KR20160011058A - 정족수인식 차단활성을 갖는 미생물 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 lba6 및 이의 이용방법 - Google Patents

정족수인식 차단활성을 갖는 미생물 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 lba6 및 이의 이용방법 Download PDF

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박희등
이상훈
함소영
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고려대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(bacillus amyloliquefaciens) LBA-6에 관한 것으로서 상기 미생물은 아실 호모세린 락톤(AHL) 분해효소(생물막 형성 억제 효소)를 생산하는 것을 특징으로 하며, 본 발명에 따르면, LBA6은 정족수인식 차단활성을 갖는 AHL 분해효소를 생산하는데, 종래 정족수인식 차단활성을 갖는 미생물 또는 효소에 비해 긴 아실체인을 갖는 AHL도 효과적으로 분해하므로 효과적인 생물막 형성 감소효과를 갖는다.
또한, 이를 생물막의 형성을 억제하는 분리막 여과공정에 적용하면 분리막의 표면에 형성되는 생물막의 형성을 분자생물학적인 방법으로 억제할 수 있으므로 투수율의 저하를 막는 동시에 분리막에 비하여 막세포 세척 주기가 길어지고 세척약품의 소모량을 줄일 수 있을 뿐만 아니라 장시간 여과공정을 수행할 수 있다.

Description

정족수인식 차단활성을 갖는 미생물 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 LBA6 및 이의 이용방법{quorum quenching Bacillus amyloliquefaciens LBA6 and method of using thereof}
본 발명은 미생물 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 LBA6에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 상기 미생물은 정족수인식 차단활성을 갖는 신규 미생물 및 이의 이용방법에 관한 것이다.
분리막을 이용한 고도의 수처리 공정, 특히, 하폐수 처리에 이용되는 분리막 생물 반응조(membrane bio-reactor, MBR) 공법의 경우, 미생물을 이용하여 생물학적으로 분해한 후, 분리막을 통과시켜 부유물질 및 대장균 등을 제거한다. 이는 간편하고 처리효율이 우수하여 많은 관심과 연구의 대상이 되고 있다.
그러나, 상기 MBR 공법은 하폐수 내에 존재하는 미생물에 의해 필연적으로 생물막이 분리막 표면에 형성되어 이로 인해 바이오파울링(biofoluling) 현상이 발생하는데, 이는 분리막의 투수도를 감소시키고, 수명 및 세정 시기를 단축시키며, 여과에 필요한 에너지 소비량이 증가하며, 분리막 성능이 저하되는 등의 문제점이 있다.
이와 같은 생물막오염 문제를 해결하기 위하여, 화학적, 물리적 방법들이 제시되었으나, 미생물의 생장에 필요한 영양분이 항시 제공되는 수처리 공정의 환경조건과, 형성되면 외부의 물리/화학적 충격에 높은 내성을 갖는 생물막 자체의 특성으로 인해 현재까지 만족할 만한 해결책이 제시되고 있지 않으며, 제시되었다고 하더라도 하폐수가 여과 방향으로 유동한다는 점에서 일시적인 대책이라는 한계가 존재한다. 따라서, 생물막 오염 현상의 근본적인 해결을 위해서는 미생물의 특성에 대한 이해와 이를 바탕으로 한 생물학적 접근법이 절실한 실정이다.
미생물이 적당한 표면에 정착하여 소수로 이루어진 군락을 형성한 후, 충분한 수의 미생물이 생장하게 되면 정족수 인식(quorum sensing, QS) 기작이 작용하여 점액성을 띈 고분자 다당류의 구조화된 생물막이 형성된다. 정족수 인식기작은 상기 미생물들로부터 분비되는 특정 신호물질(이하, 'AHL'이라고도 한다.)에 의해 특정한 유전자가 발현되는 과정을 의미한다.
이에, 생물막이 형성되는 근본적인 원인인 정족수 인식 기작을 차단하기 위해, 신호전달 물질인 아실 호모세린 락톤(AHL)의 효소적 분해를 통해 신호물질을 무력화시킴으로써 세균에 의한 병독성 요소 생산과 생물막의 형성을 저해하고자 다양한 미생물들이 발견, 연구되어 왔다.
일예로, 아실 호모세린 락톤을 분해하기 위한 효소를 갖는 미생물로는 로도코커스 속(Rhodococuss sp.) PI-33[한국공개특허 제10-2005-0038111], 아스로박터 속(Arthrobacter sp.) KH32[한국공개특허 제10-2003-0042624호] 및 아스로박터 속(Arthrobacter sp.) IBN110[한국등록특허 제10-0578525호]이 알려져 있다. 그러나, 이들 미생물은 아실 호모세린 락톤의 아실체인 길이가 짧은 경우에만 유효하거나, 어느 한 종 또는 두 종의 호모세린 락톤만을 분해할 수 있으므로 다양한 아실 호모세린 락톤이 존재하는 수처리 공정에 사용되기에는 한계점이 존재한다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여 수처리 공정 중에 발생하는 다양한 아실 호모세린 락톤을 분해할 수 있는 우수한 분해활성을 가진 미생물을 확보하고 이를 이용하여 효율적이고, 친환경적인 수처리 공정의 생물막 형성을 억제할 수 있는 방법을 개발하는 것이 요구된다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 우수한 정족수인식 차단 활성을 갖는 신규한 미생물 LBA6 및 이의 이용방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 수탁번호 KACC91788P로 기탁된 미생물 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(bacillus amyloliquefaciens) LBA-6을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 다른 목적을 이루기 위하여, 아실 호모세린 락톤(AHL) 분해효소(생물막 형성 억제 효소)를 생산하는 것을 특징으로 하는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(bacillus amyloliquefaciens) LBA-6를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 또 다른 목적을 이루기 위하여, 아실 호모세린 락톤을 신호물질로 하는 균주에 의해 유발되는 생물막을 저해하는 상기 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(bacillus amyloliquefaciens) LBA-6을 제공한다.
상기 아실 호모세린 락톤을 신호물질로 이용하는 균주는 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) PA14 균주인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 또 다른 목적을 이루기 위하여, 상기 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(bacillus amyloliquefaciens) LBA-6을 이용한 아실 호모세린 락톤 분해효소를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 또 다른 목적을 이루기 위하여,
Ⅰ) 제1항 또는 제2항에 의한 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(bacillus amyloliquefaciens) LBA-6를 배양하는 단계,
Ⅱ) 상기 Ⅰ) 단계로부터 얻은 배양액을 원심분리하여 상등액을 분리하는 단계, 및
Ⅲ) 상기 상등액을 0.45 ㎛ 필터로 필터링하는 단계를 포함하는 아실 호모세린 락톤 분해효소의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(bacillus amyloliquefaciens) LBA-6은 정족수인식 차단활성을 갖는 AHL 분해효소를 생산하는데, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(bacillus amyloliquefaciens)에 속하는 미생물에서는 AHL 분해효소를 생산하는 균주가 존재하지 않을뿐더러, 종래 정족수인식 차단활성을 갖는 미생물과 같이 짧은 아실체인을 갖는 AHL에 대해서만 한정되지 않고, 긴 아실체인을 갖는 AHL도 효과적으로 분해하므로 다양한 미생물에 의해 유발되는 생물막을 효과적으로 감소시킬 수 있다.
또한, 이를 생물막의 형성을 억제하는 분리막 여과공정에 적용하면 분리막의 표면에 형성되는 생물막의 형성을 분자생물학적인 방법으로 억제할 수 있으므로 투수율의 저하를 막는 동시에 분리막에 비하여 막세포 세척 주기가 길어지고 세척약품의 소모량을 줄일 수 있을 뿐만 아니라 장시간 여과공정을 수행할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 미생물 LBA6의 개략적인 계통도이다.
도 2는 본 발명에 따른 미생물 LBA6의 광학현미경(CLSM) 사진이다.
도 3은 본 발명의 정족수인식 차단활성을 갖는 LBA6의 AHL 분해효소 활성을 측정한 실험결과 그래프이다.
도 4는 본 발명의 정족수인식 차단활성을 갖는 LBA6의 생물막형성 저해능을 보여주는 실험결과 그래프이다.
도 5는 생물막을 형성하는 모델 균주인 PA14를 이용하여 인위적으로 슬라이드글라스 표면에 생물막을 형성시킨후, 정족수 인식 차단활성을 보이는 효소를 드립플로우 셀을 이용하여 1 일간 투입/운전, 종래의 슬라이드글라스 표면에 형성된 PA14 균주의 생물막 감소 현상을 관찰한 3차원 이미지이다.
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.
본 발명은 수탁번호 KACC91788P로 기탁된 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) LBA-6를 제공한다.
하수처리장의 활성슬러지 및 AHL을 단일 탄소원으로 하는 배지로부터 순수 분리하여 가장 활성이 우수한 단일 균주 LBA6를 선별·분리하였으며, 이러한, LBA6의 종분석을 위해 16S rDNA 염기서열을 분석한 결과, 균주 LBA6은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)에 속하는 것으로 확인되었다.
또한, 본 발명의 미생물 LBA6은 분자계통분류학적 분석에 의해 피라미쿠테스(firmicutes) 문에 속한다는 것을 확인하였다.
본 발명의 미생물 LBA6의 형태학적 특성을 조사하기 위하여 DAPI를 이용하여 염색한 후, 공초점 주사 현미경(Confocal lase scanning microscopy, CLSM)을 이용하여 관측하였다. 5 ㎕ 크기의 긴 원형모양을 지니고 있다는 것을 확인하였다.(도 1)
본 발명에 따른 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) LBA6는 하수처리장의 활성슬러지로부터 유래되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 미생물은 정족수인식 차단 효과가 있는 것을 특징으로 하고, 상기 효과는 본 발명의 균주로부터 생산되는 AHL 분해효소에 의한 것이라고 여겨진다.
보다 구체적으로 일반적으로 AHL의 종류로는 BHL(N-butanoyl-homoserine lactone), HBHL(N-3-hyeroxybutanoyl-homoserine lactone), HHL(N-3-actaoyl-homoserine lactone), OHHL(N-3-oxohexanoyl-homoserine lactone), OHHL(N-3-octaoyl-homoserine lactone), OOHL(N-3-oxooxtanoyl-homoserine lactone), OdDHL(N-3-oxododecanoyl-homoserine lactone), HtedDHL(N-3-hyeroxy-7-cis-tetradecenoyl-homoserine lactone) 등이 있다.
이들 중에서 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) LBA6은 BHL, HHL, OHL, OHHL, OdDHL 등 다양한 아실 호모세린 락톤류를 효과적으로 분해할 수 있다.
상기 신규 미생물 LBA6은 20 ℃에서부터 40 ℃까지 생존 적응이 가능하며, 30 ℃에서 생장이 가장 활발하다. 또한, 상기 온도에서 AHL 분해효소 생산이 가장 우수하다.
한편, 상기 LBA6 균주는 생물막 형성에 관여하는 다양한 종류의 AHL에 대한 분해활성이 우수하므로, 하폐수에 존재하는 미생물 특히, AHL을 신호물질로 하는 다양한 미생물이 유발하는 생물막의 형성을 효과적으로 저해할 수 있고, 이는 하기 실시예 5, 6으로부터 확인할 수 있다. 본 실시예에서는 하폐수에 존재하는 미생물로 상기 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) PA14를 사용하였다.
따라서, 상기 균주는 수처리 공정에 적용하여 하폐수 속에 존재하는 미생물의 신호물질 농도의 변화를 유도함으로써 효과적으로 생물막 형성을 제어할 수 있으며, 바람직하게는 본 발명에 따른 균주는 분리막에 고정화되거나, 하폐수 내에 접종하여 사용될 수 있다.
상기 균주를 수처리 공정에 적용하기 위해서는 시판되는 세균배지에 접종하여 배양한 후, 이의 미생물 균체 또는 배양액을 수처리 공정에 적용하여 분리막에 형성되는 생물막을 억제시킬 수 있으며, 보다 바람직하게 상기 세균배지는 AHL과 활성슬러지를 유일한 탄소원으로 하는 것이 균주의 생육을 촉진시킬 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) LBA6는 기존 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)에 속하는 미생물 군으로부터 발견되지 않던 효소로, 본 발명의 LBA6로부터 분리된 AHL 분해효소는 실시예에 기재되어 있듯이, 아실체인(acyl chain)의 길이나 그 치환여부에 관계없이 BHL, HHL, OHL, OHHL, OdDHL 등 다양한 아실 호모세린 락톤류를 효과적으로 분해할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 LBA6 균으로부터 AHL 분해효소를 제조하기 위해, 우선, 상기 LBA6를 배양한 배양액으로부터 상등액을 분리한 후, 0.45 ㎛ 필터로 정제하여 제조할 수 있다. 이와 같은 단순 분리정제단계만으로도 우수한 활성을 갖는 AHL 분해효소를 획득할 수 있으므로, 복잡한 단백질 정제공정과 이에 따른 공정시설이 필요하지 않으므로 비용을 절감할 수 있다.
또한, 상기과정을 통해 정제된 AHL 분해효소는 수처리 공정 중에서 하폐수 내에 접종하거나 분리막에 고정화하여 사용될 수 있다. 즉, 균주 또는 균주가 포함된 배양액을 사용하는 것보다 상기 정제된 AHL 분해효소는 효소 활성이 현저히 높아, 동일한 양으로도 우수한 생물막 저해효과를 얻을 수 있다. 또한, 하폐수는 다량의 미생물 및 생리활성물질을 비롯한 다양한 환경요소들이 존재하므로 이러한, 다양한 환경요인들의 영향을 덜 받고, 변형 가능성이 낮은 효소를 사용하는 것이 좋다. 따라서, 수처리 공정 조건 및 하폐수 오염정도에 따라서 상기 정제된 AHL 분해효소를 적절히 선택하여 사용하는 것이 바람직하다.
이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.
실시예 1 : 균주의 분리 및 선발.
정족수인식 차단활성을 갖는 미생물을 분리하기 위하여 실제 운영중인 덕평하수처리장의 MBR 활성슬러지 샘플을 수득한 후, 이에 탄소원으로 AHL이 포함된 증균배지에서 배양하였다. 이를 AHL이 포함된 한천배지에 도말하고 배양하여 성장속도가 빠르고 독특한 형태의 콜로니를 형성한 50 개의 균주를 선택하였다. 선택된 균주들의 AHL 분해활성이 가장 우수한 미생물 LBA6을 최종 선택하였다.
상기 증균배지[Basal medium; NaCl 1 g/L, KCl 0.5 g/L, MgCl2ㅇ6H2O 0.4 g/L, CaCl2ㅇ2H2O 0.1 g/L, KH2PO4 0.2 g/L, Na2SO4 0.15 g/L. MES buffer 1 g/L. 1000 X Trace element mixture 1 ml/L [MgCl2ㅇ6H2O 125 mg/100ml, CaCl2 5.5 mg/100ml, FeCl2ㅇ6H2O 13.5 mg/100ml, MnCl2ㅇ4H2O 1.0 mg/100ml, ZnCl2 1.7 mg/100ml, CuCl2ㅇ2H2O 0.43 mg/100ml, CoCl2ㅇ6H2O 0.6 mg/100ml, Na2MoO4ㅇ2H2O 0.6 mg/100ml], 1000 X selenite mixture 1 ml/L[Na2SeO3ㅇ5H2O 6 mg/ml, Na2WO4ㅇ2H2O 8 mg/ml, NaOH 0.4 g/ml], pH 6.0]는 유일한 탄소원으로 100 mM AHL을 증균배지 ml당 20 ㎕을 첨가하여 제조된 것이다.
실시예 2: 균주의 동정
상기 실시예 1에서 최종 선택된 균주의 동정은 형태학적 및 생화학적 특성 그리고 16S rDNA 유전자 염기서열분석을 이용하여 실시하였다.
(1) 형태적 특성 분석
상기 실시예 1에서 분리된 균주는 AHL를 단일 탄소원으로 하는 배지에서 잘 자라며, 세균의 형태는 광학현미경 사진과 같이 약간 긴 원형이었다.(도 2).
(2) 16S rDNA 염기서열 분석
상기 실시예 1에서 분리된 균주의 동정을 위해서 통상의 16S rDNA 유전자 염기서열분석을 이용하였다. 프라이머는 제노텍(Genotech)사의 27F와 1492R 프라이머를 10 pmol 농도로 사용하였고, 변성 95 ℃, 1분 어닐링 58 ℃, 1 분, 신장 72 ℃, 2 분 조건으로 30 사이클로 PCR을 실시한 후 서열분석기(Applied Biosystems model 310 automatic DNA sequencer)로 서열을 분석하였다. 분석된 염기서열의 계통학적 분류체계는 public database인 NCBI GenBank와 RDA database를 통해 확인하였다.
도 1에는 본 발명에 따른 미생물 LBA6의 대략적인 계통도를 도시하였다.
이러한, 실시예 2(2) 결과를 통해 LBA6 균주는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)에 속하는 것을 알 수 있었고, 이를 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) LBA-6로 명명하였다. 또한, 이 균주를 2013년 5월 15일에 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하였으며, 수탁번호는 KACC91788P로 부여받았다.
실시예 3 : LBA6 균주로부터 AHL 분해효소액의 제조.
우선, 상기 실시예 1로부터 수득한 LBA6 균주를 1 일간 배양액에 배양한 후, 2500 rpm으로 원심분리하여 상등액을 분리하였다. 상기 분리된 상등액을 0.45 ㎛ 필터로 정제하여 AHL-분해효소액을 수득하였다.
실시예 4 : 균주의 AHL 분해활성 측정.
실시예 1에서 수득한 LBA6 균주가 각각의 AHL에 대한 분해활성을 비교분석하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
우선, BHL, HHL, OHL, OHHL 및 OdDHL가 각각 포함된 배양액에 리포터 균주(CV026, NT1)와 상기 실시예 3으로부터 수득된 LBA6의 AHL-분해효소액을 혼합하여 각각의 배양액에 접종한 후, 30 ℃에서 24 시간 배양하였다. 동일한 조건의 배양액에 각각 균주 처리구와 대조군 시료(control, 1A-1, BH4)를 함께 준비하였다. 접종 24 시간 후 각 조건의 리포터 균주의 발색유무를 OD로 측정함으로서 AHL 분해활성을 관찰하였다.
도 3은 정족수인식을 차단하는 AHL 분해효소의 활성을 나타낸 그래프이다. 여기서 어떠한 처리도 하지 않은 시료와 종래 AHL 분해효소를 생산하는 1A-1 및 BH4 균주를 접종한 시료를 대조군으로 하였고, 본 발명의 실시예 1의 균주 LBA6를 접종한 시료를 실험군으로 하였다.
도 3을 참조하면, 실시예 1에 의한 균주 LBA6은 아실체인(acyl chain)의 길이나 그의 치환여부에 관계없이 실험된 5 종의 AHLs(BHL, HHL, OHL, OHHL 및 OdDHL)을 40% 이상 분해하였다. 그러나, 대조군으로 사용된 종래 BH4는 전체적으로 분해활성이 현저히 낮았다. 또한, 종래 1A-1는 전반적으로 BH4 보다 분해활성은 우수하였으나, 아실체인이 긴 AHLs(BHL, HHL, OHL, OHHL)에 대해서 실시예 1의 균주 LBA6보다 분해활성이 여전히 낮다는 것을 알 수 있다.
실시예 5 : 균주의 생물막 억제 활성측정
AHL-분해균주 LBA6의 정족수 인식차단 효소와 AHL-생산균주 PA14를 LB 배양액에서 혼합/배양하여 생물막 형성정도를 조사하였다. 결과를 도 4에 나타내었다.
(1) AHL 분해 효소 투입에 따른, AHL-생산균주 PA14의 생물막 형성 억제측정.
30 ℃에서 24 시간동안 AHL-생산균주 PA14를 배양한 후, 96웰 폴리스티렌 플레이트에 5%를 접종, 30 ℃에서 각각 12, 24, 36 시간동안 배양하면서 OD595㎚에서 OD 값을 측정하였다. 배양한 AHL-생산균주들의 상층액을 제거하고, 1X PBS 완충액[137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na2HPO4ㅇ7H2O, 1.4mM KH2PO4, pH 7.3]으로 세척한 후, 증류수에 녹인 1.0% (W/v) 크리스탈 바이올렛 용액 150 ㎕를 분주하여 30분 동안 염색하였다. 이후, 증류수로 상기 플레이트를 2 차적으로 세척하고 상온에서 건조시킨 뒤, 100% 에탄올을 첨가하여 웰에 남아있는 크리스탈 바이올렛 염료를 용출, OD545 ㎚에서 흡광도를 통하여 생물막 형성정도를 측정하였다.
이와 함께, AHL 분해 효소의 농도에 따른 생물막 형성 억제현상을 관찰하고자, AHL-분해균주 LBA6의 효소 필터정제액(실시예 3)을 5%, 10%의 비율로 섞어 96웰 폴리스티렌 플레이트에 접종하였다. 본 측정에서, 효소 투입농도를 제외한 다른 조건은 동일하게 수행하였으며, 흡광도를 측정하는 방법으로 생물막 형성정도를 측정하였다.
도 4를 참조하면, LBA6 균주 효소의 혼합비율이 증가할수록 생물막 형성이 감소된다는 것을 확인하였다. 즉, LBA6 균주는 AHL-생산균주 PA14에 의해 형성되는 생물막을 억제시킨다는 사실을 확인할 수 있다.
또한, LBA6이 혼합된 경우, 시간의 경과에 따라 생물막의 저해효과가 감소되고 있음을 알 수 있다. 이는 LBA6 균주의 배양시간이 길어짐에 따라 활성이 점차 감소하고 있다는 것을 보여준다.
실시예 6 : 균주가 고정화된 수처리용 분리막의 표면에 형성된 생물막의 구조 분석
실제 분리막 공정에 적용하기에 앞서, 드립플로우 셀(Drip-Flow cell)을 이용하여 비가압 상태에서 생물막 형성 모델 균주인 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) PA14 균주를 이용하여 슬라이드글라스 표면에 생물막을 형성시킨 후, AHL-분해균주인 실시예 3으로부터 수득된 LBA6의 AHL-분해효소액을 접종, 슬라이드글라스 표면에 생성된 생물막을 감소시키는 현상(생물막의 구조와 구성성분)을 관찰함으로써 본 발명의 AHL-분해균주의 생물막 형성 억제 효과를 평가하였다.
구체적으로, 드립플로우 셀 내부에 75 ㎜ × 25 ㎜ 크기의 슬라이드글라스을 설치하였으며 24 시간 배양된 실시예 3으로부터 수득된 LBA6의 AHL-분해효소액을 1.5 mL/min의 유량으로 드립플로우 셀의 내부로 공급하였다.
AHL을 신호분자로 이용하는 AHL-생산균주 PA14만이 고정화된 슬라이드글라스를 대조군으로 하고, 10 % 실시예 3으로부터 수득된 LBA6의 AHL-분해효소액이 혼합된 AHL-생산균주 PA14이 고정화된 슬라이드글라스를 실험군으로 하였다.
이때, 드립플로우 셀에 접종하기 전에 24 시간 동안 25 g/L의 LB배지에서 배양하고, 배양체를 드립플로우 셀에 바로 접종하였다.
접종 후, 24 시간동안 생물막 형성 균주가 슬라이드글라스 표면에 부착되도록 한 후 상기 영양분을 지속적으로 공급하였다. 1 일간의 드립플로우 셀 운전 후, 각 분리막의 표면에 형성된 생물막을 셀을 염색하는 SYTO 9와 미생물의 체외고분자물질 중 다당류를 염색하는 ConA를 이용하여 염색한 후 공초점 주사 현미경(Confocal laser scanning microscopy, CLSM)을 이용하여 관측하였다. CLSM을 통해 얻어진 생물막의 단층 이미지들은 IMARIS 프로그램을 이용하여 3차원 이미지로 재구성하였으며, ISA-2D 프래그램을 이용하여 분리막 표면에 형성된 생물막의 두께를 정량화하였다.
도 5는 드립플로우 셀 1일 운전 후 대조군(a)과 실험군(b)에 따른 슬라이드글라스 표면에 형성된 생물막 이미지를 나타낸 것이다.
이에 따르면, LBA6 균주의 효소를 처리하지 않은 대조군에서는 둥근모양의 생물막이 관찰되었고, 두께는 약 30 ㎛였다. 반면 10% LBA6 균주의 효소가 혼합 고정화된 슬라이드글라스에서는 생물막의 형태가 상대적으로 평평한 형태로 관찰되었고, 두께 역시 약 20 ㎛ 미만으로 상기 대조군에 비해 약 10 ㎛가 감소되었다.
즉, 본 발명에 따른 신규 미생물 LBA6은 미생물의 정족수 감지 기작에 의해 조절되는 생물막의 성장을 현저히 저하시킬 수 있다는 것을 의미하며, 생물막의 성장과 생물막 오염현상의 주된 요인임을 감안해 볼 때 비가압 상태에서도 본 발명의 생물막 형성 억제 효과가 생물막 오염 현상을 크게 완화시킬 수 있음을 나타낸다.
농업생명공학연구원 KACC91788 20130515
<110> Korea University Industrial and Academic Collaboration Foundation <120> quorum quenching Bacillus amyloliquefaciens LBA6 and method of using thereof <130> LBA6 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1426 <212> DNA <213> bacillus amyloliquefaciens LBA6 <400> 1 gggccagacc gtagcttgct ccctgatgtt agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggta 60 acctgcctgt aagactggga taactccggg aaaccggggc taataccgga tgnttgtttg 120 aaccgcatgg ttcagacata aaaggtggct tcggctacca cttacagatg gacccgcggc 180 gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcgnc gatgcgtagc cgacctgaga 240 gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtag 300 ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt 360 tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag aacaagtgcc gttcaaatag ggcggcacct 420 tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta 480 ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagggct cgcaggcggt ttcttaagtc 540 tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc 600 agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac 660 cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc 720 gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagggg 780 gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg 840 caagactgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta 900 attcgaagca acgcgaagaa cccttaccag gtcttgacat cctctgacaa tcctagagat 960 aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag gtgggtgcat ggktgtcgtc agctcgtgtc 1020 gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt gatcttagtt gccagcattc 1080 agttgggcac tctaaggtga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa 1140 atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac aatggacaga acaaagggca 1200 gcgaaaccgc gaggttaagc caatcccaca aatctgttct cagttcggat cgcagtctgc 1260 aactcgactg cgtgaagctg gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata 1320 cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccacgag agtttgtaac acccgaagtc 1380 ggtgaggtaa cctttaggag ccagccgccg aaggtgacag aaagtt 1426

Claims (6)

  1. 수탁번호 KACC91788P로 기탁된 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(bacillus amyloliquefaciens) LBA-6.
  2. 아실 호모세린 락톤(AHL) 분해효소(생물막 형성 억제 효소)를 생산하는 것을 특징으로 하는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(bacillus amyloliquefaciens) LBA-6.
  3. 아실 호모세린 락톤을 신호물질로 하는 균주에 의해 유발되는 생물막을 저해하는 제1항 또는 제2항에 의한 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(bacillus amyloliquefaciens) LBA-6.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 아실 호모세린 락톤을 신호물질로 이용하는 균주는 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) PA14 균주인 것을 특징으로 하는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(bacillus amyloliquefaciens) LBA-6.
  5. 제1항 또는 제2항에 의한 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(bacillus amyloliquefaciens) LBA-6을 이용한 아실 호모세린 락톤 분해효소.
  6. Ⅰ) 제1항 또는 제2항에 의한 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(bacillus amyloliquefaciens) LBA-6를 배양하는 단계;
    Ⅱ) 상기 Ⅰ) 단계로부터 얻은 배양액을 원심분리하여 상등액을 분리하는 단계; 및
    Ⅲ) 상기 상등액을 0.45 ㎛ 필터로 필터링하는 단계;를 포함하는 아실 호모세린 락톤 분해효소의 제조방법.
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CN113115795A (zh) * 2021-03-22 2021-07-16 华南农业大学 硝基还原假单胞菌HS-18在防治AHLs介导致病的病原菌中的应用

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