg/L)의 농도가 소폭 감소하였으며, BH4와 GCL을 모두 포함하는 담체가 첨가된 MBR3에서 모든 실험 단계에서 가장 낮은 C8-HSL (mg/L)의 농도를 나타내었다. 각 단계 별로 어떠한 담체도 첨가하지 않은 MBR1은 C8-HSL (mg/L)의 농도가 일정선을 유지하였다.

이로써, BH4 또는 GCL을 포함하는 담체는 MBR에서 막 오염을 제거하는 효과가 있으며 특히, BH4 및 GCL을 모두 포함하는 담체가 첨가된 MAR에서 막 오염 제거 효과가 가장 큰 것을 확인할 수 있었다.

결과 4. 분리막 오염지표(transmembrane pressure, TMP) 확인 결과

실시예 7에 따라, MBR에서 담체의 정족수 억제 효능을 확인하기 위하여 막오염의 지연 정도를 알 수 있는 분리막 오염지표인 transmembrane pressure (TMP)를 확인하였으며, 그 결과를 도 5 내지 6에 도시하였다.

도 5에서 MBR1 내지 3 모두 담체를 적재하지 않은 1 단계에서는 TMP의 값이 급격하게 증가하는 모양의 그래프가 나타났다. 2 단계에서는 담체가 적재되지 않은 MBR1과 GCL 및 BH4를 모두 포함하지 않은 담체를 가진 MBR2는 1단계와 유사한 그래프를 나타내었지만, BH4를 포함하는 담체를 가진 MBR3는 막 오염이 지연되어 TMP 값이 천천히 올라가는 그래프 모양을 나타내었다.

도 5의 3 단계와 4 단계에서는 BH4 및 GCL을 모두 포함하는 담체가 적재된 MBR3에서 월등한 막오염 지연활성을 나타내었으며, BH4만 포함된 담체를 가진 3 단계와 GCL만 포함된 담체를 가진 4 단계의 MBR2는 비슷한 형태의 그래프를 나타내었다.

도 6은 각 단계마다 TMP의 증가가 일어나는 시간을 나타내는 그래프이다. 담체가 적재되지 않은 MBR1은 모든 단계에서 가장 짧은 시간 내에 TMP값이 증가하였으며, MBR2는 BH4를 포함하는 담체를 가진 3 단계에서 TMP값이 가장 늦게 증가하였다. 또한, MBR3은 BH4 및 GCL을 모두 포함하는 담체를 가진 3 단계 및 4 단계에서 TMP값이 가장 늦게 증가하였다.

그 결과, BH4를 포함하는 담체를 가진 단계에서 MBR내의 TMP값의 증가가 유의하게 지연되었으며, BH4 및 GCL을 모두 포함하는 담체를 가진 단계에서 MBR내의 가장 TMP값의 증가가 억제되었다. 따라서, BH4 및 GCL을 모두 포함하는 담체가 첨가된 MBR에서 분리막 오염이 가장 지연되는 것을 확인할 수 있었다.

결과 5. 담체의 정족수 억제 효과 지속성 확인 결과

실시예 6에 따라, 정족수 억제 효과의 지속성을 확인할 수 있는 정족수 억제 미생물인 BH4의 생존 여부를 담체의 조건별로 현미경으로 모니터링하였다.

그 결과는 도 7 내지 10에 도시하였으며, 사진에 나타나있는 외부 층의 푸른빛은 살아있는 미생물이며, 붉은 빛은 죽은 미생물을 나타낸다.

도 7는 BH4를 포함하며 MBR에서 사용되지 않은 담체, 도 8은 BH4 및 GCL을 포함하며 MBR에서 사용되지 않은 담체, 도9는 BH4를 포함하며 MBR에서 사용된 담체 및 도 10은 BH4 및 GCL을 포함하며 MBR에서 사용된 담체의 외부 층을 찍은 현미경 사진을 나타내었다.

그 결과, 도 9에서 담체의 외부 층이 가장 붉은 빛을 띄었고, 도 8 및 10에서 가장 푸른 빛을 띄었으며, 이는 담체의 정족수 억제 효과에 있어서 사용 여부는 큰 영향을 미치지 않으며, 생물자극물질의 유무가 중요한 영향을 미친다는 것을 나타낸다.

Claims

정족수 억제 담체에 있어서,
생물자극물질을 포함하는 내부 층 및 정족수 억제 미생물을 포함하는 외부 층으로 이루어지고,
상기 내부 층은 상기 외부 층으로의 생물자극물질 방출을 제어하며,
상기 생물자극물질은 감마-카프로락톤인 것을 특징으로 하는 층 구조의 정족수 억제 담체.
삭제
제1항에 있어서,
상기 정족수 억제 미생물은 로도코쿠스 BH4 (Rhodococcus sp. BH4), 아세니토박터 DKY-1 (Acinetobacter sp. DKY-1), 수도모나스(Pseudomonas sp. Li4-2, Pseudomonas sp. 1A1), 바실러스(Bacillus methylotrophicus와 Bacillus amyloliquefaciens), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 아쓰로박터(Arthrobacter sp. MP1-2), 델프티마(Delftia sp. Le2-5) 및 랄스토니아(Ralstonia sp. XJ12B)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 정족수 억제 미생물을 포함하는 것을 특징으로 하는 층 구조의 정족수 억제 담체.
제1항에 있어서,
상기 내부 층은 폴리술폰, 알지네이트, 플루오르화폴리비닐리덴, 폴리우레탄, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 층 구조의 정족수 억제 담체.
제1항에 있어서,
상기 외부 층은 폴리비닐알코올, 알지네이트 및 폴리에틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 층 구조의 정족수 억제 담체.
제1항에 있어서,
상기 담체는 구형, 평판형 및 막대형 중 하나의 형태로 제조하는 것을 특징으로 하는 층 구조의 정족수 억제 담체.
생물자극물질을 포함하는 내부 층을 제조하는 단계;
정족수 억제 미생물을 포함하는 외부 층을 제조하는 단계; 및
상기 외부 층으로 상기 내부 층을 코팅하는 단계;를 포함하고,
상기 생물자극물질은 감마-카프로락톤이며,
상기 내부 층은 상기 외부 층으로의 생물자극물질 방출을 제어하는 것을 특징으로 하는 층 구조의 정족수 억제 담체 제조방법.
제7항에 있어서,
상기 내부 층은 폴리술폰, 알지네이트, 플루오르화폴리비닐리덴, 폴리우레탄, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌 중에서 선택되는 하나 이상의 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 층 구조의 정족수 억제 담체 제조방법.
제7항에 있어서,
상기 외부 층은 정족수 억제 미생물인 로도코쿠스 BH4 (Rhodococcus sp. BH4), 아세니토박터 DKY-1 (Acinetobacter sp. DKY-1), 수도모나스(Pseudomonas sp. Li4-2, Pseudomonas sp. 1A1), 바실러스(Bacillus methylotrophicus와 Bacillus amyloliquefaciens), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 아쓰로박터(Arthrobacter sp. MP1-2), 델프티마(Delftia sp. Le2-5) 및 랄스토니아(Ralstonia sp. XJ12B) 중에서 선택되는 하나 이상의 미생물 및 폴리비닐알코올, 알지네이트 및 폴리에틸렌글리콜 중에서 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 층 구조의 정족수 억제 담체 제조방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 담체를 이용하는 것을 특징으로 하는 생물오염 제어 방법.
제10항에 있어서,
분리막 생물반응기 분야 및 하폐수 고도처리·담수화 분야에서 적용 가능한 것을 특징으로 하는 생물오염 제어 방법.